JP5822252B2 - Peptide with immunity - Google Patents
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本発明は、タイレリア・オリエンターリス（Theileria orientalis）抗原ペプチド、及び該抗原ペプチドを用いたタイレリア感染症の診断手段に関する。 The present invention relates to a Theileria orientalis antigenic peptide and a diagnostic means for a Theileria infection using the antigenic peptide.
タイレリア症はダニ媒介性の寄生虫感染症で、肥育効率を損ない畜産業における生産性が損なわれる原因となる。タイレリア感染症は、その病態病理像の違いからlymphoproliferative groupとnonlymphoproliferative groupに分けて研究されて来た。
Theileria parva(T.parva)やTheileria annulata(T.annulata)は、アフリカを中心とした熱帯地域を中心に感染が確認されるlymphoproliferative groupに属する。
一方、nonlymphoproliferative groupとなるTheileria orientalis(T.orientalis)(=selgenti) は、我が国を始め、東アジアからヨーロッパまで広範囲にその感染が確認されている。
タイレリア感染は、ダニによる吸血によってウシ体内へ送り込まれたスポロゾイトが、細網内皮系細胞に侵入してシゾントとなって増殖し、その後、血中へ出たメロゾイトが赤血球へ寄生することによる。
Theileriasis is a tick-borne parasitic infection that impairs fattening efficiency and impairs productivity in the livestock industry. Tyrelia infection has been studied by dividing it into a lymphoproliferative group and a nonlymphoproliferative group based on the difference in pathologic features.
Theileria parva (T.parva) and Theileria annulata (T.annulata) belong to a lymphoproliferative group in which infection is confirmed mainly in tropical regions centering on Africa.
On the other hand, Theileria orientalis (T. orientalis) (= selgenti), which is a nonlymphoproliferative group, has been confirmed to have a wide range of infections from Japan, East Asia to Europe.
Tyleria infection is caused by sporozoites that are sent into the bovine body by blood sucking by ticks and invade reticuloendothelial cells to proliferate as schizonts, and then merozoites that enter the blood parasitize red blood cells.
lymphoproliferative groupのT.parvaやT.annulataでは、寄生するシゾントがJNK1/2等の恒常的活性化をもたらしてTやBリンパ球をtransformするため、リンパ系細胞の異常増殖とそれに関連すると考えられる症状lymphoproliferative disease（リンパ球増殖症）が出現する。一方、nonlymphoproliferative groupのT.orientalisには、リンパ球に対するtransform活性は確認されていない。一方で、免疫応答として発生する活性酸素で赤血球の膜変性（degeneration）が生じ、脾臓の細網内皮系による変性赤血球除去が亢進することで生じると考えられる、貧血とそれに関連した慢性消耗疾患(Chronic Wasting Disease)が出現する事が知られている。但し、T.orientalisの感染動向を調査した結果、抗ダニ剤が普及した現在では、原虫が感染した赤血球が末梢血中に観察されるものの、貧血等の明らかな臨床所見を呈する事は稀で、大部分は不顕性感染となる。（以上、非特許文献１〜５参照） In T.parva and T.annulata of the lymphoproliferative groups, parasitic schizonts cause constitutive activation such as JNK1 / 2 and transform T and B lymphocytes, which may be related to abnormal proliferation of lymphoid cells Symptoms lymphoproliferative disease appears. On the other hand, T. orientalis of the nonlymphoproliferative group has not been confirmed to have a transforming activity on lymphocytes. On the other hand, active oxygen generated as an immune response causes red blood cell membrane degeneration (degeneration), and anemia and associated chronic wasting disease (reduced red blood cell removal by the splenic reticuloendothelial system) Chronic Wasting Disease) is known to appear. However, as a result of investigating T.orientalis infection trends, erythrocytes infected with protozoa are observed in the peripheral blood at present when anti-mite agents have become widespread, but rarely present with clear clinical findings such as anemia. Most of them are subclinical infections. (See Non-Patent Documents 1 to 5 above)
感染原因に対する免疫応答を解明する事で、それぞれに特有の病態を克服する為の手がかりを得られる。例えば、lymphoproliferative groupのタイレリア感染について、T.parvaやT.annulataでは、その感染によってCD4+Ｔ細胞とCD8+Ｔ細胞による免疫応答が惹起され、特に、CD8+Ｔ細胞が主たる排除エフェクターとして作用する事、そしてその誘導維持にはCD4+Ｔ細胞が必要であることが明らかにされている。またγδＴ細胞は、MHC非拘束性に感染細胞によって活性化される事、そしてそれによって感染細胞を障害する事が知られている。したがって、原虫抗原特異的なCD8+Ｔ細胞の増加を検出する事は、感染状態である事を意味する。（以上、非特許文献６〜９参照） By elucidating the immune response to the cause of infection, we can obtain clues for overcoming the specific pathology. For example, in the case of Tyrelia infection of the lymphoproliferative group, in T.parva and T.annulata, the infection causes an immune response by CD4 + T cells and CD8 + T cells, and in particular, CD8 + T cells act as the main exclusion effector. It has been clarified that CD4 + T cells are necessary for the maintenance of the induction. It is also known that γδT cells are activated by infected cells in a non-MHC-restricted manner, and thereby damage infected cells. Therefore, detecting an increase in protozoan antigen-specific CD8 + T cells means an infectious state. (See Non-Patent Documents 6-9 above)
上記のように、lymphoproliferative groupの感染におけるＴ細胞の重要性が明らかになりつつある一方で、nonlymphoproliferative groupに属するT.orientalis感染では、Ｔ細胞の特異的免疫応答は殆ど明らかにされていない。実際、１）T.orientalis感染では末梢血中のリンパ球やマクロファージと言った単核球細胞が活性化するがその特異性は明らかでない。２）マラリア症、バベシア症やアナプラズマ症と言った赤血球寄生性原虫と同様、感染赤血球は脾臓で除去される。３）血中のIFN-γ値が高い程、全身症状は穏やかである。４）T.orientalis感染の末梢血をPHAで刺激すると、IFN-γ産生が検出される事などが明らかにされている。いずれにおいても、タイレリア抗原特異的にＴ細胞が存在して活性化しているのかどうかは、明らかにされていない。（以上、特許文献１０〜１４参照） As described above, the importance of T cells in infection of the lymphoproliferative group is becoming clear, whereas in T. orientalis infection belonging to the nonlymphoproliferative group, the specific immune response of T cells is hardly clarified. In fact, 1) T. orientalis infection activates mononuclear cells such as lymphocytes and macrophages in peripheral blood, but its specificity is not clear. 2) Infected erythrocytes are removed in the spleen, as are erythroid parasites such as malaria, babesiosis, and anaplasmosis. 3) The higher the blood IFN-γ level, the milder the systemic symptoms. 4) It has been clarified that IFN-γ production is detected when peripheral blood infected with T. orientalis is stimulated with PHA. In any case, it is not clear whether T cells are present and activated specifically for the Theileria antigen. (See above, see Patent Documents 10-14)
抗原特異的なＴ細胞を検出する方法が幾つか開発されている。なかでもELISpot(Enzyme-linked immunospot)technologyは、刺激よって産生される特定のサイトカインを分泌する細胞の数を評価する方法として広く活用されている。ELISPOTアッセイは最初、抗体を産生する細胞を検出する方法として報告されており、IFN-γの検出に関しては、同じグループから１９８８年の「Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production I.Enumeration of gamma-interferon-secreting cells」に報告されている（非特許文献１４参照）。 Several methods for detecting antigen-specific T cells have been developed. Among them, ELISpot (Enzyme-linked immunospot) technology is widely used as a method for evaluating the number of cells secreting specific cytokines produced by stimulation. The ELISPOT assay was first reported as a method for detecting antibody-producing cells, and IFN-γ was detected by the same group in 1988, “Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production I. Enumeration of gamma- interferon-secreting cells "(see Non-Patent Document 14).
