JP5804353B2 - Manufacturing method of compatible solute - Google Patents

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本発明は、微生物を利用することを特徴とする適合溶質の製造方法に関する。具体的には、微生物を利用することを特徴とするメチル化グリシンの製造方法に関する。   The present invention relates to a method for producing a compatible solute characterized by utilizing microorganisms. Specifically, the present invention relates to a method for producing methylated glycine characterized by utilizing microorganisms.

環境ストレスにさらされたとき、水に代わって生体成分を保護するために体内に蓄積されてくる低分子の化合物を、適合溶質という。一般には、耐塩性、乾燥耐性、凍結耐性など、細胞質の脱水を引き起こす高浸透圧ストレスに対する耐性を細胞に与える機能を持つと考えられている。   A low-molecular compound that accumulates in the body to protect biological components instead of water when exposed to environmental stress is called a compatible solute. In general, it is considered to have a function of giving cells resistance to hyperosmotic stress that causes cytoplasmic dehydration such as salt tolerance, drought tolerance, and freeze tolerance.

生物が高濃度の塩分、乾燥、凍結などに曝されることにより生じる脱水ストレス条件下では、細菌から真菌、植物、動物を含むすべての生物は細胞の膨圧を維持して保湿性を保つために浸透圧調節物質を細胞内に高密度蓄積する。実際に生物が細胞内に蓄積している浸透圧調節物質としては、K+ や Na+ などのイオンの他に、高密度蓄積しても細胞内の代謝を阻害しない適合溶質と呼ばれる低分子有機化合物（アミノ酸類、糖類、ポリオール類など）が知られている。適合溶質は、単に浸透圧の調節を行うだけでなく、タンパク質及び膜の安定化、ヒドロキシラジカル (HO・) 消去、核酸の Tm値低下による DNA複製や転写、翻訳の保護などの機能を持つことが示されており、種々の環境ストレスから細胞を保護するために重要な役割を担っている。 Under conditions of dehydration stress caused by exposure of organisms to high concentrations of salt, desiccation, freezing, etc., all organisms including bacteria, fungi, plants and animals maintain cell swell pressure and maintain moisture retention In addition, osmotic pressure-regulating substances accumulate in cells at high density. In fact, as an osmotic pressure regulating substance that organisms accumulate in cells, in addition to ions such as K + and Na + , low molecular organics called compatible solutes that do not inhibit intracellular metabolism even when accumulated at high density Compounds (amino acids, saccharides, polyols, etc.) are known. Compatible solutes not only regulate osmotic pressure, but also have functions such as protein and membrane stabilization, hydroxy radical (HO •) elimination, DNA replication and transcription by reducing Tm value of nucleic acids, and protection of translation. Has been shown to play an important role in protecting cells from various environmental stresses.

適合溶質のうち、エクトインや、グリシンがトリメチル化されたグリシンベタイン（N,N,N-トリメチルグリシン）は、浸透圧調節、タンパク質保護、膜の保護、ラジカル消去などの機能を発揮することが知られている。また、グリシンベタインよりは若干劣るものの、ジメチルグリシンについても、細胞の浸透圧調節、タンパク質合成活性の保護機能や凍結耐性の機能があるといわれている。適合溶質のうち、微生物におけるエクトイン生合成の経路及びエクトインの機能については、非特許文献１に詳述されている。   Among compatible solutes, ectoine and glycine betaine (N, N, N-trimethylglycine) in which glycine is trimethylated are known to exert functions such as osmotic pressure regulation, protein protection, membrane protection, and radical scavenging. It has been. Although it is slightly inferior to glycine betaine, dimethylglycine is also said to have functions of regulating cell osmotic pressure, protecting protein synthesis activity, and freezing tolerance. Of the compatible solutes, the ectoine biosynthesis pathway and ectoin function in microorganisms are described in detail in Non-Patent Document 1.

微生物を用いて生産効率を上げる方法は、従来より研究がなされており、高密度培養の研究も数多くなされている。しかしながら、糖類や塩類等の濃度を上げた培地を用いて目的物の生産性を高めることは簡便な方法であるが、高濃度の培地成分によって浸透圧が上昇するため、一定の浸透圧以上となると、微生物はもはや生育できなくなる。これを改善するために、例えば初発の糖濃度を上げた培地にベタインを添加することで、乳酸菌からマンニトールを効率的に生産する方法が知られている。また、塩、糖、ポリオールなどの栄養成分を高濃度に含んだ培地に、好塩性細菌ハロモナスから分離したエクトインを添加して微生物を高密度培養すると、培養効率を上げることができることが報告されている（特許文献１）。   Methods for increasing production efficiency using microorganisms have been studied conventionally, and many studies on high-density culture have been conducted. However, it is a simple method to increase the productivity of the target product using a medium with increased concentrations of sugars, salts, etc., but since the osmotic pressure is increased by a medium component of high concentration, Then, the microorganism can no longer grow. In order to improve this, for example, a method for efficiently producing mannitol from lactic acid bacteria by adding betaine to a medium having an increased initial sugar concentration is known. It has also been reported that culture efficiency can be improved by adding ectoine isolated from halophilic bacteria Halomonas to a medium containing high concentrations of nutrients such as salt, sugar, polyol, etc. and culturing microorganisms at high density. (Patent Document 1).

グリシンベタインは、エビ、カニ、タコ、イカ、貝類などの水産物やテンサイ、麦芽、キノコ類、果実などの食材に多く含まれており、"甘味"と"うま味"の一成分となっている。そのため、日本では安全性の高い食品添加物として広く使用されている。また、グリシンベタインは優れた保湿機能や生体分子保護機能を有するため、化粧品や整髪料などにも使用されている。グリシンベタインは、さらに動脈硬化の危険因子であるホモシステインの代謝に関係することから、ホモシステイン尿症患者に対する医薬品としても用いられる。加えて循環器の健康維持のためのサプリメント成分としても利用されている。世界的にも、家畜の必須栄養素コリンの欠乏を補う目的にグリシンベタインが飼料添加物として使用されている。   Glycine betaine is abundant in marine products such as shrimp, crab, octopus, squid and shellfish, and other ingredients such as sugar beet, malt, mushrooms and fruits, and is a component of "sweetness" and "umami". Therefore, in Japan, it is widely used as a highly safe food additive. In addition, glycine betaine has an excellent moisturizing function and biomolecule protecting function, and is therefore used in cosmetics and hairdressing products. Glycine betaine is also used as a pharmaceutical for patients with homocysteineuria because it is related to the metabolism of homocysteine, which is a risk factor for arteriosclerosis. In addition, it is also used as a supplement for maintaining cardiovascular health. Worldwide, glycine betaine is used as a feed additive to compensate for the deficiency of the essential nutrient choline in livestock.

グリシンベタインは "テンサイ"（別名：サトウダイコン）の根部から製造される砂糖の副産物であるテンサイ糖蜜から抽出して生産される。このため生産量は原料となるテンサイの収穫量に依存し、その有用性の高さにも関わらずグリシンベタインの増産には限界があった。   Glycine betaine is produced by extraction from sugar beet molasses, a sugar by-product produced from the roots of sugar beet (aka sugar beet). For this reason, the production amount depends on the yield of sugar beet as a raw material, and there was a limit to the increase in production of glycine betaine despite its high usefulness.

根粒菌は、適合溶質の生合成能又は蓄積能が低いために、ストレスの影響を大きく受けてしまうと考えられており、根粒菌のストレス耐性能力の向上のために、適合溶質のうち、グリシンベタインの製法について検討がなされている（特許文献２）。ここでは、グリシンベタイン生合成能又は蓄積能が低い根粒菌に、グリシンベタイン生合成に関与するコリンオキシダーゼをコードする遺伝子を導入することにより、グリシンベタインの生合成能及び蓄積能が向上することが開示されている。ここで報告されるグリシンベタインの製法は、いわゆるコリンを基質としたコリン酸化経路によるものである。   Rhizobium is thought to be greatly affected by stress due to the low biosynthetic or accumulating ability of compatible solutes. A method for producing betaine has been studied (Patent Document 2). Here, by introducing a gene encoding choline oxidase involved in glycine betaine biosynthesis into rhizobia having low glycine betaine biosynthesis or accumulation ability, the biosynthesis ability and accumulation ability of glycine betaine may be improved. It is disclosed. The production method of glycine betaine reported here is based on the so-called choline oxidation pathway using choline as a substrate.

Biotechnology Advances 28 (2010) 782-801Biotechnology Advances 28 (2010) 782-801

特開平8-154670号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 8-156670 特開2004-229557号公報JP 2004-229557 A

本発明は、所望の適合溶質を容易に高生産可能な製法を提供することを課題とする。具体的には、微生物内に所望の適合溶質を生合成させ、容易に分離・回収可能な製法を提供することを課題とする。   An object of the present invention is to provide a production method capable of easily producing a desired compatible solute with high productivity. Specifically, it is an object to provide a production method in which a desired compatible solute is biosynthesized in a microorganism and can be easily separated and recovered.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、微生物が本来産生しうる主要な適合溶質の生合成能を低下又は欠失させ、且つ所望の適合溶質生合成に関連する外来遺伝子を導入した微生物を高浸透圧条件下で培養し、当該微生物中で所望の適合溶質を生合成させる工程を含み、さらに当該微生物中で生合成した所望の適合溶質を、低浸透圧条件下で微生物から排出させ、回収する工程を含む製造方法により、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成した。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have reduced or eliminated the biosynthetic ability of the main compatible solute that can be originally produced by microorganisms and related to the desired compatible solute biosynthesis. A step of culturing a microorganism introduced with a foreign gene under high osmotic pressure conditions to biosynthesize a desired compatible solute in the microorganism, and further adding a desired compatible solute biosynthesized in the microorganism to a low osmotic pressure. The present invention has been completed by finding that the above problems can be solved by a production method including a step of discharging from microorganisms and collecting them under conditions.

