JP5825460B1 - Pretreatment method for cell deployment device, cell deployment device, and cell deployment device pretreatment system - Google Patents
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Abstract
予め細胞用展開用デバイスの濡れ性を向上させるために、マイクロ流路内にプレウェット液を通液する場合に、プレウェット液による濡れ性を確実に向上させることができる細胞展開用デバイスの前処理方法、および濡れ性を向上させた細胞展開用デバイス、ならびに濡れ性を向上させるための細胞展開用デバイスの前処理システムを提供することを課題とする。本発明は、複数のマイクロチャンバーが形成された細胞展開用デバイスにおいて、プレウェット液通液工程後にマイクロチャンバー内に残存する気泡を除去するための、細胞展開用デバイスの前処理方法であって、前記マイクロチャンバーの1個当たりの体積と、前記マイクロチャンバーの総数とが予め設定されるマイクロチャンバーチップ形成工程と、マイクロ流路にプレウェット液を通液するプレウェット液通液工程と、プレウェット液を通液した後、気泡が存在するマイクロチャンバーの数を検出する気泡付きマイクロチャンバー検出工程と、気泡状態の空気の合計量Aを算出する気泡空気体積算出工程と、前記気泡状態の空気の合計体積Aと、前記プレウェット液中に既に溶解している空気の体積Bとの和から、(A+B)/Bを算出し、この算出された値に常圧Pを掛けあわせて、作動圧力X=P?(A+B)/Bを算出する作動圧算出工程と、作動圧力Xを前記マイクロ流路に作用させることにより、気泡として存在する空気を前記プレウェット液内に溶かし込む気泡溶解工程と、を有する。In order to improve the wettability of the cell deployment device in advance, when the prewet liquid is passed through the microchannel, the cell deployment device can be reliably improved in wettability by the prewet liquid. It is an object of the present invention to provide a treatment method, a cell deployment device with improved wettability, and a cell treatment device pretreatment system for improving wettability. The present invention is a cell expansion device in which a plurality of microchambers are formed, and a pretreatment method for a cell expansion device for removing bubbles remaining in the microchamber after a pre-wet liquid flow step, A microchamber chip forming step in which the volume per one microchamber and the total number of the microchambers are set in advance, a prewet liquid passing step in which a prewet liquid is passed through the microchannel, and a prewet After passing the liquid, a bubbled microchamber detecting step for detecting the number of microchambers in which bubbles are present, a bubble air volume calculating step for calculating the total amount A of bubbled air, From the sum of the total volume A and the volume B of air already dissolved in the pre-wet liquid, (A + B) / B is calculated. Then, by multiplying the calculated value by the normal pressure P to calculate the operating pressure X = P? (A + B) / B, and by applying the operating pressure X to the microchannel, A bubble dissolving step of dissolving air existing as bubbles into the pre-wet liquid.
Description
本発明は、細胞懸濁液に先立ってマイクロチャンバー内に通液されるプレウェット液を用いる細胞展開用デバイスの前処理方法、そのような前処理により得られる細胞展開用デバイス、およびそのような前処理を実施するための細胞展開用デバイスの前処理システムに関する。 The present invention relates to a pretreatment method for a device for cell deployment using a prewetting liquid that is passed through a microchamber prior to a cell suspension, a device for cell deployment obtained by such a pretreatment, and such a device. The present invention relates to a pretreatment system for a device for cell deployment for performing pretreatment.
循環腫瘍細胞〔CTC〕、循環血管内皮細胞〔CEC〕、循環血管内皮前駆細胞〔CEP〕、各種幹細胞等(本明細書において、まとめて「希少細胞」という。)は病態に応じて全血中に極めて稀に存在する細胞である。希少細胞の検出は臨床的な有用性が明らかであるにもかかわらず、その検出は極めて難しい。近年様々な細胞分離手法を応用してその検出が試みられ製品化がなされているが、いずれにおいても対象の希少性が故、検出結果の有効性を評価(希少細胞のロスや不要細胞の混入の有無)することが重要である。 Circulating tumor cells [CTC], circulating vascular endothelial cells [CEC], circulating vascular endothelial progenitor cells [CEP], various stem cells, etc. (collectively referred to herein as “rare cells”) are contained in whole blood according to the pathological condition. It is a very rare cell. Despite the obvious clinical utility of rare cell detection, it is extremely difficult to detect. In recent years, various cell separation techniques have been applied to attempt detection and commercialization. In any case, the effectiveness of detection results was evaluated because of the rarity of the target (rare cell loss or unwanted cell contamination). It is important to
採血した血液などの検体中に目的とする希少細胞が存在するか否かを検査するための手法の一つとして、図7に示したような細胞展開用デバイス10(複数のマイクロチャンバー4を備えたマイクロチャンバーチップ2)の表面に血液由来検体などの細胞懸濁液を平面状に展開し、各マイクロチャンバー4内に細胞を収容し、それらマイクロチャンバー4内に収容された複数の細胞中に、特定の細胞が存在するか否かを確認する方法が知られている。
As one of the methods for examining whether or not a target rare cell is present in a sample such as collected blood, a cell expansion device 10 (including a plurality of
そのような稀少細胞の回収方法においては、希少細胞がマイクロチャンバー内に確実に収容されるようにする必要がある。例えば、特許文献1には、マイクロチャンバーチップ表面およびマイクロチャンバー内壁面の一部または全部を、細胞の非特異的吸着を抑制できるブロッキング剤(例えば、カゼイン等のタンパク質)で被覆することにより、血液等に含まれる多種類かつ多量の細胞を当該チップ上に展開した際、細胞がマイクロチャンバー内に格納、保持されやすく、さらに細胞がマイクロチャンバーの内壁面に吸着しにくいため、細胞同士がマイクロチャンバー内で重層化せずに、顕微鏡下での観察が容易になるという作用効果が奏される、細胞展開用マイクロチャンバーチップの発明が記載されている。 In such a rare cell recovery method, it is necessary to ensure that the rare cells are accommodated in the microchamber. For example, Patent Document 1 discloses that a part or all of the microchamber chip surface and the inner wall surface of the microchamber are coated with a blocking agent (for example, a protein such as casein) that can suppress nonspecific adsorption of cells. When many types and a large amount of cells contained in a cell are spread on the chip, the cells are easily stored and held in the microchamber and the cells are difficult to adsorb on the inner wall of the microchamber. An invention of a microchamber chip for cell deployment is described, which has the effect of facilitating observation under a microscope without being layered inside.
