JP2018063182A - Method for analyzing bacterial flora of intestinal bacteria and method for detecting allergy to helicobacter pylori in subject - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、腸内細菌の菌叢分析方法及び被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法に関する。 The present invention relates to a method for analyzing an intestinal bacterial flora and a method for detecting allergy to Helicobacter pylori in a subject.
腸内細菌叢は、免疫バランスへの関与や疾患関連性等、様々な分野での重要性が明らかになっている。しかし、腸内細菌がいかに全身の免疫や臓器に関与するのか全く不明であった。さらに、従来、腸内細菌叢は便の解析でしか解析できないものと考えられていた。 The gut microbiota has become important in various fields such as involvement in immune balance and disease relevance. However, it was completely unknown how enteric bacteria are involved in systemic immunity and organs. Furthermore, conventionally, it was thought that the intestinal microflora can be analyzed only by stool analysis.
また、ヒトの胃粘膜にはしばしば、ヘリコバクター属の細菌（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（ヘリコバクター・ピロリ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｉｌｍａｎｉｉ（ヘリコバクター・ハイルマニ）等）、又はカンピロバクター属の細菌が感染している。 Further, human gastric mucosa is often infected with Helicobacter bacteria (for example, Helicobacter pylori, Helicobacter heilmanii, etc.) or Campylobacter bacteria.
中でも、ヘリコバクター・ピロリはヒト等の胃に生息する螺旋桿菌であり、世界人口の４０〜５０％が保菌者と考えられており、日本において４０歳以上の約７割が保菌者である。また、ヘリコバクター・ピロリは、胃粘膜に感染して胃炎を惹起する。さらに、ヘリコバクター・ピロリ感染は生涯に渡って持続することが多く、粘膜の慢性活動性炎症を背景として、慢性胃炎、胃潰瘍、胃癌、特発性血小板減少性紫斑病等を引き起こす。さらに、慢性ヘリコバクター・ピロリ胃炎（Ｂ型胃炎）は、胃腺癌及び胃リンパ腫の前兆と考えられている。ＷＨＯによれば、ヘリコバクター・ピロリは最も癌のリスクが高いクラスの発癌要因であり、最近では、胃癌患者由来の血液試料中のエクソソームにヘリコバクター・ピロリ由来のＣａｇＡタンパク質が含まれることが明らかとなった（例えば、非特許文献１、参照。）。 Among them, Helicobacter pylori is a Helicobacter pylori that lives in the stomach of humans and the like, and 40 to 50% of the world population is considered to be a carrier, and about 70% of those over the age of 40 in Japan are carriers. Helicobacter pylori also infects the gastric mucosa and causes gastritis. Furthermore, Helicobacter pylori infection often persists throughout life, causing chronic gastritis, gastric ulcer, gastric cancer, idiopathic thrombocytopenic purpura, etc. against the backdrop of chronic active inflammation of the mucosa. In addition, chronic Helicobacter pylori gastritis (type B gastritis) is considered a precursor to gastric adenocarcinoma and gastric lymphoma. According to WHO, Helicobacter pylori is the highest cancer risk class of carcinogenic factors, and recently it has become clear that exosomes in blood samples from gastric cancer patients contain Helicobacter pylori-derived CagA protein. (For example, see Non-Patent Document 1).
従来、ヘリコバクター・ピロリ感染は、ＨｐＳＡ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ Ｓｔｏｏｌ Ａｎｔｉｇｅｎ）試験によって、行われていた（例えば、非特許文献１参照。）。しかしながら、ＨｐＳＡ試験では、便中に大量のヘリコバクター・ピロリ抗原が存在するときのみ機能するため、偽陰性の結果が得られることがあった。
これに対し、特許文献１には、便、唾液、及び分泌性の試料中の病原性生物を二抗体サンドイッチ結合アッセイによりヘリコバクター・ピロリ等の細菌感染を検出する方法が開示されている。
Conventionally, Helicobacter pylori infection has been performed by an HpSA (Helicobacter pylori Stool Antigen) test (see, for example, Non-Patent Document 1). However, since the HpSA test functions only when a large amount of Helicobacter pylori antigen is present in the stool, a false negative result may be obtained.
On the other hand, Patent Document 1 discloses a method of detecting bacterial infections such as Helicobacter pylori by pathogenic organisms in stool, saliva, and secretory samples by a two-antibody sandwich binding assay.
また、ヘリコバクター・ピロリの除菌治療としては、２種類の抗生物質（アモキシシリン及びクラルスロマイシン）と１種類のプロトポンプ阻害薬（ランソプラゾール）とを１週間内服するのが一般的である。 Moreover, as a sterilization treatment of Helicobacter pylori, it is common to take two types of antibiotics (amoxicillin and clarthromycin) and one type of protopump inhibitor (lansoprazole) for one week.
本発明者らは、上記治療薬を用いたヘリコバクター・ピロリの除菌治療後の患者において、薬疹（薬剤が原因の発疹）以外の皮疹、すなわち、ヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーが起こることを初めて見出した。
しかしながら、特許文献１及び非特許文献２に記載の方法では、ヘリコバクター・ピロリの除菌治療後の皮疹が、薬疹か、ヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーかを判定することはできない。
また、便の解析以外の腸内細菌の菌叢分析方法の開発には未だ至っていなかった。
The present inventors have found for the first time that a rash other than drug eruption (rash caused by a drug), that is, allergy to Helicobacter pylori occurs in a patient after eradication treatment of Helicobacter pylori using the above therapeutic agent. It was.
However, the methods described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 cannot determine whether the rash after eradication treatment of Helicobacter pylori is a drug eruption or an allergy to Helicobacter pylori.
Moreover, the development of a method for analyzing the flora of intestinal bacteria other than stool analysis has not yet been developed.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、便の解析を行わない簡便な腸内細菌の菌叢分析方法、及び簡便且つ正確な被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法を提供する。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a simple intestinal bacterial flora analysis method that does not analyze stool, and a simple and accurate method for detecting allergy to Helicobacter pylori in a subject. provide.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ヘリコバクター・ピロリの除菌治療前後の患者由来の生体試料中のエクソソームにおいて、ヘリコバクター・ピロリ等の腸内細菌由来のタンパク質の種類及び量が変化することを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that in exosomes in patient-derived biological samples before and after Helicobacter pylori eradication treatment, proteins of enterobacteria such as Helicobacter pylori The inventors have found that the type and amount are changed, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］被検体から得られた生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する分析工程を備えることを特徴とする腸内細菌の菌叢分析方法。
［２］被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法であって、
ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬を投与された前記被検体から得られた生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する分析工程を備えることを特徴とする検出方法。
［３］前記分析工程において、Ｆｌａｇｅｌｌｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓe、Ｍｅｔｈｙｌ−ａｃｃｅｐｔｉｎｇ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴｌｐＡ）、Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｆａｃｔｏｒ ＢａｍＡ、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ） ｄｉｃｉｔｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦｅｃＡ）、Ｐｅｎｔａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｏｓｉｎｅ−３−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＳｐｏＴ）、Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ、６−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ、Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、Ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ Ｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＤＮＡ ｇｙｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ、３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ６、Ｉｎｏｓｉｎｅ−５−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｌｐｈａ、ＵｖｒＡＢＣ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ、及びＦｌａｇｅｌｌａｒ ｈｏｏｋ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２、ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨＵ、Pｕｔａｔｉｖｅ ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ ＨｃｐＣ、Ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ−５５３、１０ｋＤａ ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ、Ｐｒｏｂａｂｌｅ ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ、Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ［Ｆｅ］、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｎｏｎ−ｈｅｍｅ ｆｅｒｒｉｔｉｎ、５０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｔｕ、Ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ＨＰ＿０１７５、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ、Ｕｒｅａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｅｔａ、Ｃａｔａｌａｓｅ、ＣＯＰ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ａｄｅｎｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｈｐａｉｍ）、及びＯｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｏｍｐ１１）からなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質又はそのペプチド断片を検出する［２］に記載の検出方法。
［４］前記ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬は、アモキシシリン、クラルスロマイシン、メトロニダゾール、ランソプラゾール、及びラベプラゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種である［２］又は［３］に記載の検出方法。
That is, the present invention includes the following aspects.
[1] A method for analyzing an intestinal bacterial flora, comprising an analysis step of analyzing a protein contained in an exosome in a biological sample obtained from a subject.
[2] A method for detecting allergy to Helicobacter pylori in a subject,
A detection method comprising an analysis step of analyzing a protein contained in an exosome in a biological sample obtained from the subject administered with a therapeutic agent for Helicobacter pylori infection.
[3] In the above analysis process, Flagellum-specific ATP synthase, Mannose-6-phosphate isomerase, Methyl-accepting chemotaxis protein (TlpA), Outer membrane probe. phosphate guanosine-3-pyrophosphohydrolase (SpoT), Transketolase, 6-phosphoglucolanactonase, Glucose-6-phosphate isomerase, Type III restr ction enzyme R protein, Ferrodoxin-like protein, DNA gyrase subunit A, 30S ribosomal protein S6, Inosine-5-monophosphate dehydrogenase, DNA polymerase III subunit alpha, UvrABC system protein B, and Flagellar hook-associated protein 2, DNA-binding protein HU, Putative beta-lactamase HcpC, Flavodoxin, Cytochrome c-553, 10 kDa chaperonin, Probable peroxyredoxin, Super xide dismutase [Fe], Bacterial non-heme ferritin, 50S ribosomal protein L7 / L12, Elongation factor Tu, Putative peptidyl-prolyl cis-trans isomerase HP_0175, Thioredoxin reductase, Thioredoxin, Urease subunit beta, Catalase, COP-associated protein, Adenine at least one protein selected from the group consisting of specific DNA methyltransferase (Hpaim) and Outer membrane protein (Omp11) or its peptide fragment The method according to [2] for detecting a.
[4] The detection method according to [2] or [3], wherein the therapeutic agent for Helicobacter pylori infection is at least one selected from the group consisting of amoxicillin, clarthromycin, metronidazole, lansoprazole, and rabeprazole.
