JP5812361B2 - Novel Ad vector containing gene expression control mechanism - Google Patents
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Description
本発明は、マイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ］という。）の標的配列を組み込んでなるアデノウイルス（以下、単に「Ａｄ」という。）ベクターに関し、生体内に存在するｍｉＲＮＡの標的配列を組み込むことによるＡｄベクターに組み込まれた遺伝子の発現を制御しうる遺伝子発現制御システムを搭載するＡｄベクターに関する。 The present invention relates to an adenovirus (hereinafter simply referred to as “Ad”) vector incorporating a target sequence of microRNA (hereinafter referred to as “miRNA”), by incorporating the target sequence of miRNA present in vivo. The present invention relates to an Ad vector equipped with a gene expression control system capable of controlling the expression of a gene incorporated in the Ad vector.
近年、疾患に対する治療方法の一つとして、遺伝子治療の試みが多くなされている。例えば、癌細胞の増殖阻害方法として、特定の腫瘍マーカー（例えばeIF-4H）に特異的なsiRNAを活性成分として含有する遺伝子治療に関する医薬組成物について報告がある（特許文献１）。また、このような遺伝子治療のために使用可能なベクターについても各種報告があり、抗腫瘍剤として応用されることが期待されている（特許文献２、３）。 In recent years, many gene therapy attempts have been made as one of treatment methods for diseases. For example, as a method for inhibiting the growth of cancer cells, a pharmaceutical composition relating to gene therapy containing an siRNA specific to a specific tumor marker (eg, eIF-4H) as an active ingredient has been reported (Patent Document 1). In addition, there are various reports on vectors that can be used for such gene therapy, and they are expected to be applied as antitumor agents (Patent Documents 2 and 3).
現在、遺伝子治療のベクターとして用いられるＡｄベクターは、サブグループＣ(sub-group C)に属した５型（あるいは２型）のヒトＡｄを基盤としている。ヒトＡｄはＡからＦまでのサブグループに分けられ、少なくとも５１種類の血清型(serotype)が知られているが、サブグループＢ(sub-group B)に属するウイルスを除き、多くのＡｄ（５型Ａｄを含む）はレセプターとしてcoxsackievirus and adenovirus receptor（CAR）を認識して細胞に感染する（非特許文献１）。 Currently, Ad vectors used as vectors for gene therapy are based on type 5 (or type 2) human Ad belonging to sub-group C. Human Ad is divided into subgroups A to F, and at least 51 serotypes are known, but many Ad (5) except for viruses belonging to subgroup B (sub-group B). Type Ad) recognizes coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) as a receptor and infects cells (Non-patent Document 1).
Ａｄベクターは、その優れた遺伝子導入特性から、遺伝子治療用ベクターとして各種疾患への適用が期待されている。しかしながら、Ａｄベクターを腫瘍局所へ投与した場合、一部のＡｄベクターは腫瘍から全身循環に漏出した後、主に肝臓に集積し、遺伝子発現を示すことがある。目的とする疾患部位以外で遺伝子が発現すると、好ましくない副作用が生じることが懸念される。例えば、治療遺伝子に自殺遺伝子など、遺伝子発現細胞に対して毒性を示すような遺伝子を用いた場合は、腫瘍のみならず肝臓などの腫瘍ではない組織に対しても毒性を示してしまう場合がある。目的とする細胞や組織のみで所望の遺伝子を発現させることができれば、副作用を伴うことなく、効果的な遺伝子治療が行うことができると考えられる。 The Ad vector is expected to be applied to various diseases as a gene therapy vector because of its excellent gene transfer characteristics. However, when an Ad vector is administered locally to a tumor, some Ad vectors leak into the systemic circulation from the tumor, and then accumulate mainly in the liver and show gene expression. If the gene is expressed at a site other than the target disease site, there is a concern that undesirable side effects may occur. For example, if a gene that is toxic to gene-expressing cells, such as a suicide gene, is used as a therapeutic gene, it may be toxic not only to the tumor but also to tissues that are not tumors such as the liver. . If a desired gene can be expressed only in the target cell or tissue, it is considered that effective gene therapy can be performed without causing side effects.
生体に内在するｍｉＲＮＡに制御される部分を含むレンチウイルスベクターについて報告がある。しかしながら、レンチウイルスベクターの場合は、導入遺伝子が半永久的に発現するため、遺伝子治療の目的によっては好ましくない場合がある。所望の導入遺伝子が、所望の細胞や組織のみで、発現が必要な場合のみに発現可能な遺伝子治療用ウイルスベクターが望まれている。 There have been reports on lentiviral vectors containing a portion that is regulated by miRNA endogenous to the living body. However, in the case of a lentiviral vector, the transgene is expressed semipermanently, which may not be preferable depending on the purpose of gene therapy. There is a demand for a viral vector for gene therapy that can be expressed only when a desired transgene is expressed only in a desired cell or tissue and needs to be expressed.
本発明は、所望の導入遺伝子が、所望の細胞や組織のみで、発現が必要な場合のみに発現可能な遺伝子治療用ウイルスベクターを提供することを課題とする。具体的には遺伝子治療用ベクターとしてＡｄベクターを用いた場合に、所望の導入遺伝子を、所望の細胞や組織のみで発現しうるベクターを提供することを課題とする。 It is an object of the present invention to provide a viral vector for gene therapy that can be expressed only when a desired transgene is expressed only in a desired cell or tissue and needs to be expressed. Specifically, it is an object to provide a vector capable of expressing a desired transgene only in desired cells and tissues when an Ad vector is used as a gene therapy vector.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ａｄベクターにおいて、導入遺伝子の発現を望まない細胞や組織に特異的に存在する内在性ｍｉＲＮＡの標的配列をＡｄベクターに組み込むことにより、発現を望まない細胞や組織において、Ａｄベクターに組み込まれた導入遺伝子の発現が阻止されることを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that in Ad vectors, the target sequences of endogenous miRNAs that are specifically present in cells and tissues in which transgene expression is not desired are included in the Ad vector. It was found that the expression of the transgene incorporated in the Ad vector is blocked in cells and tissues where expression is not desired, and the present invention has been completed.
