JP3833151B2 - Pharmaceutical distribution diagnostic method - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬物の組織移行性変化を迅速に予測するための薬学的分布診断法並びにそれに基づく薬物選択法及び治療法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液は、体内を循環して体の隅々にまで必要な酸素や栄養素などを運搬するばかりでなく、老廃物を運ぶなどの重要な働きを行うが、そこには種々の血清蛋白質が含まれている。そうした様々な血清蛋白質はそれぞれが独特の性質・機能を有しており、種々の血清蛋白質にはそれぞれ薬物結合サイト（薬物結合部位）が存在している。例えば、血清蛋白質の代表的なものである、ヒト血清アルブミン(HSA) やα1-酸性糖蛋白質 (AGP)などは、薬物と結合することの知られた血清蛋白質である。
生体内における薬理効果の強弱は、標的組織や標的部位への薬物の移行量に大きく依存していることが認められる。その薬物の組織移行性（分布の度合い）の主要な調節因子の一つが血清蛋白結合である。血清蛋白質には、様々なものが知られているが、その中で主に薬物の蛋白結合を大きく左右するものに人血清アルブミン(HSA) 及びα1-酸性糖蛋白質(AGP) 等が挙げられる。そうした蛋白質にはそれぞれに蛋白分子上の薬物結合サイトが存在する。一般に、主な結合サイトの数は、例えば、HSA では４個程度、AGP では３個程度が存在するといわれている。
何らかの要因でそれらの結合サイトが阻害された場合、思いがけない薬効の増強が生じ、有害反応を引き起こす可能性が高い。
【０００３】
したがって、これらの蛋白分子上の結合サイトの薬物結合性を結合サイト特異性薬物（結合サイト特異性プローブ）でモニターすることができれば、こうした問題を防ぐことなどが可能であり有用である。
生体試料を含めた試験試料を自動的に分析・測定するシステム・装置が開発され、臨床上に利用されている。こうしたシステム・装置としては、アボットIMx アナライザー、アボットTDx アナライザー、アボットTDxFLxアナライザー(Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA) といった薬物血中濃度測定システム、自動免疫測定システムなどが挙げられる（米国特許第5,358,691 号明細書）。該自動測定機器は、多数の試験試料（検体）を処理することが可能であり、それを利用しての一層の臨床データの有効利用が求められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
血清蛋白結合性が高い種々の薬物は、様々な蛋白の特定の結合サイトに結合するが、該薬物は、該蛋白の単一あるいは複数のサイトに結合する。そしてその結合状態などが変化すると、該薬物の薬効も変化する。特に重篤な肝・腎障害の時ほどその変化が大きくなる。
したがって、患者血清中の種々の血清蛋白質の薬物結合サイトの結合性を迅速に定量することが求められている。
しかしながら、多剤併用療法により多剤投与が施行されたり、重度の肝・腎障害により内因性物質が蓄積している患者の血清などにおいては、どの結合サイトに結合する薬物の遊離濃度の増大（結合阻害）がどの程度生じるのかは、血清中から直接簡便な方法で迅速に分析し予測を行うことは、現実には不可能であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、患者血清中の種々の血清蛋白質の薬物結合サイトの結合性を迅速に定量することを可能にする薬物セット並びにそれら薬物を測定する測定試薬キット、該薬物セット並びに測定試薬キットに対応する改良型測定装置に関する。
典型的な態様では、本発明は
〔１〕 薬物に対する結合サイトを有している蛋白質含有液体と該蛋白質の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブとを接触せしめ、該処理された蛋白質含有液体中の遊離のサイト特異性プローブを定量的に測定し、得られた遊離のサイト特異性プローブの量と該蛋白質の結合サイトにおける薬物の特異的結合性の程度とを相関せしめて該蛋白質の結合サイトの薬物に対する結合性を診断することを特徴とする薬物の薬学的分布診断法；
〔２〕 薬物に対する結合サイトを有している蛋白質の複数を対象として該蛋白質の結合サイトの薬物に対する結合性を診断することを特徴とする〔１〕記載の薬物の薬学的分布診断法；
【０００６】
〔３〕 蛋白質の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブの複数に関して、薬物に対する結合サイトを有している蛋白質含有液体と該サイト特異性プローブとを接触せしめ、該処理された蛋白質含有液体中の遊離のサイト特異性プローブを定量的に測定し、複数の測定結果に基づいて、得られた遊離のサイト特異性プローブの量と該蛋白質の結合サイトにおける薬物の特異的結合性の程度とを相関せしめることを特徴とする〔１〕又は〔２〕記載の薬物の薬学的分布診断法；
〔４〕 薬物に対する結合サイトを有している蛋白質が、血清蛋白質であることを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載の薬物の薬学的分布診断法；
【０００７】
〔５〕 (i) 下記 (A)、(B) 及び(C) を使用して、生物由来検体と該 (A)、(B) 及び(C) から成る群から選ばれたものとを接触せしめ、該処理された検体中の遊離のサイト特異性プローブを定量的に測定し、得られた遊離のサイト特異性プローブの量と該蛋白質の結合サイトにおける薬物の特異的結合性の程度とを相関せしめて該蛋白質の結合サイトの薬物に対する結合性を診断する：
(A) ヒト血清アルブミン (HSA)の結合サイトI に対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(B) HSA の結合サイトIIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(C) α1-酸性糖蛋白質 (AGP)の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ;
(ii) 下記 (a)、(b) 及び(c) を使用して、生物由来検体と該 (a)、(b) 及び(c) から成る群から選ばれたものとを接触せしめ、該処理された検体中の遊離のサイト特異性プローブを定量的に測定し、得られた遊離のサイト特異性プローブの量と該蛋白質の結合サイトにおける薬物の特異的結合性の程度とを相関せしめて該蛋白質の結合サイトの薬物に対する結合性を診断する：
(a) HSA の結合サイトI に対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(b) HSA の結合サイトI 及びIIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(c) AGP の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ; 又は
(iii) 下記 (1)、(2) 、(3) 及び(4) を使用して、生物由来検体と該 (1)、(2) 、(3) 及び(4) から成る群から選ばれたものとを接触せしめ、該処理された検体中の遊離のサイト特異性プローブを定量的に測定し、得られた遊離のサイト特異性プローブの量と該蛋白質の結合サイトにおける薬物の特異的結合性の程度とを相関せしめて該蛋白質の結合サイトの薬物に対する結合性を診断する：
(1) HSA の結合サイトI に対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(2) HSA の結合サイトIIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(3) HSA の結合サイトI 及びIIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(4) AGP の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
ことを特徴とする〔１〕〜〔４〕のいずれか一記載の薬物の薬学的分布診断法；
【０００８】
〔６〕 薬物に対する結合サイトを有している蛋白質含有液体と該蛋白質の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブとを接触せしめ、該処理された蛋白質含有液体中の遊離のサイト特異性プローブを定量的に測定し、得られた遊離のサイト特異性プローブの量と該蛋白質の結合サイトにおける薬物の特異的結合性の程度とを相関せしめて該蛋白質の結合サイトの薬物に対する結合性を診断する薬物の薬学的分布診断法に使用されるサイト特異性プローブ又はそのセットであって、蛋白質の結合サイトに対して特異的結合性を有していることを特徴とするサイト特異性プローブ又はそのセット；及び
【０００９】
〔７〕 (i) 下記 (A)、(B) 及び(C) から成るセット：
(A) アルブミン (HSA)の結合サイトI に対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(B) HSA の結合サイトIIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(C) α1-酸性糖蛋白質 (AGP)の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ;
(ii) 下記 (a)、(b) 及び(c) から成るセット：
(a) HSA の結合サイトI に対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(b) HSA の結合サイトI 及びIIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(c) AGP の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ; 又は