本発明によれば、便の解析を行わない簡便な腸内細菌の菌叢分析方法、及び簡便且つ正確な被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a simple intestinal bacterial flora analysis method that does not analyze feces, and a simple and accurate method for detecting allergy to Helicobacter pylori in a subject.
＜腸内細菌の菌叢分析方法＞
一実施形態において、本発明は、被検体から得られた生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する分析工程を備える腸内細菌の菌叢分析方法を提供する。
<Intestinal bacterial flora analysis method>
In one embodiment, the present invention provides an intestinal bacterial flora analysis method comprising an analysis step of analyzing a protein contained in an exosome in a biological sample obtained from a subject.
本実施形態の腸内細菌の菌叢分析方法によれば、便の解析を行わず、簡便に腸内細菌の菌叢を分析することができる。 According to the method for analyzing the flora of intestinal bacteria of this embodiment, the flora of enteric bacteria can be easily analyzed without analyzing feces.
本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬による除菌治療後の患者において、薬疹（薬剤が原因の発疹）以外の皮疹、すなわち、ヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーが起こることを初めて見出した。このとき、ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬による除菌治療前後で、患者由来の生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質が変化することを、質量分析を行うことで明らかにした。また、前記エクソソームには、ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質を含む種々の腸内細菌由来のタンパク質が含まれていることを明らかにした。前記分析結果から、特に、腸内の表層の細胞内に感染している菌がエクソソームに入り、体内に吸収されているものと考えられる。
また、ヒト等の動物の個体ごとに保有する腸内細菌の種類及び量が異なることから、個体ごとにエクソソームに含まれる腸内細菌由来のタンパク質が異なることが推測される。このことから、前記エクソソームに含まれる腸内細菌由来のタンパク質の違いが、個体の生育過程において胸腺でのＴ細胞の教育（自己抗原と非自己抗原との認識等）に関連していると考えられる。よって、エクソソームに含まれる腸内細菌由来のタンパク質を解析することで、免疫系疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アレルギー性結膜炎、 アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギー、蕁麻疹等のアレルギー疾患；ギラン・バレー症候群、クローン病、バセドウ病、橋本病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患）等の機序の解明等へ応用することができる。
The present inventors have found for the first time that a skin rash other than a drug eruption (rash caused by a drug), that is, allergy to Helicobacter pylori occurs in a patient after eradication treatment with a Helicobacter pylori infection therapeutic agent. At this time, it was clarified by mass spectrometry that the protein contained in the exosome in the patient-derived biological sample changes before and after the sterilization treatment with the Helicobacter pylori infection therapeutic agent. In addition, it was clarified that the exosome contains proteins derived from various intestinal bacteria including proteins derived from Helicobacter pylori. From the above analysis results, it is considered that in particular, bacteria infected in the cells of the surface layer in the intestine enter the exosome and are absorbed into the body.
In addition, since the types and amounts of enteric bacteria held by individual animals such as humans are different, it is presumed that the proteins derived from enteric bacteria contained in exosomes differ from one individual to another. From this, it is considered that the difference in proteins derived from enteric bacteria contained in the exosome is related to T cell education (recognition of self-antigens and non-self-antigens, etc.) in the thymus during the individual growth process. It is done. Therefore, by analyzing proteins derived from intestinal bacteria contained in exosomes, immune system diseases such as atopic dermatitis, atopic dermatitis, allergic rhinitis (hay fever), allergic conjunctivitis, allergic gastroenteritis , Bronchial asthma, childhood asthma, food allergies, drug allergies, urticaria and other allergic diseases; autoimmune diseases such as Guillain-Barre syndrome, Crohn's disease, Graves' disease, Hashimoto's disease, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus) It can be applied to elucidation of
一般的に、「エクソソーム」とは、様々な細胞が分泌する直径４０ｎｍ〜１５０ｎｍの膜小胞である。この膜小胞の中には、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の核酸、タンパク質、脂質が含まれている。さらに、エクソソームは、分泌細胞とその標的細胞の間でタンパク質や脂質を交換する重要なメッセンジャーであることが明らかとなりつつある。特に、エクソソームには生体内抗原や、抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体が含まれており、免疫細胞間での抗原情報の交換や、免疫細胞の活性化など様々な免疫応答を制御する可能性が示唆されている。よって、本実施形態の腸内細菌の菌叢分析方法においては、前記タンパク質のうち腸内細菌由来のタンパク質が腸内細菌の菌叢を反映しており、さらに免疫の獲得に関与していると考えられる。
また、エクソソームは血液等の生体試料中で数日〜数週間程度安定的に存在する。そのため、エクソソームを用いた分析は安定した結果を得ることができる。
本実施形態の腸内細菌の菌叢分析方法における工程について、以下に詳細を説明する。
In general, “exosomes” are membrane vesicles having a diameter of 40 nm to 150 nm that are secreted by various cells. These membrane vesicles contain nucleic acids such as miRNA and mRNA, proteins, and lipids. Furthermore, exosomes are becoming an important messenger that exchanges proteins and lipids between secretory cells and their target cells. In particular, exosomes contain in vivo antigens and antigen peptide / MHC complexes, suggesting the possibility of controlling various immune responses such as exchange of antigen information between immune cells and activation of immune cells. Has been. Therefore, in the method for analyzing the flora of intestinal bacteria of the present embodiment, the protein derived from enterobacteria among the proteins reflects the flora of intestinal bacteria, and is further involved in acquiring immunity. Conceivable.
In addition, exosomes exist stably in biological samples such as blood for several days to several weeks. Therefore, analysis using exosomes can obtain stable results.
Details of the steps in the intestinal bacterial flora analysis method of the present embodiment will be described below.
［分析工程］
まず、被検体から生体試料を採取する。
前記被検体としては、例えば、特別な限定はなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられ、これらに限定されない。また、被検体の種類は、目的等により任意に選択することができる。中でも、被検体はヒトであることが好ましい。被検体がヒトであることにより、ヒトにおける腸内細菌の菌叢を分析することができ、さらに免疫系疾患の機序の解明研究等へ応用することができる。
[Analysis process]
First, a biological sample is collected from a subject.
Examples of the subject include, but are not limited to, humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice, rats, and the like. The type of the subject can be arbitrarily selected depending on the purpose and the like. Among them, the subject is preferably a human. Since the subject is a human, it is possible to analyze the bacterial flora of enteric bacteria in humans, and to apply it to studies for elucidating the mechanism of immune system diseases.
前記生体試料としては、エクソソームを含むものであればよいが、エクソソームはほとんどの細胞から分泌されており、多くの生体試料中にはエクソソームが含まれている。このため、前記生体試料としては、特別な限定はなく、例えば、被検体から採取された体液試料、被検体から採取された細胞の抽出液、被検体から採取された細胞の培養上清等が挙げられ、これらに限定されない。
中でも、前記生体試料としては、採取が容易であることから、被検体から採取された体液試料であることが好ましい。
Any biological sample may be used as long as it contains exosomes, but exosomes are secreted from most cells, and many biological samples contain exosomes. Therefore, the biological sample is not particularly limited, and examples thereof include a body fluid sample collected from a subject, a cell extract collected from a subject, a cell culture supernatant collected from a subject, and the like. But are not limited to these.
Among these, the biological sample is preferably a body fluid sample collected from a subject because it is easy to collect.
前記体液試料としてより具体的には、例えば、血液、血清、血漿、尿、パフィーコート、唾液、涙液、痰、粘液、リンパ液、腹水、胸水、膀胱洗浄液等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、前記体液試料としては、採取が容易であり、その他検査における試料としても併用できることから、血液、血清、血漿、尿、パフィーコート、又は唾液であることが好ましい。 More specifically, examples of the body fluid sample include, but are not limited to, blood, serum, plasma, urine, puffy coat, saliva, tears, sputum, mucus, lymph, ascites, pleural effusion, and bladder washing fluid. Among them, the body fluid sample is preferably blood, serum, plasma, urine, puffy coat, or saliva because it can be easily collected and used as a sample in other tests.
前記被検体由来の細胞としてより具体的には、例えば、生体を構成する体細胞のうち消化器系、循環器系、泌尿器系、内分泌系の器官を構成する組織由来の細胞、生体を構成する体細胞のうち消化器系、循環器系、泌尿器系、内分泌系の器官を構成する組織から分離されたがん細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
前記組織由来の細胞としては、例えば、腎臓、副腎、肝臓、膵臓、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、胸腺、血管組織、血液、心臓等の任意の組織から採取される細胞等が挙げられ、これらに限定されない。体細胞として、より具体的には、例えば、骨髄細胞、免疫細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、マクロファージ、単球、等）、赤血球、血小板、周皮細胞、樹状細胞、上皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、肝細胞、膵島細胞（例えば、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）、心筋細胞、食道細胞、単核細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
More specifically, the subject-derived cells constitute, for example, cells derived from tissues that constitute organs of the digestive system, circulatory system, urinary system, and endocrine system among somatic cells constituting the living body. Examples of somatic cells include, but are not limited to, cancer cells isolated from tissues constituting the organs of the digestive system, circulatory system, urinary system, and endocrine system.
Examples of the tissue-derived cells include cells collected from any tissue such as kidney, adrenal gland, liver, pancreas, stomach, colon, small intestine, large intestine, bladder, thymus, vascular tissue, blood, heart, and the like. However, it is not limited to these. More specifically, as somatic cells, for example, bone marrow cells, immune cells (for example, B lymphocytes, T lymphocytes, neutrophils, macrophages, monocytes, etc.), erythrocytes, platelets, pericytes, dendrites Cells, epithelial cells, endothelial cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, hepatocytes, islet cells (eg, α cells, β cells, δ cells, ε cells, PP cells, etc.), cardiomyocytes, esophageal cells, mononuclear cells Examples include, but are not limited to, cells.