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．正常細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列を組み込んでなる、遺伝子発現制御機構を含むＡｄベクター。
２．正常細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡが、癌細胞では発現が抑制されているｍｉＲＮＡである前項１に記載のＡｄベクター。
３．正常細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡが、肝細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡである前項１または２に記載のＡｄベクター。
４．ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２２ａ，ｍｉＲ−１５，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５，ｌｅｔ−７，ｍｉＲ−１９９のいずれかより選択される前項１〜３のいずれか１に記載のＡｄベクター。
５．ｍｉＲＮＡの標的配列１単位の塩基長が、７〜２５塩基長である前項１〜４のいずれか１に記載のＡｄベクター。
６．ｍｉＲＮＡの標的配列１単位が、ｍｉＲＮＡの全部または一部に対して相補的な配列からなり、配列表の配列番号１〜７のいずれかの塩基配列の相補配列から選択される少なくとも７塩基長のオリゴヌクレオチドを含む配列からなる前項１〜５の何れか１に記載のＡｄベクター：
ｍｉＲ−１５ ；UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG （配列番号１）
ｍｉＲ−１６ ；UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG （配列番号２）
ｍｉＲ−１４３ ；UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC （配列番号３）
ｍｉＲ−１４５ ；GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU（配列番号４）
ｌｅｔ−７ ；UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU （配列番号５）
ｍｉＲ−１２２ａ；UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG （配列番号６）
ｍｉＲ−１９９ ；CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC（配列番号７）
７．ｍｉＲＮＡの標的配列が、配列表の配列番号８に示す配列からなる前項１〜５の何れか１に記載のＡｄベクター：
標的配列：ACAAACACCATTGTCACACTCCACAGCACAAACACCATTGTCACACTCCATTAATACAAACACCATTGTCACACTCCAGGACACAAACACCATTGTCACACTCCA（配列番号８）。
８．Ａｄベクターに組み込まれる所望の導入遺伝子の非翻訳領域に、遺伝子発現制御機構を含む前項１〜７の何れか１に記載のＡｄベクター。
９．前項１〜８の何れか１に記載のＡｄベクターを含む遺伝子治療用ベクター。
１０．ＨＳＶＴＫ(Herpes simplex virus thymidine kinase)遺伝子を導入遺伝子とし、該導入遺伝子の非翻訳領域に前項６又は７に記載のｍｉＲＮＡの標的配列を含むＡｄベクターを含む遺伝子治療用ベクター。
１１．前項１０に記載の遺伝子治療用ベクターとガンシクロビルを併用して用いる、抗腫瘍剤キット。
１２．以下の工程を含む、前項１〜９の何れかに記載のＡｄベクターの作製方法：
１）所望の導入遺伝子の非翻訳領域に、ｍｉＲＮＡの標的配列からなる遺伝子発現制御機構を含む遺伝子発現シャトルプラスミドを作製する工程；
２）Ａｄのゲノムを準備する工程；
３）Ａｄのゲノムを制限酵素で切断し、１）で作製した遺伝子発現シャトルプラスミドをＡｄのゲノムにライゲーションする工程。
１３．生体から分離した試料を検査する方法において、前項１〜９の何れか１に記載のＡｄベクターを用い、該Ａｄベクター上に組み込まれたレポーター遺伝子の発現を確認して、試料中の前記Ａｄベクター上に組み込まれた標的配列に対するｍｉＲＮＡの存在を分析することを特徴とする試料の検査方法。
That is, this invention consists of the following.
1. An Ad vector comprising a gene expression control mechanism, which incorporates a target sequence of miRNA that is specifically expressed in normal cells.
2. 2. The Ad vector according to item 1 above, wherein the miRNA expressed specifically in normal cells is a miRNA whose expression is suppressed in cancer cells.
3. 3. The Ad vector according to 1 or 2 above, wherein the miRNA expressed specifically in normal cells is a miRNA expressed specifically in hepatocytes.
4). The Ad vector according to any one of 1 to 3, wherein the miRNA is selected from any of miR-122a, miR-15, miR-16, miR-143, miR-145, let-7, miR-199. .
5. 5. The Ad vector according to any one of 1 to 4 above, wherein the base length of one unit of the target sequence of miRNA is 7 to 25 bases.
6). One unit of miRNA target sequence consists of a sequence complementary to all or part of miRNA, and has a length of at least 7 bases selected from the complementary sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 7 in the sequence listing 6. The Ad vector according to any one of 1 to 5 above, comprising an oligonucleotide-containing sequence:
miR-15; UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG (SEQ ID NO: 1)
miR-16; UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG (SEQ ID NO: 2)
miR-143; UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC (SEQ ID NO: 3)
miR-145; GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU (SEQ ID NO: 4)
let-7; UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU (SEQ ID NO: 5)
miR-122a; UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG (SEQ ID NO: 6)
miR-199; CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC (SEQ ID NO: 7)
7). 6. The Ad vector according to any one of 1 to 5 above, wherein the target sequence of miRNA comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing:
Target sequence: ACAAACACCATTGTCACACTCCACAGCACAAACACCATTGTCACACTCCATTAATACAAACACCATTGTCACACTCCAGGACACAAACACCATTGTCACACTCCA (SEQ ID NO: 8).
8). 8. The Ad vector according to any one of 1 to 7 above, which comprises a gene expression control mechanism in a non-translated region of a desired transgene incorporated into the Ad vector.
9. A gene therapy vector comprising the Ad vector according to any one of 1 to 8 above.
10. 8. A gene therapy vector comprising an Ad vector comprising an HSVTK (Herpes simplex virus thymidine kinase) gene as a transgene, wherein the non-translated region of the transgene comprises the miRNA target sequence described in 6 or 7 above.
11. An anti-tumor agent kit, wherein the gene therapy vector according to item 10 and ganciclovir are used in combination.
12 The method for producing an Ad vector according to any one of items 1 to 9, comprising the following steps:
1) A step of preparing a gene expression shuttle plasmid containing a gene expression control mechanism consisting of a target sequence of miRNA in an untranslated region of a desired transgene;
2) preparing an Ad genome;
3) A step of cleaving the Ad genome with a restriction enzyme and ligating the gene expression shuttle plasmid prepared in 1) to the Ad genome.
13. In the method for examining a sample separated from a living body, the Ad vector according to any one of 1 to 9 above is used, and the expression of a reporter gene incorporated on the Ad vector is confirmed, and the Ad vector in the sample is confirmed. A method for examining a sample, comprising analyzing the presence of miRNA against a target sequence incorporated above.
本発明の特定の細胞または組織に特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列を組み込んでなるＡｄベクターによれば、該特定の細胞または組織に発現するｍｉＲＮＡが、前記Ａｄベクター中の標的配列に作用することにより、特定の細胞または組織では、該Ａｄベクターに組み込んだ遺伝子の発現が阻害もしくは抑制されることとなる。
上記作用により、例えば遺伝子治療において、特定の細胞または組織の他で組み込んだ遺伝子が効果的に発現し、特定の細胞または組織での遺伝子の発現を防ぐことで、遺伝子治療による不要な副作用を軽減化することができ、効果的な治療方法とすることができる。係るＡｄベクターを用いることにより、遺伝子治療において、効果的に遺伝子デリバリーを行うことができる。
According to the Ad vector incorporating a miRNA target sequence specifically expressed in a specific cell or tissue of the present invention, the miRNA expressed in the specific cell or tissue acts on the target sequence in the Ad vector. Thus, the expression of the gene incorporated into the Ad vector is inhibited or suppressed in specific cells or tissues.