前述したような細胞展開用デバイス10を用いて稀少細胞を検出する方法において、マイクロチャンバーチップ2が、例えば、ポリスチレンなどの疎水性の材料から形成されている場合には、マイクロ流路5内に細胞懸濁液を導入したとしても、表面張力の関係で細胞懸濁液を全てのマイクロチャンバー4内に充填させることができず、複数のマイクロチャンバー4内に気泡が残存してしまう(図9参照)。
In the method for detecting rare cells using the
そのような問題を抑制するため、細胞懸濁液を展開する前に、予め表面張力の低い有機溶剤、例えばエタノールを「プレウェット液」として、マイクロチャンバーチップ2内に通液することにより、マイクロチャンバー4の濡れ性を向上させておくことが行われている。このようにプレウェット液で処理した後、純水を通液してプレウェット液を置換、洗浄してから、細胞懸濁液を通液するようにすれば、細胞懸濁液はほとんど全てのマイクロチャンバー4の内部に入り込み、細胞をマイクロチャンバー4で効率的に回収することができるようになる。
In order to suppress such a problem, before the cell suspension is developed, an organic solvent having a low surface tension, for example ethanol, is passed through the
ところが、特許文献1に記載されているように、マイクロチャンバーチップ表面およびマイクロチャンバー内壁面の一部または全部をブロッキング剤で処理する場合、プレウェット液による処理が、ブロッキング剤の効果に悪影響を与えないよう留意する必要がある。例えば、エタノール水溶液をプレウェット液として用いる場合、その濃度を30容量%以下程度にまで低くすれば、ブロッキング剤の効果に悪影響を与えることは避けられるが、今度は前述したようなプレウェット液自体に求められる効果が十分ではなくなり、マイクロチャンバー4内の気泡の残存を抑制することができなくなる。結果的に、プレウェット液に続いて細胞懸濁液をマイクロ流路5内に展開しても、マイクロチャンバー4内に細胞を効率的に回収することができず、希少細胞の検出結果の有効性を正しく評価することができなくなってしまうという問題が発生する。このような現象は、マイクロ流路5の断面積が小さく、しかもマイクロチャンバー4の密度が大きい程に生じ易い。
However, as described in Patent Document 1, when a part or all of the surface of the microchamber chip and the inner wall surface of the microchamber is treated with a blocking agent, the treatment with the pre-wet liquid adversely affects the effect of the blocking agent. It is necessary to be careful not to. For example, when an ethanol aqueous solution is used as a pre-wet liquid, if the concentration is lowered to about 30% by volume or less, adverse effects on the effect of the blocking agent can be avoided, but this time the pre-wet liquid itself as described above The effect required for the above is not sufficient, and the remaining bubbles in the
本発明は、このような実情に鑑み、細胞展開用デバイスにブロッキング処理がなされている場合にも利用することができ、かつ実質的に全てのマイクロチャンバーに気泡を残存させず、プレウェット液とそれに続いて通液される細胞懸濁液で充填することができるようにする細胞展開用デバイスの前処理方法、およびそのような処理が実施された結果、マイクロチャンバー内に気泡が残存しない状態で保存されている細胞展開用デバイス、ならびにそのような処理を実施するための細胞展開用デバイスの前処理システムを提供することを目的としている。 In view of such circumstances, the present invention can be used even when the cell expansion device is subjected to blocking treatment, and substantially no bubbles remain in all the microchambers. A pre-treatment method for a device for cell deployment that enables filling with a cell suspension to be subsequently passed, and the result of such treatment is that no bubbles remain in the microchamber. It aims at providing the pretreatment system of the device for cell deployment which preserve | saved, and the device for cell deployment for implementing such a process.
本発明者らは、鋭意検討した結果、マイクロ流路内にプレウェット液を通液してマイクロチャンバー上に気泡が生じてしまった場合に、プレウェット液を加圧することで、その気泡(空気)をプレウェット液中に溶解させて、マイクロチャンバー内から除去することができることを見出し、本発明の完成に至った。 As a result of diligent study, the inventors of the present invention have applied the pre-wet liquid to the air bubbles (air) when the pre-wet liquid is passed through the micro flow channel and bubbles are generated on the micro chamber. ) Can be dissolved in the pre-wet liquid and removed from the microchamber, and the present invention has been completed.
すなわち、上述した目的の内少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した、細胞展開用デバイスの前処理方法は、以下の通りである。
[1]
マイクロ流路の底面に複数のマイクロチャンバーが形成された細胞展開用デバイスにおいて、プレウェット液通液工程後にマイクロチャンバー内に残存する気泡を除去するための、細胞展開用デバイスの前処理方法であって、
前記マイクロチャンバーの1個当たりの体積と、前記マイクロチャンバーの総数とが予め設定されるマイクロチャンバーチップ形成工程と、
前記マイクロチャンバーチップ形成工程で得られた前記複数のマイクロチャンバーの上部に形成されているマイクロ流路にプレウェット液を通液するプレウェット液通液工程と、
前記プレウェット液を通液した後、前記マイクロチャンバー内に気泡が存在するマイクロチャンバーの数を検出する気泡付きマイクロチャンバー検出工程と、
前記気泡付きマイクロチャンバー検出工程で検出された気泡状態の空気の合計量Aを算出する気泡空気体積算出工程と、
前記気泡空気体積算出工程で得られた前記気泡状態の空気の合計体積Aと、前記プレウェット液中に既に溶解している空気の体積Bとの和から、(A+B)/Bを算出し、この算出された値に常圧Pを掛けあわせて、作動圧力X=P×(A+B)/Bを算出する作動圧算出工程と、
前記作動圧算出工程で得られた前記作動圧力X以上の圧力を前記マイクロ流路に作用させることにより、前記気泡付きマイクロチャンバー内に気泡として存在する空気を前記プレウェット液内に溶かし込む気泡溶解工程と、を有する細胞展開用デバイスの前処理方法。That is, in order to realize at least one of the above-described objects, a pretreatment method for a cell deployment device reflecting one aspect of the present invention is as follows.
[1]
In a cell deployment device in which a plurality of microchambers are formed on the bottom surface of a microchannel, this is a pretreatment method for a cell deployment device for removing bubbles remaining in the microchamber after the pre-wet liquid passing step. And
A microchamber chip forming step in which the volume per microchamber and the total number of microchambers are preset,
A pre-wet liquid flow step of passing a pre-wet liquid through a micro-channel formed in the upper part of the plurality of micro chambers obtained in the micro-chamber chip formation step;
After passing the pre-wet liquid, a microchamber with bubbles detecting step for detecting the number of microchambers in which bubbles exist in the microchamber,
A bubble air volume calculating step of calculating a total amount A of air in a bubble state detected in the microchamber with bubble detecting step;
From the sum of the total volume A of the air in the bubble state obtained in the bubble air volume calculation step and the volume B of the air already dissolved in the pre-wet liquid, calculate (A + B) / B, An operating pressure calculating step of multiplying the calculated value by the normal pressure P to calculate the operating pressure X = P × (A + B) / B;
Bubble dissolution that dissolves air existing as bubbles in the microchamber with bubbles into the pre-wet liquid by applying a pressure equal to or higher than the operating pressure X obtained in the operating pressure calculation step to the microchannel. A pretreatment method for a device for cell deployment, comprising the steps of:
また、上述した目的の内少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した、細胞展開用デバイスは、以下の通りである。
[8]
前記方法が実施されている、前処理によりマイクロチャンバーがプレウェット液で満たされた細胞展開用デバイス。Moreover, in order to realize at least one of the above-described objects, a device for cell deployment reflecting one aspect of the present invention is as follows.