前記がん細胞とは、体細胞のうち消化器系、循環器系、泌尿器系、内分泌系の器官を構成する組織由来の細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。がん細胞の由来となる癌としては、例えば、膵癌（例えば、膵管癌等）、胃癌（例えば、乳頭腺癌、粘液性腺癌、腺扁平上皮癌等）、結腸癌（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸癌（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸癌（例えば、家族性大腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、消化管間質腫瘍等）、小腸癌（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道癌、十二指腸癌、舌癌、咽頭癌（例えば、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌等）、唾液腺癌、肝臓癌（例えば、原発性肝癌、肝外胆管癌等）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌、腎盂と尿管との移行上皮癌等）、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、膀胱癌、尿道癌、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、副甲状腺癌、血管線維腫、小児固形癌（例えば、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。
なお、本明細書において、「癌」とは、診断名を表す際に用いられ、「がん」とは、悪性新生物の総称を表す際に用いられる。
The cancer cell is a cell derived from a tissue-derived cell constituting an organ of the digestive system, circulatory system, urinary system, or endocrine system among somatic cells, and has acquired infinite proliferation ability. Examples of cancers from which cancer cells are derived include pancreatic cancer (eg, pancreatic duct cancer), gastric cancer (eg, papillary adenocarcinoma, mucinous adenocarcinoma, adenosquamous carcinoma, etc.), colon cancer (eg, gastrointestinal stroma) Tumor, etc.), rectal cancer (eg, gastrointestinal stromal tumor), colorectal cancer (eg, familial colorectal cancer, hereditary non-polyposis colorectal cancer, gastrointestinal stromal tumor, etc.), small intestine cancer (eg, non-Hodgkin lymphoma) , Gastrointestinal stromal tumors, etc.), esophageal cancer, duodenal cancer, tongue cancer, pharyngeal cancer (eg, nasopharyngeal cancer, oropharyngeal cancer, hypopharyngeal cancer, etc.), salivary gland cancer, liver cancer (eg, primary liver cancer, liver External bile duct cancer, etc.), renal cancer (eg, renal cell carcinoma, transitional cell carcinoma of the renal pelvis and ureter), gallbladder cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, urethral cancer, hemangioma, malignant lymphoma (eg, Reticulosarcoma, lymphosarcoma, Hodgkin's disease, etc.), parathyroid cancer, angiofibroma, childhood solid cancer (eg small Kidney tumors, etc.), Kaposi's sarcoma, Kaposi's sarcoma, chronic myeloproliferative diseases caused by AIDS, leukemia (e.g., acute myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, etc.) and the like, but are not limited to.
In the present specification, “cancer” is used to represent a diagnosis name, and “cancer” is used to represent a general term for malignant neoplasms.
分析工程において、生体試料中のエクソソームを単離及び精製して用いることが好ましい。単離及び精製方法としては、使用する生体試料の種類に応じて、適宜公知の方法に基づき行うことができる。
単離及び精製方法としては、例えば、遠心分離、超遠心分離、濾過、膜分離、吸着分離、免疫沈降、吸水処理等を用いて、精製することができる。また、これらの単離及び精製方法のうち、遠心分離、超遠心分離、及び濾過を組み合わせた分画遠心法（参考文献１：「Thery C. et al., “UNIT 3.22 Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids”, Current Protocols in Cell Biology, Chapter 3:Unit 3.22, doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30, 2006.」、参考文献２：「Luga V. et al., “Exosomes Mediate Stromal Mobilization of Autocrine Wnt-PCP Signaling in Breast Cancer Cell Migration”, Cell, vol. 151, Issue 7, p1542-1556, 2012.」）を用いて、精製することができる。
前記分画遠心法としてはより具体的には、まず生体試料を８００ｇ及び２，０００ｇにて連続遠心分離を行い、次いで、得られた上清をフィルター濾過し、さらに、１００，０００ｇにて遠心分離を行うことで、分離及び精製されたエクソソーム画分を得ることができる。分離処理を行うにあたっては、市販の分離器等の機器を用いればよい。
In the analysis step, exosomes in the biological sample are preferably isolated and purified for use. The isolation and purification method can be appropriately performed based on a known method according to the type of biological sample to be used.
As an isolation and purification method, it can be purified using, for example, centrifugation, ultracentrifugation, filtration, membrane separation, adsorption separation, immunoprecipitation, water absorption treatment and the like. In addition, among these isolation and purification methods, a differential centrifugation method combining centrifugation, ultracentrifugation, and filtration (Reference 1: “Thery C. et al.,“ UNIT 3.22 Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids ”, Current Protocols in Cell Biology, Chapter 3: Unit 3.22, doi: 10.1002 / 0471143030.cb0322s30, 2006., Reference 2:“ Luga V. et al., “Exosomes Mediate Stromal Mobilization of Autocrine Wnt-PCP Signaling in Breast Cancer Cell Migration ”, Cell, vol. 151, Issue 7, p1542-1556, 2012.”).
More specifically, as the differential centrifugation method, first, a biological sample is continuously centrifuged at 800 g and 2,000 g, and then the obtained supernatant is filtered and further centrifuged at 100,000 g. By performing the separation, a separated and purified exosome fraction can be obtained. In performing the separation process, a commercially available apparatus such as a separator may be used.
また、分離処理時の温度は、試料の種類に応じて適宜設定することができ、例えば０℃以上１０℃以下であればよく、例えば０℃以上５℃以下であればよい。 Moreover, the temperature at the time of a separation process can be suitably set according to the kind of sample, for example, may be 0 degreeC or more and 10 degrees C or less, for example, may be 0 degreeC or more and 5 degrees C or less.
得られた画分にエクソソームが含まれることについては、フローサイトメトリー法等により、エクソソームの膜に存在する抗原タンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＨＬＡ−ＡＢＣ）を検出することで確認することができる。 The exosome is contained in the obtained fraction by detecting antigen proteins (eg, CD9, CD81, HLA-DR, and HLA-ABC) present on the exosome membrane by flow cytometry or the like. Can be confirmed.
得られたエクソソーム画分は、ＰＢＳ等を用いて洗浄し、さらに溶解緩衝液（例えば、尿素／ＳＤＳ、ロイペプチン、ペプスタチン、及びフッ化フェニルメチルスルホニル含有緩衝液等）に再懸濁させて、エクソソームに含まれるタンパク質を抽出して用いればよい。 The obtained exosome fraction is washed with PBS or the like and further resuspended in a lysis buffer (for example, urea / SDS, leupeptin, pepstatin, and phenylmethylsulfonyl fluoride-containing buffer), The protein contained in can be extracted and used.
次いで、生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する。
分析方法としては、例えば、質量分析法、タンパク質マイクロアレイ等が挙げられ、これらに限定されない。
前記質量分析法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法等が挙げられ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳなどにより分析することができる。
Subsequently, the protein contained in the exosome in the biological sample is analyzed.
Examples of the analysis method include, but are not limited to, mass spectrometry and protein microarray.
Examples of the mass spectrometry include MALDI method and ESI method, and the analysis can be performed by MALDI-TOF, LC-MS / MS, and the like.
分析工程において、タンパク質の分析により得られた結果から、腸内細菌由来のタンパク質を選択し解析することで、被検体の腸内細菌の菌叢を推測することができる。
また、後述のヘリコバクター・ピロリ等の腸内細菌に対するアレルギーの有無を判定するための指標となり得る。
また、腸内細菌叢は、がん、心臓病、免疫系疾患、痴呆症等の各種疾患との関連性も指摘されているため、腸内細菌叢のバランスと前記疾患との関連性の解明研究に応用することができる。
In the analysis step, the intestinal bacterial flora of the subject can be estimated by selecting and analyzing the protein derived from intestinal bacteria from the results obtained by protein analysis.
Moreover, it can be an index for determining the presence or absence of allergies to enterobacteria such as Helicobacter pylori described later.
In addition, since the intestinal microflora has been pointed out to be associated with various diseases such as cancer, heart disease, immune system disease, dementia, etc., elucidation of the balance between the gut microbiota and the above diseases Can be applied to research.
＜被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法＞
一実施形態において、本発明は、被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの検出方法であって、ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬を投与された前記被検体から得られた生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する分析工程を備える検出方法を提供する。
<Method for detecting allergy to Helicobacter pylori in a subject>
In one embodiment, the present invention relates to a method for detecting allergy to Helicobacter pylori in a subject, the protein contained in an exosome in a biological sample obtained from the subject administered with a therapeutic agent for Helicobacter pylori infection. A detection method comprising an analysis step of analyzing
本実施形態の検出方法によれば、被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの有無を簡便且つ正確に判定することができる。また、被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの有無が明らかとなることで、ヘリコバクター・ピロリ感染の除菌治療に失敗した場合に、薬疹がなく被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーを有しない被検体においては、２次除菌を行うことができる。一方、薬疹がなく被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーを有する被検体においても、２次除菌を行いながら、ヘリコバクター・ピロリに対するアレルギー反応の抑制又は緩和治療も並行して行うことができる。 According to the detection method of this embodiment, the presence or absence of allergy to Helicobacter pylori in a subject can be easily and accurately determined. In addition, when the presence or absence of allergy to Helicobacter pylori in the subject is clarified, if the eradication treatment for Helicobacter pylori is unsuccessful, there is no drug eruption and the subject has no allergy to Helicobacter pylori In, secondary sterilization can be performed. On the other hand, even in a subject having no drug eruption and allergic to Helicobacter pylori in the subject, the allergic reaction to Helicobacter pylori can be suppressed or alleviated in parallel while performing secondary sterilization.
被検体において、腸内において死滅したヘリコバクター・ピロリ等の腸内細菌は腸内を通って便として排出、又は腸管から吸収され体内を循環し、尿として排出される。このとき、体内を循環するヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質の一部はマクロファージ又は樹状細胞に取り込まれ、プロセッシングされた後、前記マクロファージ又は樹状細胞からヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質を含むエクソソームとして放出される。この放出されたエクソソームは免疫細胞の活性化に関与すると考えられる。よって、除菌治療により被検体の生体試料中のエクソソームに含まれるヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質の量が増加することで、免疫反応が惹起されると考えられる。これにより、ヘリコバクター・ピロリに対するアレルギー反応が皮疹等の形で現れる。
本実施形態の検出方法における工程について、以下に詳細に説明する。
In the subject, enteric bacteria such as Helicobacter pylori that have been killed in the intestine are discharged as feces through the intestine, or are absorbed from the intestinal tract and circulated in the body to be discharged as urine. At this time, a part of Helicobacter pylori derived protein circulating in the body is taken up by macrophages or dendritic cells and processed, and then released from the macrophages or dendritic cells as exosomes containing Helicobacter pylori derived proteins. The This released exosome is thought to be involved in immune cell activation. Therefore, it is considered that an immune reaction is triggered by an increase in the amount of Helicobacter pylori-derived protein contained in the exosome in the biological sample of the subject due to the sterilization treatment. As a result, an allergic reaction to Helicobacter pylori appears in the form of a skin rash.