By the above action, for example, in gene therapy, genes incorporated in other specific cells or tissues are effectively expressed, and by preventing gene expression in specific cells or tissues, unnecessary side effects due to gene therapy are reduced. And an effective treatment method. By using such an Ad vector, gene delivery can be effectively performed in gene therapy.
本発明において、Ａｄとはアデノウイルスをさし、本発明において使用可能なＡｄは、in vivoまたはin vitroでＤＮＡやＲＮＡなどの核酸配列を種々のタイプの細胞へ導入するビヒクルとしての機能を達成しうるものであれば良く、特に限定されない。代表的には、ヒトを宿主とする２型、５型、１１型、３５型の各Ａｄ、ヒト以外を宿主とするサルＡｄ、チンパンジーＡｄ、マウスＡｄ、イヌＡｄ、ヒツジＡｄおよびトリＡｄなどが挙げられる。 In the present invention, Ad refers to an adenovirus, and Ad usable in the present invention achieves a function as a vehicle for introducing a nucleic acid sequence such as DNA or RNA into various types of cells in vivo or in vitro. It is not particularly limited as long as it is possible. Typically, each of type 2, type 5, type 11 and type 35 Ad that has a human host, monkey Ad, chimpanzee Ad, mouse Ad, dog Ad, sheep Ad, and bird Ad that have a non-human host. Can be mentioned.
本発明においてＡｄゲノムとは特に限定されないが、特定の細胞種でのみ複製できるようにしたＡｄのゲノム、具体的にはＥ１領域欠損型Ａｄや、制限増殖型Ａｄのゲノムなどが好適であり、特に好適にはＥ１領域欠損型のＡｄゲノムが挙げられる。特定の細胞種でのみ複製できるとは、例えばＥ１領域欠損型Ａｄについては２９３細胞で、制限増殖型Ａｄについては２９３細胞や癌細胞でのみ増殖できるＡｄをいう。２９３細胞は、ヒト胎児腎細胞を５型ＡｄのＥ１遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株であり、Ｅ１タンパク質を恒常的に発現している。 In the present invention, the Ad genome is not particularly limited, but an Ad genome that can be replicated only in a specific cell type, specifically, an E1 region-deficient Ad, a restricted growth Ad genome, and the like are preferable. Particularly preferred is an E1 region-deficient Ad genome. The phrase “replicating only in a specific cell type” means, for example, an 293 cell for E1 region-deficient Ad and an Ad that can grow only in 293 cells or cancer cells for restricted growth type Ad. 293 cells are cell lines established by transforming human fetal kidney cells with the E1 gene of type 5 Ad, and constantly express the E1 protein.
Ｅ１領域欠損型Ａｄゲノムとは、Ｅ１領域を欠損するＡｄゲノムをいい、制限酵素によりＥ１領域を切断し、欠損させたＡｄゲノムをいう。Ｅ１領域欠損とは、Ｅ１タンパク質をコードする領域を機能的に欠損させることを意味する。機能的に欠損させるとは、例えば、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現させないようにすることであり、Ｅ１タンパク質をコードする遺伝子のすべてを欠損している必要はない。
一般に、ＡｄにおいてＥ１領域を欠損させると、Ｅ１タンパク質を発現している細胞（例えば、２９３細胞）以外では増殖することができない。
The E1 region-deficient Ad genome refers to an Ad genome that lacks the E1 region, and refers to an Ad genome that has been deleted by cutting the E1 region with a restriction enzyme. E1 region deletion means that a region encoding E1 protein is functionally deleted. The functional deletion means, for example, that the E1 protein that functions in the host cell is not expressed, and it is not necessary to delete all the genes encoding the E1 protein.
In general, if the E1 region is deleted in Ad, it cannot proliferate except for cells expressing the E1 protein (for example, 293 cells).
５型Ａｄゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）の場合において、Ｅ１領域とは、具体的には３４２〜３５２３番目に相当する。したがって、本発明のＡｄゲノムは、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現しないのであれば、３４２〜３５２３番目の領域の一部を有するものであってもよい。 In the case of type 5 Ad genome (GenBank Accession numbers: M73260, M29978), the E1 region specifically corresponds to the 342th to 3523rd positions. Therefore, the Ad genome of the present invention may have a part of the 342th to 3523rd region as long as it does not express the E1 protein that functions in the host cell.
本発明の改変型Ａｄベクターは、Ｅ１領域の他に、例えばＥ３領域を欠損させた５型Ａｄゲノムの一部または全部を用いてもよい。５型Ａｄゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）のＥ３領域とは、２８１３３〜３０８１８番目または２７８６５〜３０９９５番目に相当する部位をいう。 In addition to the E1 region, the modified Ad vector of the present invention may use, for example, part or all of the type 5 Ad genome lacking the E3 region. The E3 region of the type 5 Ad genome (GenBank Accession No .: M73260, M29978) refers to the site corresponding to the 28133-30308th or 27865-30995th.
制限増殖型Ａｄは、Ｅ１タンパク質の発現が例えば癌細胞でのみ起こるＡｄであり、NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001)に報告されているものを例示することができる。 Restricted growth type Ad is an Ad in which expression of E1 protein occurs only in, for example, cancer cells, and can be exemplified by those reported in NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001).
本発明のＡｄベクターに備えられるプロモーターは、特に制限されない。例えば、ポリメラーゼII系（pol II系）またはポリメラーゼIII系（pol III系）のいかなるプロモーターであってもよい。具体的には、pol III系のプロモーターとしてＵ６プロモーターやＨ１プロモーターを例示することができ、pol II系のプロモーターとしてＣＭＶプロモーターを例示することができる。本発明において、Ａｄゲノムに対するプロモーターの導入位置は特に限定されない。プロモーターの導入位置は、Ａｄの複製に影響を及ぼさない位置であればいずれの位置でもよい。例えばＥ１欠損領域、Ｅ３領域やＥ４領域と３’ＩＴＲ(internal terminal repeat)の間の領域であってもよく、好適にはＥ１欠損領域が挙げられる。 The promoter provided in the Ad vector of the present invention is not particularly limited. For example, any promoter of polymerase II system (pol II system) or polymerase III system (pol III system) may be used. Specifically, U6 promoter and H1 promoter can be exemplified as pol III promoters, and CMV promoter can be exemplified as pol II promoters. In the present invention, the position where the promoter is introduced into the Ad genome is not particularly limited. The promoter can be introduced at any position as long as it does not affect Ad replication. For example, the region may be an E1 deficient region, an E3 region or a region between the E4 region and a 3'ITR (internal terminal repeat), and an E1 deficient region is preferable.