すなわち本発明は、以下よりなる。
１．以下の工程を含む、微生物を用いた適合溶質（Ａ）の製造方法：
１）適合溶質（Ｂ）の生合成能を低下又は欠失させ、且つ適合溶質（Ａ）生合成に関連する外来遺伝子を導入した微生物を高浸透圧条件下で培養し、微生物中で適合溶質（Ａ）を生合成させる工程；
２）前記微生物中で生合成した適合溶質（Ａ）を、低浸透圧条件下で微生物から排出させ、回収する工程。
２．高浸透圧条件が、塩化ナトリウム濃度（NaCl)で換算した場合に0.5〜4 Mであり、低浸透圧条件が、同様に塩化ナトリウム濃度で換算した場合に0〜0.5 Mであることを特徴とする、前項１に記載の製造方法。
３．微生物が、ハロモナス属(Halomonas)に属する微生物であることを特徴とする、前項１又は２に記載の製造方法。
４．ハロモナス属に属する微生物が、Halomonas elongataに属する微生物であることを特徴とする、前項３に記載の製造方法。
５．前記適合溶質（Ｂ）が、エクトインであることを特徴とする、前項３又は４に記載の製造方法。
６．適合溶質（Ｂ）の生合成能を低下又は欠失させることが、前記微生物のゲノム上に存在するエクトイン生合成オペロンのうち、エクトイン生合成に特異的な遺伝子の一部若しくは全部を除去することである、前項５に記載の製造方法。
７．適合溶質（Ａ）が、メチル化グリシンであることを特徴とする、前項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
８．メチル化グリシンが、グリシンからサルコシンを合成する経路を介して生合成されることを特徴とする、前項７に記載の製造方法。
９．メチル化グリシンが、少なくともグルコース、グリセロール及び／又はキシロースを炭素源として生合成されることを特徴とする、前項７又は８に記載の製造方法。
１０．適合溶質（Ａ）の生合成に関連する外来遺伝子が、少なくともグリシンサルコシンメチル基転移酵素（GSMT）関連遺伝子である、前項７〜９のいずれかに記載の製造方法。
１１．グリシンサルコシンメチル基転移酵素（GSMT）関連遺伝子が、以下に示すいずれかの塩基配列からなる、前項１０に記載の製造方法：
１）配列表の配列番号１に示す塩基配列；
２）前記１）に記載の塩基配列のうち、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加といった変異された配列からなる塩基配列；
３）前記１）又は２）に記載の塩基配列に対して縮重し、グリシンサルコシンメチル基転移酵素（GSMT）が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；
４）前記１）〜３）のいずれかに記載の配列と、80％以上の相同性を有する塩基配列。
１２．適合溶質（Ａ）の生合成に関連する外来遺伝子が、さらに、ジメチルグリシンメチル基転移酵素（DMT）関連遺伝子である、前項１０又は１１に記載の製造方法。
１３．メチルグリシンメチル基転移酵素（DMT）関連遺伝子が、以下に示すいずれかの塩基配列からなる、前項１２に記載の製造方法：
１）配列表の配列番号２に示す塩基配列；
２）前記１）に記載の塩基配列のうち、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加といった変異された塩基配列；
３）前記１）又は２）に記載の塩基配列に対して縮重し、メチルグリシンメチル基転移酵素（DMT）が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；
４）前記１）〜３）のいずれかに記載の塩基配列と、80％以上の相同性を有する塩基配列。
１４．適合溶質（Ａ）の生合成に関連する外来遺伝子が、さらにＳ−アデノシルメチオニン（SAM）合成酵素関連遺伝子である、前項１０〜１３のいずれかに記載の製造方法。
１５．Ｓ−アデノシルメチオニン（SAM）合成酵素関連遺伝子が、以下に示すいずれかの塩基配列からなる、前項１４に記載の製造方法：
１）配列表の配列番号３に示す塩基配列；
２）前記１）に記載の塩基配列のうち、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加といった変異された塩基配列；
３）前記１）又は２）に記載の塩基配列に対して縮重し、Ｓ−アデノシルメチオニン（SAM）合成酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；
４）前記１）〜３）のいずれかに記載の塩基配列と、80％以上の相同性を有する塩基配列。
１６．外来遺伝子の導入が、ハロモナス属に属する微生物のゲノム上に存在するエクトイン生合成オペロンのうち、浸透圧応答性プロモーターの制御下にある領域に、前項１１に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子を導入することによる、前項３〜１１に記載製造方法。
１７．外来遺伝子の導入が、ハロモナス属に属する微生物のゲノム上に存在するエクトイン生合成オペロンのうち、浸透圧応答性プロモーターの制御下にある領域に、さらに前項１３に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子を導入することによる、前項１６に記載の製造方法。
１８．外来遺伝子の導入が、ハロモナス属に属する微生物のゲノム上に存在するエクトイン生合成オペロンのうち、浸透圧応答性プロモーターの制御下にある領域に、前項１５に記載のいずれかの遺伝子を導入することによる、前項１６又は１７に記載の製造方法。
１９．浸透圧応答性プロモーターが、ハロモナス属に属する微生物のゲノム上に存在するエクトインの生合成オペロンの上流配列（UectA）中に含まれることを特徴とする、前項１６〜１８のいずれかに記載の製造方法。
２０．メチル化グリシンが、グリシンベタインである、前項７〜１９のいずれかに記載の製造方法。
２１．メチル化グリシンが、ジメチルグリシンである、前項７〜１１、１４〜１６、１８〜１９のいずれかに記載の製造方法。
２２．ハロモナス属に属する微生物のゲノムにおいて、エクトインの生合成オペロンのうち、浸透圧応答性のプロモーターを含み、エクトインの生合成に特異的な遺伝子の一部又は全部を欠損あるいは置換していることを特徴とする微生物。
２３．エクトインの生合成に特異的な遺伝子が、L-アスパラギン酸-β-セミアルデヒドからエクトインへの代謝において、L-ジアミノ酪酸アミノ基転移酵素及び／又はL-ジアミノ酪酸アセチル基転移酵素の発現に必須な領域であることを特徴とする前項２２に記載の微生物。
２４．受託番号FERM P-22094で特定される微生物である、前項２２又は２３に記載の微生物。 That is, this invention consists of the following.
1. A method for producing a compatible solute (A) using a microorganism, comprising the following steps:
1) A microorganism in which the biosynthetic ability of the compatible solute (B) is reduced or deleted and a foreign gene related to the compatible solute (A) biosynthesis is introduced under high osmotic pressure conditions, and the compatible solute is contained in the microorganism. Biosynthesizing (A);
2) A step of discharging and recovering the compatible solute (A) biosynthesized in the microorganism under low osmotic pressure conditions.
2. The high osmotic pressure condition is 0.5 to 4 M when converted to sodium chloride concentration (NaCl), and the low osmotic pressure condition is similarly 0 to 0.5 M when converted to sodium chloride concentration. The manufacturing method according to the preceding item 1.
3. 3. The method according to item 1 or 2, wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Halomonas .
4). 4. The method according to item 3, wherein the microorganism belonging to the genus Halomonas is a microorganism belonging to Halomonas elongata .
5. 5. The method according to item 3 or 4, wherein the compatible solute (B) is ectoine.
6). Decreasing or deleting the biosynthetic ability of the compatible solute (B) removes part or all of a gene specific for ectoin biosynthesis from the ectoine biosynthesis operon present on the genome of the microorganism. The manufacturing method according to item 5 above.
7). 7. The method according to any one of items 1 to 6, wherein the compatible solute (A) is methylated glycine.
8). 8. The production method according to item 7 above, wherein methylated glycine is biosynthesized through a pathway for synthesizing sarcosine from glycine.
9. 9. The production method according to item 7 or 8, wherein methylated glycine is biosynthesized using at least glucose, glycerol and / or xylose as a carbon source.
10. 10. The production method according to any one of items 7 to 9, wherein the foreign gene related to biosynthesis of the compatible solute (A) is at least a glycine sarcosine methyltransferase (GSMT) related gene.
11. The production method according to item 10 above, wherein the glycine sarcosine methyltransferase (GSMT) -related gene consists of any of the following base sequences:
1) the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
2) A base sequence consisting of a mutated sequence wherein one or several bases are substituted, deleted, inserted or added among the base sequences described in 1) above;
3) A base sequence that is degenerate with respect to the base sequence described in 1) or 2) and encodes an amino acid sequence of glycine sarcosine methyltransferase (GSMT);
4) A base sequence having 80% or more homology with the sequence described in any one of 1) to 3) above.
12 12. The production method according to item 10 or 11, wherein the foreign gene related to biosynthesis of the compatible solute (A) is further a dimethylglycine methyltransferase (DMT) related gene.
13. The production method according to item 12 above, wherein the methylglycine methyltransferase (DMT) -related gene consists of any of the following base sequences:
1) the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
2) A base sequence in which one or several bases in the base sequence described in 1) are mutated such as substitution, deletion, insertion or addition;
3) a base sequence that is degenerate with respect to the base sequence described in the above 1) or 2) and encodes an amino acid sequence of methylglycine methyltransferase (DMT);
4) A base sequence having 80% or more homology with the base sequence described in any one of 1) to 3) above.
14 14. The production method according to any one of items 10 to 13, wherein the foreign gene related to biosynthesis of the compatible solute (A) is an S-adenosylmethionine (SAM) synthase-related gene.
15. 15. The production method according to item 14, wherein the S-adenosylmethionine (SAM) synthase-related gene consists of any of the following base sequences:
1) the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing;
2) A base sequence in which one or several bases in the base sequence described in 1) are mutated such as substitution, deletion, insertion or addition;
3) A base sequence that is degenerate with respect to the base sequence described in 1) or 2) above and encodes an amino acid sequence of S-adenosylmethionine (SAM) synthase;
4) A base sequence having 80% or more homology with the base sequence described in any one of 1) to 3) above.
16. A gene comprising any one of the nucleotide sequences described in the previous item 11 in a region under the control of an osmotic pressure responsive promoter among ectoine biosynthetic operons existing on the genome of a microorganism belonging to the genus Halomonas. The manufacturing method of the preceding clauses 3-11 by introduce | transducing.
17. The foreign gene is introduced into the region under the control of the osmotic responsive promoter among the ectoine biosynthetic operons present on the genome of the microorganism belonging to the genus Halomonas, and further comprises any one of the nucleotide sequences described in the previous item 13. 17. The production method according to item 16 above, by introducing a gene.
18. The introduction of a foreign gene involves introduction of any of the genes described in 15 above into a region under the control of an osmotic response promoter among ectoine biosynthetic operons present on the genome of a microorganism belonging to the genus Halomonas. 18. The production method according to 16 or 17 above.
19. 19. The production according to any one of the above items 16 to 18, wherein the osmotic response promoter is contained in an upstream sequence (UectA) of an ectoine biosynthesis operon existing on a genome of a microorganism belonging to the genus Halomonas. Method.
20. 20. The production method according to any one of 7 to 19 above, wherein the methylated glycine is glycine betaine.
21. The production method according to any one of 7 to 11, 14 to 16, and 18 to 19, wherein the methylated glycine is dimethylglycine.
22. In the genome of microorganisms belonging to the genus Halomonas, the ectoin biosynthesis operon contains an osmotic responsive promoter, and a part or all of a gene specific for ectoin biosynthesis is deleted or replaced. Microorganisms.
23. A gene specific for ectoin biosynthesis is essential for the expression of L-diaminobutyrate aminotransferase and / or L-diaminobutyrate acetyltransferase in the metabolism of L-aspartate-β-semialdehyde to ectoine 23. The microorganism according to item 22 above, wherein the microorganism is a large region.
24. 24. The microorganism according to the above item 22 or 23, which is a microorganism specified by the accession number FERM P-22094 .

本発明の適合溶質の製造方法により、所望の適合溶質（Ａ）を微生物内に生合成させ、高密度で蓄積させることを可能とし、かつ、蓄積された微生物内の適合溶質（Ａ）を容易に分離回収することができる。これにより、適合溶質（Ａ）を高生産することができる。
具体的には、微生物が本来有する適合溶質（Ｂ）の生合成能を低下又は欠失させ、且つ適合溶質（Ａ）の生合成に関連する外来遺伝子を導入した微生物を高浸透圧条件下で培養することにより、適合溶質（Ａ）を微生物内に生合成させ、高密度で蓄積させることができる。また、当該微生物を低浸透圧条件で処理することで、微生物を破砕することなく適合溶質（Ａ）を容易に微生物該へ排出させ、回収することができる。
さらに、使用した微生物を繰り返し利用することで、適合溶質（Ａ）を連続して高生産することができ、安定的に供給可能となる。 According to the method for producing a compatible solute of the present invention, a desired compatible solute (A) can be biosynthesized in microorganisms and accumulated at a high density, and the accumulated compatible solute (A) in microorganisms can be easily obtained. Can be separated and recovered. Thereby, the compatible solute (A) can be produced at a high rate.
Specifically, a microorganism into which the biosynthetic ability of the compatible solute (B) inherently possessed by the microorganism is reduced or deleted and a foreign gene related to biosynthesis of the compatible solute (A) is introduced under high osmotic pressure conditions. By culturing, the compatible solute (A) can be biosynthesized in the microorganism and accumulated at high density. In addition, by treating the microorganism under low osmotic pressure conditions, the compatible solute (A) can be easily discharged to the microorganism and recovered without disrupting the microorganism.
Furthermore, by repeatedly using the used microorganisms, the compatible solute (A) can be continuously produced at a high level and can be supplied stably.