[8]
A device for cell deployment in which the microchamber is filled with a pre-wet liquid by pretreatment, wherein the method is performed.
さらに、上述した目的の内少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した、細胞展開用デバイスの前処理システムは、以下の通りである。
[9]
複数のマイクロチャンバーが形成された細胞展開用デバイスと、細胞検出装置と、制御手段とを備え、
前記細胞検出装置は、少なくとも、前記細胞展開用デバイスに供給されるプレウェット液と細胞懸濁液とが貯留された薬液収容器ホルダーと、
前記細胞展開用デバイスと前記薬液収容器ホルダーとの間に移動可能に配置された通液系機構とを備え、
前記制御手段は、少なくとも、前記細胞展開用デバイス内にプレウェット液が通液された後、前記マイクロチャンバー上に気泡状態で存在する空気の合計量Aを前記プレウェット液に溶解させるのに必要な作動圧力Xを算出する作動圧算出手段と、
前記薬液収容器ホルダーに貯留されたプレウェット液を、前記薬液通液機構を介して前記細胞展開用デバイス内に通液した後、前記作動圧算出手段で算出された作動圧力X以上の圧力を前記細胞展開用デバイス内に作用させ、これにより、前記プレウェット液を通液したときに前記マイクロチャンバー上に付着した気泡状態の空気の合計量Aを、前記プレウェット液内に溶解させるように処理する、細胞展開用デバイスの前処理システム。Furthermore, in order to realize at least one of the above-described objects, a pretreatment system for a device for cell deployment reflecting one aspect of the present invention is as follows.
[9]
A device for cell deployment in which a plurality of microchambers are formed, a cell detection device, and a control means;
The cell detection device includes at least a drug container holder in which a pre-wet liquid and a cell suspension supplied to the cell deployment device are stored,
A fluid passing mechanism arranged movably between the cell deployment device and the drug solution container holder;
The control means is required to dissolve the total amount A of air existing in a bubble state on the microchamber in the prewet liquid after at least the prewet liquid is passed through the cell deployment device. An operating pressure calculating means for calculating a correct operating pressure X;
After the pre-wet liquid stored in the drug solution container holder is passed through the cell deployment device via the drug solution passing mechanism, the pressure equal to or higher than the operating pressure X calculated by the operating pressure calculating means is applied. It is made to act in the device for cell deployment, so that the total amount A of air in the bubble state attached on the micro chamber when the pre-wet liquid is passed is dissolved in the pre-wet liquid. A pretreatment system for a device for cell deployment.
本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法によれば、細胞展開用デバイスのマイクロチャンバーチップ上にプレウェット液を通液する場合に、細胞回収の阻害要因となる気泡をプレウェット液中に溶解して、マイクロチャンバー内をプレウェット液で確実に充填することができる。これにより、後に細胞懸濁液を展開した場合に、各マイクロチャンバー内を細胞懸濁液で確実に満たすことが可能となり、細胞の回収率および希少細胞の検出結果の信頼性を向上させることができる。 According to the pretreatment method of the device for cell deployment according to the present invention, when the pre-wet liquid is passed over the microchamber chip of the device for cell deployment, bubbles that become an obstacle to cell recovery are contained in the pre-wet solution. It melt | dissolves and the inside of a micro chamber can be reliably filled with a pre-wet liquid. This makes it possible to reliably fill each microchamber with the cell suspension when the cell suspension is later developed, improving the cell recovery rate and the reliability of rare cell detection results. it can.
また、本発明に係る細胞展開用デバイスによれば、実質的に全てのチャンバーがプレウェット液で予め満たされているため、速やかに細胞懸濁液の展開のために用いることができる。 In addition, according to the device for cell deployment according to the present invention, since substantially all the chambers are pre-filled with the pre-wet liquid, the device can be used for the rapid development of the cell suspension.
さらに、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システムであれば、その機能を従来の細胞回収システムおよび細胞観察システムと統合することが可能であるため、細胞回収および細胞観察に先立って速やかに細胞展開用デバイスをそのために適した状態にすることができる。一方で、細胞回収および細胞観察に適した状態の商品として出荷することのできる本発明に係る細胞展開用デバイスを、低コストで、工業的に連続して大量生産することも可能である。 Furthermore, since the function of the pretreatment system for a cell deployment device according to the present invention can be integrated with a conventional cell recovery system and cell observation system, the cell recovery and cell observation can be performed quickly. The device for cell deployment can be in a state suitable for that purpose. On the other hand, the device for cell deployment according to the present invention, which can be shipped as a product suitable for cell recovery and cell observation, can be industrially mass-produced at low cost.
以下、本発明の好ましい実施の形態に係る細胞展開用デバイスの前処理方法、細胞展開用デバイス、および細胞展開用デバイスの前処理システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。 DESCRIPTION OF EMBODIMENTS Hereinafter, a cell expansion device pretreatment method, a cell expansion device, and a cell expansion device pretreatment system according to a preferred embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
[細胞展開用デバイス]
先ず、本発明に係る前処理方法が適用される細胞展開用デバイスについて説明する。[Cell expansion device]
First, a cell expansion device to which the pretreatment method according to the present invention is applied will be described.
図1は、本発明の好ましい実施の形態に係る細胞展開用デバイスの前処理方法が適用される細胞展開用デバイス30を示した概略図である。
FIG. 1 is a schematic view showing a
なお、図1に示した細胞展開用デバイス30の断面は、図8と略同一であるので、断面については図8を参照して説明する。 1 is substantially the same as that of FIG. 8, the cross section will be described with reference to FIG.