本発明のＡｄベクターにおいて、遺伝子発現制御機構を含むとは、特定の細胞や組織特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列を含むことをいう。ｍｉＲＮＡは細胞内に存在するタンパク質に翻訳されない長さ約１９〜２５塩基ほどの２本鎖ＲＮＡをいい、他の遺伝子の発現を調節する機能を有するといわれている。ｍｉＲＮＡがその標的配列と結合すると、遺伝子の翻訳が阻害される。例えばＲＮＡｉ分子のように、所望のｍＲＮＡの分解を引き起こす、若しくは翻訳を阻害する。従って、Ａｄベクターに、所望の遺伝子を組み込んで発現させようとする場合、上記ｍｉＲＮＡの標的配列を含むＡｄベクターであれば、特定の細胞や組織特異的に発現するｍｉＲＮＡが存在する場合に、該ｍｉＲＮＡとその標的配列が結合することにより、Ａｄベクターに組み込まれた所望の遺伝子の発現を制御することができる。ここで、上記標的配列は、Ａｄベクターに組み込まれる所望の導入遺伝子の非翻訳領域に組み込むのが好適である。 In the Ad vector of the present invention, including a gene expression control mechanism means including a target sequence of miRNA that is specifically expressed in a specific cell or tissue. miRNA refers to a double-stranded RNA having a length of about 19 to 25 bases that is not translated into a protein present in cells, and is said to have a function of regulating the expression of other genes. When miRNA binds to its target sequence, gene translation is inhibited. For example, RNAi molecules cause the degradation of the desired mRNA or inhibit translation. Therefore, when an Ad vector is to be expressed by incorporating a desired gene, if the Ad vector contains the miRNA target sequence, the miRNA that is expressed specifically in a specific cell or tissue is present. By binding the miRNA and its target sequence, the expression of a desired gene incorporated in the Ad vector can be controlled. Here, the target sequence is preferably incorporated into an untranslated region of a desired transgene incorporated into the Ad vector.
ｍｉＲＮＡは、ヒトを含む生物に多数存在することが公知である。本発明におけるｍｉＲＮＡは、特定の細胞または組織において特異的に発現するものであればよい。例えば、正常細胞に特異的に発現するｍｉＲＮＡ、癌細胞では発現が抑制されるｍｉＲＮＡ、また肝臓細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡなどが好ましい。正常細胞でのみ特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列をＡｄベクターに組み込むことで、例えば正常細胞では、Ａｄベクターに組み込んだ遺伝子の発現を抑制することができ、正常細胞に対する発現遺伝子による毒性等を軽減化させることができる。同様に、肝臓細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列をＡｄベクターに組み込むことで、例えば肝臓細胞では、Ａｄベクターに組み込んだ遺伝子の発現を抑制することができ、肝毒性を軽減化させることができる。また、癌細胞では発現が抑制されるｍｉＲＮＡの標的配列をＡｄベクターに組み込むことで、癌細胞が存在する場合に、Ａｄベクター上の導入遺伝子を発現させることができ、癌細胞特異的に遺伝子治療を行うこともできるし、癌細胞の存在の有無をレポータータンパク質の発現を指標として、確認することもできる。癌細胞では発現が抑制されるｍｉＲＮＡの例として、具体的にはｍｉＲ−１５，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５，ｌｅｔ−７，ｍｉＲ−１９９が挙げられる。また、肝臓細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡの例として、具体的にはｍｉＲ−１２２ａが挙げられる。ｍｉＲＮＡの配列や由来は、ｍｉＲＮＡを掲載するデータベース、例えばmiRBase sequence database (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)を検索して確認することができる。 Many miRNAs are known to exist in organisms including humans. The miRNA in the present invention only needs to be specifically expressed in a specific cell or tissue. For example, miRNAs that are specifically expressed in normal cells, miRNAs that are suppressed in cancer cells, miRNAs that are specifically expressed in liver cells, and the like are preferable. By incorporating a target sequence of miRNA that is specifically expressed only in normal cells into the Ad vector, for example, in normal cells, the expression of the gene incorporated in the Ad vector can be suppressed. It can be reduced. Similarly, by incorporating a miRNA target sequence specifically expressed in liver cells into an Ad vector, for example, in liver cells, expression of the gene incorporated in the Ad vector can be suppressed, and liver toxicity can be reduced. it can. In addition, by incorporating a miRNA target sequence whose expression is suppressed in cancer cells into the Ad vector, the transgene on the Ad vector can be expressed in the presence of cancer cells, and gene therapy can be performed specifically for cancer cells. The presence or absence of cancer cells can also be confirmed using reporter protein expression as an indicator. Specific examples of miRNAs whose expression is suppressed in cancer cells include miR-15, miR-16, miR-143, miR-145, let-7, miR-199. An example of miRNA expressed specifically in liver cells is miR-122a. The sequence and origin of miRNA can be confirmed by searching a database for miRNA, such as miRBase sequence database (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml).
各ｍｉＲＮＡの塩基配列は、以下のとおりである。
ｍｉＲ−１５ ；UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG （配列番号１）
ｍｉＲ−１６ ；UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG （配列番号２）
ｍｉＲ−１４３ ；UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC （配列番号３）
ｍｉＲ−１４５ ；GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU（配列番号４）
ｌｅｔ−７ ；UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU （配列番号５）
ｍｉＲ−１２２ａ；UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG （配列番号６）
ｍｉＲ−１９９ ；CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC（配列番号７）
The base sequence of each miRNA is as follows.
miR-15; UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG (SEQ ID NO: 1)
miR-16; UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG (SEQ ID NO: 2)
miR-143; UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC (SEQ ID NO: 3)
miR-145; GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU (SEQ ID NO: 4)
let-7; UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU (SEQ ID NO: 5)
miR-122a; UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG (SEQ ID NO: 6)
miR-199; CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC (SEQ ID NO: 7)
本発明において、ｍｉＲＮＡの標的配列１単位はｍｉＲＮＡの全部または一部に対して相補的な配列からなり、塩基長が７〜２５塩基長であり、好ましくは１５〜２５塩基長，より好ましくは１９〜２５塩基長である。ここで、ｍｉＲＮＡの標的配列１単位とは、あるｍｉＲＮＡが標的としうる配列の最低限の単位のものをいう。具体的には、配列表の配列番号１〜７のいずれかの塩基配列の相補配列から選択される少なくとも７塩基長のオリゴヌクレオチドをいい、更にいずれかの箇所に置いて１〜複数個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加、挿入されているものであってもよい。 In the present invention, one unit of miRNA target sequence consists of a sequence complementary to all or part of miRNA, and has a base length of 7 to 25 bases, preferably 15 to 25 bases, more preferably 19 It is ˜25 bases long. Here, one unit of a miRNA target sequence means a minimum unit of a sequence that can be targeted by a certain miRNA. Specifically, it refers to an oligonucleotide having a length of at least 7 bases selected from a complementary sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 7 in the Sequence Listing, and further placed at any position from 1 to a plurality of nucleotides May be substituted, deleted, added, or inserted.