二段階の相同組換法による組換型ハロモナス菌株の作製方法を示す図である。（実施例１）It is a figure which shows the preparation methods of the recombinant halomonas strain by a two-step homologous recombination method. (Example 1) 野生型H. elongataのゲノム上に有するエクトイン生合成オペロン（ectABC）の上流配列（UectA）を示す図である。図２に示す配列部分は、配列番号１１の1096-1227部分に該当する。UectAには、適合溶質の産生に必要なプロモーター領域が含まれる。（実施例１）It shows the upstream sequence (U ECTA) of ectoine biosynthetic operon having on the genome of wild-type H. elongata (ectABC). The sequence portion shown in FIG. 2 corresponds to the 1096-1227 portion of SEQ ID NO: 11. U ectA contains the promoter region necessary for the production of compatible solutes. (Example 1) 各種ハロモナス菌株におけるエクトイン生合成オペロン領域のゲノム構造を示す図である。（実施例１）It is a figure which shows the genome structure of the ectoine biosynthesis operon area | region in various Halomonas strains. (Example 1) グリシンベタインの２つの異なる生合成経路を示す概念図である。Ａ．コリン酸化経路; コリンを基質とし、コリンデヒドロゲナーゼ（BetA）及びベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（BetB）の２種類の酵素による酸化反応により、グリシンベタインが生合成される。Ｂ．グリシンメチル化経路； ２種類のメチル基転移酵素により触媒される、グリシンを基質とした三段階のメチル化反応によりグリシンベタインが生合成される。FIG. 2 is a conceptual diagram showing two different biosynthetic pathways for glycine betaine. A. Choline oxidation pathway; Glycine betaine is biosynthesized by an oxidation reaction by two kinds of enzymes, choline dehydrogenase (BetA) and betaine aldehyde dehydrogenase (BetB), using choline as a substrate. B. Glycine methylation pathway: Glycine betaine is biosynthesized by a three-stage methylation reaction using glycine as a substrate, catalyzed by two types of methyltransferases. グリシンベタインのグリシンメチル化による生合成経路を示す図である。It is a figure which shows the biosynthetic pathway by glycine methylation of glycine betaine. GMST関連遺伝子の塩基配列を示す図である。（配列番号１，７）It is a figure which shows the base sequence of a GMST related gene. (SEQ ID NO: 1, 7) DMT関連遺伝子の塩基配列を示す図である。（配列番号２，８）It is a figure which shows the base sequence of a DMT related gene. (SEQ ID NO: 2, 8) SAMS関連遺伝子の塩基配列を示す図である。（配列番号３，９）It is a figure which shows the base sequence of a SAMS related gene. (SEQ ID NO: 3, 9) mCerry関連遺伝子の塩基配列を示す図である。（配列番号４，１０）It is a figure which shows the base sequence of a mCerry related gene. (SEQ ID NO: 4, 10) UectA領域の塩基配列を示す図である。（配列番号５，１１）It is a figure which shows the base sequence of UectA area | region. (SEQ ID NO: 5, 11) DectC領域の塩基配列を示す図である。（配列番号６，１２）It is a figure which shows the base sequence of a DectC area | region. (SEQ ID NO: 6, 12) 各種ハロモナス菌株におけるグリシンベタイン生合成オペロンの発現解析結果を示す写真図である。（実験例１−１）It is a photograph figure which shows the expression analysis result of the glycine betaine biosynthesis operon in various Halomonas strains. (Experimental Example 1-1) 各種ハロモナス株の細胞抽出液中の各種適合溶質成分のHPLC分析による、ジメチルグリシン、グリシンベタイン及びエクトインの検出結果を示す図である。（実験例１−２）It is a figure which shows the detection result of a dimethylglycine, a glycine betaine, and ectoine by HPLC analysis of various compatible solute components in the cell extract of various halomonas strains. (Experimental example 1-2) エクトイン非生産性のハロモナス株において、エクトインの代わりに生産されたグリシンベタインが適合溶質として機能することにより、エクトイン非生産性のハロモナス株の塩ストレス耐性が向上することを示す図である。（実験例１−２）FIG. 3 is a diagram showing that salt stress tolerance of a non-ectoin-producing halomonas strain is improved by the function of glycine betaine produced in place of ectoine as a compatible solute in a non-ectoin-producing halomonas strain. (Experimental example 1-2) 高浸透圧条件下でのグリシンベタイン生産結果を示す図である。Ａ．細胞抽出液中のベタイン濃度及び培養液中から回収された細胞量（n=3）。Ｂ．培養液当たり又は細胞当たりのグリシンベタイン生産量（Aの値から算出）を示す図である。（実施例２）It is a figure which shows the glycine betaine production result under high osmotic pressure conditions. A. Betaine concentration in the cell extract and the amount of cells recovered from the culture (n = 3). B. It is a figure which shows the production amount (calculated from the value of A) of glycine betaine per culture solution or per cell. (Example 2) 高浸透圧条件での二段階培養プロセスによるグリシンベタイン生産結果を示す図である。（実施例３）It is a figure which shows the glycine betaine production result by the two-stage culture process on high osmotic pressure conditions. (Example 3) 炭素源としてグルコースを添加した条件での、各種ハロモナス菌株における人工海水培地におけるジメチルグリシン、グリシンベタイン及びエクトインの生合成結果を示す図である。（実施例４）It is a figure which shows the biosynthesis result of dimethylglycine, glycine betaine, and ectoine in the artificial seawater culture medium in various Halomonas strains on the conditions which added glucose as a carbon source. (Example 4) 炭素源としてグリセロールを添加した条件での、各種ハロモナス菌株における人工海水培地におけるジメチルグリシン、グリシンベタイン及びエクトインの生合成結果を示す図である。（実施例４）It is a figure which shows the biosynthesis result of the dimethylglycine, glycine betaine, and ectoine in the artificial seawater culture medium in various Halomonas strains on the conditions which added glycerol as a carbon source. (Example 4) 炭素源としてキシロースを添加した条件での、各種ハロモナス菌株における人工海水培地におけるジメチルグリシン、グリシンベタイン及びエクトインの生合成結果を示す図である。（実施例４）It is a figure which shows the biosynthesis result of dimethylglycine, glycine betaine, and ectoine in the artificial seawater culture medium in various Halomonas strains on the conditions which added xylose as a carbon source. (Example 4)

本発明は、微生物を利用することを特徴とする適合溶質の製造方法に関する。本発明は、高浸透圧条件下で適合溶質を生合成・蓄積しうる微生物を宿主として用いて、所望の適合溶質を製造する方法に関する。   The present invention relates to a method for producing a compatible solute characterized by utilizing microorganisms. The present invention relates to a method for producing a desired compatible solute using, as a host, a microorganism that can biosynthesize and accumulate a compatible solute under high osmotic pressure conditions.

本明細書において「所望の適合溶質」は、「微生物が本来産生しうる主要な適合溶質」とは異なる別の物質の意味で用いられる。以下、本明細書において、所望の適合溶質を「適合溶質（Ａ）」といい、当該微生物が本来産生しうる主要な適合溶質を「適合溶質（Ｂ）」として区別して述べる。また、本明細書において適合溶質全般を意味し、両者を区別しない場合は、（Ａ）や（Ｂ）などの識別する用語を用いないものとする。   In the present specification, “desired compatible solute” is used in the meaning of another substance different from “a main compatible solute that can be produced by a microorganism”. Hereinafter, in this specification, a desired compatible solute is referred to as “compatible solute (A)”, and the main compatible solute that can be originally produced by the microorganism is referred to as “compatible solute (B)”. Further, in this specification, it means an entire compatible solute, and when the two are not distinguished from each other, a term such as (A) or (B) is not used.

本明細書において、適合溶質（Ａ）の製造方法は以下の工程を含む。
１）微生物が本来有する適合溶質（Ｂ）の生合成能を低下又は欠失させ、且つ適合溶質（Ａ）生合成に関連する外来遺伝子を導入した微生物を高浸透圧条件下で培養し、微生物中で適合溶質（Ａ）を生合成させる工程；
２）前記微生物中で生合成した適合溶質（Ａ）を、低浸透圧条件下で微生物から排出させ、回収する工程。
本発明の製造方法において、高浸透圧条件及び低浸透圧条件は、上記の工程１）の浸透圧条件（高浸透圧条件）に比べて、工程２）の浸透圧条件が相対的に低い浸透圧条件（低浸透圧条件）であればよい。微生物を、工程１）の浸透圧条件に比べて、工程２）で相対的に低い浸透圧条件で処理することにより、適合溶質（Ａ）を微生物から排出させることができる。 In this specification, the manufacturing method of a compatible solute (A) includes the following processes.
1) A microorganism in which the biosynthetic ability of the compatible solute (B) originally possessed by the microorganism is reduced or deleted and a foreign gene related to the compatible solute (A) biosynthesis is introduced is cultured under high osmotic pressure conditions. Biosynthesizes a compatible solute (A) in it;
2) A step of discharging and recovering the compatible solute (A) biosynthesized in the microorganism under low osmotic pressure conditions.
In the production method of the present invention, the high osmotic pressure condition and the low osmotic pressure condition are such that the osmotic pressure condition in the step 2) is relatively low compared to the osmotic pressure condition (high osmotic pressure condition) in the above step 1). Any pressure condition (low osmotic pressure condition) may be used. The compatible solute (A) can be discharged from the microorganism by treating the microorganism under the osmotic pressure condition relatively low in the step 2) compared to the osmotic pressure condition in the step 1).

本明細書において、「高浸透圧条件」とは、塩化ナトリウム(NaCl)濃度で換算した場合に、0.5〜4 M程度の条件とすることができ、例えば0.51〜3.6 Mであり、好ましくは0.75〜3.6 Mであり、より好ましくは1.0〜3.2 Mであり、さらに好ましくは約2.0〜2.6 Mである。また、本発明における「低浸透圧条件」とは、同様に塩化ナトリウム濃度で換算した場合に0〜0.5 M程度の条件とすることができ、好ましくは、0〜0.34 Mとすることができ、例えば水の条件であってもよい。ただし、本発明の製造方法に使用する微生物を製造において複数回使用することを考慮すると、微生物が破裂しない程度の低浸透圧条件であることが好適である。そのような条件としては、0.02〜0.06 Mである。上記の範囲から、工程１）で選択した高浸透圧条件に比べ、工程２）では工程１）で選択した条件より相対的に低い浸透圧条件を適宜選択することができる。   In the present specification, the “high osmotic pressure condition” can be a condition of about 0.5 to 4 M when converted in terms of sodium chloride (NaCl) concentration, for example, 0.51 to 3.6 M, preferably 0.75. It is -3.6M, More preferably, it is 1.0-3.2M, More preferably, it is about 2.0-2.6M. In addition, the “low osmotic pressure condition” in the present invention can be a condition of about 0 to 0.5 M, preferably 0 to 0.34 M when converted in terms of sodium chloride concentration. For example, the condition may be water. However, considering that the microorganism used in the production method of the present invention is used a plurality of times in the production, it is preferable that the osmotic pressure condition is such that the microorganism does not rupture. Such conditions are 0.02 to 0.06 M. From the above range, the osmotic pressure condition relatively lower than the condition selected in step 1) can be appropriately selected in step 2) as compared with the high osmotic pressure condition selected in step 1).