図1および図8に示したように、細胞展開用デバイス30は、複数のマイクロチャンバー4が形成されたマイクロチャンバーチップ2と、複数のマイクロチャンバー4上に一つのマイクロ流路5が形成されるように、枠状のシール部材34を介して配置された流路形成枠体8と、流路形成枠体8に設けられた入口部3と、入口部3からマイクロ流路5に導入された細胞懸濁液をマイクロ流路5から導出させるために流路形成枠体8に設けられた出口部7などとを有する。
As shown in FIGS. 1 and 8, the
マイクロチャンバーチップ2は、マイクロチャンバーアレイ〔MCA〕とも称され、この実施の形態では、長さJ、幅Hからなる範囲にマイクロチャンバー4が1000〜30000個以上形成されている。
The
また、マイクロチャンバー4が形成される領域の長さJは10mm以上であり、マイクロ流路5の断面積は5mm2以下である。The length J of the
マイクロチャンバー4とは、一個以上の細胞を「収容」し、「保持」することができる凹状の微細穴をいい、有底であることが好ましい。
The
ここで、「保持」とは、マイクロチャンバー4に収容された細胞が、細胞展開用のマイクロチャンバーチップ2のマイクロ流路5に対する染色液や洗浄液の通液等によってマイクロチャンバー4の外方に出難いことをいう。
Here, “holding” means that the cells contained in the
また、マイクロチャンバー4の開口上部の直径は、20〜500μmであることが好ましい。該直径が20〜500μmの範囲内であると、マイクロチャンバー4内に好適に細胞を収容、保持することができる。
Moreover, it is preferable that the diameter of the opening upper part of the
マイクロチャンバー4の深さは、マイクロチャンバー1つあたりに細胞を10〜15個程度収容できることが好ましく、典型的には、マイクロチャンバー4の深さは、10〜250μmである。
The depth of the
マイクロチャンバー4の形状は、底部が平坦な逆円錐形であるが、これに限定されない。
The shape of the
マイクロチャンバーチップ2の材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン〔PDMS〕、ポリメチルメタクリレート〔PMMA〕、環状オレフィンコポリマー〔COC〕などのポリマーが挙げられる。マイクロチャンバーチップ2は、成形されたポリマーに、金属、ガラス、石英ガラスなどからなる基板を貼り合わせたような複数の材料を組み合わせたものであってもよい。
Examples of the material of the
マイクロ流路5は、細胞懸濁液をマイクロチャンバーチップ2上で流通させることが可能なものであれば、この例に限定されない。
The
図1に示した細胞展開用デバイス30では、図8に示したように、マイクロチャンバーチップ2の上面を底面とし、さらに、マイクロチャンバーチップ2の上面側に設けられた流路形成枠体8とシール部材34とによりマイクロ流路5が画成されている。
In the
流路形成枠体8の材料としては、例えばマイクロチャンバーチップ2と同じ材料を用いることが好ましい。
As a material for the flow
このマイクロ流路5は、流路形成枠体8の入口部3と出口部7とに連通しており、入口部3から流入した細胞懸濁液が矢印で示す方向に流れて、出口部7から導出できるようになっている。
The
[前処理方法]
以下、図3、図4(A)〜(D)を参照しながら、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法について、また図5を参照しながら、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システムについて説明する。[Pre-processing method]
Hereinafter, referring to FIGS. 3 and 4 (A) to (D), the pretreatment method for the device for cell expansion according to the present invention, and the cell expansion device according to the present invention with reference to FIG. The preprocessing system will be described.
図3に示したように、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法は、マイクロチャンバーチップ形成工程Cと、プレウェット液通液工程Dと、気泡付きマイクロチャンバー検出工程Eと、気泡空気体積算出工程Fと、作動圧算出工程Gと、気泡溶解工程Hとを有し、これらの工程をこの順番で行う方法である。マイクロチャンバーチップ形成工程Cを経た後の細胞展開用デバイスは図4(A)に示され、プレウェット液通液工程Dを経た後の細胞展開用デバイスは図4(B)に、気泡溶解工程Hを始めたときの細胞展開用デバイスは図4(C)に、気泡溶解工程Hを経た後の細胞展開用デバイスは図4(D)に、それぞれ示されている。 As shown in FIG. 3, the pretreatment method of the device for cell deployment according to the present invention includes a microchamber chip forming step C, a pre-wet liquid passing step D, a bubbled microchamber detecting step E, and bubbled air. The method includes a volume calculation step F, an operating pressure calculation step G, and a bubble dissolution step H, and these steps are performed in this order. The device for cell deployment after passing through the microchamber chip forming step C is shown in FIG. 4 (A), and the device for cell deployment after passing through the pre-wet liquid passing step D is shown in FIG. 4 (B). The device for cell expansion when H is started is shown in FIG. 4 (C), and the device for cell expansion after the bubble lysis step H is shown in FIG. 4 (D).
本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法によれば、図3に示した各工程をこの順番で行うことにより、例えば、図4(B)に示したように、プレウェット液をマイクロ流路5に通液した場合にマイクロチャンバー4上に付着してしまった気泡9を、図4(D)に示したようにプレウェット液11内に全て溶解させることが可能となる。これにより、細胞展開用デバイス30の濡れ性を向上させることができる。
According to the pretreatment method of the device for cell deployment according to the present invention, by performing the steps shown in FIG. 3 in this order, for example, as shown in FIG. All the
<プレウェット液>
プレウェット液としては、水と相溶性のある有機溶媒の水溶液を用いることができる。例えば、エタノール水溶液であることが好ましく、特には30容量%以下のエタノール水溶液であることが好ましい。このような濃度のエタノール水溶液であれば、例えば、図2に示したように、マイクロチャンバー4の底面32以外の部分に、細胞の付着を防止するブロッキング剤50を付着させた場合であっても、ブロッキング効果が損なわれることは少ない(例えば、特許文献1参照)。なお、「濃度が30容量%以下の有機溶媒(エタノール)水溶液」には、当該有機溶媒(エタノール)の濃度が0容量%に相当する、純水、生理食塩水、緩衝液その他の水溶液自体も包含される。<Pre-wet liquid>
As the pre-wet liquid, an aqueous solution of an organic solvent compatible with water can be used. For example, an aqueous ethanol solution is preferable, and an aqueous ethanol solution of 30% by volume or less is particularly preferable. In the case of an ethanol aqueous solution having such a concentration, for example, as shown in FIG. 2, even when a blocking
<細胞懸濁液>
細胞懸濁液は、希少細胞を含んでいる可能性がある、例えばヒトなどの血液、リンパ液、組織液、体腔液などであり、希釈液などで適宜希釈されていてもよい。また、細胞懸濁液は、生体由来のものに限定されず、試験・研究等のために人工的に細胞を懸濁させて調製した細胞の分散液であってもよい。特に、血液から赤血球を分離した後の細胞懸濁液を適用することがCTC等の希少細胞の回収・検出には好適である。<Cell suspension>
The cell suspension may contain rare cells, for example, blood such as human, lymph fluid, tissue fluid, body cavity fluid, etc., and may be appropriately diluted with a diluent or the like. The cell suspension is not limited to those derived from living organisms, and may be a cell dispersion prepared by suspending cells artificially for testing and research. In particular, application of a cell suspension after separating red blood cells from blood is suitable for collecting and detecting rare cells such as CTC.
希少細胞としては、例えば癌細胞などが挙げられる。特に、細胞懸濁液が血液または血液由来検体である場合、希少細胞は、CTC〔循環腫瘍細胞または循環癌細胞〕、CEC〔循環血管内皮細胞〕およびCEP〔循環血管内皮前駆細胞〕のいずれか一種以上の細胞であってもよい。 Examples of rare cells include cancer cells. In particular, when the cell suspension is blood or a blood-derived specimen, the rare cells are any of CTC (circulating tumor cells or circulating cancer cells), CEC (circulating vascular endothelial cells) and CEP (circulating vascular endothelial progenitor cells). One or more types of cells may be used.