一方、本発明者は、T.orientalis感染ウシにおいて免疫応答の進展(サイトカイン産生変化)を詳細に解析したところ、感染後、速やかにMPSP（major piroplasm surface
protein）ペプチド特異的にIFN-γを産生する細胞が増加し、時間経過と伴に減少して消失したが、このIFN-γ産生する細胞の減少に従い、MPSPペプチド特異的に反応してIL-10を産生する細胞が増加するという知見を得ている。
このように、IFN-γ産生は、T.orientalis感染後経時的に減少、消失するから、IFN-γ産生のみ測定する手段では、診断的意義は乏しい。そのため、本発明者はT.orientalis抗原を用いてIL-10及びIFN-γを産生するＴ細胞を同時に検出する診断システムを開発し、病態診断を可能にした（特許文献１参照）。実際、このシステムによって、タイレリア感染特異的に応答してIFN-γ及びIL-10産生Ｔ細胞を検出できる。
On the other hand, the present inventor analyzed in detail the progress of immune response (change in cytokine production) in T. orientalis-infected cattle, and as a result, MPSP (major piroplasm surface)
protein) Peptide-specific IFN-γ-producing cells increased and disappeared with time. However, as this IFN-γ-producing cell decreased, it reacted specifically with the MPSP peptide to produce IL- The knowledge that the cell which produces 10 increases is obtained.
Thus, since IFN-γ production decreases and disappears over time after infection with T. orientalis, the means of measuring only IFN-γ production has little diagnostic significance. For this reason, the present inventor has developed a diagnostic system for simultaneously detecting T cells producing IL-10 and IFN-γ using the T. orientalis antigen, thereby enabling pathological diagnosis (see Patent Document 1). In fact, this system can detect IFN-γ and IL-10 producing T cells in response to Tyreria infection specifically.
上記したように、本発明者は、牛タイレリア感染症の診断手段として、T.orientalis抗原に応答してIFN-γ及びIL-10を産生する各Ｔ細胞数の増減を評価する新たな診断システムの構築しており、本願発明の課題は、このような診断システム使用の利便性をより向上させるために、使用しうるタイレリア抗原の多様化を図るとともに、Ｔ細胞免疫応答を誘導する能力が高く、より使い勝手のよいタイレリア抗原を提供する点にある。 As described above, the present inventor, as a diagnostic means for bovine Theileria infection, is a new diagnostic system for evaluating the increase or decrease in the number of T cells that produce IFN-γ and IL-10 in response to T. orientalis antigen. In order to improve the convenience of using such a diagnostic system, the object of the present invention is to diversify the Tyreria antigens that can be used and to increase the ability to induce a T cell immune response. It is in the point of providing a more convenient Tyrelia antigen.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究の結果、タイレリア抗原の一種であるp23抗原にＴ細胞免疫応答能があるとの知見を得て、これをさらに一歩進め、p23抗原の各種部分ペプチドを合成し、Ｔ細胞免疫応答能を調べた結果、p23抗原の部分ペプチドにおいてＴ細胞免疫応答を誘導する能力を有するものがあることを見いだした。さらに、これらペプチドの中には、T.orientalisの株（サブタイプ）によらずＴ細胞免疫応答を誘導できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor has obtained the knowledge that p23 antigen, which is a kind of Tyreria antigen, has T cell immune response ability, and has taken this further one step. As a result of synthesizing the peptides and examining the T cell immune response ability, it was found that some partial peptides of the p23 antigen have the ability to induce a T cell immune response. Furthermore, it has been found that some of these peptides can induce a T cell immune response regardless of the T. orientalis strain (subtype), and the present invention has been completed.
That is, the present invention is as follows.
（１）配列番号８、９、１２、１４、１５、２０及び２１に示されるいずれか１種のアミノ酸配列を有するペプチド。
（２）配列番号３０〜３３に示されるいずれか１種のアミノ酸配列を有するペプチド。
（３）配列番号２４〜２６に示されるいずれか１種のアミノ酸配列を有するペプチド。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチドからなる、ウシのT.orientalis感染症診断剤。
（４）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド及びIFN-γに対する抗体及び／又はIL-10に対する抗体を少なくとも含むことを特徴とする、ウシのT.orientalis感染症診断キット。
(1) A peptide having any one amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 8, 9, 12, 14, 15, 20, and 21.
(2) A peptide having any one amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 30 to 33.
(3) A peptide having any one amino acid sequence shown by SEQ ID NOs: 24-26.
(4) A bovine T. orientalis infectious disease diagnostic agent comprising the peptide according to any one of (1) to (3) above.
(4) A diagnostic kit for bovine T. orientalis infection comprising at least the peptide according to any one of (1) to (4) above and an antibody against IFN-γ and / or an antibody against IL-10 .
Theileriosisの原因の一つであるT.parvaについては、すでに、Ｔ細胞免疫応の全容がほぼ解明されている。これに対してT.orientalis感染症に関しては、免疫システムで極めて重要な役割を果たす病原体由来抗原特異的Ｔ細胞がジェネレーションされるかどうか詳しくはわかっていなかった。このような状況下、本発明のペプチドにより、T.orientalis感染ウシ個体中に同病原体由来p23抗原に特異的に応答してIFN-γ及びIL-10を産生するＴ細胞が存在することを初めて検出することに成功したものである。
本発明のペプチドは、上記p23抗原特異的なＴ細胞免疫応答の誘導能が高く、T.orientalisに感染したウシが産生するp23抗原特異的なIFN-γ分泌Ｔ細胞及びIL-10分泌Ｔ細胞を刺激し、IFN-γ及びIL-10Tを分泌させ、このIFN-γ及びIL-10を感度よく検出、測定することが可能となる。このIFN-γ及びIL-10はT.orientalis感染に基づくp23抗原特異的に産生されたＴ細胞の量を反映するから、これにより、T.orientalisの感染の有無、該感染に基づく病態の程度を診断ができる。
Regarding T. parva, one of the causes of Theileriosis, the whole picture of T cell immunity has already been elucidated. On the other hand, regarding T. orientalis infection, it was not known in detail whether pathogen-derived antigen-specific T cells that play an extremely important role in the immune system are generated. Under such circumstances, for the first time, T-orientalis-infected bovine individuals have T cells that produce IFN-γ and IL-10 in response to the p23 antigen derived from the same pathogen. It has succeeded in detecting.
The peptide of the present invention has a high ability to induce the above-mentioned p23 antigen-specific T cell immune response, and p23 antigen-specific IFN-γ secreting T cells and IL-10 secreting T cells produced by cattle infected with T. orientalis , IFN-γ and IL-10T are secreted, and IFN-γ and IL-10 can be detected and measured with high sensitivity. Since IFN-γ and IL-10 reflect the amount of p23 antigen-specific T cells produced based on T. orientalis infection, the presence or absence of T. orientalis infection and the degree of pathology based on the infection Can be diagnosed.
一方、本発明のペプチドのうち、T.orientalis感染ウシ個体中に同病原体由来p23抗原に特異的に応答してIFN-γ及びIL-10特定ペプチドは、p23抗原特異的なＴ細胞免疫応答に属する株（サブクラス）によらず、p23抗原特異的なＴ細胞免疫応答を誘導する。したがって、このようなペプチドはユニバーサルな刺激剤であり、予め感染型の分かっていないT.orientalisの感染症の診断にも適用でき、この点で利便性が高い。
以上のとおり、本発明のペプチド抗原はT.orientalis感染症の診断剤として、極めて有用である。
On the other hand, among the peptides of the present invention, IFN-γ and IL-10 specific peptides respond to p23 antigen-specific T cell immune response in response to p23 antigen derived from the same pathogen in T. orientalis infected bovine individuals. It induces a p23 antigen-specific T cell immune response regardless of the strain (subclass) to which it belongs. Therefore, such a peptide is a universal stimulant and can be applied to the diagnosis of T. orientalis infectious disease whose infection type is not known in advance, and is highly convenient in this respect.
As described above, the peptide antigen of the present invention is extremely useful as a diagnostic agent for T. orientalis infection.