本明細書において、「微生物」とは、高浸透圧条件下で適合溶質を生合成・蓄積しうる微生物であり、例えば好塩性菌が挙げられる。好塩性菌の種類としては、至適塩濃度により、低度好塩性菌、中度好塩性菌、高度好塩性菌等が挙げられる。本発明に使用可能な微生物としては、好ましくは中度好塩性菌であり、具体的にはハロモナス属(Halomonas)、クロモハロバクター属(Chromohalobacter)、アクロモバクター属（Achromobacter）、アシディフィラム属（Acidiphilium）、アルカニボラクス属（Alcanivorax）、アミコラトプシス属（Amycolatopsis）、バチルス属（Bacillus）、ヘルミニイモナス属（Herminiimonas）、ハイフォモナス属（Hyphomonas）、キトコッカス属（Kytococcus）、マリノバクター属（Marinobacter）、マリノモナス属（Marinomonas）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ニトロソプミルス属（Nitrosopumilus）、ノカルジア属（Nocardia）、オクロバクテリウム属（Ochrobactrum）、パエニバチルス属（Paenibacillus）、リゾビウム属（Rhizobium）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、サッカロモノスポラ属（Saccharopolyspora）、サッカロポリスポラ属（Saccharopolyspora）、スフィンゴピキシス属（Sphingopyxis）、 スチグマテラ属（Stigmatella）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）などに属する微生物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記のうち、ハロモナス属に属する微生物としては、H. elongata、H. boliviensis、H. campisalis、H. halmophila、H. halophila、H. halodenitrificans、H. variabilis が挙げられ、入手可能な菌株としては、H. boliviensis DSM 15516T、H. campisalis ATCC 700597、H. elongata ATTC 33173T、H. elongata DSM 142、H. elongata DSM 2581T、H. elongata OUT30018、H. halmophila CCM 2833T、H. halophila CCM 3662T、H. halodenitrificans DSM 735T、H. variabilis DSM 3051Tが挙げられる。また、クロモハロバクター属に属する微生物としては、C. marismortui及びC. salexigensが挙げられ、入手可能な菌株としては、C. marismortui ATCC 17056及びC. salexigens DSM 3043Tが挙げられる。上記のうち、エクトイン生合成遺伝子を有する全ゲノム解読済みの菌株としてはH. elongata DSM 2581T及びC. salexigens DSM 3043が挙げられる。その他、エクトイン生合成遺伝子を有する全ゲノム解読済みの菌株としては、例えばAchromobacter xylosoxidans A8、Acidiphilium cryptum JF-5、Acidiphilium multivorum AIU301、Alcanivorax borkumensis SK2、Amycolatopsis mediterranei U32、Bacillus clausii KSM-K16、Bacillus pseudofirmus OF4、Bordetella avium 197N、Brachybacterium faecium DSM 4810、Herminiimonas arsenicoxydans、Hyphomonas neptunium ATCC 15444、Kytococcus sedentarius DSM 20547、Marinobacter aquaeolei VT8、Marinomonas sp. MWYL1、Mycobacterium gilvum PYR-GCK、Mycobacterium smegmatis str. MC2 155、Mycobacterium sp. JLS、Mycobacterium sp. KMS、Mycobacterium sp. MCS、Mycobacterium vanbaalenii PYR-1、Nitrosopumilus maritimus SCM1、Nocardia farcinica IFM 10152、Ochrobactrum anthropi ATCC 49188、Paenibacillus sp. Y412MC10、Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841、Rhodococcus equi 103S、Rhodococcus opacus B4、Saccharomonospora viridis DSM 43017、Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338、Sphingopyxis alaskensis RB2256、Stigmatella aurantiaca DW4/3-1、Streptomyces avermitilis MA-4680、Streptomyces griseus subsp. griseus NBRC 13350、Streptomyces scabiei 87.22等が挙げられる。その他、エクトインを産生しうる微生物として、Brevibacterium epidermis DSM 20659 、Brevibacterium linens、Brevibacterium sp. strain JCM 6894、Kocuria varians CCM3316、Nesterenkonia halobia DSM 20541T、Nocardiopsis sp. A5-1、Streptomyces coelicolor A3、Streptomyces griseolus DSM 40067T、Bacillus alcalophilus DSM 485T、Bacillus agaradhaerens DSM 8721T、Bacillus clarkii DSM 8720T 、Bacillus halodurans DSM 497T、Bacillus mojavensis DSM 9205T、Bacillus pseudalcaliphilus DSM 8725T、Bacillus pseudofirmus DSM 8715T、Gracilibacillus halotolerans DSM 11805T、Halobacillus halophilus DSMZ 2266T
Halobacillus trueperi DSM 10404T、Marinococcus halophilus DSM 20408T、Marinococcus sp. M52、Salimicrobium albus DSM 20748T、Sporosarcina pasteurii DSM 33T、Sporosarcina psycrophila DSM 3T、Virgibacillus marismortui DSM 12325T、Virgibacillus pantothenticus DSM 26、Virgibacillus salexigens DSM 11438、Rhodovibrio salinarum BN 40、Rhodovulum sulfidophilum DSM 1374T、Halorhodospira abdelmalekii DSM 2110T、Halorhodospira halochloris DSM 1059T、Halorhodospira halophila DSM 244T、Pantoea agglomerans strain CPA-2、Pseudomonas halophila DSM 3050T、Pseudomonas halosaccharolytica CCM 2851、Thioalkalibacter halophilus DSMZ 19224、Vibrio alginolyticus DSM 2171T、Vibrio cholerae O139 strain MO10、Vibrio costicola CCM 2811、Vibrio fischeri DSM 507、Vibrio fischeri DSM 7151、Vibrio harveyi DSM 2165、Vibrio harveyi DSM 6904、Vibrio parahaemolyticus RIMD2210633等が挙げられる。 In the present specification, “microorganism” is a microorganism capable of biosynthesizing and accumulating compatible solutes under high osmotic pressure conditions, and examples thereof include halophilic bacteria. Examples of the types of halophilic bacteria include low halophilic bacteria, moderately halophilic bacteria, and highly halophilic bacteria depending on the optimum salt concentration. The microorganism that can be used in the present invention is preferably a moderately halophilic bacterium, and specifically, genus Halomonas , Chromohalobacter , Achromobacter , and acidiphyllum. genus (Acidiphilium), Arukaniborakusu genus (Alcanivorax), genus Amycolatopsis (Amycolatopsis), Bacillus (Bacillus), Heruminiimonasu genus (Herminiimonas), Haifomonasu genus (Hyphomonas), Kitokokkasu genus (Kytococcus), Marino genus (Marinobacter), Marinomonasu genus (Marinomonas), Mycobacterium (Mycobacterium), nitroso-flops Mills belonging to the genus (Nitrosopumilus), Nocardia (Nocardia), o black genus (Ochrobactrum), Paenibacillus genus (Paenibacillus), Rhizobium (Rhizobium), Rhodococcus sp. (Rhodococcus), Saccharomyces Nosupora genus (Saccharopolyspora), Saccharopolyspora sp (Saccharopolyspora), Sphingomonas Pichia cis genus (Sphingopyxis), Suchigumatera genus (Stigmatella), although Streptomyces (Streptomyces) microorganisms belonging to the and the like, it is not limited to It is not something. Among the above, microorganisms belonging to the genus Halomonas include H. elongata , H. boliviensis , H. campisalis , H. halmophila , H. halophila , H. halodenitrificans , H. variabilis , and available strains include H. boliviensis DSM 15516 T , H. campisalis ATCC 700597, H. elongata ATTC 33173 T , H. elongata DSM 142, H. elongata DSM 2581 T , H. elongata OUT30018, H. halmophila CCM 2833 T , H. halophila CCM 3662 T , H. halodenitrificans DSM 735 T , H. variabilis DSM 3051 T. As the microorganisms belonging to Chromobacterium halo genus, C. marismortui and C. Salexigens. Examples of the available strains include C. marismortui ATCC 17056 and C. salexigens DSM 3043 T. Among the above, H. elongata DSM 2581 T and C. salexigens DSM 3043 are mentioned as the genome-completed strain having the ectoine biosynthesis gene. In addition, examples of the genome-completed strain having ectoine biosynthesis gene include Achromobacter xylosoxidans A8, Acidiphilium cryptum JF-5, Acidiphilium multivorum AIU301, Alcanivorax borkumensis SK2, Amycolatopsis mediterranei U32, Bacillus clausii KSM-K16, OF4 pseudo Bordetella avium 197N, Brachybacterium faecium DSM 4810 , Herminiimonas arsenicoxydans, Hyphomonas neptunium ATCC 15444, Kytococcus sedentarius DSM 20547, Marinobacter aquaeolei VT8, Marinomonas sp. MWYL1, Mycobacterium gilvum PYR-GCK, Mycobacterium smegmatis str. MC2 155, Mycobacterium sp. JLS, Mycobacterium sp. KMS, Mycobacterium sp. MCS , Mycobacterium vanbaalenii PYR-1, Nitrosopumilus maritimus SCM1, Nocardia farcinica IFM 10152, Ochrobactrum anthropi ATCC 49188, Paenibacillus sp. Y412MC10, Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841, Rhodococcus equi 103S, Rhodococcus opacus B4, Saccharomonospora viridis DSM 43017, Sac charopolyspora erythraea NRRL 2338, Sphingopyxis alaskensis RB2256, Stigmatella aurantiaca DW4 / 3-1, Streptomyces avermitilis MA-4680, Streptomyces griseus subsp. griseus NBRC 13350, Streptomyces scabiei 87.22 Other microorganisms that can produce ectoine include Brevibacterium epidermis DSM 20659, Brevibacterium linens, Brevibacterium sp. Strain JCM 6894, Kocuria varians CCM3316, Nesterenkonia halobia DSM 20541 T, Nocardiopsis sp. A5-1, Streptomyces coelicolor A3, Streptomyces griseolus DSM 40067 T, Bacillus alcalophilus DSM 485 T, Bacillus agaradhaerens DSM 8721 T , Bacillus clarkii DSM 8720 T , Bacillus halodurans DSM 497 T , Bacillus mojavensis DSM 9205 T , Bacillus pseudalcaliphilus DSM 8725 T , Bacillus pseudofirmus DSM 8715 T , Gracilibacillus halotolerans DSM 11805 T , Halobacillus halophilus DSMZ 2266 T
Halobacillus trueperi DSM 10404 T, Marinococcus halophilus DSM 20408 T, Marinococcus sp. M52, Salimicrobium albus DSM 20748 T, Sporosarcina pasteurii DSM 33 T, Sporosarcina psycrophila DSM 3 T, Virgibacillus marismortui DSM 12325 T, Virgibacillus pantothenticus DSM 26, Virgibacillus salexigens DSM 11438 , Rhodovibrio salinarum BN 40, Rhodovulum sulfidophilum DSM 1374 T, Halorhodospira abdelmalekii DSM 2110 T, Halorhodospira halochloris DSM 1059 T, Halorhodospira halophila DSM 244 T, Pantoea agglomerans strain CPA-2, Pseudomonas halophila DSM 3050 T, Pseudomonas halosaccharolytica CCM 2851, Thioalkalibacter halophilus DSMZ 19224, Vibrio alginolyticus DSM 2171 T , Vibrio cholerae O139 strain MO10, Vibrio costicola CCM 2811, Vibrio fischeri DSM 507, Vibrio fischeri DSM 7151, Vibrio harveyi DSM 2165, Vibrio harveyi DSM 6904, Vibrio parahaemous

本明細書において、「適合溶質（Ｂ）」とは、高浸透圧条件下で適合溶質を生合成・蓄積しうる微生物が、本来産生しうる適合溶質であればよく、特に当該微生物内に高密度に蓄積される適合溶質が好ましい。例えばハロモナス属に属する微生物では、エクトイン、ヒドロキシエクトイン、N-γ-アセチルジアミノ酪酸などが挙げられ、特に好ましくはエクトインである。アクチノポリスポラ（Actinopolyspora）属に属する微生物では、グリシベタイン、トレハロースなどが挙げられ、バシラス（Bacillus）属に属する微生物では、プロリン、グルタミン酸、グルタミンなどが挙げられる。 In the present specification, the “compatible solute (B)” may be any microorganism that can biosynthesize and accumulate a compatible solute under high osmotic pressure conditions, as long as it is a compatible solute that can be originally produced. A compatible solute that accumulates in density is preferred. For example, microorganisms belonging to the genus Halomonas include ectoine, hydroxyectoine, N-γ-acetyldiaminobutyric acid, and the like, with ectoine being particularly preferred. Examples of microorganisms belonging to the genus Actinopolyspora include glycybetaine and trehalose. Examples of microorganisms belonging to the genus Bacillus include proline, glutamic acid, and glutamine.

本明細書において、「適合溶質（Ｂ）の生合成能を低下又は欠失」とは、適合溶質（Ｂ）の生合成能が通常の場合より低い量に抑制されていること、又は全く生合成されないことをいう。この場合において、適合溶質（Ｂ）の生合成能は低いほうが適合溶質（Ａ）を高密度に生合成することができる。従って、適合溶質（Ｂ）の生合成能は、野生型を100％とした場合に、60％以下、好ましくは、40％以下、より好ましくは20％以下に低下しているのか好ましく、生合成能が欠失しているのが最も好ましい。適合溶質（Ｂ）の生合成能を低下又は欠失させるための手段として、適合溶質（Ｂ）を生合成するのに必須の酵素をコードする遺伝子のコード領域内の変異導入による酵素活性の低下又は欠失させることができればよい。遺伝子のコード領域内の変異導入は、微生物のゲノム上に存在する適合溶質（Ｂ）生合成に特異的な遺伝子の一部又は全部を欠損させることが考えられる。「適合溶質（Ｂ）生合成に特異的な遺伝子」としては、例えば適合溶質（Ｂ）を生合成するのに必須の酵素関連遺伝子が挙げられる。適合溶質（Ｂ）の生合成において複数の酵素が必須の場合は、それらの酵素のうちいずれか１種以上又は全ての酵素関連遺伝子の一部又は全部を欠損させてもよい。生合成に特異的な遺伝子の一部又は全部を欠損させる方法は、遺伝子組み換えの手法等、自体公知の方法によることができる。例えば、目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、当該変異型遺伝子を含むDNA、或いは遺伝子の一部又は全部を欠損させたDNAで、微生物のゲノム上の遺伝子と相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子の一部又は全部を欠損させることが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.97, p.6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. Vol.184, p.5200-5203 (2002)）と組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等を参照することができる。さらに、ハロモナス属に属する菌株の遺伝子操作に参考となる公知文献としては、Journal of Bacteriology Vol.184, p.3078-3085 (2002)が挙げられる。   In the present specification, “reducing or deleting the biosynthetic ability of the compatible solute (B)” means that the biosynthetic capacity of the compatible solute (B) is suppressed to a lower level than usual or completely biosynthetic. It means not being synthesized. In this case, the compatible solute (A) can be biosynthesized at a higher density when the biosynthesis ability of the compatible solute (B) is lower. Therefore, the biosynthetic ability of the compatible solute (B) is preferably reduced to 60% or less, preferably 40% or less, more preferably 20% or less when the wild type is 100%. Most preferably, the ability is deleted. As a means for reducing or eliminating the biosynthetic ability of the compatible solute (B), a decrease in enzyme activity by introducing a mutation in the coding region of a gene encoding an enzyme essential for biosynthesis of the compatible solute (B) Or what is necessary is just to be able to delete. It is conceivable that the introduction of a mutation in the coding region of a gene results in deletion of a part or all of the gene specific for biosynthesis of compatible solute (B) existing on the genome of the microorganism. Examples of the “gene specific for the compatible solute (B) biosynthesis” include an enzyme-related gene essential for biosynthesis of the compatible solute (B). In the case where a plurality of enzymes are essential in the biosynthesis of the compatible solute (B), some or all of any one or more of these enzymes or all of the enzyme-related genes may be deleted. A method for deleting part or all of a gene specific for biosynthesis can be a method known per se such as a gene recombination technique. For example, a partial gene of a target gene is modified to produce a mutant gene that does not produce a normally functioning enzyme, and DNA containing the mutant gene or DNA partially or entirely deleted is used. By causing homologous recombination with a gene on the genome of a microorganism, part or all of the target gene on the genome can be deleted. The gene replacement using such homologous recombination is a method called “Red-driven integration” (Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 97, p.6640-6645 (2000)). Reference can be made to a method (see WO2005 / 010175) in combination with a Red driven integration method and a λ phage-derived excision system (J. Bacteriol. Vol.184, p.5200-5203 (2002)). Furthermore, Journal of Bacteriology Vol. 184, p. 3078-3085 (2002) can be cited as a known document that can be used as a reference for genetic manipulation of strains belonging to the genus Halomonas.