The steps in the detection method of the present embodiment will be described in detail below.
［分析工程］
まず、ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬を投与された被検体から生体試料を採取する。
前記被検体としては、上述の＜腸内細菌の菌叢分析方法＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、被検体はヒトであることが好ましい。被検体がヒトであることにより、ヘリコバクター・ピロリ感染の２次除菌の実施可否を判断することができる。
[Analysis process]
First, a biological sample is collected from a subject administered with a therapeutic agent for Helicobacter pylori infection.
Examples of the subject include the same as those exemplified in the above <Method for analyzing the flora of intestinal bacteria>. Among them, the subject is preferably a human. Whether or not secondary sterilization of Helicobacter pylori infection can be performed can be determined by the subject being a human.
前記ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬としては、例えば、アモキシシリン、クラルスロマイシン、メトロニダゾール、ランソプラゾール、ラベプラゾール等が挙げられ、これらに限定されない。これらの治療薬は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。中でも、治療薬は、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールを混合して用いることが好ましい。
服用方法及び服用量については、有効成分の種類、被検体の年齢、性別、体重、症状、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。例えば、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１回につき、アモキシシリン（形状：水和物）を７５０ｍｇ程度、クラルスロマイシンを２００ｍｇ程度、及びランソプラゾール（形状：ナトリウム塩）を１０ｍｇ程度同時に、１日２回、７日間続けて経口投与すればよい。
なお、クラルスロマイシンは、１回４００ｍｇ、１日２回を上限として、必要に応じて適宜増量することができる。
Examples of the therapeutic agent for Helicobacter pylori infection include, but are not limited to, amoxicillin, clarthromycin, metronidazole, lansoprazole, rabeprazole and the like. These therapeutic agents may be used alone or in combination of two or more. Among these, it is preferable that the therapeutic agent is used by mixing amoxicillin, clarthromycin, and lansoprazole.
The dosage method and dosage are appropriately adjusted in consideration of the type of active ingredient, the age, sex, weight, symptom, administration method, treatment time, etc. of the subject. For example, generally in an adult (with a body weight of 60 kg), about 750 mg of amoxicillin (form: hydrate), about 200 mg of clarthromycin, and about 10 mg of lansoprazole (form: sodium salt) at the same time, It may be administered orally twice a day for 7 consecutive days.
Clarthromycin can be appropriately increased as necessary up to 400 mg at a time, twice a day as an upper limit.
また、被検体において生体試料を採取するタイミングとしては、例えばヘリコバクター・ピロリ感染治療薬の投与期間の終了直後から１５日以内であればよく、例えば投与期間の終了から３日以上１０日以内であればよい。 Further, the timing of collecting the biological sample in the subject may be, for example, within 15 days from the end of the administration period of the Helicobacter pylori infection therapeutic agent, for example, 3 days to 10 days from the end of the administration period. That's fine.
前記生体試料としては、上述の＜腸内細菌の菌叢分析方法＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、前記生体試料としては、採取が容易であることから、被検体から採取された体液試料であることが好ましい。 Examples of the biological sample include those similar to those exemplified in the above <Method for analyzing flora of intestinal bacteria>. Among these, the biological sample is preferably a body fluid sample collected from a subject because it is easy to collect.
前記体液試料としては、上述の＜腸内細菌の菌叢分析方法＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、前記体液試料としては、採取が容易であり、その他検査における試料としても併用できることから、血液、血清、血漿、尿、パフィーコート、又は唾液であることが好ましい。 Examples of the bodily fluid sample include those similar to those exemplified in the above <Method for analyzing flora of intestinal bacteria>. Among them, the body fluid sample is preferably blood, serum, plasma, urine, puffy coat, or saliva because it can be easily collected and used as a sample in other tests.
分析工程において、生体試料中のエクソソームを単離及び精製して用いることが好ましい。単離及び精製方法としては、使用する生体試料の種類に応じて、適宜公知の方法に基づき行うことができる。
単離及び精製方法としては、上述の＜腸内細菌の菌叢分析方法＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
In the analysis step, exosomes in the biological sample are preferably isolated and purified for use. The isolation and purification method can be appropriately performed based on a known method according to the type of biological sample to be used.
Examples of the isolation and purification method include the same methods as those exemplified in the above <Method for analyzing the flora of enteric bacteria>.
得られた画分にエクソソームが含まれることについては、フローサイトメトリー法等により、エクソソームの膜に存在する抗原タンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＨＬＡ−ＡＢＣ）を検出することで確認することができる。 The exosome is contained in the obtained fraction by detecting antigen proteins (eg, CD9, CD81, HLA-DR, and HLA-ABC) present on the exosome membrane by flow cytometry or the like. Can be confirmed.
得られたエクソソーム画分は、ＰＢＳ等を用いて洗浄し、エクソソームに含まれるタンパク質を抽出して用いればよい。
エクソソーム中のタンパク質の抽出方法としては、例えば、界面活性剤又はカオトロピック試薬を用いた抽出方法等が挙げられる。
前記界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性化剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、トリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ等の非イオン界面活性剤等を挙げることができ、これらに限定されない。
界面活性剤は、タンパク質量に応じて、所定の割合で添加すればよく、例えば、エクソソームを含む溶液における界面活性剤の濃度は、例えば０．０００１（ｗ／ｖ）％以上１（ｗ／ｖ）％以下であればよく、例えば０．００２（ｗ／ｖ）％以上０．０５（ｗ／ｖ）％以下であればよく、例えば０．００５（ｗ／ｖ）％以上０．５（ｗ／ｖ）％以下であればよい。
界面活性剤が陰イオン界面活性化剤、特にＳＤＳである場合、エクソソームを含む溶液における界面活性化剤の濃度は、例えば０．００１（ｗ／ｖ）％以上０．０５（ｗ／ｖ）％以下であればよく、例えば０．００５（ｗ／ｖ）％以上０．００８（ｗ／ｖ）％以下であればよい。
このように比較的低い濃度の界面活性剤を用いることにより、効果的にタンパク質を抽出することができる。
The obtained exosome fraction may be washed with PBS or the like, and the protein contained in the exosome may be extracted and used.
Examples of a method for extracting a protein from an exosome include an extraction method using a surfactant or a chaotropic reagent.
Examples of the surfactant include anionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate (SDS) and sodium deoxycholate, cationic surfactants, amphoteric surfactants, Triton (registered trademark) X-100, Nonionic surfactants such as n-Octyl-β-D-glucoside and the like can be mentioned, but are not limited thereto.
The surfactant may be added at a predetermined ratio according to the amount of protein. For example, the concentration of the surfactant in the solution containing exosome is, for example, 0.0001 (w / v)% or more and 1 (w / v). )% Or less, for example 0.002 (w / v)% or more and 0.05 (w / v)% or less, for example 0.005 (w / v)% or more and 0.5 (w / V)% or less.
When the surfactant is an anionic surfactant, particularly SDS, the concentration of the surfactant in the solution containing exosome is, for example, 0.001 (w / v)% or more and 0.05 (w / v)%. For example, it may be 0.005 (w / v)% or more and 0.008 (w / v)% or less.
Thus, protein can be extracted effectively by using a surfactant having a relatively low concentration.
また、前記カオトロピック試薬としては、カオトロピック効果を生じさせる物質であればよく、例えば、チオシアン酸イオン等のカオトロピック塩であってもよく、具体的には、尿素、グアニジン塩酸、グアニジンイソチオシアネート等が挙げられる。
前記界面活性剤と前記カオトロピック試薬とは混合して用いてもよい。
Further, the chaotropic reagent may be any substance that causes a chaotropic effect, and may be, for example, a chaotropic salt such as thiocyanate ion, specifically, urea, guanidine hydrochloride, guanidine isothiocyanate, and the like. It is done.
The surfactant and the chaotropic reagent may be mixed and used.
また、上記エクソソームの単離及び精製と、エクソソーム中のタンパク質の抽出方法について、市販のキット（例えば、ＤｉａｇＥｘｏ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ Ｅｘｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（１０１ Ｂｉｏ社製）、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ ＲＮＡ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等）を用いて行ってもよい。 In addition, with regard to isolation and purification of the exosome and a method for extracting a protein in the exosome, a commercially available kit (for example, Diaxo (registered trademark) Serum Exosomal Protein Extraction Kit (manufactured by 101 Bio), Total Exosome RNA & Protein Isolation Isolation (Thermo Fisher Scientific, etc.) may be used.
次いで、生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する。
分析方法としては、上述の＜腸内細菌の菌叢分析方法＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
Subsequently, the protein contained in the exosome in the biological sample is analyzed.
Examples of the analysis method include the same methods as those exemplified in the above <Method for analyzing intestinal bacterial flora>.
分析工程において、タンパク質の分析により得られた結果から、ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質が検出された場合、被検体においてヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーを有すると判定することができる。 In the analysis step, when a protein derived from Helicobacter pylori is detected from the results obtained by protein analysis, it can be determined that the subject has an allergy to Helicobacter pylori.