本発明のペプチドは、T.orientalisのp23抗原の部分ペプチドであって、そのアミノ酸配列は、配列番号８、９、１２、１４、１５、２０、２１、配列番号３０〜３３及び配列番号２４〜２６に示される。
本発明のペプチドは、ウシのT.orientalis原虫感染の有無あるいはさらにその病態を診断するための診断剤として用いられる。
上記配列番号８、９、１２、１４、１５、２０、２１及び配列番号３０〜３３で示されるペプチドは、人工感染・自然感染の両者に対して共通してＴ細胞免疫応答を示す。
さらに、配列番号２４〜２６に示されるペプチドは、T.orientalisのikeda型、及びikeda型とchitose型の両方に感染しているウシに対して、Ｔ細胞免疫応答能を有し、T.orientalis原虫のサブタイプにとらわれることなく、より幅広いタイレリア感染症の診断に適用できる。
The peptide of the present invention is a partial peptide of T. orientalis p23 antigen, and its amino acid sequence is SEQ ID NO: 8, 9, 12, 14, 15, 20, 21, SEQ ID NO: 30 to 33 and SEQ ID NO: 24 to 26.
The peptide of the present invention is used as a diagnostic agent for diagnosing the presence or absence of T. orientalis protozoa infection in cattle or the pathology thereof.
The peptides represented by SEQ ID NOs: 8, 9, 12, 14, 15, 20, and 21 and SEQ ID NOs: 30 to 33 show a T cell immune response in common to both artificial infection and natural infection.
Furthermore, the peptides shown in SEQ ID NOs: 24-26 have a T cell immune response ability against cattle infected with T. orientalis ikeda type and both ikeda type and chitose type, and T. orientalis It can be applied to diagnosis of a wider range of Theileria infections without being bound by protozoan subtypes.
以下に、本発明のペプチドを用いたT.orientalisの感染症の診断手法について説明する。
ウシがT.orientalis原虫に人工的に感染した場合のＴ細胞免疫応答は、最初に該原虫抗原特異的なIFN-γ分泌Ｔ細胞が増加し、その後徐々に該IFN-γ分泌Ｔ細胞が減少し始めるとともに、これに変わって該原虫抗原特異的なIL-10分泌Ｔ細胞が増加するようになり、その後安定して該IL-10分泌細胞が検出されるようになる。すなわち、T.orientalis抗原特異的なＴ細胞は、IFN-γの分泌により特徴づけられるTh１からIL-10の分泌により特徴づけられるTh2またはTregに推移する。
これらT.orientalis原虫抗原特異的なIFN-γ分泌Ｔ細胞とIL-10分泌Ｔ細胞の数は、T.orientalis感染の進行を反映し、IFN-γ分泌Ｔ細胞とIL-10分泌Ｔ細胞の数がともに一定値を超えるウシは、T.orientalis感染症が発症していることが、明らかになっている（特許文献１）。
Below, the diagnostic method of the infection of T. orientalis using the peptide of this invention is demonstrated.
When bovines are artificially infected with T. orientalis protozoa, the T cell immune response first increases the IFN-γ secreting T cells specific to the protozoal antigen, and then gradually decreases the IFN-γ secreting T cells. At the same time, instead of this, IL-10 secreting T cells specific to the protozoan antigen increase, and then the IL-10 secreting cells are stably detected. That is, T. orientalis antigen-specific T cells transition from Th1 characterized by IFN-γ secretion to Th2 or Treg characterized by IL-10 secretion.
The numbers of T. orientalis protozoan antigen-specific IFN-γ secreting T cells and IL-10 secreting T cells reflect the progression of T. orientalis infection, and IFN-γ secreting T cells and IL-10 secreting T cells. It has been clarified that T. orientalis infection develops in cattle whose numbers both exceed a certain value (Patent Document 1).
一方、自然感染ウシの解析では、大部分の個体は、IFN-γもしくはIL-10の片方が高い値を示した。一部の個体で、同時に高い値を示す個体が観察されたが、これらには貧血等の症状が観察された。これはタイレリア原虫感染によって誘導されたIL-10によって、Th１細胞から分泌されるIFN-γのマクロファージに対する活性化効果が抑制される状態にあり、慢性化状態から急激に病態が悪化する際に見られる病理像と類似性が認められる。
ウシがT.orientalis原虫に感染している場合、ウシの末梢血から調整された細胞懸濁液中には、T.orientalis抗原特異的に応答するIFN-γ分泌Ｔ細胞及びIL-10分泌Ｔ細胞が含有されるが、このほかにもＢ細胞、単球、マクロファージや樹状細胞等様々な細胞が含有している。
On the other hand, in the analysis of naturally infected cattle, most individuals showed higher values of either IFN-γ or IL-10. In some individuals, high values were observed at the same time, but symptoms such as anemia were observed in these individuals. This is because IL-10 induced by the Thelarial protozoa infection suppresses the activation effect of IFN-γ secreted from Th1 cells on macrophages, and is seen when the pathological condition deteriorates rapidly from the chronic state. Similar to the observed pathological features.
When cattle are infected with T. orientalis protozoa, cell suspensions prepared from bovine peripheral blood contain IFN-γ secreting T cells and IL-10 secreting T cells that respond specifically to T. orientalis antigen. In addition to these cells, various cells such as B cells, monocytes, macrophages and dendritic cells are also contained.
本発明のペプチドは、この懸濁液中に含まれる、T.orientalis抗原特異的に応答するIFN-γ分泌Ｔ細胞及びIL-10分泌Ｔ細胞を刺激し、活性化する。
この活性化によって、T.orientalis感染によってジェネレートとしたT.orientalis抗原特異的に応答するIFN-γ分泌Ｔ細胞及びIL-10分泌Ｔ細胞は、それぞれIFN-γおよびIL-10を分泌するようになる。本発明においては、この分泌されたIFN-γ及びIL-10をそれぞれターゲットとする解析法によって、T.orientalis抗原特異的に応答するIFN-γ分泌Ｔ細胞及びIL-10分泌Ｔ細胞数を求める。
この刺激は、上記細胞懸濁液に刺激物質である本発明のペプチド抗原を混和すればよい。
本発明のペプチドを使用するウシT.orientalis感染症の診断においては、被験試料の細胞懸濁液は、ウシから採取された末梢血をそのまま用いてもよいし、また、凍結保存したものを用いてもよい。
The peptide of the present invention stimulates and activates IFN-γ-secreting T cells and IL-10-secreting T cells that respond specifically to the T. orientalis antigen contained in this suspension.
By this activation, IFN-γ secreting T cells and IL-10 secreting T cells that respond specifically to T. orientalis antigen generated by T. orientalis infection seem to secrete IFN-γ and IL-10, respectively. become. In the present invention, the numbers of IFN-γ secreting T cells and IL-10 secreting T cells that specifically respond to T. orientalis antigen are determined by an analysis method targeting these secreted IFN-γ and IL-10, respectively. .
For this stimulation, the peptide antigen of the present invention, which is a stimulating substance, may be mixed in the cell suspension.
In the diagnosis of bovine T. orientalis infection using the peptide of the present invention, the peripheral blood collected from the bovine may be used as it is as the cell suspension of the test sample, or a cryopreserved one is used. May be.
より具体的には、ウシより抗凝固処理した末梢血液より、HISTOPAQE（登録商標）-1077(SIGMA-ALDRICH社)などを用いた密度遠心分離法によって単離したPeripheral Blood Mononuclear Cells(PBMCs)を使用する。単離後すぐに使用しない場合は細胞凍結保護液CP-1(極東製薬工業株式会社)などを用いて凍結保存してもよい。また、細胞懸濁液の調製は特に限定されるものではなく、通常使用される培地等により行うが、可能な限りRPMI１６４０培地へ最終濃度１０％非働済FCS、５０μM2-メルカプトエタノール、１００units/ml penicillin、１００μg/ml streptomycinを添加したRPMIコンプリートメディウムが望ましい。また、使用するPBMCはRPMIコンプリートメディウムへ懸濁した際に細胞数検出キットNucleoCassette(chemometec社)もしくは血球計算盤を用いて細胞数を算出した後に測定に用いる。 More specifically, Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) isolated by density centrifugation using HISTOPAQE (registered trademark) -1077 (SIGMA-ALDRICH) from peripheral blood anticoagulated from cattle To do. When not used immediately after isolation, cell cryoprotectant CP-1 (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) may be used for cryopreservation. The preparation of the cell suspension is not particularly limited, and is carried out using a commonly used medium or the like. However, as much as possible, the final concentration of 10% inactivated FCS, 50 μM 2-mercaptoethanol, 100 units / ml in RPMI 1640 medium. RPMI complete medium supplemented with penicillin and 100 μg / ml streptomycin is desirable. In addition, the PBMC to be used is used for measurement after suspending in RPMI complete medium after calculating the number of cells using a cell number detection kit NucleoCassette (chemometec) or a hemocytometer.