本発明のＡｄベクターに組み込まれる標的配列全体としては、ｍｉＲＮＡと標的配列の相互作用を効果的に発揮させるために、複数単位（複数コピー）のものであってもよい。ベクターに組み込む標的配列全体の長さは、ベクターに組み込み可能な長さであればよく、特に制限されないが、例えば標的配列１単位を１０コピー含んでいてもよく、好適には２〜６コピー含んでいてもよい。標的配列全体の中に含まれる標的配列１単位の配列と配列の間には、適当な長さのオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。適当な長さのオリゴヌクレオチドの長さは特に制限されないが、標的配列全体としてベクターに組み込み可能な長さであればよく、例えば０〜８塩基長のオリゴヌクレオチドであってもよい。 The entire target sequence incorporated into the Ad vector of the present invention may be a plurality of units (multiple copies) in order to effectively exert the interaction between the miRNA and the target sequence. The length of the entire target sequence to be incorporated into the vector is not particularly limited as long as it can be incorporated into the vector. For example, it may contain 10 copies of 1 unit of the target sequence, preferably 2 to 6 copies. You may go out. An oligonucleotide having an appropriate length may be included between the sequence of one unit of the target sequence contained in the entire target sequence. The length of the oligonucleotide having an appropriate length is not particularly limited as long as the entire target sequence can be incorporated into the vector, and may be, for example, an oligonucleotide having a length of 0 to 8 bases.
本発明のＡｄベクターの作製は、作製工程において１または複数の制限酵素の認識配列を各々制限酵素で消化し、導入遺伝子を、シャトルベクターを介して、またはシャトルベクターを介することなく、インビトロライゲーションにより導入することができる。 In the production process, the Ad vector of the present invention is prepared by digesting one or a plurality of restriction enzyme recognition sequences with restriction enzymes, respectively, and transferring the transgene by in vitro ligation via the shuttle vector or without the shuttle vector. Can be introduced.
本発明Ａｄベクターは、以下の工程を含む製造方法により作製することができる。
１）導入遺伝子の非翻訳領域に目的ｍｉＲＮＡの標的配列からなる遺伝子発現制御機構を含む遺伝子発現シャトルプラスミドを作製する工程；
２）Ａｄゲノムを準備する工程；
３）Ａｄゲノムを制限酵素で切断し、１）で作製した遺伝子発現シャトルプラスミドをＡｄゲノムにライゲーションする工程。
The Ad vector of the present invention can be produced by a production method including the following steps.
1) A step of preparing a gene expression shuttle plasmid including a gene expression control mechanism comprising a target sequence of a target miRNA in an untranslated region of a transgene;
2) preparing an Ad genome;
3) A step of cleaving the Ad genome with a restriction enzyme and ligating the gene expression shuttle plasmid prepared in 1) to the Ad genome.
上記により得られたＡｄプラスミドは、上記プラスミド両末端を、制限酵素を用いて線状にし、これを例えば２９３細胞（Ｅ１欠損型Ａｄベクターや制限増殖型Ａｄベクターの場合）、または癌細胞（制限増殖型Ａｄベクターの場合）にトランスフェクションすることで、上記遺伝子発現制御機構を含むＡｄベクターを作製することができる。 The Ad plasmid obtained as described above is linearized at both ends of the plasmid using a restriction enzyme, and is converted into, for example, 293 cells (in the case of E1-deficient Ad vector or restricted growth Ad vector) or cancer cells (restriction). In the case of a propagation type Ad vector), an Ad vector containing the gene expression control mechanism can be prepared.
本発明において、Ａｄベクターに組み込まれた所望の導入遺伝子とは、例えば遺伝子治療等に用いられる薬剤としての機能を有する遺伝子が挙げられる。遺伝子治療は、正常な遺伝子を細胞に補ったり、遺伝子の欠陥を修復・修正することで疾患を治療する場合に利用されるが、例えば癌に対しては癌に特異的な免疫反応をおこすサイトカインを発現させる遺伝子治療を挙げることができる。このように、遺伝子治療は生命活動の根幹を制御する治療法であり、遺伝子疾患だけでなく、癌やエイズ、そして難病など、様々な病気の治療への可能性が検討されている。具体的には、ＨＳＶＴＫ(Herpes simplex virus thymidine kinase)遺伝子と抗ウイルス剤であるガンシクロビル（ＧＣＶ）を用いた自殺遺伝子治療の検討が進められている。ＨＳＶＴＫ遺伝子が発現することにより、ＧＣＶを活性化体に変換し、細胞死を誘導することで抗腫瘍作用を示す治療方法である。しかしながら、かかる自殺遺伝子が、癌細胞以外の場所で作用することにより、強い副作用を生じる危惧がある。本発明のＡｄベクターに組み込まれた所望の遺伝子は、前述の遺伝子治療に用いられるような遺伝子を挙げることができる。本発明のＡｄベクターを遺伝子治療に用いることで、必要とする細胞や組織以外の部位で、例えば前記自殺遺伝子が発現しないように遺伝子発現制御機構を含むことで、効果的な遺伝子治療を行うことができる。 In the present invention, the desired transgene incorporated into the Ad vector includes, for example, a gene having a function as a drug used for gene therapy or the like. Gene therapy is used to treat diseases by supplementing normal cells with cells or repairing and correcting gene defects. For example, cytokines cause cancer-specific immune responses to cancer. And gene therapy that expresses. Thus, gene therapy is a treatment method that controls the basis of life activity, and the possibility of treating various diseases such as cancer, AIDS, and intractable diseases as well as genetic diseases is being investigated. Specifically, studies on suicide gene therapy using HSVTK (Herpes simplex virus thymidine kinase) gene and ganciclovir (GCV), which is an antiviral agent, are in progress. It is a therapeutic method that exhibits an antitumor effect by converting GCV to an activated form by inducing HSVTK gene and inducing cell death. However, there is a risk that such a suicide gene may cause strong side effects by acting in places other than cancer cells. Examples of the desired gene incorporated into the Ad vector of the present invention include genes that are used in the aforementioned gene therapy. By using the Ad vector of the present invention for gene therapy, effective gene therapy can be performed by including a gene expression control mechanism so that the suicide gene is not expressed, for example, in a site other than the necessary cells and tissues. Can do.
本発明は、例えばＨＳＶＴＫ(Herpes simplex virus thymidine kinase)遺伝子を導入遺伝子とし、該導入遺伝子の非翻訳領域にｍｉＲＮＡの標的配列を含むＡｄベクターを含む遺伝子治療用ベクターにも及ぶ。また、本発明の遺伝子治療用ベクターは、ガンシクロビルと併用して使用することで、より効果的な抗腫瘍剤として使用できることから、本発明は、遺伝子治療用ベクターとガンシクロビルを各々薬剤として含む抗腫瘍剤キットにも及ぶ。 The present invention also extends to a gene therapy vector including, for example, an HS vector (Herpes simplex virus thymidine kinase) gene as a transgene and an Ad vector containing a miRNA target sequence in the untranslated region of the transgene. In addition, since the gene therapy vector of the present invention can be used as a more effective antitumor agent when used in combination with ganciclovir, the present invention provides an antitumor tumor comprising a gene therapy vector and ganciclovir as drugs. Also extends to drug kits.