(iii) 下記 (1)、(2) 、(3) 及び(4) から成るセット：：
(1) HSA の結合サイトI に対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(2) HSA の結合サイトIIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(3) HSA の結合サイトI 及びIIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(4) AGP の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
であって、生物由来検体と該セットのサイト特異性プローブとを接触せしめ、該処理された検体中の遊離のサイト特異性プローブを定量的に測定し、得られた遊離のサイト特異性プローブの量と該蛋白質の結合サイトにおける薬物の特異的結合性の程度とを相関せしめて該蛋白質の結合サイトの薬物に対する結合性を診断することのできるものであることを特徴とする〔６〕記載のサイト特異性プローブ又はそのセットを提供する。
【００１０】
かくして、本発明は、薬物の薬学的分布診断法並びにそれに使用する試薬、さらには試薬セットや試薬の組合せキットも提供される。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
薬物に対する結合サイトを有する蛋白質の結合サイトについては、薬物とHSA あるいはAGP というように、単一の蛋白で研究されるにとどまり、例えば血清中で生ずる薬物蛋白結合性をサイト毎に正しく評価できなかった。これは、薬物は必ずしも単一の血清蛋白質のみと結合しているわけではないからである。例えば、HSA 及びAGP の両方に主に結合するような薬物では、たとえそのサイトが同定してあっても、そのような薬物の結合性は、それぞれの蛋白質の結合サイトの結合性を評価できなければ、正確な推測は不可能である。かくして、本発明では、こうしたHSA 及びAGP の両方の結合サイトの結合性の程度を同時に比較検討することを可能にするものであり、これにより両蛋白質に結合する薬物の結合度合の推測をも可能にするものである。
【００１２】
こうしたことから、例えば、HSA 分子上のサイトI にしか結合しないことが判明している薬物では、どの程度の結合の変化があるかについて、その推測をかなりの程度正確になすことを可能にする。本発明では、結合サイトの不明な薬物についても、簡便にその結合サイトを同定できるキットを提供できる。
本発明では、種々の蛋白質の薬物結合サイトの結合性を血清そのもので同時に評価することを可能にしており、蛋白結合性の高い薬物の血清蛋白結合性を類推したり、評価することを可能にしている。また、本発明では、少なくともHSA 及びAGP の両方の結合サイトの結合性の程度を同時に患者血清からモニターできるプローブ的薬物と最適な組み合わせを提供することを可能にしており、動態変化を捕らえるツールを提供するものである。
【００１３】
本明細書において「検体」としては、薬物に対する結合サイトを有している蛋白質を含有していることが予想される材料が挙げられる。該検体は、当該蛋白質の存在している生体試料から得られたものをそのまま使用してもよいし、予め前処理してその試料の性状などを変えたものであってもよい。検体としては、例えば血液、血清、血漿、リンパ液、唾液、髄液、尿、乳、腹水、細胞外浸出液、細胞ホモジュネート、組織ホモジュネート、細胞抽出液、組織抽出液などの細胞・組織由来のものを含めた生理的な体液などの生物学的な試料から得られたものが挙げられる。検体はその使用の前に前処理をされることができ、例えば血液から血清を調製するとか、粘性の高い液体を希釈するとか、組織・細胞から抽出液を作成するなどの処理をされていてよい。該処理としては、濾過、留去、濃縮、妨害物質の不活性化、試薬の添加などが挙げられる。
【００１４】
本明細書において「薬物」とは、生物学的な活性を期待されて利用されるものであればなんら制限はないが、例えば治療目的で投与されるものなどが挙げられる。該薬物としては、有機化合物、蛋白質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、抗生物質、治療薬、それらの代謝物などが挙げられる。該薬物としては、代表的には生体蛋白質に存在する結合サイトに結合する活性を有するものあるいは該結合サイトに結合する部位を少なくとも一つ有するものが挙げられる。該薬物としては、天然に存在する結合性を有する構成体に対する如何なるものであってもよいし、結合性を有する構成体を調製することが可能なものが好ましい。
本明細書において「薬物に対する結合サイトを有している蛋白質」としては、該薬物と結合する部位（サイト）を少なくとも一つ有するものが挙げられる。該結合サイト保有蛋白質は、特異的に当該薬物と結合する結合サイトを有するものが好ましく、該結合サイトは当該蛋白質中に一箇所あるいは複数の箇所存在していてよいし、該結合サイトのうちの一つは、複数の薬物とそれぞれ結合する活性を有しているものであってよい。該結合サイト保有蛋白質は、特に制限されないが、生体に存在するものが挙げられ、例えば血清蛋白質、血漿蛋白質、組織蛋白質、レセプター、膜蛋白質などが挙げられる。代表的な結合サイト保有蛋白質としては、ヒト血清アルブミン (HSA)、α1-酸性糖蛋白質 (AGP)、IgG, IgA, IgM 等のγ−グロブリンなどが挙げられる。 HSAには複数の薬物結合サイトが存在することが知られており、例えば以下のサイトに以下記載のような薬物が結合することが知られている:
【００１５】
HSA 分子上の結合サイト
1) サイトI : ワルファリン、フェニルブタゾン、ダンシル−Ｌ−アスパラギン、フェニトイン、アザプロパゾン、バルプロ酸、ジクマロール、インドメタシンなど
2) サイトII :ジアパム、L-トリプトファン、ダンシルサルコシン、イブプロフェン、バルプロ酸、サリチル酸、ジクマロール、インドメタシンなど
3) サイトIII : ジギトキシンなど
4) ビリルビンサイト：ビリルビンなど
また、AGP では、例えば以下のサイトに以下記載のような薬物が結合することが知られている:
AGP 分子上の結合サイト
1) 塩基性薬物結合サイト: ベラパミル、クロルプロマジン、ジソピラミド、リドカインなど
2) 酸性薬物結合サイト: ジクマロールなど
3) 酸・塩基共通サイト: プロプラノロールなど
【００１６】
使用プローブ薬物としては、その薬物同志の交叉反応により当該測定に悪影響を与えないものを組み合わせることが好ましい。
代表的な場合、フェニトイン、バルプロ酸及びジソピラミドの組合せ、フェニトイン、バルプロ酸、ジアゼパム及びジソピラミドの組合せなどが挙げられる。
例えば、HSA 分子上の結合サイト、すなわち、サイトI 、サイトII、サイトIII などに特異的に結合する薬物を任意に選択し、同様にAGP 分子上の結合サイトすなわち、塩基性薬物結合サイト、酸性薬物結合サイトなどに特異的に結合する薬物を任意に選択し、それらのうちの複数のものを使用し、好適には複数の結合サイトにつき、その結合性（結合阻害）を定量することが挙げられる。
薬物としては、公知のものであってもあるいは新規なものであってもよいが、生体に存在する結合サイトを有する蛋白質に結合するものが挙げられ、例えば、メルク・インデックス (Susan Budavari (Ed.), The Merck Index: an encyclopedia of chemicals, drugs, and biologicals, 13th Edition, Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories Division of Merck, 2001) などに記載のものなどが挙げられる。
【００１７】
測定装置は、多数の検体を連続して自動化された操作で測定できるものが好ましく、例えばアボットTDxFLxアナライザー(Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA) といった薬物血中濃度測定システム、アボットIMx アナライザーといった自動免疫測定システムなどが挙げられる、さらに米国特許第5,358,691 号明細書などに記載のものあるいはそれを改良したものが挙げられる（なお、米国特許第5,358,691 号明細書の記載内容は本明細書において援用され、該文献を参照することにより、本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである）。本明細書において測定装置は、血清から得られた濾液を分注できるものが好ましい。測定対象物は、微量であることから、低濃度のものも測定可能であることが好ましい。
【００１８】
本発明においては、米国特許第5,358,691 号明細書の記載あるいはその他の公知文献に記載と同様に、検知あるいは測定されるべき化合物あるいは組成物であって、少なくとも一つのエピトープあるいは結合サイトを有する化合物あるいは組成物をアナライトとしているアッセイが利用できる。該アナライトとしては、天然に存在する結合性を有するものに対するようないかなるものであってもよく、またそれに対して結合性を有するものを作成することができるようなものが挙げられる。該アッセイにおいては、アナライトのアナログ体も利用される。該アナライトのアナログ体は、アナライト自体より程度として大きいかあるいは少ないといった違いはあるが、アナライトに特異的に結合する性質を有するものと交叉反応するような物質である。該アナライトのアナログ体としては、修飾されたアナライト、アナライト分子から誘導されたフラグメントあるいはその一部を合成したものなどが挙げられ、当該アナライトに共通するエピトープサイトの少なくとも一部を有しているものが好ましい。
【００１９】