上記T.orientalis抗原の混和によって活性化し、IFN-γおよびIL-10を分泌するようになった細胞懸濁液中のＴ細胞数の計測には、例えばIFN-γおよびIL-10 ELISpotアッセイに代表されるサイトカイン検出システムを用いることが可能である。具体的にはPBMCｓ懸濁液をＴ細胞刺激用ペプチドとともに96ウェルプレート(PVDFボトム)にて培養することで、この培養ウェル底面に事前コーティングされた抗IFN-γ抗体および抗体IL-10抗体と接触させ、最終的に底面のこれらの抗体に捕獲されたIFN-γおよびIL-10を特異的抗体で検出する。この様なやり方で検出されたIFN-γおよびIL-10を分泌するようになったＴ細胞の数は、求めるT.orientalis感染によってジェネレートとしたT.orientalis抗原特異的に応答するIFN-γ分泌Ｔ細胞及びIL-10分泌Ｔ細胞数に対応する。 To measure the number of T cells in a cell suspension activated by mixing the T. orientalis antigen and secreting IFN-γ and IL-10, for example, an IFN-γ and IL-10 ELISpot assay is used. It is possible to use a representative cytokine detection system. Specifically, by culturing a PBMCs suspension with a T cell stimulating peptide in a 96-well plate (PVDF bottom), the anti-IFN-γ antibody and the antibody IL-10 antibody pre-coated on the bottom surface of the culture well The IFN-γ and IL-10 that have been contacted and finally captured by these antibodies on the bottom surface are detected with specific antibodies. The number of T cells that became secreted IFN-γ and IL-10 detected in this way was determined by the T.orientalis antigen specific response generated by the desired T.orientalis infection. Corresponds to the number of secreted T cells and IL-10 secreted T cells.
上記使用する抗IFN-γ抗体数および抗体IL-10抗体は、ウシ由来のIFN-γ及びIL-10を結合できるものであればよい。又、抗体の種類は、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体のどちらでも使用可能である。
サイトカイン分泌Ｔ細胞の数を測定する方法は、抗体による細胞内染色を行ないフローサイトメーターで検出する等いくつか知られているが、本願発明においては、上記ELISpot(Enzyme-linked immunospot)法が好ましく用いられる。
このように求められたT.orientalis抗原特異的に応答するIFN-γ分泌Ｔ細胞及びIL-10分泌Ｔ細胞数は、T.orientalis感染の状態を反映し、診断対象のウシにおいてIFN-γ分泌Ｔ細胞及びIL-10分泌Ｔ細胞数がともに検出されない場合には、診断対象のウシはT.orientalisに感染しておらず、また、IFN-γ分泌Ｔ細胞及びIL-10分泌Ｔ細胞数が単独または両方で一定基準値を超える場合には、診断対象のウシにおいて、T.orientalis感染症を発症しているか、あるいは発症する恐れが高いものと判定することができる。この基準値は、IFN-γ分泌Ｔ細胞及びIL-10分泌Ｔ細胞数とT.orientalis感染症の発症との関係を調べることにより、求めることが可能である。
The number of anti-IFN-γ antibodies and the antibody IL-10 used above may be any antibodies that can bind bovine-derived IFN-γ and IL-10. Further, as the type of antibody, either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be used.
There are several known methods for measuring the number of cytokine-secreting T cells, such as intracellular staining with antibodies and detection with a flow cytometer. In the present invention, the above-mentioned ELISpot (Enzyme-linked immunospot) method is preferred. Used.
The number of IFN-γ secreting T cells and IL-10 secreting T cells that respond specifically to the T. orientalis antigen thus determined reflects the state of T. orientalis infection, and IFN-γ secretion in the cattle to be diagnosed If the number of T cells and IL-10 secreting T cells are not detected, the cattle to be diagnosed are not infected with T. orientalis, and the numbers of IFN-γ secreting T cells and IL-10 secreting T cells are When a certain reference value is exceeded, alone or both, it can be determined that the cattle to be diagnosed develop or are likely to develop T. orientalis infection. This reference value can be obtained by examining the relationship between the number of IFN-γ secreting T cells and IL-10 secreting T cells and the onset of T. orientalis infection.
例えば、ELISpot法を使用した場合、T.orientalis感染症の発症は、細胞懸濁液中の各T.orientalis抗原特異的IFN-γ分泌Ｔ細胞およびIL-10分泌Ｔ細胞に由来する各スポット数が、それぞれともに(IFN-γは１×10E6cellsあたり、IL-10は１×10E5cellsあたり)１０個以上検出された場合に生じている。なお、ウシPBMCは末梢血液１００mlより約２×10E9cells程度が回収できるため、末梢血液１ml当たり約２×10E7cellsが含まれる。IFN-γ検出ウエルでは１×10E6cells、IL-10検出ウエルでは１×10E5cellsのPBMCを播種して測定する場合、それぞれの検出されたサイトカインスポット数が「１０」とすると、１mlあたりIFN-γ分泌Ｔ細胞が２００個、IL-10分泌Ｔ細胞が２０００個含まれている。よって、本発明のペプチドを使用して診断する場合、この値をT.orientalis感染症が発症しているか否かの基準値とすることができる。また、ELISpot法以外の方法を使用した場合においても、この基準値に対応する解析データに基づき、T.orientalis感染症が発症しているか否かの診断を行うことができる。ただし、これらの基準値は、求められる解析の精度に依存するため、実験の目的に応じて最適化することも可能である。 For example, when the ELISpot method is used, the onset of T. orientalis infection is determined by the number of spots derived from each T. orientalis antigen-specific IFN-γ secreting T cell and IL-10 secreting T cell in the cell suspension. However, it occurs when 10 or more of each are detected (IFN-γ per 1 × 10E6 cells, IL-10 per 1 × 10E5 cells). Since bovine PBMC can collect about 2 × 10E9 cells from 100 ml of peripheral blood, about 2 × 10E7 cells are contained per 1 ml of peripheral blood. When IFN-γ detection wells are seeded with 1 × 10E6cells in IL-10 detection wells and 1 × 10E5cells in IL-10 detection wells, if the number of detected cytokine spots is “10”, IFN-γ secretion per ml It contains 200 T cells and 2000 IL-10 secreting T cells. Therefore, when diagnosing using the peptide of the present invention, this value can be used as a reference value as to whether T. orientalis infection has developed. Even when a method other than the ELISpot method is used, it is possible to diagnose whether or not a T. orientalis infection has developed based on the analysis data corresponding to the reference value. However, these reference values depend on the required accuracy of analysis, and can be optimized according to the purpose of the experiment.
上記ELISpot法に対して、既存のPCR法、血液スメア解析、既存の一般血液解析を組み合わせる事で、免疫応答のバランスと病態の診断をより確実に行うことも可能である。すなわち、PCR法および血液スメア解析によって、血液内に存在するT.orientalisを検出することでELISpot結果を補強することが可能であるし、一般血液解析によって貧血等の病態の発症の有無を直接示すことでELISpot結果との相関性を示すことが可能である。
以下に、本発明を実施例として説明するが、本発明は該実施例に何ら限定・制約されるものではない。
By combining the above-mentioned ELISpot method with the existing PCR method, blood smear analysis, and existing general blood analysis, it is possible to more reliably diagnose the balance of immune response and the pathological condition. That is, it is possible to reinforce ELISpot results by detecting T. orientalis present in blood by PCR method and blood smear analysis, and directly indicate the presence or absence of pathological conditions such as anemia by general blood analysis It is possible to show the correlation with the ELISpot result.
Hereinafter, the present invention will be described as examples, but the present invention is not limited or restricted to the examples.