前記ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質としては、例えば、Ｆｌａｇｅｌｌｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓe、Ｍｅｔｈｙｌ−ａｃｃｅｐｔｉｎｇ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴｌｐＡ）、Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｆａｃｔｏｒ ＢａｍＡ、Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ） ｄｉｃｉｔｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦｅｃＡ）、Ｐｅｎｔａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｏｓｉｎｅ−３−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＳｐｏＴ）、Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ、６−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ、Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、Ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ Ｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＤＮＡ ｇｙｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ、３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ６、Ｉｎｏｓｉｎｅ−５−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｌｐｈａ、ＵｖｒＡＢＣ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ、及びＦｌａｇｅｌｌａｒ ｈｏｏｋ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２、ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨＵ、Pｕｔａｔｉｖｅ ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ ＨｃｐＣ、Ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ−５５３、１０ｋＤａ ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ、Ｐｒｏｂａｂｌｅ ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ、Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ［Ｆｅ］、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｎｏｎ−ｈｅｍｅ ｆｅｒｒｉｔｉｎ、５０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｔｕ、Ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ＨＰ＿０１７５、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ、Ｕｒｅａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｅｔａ、Ｃａｔａｌａｓｅ、ＣＯＰ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ａｄｅｎｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｈｐａｉｍ）、Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｏｍｐ１１）等が挙げられ、これらに限定されない。また、これらのタンパク質のペプチド断片であってもよい。これらのタンパク質のうち、少なくとも１種が検出されることにより、被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの有無を判定することができる。 The protein from the Helicobacter pylori, for example, Flagellum-specific ATP synthase, Mannose-6-phosphate isomerase, Methyl-accepting chemotaxis protein (TlpA), Outer membrane protein assembly factor BamA, Iron (III) dicitrate transport protein (FecA ), Penta-phosphate guanosine-3-pyrophosphohydrolase (SpoT), Transketolase, 6-phosphoglucolactonase, Glucose-6-phosphate is omerase, Type III restriction enzyme R protein, Ferrodoxin-like protein, DNA gyrase subunit A, 30S ribosomal protein S6, Inosine-5-monophosphate dehydrogenase, DNA polymerase III subunit alpha, UvrABC system protein B, and Flagellar hook-associated protein 2, DNA-binding protein HU, Putative beta-lactamase HcpC, Flavodoxin, Cytochrome c-553, 10 kDa chaperon n, Probable peroxiredoxin, Superoxide dismutase [Fe], Bacterial non-heme ferritin, 50S ribosomal protein L7 / L12, Elongation factor Tu, Putative peptidyl-prolyl cis-trans isomerase HP_0175, Thioredoxin reductase, Thioredoxin, Urease subunit beta, Catalase, COP -Associated protein, Adenine specific DNA methyltransferase (Hpaim), Outer membrane protein (Omp 11) etc. are mentioned, It is not limited to these. Moreover, the peptide fragment of these proteins may be sufficient. By detecting at least one of these proteins, it is possible to determine the presence or absence of allergy to Helicobacter pylori in the subject.
また、本実施形態の検出方法において、薬剤アレルギー検査を並行して実施してもよい。前記薬剤アレルギー検査としては、例えば、パッチテスト（スクラッチパッチテスト）、プリックテスト、内服テスト（誘発テスト）、薬剤によるリンパ球刺激試験（ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ；ＤＬＳＴ）等が挙げられ、これらに限定されない。
薬剤アレルギー検査を実施することにより、２次除菌の実施可否を判断することができる。
In the detection method of the present embodiment, the drug allergy test may be performed in parallel. Examples of the drug allergy test include a patch test (scratch patch test), a prick test, an internal test (induction test), a drug-induced lymphocyte stimulation test (DLST), and the like. It is not limited.
Whether or not secondary sterilization can be performed can be determined by performing a drug allergy test.
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to a following example.
［実施例１］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来の末梢血単核球の採取
まず、ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者（１５名、内皮疹を呈した患者１２名、及び皮疹を呈しない患者３名）から採血し、ヘパリン含有採血管に採取した。次いで、フィコール比重遠心法により、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）を単離した。
なお、ヘリコバクター・ピロリ感染患者におけるヘリコバクター・ピロリ除菌は、１回につき、アモキシシリン（形状：水和物）７５０ｍｇ、クラルスロマイシン２００ｍｇ、及びランソプラゾール（形状：ナトリウム塩）１０ｍｇを同時に経口投与し、１日２回、７日間続けて経口投与することで行った。
[Example 1]
(1) Collection of peripheral blood mononuclear cells from patients after eradication of Helicobacter pylori First, patients after eradication of Helicobacter pylori (15 patients, 12 patients with endothelial rash, and 3 patients without rash) Blood) and collected in heparin-containing blood collection tubes. Next, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated by Ficoll specific gravity centrifugation.
In addition, Helicobacter pylori eradication in patients infected with Helicobacter pylori was simultaneously orally administered amoxicillin (shape: hydrate) 750 mg, clarthromycin 200 mg, and lansoprazole (shape: sodium salt) simultaneously. It was performed by oral administration twice a day for 7 consecutive days.
得られたＰＢＭＣは、１０ｃｍディッシュに播種し、３７℃、５％二酸化濃度の環境下で培養し、培養開始９０分後に非接着細胞を取り除き、接着した細胞を７日間培養し、維持した。ＰＢＭＣの培養には、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００ｎｇ／ｍＬヒト組換え顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）（ＲＤ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）含有ＲＰＭＩ培地を用いた。 The obtained PBMC was seeded in a 10 cm dish, cultured in an environment of 37 ° C. and 5% dioxide concentration, non-adherent cells were removed 90 minutes after the start of culture, and the adhered cells were cultured and maintained for 7 days. PBMC was cultured with 10% fetal bovine serum (FBS), 4 mM L-glutamine, penicillin / streptomycin, and 100 ng / mL human recombinant granulocyte / macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). ) RPMI medium (made by RD systems) was used.
（２）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣを用いたリンパ球刺激試験
次いで、得られたＰＢＭＣのうち皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣを用いて、薬剤によるリンパ球刺激試験（ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ；ＤＬＳＴ）を行った。具体的には、前記ＰＢＭＣを浮遊培養し、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の薬剤を各４μｇ／ｍＬで添加し、５日間培養した。次いで、トリチウムチミジン（３Ｈ−チミジン）（パーキンエルマー社製）を投与し、１２時間培養し、ＤＮＡ合成に使用されたチミジン量を液体シンチレーションカウンターで計測した。すなわち、前記治療薬の添加により、３Ｈ−チミジン取り込み量が増加した場合、薬剤特異的Ｔ細胞が存在すると判断することができる。
(2) Lymphocyte stimulation test using PBMC derived from patients after eradication of Helicobacter pylori Next, using PBMC derived from patients after eradication of Helicobacter pylori that exhibited rash among the obtained PBMCs, A lymphocyte-stimulated test (DLST) was performed. Specifically, the PBMCs were cultured in suspension, and three types of drugs, amoxicillin, clarthromycin, and lansoprazole, were added at 4 μg / mL, and cultured for 5 days. Subsequently, tritium thymidine ( 3 H-thymidine) (manufactured by PerkinElmer) was administered, cultured for 12 hours, and the amount of thymidine used for DNA synthesis was measured with a liquid scintillation counter. That is, when the amount of 3 H-thymidine incorporation is increased by the addition of the therapeutic agent, it can be determined that drug-specific T cells are present.
ＤＬＳＴにより、ヘリコバクター・ピロリ除菌後、皮疹を呈した患者１２名のうち、３名はＤＬＳＴ陽性であり、残りの９名はＤＬＳＴ陰性であった（図示せず）。
よって、上記９名については、薬剤以外の要因により皮疹が起きたことが示唆された。
Of 12 patients who developed skin rash after eradication of Helicobacter pylori by DLST, 3 were DLST positive and the remaining 9 were DLST negative (not shown).
Therefore, it was suggested that the above 9 patients had skin eruptions due to factors other than drugs.
（３）サイトカイン量の測定
次いで、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びヘリコバクター・ピロリ非感染者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ）、対照群として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ２５９９２株）の死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ）、又はコントロールとしてＰＢＳを添加し、２４時間培養した。次いで、各培養液を４℃で５分間２，５００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２７−Ｐｌｅｘ ｐａｎｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、得られた上清に含まれるサイトカイン量を測定した。具体的には、ＥＬＩＳＡキット（ＲＤ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、サイトカインとして、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ＩＦＮ）−γ、及びｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）−αの量を測定した。結果を図１（Ａ）〜（Ｅ）に示す。図１（Ａ）〜（Ｅ）において、「ＨＰ（−）」とはヘリコバクター・ピロリ非感染者由来のＰＢＭＣを意味し、「ＨＰ（＋）」とはヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを意味し、「ＳＥ（＋）」とは皮疹を呈する患者由来のＰＢＭＣを意味する。すなわち、「ＨＰ（−）」とは、ヘリコバクター・ピロリ非感染者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「ＨＰ（＋）ＳＥ（−）」とは、皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「ＨＰ（＋）ＳＥ（＋）」とは、皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群である。また、図１（Ａ）〜（Ｅ）において、「ＨＰ」はヘリコバクター・ピロリの死菌を添加した試験群であり、「Ｅ．ｃｏｌｉ」は大腸菌の死菌を添加した対照群であり、「ＰＢＳ」はＰＢＳを添加したコントロール群である。
(3) Measurement of cytokine amount Next, Helicobacter pylori-infected patients who are DLST-negative and show a rash, Helicobacter pylori-infected patients who are DLST-negative and do not show a rash, and PBMC derived from a non-helicobacter pylori-infected person, H. pylori killed (1.0 × 10 7 / CFU), E. coli (ATCC 25992 strain) killed (1.0 × 10 7 / CFU) as a control group, or PBS as a control, Cultured for 24 hours. Each culture was then centrifuged at 2,500 rpm for 5 minutes at 4 ° C. Subsequently, the amount of cytokine contained in the obtained supernatant was measured using Bio-Plex Human Cytokine 27-Plex panel (manufactured by Bio-Rad). Specifically, using an ELISA kit (manufactured by RD systems), as cytokines, interleukin (IL) -2, IL-4, IL-6, interferon (IFN) -γ, and tumor necrosis factor (TNF)- The amount of α was measured. The results are shown in FIGS. 1 (A) to (E), “HP (−)” means PBMC derived from a non-Helicobacter pylori infected person, and “HP (+)” means PBMC derived from a Helicobacter pylori infected patient. “SE (+)” means PBMC derived from a patient presenting with a skin rash. That is, “HP (−)” is a test group using PBMC derived from a non-Helicobacter pylori infected person, and “HP (+) SE (−)” is a Helicobacter pylori infected patient who does not show a rash. It is a test group using PBMC derived from, and “HP (+) SE (+)” is a test group using PBMC derived from a Helicobacter pylori-infected patient presenting with a skin rash. In FIGS. 1A to 1E, “HP” is a test group to which killed Helicobacter pylori was added, “E. coli” is a control group to which killed E. coli was added, “PBS” is a control group to which PBS was added.