このような細胞懸濁液に含まれる種々の細胞の直径は、10〜100μmであることが好ましいが、少なくともマイクロチャンバー4の直径より小さいことが必要である。
The diameter of various cells contained in such a cell suspension is preferably 10 to 100 μm, but it is necessary to be at least smaller than the diameter of the
上記マイクロチャンバーチップ形成工程Cでは、少なくとも、マイクロチャンバー4が形成される領域のマイクロ流路5の体積Vと、その領域内に形成されるマイクロチャンバー4の体積の総和Wとを算出することのできる情報が予め設定される。
In the microchamber chip forming step C, at least the volume V of the
例えば、マイクロチャンバー4が長方形の領域に形成されている場合、前記マイクロ流路5の体積Vは、マイクロチャンバー4が形成される領域の長さJおよび幅Qと、マイクロ流路5の高さHとから、式:V=J×Q×Hにより算出することができる。
For example, when the
また、前記マイクロチャンバー4の体積の総和Wは、前記領域内に形成されるマイクロチャンバー4の総数Nと、マイクロチャンバー1個当たりの体積Uとから、式:W=U×Nにより算出することができる。マイクロチャンバー1個当たりの体積Uは、例えばマイクロチャンバー5が円柱の形状である場合、マイクロチャンバー4の直径Lと深さDとから、式:U=π(L/2)2Dにより算出することができる。The total volume W of the
これら設定された値は、既知情報として、例えば図5に示した細胞展開用デバイスの前処理システム200の制御手段190などに保存される。上記プレウェット液通液工程Dは、マイクロチャンバー4の濡れ性を向上させて、細胞懸濁液でマイクロチャンバー4を満たすことができるようにするために、マイクロ流路5内に予めプレウェット液11を通液する(プレウェット液を送液して、マイクロチャンバー4の内部に空気は残存しているものの、それを除いてマイクロ流路がプレウェット液11で満たされた状態とする)工程である。
These set values are stored as known information, for example, in the control means 190 of the
プレウェット液通液工程Dでは、入口部3から出口部7に向かうプレウェット液11の一方向の流れで行っても良いが、入口部3からプレウェット液11の導入と吸引を交互に行って両方向の流れで行っても良い。
In the pre-wet liquid passing process D, the
上記気泡付きマイクロチャンバー検出工程Eは、プレウェット液通液工程Dによりマイクロ流路5内にプレウェット液11を通液したときに、マイクロチャンバー4の内部に気泡9が存在する(マイクロチャンバー4の底面に気泡9が付着している)マイクロチャンバー4の数nを検出する工程である。マイクロチャンバー4上に付着した気泡9の検出は撮像装置などで行うことができる。撮像装置を介して行う場合には、単位面積(視野面積)当たりの気泡数を測定して、その単位面積内で気泡が残存するマイクロチャンバー4の割合を算出し、それをマイクロチャンバー4が形成される領域全体で気泡が残存するマイクロチャンバー4の割合Rとみなし、前記内部に気泡9が残存するマイクロチャンバー4の数nを、式:n=N×Rにより算出することができる。また、その情報は制御手段190などに保存される。
In the microchamber detection step E with bubbles, when the
気泡空気体積算出工程Fは、気泡付きマイクロチャンバー検出工程Eで検出された気泡状態の空気体積(容積)の合計量Aを算出する工程である。この気泡状態の空気体積の合計量Aの算出は、各種データが保存された制御手段190などにより行われ、制御手段190などに保存される。例えば、マイクロチャンバー4の1個あたりの内部に残存する気泡9の体積を、マイクロチャンバー4の1個あたりの体積Uとみなせば、気泡状態の空気体積の合計量Aは、式:A=U×nで算出することができる。
The bubble air volume calculation step F is a step of calculating the total amount A of the air volume (volume) in the bubble state detected in the bubbled microchamber detection step E. The calculation of the total amount A of the air volume in the bubble state is performed by the
上記作動圧算出工程Gは、気泡空気体積算出工程Fで得られた気泡状態の空気の合計体積Aと、プレウェット液11中に既に溶解している空気の溶解体積Bから、(A+B)/Bを算出し、この算出された値に常圧Pを掛けあわせて、作動圧力X=P×(A+B)/Bを算出する工程である。
The operating pressure calculation step G includes (A + B) / from the total volume A of the air in the bubble state obtained in the bubble air volume calculation step F and the dissolution volume B of the air already dissolved in the
作動圧力Xは、気泡9として残存する空気泡を全てプレウェット液11内に溶解させるために、マイクロ流路内に印加する圧力であり、以下のような原理に基づいて求められる値である。ヘンリーの法則により、気体の溶解度は圧力に比例するため、常圧Pにおいて体積Bの空気が溶解しているプレウェット液11中には、作動圧力X=P×(A+B)/B(>P)において、気泡9として残存する空気泡の体積Aと、既にプレウェット液11中に溶解している空気の体積Bの合計体積A+Bを溶解させることができる。ボイルの法則より、一定温度における気体の体積は、圧力に反比例するため、体積が(A+B)/B倍の場合は、少なくとも、常圧Pの(A+B)/B倍の作動圧力Xを掛ければ良い。また、溶解させるためには作動圧力X以上の圧力をかけても良いが、マイクロチャンバー部に対して破損等を生じない程度の圧力にする必要がある。
The operating pressure X is a pressure applied to the microchannel in order to dissolve all the air bubbles remaining as the
ここで、試薬収容器に収容したプレウェット液11が、脱気していない通常の状態のものである場合、その試薬収容基に収容したプレウェット液11中に既に溶解している空気の体積B0がそのまま、前記式に用いられるBとなる。このような脱気していないプレウェット液11を用いた場合の、プレウェット液通液工程後のマイクロチャンバー内の残存気泡量をA0とおく。Here, when the
一方、試薬収容器には、予め脱気することで溶解している空気の体積が実質的にゼロである状態のプレウェット液11を収容しておくこともできる。このような脱気したプレウェット液11を用いた場合の、プレウェット液通液工程後のマイクロチャンバー内の残存気泡量A1はおよそA0−B0となり、脱気していないプレウェット液を用いた場合の残存気泡量A0に比べて少なくすることができ、その結果作動圧力Xを低くすることができる。A0−B0≦0のときは、残存気泡量A1は実質的にゼロになり、気泡溶解工程Hはもはや必要なくなる。したがって、A1=A0−B0>0のときだけ、上記式のAにA1を代入し、作動圧力X=P×(A+B)/Bを算出し、気泡溶解工程Hを実施すればよい。また、このプレウェット液通液工程によって、試薬収容器に収容された状態では実質的にゼロであったプレウェット液への空気の溶解体積はB0となり、このB0を前記式のBとすることになる。On the other hand, the
この作動圧力Xの算出も、制御手段190で行うことができ、得られた情報は制御手段190などに保存される。
The calculation of the operating pressure X can also be performed by the
上記気泡溶解工程Hは、作動圧算出工程Gで得られた作動圧力X以上の圧力をマイクロ流路5に作用させることにより、気泡付きマイクロチャンバー上に気泡9として存在する空気をプレウェット液11内に溶かし込む工程である。
In the bubble dissolving step H, a pressure equal to or higher than the operating pressure X obtained in the operating pressure calculating step G is applied to the
<圧力の印加方法>
気泡溶解工程Hは、通液系機構110に具備された圧力ポンプなどにより行われる。また、細胞検出装置100(通液系機構110)および制御手段190は、所定の圧力がプレウェット液に印加されることを確実なものとするために、マイクロ流路内の圧力の測定機構(図示せず)およびその制御プログラムを備えていることが好ましい。<Applying pressure>
The bubble dissolving step H is performed by a pressure pump provided in the
代表的には、次の2通りの方法で、所定の作動圧力Xをマイクロ流路内のプレウェット液に印加することができる。 Typically, the predetermined operating pressure X can be applied to the pre-wet liquid in the microchannel by the following two methods.