本実施例において用いた手法、及び抗原ペプチドは以下に示される。 Techniques and antigenic peptides used in this example are shown below.
１）ELISpotアッセイの準備
下記の免疫活性化反応の培養が終了するまでの操作は安全キャビネットもしくはクリーンベンチ内で無菌的に行った。
底面がPolyVinylidine DiFluoride(PVDF)メンブランで構成されている９６ウエルフィルタープレート(Millipore社)を準備し、各ウエルへ７０％EtOHを５０ulずつ加え３０秒−２分間処理することにより疎水性PVDFメンブランの親水処理を行った。ウエル内のEtOHをアスピレーターにより吸引除去後、Phosphate Buffered Saline(Ca2+ Mg2+ 無添加)(PBS)を各ウエルあたり１５０ul加えた後にアスピレーターで取り除く洗浄作業を５回繰り返す。洗浄操作が終了した後、抗bovine IFN-γキャプチャー抗体(MABTECH code 3115-3)または、抗IL-10キャプチャー抗体(AbD serotec, code MCA2110, clone CC318)をPBSにより７．５μg/mlに希釈し、８０μlずつ加え４℃、一晩処理することにより底面のPVDFメンブランへキャプチャー抗体をコーティングさせた。翌日に余剰なキャプチャー抗体はアスピレーターにより吸引除去後、各ウエルを１５０μlのPBSで洗浄作業を行った。洗浄終了後のウエルにはRPMIコンプリートメディウム(RPMIメディウムへ最終濃度１０％FCS(本実験系では非働化処理したFCSを使用)、５０μM2-メルカプトエタノール、１００units/ml penicillin、１００μg/ml streptomycinになるように添加したもの)を１００μlずつ加えて室温３０分間もしくは４℃、１時間以上のブロッキング処理を行った。また、処理温度が４℃でのブロッキング処理を行った場合はELISpot assayを行う前にプレートを室温へ戻した。
1) Preparation of ELISpot assay The operation until the culture of the following immune activation reaction was completed aseptically in a safety cabinet or clean bench.
Prepare a 96-well filter plate (Millipore) with a bottom surface composed of PolyVinylidine DiFluoride (PVDF) membrane, add 50ul of 70% EtOH to each well, and treat for 30 seconds-2 minutes to make hydrophilic the hydrophobic PVDF membrane. Processed. EtOH in the well is removed by suction with an aspirator, and Phosphate Buffered Saline (without Ca2 + Mg2 + added) (PBS) is added in an amount of 150 ul per well, and then the washing operation is repeated 5 times. After the washing operation is completed, the anti-bovine IFN-γ capture antibody (MABTECH code 3115-3) or anti-IL-10 capture antibody (AbD serotec, code MCA2110, clone CC318) is diluted to 7.5 μg / ml with PBS. The capture antibody was coated on the PVDF membrane on the bottom by adding 80 μl each and treating at 4 ° C. overnight. On the next day, excess capture antibody was removed by suction with an aspirator, and each well was washed with 150 μl of PBS. In the wells after washing, RPMI complete medium (RPMI medium with final concentration of 10% FCS (deactivated FCS is used in this experimental system), 50 μM 2-mercaptoethanol, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin 100 μl each) was added, followed by blocking treatment at room temperature for 30 minutes or at 4 ° C. for 1 hour or more. In addition, when a blocking treatment at a treatment temperature of 4 ° C. was performed, the plate was returned to room temperature before performing the ELISpot assay.
２）ELISpotアッセイに使用する細胞の準備
実験に用いる細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells(PBMCs))は目的の個体から抗凝固処理した末梢血液よりHISTOPAQE（登録商標）-1077(SIGMA-ALDRICH社)による密度遠心分離法をもちいて単離した。また、単離後すぐに使用しない場合は細胞凍結保護液CP-1(極東製薬工業株式会社)などを用いて必要になるまで凍結保存した。PBMCs（脾臓細胞も使用可）はRPMIコンプリートメディウムで洗浄後、RPMIコンプリートメディウムへ再懸濁させ細胞数検出キットNucleoCassetteTM(chemometec)もしくは血球計算盤を用いて細胞数を算出しておく。
2) Preparation of cells to be used in ELISpot assay The density of cells used in the experiment (Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs)) from peripheral blood anticoagulated from the target individual was determined by HISTOPAQE (registered trademark) -1077 (SIGMA-ALDRICH). Isolated using a centrifuge. When not used immediately after isolation, the cells were cryopreserved using a cell cryoprotectant CP-1 (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like until needed. PBMCs (spleen cells can also be used) are washed with RPMI complete medium, resuspended in RPMI complete medium, and the number of cells is calculated using a cell number detection kit NucleoCassette ™ (chemometec) or a hemocytometer.
３）抗原ペプチド
今回使用した刺激抗原ペプチドを下記に示す。
ａ)タイレリア原虫表面タンパク質であるmajor piroplasm surface protein(ピロプラズマ主要表面タンパク質, MPSP)において抗原性が報告されている7C、7I、15C、15Iの４種類をペプチド合成した(J.Vet.Med.Sci 63:895-901,2001 Kakuda T et al)。
ｂ)タイレリア原虫表面タンパク質であるIkeda型p23抗原に対して１０アミノ酸をオーバーラップさせた２０アミノ酸残基からなる１９種類をペプチド合成した(Int.J.Parasitol.,29:593-599,1999 Sako Y et al)
ｃ）タイレリア原虫表面タンパク質であるchitose型p23抗原の部分ペプチド３種を合成した。
これら合成された各ペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
3) Antigenic peptide The stimulating antigen peptide used this time is shown below.
a) Peptide synthesis of 4 types of antigens, 7C, 7I, 15C, and 15I, which have been reported to be antigenic in major piroplasm surface protein (MPSP), a P. cerevisiae surface protein (J. Vet. Med. Sci 63: 895-901,2001 Kakuda T et al).
b) 19 kinds of peptides consisting of 20 amino acid residues in which 10 amino acids overlap with the Ikeda-type p23 antigen, which is a Theilaria parasite surface protein, were synthesized (Int. J. Parasitol., 29: 593-599, 1999 Sako). Y et al)
c) Three partial peptides of chitose-type p23 antigen, which is a surface protein of Theileria parasite, were synthesized.
The amino acid sequences of these synthesized peptides are shown below.