図１（Ａ）〜（Ｅ）から、「ＨＰ（＋）ＳＥ（＋）」群のうち、ヘリコバクター・ピロリの死菌を添加した試験群において、各種サイトカインの有意な上昇が認められた。これに対し、「ＨＰ（−）」群、及び「ＨＰ（＋）ＳＥ（−）」群においては、各種サイトカインの上昇は認められなかった。
このことから、ＤＬＳＴ陰性であり、皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣでは、ヘリコバクター・ピロリの死菌の存在により、サイトカインの分泌が惹起されたと推察された。
From FIG. 1 (A)-(E), the significant increase of various cytokine was recognized in the test group which added the dead microbe of Helicobacter pylori among "HP (+) SE (+)" groups. On the other hand, in the “HP (−)” group and the “HP (+) SE (−)” group, no increase in various cytokines was observed.
From this, it was speculated that in PBMC derived from a Helicobacter pylori-infected patient who is DLST-negative and presents with a skin eruption, the secretion of cytokines was caused by the presence of killed Helicobacter pylori.
［実施例２］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣの採取
実施例１で採取したＰＢＭＣを実施例２においても使用した。
[Example 2]
(1) Collection of patient-derived PBMC after Helicobacter pylori eradication The PBMC collected in Example 1 was also used in Example 2.
（２）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣを用いたリンパ球刺激試験
次いで、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いて、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の薬剤（各４μｇ／ｍＬ）の他に、ヘリコバクター・ピロリの死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ）を添加した以外は、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、リンパ球刺激試験を行った。結果を図２に示す。図２において、「Ｐａｔｉｅｎｔ ５」とはＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈する特定のヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「Ｐａｔｉｅｎｔ ６」とはＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈する特定のヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「ＨＰ（＋）ＳＥ（−）」とは、皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群である。
(2) Lymphocyte stimulation test using PBMC derived from patients after Helicobacter pylori eradication Next, patients with Helicobacter pylori infection that are DLST negative and show rash, and those who are DLST negative and do not show rash Except for the addition of 3 types of drugs (4 μg / mL each) of amoxicillin, clarthromycin, and lansoprazole using PBMCs derived from the bacterium, killed Helicobacter pylori (1.0 × 10 7 / CFU) In the same manner as in Example 1 (2), a lymphocyte stimulation test was performed. The results are shown in FIG. In FIG. 2, “Patient 5” is a test group using PBMC derived from a specific Helicobacter pylori-infected patient that is DLST-negative and presents with a rash, and “Patient 6” is a specific group that is DLST-negative and presents with a rash. It is a test group using PBMC derived from a Helicobacter pylori-infected patient, and “HP (+) SE (−)” is a test group using PBMC derived from a Helicobacter pylori-infected patient who does not present a rash.
図２から、「Ｐａｔｉｅｎｔ ５」群おいて、ヘリコバクター・ピロリの死菌の存在により、ヘリコバクター・ピロリ特異的Ｔ細胞が存在することが確かめられた。 From FIG. 2, it was confirmed that Helicobacter pylori-specific T cells exist in the “Patient 5” group due to the presence of killed Helicobacter pylori.
［実施例３］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣの採取
実施例１で採取したＰＢＭＣを実施例３においても使用した。
[Example 3]
(1) Collection of patient-derived PBMC after Helicobacter pylori eradication PBMC collected in Example 1 were also used in Example 3.
（２）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
次いで、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ、又は３．３×１０６／ＣＦＵ）、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の薬剤（各４μｇ／ｍＬ）、又はＰＢＳを添加し、２４時間培養した。次いで、各ＰＢＭＣを回収し、ヒトＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔＰＲＯ キット（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ社製）を用いて、抗原特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の存在を確かめた。データは、２×１０５細胞のＰＢＭＣ当たりのスポット形成単位（ＣＦＵ）として表示した。また、ポジティブコントロールとして、ポリクローナル活性化剤である抗ＣＤ３抗体を用いた。スポットの計測は、ＣＴＬ−ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ５ ＵＶ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）及びＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０ ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて行った。結果を図３に示す。図３において、「ＨＰ」は、ヘリコバクター・ピロリの死菌を１．０×１０７／ＣＦＵ添加した試験群であり、「ＨＰ（ｏｎｅ ｔｈｉｒｄ ｏｆ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）」はヘリコバクター・ピロリの死菌を３．３×１０６／ＣＦＵ添加した試験群であり、「Ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ」はアモキシシリンを４μｇ／ｍＬ添加した試験群であり、「Ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ」はクラルスロマイシンを４μｇ／ｍＬ添加した試験群であり、「Ｌａｎｓｏｐｒａｚｏｌｅ」はランソプラゾールを４μｇ／ｍＬ添加した試験群であり、「ＰＢＳ」はＰＢＳを添加したコントロール群である。また、「Ｐａｔｉｅｎｔ ５」とはＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈する特定のヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「Ｐａｔｉｅｎｔ ６」とはＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈する特定のヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「ＨＰ（＋）ＳＥ（−）」とは、皮疹を呈しないヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群である。
(2) ELISpot assay using PBMC derived from a patient after Helicobacter pylori eradication Next, from a Helicobacter pylori infected patient who is DLST negative and exhibits a rash, and from a Helicobacter pylori infected patient who is DLST negative and does not exhibit a rash Three types of drugs (4 μg / mL each), killed by Helicobacter pylori (1.0 × 10 7 / CFU, or 3.3 × 10 6 / CFU), amoxicillin, clalasromycin, and lansoprazole, Alternatively, PBS was added and cultured for 24 hours. Next, each PBMC was collected, and the presence of antigen-specific IFN-γ producing cells was confirmed using a human IFN-γ ELISpot PRO kit (manufactured by Mabtech AB). Data were expressed as spot forming units (CFU) per 2 × 10 5 cells PBMC. As a positive control, an anti-CD3 antibody that is a polyclonal activator was used. The spot was measured using CTL-ImmunoSpot S5 UV Analyzer (manufactured by Cellular Technology) and CTL ImmunoSpot Professional Software 5.0 reader (manufactured by Cellular Technology). The results are shown in FIG. In FIG. 3, “HP” is a test group to which 1.0 × 10 7 / CFU of killed Helicobacter pylori was added, and “HP (one third of dilution)” was 3. 3 × 10 6 / CFU added test group, “Amocillin” is a test group added with 4 μg / mL amoxicillin, “Clarithromycin” is a test group added with 4 μg / mL clalsromycin, and “Lansoprazole” Is a test group to which 4 μg / mL lansoprazole was added, and “PBS” is a control group to which PBS was added. “Patient 5” is a test group using PBMC derived from a specific Helicobacter pylori-infected patient that is DLST-negative and presents with a rash, and “Patient 6” is a specific Helicobacter pylori that is DLST-negative and exhibits a rash. It is a test group using PBMC derived from H. pylori-infected patients, and “HP (+) SE (−)” is a test group using PBMC derived from Helicobacter pylori-infected patients who do not present a rash.
図３から、「Ｐａｔｉｅｎｔ ５」群おいて、ヘリコバクター・ピロリの死菌の濃度依存的に、ＰＢＭＣ中のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の数が上昇していた。一方、薬剤を添加した試験群ではＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞は認められなかった。 From FIG. 3, in the “Patient 5” group, the number of IFN-γ producing T cells in PBMC increased depending on the concentration of killed Helicobacter pylori. On the other hand, IFN-γ producing T cells were not observed in the test group to which the drug was added.
［実施例４］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣの採取
実施例１で採取したＰＢＭＣを実施例４においても使用した。
[Example 4]
(1) Collection of patient-derived PBMC after Helicobacter pylori eradication PBMC collected in Example 1 were also used in Example 4.
（２）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣを用いたフローサイトメトリー
次いで、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ）、又はアモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤（各４μｇ／ｍＬ）を添加し、２４時間培養した。次いで、各ＰＢＭＣを回収し、以下の抗体及び試薬を用いて染色した。
・ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）
・ＰＥ−Ｃｙ７結合抗ＣＤ３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）
・ＰＥ結合抗ＣＤ１５４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）
・ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８１抗体 (ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製)
・ＰＥ結合抗ＣＤ９抗体(ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製)
・Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ結合抗ＣＤ６３抗体(ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製)
・ＰＥ−Ｃｙ７結合抗ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体(ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製)
・ＰｅｒＣＰ ｃｙ５．５結合抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体(ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製)
・Ｓｙｔｏｘ Ｂｌｕｅ (Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)
(2) Flow cytometry using PBMC derived from a patient after eradication of Helicobacter pylori Next, PBMC derived from a Helicobacter pylori-infected patient who is DLST-negative and presents a rash, 10 7 / CFU), or 3 types of mixed drugs (4 μg / mL each) of amoxicillin, clarusthromycin, and lansoprazole, and cultured for 24 hours. Each PBMC was then collected and stained with the following antibodies and reagents.
-FITC-conjugated anti-CD4 antibody (manufactured by BD Bioscience)
-PE-Cy7-conjugated anti-CD3 antibody (manufactured by BD Bioscience)
-PE-conjugated anti-CD154 antibody (manufactured by BD Bioscience)
-FITC-conjugated anti-CD81 antibody (manufactured by BioLegend)
-PE-conjugated anti-CD9 antibody (manufactured by BioLegend)
・ Pacific Blue binding anti-CD63 antibody (manufactured by BioLegend)
PE-Cy7-conjugated anti-HLA-ABC antibody (manufactured by BioLegend)
PerCP cy5.5 binding anti-HLA-DR antibody (manufactured by BioLegend)
・ Sytox Blue (manufactured by Thermo Fisher Scientific)
次いで、染色した細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ ｏｒ Ａｒｉａ ＩＩＩ ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ(ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製)を用いて、測定した。次いで、得られたデータをＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社製）を用いて、解析した。結果を図４（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図４（Ａ）において、「ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ」は、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤（各４μｇ／ｍＬ）を添加した試験群であり、図４（Ｂ）において、「ＨＰ」はヘリコバクター・ピロリの死菌を１．０×１０７／ＣＦＵ添加した試験群である。 Subsequently, the stained cells were measured using a FACS Canto II or Aria III cytofluorometer (manufactured by BD Bioscience). Subsequently, the obtained data was analyzed using FlowJo software (manufactured by Tree Star). The results are shown in FIGS. 4 (A) and (B). In FIG. 4 (A), “medics” is a test group to which three kinds of mixed drugs (4 μg / mL each) of amoxicillin, clalthromycin, and lansoprazole were added. In FIG. 4 (B), “HP” Is a test group to which 1.0 × 10 7 / CFU of killed Helicobacter pylori was added.