上記「結合性を有するもの」としては、結合対をなす一方のものを指し、例えば二つの異なる分子がある場合、その一方の分子がもう一方の分子に化学的あるいは物理的に特異的結合をするような関係のその一方の分子をいう。こうした結合対をなすものとしては、特に制限されないが、例えば抗原と抗体の結合対をなすもの、ビオチンとアビジン、糖類とレクチン、相補的なヌクレオチド配列、相補的なペプチド配列、エフェクター分子とレセプター分子、補酵素と酵素、酵素阻害剤と酵素、ペプチド配列とその配列あるいはその配列を含有する蛋白質に特異性を持つ抗体、酸性物質と塩基性物質、色素と蛋白質結合体、ペプチドとそれに特異的に結合する蛋白質などが挙げられる。該結合対をなすものとしては、さらに、その元々の結合性を有するもののアナログであるものであってもよく、例えば遺伝子組換え技術あるいはバイオエンジニアリング技術を駆使して作成されたものなどが挙げられる。該結合性を有するものとしては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、組換え蛋白質、融合蛋白質、キメラ蛋白質、それらの混合物あるいは断片、当該分野で当業者に知られているものなどが挙げられる。
【００２０】
上記アッセイにおいては、検知可能なものを利用することができ、そうしたものとしては、例えば物理的あるいは化学的に検知することが可能な性質を持っているような基あるいは化合物のうちのいかなるものであってもよく、好適に上記結合性を有するものを標識して、それと一緒になったコンジュゲートを生成するものが挙げられる。こうした化学的に検知可能なものとしては、例えば酵素、酵素基質、補欠分子団、補酵素などの酵素学的に活性を有するもの、スピンラベル、蛍光物質あるいは蛍光源、発色物質あるいは発色源、化学発光剤や生物発光剤などの発光物質、ビオチン−アビジンなどの相互に結合可能なリガンド、トキシン類、ハプテン類、電気的あるいは磁気的に活性なもの、DNA 、RNA 、ポリサッカライド類、ポリペプチド類、リポソーム類、着色粒子、マイクロパーティクル、金属コロイド、無機コロイドなどが挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００２１】
上記アッセイにおいては、当該分野で知られている様々な測定・検知システムを利用してそのアッセイを行うことができ、例えば分光光学的吸光度アッセイ、タービディメトリックアッセイ、ネフェロメトリックアッセイ、放射エネルギー中和アッセイ、イオン捕獲アッセイ、発色アッセイ、蛍光アッセイ、電気化学的検出システム、電圧あるいは電流検知システム、イムノアッセイなどが挙げられるが、それに限定されるものではない。イムノアッセイでは、例えば蛍光偏光イムノアッセイ (FPIA) 、競合イムノアッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、イムノメトリックアッセイなどが挙げられ、不均一系あるいは均一系を使用したアッセイ法が包含されるが、それに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の薬学的分布診断法では、同時に、血清中の総蛋白、遊離脂肪酸(Free Fatty Acid: FFA)、HSA 濃度、AGP 濃度などを測定できるものが好適に使用できる。また、薬物結合サイトの結合性測定キットは、以下の構成を有しているものが好ましい：
1) HSA及びAGP （好ましくは容易に溶解可能な粉末状のもの）含有容器（例えば、プラスチックチューブなど）並びに所要のサイト特異性プローブの全部あるいは一つを含有する液とがセットとなっているもの；
2) HSA、AGP 及びγ- グロブリン（好ましくは容易に溶解可能な粉末状のもの）含有容器（例えば、プラスチックチューブなど）並びに所要のサイト特異性プローブの全部あるいは一つを含有する液とがセットとなっているもの；及び
3) 上記1)あるいは2)の容器が限外濾過器であるものと所要のサイト特異性プローブの全部あるいは一つを含有する液とがセットとなっているもの。
【００２３】
本発明の特徴の一つは、病態の悪化している患者のHSA 及びAGP における種々の結合サイトの蛋白結合阻害を的確に判断することで、蛋白結合依存性の高い薬物の投与量軽減のための投与タイミングを敏速に把握できることである。また、本発明の別の特徴は、患者血清から種々のサイトへの大きな結合阻害が見つかった場合、蛋白結合の特性上、その物質は多量に存在することになり、代謝阻害への関与の可能性をも予測することができることである。言い換えると、これまで、目的薬物（特定結合サイトのみ）の蛋白結合阻害だけを追った場合、当然、その他のサイトに結合しているものを感知できないために、未知の蛋白結合阻害物質は存在しないと判断してしまう。よって、未知の大量の代謝阻害物質を見逃すことにつながり、誤った薬物投与法を行う可能性が高くなる。
本発明にしたがえば、生体内蛋白質の結合サイトの薬物結合性を的確に診断できるので、当該薬物の投与量を最大限に軽減し、最適な効き目を患者に供与することを可能にする。このことは、難治性患者治療はもちろんのこと集中治療室で管理されている重症患者に対しても薬物の過量投与を防ぎ、一転して安全且つ有効性の高い前向きの投与設計につながることを意味する。
【００２４】
臨床での薬物の効き目や有害反応を考える場合、代謝を中心に考えなければならない。しかしながら、代謝能がほぼなくなっている重症な肝障害の段階においては、未変化体薬物の動態を考えることと同じになる。この様な病態時に、投与予定薬物の結合サイトに思いがけない結合阻害が生じている場合には薬効の増強に注意を払い慎重な薬物投与を行わねばならない。従って、蛋白結合性の高い薬物の組織移行性は蛋白結合の変化に大きく依存してくる可能性が高いため、その時の蛋白結合阻害を的確に血清から判断することは、重症患者に対する副作用を軽減し有効な薬物投与を行うための一助になる。
逆に、結合阻害薬を積極的に使用し、患者に対し効率よい薬物治療を行う場合に於いても、その最適な阻害タイミングがつかめるため、そのような結合阻害薬（補助薬）を最小量で最大の効果を生み出すための方法として使える。これはまさに画期的な薬学的分布診断法として、前向きな薬物投与設計を企図する場合に役立てることもできる。さらには、本診断を遂行することで、的確な代謝診断を行うことにもつながることは疑う余地がない。現在までのところ本診断法を用い患者個々の薬物の組織移行性を推測し投与設計を行う薬物治療法は皆無である。特に、本診断法は重篤な肝・腎障害を有する患者に対し、より有効な薬物投与設計を見出せる点において他に例を見ない特色を有する。
本発明に従えば、血清蛋白質と薬物との結合性の評価診断を可能にする。また、組織蛋白質と薬物との結合性の評価診断をも可能にする。かくして、患者血清中の種々の血清蛋白質の薬物結合サイトの結合性を迅速に定量評価する薬物の組合せ、それらの薬物を測定する試薬キット、例えばモノクローナル抗体を利用した試薬キット、さらにはそれに対応できる改良された測定機器が提供されることは明らかである。該キットは、上記した自動化された測定装置に適合できるようにされているもので、例えば検体を収容できる区画、測定試薬を収めた区画、希釈液などを収めた区画などを備えた容器に入れられているものであってよい。
さらに、複数の結合サイトについて測定を実施できる形態のもの、異なる結合サイトに対して特異的結合性を有している複数のサイト特異性プローブを使用するような形態のもの、HSA のサイトI に対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブと該サイトI とは異なるサイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブとを使用することを可能にする形態のもの、異なるサイト間で、そのプローブの遊離物の量を比較評価できる形態のものなど、その目的に合致した形態とすることができ、それらも本発明の特徴と見なしてよい。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
【００２６】
実施例１
患者血清中のHSA 及びAGP の双方の結合サイトにおける結合性を決定する。 採取された患者血清の一定量をファルコンチューブに入れ、次にそれに一定濃度のサイト特異性プローブ薬物を混合する。サイト特異性プローブ薬物としては、バルプロ酸(HSAのサイト I及びサイトII) 、フェニトイン(HSAのサイト I) 、ジアゼパム(HSAのサイトII) 、及びジソピラミド(AGPの塩基性薬物結合サイト) を使用した。得られた血清試料 0.5〜1 mlを限外濾過器にかけて、処理した（限外濾過時間は 10 〜15分間とした) 。得られた濾液を測定装置 TDXFLX （アボット社、米国）にセットし、測定を行った。なお、ジアゼパムのみは島津製作所製6AシリーズのHPLCにて測定した。測定試薬は、TDXFLX用の使用したサイト特異性プローブ薬物に対応した試薬（アボット社、米国）を当該測定装置にセットした。測定は同一の患者につき朝に採取した血清と夕方に採取した血清との両方につき行い、プローブ薬物の遊離濃度及び血清蛋白・FFA の濃度の変化を調べた。得られた結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
結果、同一患者において、各サイトの薬物に対する結合性に変動が認められる。本例では、朝採取した血清と夕方採取した血清との間で、HSA のサイトIIのためのサイト特異性プローブ薬物であるバルプロ酸及びジアゼパムの遊離体の量が、変動していることが認められることから、この患者の場合、HSA のサイトIIにおけるサイト結合性をサイトII結合特異性プローブでモニターすることは薬学的分布診断において重要であると判断される。つまり、サイトII結合阻害時にHSA のサイトIIに結合する治療薬（特に分布容積小さい、あるいはターゲッティング性の高い、あるいは代謝されない治療薬が望ましい。剤形としては注射や坐薬のような急激に血中に移行できるものが良い。）の効果を少量で上げることが可能になる。当然、投与量を軽減しているので、薬物の主な排泄臓器である肝・腎臓の障害を回避できる可能性が高くなる。