(1)マイクロ流路内にプレウェット液を通液した後、出口部7を封止してから、さらに通液系機構110によりプレウェット液を押し出すようにする。通液系機構110による吐出操作を繰り返す(所定の時間続ける)ことにより、徐々にプレウェット液に印加される圧力を高め、所定の作動圧力Xに到達させることができ、到達すればその操作を止めればよい。
(1) After the pre-wet liquid is passed through the microchannel, the outlet portion 7 is sealed, and then the pre-wet liquid is pushed out by the
このような(1)の実施形態を採用する場合、細胞検出装置100は、出口部封止機構(図示せず)を備え、制御手段190は、所定のタイムスケジュールで自動的に、当該出口部封止機構により出口部7を封止し、通液系機構110でプレウェット液11を押すよう操作することのできる制御プログラムを実行可能なものとすることが好ましい。
When such an embodiment of (1) is adopted, the
(2)マイクロ流路内にプレウェット液を通液させる時から、あるいは通液した後、出口部7を封止せず開放したまま、通液系機構110によりプレウェット液を高流量でマイクロ流路中を移動させる。プレウェット液の移動は、通液系機構による吐出および/または吸引により行うことができ、移動の方向は、一方向でもよいし、双方向(往復送液)でもよい。少なくとも所定の作動圧力Xを生み出すために必要なプレウェット液の流量は、通液系機構110にとって適切な流量の範囲内に収まっていることが好ましいが、もしもその範囲外にある場合でも、通液系機構110の流量を適切な範囲内で設定した上で、所定の時間、吐出および/または吸引することで、所定の作動圧力Xを生み出すことが可能である。
(2) When the pre-wet liquid is passed through the micro-channel, or after the liquid is passed, the pre-wet liquid is flowed at a high flow rate by the
このような(2)の実施形態を採用する場合、制御手段190は、所定のタイムスケジュールで自動的に、通液系機構110でプレウェット液11を所定の高流量で移動させるよう操作することのできる制御プログラムを実行可能なものとすることが好ましい。また、細胞展開用デバイス30の出口部7は、マイクロ流路内のプレウェット液に圧力がかかりやすくするよう、面積が小さいものの方が好ましい。
When such an embodiment of (2) is adopted, the control means 190 operates to automatically move the
以上のように、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法では、上記の各工程(C)〜(H)を連続的に行うことにより、全てのマイクロチャンバー4をプレウェット液11で満たした細胞展開用デバイスを提供することができる。すなわち、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法では、細胞展開用デバイス30のマイクロ流路5内に、単にプレウェット液11を通液しただけでは、図9に示したようにマイクロチャンバー4内に気泡9が残存してしまうので、このマイクロ流路5内に常圧より大きい圧力を印加することにより、気泡9をプレウェット液中に溶解させている。
As described above, in the pretreatment method for a cell deployment device according to the present invention, all the
[前処理システム]
以下に、本発明に係る前処理方法を実施するのに好適な細胞展開用デバイスの前処理システム200について説明する。[Pretreatment system]
Below, the
前処理システム200は、細胞展開用デバイス30と、試薬収容器20と、細胞検出装置100と、制御手段190などとから構成されている。細胞展開用デバイス30および試薬収容器20は、細胞検出装置100にセットして用いられ、また制御手段190は細胞検出装置100を制御可能なよう接続して用いられる。
The
細胞検出装置100は、細胞展開用デバイス30のマイクロ流路5に、各種の液体を通液するための通液系機構110、撮像装置120、細胞展開用デバイス30を保持する細胞回収デバイスホルダー160、試薬収容器を保持する試薬収容器ホルダー170、ならびに細胞検出装置100が備える各種の機器類を制御するための制御手段190を備える。通液系機構110および撮像装置120は、任意の位置で液の吸引・吐出および細胞観察を可能にするための空間的な移動手段を備えることが望ましい。
The
通液系機構110は、制御手段190の制御により、試薬収容器20内に貯留されたプレウェット液11や細胞懸濁液の他、染色液、解離液、洗浄液、その他の試薬類のそれぞれの収納部と、細胞展開用デバイス10の入口部3との間を移動し、それらの液の吸引および吐出を行う機構である。具体的には、通液系機構110によって、試薬収容器に収容されているプレウェット液11、細胞懸濁液などの液体を所定の量吸引し、細胞展開用デバイス30の入口部3で所定の流量で吐出して、マイクロ流路5に導入する。
Under the control of the control means 190, the
また、通液により所定の処理が終わった後は、マイクロ流路5を満たしていた液体を入口部3から吸引して排出し、試薬収容器20の廃液収納部で吐出する。通液系機構110は、例えば、シリンジポンプ、交換可能なチップ、X軸方向(図5の左右方向)およびZ軸方向(図5の上下方向)に移動可能なアクチュエーターなどを用いて構築することができる。シリンジポンプは、細胞観察に関する各工程において、所望の流量で吸引および吐出ができる能力を有する。
Further, after the predetermined processing is completed by the liquid flow, the liquid filling the
撮像装置120は、対物レンズ、対眼レンズ、CCDカメラなどを含む蛍光顕微鏡に準じた形態とし、マイクロチャンバー4に付着した気泡9を撮影することができる。
The
制御手段190としては、細胞検出装置100の各種の機器類に接続され、それらの機器類の制御プログラムを実行可能なパーソナルコンピュータを用いることができる。制御プログラムは、パーソナルコンピュータが内蔵する記憶媒体に記憶されていても良いし、ネットワークまたは取り外し可能な記憶媒体を介してパーソナルコンピュータが利用できる状態に置かれていても良い。
As the control means 190, a personal computer connected to various devices of the
制御プログラムは、気泡空気9の検出や作動圧力Xの算出、作動圧力Xをマイクロ流路5に作用させる操作などを、各種データから自動化して求めることができるものである。また、細胞観察のための所定の工程に従って、所定のタイムスケジュールで、プレウェット液11や細胞懸濁液などを通液するよう通液系機構110を操作したりできるものである。
The control program can automatically obtain, from various data, the detection of the
本発明の好ましい実施の形態では、制御手段190により作動圧力Xを算出するようにしているが、本発明は、これに限定されない。 In the preferred embodiment of the present invention, the operating pressure X is calculated by the control means 190, but the present invention is not limited to this.