本発明のＡｄベクターに組み込まれる所望の導入遺伝子は、使用の目的に応じ、例えばルシフェラーゼやＧＦＰなどのレポータータンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、生体から分離した試料を検査する場合、試料において、特定の疾患に応じて試料中の特定のｍｉＲＮＡの発現量が増減する場合がある。このような試料中に内在する特定のｍｉＲＮＡの増減を調べる場合に、ｍｉＲＮＡと本発明のＡｄベクター上のｍｉＲＮＡの標的配列が結合することで、レポータータンパク質の発現が制御される。そこで、レポータータンパク質の発現を確認することで、試料中のｍｉＲＮＡの存在を確認することができる。このように、該Ａｄベクター上に組み込まれたレポーター遺伝子の発現を確認して、試料中の前記Ａｄベクター上に組み込まれた標的配列に対するｍｉＲＮＡの存在を分析することによる試料の検査方法も本発明の範囲に含めることができる。また、Ａｄベクターに組み込まれる所望の遺伝子は、その発現を確認することができれば、使用する目的に応じて、どのような遺伝子であってもよい。さらに、本発明のＡｄベクターに組み込まれる所望の導入遺伝子は、上述のように遺伝子治療等に使用可能な遺伝子と、上述のレポータータンパク質をコードする遺伝子を組み合わせたものであってもよい。 The desired transgene incorporated into the Ad vector of the present invention may be a gene encoding a reporter protein such as luciferase or GFP, depending on the purpose of use. For example, when examining a sample separated from a living body, the expression level of a specific miRNA in the sample may increase or decrease in the sample according to a specific disease. When the increase / decrease of specific miRNA contained in such a sample is examined, the expression of the reporter protein is controlled by binding of the miRNA and the target sequence of the miRNA on the Ad vector of the present invention. Therefore, the presence of miRNA in the sample can be confirmed by confirming the expression of the reporter protein. Thus, the present invention also relates to a method for examining a sample by confirming the expression of a reporter gene incorporated on the Ad vector and analyzing the presence of miRNA against the target sequence incorporated on the Ad vector in the sample. Can be included in the range. The desired gene to be incorporated into the Ad vector may be any gene depending on the purpose of use as long as its expression can be confirmed. Furthermore, the desired transgene incorporated into the Ad vector of the present invention may be a combination of a gene that can be used for gene therapy as described above and a gene that encodes the above reporter protein.
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto.
（実施例１）遺伝子発現制御システムを搭載したホタルルシフェラーゼ遺伝子発現カセットの作製
肝臓細胞で遺伝子発現が抑制されるような遺伝子発現カセットを作製した。ＣＭＶプロモーターにホタルルシフェラーゼ遺伝子と、その３’非翻訳領域に肝臓で特異的に発現するｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２ａ）の標的配列を挿入し、シャトルプラスミドpCMVL1-mir122aTを作製した（図１（Ａ）参照）。ｍｉＲＮＡの標的配列として、ｍｉＲ−１２２ａに完全相補な配列（標的配列１単位）を４コピー含む、配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挿入した。また遺伝子発現効率の補正を目的として、ウミシイタケルシフェラーゼ発現シャトルプラスミドpCMV-RL1を作製した。
標的配列：ACAAACACCATTGTCACACTCCACAGCACAAACACCATTGTCACACTCCATTAATACAAACACCATTGTCACACTCCAGGACACAAACACCATTGTCACACTCCA（配列番号８）
上記において、下線を施した部分は、配列表の配列番号６に記載する配列の相補配列と完全に一致する配列である。
(Example 1) Preparation of a firefly luciferase gene expression cassette equipped with a gene expression control system A gene expression cassette that suppresses gene expression in liver cells was prepared. The firefly luciferase gene was inserted into the CMV promoter, and the target sequence of miRNA (miR-122a) specifically expressed in the liver was inserted into its 3 ′ untranslated region to prepare shuttle plasmid pCMVL1-mir122aT (see FIG. 1 (A)). ). As a target sequence of miRNA, an oligonucleotide consisting of a base sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, containing 4 copies of a sequence completely complementary to miR-122a (1 unit of target sequence) was inserted. For the purpose of correcting the gene expression efficiency, a Renilla luciferase expression shuttle plasmid pCMV-RL1 was prepared.
Target sequence: A CAAACACCATTGTCACACTCCA CAGCA CAAACACCATTGTCACACTCCA TTAATA CAAACACCATTGTCACACTCCA GGACA CAAACACCATTGTCACACTCCA (SEQ ID NO: 8)
In the above, the underlined portion is a sequence that completely matches the complementary sequence of the sequence described in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
（実施例２）遺伝子発現制御システムを搭載したＨＳＶＴＫ遺伝子遺伝子発現カセットの作製
特定のｍｉＲＮＡを発現している細胞で遺伝子発現が抑制されるような遺伝子発現カセットを作製した。ＣＭＶプロモーターにＨＳＶＴＫ遺伝子と、その３’非翻訳領域に、実施例１と同様に肝臓で特異的に発現するｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２ａ）の標的配列を挿入し、シャトルプラスミドpCMVTK-mir122aTを作製した（図１（Ｂ）参照）。
(Example 2) Preparation of HSVTK gene gene expression cassette equipped with a gene expression control system A gene expression cassette was prepared so that gene expression was suppressed in cells expressing a specific miRNA. The target sequence of miRNA (miR-122a) specifically expressed in the liver was inserted into the CMV promoter and HSVTK gene and its 3 ′ untranslated region in the same manner as in Example 1 to prepare shuttle plasmid pCMVTK-mir122aT ( (See FIG. 1B).
（実施例３）Ａｄベクターの作製
ＡｄゲノムのＥ３欠損領域に、遺伝子発現効率補正用にウミシイタケルシフェラーゼ発現カセットを挿入するため、実施例１で作製したシャトルプラスミドpCMV-RL1をCsp45Iで、ＡｄプラスミドpAdHM20をClaIで切断し、両者の切断フラグメントを直接ライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌（DH5a）にトランスフォーメーションした。独立大腸菌クローンを培養し、プラスミドＤＮＡを回収した。制限酵素解析を行い、ウミシイタケルシフェラーゼ発現単位が挿入されたプラスミドpAdHM20-RLを得た。
(Example 3) Preparation of Ad vector In order to insert a Renilla luciferase expression cassette into the E3 deficient region of the Ad genome for correction of gene expression efficiency, the shuttle plasmid pCMV-RL1 prepared in Example 1 was replaced with Csp45I and Ad plasmid. pAdHM20 was cleaved with ClaI, and both cleaved fragments were directly ligated. The ligation product was transformed into E. coli (DH5a). Independent E. coli clones were cultured and plasmid DNA was recovered. Restriction enzyme analysis was performed to obtain a plasmid pAdHM20-RL in which a Renilla luciferase expression unit was inserted.