同様に、各種の血清蛋白の結合サイトに対するプローブ薬物を使用して、各結合サイトにおける薬物の結合性（結合阻害）の程度を測定することにより、それぞれの結合サイトにおける結合阻害度を推測できるばかりでなく、患者の種々の血清蛋白質の質的・量的変化や投与薬物の動態（薬物の組織移行性あるいは分布なども包含される）を把握することが可能となり、さらに結合性の高い内因性物質や投与薬物より誘導される結合性の高い未知の代謝物の存在量の変化、加えて患者の結合蛋白の変異体の存在に関しても、プローブの蛋白結合阻害の度合及び各種蛋白質・FFA 等の変動を調べることで割り出すことが可能となる。
【００２９】
同時に、患者血清中の薬物の種類、総蛋白、FFA 、HSA 濃度、AGP 濃度などを使用することができ、そうすることにより、より的確な診断データとなる。
患者血清中にその結合サイトに対するプローブ薬物の結合性に大きく関わる内因性物質や薬物及びその代謝物があまり存在しなければ、特にはAGP の濃度変化のモニターに使用できて有用である。
また、HSA あるいはAGP に結合する薬物によっては置換し難い新たな結合サイトを見いだすことを可能にせしめる。さらに、これら薬物の遊離濃度をモニターすることにより、HSA あるいはAGP の正確な濃度変化をモニターすることも可能である（該薬物の遊離濃度は、常に、HSA あるいはAGP の濃度に依存して変化する）。
【００３０】
実施例２
結合サイトの同定されていない薬物に関する、種々の蛋白におけるサイトの決定
蛋白組成が既知の血清（例えば、同一ロットのプール血清または同一の健常人より得られた血清など）の一定量（例えば、0.5 〜1 ml) を、三つのファルコンチューブに入れ、次にそれに一定濃度の結合サイトの同定されていない薬物を混合する。さらに、これに一定濃度のサイト特異性プローブ薬物を混合する。サイト特異性プローブ薬物としては、バルプロ酸(HSAのサイト I及びサイトII) 、フェニトイン(HSAのサイト I) 、ジアゼパム(HSAのサイトII) 、及びジソピラミド(AGPの塩基性薬物結合サイト) を使用した。得られた血清試料 0.45 〜0.95 ml を限外濾過器にかけて、処理した（限外濾過時間は 10 〜15分間とした) 。得られた濾液を測定装置 FLX（アボット社、米国）にセットし、測定を行った。なお、ジアゼパムのみは島津製作所製6AシリーズのHPLCにて測定した。測定試薬は、 FLX用の使用したサイト特異性プローブ薬物に対応した試薬（アボット社、米国）を当該測定装置にセットした。測定は結合サイトの同定されていない薬物の添加量毎に行い、プローブ薬物の遊離濃度の変化を調べた。得られた結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
結果、本結合サイトの同定されていない薬物（サラゾスルファピリジン）の添加量が増大するにつれ、HSA のサイト Iに特異性を有するサイト特異性プローブ薬物であるフェニトインの遊離量が増加することから、当然、サイトI 及びIIをモニターしているバルプロ酸の遊離量は増大し、本試験薬物の結合サイトは、HSA のサイト Iあるいはその近傍と診断される。
【００３３】
実施例３
FFA-ジクロフェナック坐薬療法
FFA は空腹時に上昇することより、その時のサイトIIの阻害度合を把握することでジクロフェナック坐薬（サイトII）の最適な投与設計ができる場合がある（食事時間の制限を一定時間帯に設けることでFFA の濃度をある程度調節できる）。
年齢・性別：６８歳 女性
病名：慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性膝関節症（左人工関節置換術）
主訴：全身関節痛およびリウマチ熱による発熱
経緯：整形外科入院中、ジクロフェナック坐薬（50mg）を朝のこわばりと痛みに対し7:00と夕方近くに出るリウマチ熱のために15:00 前後に投与していたが、リウマチ熱のおさまりが悪かった。
【００３４】
【表３】
上述データからの薬学的分布診断を解説する。空腹時6:00はFFA が上昇し、やや満腹時10:00 はFFA が低下している。本患者のHSA 値が比較的低かったことに起因してFFA 濃度の高低でサイトII領域（ジアゼパム及びバルプロ酸）の結合阻害が生じることが判明した。ジアゼパムの阻害程度は1.5 倍であった。従って、リウマチ熱発症前になるべく空腹になるように間食をなくしてもらうことで、FFA の増大が見込めジクロフェナック坐薬50mgを25mgに減量して投与してもジクロフェナックの組織移行性は増すことにより十分鎮痛効果はあるものと判断した。結果はジクロフェナック坐薬25mgでリウマチ熱を抑えるに至った。同時に早朝（空腹時）7:00のジクロフェナック坐薬の効き目に関してもFFA 上昇によりサイトIIが阻害されているためジクロフェナック坐薬50mgから25mgに減量しても良好な鎮痛効果を得るものと考え施行した結果、予測通りの効果を得るに至り疼痛コントロールができた。
本診断法を用いてジクロフェナック坐薬50mgを２個（朝及び夕方前に１個ずつ）から25mgを２個（朝及び夕方前に１個ずつ）に減量し、良好な鎮痛コントロールが可能となった。
ここで分かる通りフェニトイン（サイト I）の阻害程度は低い。従ってサイトI に関与する薬物は利用しにくい。
AGP 塩基薬物結合サイトのプローブであるジソピラミド阻害濃度は0.38〜0.84μg/mlと著しく増大されている。これはAGP の濃度の242 から154 mg/dl に減少したためである（このようにAGP の濃度の増減も予測できる場合が多い。なぜならばAGP の結合に生体内で影響を与える薬物や内因性物質は非常に少ないためである）。もしジソピラミド阻害濃度に変化がない場合、未知のAGP 塩基薬物結合サイトの阻害物質が6:00の血清中（サンプル）に存在することになる。
【００３６】
実施例４
ナブメトン-FFA- ジクロフェナック坐薬療法
FFA 濃度の上昇のみのサイトII阻害効果だけでは鎮痛効果が十分でない場合に用いる。
年齢・性別：７３歳 女性
病名：慢性関節リウマチ（ＲＡ）、頸椎垂直性脱臼（後頭骨頸椎後方固定術）
主訴：手指および手足の四肢の痛み（ほぼ全身の痛み）
経緯：ジクロフェナック坐薬50mgと25mgを早朝と夕で投与しており、坐薬の効果がなくなってくると痛くなってくるという生活を続けていた（早朝・夕頃が痛い）。最近は坐薬を投与しても痛みが治まりにくいこともあった。また、坐薬を肛門内に挿入している時、坐薬50mgサイズも大きいこともあり肛門内挿入時の痛みも訴えられていた（挿入時痛いと挿入後数時間痛い）。
【００３７】
【表４】
上述データからの薬学的分布診断を解説する。昼食後(12:30〜13:00)ナブメトン錠２錠(800mg) を服用させた後４〜５時間経過時(17:50) がナブメトンの活性代謝物（ナブメトン錠によるサイトII阻害効果はナブメトンの活性代謝物である6-メトキシ-2- ナフチル酢酸（略号6MNA）である）の最高血中濃度であることから、ジアゼパム（HSA のサイトII）の阻害程度をナブメトン錠２錠服用前(5:00)と比較すると明らかに２倍以上である。ここで注目すべきは、FFA の濃度が減少（FFA 濃度の減少はサイトIIの阻害程度が下がる）しているにも関わらず6MNAの阻害効果は十分にでていることである。フェニトイン（HSA のサイト I）の阻害(17:50) も観察されるが 1.3倍程度でありサイトIIの結合阻害に着目すべきである。従って、これまで、朝5:00頃と夕方 17:00〜18:00 の間にそれぞれ２回投与されていたジクロフェナック坐薬50mgと25mgを25mgと12.5mgに減量しても組織移行性は増大することより痛みをコントロールできると判断し、ナブメトンジクロフェナック坐薬療法を施行した。その結果、徐々に痛みのコントロールがなされ、夕方近くまでの痛みが軽減されるに至った。本療法により、ジクロフェナック坐薬のサイズを大型のものから小型のものに変更でき肛門挿入時の痛みは若干改善され、当然のことながら坐薬の投与量を削減できた。
フェニトインの阻害程度が 1.3倍であることより、サイト I系の多量の未知の結合物質が存在する可能性が高いと判断できる（TP、HSA 、AGP の変動がないことと、FFA はこの濃度ではサイト Iを阻害できない）。
AGP 塩基薬物結合サイトのプローブであるジソピラミドの遊離濃度の変動がないことよりAGP の濃度変動はないと判断できる（AGP の濃度の変動予測可能）。
ジクロフェナック坐薬の鎮痛効果は大きい。しかしながら長期高用量投与は主に肝臓・腎臓障害の副作用が出やすいので、一般に副作用の低い（安全性の高い）ナブメトン錠を用いてジクロフェナック坐薬の用量を下げた方がよい。
【００３９】
【発明の効果】
本発明は、血清蛋白の薬物結合サイトの阻害の程度を最適に評価する方法、それに使用する結合サイト特異性プローブ薬物、さらに自動血中薬物濃度測定装置を使用した薬学的分布診断法並びにそれに基づく薬物選択法及び治療法を提供している。本発明は、血清蛋白の薬物結合サイトの結合性をモニタリングできる試薬系をも提供し、結合サイト間での相互作用の検討、最適な結合サイト特異性プローブ薬物による薬物の組織移行性の迅速且つ簡便な予測法を提供する。本発明により、薬物の分布診断法を構築でき、適正な薬物療法を確立でき、治療診断を効率よく安全に行うことが可能となる。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a pharmaceutical distribution diagnostic method for quickly predicting a tissue migration change of a drug, and a drug selection method and a therapeutic method based on the method.