上記において、適合溶質（Ｂ）を本来産生する微生物のゲノム上に有する浸透圧応答性のプロモーターは、除去しないことが必要である。当該微生物が有する浸透圧応答性プロモーターの下流に、適合溶質（Ａ）の生合成に関連する外来遺伝子を導入することで、高浸透圧条件下で適合溶質（Ａ）を生合成することが可能となるからである。この場合において、「適合溶質（Ａ）」は、「適合溶質（Ｂ）」とは異なる適合溶質であればよく、特に限定されない。   In the above, it is necessary not to remove the osmotically responsive promoter on the genome of the microorganism that originally produces the compatible solute (B). It is possible to biosynthesize compatible solute (A) under high osmotic pressure conditions by introducing a foreign gene related to biosynthesis of compatible solute (A) downstream of the osmotic pressure responsive promoter of the microorganism. Because it becomes. In this case, the “compatible solute (A)” may be any compatible solute different from the “compatible solute (B)”, and is not particularly limited.

本発明における「浸透圧応答性プロモーター」とは、微生物の適合溶質（Ｂ）の産生系に必要な浸透圧応答性プロモーターが挙げられる。具体的には、例えばハロモナス属に属するH. elongataの適合溶質（Ｂ）であるエクトインの産生系に必要な浸透圧応答性プロモーターが挙げられる。H. elongataの場合は、浸透圧応答性プロモーターは、当該微生物のゲノム上に存在するエクトインの生合成オペロンの上流配列（UectA）中に含まれる（図１、２参照）。 Examples of the “osmotic pressure responsive promoter” in the present invention include an osmotic pressure responsive promoter necessary for a production system of a compatible solute (B) of a microorganism. Specifically, for example, an osmotic pressure responsive promoter necessary for a production system of ectoine which is a compatible solute (B) of H. elongata belonging to the genus Halomonas can be mentioned. In the case of H. elongata , the osmotic responsive promoter is contained in the upstream sequence (U ectA ) of the ectoine biosynthesis operon present on the genome of the microorganism (see FIGS. 1 and 2).

本明細書において、「適合溶質（Ａ）の生合成に関連する外来遺伝子」とは、本明細書の微生物がゲノム上に本来有する遺伝子とは異なる遺伝子であって、適合溶質（Ａ）の生合成に必須のタンパク質等に関連する遺伝子が挙げられる。生合成に必須のタンパク質として、例えば、微生物内で所望の適合溶質（Ａ）を生合成するために必要な酵素等が挙げられる。   In the present specification, the “foreign gene related to biosynthesis of the compatible solute (A)” is a gene different from the gene originally possessed by the microorganism of the present specification on the genome, and the live of the compatible solute (A). Examples include genes related to proteins essential for synthesis. Examples of proteins essential for biosynthesis include enzymes necessary for biosynthesis of a desired compatible solute (A) in a microorganism.

例えば、ハロモナス属に属する微生物では、適合溶質（Ｂ）としてのエクトインの生合成能を低下又は欠失させて、適合溶質（Ａ）の生合成に関連する外来遺伝子を導入することで、高浸透圧条件下で適合溶質（Ａ）を生合成することができる（図１参照）。エクトインの生合成能を低下又は欠失させるためには、ハロモナス属に属する微生物のゲノムにおいて、エクトインの生合成オペロンのうち上流配列（UectA）中に含まれる浸透圧応答性プロモーターを残しておけば、エクトイン生合成に特異的な遺伝子の一部又は全部を欠損させてもよい。エクトイン生合成に特異的な遺伝子として、L-アスパラギン酸-β-セミアルデヒドからエクトインへの代謝に必要な酵素関連遺伝子が挙げられる。当該必要な酵素として、L-ジアミノ酪酸アミノ基転移酵素及び／又はL-ジアミノ酪酸アセチル基転移酵素が挙げられる（非特許文献１参照）。これらの酵素は、EctA、EctB、EctCで表すことができ、これらに関連する遺伝子を各々ectA、ectB、ectCで表すことができる（図３(a)参照）。本明細書において、「エクトインの生合成能を低下又は欠失」は、エクトインの生合成オペロンのうち、ectA、ectB、ectCから選択される１種又は複数の遺伝子の、一部又は全部を欠損させることにより、達成することができる（図３(b)参照）。この場合において、エクトインの生合成能は低いほうが適合溶質（Ａ）を高密度に生合成することができる。従って、エクトインの生合成能は、野生型を100％とした場合に、60％以下、好ましくは40％以下、より好ましくは20％以下に低下しているのか好ましく、生合成能が欠失しているのが最も好ましい。 For example, in a microorganism belonging to the genus Halomonas, high penetration is achieved by reducing or eliminating the biosynthetic ability of ectoine as a compatible solute (B) and introducing a foreign gene related to biosynthesis of the compatible solute (A). The compatible solute (A) can be biosynthesized under pressure conditions (see FIG. 1). In order to reduce or eliminate ectoin biosynthesis, the osmo-responsive promoter contained in the upstream sequence (U ectA ) of the ectoin biosynthesis operon must remain in the genome of the microorganism belonging to the genus Halomonas. For example, part or all of a gene specific for ectoine biosynthesis may be deleted. Specific genes for ectoine biosynthesis include enzyme-related genes necessary for the metabolism of L-aspartate-β-semialdehyde to ectoine. Examples of the necessary enzyme include L-diaminobutyric acid aminotransferase and / or L-diaminobutyric acid acetyltransferase (see Non-Patent Document 1). These enzymes can be represented by EctA, EctB, and EctC, and genes related to these enzymes can be represented by ectA, ectB, and ectC, respectively (see FIG. 3 (a)). In the present specification, “decrease or deletion of ectoin biosynthesis ability” means that one or more genes selected from ectA, ectB, and ectC are deleted from the ectoin biosynthesis operon. This can be achieved (see FIG. 3B). In this case, the lower the biosynthetic ability of ectoine, the higher the density of the compatible solute (A) biosynthesized. Therefore, it is preferable that the biosynthetic ability of ectoine is reduced to 60% or less, preferably 40% or less, more preferably 20% or less when the wild type is 100%. Most preferably.

上記において、適合溶質（Ａ）の種類は、上記のハロモナス属に属する微生物がゲノム上に有する浸透圧応答性プロモーターの制御下、即ち、当該浸透圧応答性プロモーターの下流に、適合溶質（Ａ）の生合成に関連する外来遺伝子を導入することができるのであれば特に限定されない。   In the above, the compatible solute (A) is classified into the compatible solute (A) under the control of the osmo-responsive promoter that the microorganism belonging to the genus Halomonas has on the genome, that is, downstream of the osmo-responsive promoter. There is no particular limitation as long as a foreign gene related to the biosynthesis of can be introduced.

本発明の製造方法において、「適合溶質（Ａ）」として、具体的にはメチル化グリシンを製造することができる。本明細書の「メチル化グリシン」としては、例えばグリシンベタイン、ジメチルグリシンやサルコシンが挙げられ、最も好適にはグリシンベタインが挙げられる。   In the production method of the present invention, as the “compatible solute (A)”, specifically, methylated glycine can be produced. Examples of the “methylated glycine” in the present specification include glycine betaine, dimethylglycine and sarcosine, and most preferably glycine betaine.

グリシンベタインは、種々の生物が乾燥や塩ストレスなど外的浸透圧変化に応じて細胞内の浸透圧を維持するために蓄積する適合溶質の１種である。細菌、植物、動物は、乾燥又は塩ストレスの条件のもとでベタインを生合成し、蓄積するが、これらの多くの生物においては、コリンからベタインアルデヒド、さらにベタインアルデヒドからグリシンベタインへの二段階酸化反応によってグリシンベタインが生合成される（図４）。大腸菌を含む多くの細菌や植物の葉緑体などでは、コリンデヒドロゲナーゼ（BetA）及びベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（BetB）が各段階の反応を触媒することが知られている。   Glycine betaine is one type of compatible solute that various organisms accumulate to maintain intracellular osmotic pressure in response to changes in external osmotic pressure such as drought and salt stress. Bacteria, plants, and animals biosynthesize and accumulate betaine under conditions of drought or salt stress, but in many of these organisms, there are two steps: choline to betaine aldehyde, and betaine aldehyde to glycine betaine. Glycine betaine is biosynthesized by the oxidation reaction (FIG. 4). It is known that choline dehydrogenase (BetA) and betaine aldehyde dehydrogenase (BetB) catalyze each stage of reaction in many bacteria including Escherichia coli and plant chloroplasts.

古細菌のメタン細菌、好気性従属真正細菌、嫌気性光栄養細菌、シアノバクテリアの中には単純な炭素源からグリシンベタインを生合成する能力を有する生物種が発見されている。これまでに、好気性従属真正細菌であるActinopolyspora halophila、嫌気性光栄養細菌であるEctothiorhodopspira halochloris、シアノバクテリアであるAphanothece halophyticaにおいて、アミノ酸であるグリシンからサルコシン、サルコシンからジメチルグリシン、ジメチルグリシンからグリシンベタインの三段階のメチル化反応によってグリシンベタインが生合成されることが明らにされている（図４、５）。グリシンからサルコシンを合成する経路を介してメチル化グリシンを産生する場合には、グリシンからのメチル基転移反応にメチル基転移酵素を必要とする。グリシンからサルコシンへ、サルコシンからジメチルグリシンへのメチル化反応に必須のメチル基転移酵素は、グリシンサルコシンメチル基転移酵素（以下単に、「GSMT」ともいう。）である。また、ジメチルグリシンからグリシンベタインへのメチル化反応に必須の酵素は、ジメチルグリシンメチル基転移酵素（以下、単に「DMT」ともいう。）である（図４、５参照）。また、グリシンへのメチル基供与体として、S-アデノシルメチオニン（以下、単に「SAM」ともいう。）が挙げられる（図５参照）。メチオニンにアデノシン三リン酸（ATP）とSAM合成酵素(SAMS)が作用してSAMが生合成される。 Among archaeal methane bacteria, aerobic dependent eubacteria, anaerobic phototrophic bacteria, and cyanobacteria, species having the ability to biosynthesize glycine betaine from simple carbon sources have been discovered. So far, in the aerobic dependent eubacteria Actinopolyspora halophila , the anaerobic phototrophic bacterium Ectothiorhodopspira halochloris , and the cyanobacterium Aphanothece halophytica , the amino acids glycine to sarcosine, sarcosine to dimethylglycine, and dimethylglycine to glycine betaine It has been clarified that glycine betaine is biosynthesized by a three-step methylation reaction (FIGS. 4 and 5). When methylated glycine is produced via a route for synthesizing sarcosine from glycine, methyltransferase is required for the methyl group transfer reaction from glycine. The methyltransferase that is essential for the methylation reaction from glycine to sarcosine and from sarcosine to dimethylglycine is glycine sarcosine methyltransferase (hereinafter also simply referred to as “GSMT”). An enzyme essential for the methylation reaction from dimethylglycine to glycine betaine is dimethylglycine methyltransferase (hereinafter also simply referred to as “DMT”) (see FIGS. 4 and 5). An example of a methyl group donor to glycine is S-adenosylmethionine (hereinafter also simply referred to as “SAM”) (see FIG. 5). Adenosine triphosphate (ATP) and SAM synthase (SAMS) act on methionine to biosynthesize SAM.

「適合溶質（Ａ）」としてのメチル化グリシンは、微生物中にグリシンからサルコシンを生合成する経路が存在しない場合に、グリシンからサルコシンを生合成する経路に関連する外来遺伝子を導入することで、生合成することができる。より詳しくは、当該微生物の適合溶質（Ｂ）の生合成能を低下又は欠失させ、且つグリシンからサルコシンを合成するのに必要なメチル基転移酵素に関連する外来遺伝子を導入し、当該微生物を高浸透圧条件下で培養することで、微生物中でメチル化グリシンを生合成することができる。この場合に使用可能な微生物は、上述の本明細書における微生物であって、グリシンからサルコシンを生合成する経路が存在しない微生物であればよく、特に限定されない。前記微生物に、メチル基転移酵素に関連する遺伝子を導入することにより、グリシンからサルコシンを合成する経路を介してメチル化グリシンを生合成することができる（図４参照）。   Methylated glycine as “compatible solute (A)” is introduced by introducing a foreign gene related to the pathway for biosynthesis of sarcosine from glycine when there is no pathway for biosynthesis of sarcosine from glycine in the microorganism, It can be biosynthesized. In more detail, a foreign gene related to a methyltransferase required to synthesize sarcosine from glycine is introduced by reducing or deleting the biosynthetic ability of the compatible solute (B) of the microorganism, and By culturing under high osmotic pressure conditions, methylated glycine can be biosynthesized in microorganisms. The microorganism that can be used in this case is not particularly limited as long as it is the microorganism in the present specification described above and does not have a pathway for biosynthesize sarcosine from glycine. By introducing a gene related to methyltransferase into the microorganism, methylated glycine can be biosynthesized through a pathway for synthesizing sarcosine from glycine (see FIG. 4).