プレウェット液11の通液により気泡9が残存するマイクロチャンバー4の割合は、用いるプレウェット液の実施形態によって一定の傾向が定まっており、例えばプレウェット液としてエタノール水溶液を用いる場合、当該プレウェット液中のエタノールの濃度によって図6のように定まることが実験の結果から明らかである(なお、図6では、複数回の実験結果の中から最大値を採用している)。そのため、予め用意された図6のグラフに基づいて、気泡9が付着するマイクロチャンバー4の割合を仮定し、これにマイクロチャンバー4の体積を掛けあわせることで残存する気泡状態の空気の合計量Aを算出することもできる。
The ratio of the
このように、本発明では、制御手段190に図6の情報を記憶させておき、この情報から作動圧力Xを近似的に求めることもできる。
As described above, in the present invention, the information of FIG. 6 is stored in the
試薬収容器20には、プレウェット液11、細胞懸濁液、洗浄液など、細胞観察を行う上で流路1に通液する必要のある各種の液体が収容されている。
The
本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システム200によれば、本発明に係る前処理方法を容易に実施することができ、これにより実質的に全てのマイクロチャンバーがプレウェット液で予め満たされた細胞展開用デバイスを作製することができる。
According to the
なお、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システム200では、マイクロ流路5内の温度を室温あるいは定められたある温度で一定に維持するものであってもよいが、細胞展開用デバイス30のマイクロ流路5内にプレウェット液11を通液した後に、プレウェット液11の温度を、例えば4〜10℃程度に下げるように設定することが好ましい。プレウェット液11の温度を下げるように通液後に冷却すれば、マイクロ流路5に通液した後に残存した気泡9は、温度低下により体積が減少するため、気泡状態の空気の合計体積Aが少なくなり、また水(プレウェット液)の温度が低いほど空気の飽和溶解量が増加するので、結果として、作動圧力Xを低くすることができる。
In the cell treatment
このような実施形態を採用する場合、細胞検出装置100(細胞回収デバイスホルダー160)は、例えば冷却用プレートや小型の温度センサーを含む温度調節機構(図示せず)を備え、制御手段190は、当該温度調節機構により所定のタイムスケジュールで自動的にプレウェット液11の温度を下げるよう操作することのできる、温度調節用の制御プログラムを実行可能なものとすることが好ましい。
When such an embodiment is adopted, the cell detection apparatus 100 (cell collection device holder 160) includes a temperature adjustment mechanism (not shown) including, for example, a cooling plate and a small temperature sensor, and the
<比較例1:純水をプレウェットとして、低流量(1ml/min)で通水した場合>
幅15mm、深さ0.1mm、長さ43mmのマイクロ流路5の底面に、直径0.12mm、深さ0.05mmの円柱状のマイクロチャンバー4が14000個配置された細胞展開用デバイスのマイクロ流路5中に、シリンジポンプを用いて1ml/minで100μlの純水(エタノール濃度0%)をゆっくりと通液した。顕微鏡で観察した画像より、チャンバー数の全体の約99%のチャンバーに気泡が残存し、プレウェット液が満たされていない状態が生じた。<Comparative Example 1: When pure water is pre-wet and water is passed at a low flow rate (1 ml / min)>
A micro of a cell deployment device in which 14,000 cylindrical
<比較例2:30%エタノール水溶液を低流量(シリンジポンプ:1ml/min)で通水した場合>
幅15mm、深さ0.1mm、長さ43mmのマイクロ流路5の底面に、直径0.12mm、深さ0.05mmの円柱状のマイクロチャンバー4が14000個配置された細胞展開用デバイスのマイクロ流路5中に、シリンジポンプを用いて1ml/minで100μlの30%のエタノール水溶液をゆっくりと通液した。顕微鏡で観察した画像より、チャンバー数の全体の約15%のチャンバーに気泡が残存し、プレウェット液が満たされていない状態が生じた。<Comparative Example 2: When a 30% ethanol aqueous solution is passed through at a low flow rate (syringe pump: 1 ml / min)>
A micro of a cell deployment device in which 14,000 cylindrical
<実施例1:出口部を封止して圧力を掛けた場合>
幅15mm、深さ0.1mm、長さ43mmのマイクロ流路5の底面に、直径0.12mm、深さ0.05mmの円柱状のマイクロチャンバー4が14000個配置された細胞展開用デバイスのマイクロ流路5中に、シリンジポンプを用いて1ml/minで100μlの純水をプレウェット液としてゆっくりと通液した。顕微鏡で観察した画像より、約99%のチャンバーに気泡が残存したことが確認できた。チャンバー1個当たりの残存空気泡の体積が約0.8nlで、14000個のマイクロチャンバーの99%に空気泡が残存しているため、その体積の合計量Aは約11nlであった。25℃の室温における空気の溶解度が、1cm3中純水で約0.02cm3であるとする(理科年表より)と、マイクロ流路体積86μl中のプレウェット液には既に約1.5μl(B)の空気が溶解していると考えられるため、全ての空気を溶解するためには、(A+B)/B=約8となり、少なくとも常圧Pの8倍の空気(8P)を印加する必要があることがわかった。事前に、出口部7を封止したシリンジ(ハミルトン社製、容量1ml)の駆動量と内部圧力の関係を圧力センサ(KEYENCE社製)で測定し、プレウェット液(純水)が入った状態のマイクロ流路5内が9Pの圧力となるように、シリンジとシリンジポンプ(マイクロシリンジポンプ)で印加した。再度顕微鏡で画像を撮影したところ、約99%のマイクロチャンバーがプレウェット液で満たされていた。<Example 1: When an outlet is sealed and pressure is applied>
A micro of a cell deployment device in which 14,000 cylindrical
<実施例2:出口部を開放した状態で高流量(シリンジポンプ:40ml/min)でプレウェットした場合>
幅15mm、深さ0.1mm、長さ43mmのマイクロ流路5の底面に、直径0.12mm、深さ0.05mmの円柱状のマイクロチャンバー4が14000個配置された細胞展開用デバイスのマイクロ流路5にプレウェット液として純水を通液した場合、全てのマイクロチャンバーに、空気の気泡が残存することを仮定し、マイクロチャンバー1個当たりの残存空気泡の体積が約0.8nlで、14000個のチャンバーがあるため、その体積の合計量Aは約11μlと算出された。25℃の室温における空気の溶解度が、1cm3中純水で約0.02cm3であるとする(理科年表)と、マイクロ流路体積86μl中のプレウェット液には常圧で約1.5μl(B)の空気が溶解していると考えられるため、全ての空気を溶解するためには、少なくとも(A+B)/B=約8倍の圧力を印加する必要があることが分かった。流量は、マイクロシリンジポンプで制御した。マイクロ流路デバイスの耐圧性を考慮して、40ml/minの流量を設定し、出口部7を開放したマイクロ流路5に設置したシリンジ(テルモ社製、容量50ml)とマイクロ流路5との間にかかる圧力を圧力センサ(KEYENCE社製)で測定した。約1分間ポンプを駆動させることで、内部圧力が常圧Pの約9倍(9P)となることが分かったため、ポンプの設定流量を40ml/minとして1分間(40ml)、純水をプレウェット液としてマイクロ流路5に通液して圧力を印加した。再度顕微鏡で画像を撮影したところ、約99%のマイクロチャンバーがプレウェット液で満たされていた。<Example 2: When pre-wetting at a high flow rate (syringe pump: 40 ml / min) with the outlet portion opened>
A micro of a cell deployment device in which 14,000 cylindrical
2 マイクロチャンバーチップ
3 入口部
4 マイクロチャンバー
5 マイクロ流路
7 出口部
8 流路形成枠体
9 気泡
11 プレウェット液
20 試薬収容器
30 細胞展開用デバイス