[0002]
[Prior art]
Blood not only circulates in the body and transports necessary oxygen and nutrients to every corner of the body, but also carries important functions such as transporting waste products, but it contains various serum proteins. ing. Each of these various serum proteins has unique properties and functions, and each of the various serum proteins has a drug binding site (drug binding site). For example, typical serum proteins such as human serum albumin (HSA) and α 1 -Acidic glycoprotein (AGP) is a serum protein known to bind to drugs.
It is recognized that the strength and weakness of the pharmacological effect in the living body largely depend on the amount of drug transferred to the target tissue or target site. One of the main regulators of the drug's tissue transportability (degree of distribution) is serum protein binding. Various types of serum proteins are known. Among them, human serum albumin (HSA) and α mainly affect the protein binding of drugs. 1 -Acidic glycoprotein (AGP) and the like. Each such protein has a drug binding site on the protein molecule. In general, it is said that the number of main binding sites is, for example, about 4 for HSA and about 3 for AGP.
If these binding sites are blocked for some reason, an unexpected increase in efficacy is likely and an adverse reaction is likely to occur.
[0003]
Therefore, if the drug binding properties of the binding sites on these protein molecules can be monitored with a binding site specific drug (binding site specific probe), it is possible to prevent such problems and the like.
Systems and devices for automatically analyzing and measuring test samples including biological samples have been developed and used clinically. Examples of such systems and devices include drug blood concentration measurement systems such as Abbott IMx Analyzer, Abbott TDx Analyzer, Abbott TDxFLx Analyzer (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA), and automatic immunoassay systems (US Pat. No. 5,358,691). Issue description). The automatic measuring instrument is capable of processing a large number of test samples (specimens), and more effective use of clinical data is required by using the automatic measurement instrument.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Various drugs with high serum protein binding bind to specific binding sites of various proteins, but the drugs bind to single or multiple sites of the protein. When the binding state or the like changes, the drug efficacy of the drug also changes. In particular, the change becomes more severe with severe liver and kidney disorders.
Therefore, there is a need to rapidly quantify the binding properties of drug binding sites of various serum proteins in patient serum.
However, in the serum of patients who have been administered multiple drugs by multiple drug combination therapy, or who have accumulated endogenous substances due to severe liver / kidney disorders, the free concentration of the drug that binds to any binding site ( In reality, it has been impossible to quickly analyze and predict how much (binding inhibition) occurs from serum directly by a simple method.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present invention is compatible with a drug set that enables rapid quantification of the drug binding sites of various serum proteins in patient serum, a measurement reagent kit for measuring these drugs, the drug set, and a measurement reagent kit. The present invention relates to an improved measuring apparatus.
In an exemplary embodiment, the present invention provides
[1] A protein-containing liquid having a binding site for a drug and a site-specific probe having a specific binding property to the binding site of the protein are brought into contact with each other in the treated protein-containing liquid. The amount of the free site-specific probe obtained was quantitatively measured, and the amount of the obtained free site-specific probe was correlated with the degree of specific binding of the drug at the binding site of the protein. A method for diagnosing the pharmaceutical distribution of a drug, comprising diagnosing the binding of the drug to
[2] The method for diagnosing the pharmaceutical distribution of a drug according to [1], wherein a plurality of proteins having a binding site for the drug are diagnosed and the binding property of the binding site of the protein to the drug is diagnosed;
[0006]
[3] With respect to a plurality of site-specific probes having specific binding properties to a protein binding site, the protein-containing liquid having a drug binding site is brought into contact with the site-specific probe; The free site-specific probe in the treated protein-containing liquid is quantitatively measured. Based on a plurality of measurement results, the amount of the obtained free site-specific probe and the amount of the drug at the binding site of the protein are measured. A method for diagnosing a pharmaceutical distribution of a drug according to [1] or [2], which correlates with the degree of specific binding;
[4] The method for diagnosing a pharmaceutical distribution of a drug according to any one of [1] to [3], wherein the protein having a binding site for the drug is a serum protein;
[0007]
[5] (i) Using the following (A), (B) and (C), contact the biological specimen with one selected from the group consisting of (A), (B) and (C) The amount of the free site-specific probe obtained and the degree of specific binding of the drug at the protein binding site are measured quantitatively by measuring the free site-specific probe in the treated specimen. Correlate to diagnose binding of the protein binding site to the drug:
(A) Site-specific probe having specific binding property to binding site I of human serum albumin (HSA)
(B) Site-specific probe with specific binding to HSA binding site II
(C) α 1 A site-specific probe having specific binding properties to the binding site of acidic glycoprotein (AGP);
(ii) using the following (a), (b) and (c), bringing the biological specimen into contact with the one selected from the group consisting of (a), (b) and (c), Quantitatively measure the free site-specific probe in the treated specimen and correlate the amount of free site-specific probe obtained with the degree of specific binding of the drug at the protein binding site. Diagnose the binding of the protein binding site to the drug:
(a) Site-specific probe having specific binding property to binding site I of HSA
(b) Site-specific probe having specific binding properties to HSA binding sites I and II
(c) a site-specific probe having specific binding properties to the binding site of AGP; or
(iii) Using the following (1), (2), (3) and (4), selected from the group consisting of the biological specimen and the (1), (2), (3) and (4) The amount of the free site-specific probe obtained and the specific binding of the drug at the binding site of the protein. Correlate with the degree of sex to diagnose the binding of the protein binding site to the drug:
(1) Site-specific probe with specific binding to HSA binding site I
(2) Site-specific probe with specific binding to HSA binding site II
(3) Site-specific probe having specific binding properties to HSA binding sites I and II
(4) Site-specific probe that has specific binding properties to the AGP binding site
A method for diagnosing the pharmaceutical distribution of the drug according to any one of [1] to [4],
[0008]
[6] A protein-containing liquid having a binding site for a drug and a site-specific probe having a specific binding property to the binding site of the protein are brought into contact with each other in the treated protein-containing liquid. The amount of the free site-specific probe obtained was quantitatively measured, and the amount of the obtained free site-specific probe was correlated with the degree of specific binding of the drug at the binding site of the protein. A site-specific probe or a set thereof for use in a method for diagnosing the pharmaceutical distribution of a drug for diagnosing its binding to a drug, characterized by having a specific binding property to a protein binding site A site-specific probe or set thereof; and
[0009]
[7] (i) A set consisting of (A), (B) and (C) below:
(A) Site-specific probe having specific binding properties to albumin (HSA) binding site I
(B) Site-specific probe with specific binding to HSA binding site II
(C) α 1 A site-specific probe having specific binding properties to the binding site of acidic glycoprotein (AGP);
(ii) A set consisting of (a), (b) and (c) below:
(a) Site-specific probe having specific binding property to binding site I of HSA
(b) Site-specific probe having specific binding properties to HSA binding sites I and II
(c) a site-specific probe having specific binding properties to the binding site of AGP; or
(iii) A set consisting of (1), (2), (3) and (4) below:
(1) Site-specific probe with specific binding to HSA binding site I
(2) Site-specific probe with specific binding to HSA binding site II
(3) Site-specific probe having specific binding properties to HSA binding sites I and II
(4) Site-specific probe that has specific binding properties to the AGP binding site
A biological specimen and the set of site-specific probes are contacted, and free site-specific probes in the treated specimen are quantitatively measured, and the obtained free site-specific probes The amount of the binding site of the protein at the binding site of the protein can be correlated to diagnose the binding property of the binding site of the protein to the drug according to [6] A site-specific probe or set thereof is provided.
[0010]
Thus, the present invention also provides a method for diagnosing a pharmaceutical drug distribution, a reagent used therefor, a reagent set, and a kit for combining reagents.
Other objects, features, excellence and aspects of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the following description. However, it is understood that the description of the present specification, including the following description and the description of specific examples and the like, show preferred embodiments of the present invention and are presented only for explanation. I want. Various changes and / or modifications (or modifications) within the spirit and scope of the present invention disclosed herein will occur to those skilled in the art based on the following description and knowledge from other parts of the present specification. Will be readily apparent. All patent documents and references cited herein are cited for illustrative purposes and are not to be construed as a part of this specification. is there.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Protein binding sites that have binding sites for drugs can only be studied with a single protein, such as drugs and HSA or AGP. For example, drug protein binding that occurs in serum cannot be evaluated correctly for each site. It was. This is because a drug is not necessarily bound only to a single serum protein. For example, for drugs that mainly bind to both HSA and AGP, even if the sites are identified, the binding properties of such drugs must be able to assess the binding properties of the respective protein binding sites. For example, accurate guessing is impossible. Thus, in the present invention, it is possible to simultaneously compare the degree of binding of both the binding sites of both HSA and AGP, and this makes it possible to estimate the binding degree of the drug that binds to both proteins. It is to make.