図４（Ａ）及び（Ｂ）から、「ＨＰ」群では、ヘリコバクター・ピロリの添加により初期活性マーカーであるＣＤ１５４が高発現していることが確かめられた。このことから、「ＨＰ」群では、ヘリコバクター・ピロリ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が存在することが確かめられた。 4 (A) and 4 (B), in the “HP” group, it was confirmed that CD154 as an initial activity marker was highly expressed by the addition of Helicobacter pylori. From this, it was confirmed that Helicobacter pylori specific CD4 + T cells exist in the “HP” group.
［実施例５］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣの採取
実施例１で採取したＰＢＭＣを実施例５においても使用した。
[Example 5]
(1) Collection of patient-derived PBMC after Helicobacter pylori eradication PBMC collected in Example 1 were also used in Example 5.
（２）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣを用いたフローサイトメトリー
次いで、ＤＬＳＴ陰性でありアモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤の投与開始から１０日後（薬剤投与中止から３日後）に皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者、及びＤＬＳＴ陰性であり前記混合薬剤の投与開始から１０日より以前（薬剤投与中止から３日より以前）に皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣに、ヘリコバクター・ピロリの死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ）、アモキシシリン、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤（各４μｇ／ｍＬ）、ヘリコバクター・ピロリの死菌（１．０×１０７／ＣＦＵ）及び前記混合薬剤、又はＰＢＳを添加し、２４時間培養した以外は、実施例４の（２）と同様の方法を用いて、フローサイトメトリーを行った。次いで、得られたデータから、ＣＤ４＋Ｔ細胞数に対するＣＤ１５４＋細胞数の割合（％）を計算した。結果を図５（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
図５（Ａ）及び（Ｂ）において、「Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ ＋ ｄｒｕｇ」はヘリコバクター・ピロリの死菌及び前記混合薬剤を添加した試験群であり、「Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ」はヘリコバクター・ピロリの死菌のみを添加した試験群であり、「ｄｒｕｇｓ」は前記混合薬剤のみを添加した試験群であり、「ＰＢＳ」はＰＢＳを添加したコントロール群である。
また、図５（Ａ）において、「≧１０ｄａｙｓ」はＤＬＳＴ陰性であり前記混合薬剤の投与開始から１０日後（薬剤投与中止から３日後）に皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群であり、「＜１０ｄａｙｓ」はＤＬＳＴ陰性であり前記混合薬剤の投与開始から１０日より以前（薬剤投与中止から３日より以前）に皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを用いた試験群である。
(2) Flow cytometry using PBMC derived from a patient after Helicobacter pylori eradication Next, 10 days after the start of administration of three mixed drugs of DLST-negative, amoxicillin, clarthromycin, and lansoprazole (drug discontinuation) 3 days after) and a Helicobacter pylori infection patient who was infected with Helicobacter pylori who was DLST negative and had a skin rash before 10 days from the start of administration of the mixed drug (before 3 days after discontinuation of drug administration) Three types of mixed drugs (4 μg / mL each), killed Helicobacter pylori, killed Helicobacter pylori (1.0 × 10 7 / CFU), amoxicillin, clarthromycin, and lansoprazole (1.0 × 10 7 / CFU) and the mixing agent, or PBS Was added, except 24 hours of culture, using the same method as (2) in Example 4, it was subjected to flow cytometry. Subsequently, the ratio (%) of the number of CD154 + cells to the number of CD4 + T cells was calculated from the obtained data. The results are shown in FIGS. 5 (A) and (B).
5 (A) and 5 (B), “H. Pylori + drug” is a test group to which Helicobacter pylori killed bacteria and the mixed drug were added, and “H. Pylori” is only a killed Helicobacter pylori killed bacteria. “Drugs” is a test group to which only the mixed drug is added, and “PBS” is a control group to which PBS is added.
In FIG. 5 (A), “≧ 10 days” is DLST negative, and PBMC derived from a Helicobacter pylori-infected patient who presented with a skin rash 10 days after the start of administration of the mixed drug (3 days after the stop of drug administration) was used. "<10 days" was DLST-negative, and PBMC from Helicobacter pylori-infected patients who had a skin rash before 10 days from the start of administration of the mixed drug (before 3 days from the stop of drug administration). The test group used.
図５（Ａ）及び（Ｂ）から、「≧１０ｄａｙｓ」群では、ヘリコバクター・ピロリの添加により、ＣＤ１５４＋Ｔ細胞の割合が上昇していることが確かめられた。このことから、「≧１０ｄａｙｓ」群では、ヘリコバクター・ピロリ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が存在することが確かめられた。 5 (A) and 5 (B), it was confirmed that in the “≧ 10 days” group, the proportion of CD154 + T cells was increased by the addition of Helicobacter pylori. From this, it was confirmed that Helicobacter pylori specific CD4 + T cells exist in the “≧ 10 days” group.
［実施例６］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来の血液試料の採取
実施例１において採血した各血液試料のうちＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者の血液試料について、採血管を転倒講和して３０分間静置した。次いで、３，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い、上清（血清）を得た。得られた血清は使用するまで、冷蔵保存した。
[Example 6]
(1) Collection of blood samples from patients after Helicobacter pylori eradication For each blood sample collected in Example 1, a blood sample of a Helicobacter pylori infected patient who was DLST-negative and presented with a rash He settled down and left for 30 minutes. Subsequently, centrifugation was performed at 3,000 rpm for 5 minutes to obtain a supernatant (serum). The obtained serum was stored refrigerated until use.
（２）血液試料からエクソソームの単離
次いで、（１）で得られた血清について、３００×ｇで遠心分離を行い、上清を得た。次いで、得られた上清を１００，０００×ｇで超遠心分離して、エクソソームのペレットを得た。得られたエクソソームのペレットをＰＢＳで洗浄した後、少量のＰＢＳに再懸濁した。
また、得られたエクソソームについて、エクソソームマーカー（ＣＤ９、ＣＤ８１、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＨＬＡ−ＡＢＣ）を各マーカーに対する抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた染色を行い、フローサイトメトリーにより解析し確認した。
(2) Isolation of exosome from blood sample Next, the serum obtained in (1) was centrifuged at 300 × g to obtain a supernatant. The resulting supernatant was then ultracentrifuged at 100,000 × g to obtain an exosome pellet. The obtained exosome pellet was washed with PBS and then resuspended in a small amount of PBS.
Moreover, about the obtained exosome, the exosome marker (CD9, CD81, HLA-DR, and HLA-ABC) is dye | stained using the antibody (made by BD Bioscience) for each marker, and it analyzes and confirms by flow cytometry did.
（３）液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるエクソソームに含まれるタンパク質の解析
次いで、（２）で得られたエクソソームのペレットについて、相関移動溶解法(ＰＴＳ（Ｐｈａｓｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）法)を用いて、タンパク質を抽出した。具体的には、前記（２）で得られたエクソソームのペレットに、陰イオン性界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ；ＳＤＣ）及びＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）を１２ｍＭとなるように添加し、膜タンパク質を溶解した。次いで、有機溶媒として酢酸エチル（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）（最終濃度５０％）を添加し、さらにトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＴＦＡ）（最終濃度０．５％）を添加して酸性条件下とすることで有機相に界面活性剤を移動させて、水相を回収することで界面活性剤を除去した。次いで、水相に含まれるエクソソームに含まれていたタンパク質を１質量％のトリプシンを用いて、３７℃で一晩消化処理した。次いで、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ｎａｎｏ−ｆｌｏｗ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｏｎｅｘ社製）及びＨＴＣ−ＰＡＬ ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ社製）、並びにＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)を用いた液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により、消化処理されたタンパク質を測定した。測定データはＭａｘＱｕａｎｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．５．１．２）を用いて解析した。また、ピークリストはＡｎｄｒｏｍｅｄａ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅを用いて、ＵｎｉＰｒｏｔ ＨＰ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅと照合して解析した。質量分析において、「ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」＝７ｐｐｍ、「ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｏｎ ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」＝０．０１Ｄａとなるように設定した。タンパク質の解析結果のうち、ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質を以下の表１に示す。
(3) Analysis of proteins contained in exosomes by liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS / MS) Subsequently, the exosome pellet obtained in (2) was subjected to a phase transfer lysis method (PTS (Phase Transfer Surfactant) method). ) Was used to extract the protein. Specifically, the anionic surfactant sodium deoxycholate (SDC) and sodium N-lauroylsarcosine sodium salt were added to the exosome pellet obtained in (2) above. The membrane protein was dissolved by adding 12 mM. Next, ethyl acetate (final concentration 50%) is added as an organic solvent, and trifluoroacetic acid (TFA) (final concentration 0.5%) is added to make it an acidic condition. The surfactant was removed by moving the surfactant to the organic phase and recovering the aqueous phase. Subsequently, the protein contained in the exosome contained in the aqueous phase was digested overnight at 37 ° C. with 1% by mass of trypsin. Subsequently, an UltraMate 3000 nano-flow HPLC system (manufactured by Dionex) and HTC-PAL autosampler (manufactured by CTC Analytics), and Q-Exactive mass spectrometer (Thermo Fisher LC-manufactured) were used. The digested protein was measured by -MS / MS). The measurement data was analyzed using MaxQuant software (version 1.5.1.2). In addition, the peak list was analyzed using the Andromeda search engine and collated with UniProt HP protein database. In mass spectrometry, “precursor mass tolerance” = 7 ppm and “fragmention mass tolerance” = 0.01 Da were set. Table 1 below shows proteins derived from Helicobacter pylori among the results of protein analysis.