さらに、ＡｄゲノムのＥ１欠損領域に、実施例１のｍｉＲＮＡの標的配列による遺伝子発現制御システムを搭載したホタルルシフェラーゼ発現カセットを挿入するため、pCMVL1-mir122aTおよびpAdHM20-RLをそれぞれI-CeuIおよびPI-SceIで消化した。その後、得られたフラグメントをライゲーションし、pAdHM20-CMVL1-mir122aT-RLを作製した（図２）。 Furthermore, in order to insert the firefly luciferase expression cassette loaded with the gene expression control system based on the miRNA target sequence of Example 1 into the E1 deficient region of the Ad genome, pCMVL1-mir122aT and pAdHM20-RL are respectively I-CeuI and PI- Digested with SceI. Thereafter, the obtained fragment was ligated to prepare pAdHM20-CMVL1-mir122aT-RL (FIG. 2).
また、ＨＳＶＴＫ発現プラスミドpAdHM20-HSVTK-mir122aTについては、同様に実施例２のｍｉＲＮＡの標的配列による遺伝子発現制御システムを搭載したＨＳＶＴＫ発現カセットを挿入するため、pAdHM20およびpCMVTK-mir122aTをI-CeuIとPI-SceIで消化し、得られたフラグメントをライゲーションすることにより作製した。 Similarly, for HSVTK expression plasmid pAdHM20-HSVTK-mir122aT, pAdHM20 and pCMVTK-mir122aT were inserted into I-CeuI and PI in order to insert the HSVTK expression cassette loaded with the gene expression control system based on the miRNA target sequence of Example 2. -Digested with SceI and generated by ligation of the resulting fragment.
次に作製したプラスミドを、ウイルスゲノム末端に制限酵素認識部位が存在するPacIで切断することにより線状にし、Superfect(R)（Qiagen社）を用いて２９３細胞にトランスフェクションした。約１０日間培養後、ｍｉＲＮＡ標的配列（配列番号８）を含む遺伝子発現制御システムを搭載したホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ発現Ａｄベクター、Ad-L-mir122aT、およびＨＳＶＴＫ発現Ａｄベクター、Ad-tk-mir122aTを得た。これらのベクターを増幅させ、塩化セシウムを用いた定法により精製した。精製したＡｄベクターの物理化学的力価は分光学的方法により測定した。 Next, the prepared plasmid was linearized by cutting with PacI having a restriction enzyme recognition site at the end of the viral genome, and transfected into 293 cells using Superfect (R) (Qiagen). After culturing for about 10 days, a firefly and Renilla luciferase expression Ad vector, Ad-L-mir122aT, and an HSVTK expression Ad vector Ad-tk-mir122aT equipped with a gene expression control system containing a miRNA target sequence (SEQ ID NO: 8) Obtained. These vectors were amplified and purified by a conventional method using cesium chloride. The physicochemical titer of the purified Ad vector was measured by a spectroscopic method.
コントロールＡｄベクターとして、今回使用したｍｉＲ−１２２ａ標的配列と逆方向の配列を挿入したAd-L-mirConTおよびAd-tk-mirConT、およびｍｉＲ−１２２ａ標的配列を挿入していないAd-Lも同様に作製した。 As control Ad vectors, Ad-L-mirConT and Ad-tk-mirConT into which the sequence reverse to the miR-122a target sequence used this time was inserted, and Ad-L into which the miR-122a target sequence was not inserted were similarly used. Produced.
（実験例１）In vivo遺伝子導入実験
C57Bl6マウス（５−６週令、メス）の下腹部にB16メラノーマ細胞を5×105 cells/50μlで皮下移植した。腫瘍の大きさが５−８ｍｍに達した後、実験に用いた。実施例３で作製したホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現Ａｄベクター(Ad-L-mir122aT)並びにコントロールＡｄベクター(Ad-L, Ad-L-mirConT)を、各々3×109, 3×1010 vector particle (VP)/マウスの投与量で腫瘍に局所投与し、４８時間後、腫瘍および各臓器を回収した。溶解緩衝液でホモジネートした腫瘍および各臓器を３回凍結融解したのち、15000rpm、１０分間遠心処理し、上清を回収した。回収した上清中のホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を、Dual luciferase(R) Assay kit (Promega社)を用いて測定した。タンパク質量の定量は、Bio-Rad(R) assay kit (Bio-Rad社)を用いて行った。
(Experiment 1) In vivo gene transfer experiment
B16 melanoma cells were subcutaneously implanted at 5 × 10 5 cells / 50 μl in the lower abdomen of C57B16 mice (5-6 weeks old, female). After the tumor size reached 5-8 mm, it was used for experiments. Firefly and Renilla luciferase expression Ad vectors (Ad-L-mir122aT) and control Ad vectors (Ad-L, Ad-L-mirConT) prepared in Example 3 were respectively 3 × 10 9 and 3 × 10 10 vectors. Particles (VP) / mouse were administered locally at the dose of mice, and after 48 hours, tumors and organs were collected. The tumor and each organ homogenized with the lysis buffer were thawed and thawed three times, and then centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. Firefly and Renilla luciferase activities in the collected supernatant were measured using Dual luciferase (R) Assay kit (Promega). The amount of protein quantification was performed using a Bio-Rad (R) assay kit (Bio-Rad , Inc.).
Ad-L-mir122aTおよびAd-L-mirConTによるマウスの肝臓および腫瘍でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量を、Ad-Lによる発現量を１としたときの相対比で示した（図３）。その結果、肝臓での遺伝子発現量は、Ad-Lによる発現量に比べて1/90〜1/100に減少した。一方で腫瘍での遺伝子発現量においては、ｍｉＲＮＡ標的配列を挿入することによる大きな影響は観察されず、Ad-Lと同程度の遺伝子発現量が維持されることを確認した。 The expression level of the luciferase gene in mouse liver and tumor by Ad-L-mir122aT and Ad-L-mirConT is shown as a relative ratio when the expression level by Ad-L is 1. (FIG. 3) As a result, the gene expression level in the liver decreased to 1/90 to 1/100 compared with the expression level by Ad-L. On the other hand, in the gene expression level in the tumor, no significant effect was observed by inserting the miRNA target sequence, and it was confirmed that the gene expression level comparable to Ad-L was maintained.