[0012]
This allows, for example, a drug that is known to bind only to Site I on the HSA molecule to be reasonably accurate in guessing how much the binding changes. . In the present invention, a kit that can easily identify a binding site of a drug with an unknown binding site can be provided.
In the present invention, it is possible to simultaneously evaluate the binding of drug binding sites of various proteins with serum itself, and it is possible to estimate and evaluate the serum protein binding of drugs with high protein binding. ing. In the present invention, it is possible to provide an optimal combination with a probe drug capable of simultaneously monitoring the binding degree of both HSA and AGP binding sites from patient serum, and a tool for capturing kinetic changes. It is to provide.
[0013]
In this specification, examples of the “specimen” include materials that are expected to contain a protein having a binding site for a drug. As the sample, a sample obtained from a biological sample in which the protein is present may be used as it is, or the sample may be pretreated and the properties of the sample may be changed. Samples include those derived from cells / tissues such as blood, serum, plasma, lymph, saliva, spinal fluid, urine, milk, ascites, extracellular exudate, cell homogenate, tissue homodulate, cell extract, tissue extract, etc. Those obtained from biological samples such as physiological fluids included. Specimens can be pre-treated before use. For example, preparation of serum from blood, dilution of highly viscous liquid, preparation of extract from tissues / cells, etc. Good. Examples of the treatment include filtration, distillation, concentration, inactivation of interfering substances, addition of reagents, and the like.
[0014]
In the present specification, the “drug” is not particularly limited as long as it is expected to have biological activity, and examples thereof include those administered for therapeutic purposes. Examples of the drug include organic compounds, proteins, peptides, microorganisms, amino acids, nucleic acids, hormones, steroids, vitamins, antibiotics, therapeutic agents, metabolites thereof, and the like. Examples of the drug typically include those having an activity of binding to a binding site present in a biological protein and those having at least one site binding to the binding site. The drug may be any drug that has a binding property that exists in nature, and is preferably capable of preparing a binding property.
In the present specification, examples of the “protein having a binding site for a drug” include those having at least one site (site) that binds to the drug. The binding site possessing protein preferably has a binding site that specifically binds to the drug, and the binding site may be present in one or a plurality of locations in the protein. One of them may have an activity of binding to a plurality of drugs. The binding site-retaining protein is not particularly limited, and examples thereof include those present in the living body, such as serum protein, plasma protein, tissue protein, receptor, membrane protein and the like. Typical binding site possessing proteins include human serum albumin (HSA), α 1 -Acid glycoprotein (AGP), γ-globulin such as IgG, IgA, IgM and the like. HSA is known to have multiple drug binding sites, for example, the following sites are known to bind to the following drugs:
[0015]
Binding sites on HSA molecules
1) Site I: Warfarin, phenylbutazone, dansyl-L-asparagine, phenytoin, azapropazone, valproic acid, dicoumarol, indomethacin, etc.
2) Site II: Diapam, L-tryptophan, dansyl sarcosine, ibuprofen, valproic acid, salicylic acid, dicoumarol, indomethacin, etc.
3) Site III: Digitoxin, etc.
4) Bilirubin site: bilirubin, etc.
In AGP, for example, the following drugs are known to bind to the following sites:
Binding sites on AGP molecules
1) Basic drug binding sites: verapamil, chlorpromazine, disopyramide, lidocaine, etc.
2) Acidic drug binding sites: Dicoumarol, etc.
3) Acid / base common site: propranolol, etc.
[0016]
As the probe drug to be used, it is preferable to combine those drugs that do not adversely affect the measurement due to the cross reaction between the drugs.
Typical examples include a combination of phenytoin, valproic acid and disopyramide, a combination of phenytoin, valproic acid, diazepam and disopyramide.
For example, a drug that specifically binds to a binding site on the HSA molecule, i.e., Site I, Site II, Site III, etc. is arbitrarily selected. It is possible to arbitrarily select drugs that specifically bind to drug binding sites, etc., use a plurality of them, and preferably quantify their binding properties (binding inhibition) for a plurality of binding sites. It is done.
The drug may be a known one or a novel one, and includes one that binds to a protein having a binding site present in the living body, for example, Merck Index (Susan Budavari (Ed. ), The Merck Index: an encyclopedia of chemicals, drugs, and biologicals, 13th Edition, Whitehouse Station, NJ: Merck Research Laboratories Division of Merck, 2001).
[0017]
The measuring device is preferably a device that can measure a large number of specimens in a continuous and automated manner, for example, a drug blood concentration measuring system such as an Abbott TDxFLx analyzer (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA), an automatic such as an Abbott IMx analyzer. Examples include immunoassay systems and the like, and those described in U.S. Pat. No. 5,358,691, etc. or improvements thereof (the contents of U.S. Pat. No. 5,358,691 are incorporated herein by reference). , The contents of which are hereby incorporated by reference as a part of this specification). In the present specification, the measuring device is preferably one that can dispense a filtrate obtained from serum. Since the measurement object is a very small amount, it is preferable that a low-concentration object can be measured.
[0018]
In the present invention, as described in US Pat. No. 5,358,691 or other known documents, the compound or composition to be detected or measured is a compound or composition having at least one epitope or binding site. Assays where the composition is an analyte are available. The analyte may be any compound that has a binding property that exists in nature, and one that can produce a compound having a binding property thereto. In the assay, an analog of an analyte is also used. The analog of the analyte is a substance that cross-reacts with an analyte having a property of specifically binding to the analyte, although there is a difference that it is larger or smaller than the analyte itself. Examples of the analog of the analyte include a modified analyte, a fragment derived from an analyte molecule, or a synthesized part thereof, and has at least a part of an epitope site common to the analyte. What is doing is preferable.
[0019]
The term “having binding property” refers to one that forms a binding pair. For example, when there are two different molecules, one molecule chemically or physically binds to the other molecule. One of the molecules that have such a relationship. Such a binding pair is not particularly limited, but for example, an antigen-antibody binding pair, biotin and avidin, saccharide and lectin, complementary nucleotide sequence, complementary peptide sequence, effector molecule and receptor molecule , Coenzyme and enzyme, enzyme inhibitor and enzyme, peptide sequence and antibody having specificity to the sequence or protein containing the sequence, acidic substance and basic substance, dye and protein conjugate, peptide and specifically to it Examples include proteins that bind. The binding pair may further be an analog of the original binding property, such as a gene created by using gene recombination technology or bioengineering technology. . Examples of such binding agents include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinant antibodies, chimeric antibodies, recombinant proteins, fusion proteins, chimeric proteins, mixtures or fragments thereof, those known to those skilled in the art, and the like. Is mentioned.
[0020]
In the above assay, a detectable substance can be used, such as any group or compound having a property capable of being detected physically or chemically. There may be mentioned those that suitably label those having the above binding properties to produce a conjugate therewith. Such chemically detectable substances include, for example, enzymatically active substances such as enzymes, enzyme substrates, prosthetic groups, coenzymes, spin labels, fluorescent substances or fluorescent sources, coloring substances or coloring sources, chemicals Luminescent substances such as luminescent agents and bioluminescent agents, mutually binding ligands such as biotin-avidin, toxins, haptens, electrically or magnetically active substances, DNA, RNA, polysaccharides, polypeptides , Liposomes, colored particles, microparticles, metal colloids, inorganic colloids and the like, but are not limited thereto.
[0021]
In the above assay, various measurement / detection systems known in the art can be used, for example, spectrophotometric absorbance assay, turbidimetric assay, neferometric assay, in radiant energy. Examples include, but are not limited to, sum assays, ion capture assays, chromogenic assays, fluorescence assays, electrochemical detection systems, voltage or current sensing systems, immunoassays, and the like. Examples of the immunoassay include, but are not limited to, a fluorescence polarization immunoassay (FPIA), a competitive immunoassay, a sandwich immunoassay, an immunometric assay, and the like, and assay methods using a heterogeneous system or a homogeneous system.
[0022]
In the pharmaceutical distribution diagnostic method of the present invention, those capable of measuring total protein, free fatty acid (FFA), HSA concentration, AGP concentration, etc. in serum can be suitably used. In addition, the drug binding site binding measurement kit preferably has the following configuration:
1) A container containing HSA and AGP (preferably easily soluble powder) (for example, a plastic tube) and a solution containing all or one of the required site-specific probes. thing;
2) A container containing HSA, AGP and γ-globulin (preferably in a powder form that can be easily dissolved) (for example, a plastic tube) and a solution containing all or one of the required site-specific probes. And;
3) The container in 1) or 2) above is an ultrafilter and a liquid containing all or one of the required site-specific probes.