MPSP由来ペプチド
7C（MPSP Chitose型アミノ酸配列の第６１位から８０位からなるペプチド配列）；DTSKFTPTVAHRLKHAEDLF（配列番号１)
7I（MPSP Ikeda型アミノ酸配列の第６１位から８０位からなるペプチド配列）；DTSKFTPTVAHRLKHAEDLF（配列番号２)
15C（MPSP Chitose型アミノ酸配列の第１４１位から１６０位からなるペプチド配列）；GTGKVYDFVGNFKVTKVKFE（配列番号３)
15I（MPSP Ikeda型アミノ酸配列の第１４１位から１６０位からなるペプチド配列）；GTGKLYNFIGNFKVKKVMFE（配列番号４)
Ikeda型p23抗原由来ペプチド
p23 Ikeda No.1（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第２９位から４８位からなるペプチド配列）；TAIYIDKDGKFPDRITINHF（配列番号５)
p23 Ikeda No.2（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第３９位から５８位からなるペプチド配列）；FPDRITINHFQSDMEGYKAY（配列番号６)
p23 Ikeda No.3（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第４９位から６８位からなるペプチド配列）；QSDMEGYKAYTYQKDGDKYV（配列番号７)
p23 Ikeda No.4（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第５９位から７８位からなるペプチド配列）；TYQKDGDKYVNISKVFYGER（配列番号８)
p23 Ikeda No.5（p23Ikeda 型アミノ酸配列の第６９位から８８位からなるペプチド配列）；NISKVFYGERLLKVAGYNMK（配列番号９)
p23 Ikeda No.6（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第７９位から９８位からなるペプチド配列）；LLKVAGYNMKCDYVFYIKVF（配列番号１０)
p23 Ikeda No.7(p23 Ikeda型アミノ酸配列の第８９位から１０８位からなるペプチド配列)；CDYVFYIKVFWKADIAPFLI(配列番号１１)
p23 Ikeda No.8（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第９９位から１１８位からなるペプチド配列）；WKADIAPFLIKLKYYSWSWA（配列番号１２)
p23 Ikeda No.9（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第１０９位から１２８位からなるペプチド配列）；KLKYYSWSWAPYRKHFKLNP（配列番号１３)
p23 Ikeda No.10（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第１１９位から１３８位からなるペプチド配列）；PYRKHFKLNPQLEWEEVFIP（配列番号１４)
p23 Ikeda No.11（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第１２９位から１４８位からなるペプチド配列）；QLEWEEVFIPTIDETSETGY（配列番号１５)
p23 Ikeda No.12（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第１３９位から１５８位からなるペプチド配列）；TIDETSETGYRKLFKQRMDN（配列番号１６)
p23 Ikeda No.13（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第１４９位から１６８位からなるペプチド配列）；RKLFKQRMDNLVSLIGDDLL（配列番号１７）
p23 Ikeda No.14（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第１５９位から１７８位からなるペプチド配列）；LVSLIGDDLLSTYKPFKATK（配列番号１８)
p23 Ikeda No.15（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第１６９位から１８８位からなるペプチド配列）；STYKPFKATKAEQVVAGATE（配列番号１９)
p23 Ikeda No.16（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第１７９位から１９８位からなるペプチド配列）；AEQVVAGATEEEKSDKKKYV（配列番号２０)
p23 Ikeda No.17（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第１８９位から２０８位からなるペプチド配列）；EEKSDKKKYVLMVVVVVVFV（配列番号２１)
p23 Ikeda No.18（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第１９９位から２１８位からなるペプチド配列）；LMVVVVVVFVVVASLVVFLV（配列番号２２)
p23 Ikeda No.19（p23 Ikeda型アミノ酸配列の第２０９位から２２３位からなるペプチド配列）；VVASLVVFLVKFCLK（配列番号２３)
MPSP-derived peptide
7C (peptide sequence consisting of positions 61 to 80 of the MPSP Chitose amino acid sequence); DTSKFTPTVAHRLKHAEDLF (SEQ ID NO: 1)
7I (peptide sequence consisting of positions 61 to 80 of the MPSP Ikeda type amino acid sequence); DTSKFTPTVAHRLKHAEDLF (SEQ ID NO: 2)
15C (peptide sequence consisting of positions 141 to 160 of the MPSP Chitose type amino acid sequence); GTGKVYDFVGNFKVTKVKFE (SEQ ID NO: 3)
15I (peptide sequence consisting of positions 141 to 160 of the MPSP Ikeda type amino acid sequence); GTGKLYNFIGNFKVKKVMFE (SEQ ID NO: 4)
Ikeda-type p23 antigen-derived peptide
p23 Ikeda No. 1 (peptide sequence consisting of positions 29 to 48 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); TAIYIDKDGKFPDRITINHF (SEQ ID NO: 5)
p23 Ikeda No.2 (peptide sequence consisting of positions 39 to 58 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); FPDRITINHFQSDMEGYKAY (SEQ ID NO: 6)
p23 Ikeda No.3 (peptide sequence consisting of positions 49 to 68 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); QSDMEGYKAYTYQKDGDKYV (SEQ ID NO: 7)
p23 Ikeda No.4 (peptide sequence consisting of positions 59 to 78 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); TYQKDGDKYVNISKVFYGER (SEQ ID NO: 8)
p23 Ikeda No.5 (peptide sequence consisting of positions 69 to 88 of the p23Ikeda type amino acid sequence); NISKVFYGERLLKVAGYNMK (SEQ ID NO: 9)
p23 Ikeda No. 6 (peptide sequence consisting of positions 79 to 98 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); LLKVAGYNMKCDYVFYIKVF (SEQ ID NO: 10)
p23 Ikeda No. 7 (peptide sequence consisting of positions 89 to 108 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); CDYVFYIKVFWKADIAPFLI (SEQ ID NO: 11)
p23 Ikeda No.8 (peptide sequence consisting of positions 99 to 118 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); WKADIAPFLIKLKYYSWSWA (SEQ ID NO: 12)
p23 Ikeda No. 9 (peptide sequence consisting of positions 109 to 128 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); KLKYYSWSWAPYRKHFKLNP (SEQ ID NO: 13)
p23 Ikeda No. 10 (peptide sequence consisting of positions 119 to 138 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); PYRKHFKLNPQLEWEEVFIP (SEQ ID NO: 14)
p23 Ikeda No.11 (peptide sequence consisting of positions 129 to 148 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); QLEWEEVFIPTIDETSETGY (SEQ ID NO: 15)
p23 Ikeda No.12 (peptide sequence consisting of positions 139 to 158 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); TIDETSETGYRKLFKQRMDN (SEQ ID NO: 16)
p23 Ikeda No.13 (peptide sequence consisting of positions 149 to 168 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); RKLFKQRMDNLVSLIGDDLL (SEQ ID NO: 17)
p23 Ikeda No. 14 (peptide sequence consisting of positions 159 to 178 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); LVSLIGDDLLSTYKPFKATK (SEQ ID NO: 18)
p23 Ikeda No.15 (peptide sequence consisting of positions 169 to 188 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); STYKPFKATKAEQVVAGATE (SEQ ID NO: 19)
p23 Ikeda No.16 (peptide sequence consisting of positions 179 to 198 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); AEGVVAGATEEEKSDKKKYV (SEQ ID NO: 20)
p23 Ikeda No. 17 (peptide sequence consisting of positions 189 to 208 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); EEKSDKKKYVLMVVVVVVFV (SEQ ID NO: 21)
p23 Ikeda No.18 (peptide sequence consisting of positions 199 to 218 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); LMVVVVVVFVVVASLVVFLV (SEQ ID NO: 22)
p23 Ikeda No.19 (peptide sequence consisting of positions 209 to 223 of the p23 Ikeda type amino acid sequence); VVASLVVFLVKFCLK (SEQ ID NO: 23)
Chitose型p23抗原由来ペプチド
p23 Chitose No.4（p23 Chitose型アミノ酸配列の第５９位から７８位からなるペプチド配列）；TYQKEGDKYVNITKVFFGER（配列番号２４）
p23 Chitose No.8（p23 Chitose型アミノ酸配列の第９９位から１１８位からなるペプチド配列）；WKGELAPFLIKLKYYSWSWA（配列番号２５)
p23 Chitose No.16（p23 Chiotse型アミノ酸配列の第１７９位から１９８位からなるペプチド配列）；AEQTVAVATEEEKSDKKKYV（配列番号２６）
Chitose-type p23 antigen-derived peptide
p23 Chitose No. 4 (peptide sequence consisting of positions 59 to 78 of the p23 Chitose type amino acid sequence); TYQKEGDKYVNITKVFFGER (SEQ ID NO: 24)
p23 Chitose No. 8 (peptide sequence consisting of positions 99 to 118 of the p23 Chitose type amino acid sequence); WKGELAPFLIKLKYYSWSWA (SEQ ID NO: 25)
p23 Chitose No.16 (peptide sequence consisting of positions 179 to 198 of the p23 Chiotse type amino acid sequence); AEGTVAVATEEEKSDKKKYV (SEQ ID NO: 26)
T.orientalisp23抗原のサブタイプ３種のアミ酸配列（Buffeli型；配列番号２７、Chitose型；配列番号２８、Ikeda型；配列番号２９）、及び該p23抗原における上記合成した各ペプチドの対応する領域は図１に示される。
上記p23 Chitose Ｎｏ．４、Ｎｏ．８及びＮｏ．１６は、それぞれp23ikedaＮｏ．４、Ｎｏ．８及びＮｏ．１６に対応している。
T. orientalisp23 antigen subtype 3 amino acid sequences (Buffeli type; SEQ ID NO: 27, Chitose type; SEQ ID NO: 28, Ikeda type; SEQ ID NO: 29), and corresponding regions of each of the synthesized peptides in the p23 antigen Is shown in FIG.