グリシンからサルコシンを生合成する経路に関連する外来遺伝子として、上述のごとく、グリシンからサルコシンへのメチル基転移反応に必要なメチル基転移酵素関連遺伝子が挙げられる。具体的には、上述のGSMT関連遺伝子が挙げられる。GSMT関連遺伝子を本発明の微生物に導入することで、グリシンからサルコシンを合成する経路を、微生物に導入することができる。さらに、GSMTは、サルコシンからジメチルグリシンの生合成にも作用する。従って、本発明の「適合溶質の製造方法」のうち、メチル化グリシンの製造方法においては、微生物に少なくともGSMT関連遺伝子を導入することが必要である。また、ジメチル化グリシンからグリシンベタインを生合成させるために、DMT関連遺伝子を導入することが必要である。また、GSMT及びDMTがつながった酵素(GSDMT)もクローニングされており（J Biological Chemistry, 278, pp.4932-4942 (2003)）、GSDMT関連遺伝子を本発明の微生物に導入してもよい。グリシンのメチル化を効率的に行うために、SAM合成酵素関連遺伝子を本発明の微生物にさらに導入してもよい。SAM合成酵素を発現させるために、本発明の微生物のゲノム上に存在するSAM合成酵素関連遺伝子を利用してもよい。   Examples of the foreign gene related to the pathway for biosynthesis of sarcosine from glycine include methyltransferase-related genes necessary for the methyl group transfer reaction from glycine to sarcosine as described above. Specifically, the above-mentioned GSMT-related genes can be mentioned. By introducing a GSMT-related gene into the microorganism of the present invention, a pathway for synthesizing sarcosine from glycine can be introduced into the microorganism. Furthermore, GSMT also acts on the biosynthesis of dimethylglycine from sarcosine. Therefore, in the “method for producing a compatible solute” of the present invention, in the method for producing methylated glycine, it is necessary to introduce at least a GSMT-related gene into a microorganism. In addition, in order to biosynthesize glycine betaine from dimethylated glycine, it is necessary to introduce a DMT-related gene. In addition, an enzyme in which GSMT and DMT are linked (GSDMT) has been cloned (J Biological Chemistry, 278, pp.4932-4942 (2003)), and a GSDMT-related gene may be introduced into the microorganism of the present invention. In order to efficiently perform glycine methylation, a SAM synthase-related gene may be further introduced into the microorganism of the present invention. In order to express the SAM synthase, a SAM synthase-related gene present on the genome of the microorganism of the present invention may be used.

本発明の微生物が、ハロモナス属に属する微生物、具体的にはH. elongataの場合は、メチル化グリシンのうち、特にサルコシン及び／又はジメチルグリシンを生合成させるために、エクトインの産生系に必要な浸透圧応答性プロモーターの下流領域に、少なくともGSMT関連遺伝子を導入することができる。さらに、グリシンベタインを生合成させるために、DMT関連遺伝子を導入することができる（図３(d)参照）。GSMT関連遺伝子及びDMT関連遺伝子を、エクトインの産生系に必要な浸透圧応答性プロモーターの下流領域に導入することにより、グリシンベタイン産生用のポリシストロン性オペロンを構築することができる。当該グリシンベタイン産生用のポリシストロン性オペロンには、SAM合成酵素関連遺伝子を含んでいてもよい（図３(e)参照）。 When the microorganism of the present invention is a microorganism belonging to the genus Halomonas, specifically H. elongata , it is necessary for the ectoine production system in order to biosynthesize sarcosine and / or dimethylglycine among methylated glycines. At least a GSMT-related gene can be introduced into the downstream region of the osmotic pressure responsive promoter. Furthermore, in order to biosynthesize glycine betaine, a DMT-related gene can be introduced (see FIG. 3 (d)). A polycistronic operon for producing glycine betaine can be constructed by introducing a GSMT-related gene and a DMT-related gene into a downstream region of an osmotic response promoter necessary for an ectoine production system. The polycistronic operon for producing glycine betaine may contain a SAM synthase-related gene (see FIG. 3 (e)).

本発明の微生物が、ハロモナス属に属する微生物、具体的にはH. elongataの場合では、野生型の場合に、グリシンベタインは脂質の代謝経路であるコリンからの二段階酸化反応によって生合成されるが（図４参照）、コリンから産生されるグリシンベタインの産生量は限られている。一方、本発明の製造方法によれば、植物バイオマス由来の主要な炭素源である、グルコース、グリセロール及び／又はキシロースなどの豊富で単純な炭素源を利用し、これより産生される必須アミノ酸のグリシンを介して、微生物内にメチル化グリシンを生合成し、高密度に蓄積することができる。 When the microorganism of the present invention is a microorganism belonging to the genus Halomonas, specifically in the case of H. elongata , glycine betaine is biosynthesized by a two-step oxidation reaction from choline, which is a metabolic pathway of lipids. However (see FIG. 4), the amount of glycine betaine produced from choline is limited. On the other hand, according to the production method of the present invention, glycine, an essential amino acid produced from abundant and simple carbon sources such as glucose, glycerol and / or xylose, which are main carbon sources derived from plant biomass. Thus, methylated glycine can be biosynthesized in microorganisms and accumulated at high density.

本発明において、GSMT関連遺伝子は、以下に示すいずれかの塩基配列からなる。
１）配列表の配列番号１に示す塩基配列；
２）前記１）に記載の塩基配列のうち、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加といった変異された配列からなる塩基配列；
３）前記１）又は２）に記載の塩基配列に対して縮重し、GSMTが有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；
４）前記１）〜３）のいずれかに記載の配列と、80％以上の相同性を有する塩基配列。 In the present invention, the GSMT-related gene consists of any of the following base sequences.
1) the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
2) A base sequence consisting of a mutated sequence wherein one or several bases are substituted, deleted, inserted or added among the base sequences described in 1) above;
3) a base sequence that is degenerate with respect to the base sequence described in 1) or 2) and encodes an amino acid sequence of GSMT;
4) A base sequence having 80% or more homology with the sequence described in any one of 1) to 3) above.

本発明において、DMT関連遺伝子は、以下に示すいずれかの塩基配列からなる。
１）配列表の配列番号２に示す塩基配列；
２）前記１）に記載の塩基配列のうち、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加といった変異された塩基配列；
３）前記１）又は２）に記載の塩基配列に対して縮重し、DMTが有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；
４）前記１）〜３）のいずれかに記載の塩基配列と、80％以上の相同性を有する塩基配列。 In the present invention, the DMT-related gene consists of any of the following base sequences.
1) the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
2) A base sequence in which one or several bases in the base sequence described in 1) are mutated such as substitution, deletion, insertion or addition;
3) A base sequence that is degenerate with respect to the base sequence described in 1) or 2) and encodes an amino acid sequence of DMT;
4) A base sequence having 80% or more homology with the base sequence described in any one of 1) to 3) above.

本発明において、SAMS関連遺伝子は、以下に示すいずれかの塩基配列からなる。
１）配列表の配列番号３に示す塩基配列；
２）前記１）に記載の塩基配列のうち、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加といった変異された塩基配列；
３）前記１）又は２）に記載の塩基配列に対して縮重し、SAM合成酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；
４）前記１）〜３）のいずれかに記載の塩基配列と、80％以上の相同性を有する塩基配列。 In the present invention, the SAMS-related gene consists of any of the following base sequences.
1) the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing;
2) A base sequence in which one or several bases in the base sequence described in 1) are mutated such as substitution, deletion, insertion or addition;
3) A base sequence that is degenerate with respect to the base sequence described in 1) or 2) above and encodes an amino acid sequence possessed by a SAM synthase;
4) A base sequence having 80% or more homology with the base sequence described in any one of 1) to 3) above.

各酵素遺伝子の塩基配列のうち、「１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加」の変異を生じさせる方法としては、PCR法、エラープローンPCR法、DNAシャッフリング法やキメラ酵素を作製する手法等の公知の方法を利用することができる。これらの手法を用いて得られた各酵素遺伝子の塩基配列によりコードされる各アミノ酸配列を有する酵素の比活性や安定性の評価を行うことで、本願に適した高活性酵素又は高安定性酵素を選抜することができる。この場合において、「１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加」とは、1〜15個程度の塩基が置換、欠失、挿入又は付加していてもよいことを意味する。   Among the nucleotide sequences of each enzyme gene, methods for causing mutations of “one or several bases are substituted, deleted, inserted or added” include PCR, error-prone PCR, DNA shuffling, and chimeric enzymes. A known method such as a manufacturing method can be used. By evaluating the specific activity and stability of the enzyme having each amino acid sequence encoded by the base sequence of each enzyme gene obtained using these methods, a highly active enzyme or a highly stable enzyme suitable for the present application Can be selected. In this case, “one or several bases are substituted, deleted, inserted or added” means that about 1 to 15 bases may be substituted, deleted, inserted or added.

本発明は、ハロモナス属に属する微生物のゲノムにおいて、エクトインの生合成オペロンのうち、浸透圧応答性のプロモーターを含み、エクトインの生合成に特異的な遺伝子領域の一部又は全部を欠損あるいは置換していることを特徴とする微生物にも及ぶ。「エクトインの生合成に特異的な領域」とは、エクトインの生合成オペロンのうち、エクトインの生合成に特異的な酵素をコードする遺伝子領域が挙げられる。「エクトインの生合成に特異的な酵素」とは、L-アスパラギン酸-β-セミアルデヒドからエクトインへの代謝において、L-ジアミノ酪酸アミノ基転移酵素及び／又はL-ジアミノ酪酸アセチル基転移酵素が挙げられる（非特許文献１：Biotechnology Advances 28 (2010) 782-801参照）。これらの酵素は、EctA、EctB、EctCで表すことができ、これらに関連する遺伝子を各々ectA、ectB、ectCで表すことができる（図３(a)参照）。「エクトインの生合成に特異的な遺伝子領域の一部又は全部を欠損あるいは置換している」とは、具体的にはectA、ectB及びectCから選択される１種又は複数の遺伝子の一部又は全部を欠損し（図３(b)参照）、あるいは他の遺伝子に置換されている（例えば図３(c)〜(e)参照）ことをいう。具体的には、H. elongataのエクトインの生合成オペロン（ectABC）領域を欠失している株（Halomonas elongata KA1）が挙げられ、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1つくばセンター中央第6）に寄託申請され、平成23年3月31日に受領され、受託番号FERM P-22094として受託されている。 In the genome of a microorganism belonging to the genus Halomonas, the present invention includes an osmotic responsive promoter among ectoine biosynthetic operons, wherein a part or all of a gene region specific to ectoin biosynthesis is deleted or replaced. It also extends to microorganisms characterized by The “region specific for ectoin biosynthesis” includes a gene region encoding an enzyme specific for ectoine biosynthesis in the ectoine biosynthesis operon. “Enzyme specific for ectoin biosynthesis” refers to L-diaminobutyrate aminotransferase and / or L-diaminobutyrate acetyltransferase in the metabolism of L-aspartate-β-semialdehyde to ectoine. (Nonpatent literature 1: Biotechnology Advances 28 (2010) 782-801 reference). These enzymes can be represented by EctA, EctB, and EctC, and genes related to these enzymes can be represented by ectA, ectB, and ectC, respectively (see FIG. 3 (a)). “Deletion or replacement of part or all of a gene region specific for ectoin biosynthesis” specifically means a part of one or more genes selected from ectA, ectB and ectC or It means that all of them are deleted (see FIG. 3 (b)) or replaced with another gene (for example, see FIGS. 3 (c) to (e)). Specifically, there is a strain ( Halomonas elongata KA1) that lacks the ectoin biosynthetic operon (ectABC) region of H. elongata. 8566 Ibaraki Prefecture Tsukuba City Higashi 1-1-1 Tsukuba Center Chuo No. 6) was applied for deposit , received on March 31, 2011 , and deposited under the deposit number FERM P-22094.