表１から、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者の血液試料由来のエクソソームには、ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質が存在することが確かめられた。 From Table 1, it was confirmed that the protein derived from Helicobacter pylori exists in the exosome derived from the blood sample of the Helicobacter pylori infection patient who is DLST negative and presented with a skin rash.
［実施例７］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来のＰＢＭＣの採取
実施例１で採取したＰＢＭＣのうち、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣを実施例７においても使用した。
[Example 7]
(1) Collection of patient-derived PBMC after eradication of Helicobacter pylori Among the PBMCs collected in Example 1, PBMC derived from a Helicobacter pylori-infected patient who was DLST-negative and presented with a rash was also used in Example 7. .
（２）血液試料からエクソソームの単離
次いで、血清の代わりに前記ＰＢＭＣの培養上清を用いた以外は、実施例６の（２）と同様の方法を用いて、エクソソームを単離した。
(2) Isolation of exosomes from blood sample Next, exosomes were isolated using the same method as in (2) of Example 6 except that the culture supernatant of PBMC was used instead of serum.
（３）液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるエクソソームに含まれるタンパク質の解析
次いで、実施例６の（３）と同様の方法を用いて、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるエクソソームに含まれるタンパク質の解析を行った、タンパク質の解析結果のうち、ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質を以下の表２に示す。
(3) Analysis of protein contained in exosome by liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS / MS) Next, using the same method as in (3) of Example 6, liquid chromatography mass spectrometry (LC- Table 2 below shows proteins derived from Helicobacter pylori among the analysis results of the proteins analyzed for proteins contained in exosomes by MS / MS).
表２から、ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈したヘリコバクター・ピロリ感染患者由来のＰＢＭＣの培養上清に含まれるエクソソームには、ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質が存在することが確かめられた。 From Table 2, it was confirmed that a protein derived from Helicobacter pylori was present in the exosome contained in the culture supernatant of PBMC derived from a Helicobacter pylori-infected patient who was DLST negative and presented with a skin rash.
［実施例８］
（１）ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者由来の血液試料の採取
ＤＬＳＴ陰性であり皮疹を呈するヘリコバクター・ピロリ感染患者において、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤の投与開始直後、３日後、７日後、及び１０日後に採血を行った。次いで、採血管を転倒講和して３０分間静置した。次いで、３，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い、上清（血清）を得た。得られた血清は使用するまで、冷蔵保存した。
[Example 8]
(1) Collection of blood samples from patients after Helicobacter pylori eradication Immediately after the start of administration of the three kinds of mixed drugs of clarusthromycin and lansoprazole in patients with Helicobacter pylori infected with DLST negative and rash Blood was collected 7 days later and 10 days later. Next, the blood collection tube was tumbled and allowed to stand for 30 minutes. Subsequently, centrifugation was performed at 3,000 rpm for 5 minutes to obtain a supernatant (serum). The obtained serum was stored refrigerated until use.
（２）血液試料からエクソソームの単離
次いで、採血日の異なる血清を複数用いた以外は、実施例６の（２）と同様の方法を用いて、エクソソームを単離した。
(2) Isolation of exosomes from blood sample Subsequently, exosomes were isolated using the same method as in (2) of Example 6 except that a plurality of sera with different blood collection dates were used.
（３）安定同位体ラベル化法を用いたペプチドの標識及びイオン交換カラムを用いたタンパク質の分離
次いで、得られたエクソソームについて、実施例６の（３）と同様にＰＴＳ法を用いて、タンパク質を抽出した。次いで、抽出されたエクソソームに含まれていたタンパク質をアミン反応性ＴＭＴ１０ｐｌｅｘ（登録商標） Ｉｓｏｂａｒｉｃ Ｌａｂｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ (Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)を用いた安定同位体ラベル化法により、タンパク質を標識した。次いで、標識されたタンパク質を含む溶液をイオン交換カラムを用いて、分画した。
(3) Labeling of peptide using stable isotope labeling method and separation of protein using ion exchange column Next, the obtained exosome was analyzed using the PTS method in the same manner as in (3) of Example 6. Extracted. Subsequently, the protein contained in the extracted exosome was labeled by a stable isotope labeling method using an amine-reactive TMT10plex (registered trademark) Isobaric Label Reagent Set (manufactured by Thermo Fisher Scientific). Next, the solution containing the labeled protein was fractionated using an ion exchange column.
（４）質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）によるエクソソームに含まれるタンパク質の解析
次いで、分画されたタンパク質について、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)を用いたー質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）により、測定した。測定データはＭａｘＱｕａｎｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．５．１．２）を用いて解析した。また、ピークリストはＡｎｄｒｏｍｅｄａ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅを用いて、ＵｎｉＰｒｏｔ ＨＰ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅと照合して解析した。質量分析において、「ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」＝７ｐｐｍ、「ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｏｎ ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ」＝０．０１Ｄａとなるように設定した。タンパク質の解析結果のうち、ヘリコバクター・ピロリ由来以外の腸内細菌由来のタンパク質を以下の表３に示す。
(4) Analysis of proteins contained in exosomes by mass spectrometry (MS / MS) Subsequently, the fractionated proteins were subjected to mass spectrometry (MS / MS) using a Q-Exactive mass spectrometer (manufactured by Thermo Fisher Scientific). MS). The measurement data was analyzed using MaxQuant software (version 1.5.1.2). In addition, the peak list was analyzed using the Andromeda search engine and collated with UniProt HP protein database. In mass spectrometry, “precursor mass tolerance” = 7 ppm and “fragmention mass tolerance” = 0.01 Da were set. Among the protein analysis results, proteins derived from enterobacteria other than those derived from Helicobacter pylori are shown in Table 3 below.
表３から、クラルスロマイシン、及びランソプラゾールの３種類の混合薬剤の投与より、ヘリコバクター・ピロリ以外の腸内細菌由来のタンパク質について、エクソソームにおける含有量が減ることが確かめられた。このことから、薬剤の投与より、ヘリコバクター・ピロリ以外の腸内細菌についても除菌されることが推察される。
また、薬剤の投与後に増加するヘリコバクター・ピロリ以外の腸内細菌由来のタンパク質も存在する。例えば、表３において、「Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ． ｊｅｊｕｎｉ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｏ：２３／３６」はギラン・バレー症候群の原因菌とされている。このことから、エクソソームに含まれる腸内細菌由来のタンパク質を解析することは、各種疾患と腸内細菌叢との関連性を解明するために有用であると考えられる。
From Table 3, it was confirmed that the content in exosomes of proteins derived from enterobacteria other than Helicobacter pylori was reduced by administration of three kinds of mixed drugs of clarusthromycin and lansoprazole. From this, it is presumed that enterobacteria other than Helicobacter pylori will be sterilized by the administration of the drug.
There are also proteins derived from enterobacteria other than Helicobacter pylori that increase after administration of the drug. For example, in Table 3, “Campylobacter jejuni subsp. Jejuni serotype O: 23/36” is regarded as a causative bacterium of Guillain-Barre syndrome. Therefore, it is considered that analyzing proteins derived from intestinal bacteria contained in exosomes is useful for elucidating the relationship between various diseases and intestinal bacterial flora.
以上のことから、ヘリコバクター・ピロリ感染患者の血液試料由来のエクソソームに含まれているタンパク質を分析することにより、前記患者におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの有無を判定することができる。また、被検体の血液試料由来のエクソソームに含まれているタンパク質を分析することにより、被検体の腸内細菌の菌叢を簡便に分析することができる。 From the above, the presence or absence of allergy to Helicobacter pylori in the patient can be determined by analyzing the protein contained in the exosome derived from the blood sample of the Helicobacter pylori infected patient. In addition, by analyzing the protein contained in the exosome derived from the blood sample of the subject, the bacterial flora of the intestinal bacterium of the subject can be easily analyzed.
本発明の腸内細菌の菌叢分析方法によれば、便の解析を行わず、簡便に腸内細菌の菌叢を分析することができる。さらに、腸内細菌叢は、がん、心臓病、免疫系疾患、痴呆症等の各種疾患との関連性も指摘されているため、腸内細菌叢のバランスと前記疾患との関連性の解明研究に応用することができる。
また、本発明の検出方法によれば、被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの有無を簡便且つ正確に判定することができる。さらに、被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーの有無が明らかとなることで、ヘリコバクター・ピロリ感染の除菌治療に失敗した場合に、薬疹がなく被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーを有しない被検体においては、２次除菌を行うことができる。一方、薬疹がなく被検体におけるヘリコバクター・ピロリに対するアレルギーを有する被検体においても、２次除菌を行いながら、ヘリコバクター・ピロリに対するアレルギー反応の抑制又は緩和治療も並行して行うことができる。
According to the method for analyzing the flora of intestinal bacteria of the present invention, the flora of enteric bacteria can be easily analyzed without analyzing feces. Furthermore, since the intestinal microflora has been pointed out to be associated with various diseases such as cancer, heart disease, immune system disease, and dementia, elucidation of the balance between the gut microbiota and the above diseases Can be applied to research.
Moreover, according to the detection method of the present invention, the presence or absence of allergy to Helicobacter pylori in a subject can be determined easily and accurately. In addition, when the presence or absence of allergy to Helicobacter pylori in the subject is clarified, the subject who does not have drug eruption and does not have allergy to Helicobacter pylori in the subject when the eradication treatment for Helicobacter pylori infection fails In, secondary sterilization can be performed. On the other hand, even in a subject having no drug eruption and allergic to Helicobacter pylori in the subject, the allergic reaction to Helicobacter pylori can be suppressed or alleviated in parallel while performing secondary sterilization.
Claims (4)
ヘリコバクター・ピロリ感染治療薬を投与された前記被検体から得られた生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を分析する分析工程を備えることを特徴とする検出方法。 A method for detecting allergy to Helicobacter pylori in a subject,
A detection method comprising an analysis step of analyzing a protein contained in an exosome in a biological sample obtained from the subject administered with a therapeutic agent for Helicobacter pylori infection.
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