P23 Chitose No. above. 4, no. 8 and no. 16 is p23ikedaNo. 4, no. 8 and no. 16 is supported.
４）免疫活性化反応
上記１）のキャプチャー抗体をブロッキングした９６ウエルフィルタープレートにおいて、ブロッキング処理に用いたRPMIコンプリートメディウムを除去した後に、抗bovine IFN-γキャプチャー抗体をコーティングしたウエルには３×10E5cellsまたは抗IL-10キャプチャー抗体をコーティングしたウェルには１×10E5cellsの細胞を含むRPMIコンプリートメディウム１００μlずつウェルへ播種する。刺激用抗原ペプチドを合成し、RPMIコンプリートメディウムで最終濃度の２倍濃度に調製し用いた。調製した刺激用抗原ペプチドを１００ulずつ加えて目的の最終濃度の刺激用抗原ペプチドを含む細胞懸濁液２００ulとする。ELISPOTアッセイのコントロールとしては最終濃度１μg/ml phytohemagglutin (PHA)で刺激するためのウエルを用意し、数回ピペティングした後に３７℃のCO2インキュベーター内で１８−４２時間、振動を与えないように培養した。
4) Immune activation reaction After removing the RPMI complete medium used for blocking treatment in the 96-well filter plate blocked with the capture antibody of 1) above, the well coated with anti-bovine IFN-γ capture antibody is 3 × 10E5cells Alternatively, 100 μl of RPMI complete medium containing 1 × 10E5 cells is seeded in each well coated with anti-IL-10 capture antibody. An antigenic peptide for stimulation was synthesized, prepared with RPMI complete medium to a concentration twice the final concentration, and used. 100 ul of the prepared stimulating antigenic peptide is added to obtain 200 ul of cell suspension containing the target final concentration of the stimulating antigenic peptide. As a control for the ELISPOT assay, a well for stimulation with a final concentration of 1 μg / ml phytohemagglutin (PHA) was prepared. After pipetting several times, it was cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 18 to 42 hours without shaking. .
５）ELISpotアッセイの検出
細胞懸濁液を除去した後に２００μl PBSで５回洗浄作業をし、０．５％FCSを含むPBS(０．５％ FCS/PBS)で希釈した抗bovine IFN-γビオチン化抗体(最終濃度０．２５ug/ml MABTECH code 3115-6)または抗bovine IL-10ビオチン化抗体(最終濃度０．２５μg/ml AbD serotec code MCA211B clone CC320)をそれぞれのサイトカインに対応するウエルへ８０μlずつ加えて室温２時間反応させた。ビオチン化抗体溶液を除去し、２００μlPBSで５回洗浄作業をした後に０．５％FCS/PBSで１０００倍希釈したHorseradish Peroxidase(HRP)をコンジュゲートしたstreptavidin(MABTECH code 3310-9)を室温１時間反応させた。HRP溶液を除去し、２００μlPBSで５回洗浄作業をした後に3-Amino-9-ethylcarbazole(AEC)substrate kit(BD Biosciences code 551951)を用いて室温３０分間、発色させた。
流水により反応液を洗い流し発色反応を停止させる。プレートは風乾によって十分に乾燥させた。
5) Detection of ELISpot assay Anti-bovine IFN-γ biotin diluted with PBS containing 0.5% FCS (0.5% FCS / PBS) after washing with 200 μl PBS after removing the cell suspension. 80 μl of conjugated antibody (final concentration 0.25 ug / ml MABTECH code 3115-6) or anti-bovine IL-10 biotinylated antibody (final concentration 0.25 μg / ml AbD serotec code MCA211B clone CC320) to wells corresponding to each cytokine They were added in portions and allowed to react at room temperature for 2 hours. After removing the biotinylated antibody solution and washing 5 times with 200 μl PBS, streptavidin (MABTECH code 3310-9) conjugated with Horseradish Peroxidase (HRP) diluted 1000 times with 0.5% FCS / PBS for 1 hour at room temperature Reacted. After removing the HRP solution and washing 5 times with 200 μl PBS, color was developed using a 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) substrate kit (BD Biosciences code 551951) at room temperature for 30 minutes.
Rinse the reaction solution with running water to stop the color reaction. The plate was thoroughly dried by air drying.
６）タイレリア病の顕微鏡検査(ギムザ染色による原虫の直接観察)
検体ウシより採取した血液をスライドガラスへ塗布し、乾燥させた。メタノールによって固定した後に、MUTO化学薬品より購入したギムザ液により添付プロトコールにしたがって染色を行った。染色が終了した後に軽く水洗し、再び乾燥させ封入した。
その後に下記基準に従って顕微鏡を用いて検鏡し下記の基準に従って原虫の感染を判定した。
+ １０視野を観察して、１個の原虫を検出したもの
++ １０視野を観察して、２−９個の原虫を検出したもの
+++ １視野で１−９個の原虫を検出したもの
++++ １視野で１０個以上の原虫を検出したもの
6) Microscopic examination of Theileria disease (direct observation of protozoa by Giemsa staining)
Blood collected from a sample cow was applied to a slide glass and dried. After fixation with methanol, staining was performed with Giemsa solution purchased from MUTO Chemicals according to the attached protocol. After the dyeing was completed, it was washed lightly, dried again and sealed.
Thereafter, it was examined using a microscope according to the following criteria, and protozoan infection was determined according to the following criteria.
+ Observed 10 fields and detected 1 protozoa
++ Observed 10 fields of view and detected 2-9 protozoa
+++ 1 to 1 protozoa detected in 1 field of view
++++ More than 10 protozoa detected in one field of view
７）タイレリア病の遺伝子診断
タイレリア病の遺伝子診断(Polymerase Chain Reaction(PCR)法)は、J Vet Med Sci 66:251-256,2004とJ Clin.Micro.31:2565-2569に従って実施した。その概略を示す。検体から採取した血液サンプルは０．１％NaCl溶液処理により赤血球を溶血させた。遠心操作後に得られたピロプラズマと赤血球デブリをDNA extraction buffer(10mM Tris-HCl(pH8.0)、１５０mM NaCl、１０mM EDTA)へ溶解させ、この溶液中へsodium dodecyl sulfate(最終濃度０．１％)とprotease K(最終濃度１００ug/ml)になるように加えて、５５℃２時間処理する。抽出されたDNAはフェーノール・クロロフォルム法、エタノール沈殿により精製し、PCR法のテンプレートとして使用した。PCR法の反応行程は、熱変性：９５℃で２分(最初の熱変性は３分)、アニーリング：６３℃で２分、伸長反応：７３℃で３分(最終サイクルが終了した後に７３℃で３分を行う)を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。次に、このPCR法によって得られた産物を常法に従い電気泳動分析する。その結果分離できたバンドパターンを分析することによりタイレリア感染を判定した。
7) Genetic diagnosis of Theileria disease The genetic diagnosis (Polymerase Chain Reaction (PCR) method) of Theileria disease was performed according to J Vet Med Sci 66: 251-256, 2004 and J Clin. Micro.31: 2565-2569. The outline is shown. Blood samples collected from the specimens were lysed with red blood cells by treatment with 0.1% NaCl solution. Pyroplasma and erythrocyte debris obtained after centrifugation are dissolved in DNA extraction buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA), and sodium dodecyl sulfate (final concentration 0.1%) is added to this solution. ) And protease K (final concentration 100 ug / ml) and treated at 55 ° C. for 2 hours. The extracted DNA was purified by the phenol / chloroform method and ethanol precipitation and used as a template for the PCR method. The reaction process of the PCR method is as follows: heat denaturation: 95 ° C. for 2 minutes (initial heat denaturation is 3 minutes), annealing: 63 ° C. for 2 minutes, extension reaction: 73 ° C. for 3 minutes (73 ° C. after the end of the final cycle) 3 minutes) was taken as one cycle, and this was carried out for 30 cycles. Next, the product obtained by this PCR method is subjected to electrophoretic analysis according to a conventional method. As a result, the band pattern thus isolated was analyzed to determine the Theileria infection.