本発明において、適合溶質（Ｂ）の生合成能を低下又は欠失させ、且つ適合溶質（Ａ）生合成に関連する外来遺伝子を導入した微生物を高浸透圧条件下で培養して生合成された適合溶質（Ａ）は、微生物中に生合成され、高密度に蓄積されており、係る微生物を低浸透圧条件で処理することで微生物を破砕することなく、適合溶質（Ａ）を容易に微生物該へ排出させ、回収することができる。具体的には、ハロモナス属に属する微生物（例えば、H. elongata）が本来産生しうるエクトインの生合成能を低下又は欠失させ、且つメチル化グリシン生合成に関連する外来遺伝子を導入した微生物を高浸透圧条件下で培養して生合成されたメチル化グリシン（例えば、グリシンベタイン、ジメチルグリシン）は、微生物中に高密度で蓄積されており、係る微生物を低浸透圧条件で処理することで微生物を破砕することなく、メチル化グリシンを容易に微生物外へ排出させ、回収することができる。例えば当該低浸透圧溶液に微生物を懸濁することで、微生物を破砕することなく、メチル化グリシンを容易に微生物外へ排出させ、回収することができる。 In the present invention, a microorganism in which the biosynthetic ability of the compatible solute (B) is reduced or deleted and a foreign gene related to the compatible solute (A) biosynthesis is introduced is cultured under high osmotic pressure conditions and biosynthesized. The compatible solute (A) is biosynthesized and accumulated at a high density in the microorganism, and the compatible solute (A) can be easily obtained without crushing the microorganism by treating the microorganism under low osmotic pressure conditions. Microorganisms can be discharged and recovered. Specifically, a microorganism in which a microorganism belonging to the genus Halomonas (for example, H. elongata ) has reduced or eliminated the ability to biosynthesize ectoine and introduced a foreign gene related to methylated glycine biosynthesis. Methylated glycine (for example, glycine betaine, dimethylglycine) biosynthesized by culturing under high osmotic pressure conditions is accumulated at high density in microorganisms. By treating such microorganisms under low osmotic pressure conditions, Methylated glycine can be easily discharged out of the microorganism and collected without disrupting the microorganism. For example, by suspending a microorganism in the low osmotic pressure solution, methylated glycine can be easily discharged out of the microorganism and recovered without disrupting the microorganism.

本発明の理解を深めるために、以下に実施例及び実験例を示して具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは明らかである。   In order to deepen the understanding of the present invention, examples and experimental examples will be specifically described below, but it is clear that the present invention is not limited to these examples.

（実施例１）グリシンベタイン生合成のための組換型ハロモナス菌株の作製
本実施例では、中度好塩性細菌が高浸透圧条件下で適合溶質のエクトインを高密度に生合成する機構を活用し、エクトインに替わりグリシンベタインを高密度に生合成する組換型ハロモナス菌株を作製した。 Example 1 Production of Recombinant Halomonas Strain for Biosynthesis of Glycine Betaine In this example, the mechanism by which moderately halophilic bacteria biosynthesize ectoine, a compatible solute, under high osmotic pressure conditions. Utilized, a recombinant halomonas strain that biosynthesizes glycine betaine at high density instead of ectoin was prepared.

１）使用菌株（以下の実施例、実験例でも同様）
エクトイン生合成オペロンを欠損したH. elongata KA1株（以下、「ハロモナス菌（KA1株）」）を使用した。即ち、ハロモナス菌（KA1株）は、エクトイン非産生株である。ハロモナス菌の培養は37℃で行い、LB(Luria-Bertani)培地、M63最小培地（炭素源として、0.2％グリセロール又はグルコースを添加）、又は人工海水培地（炭素源として0.2％グルコース、グリセロール、又はキシロースを添加）を基本として使用し、必要に応じて2×又は4×ダイゴIMK培地及びNaClを適当量添加した培地を使用した。 1) Strain used (same in the following examples and experimental examples)
H. elongata KA1 strain (hereinafter referred to as “Halomonas bacterium (KA1 strain)”) lacking the ectoine biosynthesis operon was used. That is, Halomonas bacteria (KA1 strain) is an ectoin non-producing strain. Halomonas bacteria are cultured at 37 ° C., LB (Luria-Bertani) medium, M63 minimal medium (with 0.2% glycerol or glucose added as a carbon source), or artificial seawater medium (0.2% glucose, glycerol, or as a carbon source) Xylose added) was used as a basis, and 2 × or 4 × Daigo IMK medium and a medium supplemented with an appropriate amount of NaCl as required were used.

２）グリシンベタイン生合成のための遺伝子の設計
ハロモナス菌（KA1株）に、グリシンを出発物質としたグリシンベタイン生合成能力を付与するのに必要な２種類の酵素、GMST及びDMTに関連する各遺伝子は、耐塩性シアノバクテリアAphanothece halophyticaにおいて同定された酵素のアミノ酸配列をもとに設計した。GSMT関連遺伝子及びDMT関連遺伝子については、それらのコドン使用頻度をハロモナス菌（KA1株）での発現用に最適化した人工遺伝子HeGSMT（配列番号１）及びHeDMT（配列番号２）を設計して使用した。さらに、SAMの供給に機能するSAM合成酵素(SAMS)については、ハロモナス菌ゲノム上にコードされたSAMS関連遺伝子（配列番号３）をサブクローニングして使用した。また、遺伝子発現量を解析するためのレポーターとして赤色蛍光タンパク質をコードしたmCherry遺伝子（赤色蛍光タンパク質レポーター遺伝子）（配列番号４）を使用した。各遺伝子について、遺伝子組換え操作等のために制限酵素認識部位を付加したものは、各々配列番号７〜１０に示した（図６〜９参照）。 2) Design of genes for glycine betaine biosynthesis Each of the two types of enzymes, GMST and DMT, required to confer the ability to biosynthesize glycine betaine starting from glycine to Halomonas (KA1 strain) The gene was designed based on the amino acid sequence of the enzyme identified in the salt-tolerant cyanobacterium Aphanothece halophytica . For GSMT-related genes and DMT-related genes, artificial genes HeGSMT (SEQ ID NO: 1) and HeDMT (SEQ ID NO: 2), whose codon usage was optimized for expression in Halomonas (KA1 strain), are used. did. Furthermore, for the SAM synthase (SAMS) that functions to supply SAM, the SAMS-related gene (SEQ ID NO: 3) encoded on the genome of Halomonas was subcloned and used. Moreover, mCherry gene (red fluorescent protein reporter gene) (SEQ ID NO: 4) encoding red fluorescent protein was used as a reporter for analyzing gene expression level. Each gene with a restriction enzyme recognition site added for gene recombination and the like is shown in SEQ ID NOs: 7 to 10 (see FIGS. 6 to 9).

３）相同組換用プラスミドの構築
ハロモナス菌が高浸透圧条件下で適合溶質のエクトインを高密度に生合成する機構を活用し、ハロモナス菌（KA1株）を用いて、エクトインの替わりにグリシンベタインを高密度に生合成する組換型ハロモナス菌株を作製するためのプラスミドを構築した。プラスミドは、必要な相同組換領域として、エクトイン生合成オペロン（ectABC）の上流配列（UectA）（配列番号５）及び下流配列（DectC）（配列番号６）をゲノムPCR法によりクローン化し、赤色蛍光タンパク質（mCherry）をコードしたレポーター遺伝子（配列番号４）と連結して、pK18mobsacB-UectA-mCherry-DectCプラスミドとした。そして、mCherryの下流に目的遺伝子（X）、具体的には２種類のメチル基転移酵素関連遺伝子(HeGSMT及びHeDMT)をポリシストロン性のオペロンとして挿入し、pK18mobsacB-UectA-mCherry-GSMT-DMT-DectCプラスミドを構築した（図１参照）。さらに、配列番号３に示す配列からなるSAMS関連遺伝子をポリシストロン性のオペロンとして挿入し、pK18mobsacB-UectA-mCherry-GSMT-SAMS-DMT-DectCプラスミドを構築した。コントロールとして、mCherry遺伝子単独発現のプラスミドを同様に構築した。エクトイン生合成オペロン（ectABC）の上流配列（UectA）には、エクトインの産生に必要なプロモーター領域が含まれる（図２参照）。UectA及びDectCについて、制限酵素認識部位を付加したものは、各々配列番号１１及び１２に示した（図１０〜１１参照）。 3) Construction of homologous recombination plasmid Using the mechanism by which halomonas biosynthesizes ectoine, a compatible solute, under high osmotic pressure conditions at high density, using halomonas bacterium (strain KA1), instead of ectoine, glycine betaine A plasmid for constructing a recombinant halomonas strain that biosynthesizes at high density was constructed. As a necessary homologous recombination region of the plasmid, the upstream sequence (U ectA ) (SEQ ID NO: 5) and the downstream sequence (D ectC ) (SEQ ID NO: 6) of the ectoine biosynthesis operon (ectABC) are cloned by genomic PCR, in conjunction with red fluorescent protein (mCherry) encoding the reporter gene (SEQ ID NO: 4), was pK18mobsacB-U ectA -mCherry-D ectC plasmid. The inserted target gene downstream of mCherry (X), 2 types of methyltransferase enzymes related genes specifically the (HeGSMT and HeDMT) as polycistronic operon, pK18mobsacB-U ectA -mCherry-GSMT -DMT -D ectC plasmid was constructed (see FIG. 1). Further, by inserting the SAMS-associated genes consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 3 as a polycistronic operon was constructed pK18mobsacB-U ectA -mCherry-GSMT- SAMS-DMT-D ectC plasmid. As a control, a plasmid expressing mCherry gene alone was similarly constructed. The upstream region (U ectA ) of the ectoine biosynthetic operon (ectABC) contains a promoter region necessary for ectoine production (see FIG. 2). U ectA and D ectC to which restriction enzyme recognition sites are added are shown in SEQ ID NOS: 11 and 12, respectively (see FIGS. 10 to 11).

４）組換型ハロモナス菌株の作製
上記３）で構築した各種オペロンを含む上述の各種相同組換用プラスミドを、接合伝達法によりハロモナス菌（KA1株）へ導入した。そして、導入した相同組換用プラスミドDNAとハロモナス菌ゲノム上の標的DNAの相同領域配列（UectA又はDectC）間で起きる二段階の相同組換反応により、目的遺伝子（X）を標的領域、即ち高浸透圧条件に応答して発現が誘導される適合溶質エクトインの生合成オペロン（ectABC）のプロモーター領域を含むUectA配列の下流に挿入した組換型ハロモナス菌株を作製した（図１参照）。 4) Production of Recombinant Halomonas Strains The above-mentioned various homologous recombination plasmids containing the various operons constructed in 3) above were introduced into Halomonas bacteria (KA1 strain) by the conjugation transfer method. Then, the target gene (X) is transformed into the target region by a two-step homologous recombination reaction that occurs between the introduced homologous recombination plasmid DNA and the homologous region sequence (U ectA or D ectC ) of the target DNA on the Halomonas genome. That is, a recombinant halomonas strain inserted downstream of the U ectA sequence containing the promoter region of the biosynthetic operon (ectABC) of a compatible solute ectoin whose expression is induced in response to high osmotic pressure conditions was prepared (see FIG. 1). .

ハロモナス菌野生型株及び組換型ハロモナス菌株におけるエクトイン生合成オペロン領域のゲノム構造を図３に示した。図３に示したエクトイン非生産性のハロモナス菌株（KA1）は、野生型のハロモナス菌がゲノム上に有する適合溶質エクトインの生合成オペロン（ectABC）のうち、ectAの第2コドンからectCの最終コドンの領域を欠損したゲノム構造を有しており、ectABCオペロンのプロモーター領域を含むUectA配列とectABCオペロンのターミネーター領域を含むDectCを保持している。
(a)野生型株：エクトイン生合成オペロン（ectABC）を有する野生型株
(b)△ect株：ectABCを欠損した株（KA1株）
(c)△ect::mCherry株：ectABCオペロンのプロモーター領域を含むUectA配列の下流にmCherryを挿入した株
(d)△ect::mCherry-GSMT-DMT株：ectABCオペロンプロモーター領域を含むUectA配列の下流にmCherry、HeGSMT、及びHeDMTを挿入した株
(e)△ect::mCherry-GSMT-SAMS-DMT株：ectABCオペロンのプロモーター領域を含むUectA配列の下流にmCherry、HeGSMT、HeDMT、及びSAM合成酵素遺伝子(SAMS) を挿入した株 FIG. 3 shows the genomic structure of the ectoine biosynthesis operon region in the wild-type strain of Halomonas and the recombinant strain of Halomonas. The non-ectoin-producing halomonas strain (KA1) shown in FIG. 3 is the second codon of ectA from the second codon of ectA in the biosynthetic operon (ectABC) of the compatible solute ectoine possessed by wild-type halomonas on the genome. It has a genomic structure lacking a region, holding the D ECTC including terminator region U ECTA sequence ectABC operon containing a promoter region of ectABC operon.
(a) Wild type strain: Wild type strain having ectoine biosynthesis operon (ectABC)
(b) Δect strain: strain lacking ectABC (KA1 strain)
(c) Δect :: mCherry strain: a strain in which mCherry is inserted downstream of the U ectA sequence containing the promoter region of the ectABC operon
(d) △ ect :: mCherry-GSMT-DMT strain: a strain in which mCherry, HeGSMT, and HeDMT are inserted downstream of the U ectA sequence containing the ectABC operon promoter region
(e) △ ect :: mCherry-GSMT-SAMS-DMT strain: A strain in which mCherry, HeGSMT, HeDMT, and SAM synthase gene (SAMS) are inserted downstream of the U ectA sequence containing the promoter region of the ectABC operon

上記のうち、(b)H. elongataよりエクトインの生合成オペロン（ectABC）領域を欠損させた△ect株（Halomonas elongata KA1）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1つくばセンター中央第6）に寄託申請され、平成23年3月31日に受領され、受託番号FERM P-22094として受託されている。 Among the above, (b) △ ect strain ( Halomonas elongata KA1) lacking the ectoin biosynthetic operon (ectABC) region from H. elongata is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) 8566 Ibaraki Prefecture Tsukuba City Higashi 1-1-1 Tsukuba Center Chuo No. 6) was applied for deposit , received on March 31, 2011 , and deposited under the deposit number FERM P-22094.