[0023]
One of the features of the present invention is to reduce the dose of a drug highly dependent on protein binding by accurately determining the inhibition of protein binding at various binding sites in HSA and AGP in patients whose condition has deteriorated. Is to be able to quickly grasp the timing of administration. Another feature of the present invention is that, when large binding inhibition from patient sera to various sites is found, the substance is present in a large amount due to the characteristics of protein binding, and may be involved in metabolic inhibition. It is also possible to predict gender. In other words, until now, if only the protein binding inhibition of the target drug (specific binding site only) has been followed, naturally there is no unknown protein binding inhibitor because it cannot sense what is bound to other sites. It will be judged. Therefore, an unknown large amount of metabolic inhibitors are missed, and the possibility of performing an incorrect drug administration method is increased.
According to the present invention, since the drug binding property of the binding site of the protein in the living body can be accurately diagnosed, it is possible to reduce the dose of the drug to the maximum and to provide the patient with the optimal effect. This will prevent overdose of drugs for severe patients managed in the intensive care unit as well as treatment for refractory patients, and will lead to a safe and highly effective prospective dosage design. means.
[0024]
When considering the effects of drugs and adverse reactions in clinical practice, we must focus on metabolism. However, at the stage of severe liver injury where metabolic capacity is almost lost, it is the same as considering the dynamics of unchanged drug. In such a pathological condition, if unexpected binding inhibition occurs at the binding site of the drug to be administered, careful drug administration must be performed while paying attention to the enhancement of drug efficacy. Therefore, it is highly probable that tissue migration of drugs with high protein binding will depend greatly on changes in protein binding, and accurately determining protein binding inhibition at that time will reduce side effects on severe patients. It helps to administer effective drugs.
Conversely, even when binding inhibitors are actively used and effective drug treatment is performed on patients, the optimal amount of inhibition can be determined, so the minimum amount of such binding inhibitors (adjuvants) is required. It can be used as a method to produce the maximum effect. This can also be used as a groundbreaking method for pharmacological distribution diagnosis when planning a positive drug administration design. Furthermore, there is no doubt that this diagnosis will lead to an accurate metabolic diagnosis. To date, there is no drug treatment method that uses this diagnostic method to estimate the tissue transferability of each individual drug and to design the administration. In particular, this diagnostic method is unique in that it can find a more effective drug administration design for patients with severe liver / kidney disorders.
According to the present invention, it is possible to evaluate and diagnose the binding property between a serum protein and a drug. It also makes it possible to evaluate and evaluate the binding between tissue proteins and drugs. Thus, combinations of drugs that rapidly and quantitatively evaluate the binding properties of drug binding sites of various serum proteins in patient sera, reagent kits that measure these drugs, for example, reagent kits that use monoclonal antibodies, and further support them It is clear that an improved measuring instrument is provided. The kit can be adapted to the above-described automated measuring apparatus. For example, the kit is put in a container having a compartment for storing a sample, a compartment for containing a measurement reagent, a compartment for containing a diluent, and the like. It may be what has been.
In addition, it is possible to perform measurements on multiple binding sites, to use multiple site-specific probes that have specific binding properties to different binding sites, and to HSA site I. A site-specific probe having a specific binding property and a site-specific probe having a specific binding property to a site different from the site I. Or a form that can be used to compare and evaluate the amount of the free substance of the probe between different sites, and may be regarded as a feature of the present invention.
[0025]
【Example】
The present invention will be specifically described below with reference to examples. However, these examples are provided merely for the purpose of explaining the present invention and for reference to specific embodiments thereof. These exemplifications are for explaining specific specific embodiments of the present invention, but are not intended to limit or limit the scope of the invention disclosed in the present application. In the present invention, it should be understood that various embodiments based on the idea of the present specification are possible.
All examples were performed or can be performed using standard techniques, except as otherwise described in detail, and are well known and routine to those skilled in the art. .
[0026]
Example 1
Determine binding at both HSA and AGP binding sites in patient serum. An aliquot of collected patient serum is placed in a Falcon tube, which is then mixed with a constant concentration of site-specific probe drug. As site-specific probe drugs, valproic acid (HSA site I and site II), phenytoin (HSA site I), diazepam (HSA site II), and disopyramide (AGP basic drug binding site) were used. . The obtained serum sample (0.5 to 1 ml) was applied to an ultrafilter and processed (ultrafiltration time was 10 to 15 minutes). The obtained filtrate was set in a measuring apparatus TDXFLX (Abbott, USA) and measured. Only diazepam was measured by HPLC of Shimadzu 6A series. As a measuring reagent, a reagent (Abbott, USA) corresponding to the site-specific probe drug used for TDXFLX was set in the measuring apparatus. Measurements were performed on both the serum collected in the morning and the serum collected in the evening for the same patient, and the changes in the free concentration of the probe drug and the concentration of serum protein / FFA were examined. The obtained results are shown in Table 1.
[0027]
[Table 1]
As a result, in the same patient, the binding to the drug at each site varies. In this example, it was observed that the amount of free products of valproic acid and diazepam, which are site-specific probe drugs for HSA Site II, varied between serum collected in the morning and serum collected in the evening. Therefore, in this patient, it is judged that monitoring the site binding property of HSA at site II with a site II binding specific probe is important in the diagnosis of pharmaceutical distribution. In other words, a therapeutic agent that binds to Site II of HSA when site II binding is inhibited (especially a therapeutic agent with a small volume of distribution, high targeting, or non-metabolized is desirable. The dosage form is rapidly in the blood like injections and suppositories. It is possible to increase the effect of a small amount). Naturally, since the dose is reduced, there is a high possibility that damage to the liver and kidney, which are the main excretory organs of the drug, can be avoided.
Similarly, by using probe drugs for the binding sites of various serum proteins and measuring the degree of drug binding (binding inhibition) at each binding site, the degree of binding inhibition at each binding site can be estimated. In addition, it is possible to grasp the qualitative and quantitative changes of various serum proteins of patients and the kinetics of administered drugs (including the tissue migration or distribution of drugs), and the intrinsicity of binding is high. In terms of changes in the abundance of unknown metabolites with high binding properties derived from substances and administered drugs, as well as the presence of patient binding protein mutants, the degree of protein binding inhibition of the probe and various proteins, FFA, etc. It becomes possible to find out by examining the fluctuation.
[0029]
At the same time, the type of drug in the patient's serum, total protein, FFA, HSA concentration, AGP concentration, etc. can be used, which results in more accurate diagnostic data.
If there is not much endogenous substance or drug and its metabolite that greatly affect the binding property of the probe drug to the binding site in the patient serum, it can be used particularly for monitoring the change in AGP concentration.
It also makes it possible to find new binding sites that are difficult to replace with drugs that bind to HSA or AGP. It is also possible to monitor the exact concentration change of HSA or AGP by monitoring the free concentration of these drugs (the free concentration of the drug always changes depending on the concentration of HSA or AGP) ).
[0030]
Example 2
Determining sites in various proteins for drugs with unidentified binding sites
A fixed amount (eg, 0.5-1 ml) of serum with a known protein composition (eg, the same lot of pooled serum or serum obtained from the same healthy person) is placed in three falcon tubes and then fixed to it. Mix drugs with unidentified concentrations of binding sites. Further, a constant concentration of site-specific probe drug is mixed with this. As site-specific probe drugs, valproic acid (HSA site I and site II), phenytoin (HSA site I), diazepam (HSA site II), and disopyramide (AGP basic drug binding site) were used. . The obtained serum samples (0.45 to 0.95 ml) were processed by ultrafiltration, and the ultrafiltration time was 10 to 15 minutes. The obtained filtrate was set in a measuring apparatus FLX (Abbott, USA) and measured. Only diazepam was measured by HPLC of Shimadzu 6A series. As the measurement reagent, a reagent (Abbott, USA) corresponding to the site-specific probe drug used for FLX was set in the measurement apparatus. The measurement was performed for each addition amount of the drug whose binding site was not identified, and the change in the free concentration of the probe drug was examined. The obtained results are shown in Table 2.
[0031]
[Table 2]
As a result, the amount of phenytoin, a site-specific probe drug that has specificity for HSA site I, increases as the amount of unidentified drug (sarazosulfapyridine) added to this binding site increases. Of course, the amount of valproic acid monitoring Sites I and II increases, and the binding site of the test drug is diagnosed at or near Site I of HSA.
[0033]
Example 3
FFA-diclofenac suppository therapy
Since FFA rises on an empty stomach, it may be possible to design optimal administration of diclofenac suppository (Site II) by grasping the degree of inhibition of Site II at that time (by setting a meal time limit in a certain period of time). FFA concentration can be adjusted to some extent).
Age / Gender: 68 years old Female
Name of disease: rheumatoid arthritis (RA), knee osteoarthritis (left artificial joint replacement)
Chief complaint: systemic pain and fever from rheumatic fever
Background: During hospitalization for orthopedics, diclofenac suppository (50 mg) was administered around 15:00 for rheumatic fever, which occurred near 7:00 in the evening for stiffness and pain in the morning, but the mass of rheumatic fever was poor It was.