34 枠状のシール部材
100 細胞検出装置
110 通液系機構
120 撮像装置
170 試薬収容器
190 制御手段
200 細胞展開用デバイスの前処理システム
B 既に溶解している空気の溶解量
C マイクロチャンバーチップ形成工程
D プレウェット液通液工程
E 気泡付きマイクロチャンバー検出工程
F 気泡空気体積算出工程
G 作動圧力算出工程
H 気泡溶解工程
J 長さ
X 作動圧力2
Claims (8)
の、細胞展開用デバイスの前処理方法であって、
前記マイクロチャンバーの1個当たりの体積と、前記マイクロチャンバーの総数とが予め設定されるマイクロチャンバーチップ形成工程と、
前記マイクロチャンバーチップ形成工程で得られた前記複数のマイクロチャンバーの上部に形成されているマイクロ流路にプレウェット液を通液するプレウェット液通液工程と、
前記プレウェット液を通液した後、前記マイクロチャンバー内に気泡が存在するマイクロチャンバーの数を検出する気泡付きマイクロチャンバー検出工程と、
前記気泡付きマイクロチャンバー検出工程で検出された気泡状態の空気の合計量Aを算出する気泡空気体積算出工程と、
前記気泡空気体積算出工程で得られた前記気泡状態の空気の合計体積Aと、前記プレウェット液中に既に溶解している空気の体積Bとの和から、(A+B)/Bを算出し、この算出された値に常圧Pを掛けあわせて、作動圧力X=P×(A+B)/Bを算出する作動圧算出工程と、
前記作動圧算出工程で得られた前記作動圧力X以上の圧力を前記マイクロ流路に作用させることにより、前記気泡付きマイクロチャンバー内に気泡として存在する空気を前記プレウェット液内に溶かし込む気泡溶解工程と、を有する細胞展開用デバイスの前処理方法。 In a cell deployment device in which a plurality of microchambers are formed on the bottom surface of a microchannel, this is a pretreatment method for a cell deployment device for removing bubbles remaining in the microchamber after the pre-wet liquid passing step. And
A microchamber chip forming step in which the volume per microchamber and the total number of microchambers are preset,
A pre-wet liquid flow step of passing a pre-wet liquid through a micro-channel formed in the upper part of the plurality of micro chambers obtained in the micro-chamber chip formation step;
After passing the pre-wet liquid, a microchamber with bubbles detecting step for detecting the number of microchambers in which bubbles exist in the microchamber,
A bubble air volume calculating step of calculating a total amount A of air in a bubble state detected in the microchamber with bubble detecting step;
From the sum of the total volume A of the air in the bubble state obtained in the bubble air volume calculation step and the volume B of the air already dissolved in the pre-wet liquid, calculate (A + B) / B, An operating pressure calculating step of multiplying the calculated value by the normal pressure P to calculate the operating pressure X = P × (A + B) / B;
Bubble dissolution that dissolves air existing as bubbles in the microchamber with bubbles into the pre-wet liquid by applying a pressure equal to or higher than the operating pressure X obtained in the operating pressure calculation step to the microchannel. A pretreatment method for a device for cell deployment, comprising the steps of:
前記細胞検出装置は、少なくとも、前記細胞展開用デバイスに供給されるプレウェット液と細胞懸濁液とが貯留された薬液収容器ホルダーと、
前記細胞展開用デバイスと前記薬液収容器ホルダーとの間に移動可能に配置された通液系機構とを備え、
前記制御手段は、少なくとも、前記細胞展開用デバイス内にプレウェット液が通液された後、前記マイクロチャンバー上に気泡状態で存在する空気の合計量Aを前記プレウェット液に溶解させるのに必要な作動圧力Xを算出する作動圧算出手段と、
前記薬液収容器ホルダーに貯留されたプレウェット液を、前記薬液通液機構を介して前記細胞展開用デバイス内に通液した後、前記作動圧算出手段で算出された作動圧力X以上の圧力を前記細胞展開用デバイス内に作用させ、これにより、前記プレウェット液を通液したときに前記マイクロチャンバー上に付着した気泡状態の空気の合計量Aを、前記プレウェット液内に溶解させるように処理する、細胞展開用デバイスの前処理システム。
A device for cell deployment in which a plurality of microchambers are formed, a cell detection device, and a control means;
The cell detection device includes at least a drug container holder in which a pre-wet liquid and a cell suspension supplied to the cell deployment device are stored,
A fluid passing mechanism arranged movably between the cell deployment device and the drug solution container holder;
The control means is required to dissolve the total amount A of air existing in a bubble state on the microchamber in the prewet liquid after at least the prewet liquid is passed through the cell deployment device. An operating pressure calculating means for calculating a correct operating pressure X;
After the pre-wet liquid stored in the drug solution container holder is passed through the cell deployment device via the drug solution passing mechanism, the pressure equal to or higher than the operating pressure X calculated by the operating pressure calculating means is applied. It is made to act in the device for cell deployment, so that the total amount A of air in the bubble state attached on the micro chamber when the pre-wet liquid is passed is dissolved in the pre-wet liquid. A pretreatment system for a device for cell deployment.
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