（実験例２）癌治療効果の検討
実験例１と同様に作製した皮下腫瘍モデルマウスに対し、ｍｉＲＮＡ標的配列を含むＨＳＶＴＫ発現Ａｄベクター（Ad-tk-mir122aT）、ｍｉＲＮＡ標的配列とは逆方向の配列を挿入したＨＳＶＴＫ発現Ａｄベクター（Ad-tk-mirConT）およびｍｉＲ−１２２ａの標的配列を含まないAd-Lを、各々3×109および3×1010 VP/腫瘍の各投与量で腫瘍内投与した。Ａｄベクター投与翌日より毎日、ガンシクロビル（GCV）を75 mg/kgの投与量で腹腔内投与するとともに、腫瘍サイズを測定し、計算式よりその体積を求めた（腫瘍体積(mm3)＝（長径）×（短径）２×0.5236）。
(Experimental example 2) Examination of cancer therapeutic effect For a subcutaneous tumor model mouse produced in the same manner as in Experimental example 1, an HSVTK expression Ad vector (Ad-tk-mir122aT) containing a miRNA target sequence, in a direction opposite to that of the miRNA target sequence HSVTK expression Ad vector (Ad-tk-mirConT) into which the sequence was inserted and Ad-L not containing the target sequence of miR-122a were injected into the tumor at doses of 3 × 10 9 and 3 × 10 10 VP / tumor, respectively. Administered. Every day from the day after Ad vector administration, ganciclovir (GCV) was intraperitoneally administered at a dose of 75 mg / kg, the tumor size was measured, and the volume was determined from the formula (tumor volume (mm 3 ) = (major axis) ) X (minor axis) 2 x 0.5236).
その結果、Ad-tk-mir122aTを腫瘍内投与した場合は、Ad-tk-mirConTと同程度の優れた抗腫瘍効果を示すことが確認され、ｍｉＲＮＡ標的配列を含むベクターを投与した場合であっても、抗腫瘍効果には悪影響を及ぼさないことが確認された（図４）。 As a result, when Ad-tk-mir122aT was administered intratumorally, it was confirmed that the anti-tumor effect was as excellent as Ad-tk-mirConT, and when a vector containing a miRNA target sequence was administered. It was also confirmed that the antitumor effect was not adversely affected (FIG. 4).
（実験例３）肝障害の検討（ＧＰＴ）
実験例２と同手法によりＡｄベクターを投与し、６日後に眼窩採血を行い、血清中のグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）濃度を測定した。
(Experimental example 3) Examination of liver injury (GPT)
Ad vector was administered by the same method as in Experimental Example 2, and orbital blood was collected 6 days later, and glutamate pyruvate transaminase (GPT) concentration in serum was measured.
その結果、Ad-tk-mirConTを投与した場合に比べ、Ad-tk-mir122aTの場合は、ＧＰＴ活性が低く抑えられ、肝障害が低く抑えられていることが確認された（図５）。 As a result, it was confirmed that the Ad-tk-mir122aT suppressed GPT activity to a low level and the liver damage to a low level compared to the case of Ad-tk-mirConT administration (FIG. 5).
（実験例４）肝障害の検討（組織学的検討）
実験例２と同手法によりＡｄベクターを投与し、６日後に肝臓を回収し、組織切片を作製した。組織は、通常の方法に従って固定し、パラフィン包埋し、薄切切片を作製したものをヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。組織切片を顕微鏡下観察し、肝障害の程度を評価した。
(Experimental example 4) Examination of liver injury (histological examination)
The Ad vector was administered in the same manner as in Experimental Example 2, and the liver was collected 6 days later to prepare a tissue section. Tissues were fixed according to conventional methods, embedded in paraffin, and sliced sections were stained with hematoxylin and eosin. Tissue sections were observed under a microscope to evaluate the degree of liver injury.
その結果、Ad-tk-mirConTを投与した場合では、広範囲における肝細胞の変性や炎症性細胞の浸潤など肝障害を有意に認めたが（図６Ａ）、Ad-tk-mir122aT（図６Ｂ）の場合は、生理食塩水（図６Ｃ）と同様に肝障害を認めなかった。 As a result, when Ad-tk-mirConT was administered, liver damage such as degeneration of hepatocytes and infiltration of inflammatory cells was significantly observed (FIG. 6A), but Ad-tk-mir122aT (FIG. 6B) In the case, no liver damage was observed as in the case of physiological saline (FIG. 6C).
（実験例５）体重に及ぼす影響
実験例２と同手法によりＡｄベクターを投与し、１０日後の体重を測定した。
(Experimental example 5) Influence on body weight Ad vector was administered by the same method as Experimental example 2, and the body weight after 10 days was measured.
その結果、Ad-tk-mirConTを投与した場合では、大きく体重の減少を認めたが、Ad-tk-mir122aTの場合は、生理食塩水投与の場合と比べて有意差を認めなかった（図７）。 As a result, when Ad-tk-mirConT was administered, a significant decrease in body weight was observed, but in the case of Ad-tk-mir122aT, no significant difference was observed compared to the case of physiological saline administration (FIG. 7). ).
以上詳述したように、本発明の特定の細胞または組織に特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列を組み込んでなるＡｄベクターを用いると、例えば遺伝子治療において、特定の細胞または組織とは異なる部位で、Ａｄベクターに組み込んだ遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。特定の細胞や組織での遺伝子の発現を防ぐことで、例えば正常細胞や肝細胞などの特定の細胞や組織において、遺伝子治療による不要な副作用を軽減化することができ、効果的な遺伝子治療方法とすることができる。係るＡｄベクターを用いることにより、遺伝子治療において、効果的に遺伝子デリバリーを行うことができる。 As described in detail above, when an Ad vector incorporating a miRNA target sequence specifically expressed in a specific cell or tissue of the present invention is used, for example, in gene therapy, at a site different from the specific cell or tissue. The expression of the gene incorporated into the Ad vector can be effectively suppressed. By preventing gene expression in specific cells and tissues, unnecessary side effects due to gene therapy can be reduced in specific cells and tissues such as normal cells and hepatocytes. It can be. By using such an Ad vector, gene delivery can be effectively performed in gene therapy.
このように、本発明のＡｄベクターは、遺伝子治療に有効に利用することができる。その他、特定のｍｉＲＮＡと本発明のＡｄベクターが作用することから、本発明のＡｄベクターを用いると、試料中のｍｉＲＮＡの有無を検出することができ、これにより、試料中のｍｉＲＮＡをマーカーとして試料の検査を行うことができる。例えば、特定の癌のみで発現抑制されるｍｉＲＮＡが公知である場合に、このようなｍｉＲＮＡ標的配列とレポータータンパク質を含むＡｄベクターを用いて試料中のｍｉＲＮＡ標的配列をマーカーとして検出した場合、特定の癌の場合はｍｉＲＮＡが抑制されることから、癌が存在する場合にのみレポータータンパク質が発現することとなる。このように、癌の検査などにも用いることができる。 Thus, the Ad vector of the present invention can be effectively used for gene therapy. In addition, since the specific miRNA and the Ad vector of the present invention act, the presence or absence of miRNA in the sample can be detected by using the Ad vector of the present invention. Can be inspected. For example, when miRNA whose expression is suppressed only in a specific cancer is known, when the miRNA target sequence in a sample is detected as a marker using an Ad vector containing such a miRNA target sequence and a reporter protein, a specific Since miRNA is suppressed in the case of cancer, the reporter protein is expressed only when cancer is present. Thus, it can also be used for cancer testing.
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