[0034]
[Table 3]
The diagnosis of pharmaceutical distribution from the above data is explained. At 6:00 on an empty stomach, the FFA increased, and at 10:00 on a full stomach, the FFA decreased. Due to the relatively low HSA value in this patient, it was found that high and low FFA concentrations resulted in inhibition of binding to the site II region (diazepam and valproic acid). The degree of inhibition of diazepam was 1.5 times. Therefore, by eliminating snacks so as to be hungry as much as possible before the onset of rheumatic fever, it is expected that FFA will increase. It was judged that there was an effect. As a result, diclofenac suppository 25 mg led to suppression of rheumatic fever. At the same time, as for the effect of diclofenac suppository at 7:00 in the early morning (fasting), Site II was inhibited by the increase in FFA, and as a result, it was considered that a good analgesic effect could be obtained even if the dose was reduced from 50 mg to 25 mg. Pain control was achieved with the expected effect.
Using this diagnostic method, diclofenac suppository 50 mg was reduced from 2 (one each before morning and evening) to 25 mg (one each before morning and evening), and good analgesic control became possible. .
As can be seen here, the degree of inhibition of phenytoin (site I) is low. Therefore, drugs related to Site I are difficult to use.
The disopyramide inhibitory concentration, which is a probe of the AGP base drug binding site, is remarkably increased to 0.38 to 0.84 μg / ml. This is because the concentration of AGP decreased from 242 mg / dl to 154 mg / dl (in this way, increase or decrease of AGP concentration can often be predicted because drugs and endogenous substances that affect AGP binding in vivo) Because there are very few). If there is no change in the disopyramide inhibitory concentration, an unknown AGP base drug binding site inhibitor will be present in the serum at 6:00 (sample).
[0036]
Example 4
Nabumeton-FFA- diclofenac suppository therapy
It is used when the analgesic effect is not sufficient only by the site II inhibitory effect of increasing the FFA concentration alone.
Age / sex: 73 years old Female
Name of disease: Rheumatoid arthritis (RA), vertical cervical dislocation (occipital cervical vertebral fusion)
Chief complaint: Pain in the extremities of fingers and limbs (almost systemic pain)
Background: Diclofenac suppositories 50 mg and 25 mg were administered in the early morning and evening, and continued to live in pain when the effect of the suppository disappeared (early morning and evening hurts). Recently, suppositories sometimes made it difficult to get rid of pain. Also, when the suppository was inserted into the anus, the suppository was 50 mg in size and the pain at the time of insertion into the anus was also complained (pain during insertion and pain for several hours after insertion).
[0037]
[Table 4]
The diagnosis of pharmaceutical distribution from the above data is explained. After taking lunch (12: 30-13: 00) and taking 2 tablets (800 mg) of Nabumeton tablets 4-5 hours later (17:50), the active metabolite of Nabumeton (Site II inhibitory effect of Nabumeton tablets is Nabumeton 6-methoxy-2-naphthylacetic acid (abbreviation 6MNA), the highest blood concentration of diazepam (HSA site II), the degree of inhibition of diazepam (HSA site II) before taking 2 nabumetone tablets (5 : 00) clearly more than twice. It should be noted here that despite the decrease in FFA concentration (decrease in FFA concentration reduces the degree of inhibition of Site II), the inhibitory effect of 6MNA is sufficient. Although inhibition (17:50) of phenytoin (HSA site I) is also observed, it is about 1.3 times, and attention should be paid to inhibition of binding of site II. Therefore, tissue transferability is increased even if the doses of diclofenac suppository 50 mg and 25 mg, which were administered twice between 5:00 am and 17: 00-18: 00 in the evening, are reduced to 25 mg and 12.5 mg. Based on this, it was judged that the pain could be controlled, and nabumetone diclofenac suppository therapy was performed. As a result, the pain was gradually controlled and the pain until the evening was reduced. With this therapy, the size of the diclofenac suppository could be changed from a large one to a small one, and pain during anal insertion was slightly improved, and of course the dose of suppository could be reduced.
Since the degree of inhibition of phenytoin is 1.3-fold, it can be judged that there is a high possibility that a large amount of unknown binding substances in the site I system exist (no change in TP, HSA, AGP, and FFA at this concentration Can't inhibit Site I).
Since there is no change in the free concentration of disopyramide, which is a probe of the AGP base drug binding site, it can be judged that there is no change in the concentration of AGP (a change in the concentration of AGP can be predicted).
The analgesic effect of diclofenac suppositories is great. However, since long-term high-dose administration tends to cause side effects such as liver / kidney disorders, it is generally better to lower the dose of diclofenac suppository using nabumetone tablets with low side effects (high safety).
[0039]
【The invention's effect】
The present invention relates to a method for optimally evaluating the degree of inhibition of a drug binding site of a serum protein, a binding site-specific probe drug used therefor, a pharmaceutical distribution diagnostic method using an automatic blood drug concentration measuring apparatus, and a method based thereon Drug selection and treatment are provided. The present invention also provides a reagent system that can monitor the binding property of a drug binding site of a serum protein, studying the interaction between the binding sites, and quickly and rapidly improving the tissue migration of a drug by an optimal binding site-specific probe drug. Provide a simple prediction method. According to the present invention, a drug distribution diagnosis method can be constructed, an appropriate drug therapy can be established, and a treatment diagnosis can be performed efficiently and safely.
It will be apparent that the invention may be practiced otherwise than as particularly described in the foregoing description and examples. Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, and thus are within the scope of the claims appended hereto.
Claims (5)
(A)ヒト血清アルブミン(HSA)の結合サイトIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(B)HSAの結合サイトIIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(C)α1−酸性糖蛋白質(AGP)の結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ；
(ii)下記(a)、(b)及び(c)を使用して、生物由来検体と該(a)、(b)及び(c)から成る群から選ばれたものとを接触せしめ、該処理された検体中の遊離のサイト特異性プローブを定量的に測定し、得られた遊離のサイト特異性プローブの量と該蛋白質の結合サイトにおける薬物の特異的結合性の程度とを相関せしめて該蛋白質の結合サイトの薬物に対する結合性を診断する：
(a)HSAの結合サイトIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(b)HSAの結合サイトI及びIIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(c)AGPの結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ；又は
(iii)下記(1)、(2)、(3)及び(4)を使用して、生物由来検体と該(1)、(2)、(3)及び(4)から成る群から選ばれたものとを接触せしめ、該処理された検体中の遊離のサイト特異性プローブを定量的に測定し、得られた遊離のサイト特異性プローブの量と該蛋白質の結合サイトにおける薬物の特異的結合性の程度とを相関せしめて該蛋白質の結合サイトの薬物に対する結合性を診断する：
(1)HSAの結合サイトIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(2)HSAの結合サイトIIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(3)HSAの結合サイトI及びIIに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
(4)AGPの結合サイトに対して特異的結合性を有しているサイト特異性プローブ
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一記載の薬物の薬学的分布診断法。(i) using the following (A), (B) and (C), bringing a biological specimen into contact with one selected from the group consisting of (A), (B) and (C), Quantitatively measure the free site-specific probe in the treated specimen and correlate the amount of free site-specific probe obtained with the degree of specific binding of the drug at the protein binding site. Diagnose the binding of the protein binding site to the drug:
(A) Site-specific probe having specific binding property to binding site I of human serum albumin (HSA)
(B) Site-specific probe having specific binding property to binding site II of HSA
(C) a site-specific probe having a specific binding property to the binding site of α 1 -acid glycoprotein (AGP);
(ii) using the following (a), (b) and (c), bringing a biological specimen into contact with one selected from the group consisting of (a), (b) and (c), Quantitatively measure the free site-specific probe in the treated specimen and correlate the amount of free site-specific probe obtained with the degree of specific binding of the drug at the protein binding site. Diagnose the binding of the protein binding site to the drug:
(a) Site-specific probe having specific binding property to binding site I of HSA
(b) Site-specific probe having specific binding properties to binding sites I and II of HSA
(c) a site-specific probe having specific binding to the binding site of AGP; or
(iii) using the following (1), (2), (3) and (4), selected from the group consisting of the biological specimen and the (1), (2), (3) and (4) The amount of the free site-specific probe obtained and the specific binding of the drug at the binding site of the protein. Correlate with the degree of sex to diagnose the binding of the protein binding site to the drug:
(1) Site-specific probe that has specific binding properties to binding site I of HSA
(2) A site-specific probe having specific binding properties to HSA binding site II
(3) Site-specific probe having specific binding properties to binding sites I and II of HSA
(4) The method for diagnosing a pharmaceutical distribution according to any one of claims 1 to 4, which is a site-specific probe having a specific binding property to the binding site of AGP.
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