実施例１
免疫応答機構の基礎研究において広く使用されている植物レクチン（PHA）刺激と我々が以前に明らかにしたMPSP抗原ペプチドを陽性コントロールとして、本ELISPOTアッセイ系を用いた際にp23抗原ペプチド刺激よってIFN-γが検出できるか検討した。
標的細胞として既存のタイレリア病診断法である６）顕微鏡検査と７）PCR法で確認したIkeda型T.orientalis原虫に自然に感染したウシ(自然感染ウシ)と該タイレリア原虫を含む血液を接種し感染させたウシ(人工感染ウシ)から回収したPBMCを用いた。上記４）に記載の手法（免疫活性化反応）に従い、上記１）に記載の抗bovine IFN-γキャプチャー抗体をコーティングしたプレート(IFN-γ検出プレート)に、上記２)の手法に従い調整した標的細胞と各MPSP抗原ペプチド(最終濃度：１μM)及び各Ikeda型p23抗原ペプチド(最終濃度：１μM)およびPHA(最終濃度：１μg/ml)を混合し１８時間インキュベーションした。その後、上記３)ELISpotアッセイの操作を行ってスポットを検出した。その結果、Ikeda型p23抗原ペプチドＮｏ．４（配列番号８）、Ｎｏ．５（配列番号９）、Ｎｏ．８（配列番号１２）、Ｎｏ．１０（配列番号１４）、Ｎｏ．１１（配列番号１５）、Ｎｏ．１６（配列番号２０）及びＮｏ．１７（配列番号２１）が自然感染ウシ・人工感染ウシの両方のPBMCに対して陽性コントロールとして用いたMPSP抗原ペプチドと同等以上のIFN-γのスポットを得ることができた（図２）。このことからp23抗原ペプチドにも免疫刺激能がありIFN-γを検出することが可能であるとの結論を得た。
Example 1
As a positive control using the plant lectin (PHA) stimulation widely used in basic research of immune response mechanism and the MPSP antigen peptide that we have clarified previously, IFN- It was investigated whether γ could be detected.
6) Microscopic examination and 7) Ikeda-type T. orientalis protozoa confirmed by PCR were inoculated as target cells and inoculated with cattle (naturally infected cattle) naturally infected with blood containing the protozoan protozoa. PBMCs collected from infected cattle (artificial infected cattle) were used. In accordance with the method described in 4) above (immune activation reaction), a target (IFN-γ detection plate) coated with the anti-bovine IFN-γ capture antibody described in 1) above was prepared according to the method described in 2) above. The cells were mixed with each MPSP antigen peptide (final concentration: 1 μM) and each Ikeda type p23 antigen peptide (final concentration: 1 μM) and PHA (final concentration: 1 μg / ml) and incubated for 18 hours. Thereafter, the spot was detected by operating the above 3) ELISpot assay. As a result, Ikeda-type p23 antigen peptide No. 4 (SEQ ID NO: 8), No. 4 5 (SEQ ID NO: 9), No. 5 8 (SEQ ID NO: 12), No. 8 10 (SEQ ID NO: 14), No. 10 11 (SEQ ID NO: 15), No. 11 16 (SEQ ID NO: 20) and No. 1 17 (SEQ ID NO: 21) was able to obtain an IFN-γ spot equivalent to or better than the MPSP antigen peptide used as a positive control for PBMC of both naturally and artificially infected cattle (FIG. 2). From this, it was concluded that p23 antigen peptide also has immunostimulatory ability and can detect IFN-γ.
上記実験結果から、T.orientalisのP23抗原（ikeda型）における自然感染ウシ・人工感染ウシに共通して免疫刺激を与える領域は、両感染ウシに対しIFN-γのスポットを検出できた上記抗原ペプチドＮｏ．４、５、８、１０、１１、１６、１７に対応する下記１）〜４）の領域であると考えられ、下記１）〜４）のアミノ酸配列を有するペプチドも同様に両感染ウシに対して免疫刺激能を有する。
１）AA５９−８８（Ｎｏ．４、５に対応）:TYQKDGDKYVNISKVFYGERNISKVFYGERLLKVAGYNMK（配列番号３０）
２）AA９９−１０８（Ｎｏ．８に対応）:WKADIAPFLI（配列番号３１）
３）AA１２９−１３８（Ｎｏ．１０、１１に対応）:QLEWEEVFIP（配列番号３２）
４）AA１７９−２０８（Ｎｏ．１６、１７に対応）:AEQVVAGATEEEKSDKKKYVLMVVVVVFV（配列番号３３）
Based on the above experimental results, the region of T. orientalis P23 antigen (ikeda type) that gives immunostimulation in common to both naturally infected and artificially infected cattle is the antigen that was able to detect the IFN-γ spot on both infected cattle Peptide No. The peptides having the amino acid sequences of 1) to 4) below are considered to correspond to 4, 5, 8, 10, 11, 16, 17 and the following 1) to 4) are also the same for both infected cattle. Have immunostimulatory ability.
1) AA59-88 (corresponding to Nos. 4 and 5): TYQKDGDKYVNISKVFYGERNISKVFYGERLLKVAGYNMK (SEQ ID NO: 30)
2) AA99-108 (corresponding to No. 8): WKADIAPFLI (SEQ ID NO: 31)
3) AA129-138 (corresponding to Nos. 10 and 11): QLEWEEVFIP (SEQ ID NO: 32)
4) AA 179-208 (corresponding to No. 16 and 17): AEQVVAGATEEEKSDKKKYVLMVVVVVFV (SEQ ID NO: 33)
実施例２
自然感染・人工感染に共通してＴ細胞を活性化できた６種類(Ｎｏ．４、５、８、１０、１１、１６、１７)のペプチドのうち、ikeda型p23Ｎｏ．４、８、１６及びこれらに対応するchitose型p23Ｎｏ．４、８、１６（それぞれ配列番号２４、２５、２６）がChitose型やIkeda型アミノ酸配列に特異的であるかどうかを検討するために実施例１の手順と同様にしてIkeda型のみに感染している自然感染ウシとChitose型とIkeda型の両方に感染している人工感染ウシのPBMCに対して上記Chitose型、Ikeda型ペプチドを用いてそれぞれ刺激してELISpotアッセイを行った。結果を図３に示す。これによれば、陽性コントロールとしてMPSP抗原ペプチドによる刺激実験の結果と比較しても、合成した６種類のp23抗原ペプチドは、同程度の陽性細胞数であった。しかしながら、MPSPペプチドによる刺激の場合は感染型に一致する優位な応答性が観察されたのに対し、p23抗原ペプチドの場合にはそれが観察されなかった。つまり、Ikeda型にのみ感染しているウシであっても、Chitose型のp23抗原ペプチド配列刺激で明らかな反応が検出されたのである。つまり、p23抗原ペプチド刺激は、タイレリア原虫の株(subtype)にとらわれること無く、タイレリア感染に対する免疫応答を検出できるユニバーサルな刺激剤となる可能性を有する。
Example 2
Among the 6 types of peptides (No. 4, 5, 8, 10, 11, 16, 17) that could activate T cells in common with natural infection and artificial infection, ikeda type p23 No. 4, 8, 16 and the corresponding chitose type p23No. In order to examine whether 4, 8, and 16 (SEQ ID NOs: 24, 25, and 26, respectively) are specific for the Chitos type or Ikeda type amino acid sequence, only the Ikeda type was infected in the same manner as in Example 1. The ELISpot assay was performed by stimulating the PBMCs of naturally infected cattle and artificially infected cattle infected with both Chitosose and Ikeda type using the above Chitose type and Ikeda type peptides, respectively. The results are shown in FIG. According to this, even when compared with the result of the stimulation experiment using the MPSP antigen peptide as a positive control, the synthesized 6 types of p23 antigen peptides had the same number of positive cells. However, in the case of stimulation with MPSP peptide, a superior response corresponding to the infectious type was observed, whereas that in the case of p23 antigen peptide was not observed. In other words, even in cows infected only with the Ikeda type, a clear reaction was detected by stimulating the Chitosose type p23 antigen peptide sequence. In other words, p23 antigen peptide stimulation has the potential to be a universal stimulator that can detect immune responses against the Theileria infection without being constrained by the Tyrelia parasite strain (subtype).
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