（実験例１−１）発現解析
本実験例では、実施例１で作製した組換型ハロモナス菌株に導入したグリシンベタイン生合成オペロンの発現解析を行った。レポーターとして導入したmCherry遺伝子の発現量を蛍光シグナルとして検出することにより、塩ストレスに応答したグリシンベタイン生合成オペロンの遺伝子発現様式を解析した。2％又は6％ NaClを含む改変LB寒天培地上で培養した組換型ハロモナス菌株の赤色蛍光シグナルを検出した。mCherry蛍光の写真はLAS4010（GE社製）にて撮影した。 (Experimental example 1-1) Expression analysis In this experimental example, the expression analysis of the glycine betaine biosynthesis operon introduce | transduced into the recombinant halomonas strain produced in Example 1 was performed. By detecting the expression level of the mCherry gene introduced as a reporter as a fluorescent signal, the gene expression pattern of the glycine betaine biosynthesis operon in response to salt stress was analyzed. A red fluorescent signal of a recombinant halomonas strain cultured on a modified LB agar medium containing 2% or 6% NaCl was detected. The photograph of mCherry fluorescence was taken with LAS4010 (manufactured by GE).

その結果、2％ NaCl条件に対し、6％ NaClの高浸透圧条件下でより強い蛍光シグナルが検出されたことから、高浸透圧条件に応答して人工グリシンベタイン生合成オペロンを強発現する組換型ハロモナス菌株の創製に成功したことが示された（図１２）。図１２における色が濃いものについて、mCherry由来の赤色蛍光シグナル強度が強いことを示す。   As a result, a stronger fluorescence signal was detected under the high osmotic pressure condition of 6% NaCl with respect to the 2% NaCl condition. Therefore, the group that strongly expresses the artificial glycine betaine biosynthesis operon in response to the high osmotic pressure condition. It was shown that the recombinant Halomonas strain was successfully created (FIG. 12). The dark color in FIG. 12 shows that the intensity of red fluorescence signal derived from mCherry is strong.

（実験例１−２）組換型ハロモナス菌株によるグリシンベタインの検出
本実験例では、実施例１で作製した組換型ハロモナス菌株において、導入したグリシンベタイン生合成オペロンが機能的に発現しているかを検証するため、3％ NaClを含むM63最少培地（炭素源として0.2％グルコースを含む）で各種ハロモナス菌株を培養した。各種ハロモナス菌株から超純水による低浸透圧処理により抽出された適合溶質成分（ジメチルグリシン、グリシンベタイン、エクトイン）をHPLCにより分析した。 (Experimental example 1-2) Detection of glycine betaine by recombinant halomonas strain In this experimental example, whether the introduced glycine betaine biosynthetic operon is functionally expressed in the recombinant halomonas strain prepared in Example 1 In order to verify the above, various halomonas strains were cultured in M63 minimal medium (containing 0.2% glucose as a carbon source) containing 3% NaCl. The compatible solute components (dimethylglycine, glycine betaine, ectoine) extracted from various halomonas strains by low osmotic pressure treatment with ultrapure water were analyzed by HPLC.

HPLCの分析手法は、Clinical Chemistry 44:9, 1937-1941 (1998)を参照した。具体的には、細胞抽出液中のカルボニル基を有するグリシンベタインやエクトインを含む化合物を4-ブロモフェナシルブロミドでラベル化して行った。HPLC分析カラムは、SupelcosilTM LC-SCX, 5μm, 25 cm×4.6 cm (Supelco Inc.)を使用し、カラム温度28℃、流速1.5 mL/min、UV検出器の波長254 nmの条件により検出した。溶媒は22 mMコリンを添加した90％アセトニトリル溶液を使用した。 The analytical method of HPLC referred to Clinical Chemistry 44: 9, 1937-1941 (1998). Specifically, a compound containing glycine betaine or ectoine having a carbonyl group in the cell extract was labeled with 4-bromophenacyl bromide. The HPLC analytical column used was Supelcosil TM LC-SCX, 5 μm, 25 cm × 4.6 cm (Supelco Inc.), and was detected under the conditions of a column temperature of 28 ° C., a flow rate of 1.5 mL / min, and a UV detector wavelength of 254 nm. . As the solvent, a 90% acetonitrile solution to which 22 mM choline was added was used.

その結果、(a)野生型ハロモナス菌株ではエクトインのみが顕著量検出されたのに対し、エクトイン生合成遺伝子を欠損したハロモナス菌株（(c)〜(e)）ではエクトインが検出されなかった。その一方で、グリシンベタイン生合成オペロンを導入した組換型ハロモナス菌株（(d)△ect::mCherry-GSMT-DMT株及び(e)△ect::mCherry-GSMT-SAMS-DMT株）では、グリシンベタインが顕著量検出された。それに対して、コントロールの(c)△ect::mCherry株ではエクトイン及びグリシンベタインは顕著量検出されなかった。さらに、(d)△ect::mCherry-GSMT-DMT株よりも、(e)△ect::mCherry-GSMT-SAMS-DMT株の方が多量のグリシンベタインが検出されたことから、SAMの供給を強化した(d)△ect::mCherry-GSMT-SAMS-DMT株がグリシンベタインを高密度で生合成しうる株として有用であることが示された（図１３）。また、4×ダイゴIMK培地を含むM63最少培地（炭素源として0.2％グルコースを含む）に6％ NaClを添加した高浸透圧条件では、エクトインを生産しないコントロールの(c)△ect::mCherry株は増殖できないのに対し、グリシンベタインを生産する(e)△ect::mCherry-GSMT-SAMS-DMT株は増殖が可能であったことから、エクトイン非生産株で生産されたグリシンベタインが適合溶質として機能することが示された（図１４）。   As a result, only a significant amount of ectoin was detected in (a) wild-type halomonas strains, whereas ectoin was not detected in halomonas strains lacking the ectoin biosynthesis gene ((c) to (e)). On the other hand, in the recombinant halomonas strain ((d) △ ect :: mCherry-GSMT-DMT strain and (e) △ ect :: mCherry-GSMT-SAMS-DMT strain) into which the glycine betaine biosynthesis operon was introduced, A significant amount of glycine betaine was detected. In contrast, no significant amounts of ectoine and glycine betaine were detected in the control (c) Δect :: mCherry strain. Furthermore, since (d) △ ect :: mCherry-GSMT-DMT strain detected more glycine betaine than (e) △ ect :: mCherry-GSMT-SAMS-DMT strain, It was shown that the (d) Δect :: mCherry-GSMT-SAMS-DMT strain enhanced in γ is useful as a strain capable of biosynthesizing glycine betaine at a high density (FIG. 13). In addition, the control (c) △ ect :: mCherry strain that does not produce ectoine under high osmotic pressure conditions in which 6% NaCl is added to M63 minimal medium (containing 0.2% glucose as a carbon source) containing 4x Daigo IMK medium Glycine betaine, which produces glycine betaine (e) △ ect :: mCherry-GSMT-SAMS-DMT, was able to grow. It was shown to function as (FIG. 14).

（実施例２）高浸透圧条件下でのグリシンベタイン産生
本実施例では、実施例１で作製した組換型ハロモナス菌株((e)△ect::mCherry-GSMT-SAMS-DMT株)について、各濃度のNaClを含むLB培地で培養したときのグリシンベタインの産生を確認した。培養は37℃で24時間行い、培地はNaCl濃度を2〜12％に増量したLB培地5 mLを使用した。そして、培養液から組換型ハロモナス菌株の細胞を遠心分離によりペレットとして回収し、回収細胞量の新鮮重量を測定した。抽出は、10 mg新鮮重量あたり40μLの超純水を加えて細胞を懸濁することにより行い、遠心分離した上澄み液を抽出液として回収した。 (Example 2) Glycine betaine production under high osmotic pressure conditions In this example, the recombinant halomonas strain prepared in Example 1 ((e) Δect :: mCherry-GSMT-SAMS-DMT strain) Production of glycine betaine was confirmed when cultured in LB medium containing NaCl at various concentrations. The culture was carried out at 37 ° C. for 24 hours, and the medium used was 5 mL of LB medium in which the NaCl concentration was increased to 2 to 12%. And the cell of the recombinant halomonas strain was collect | recovered from the culture solution as a pellet by centrifugation, and the fresh weight of the amount of recovered cells was measured. Extraction was performed by adding 40 μL of ultrapure water per 10 mg fresh weight to suspend the cells, and the centrifuged supernatant was collected as an extract.

その結果、2％の低NaCl濃度条件に比べて、3, 6, 9, 12％のNaCl濃度の上昇に伴い、組換型ハロモナス菌株の細胞から抽出されたグリシンベタイン濃度の顕著な上昇がみられた（図１５Ａ）。しかしながら、9％以上のNaCl濃度域では回収された細胞量が減少していたため、6％条件でのグリシンベタインの培養液あたりの生産量が最大であった（図１５Ｂ）。   As a result, the concentration of glycine betaine extracted from the cells of the recombinant Halomonas strain increased significantly as the NaCl concentration increased by 3, 6, 9 and 12% compared to the low NaCl concentration condition of 2%. (FIG. 15A). However, since the amount of recovered cells decreased in the NaCl concentration range of 9% or more, the production amount of glycine betaine per culture solution under the 6% condition was the maximum (FIG. 15B).

高浸透圧条件でグリシンベタインを高密度で生合成した組換型ハロモナス菌株の細胞からのグリシンベタイン抽出は、細胞を破砕することなく超純水での懸濁による低浸透圧処理のみで十分であることが示唆された。以上の結果から、(e)△ect::mCherry-GSMT-SAMS-DMT株を用いることにより、高浸透圧条件でのグリシンベタインを高密度で生合成させるプロセスの構築が可能であることが示された。また、菌株の細胞内に高密度に生合成され、蓄積されたグリシンベタインの抽出には細胞破砕を必要とせず、超純水を用いた低浸透圧処理によるグリシンベタインの抽出プロセスの構築が可能であることが示唆された。   Extraction of glycine betaine from cells of recombinant Halomonas strains that biosynthesized glycine betaine at high density under high osmotic pressure conditions is sufficient with low osmotic pressure treatment by suspension in ultrapure water without disrupting the cells. It was suggested that there is. The above results show that (e) △ ect :: mCherry-GSMT-SAMS-DMT strain can be used to construct a process for biosynthesis of glycine betaine at high density under high osmotic pressure conditions. It was done. In addition, the extraction of accumulated glycine betaine, which is biosynthesized at high density in the cells of the strain, does not require cell disruption, and it is possible to construct an extraction process for glycine betaine by low osmotic pressure treatment using ultrapure water. It was suggested that

（実施例３）高浸透圧条件での二段階培養によるグリシンベタイン生産
本実施例では、実施例１で作製した組換型ハロモナス菌株((e)△ect::mCherry-GSMT-SAMS-DMT株)について、高浸透圧条件での二段階培養によるグリシンベタインの高生産プロセスの検討を行った。実施例２の結果より、NaCl濃度が高すぎると、当該組換型菌株の細胞増殖が阻害されたが、グリシンベタインの生産性はNaCl濃度が高いほど向上していた。そこで、6％のNaCl濃度条件で当該組換型菌株を培養して細胞をあらかじめ増殖させておき、続いて15％のNaCl濃度条件下で継続して培養する二段階培養によるグリシンベタインの高生産プロセスの検討を行った。培養は37℃で行い、培地はNaCl濃度を6％又は15％に増量したLB培地50 mLを使用した。分析は実施例１と同手法にて行った。 (Example 3) Glycine betaine production by two-stage culture under high osmotic pressure conditions In this example, the recombinant halomonas strain ((e) Δect :: mCherry-GSMT-SAMS-DMT strain prepared in Example 1) ), A high production process of glycine betaine by two-stage culture under high osmotic pressure conditions was investigated. From the results of Example 2, when the NaCl concentration was too high, cell growth of the recombinant strain was inhibited, but the productivity of glycine betaine was improved as the NaCl concentration was higher. Therefore, high production of glycine betaine by two-stage culture in which the recombinant strain is cultured under 6% NaCl concentration condition and cells are proliferated in advance, and then continuously cultured under 15% NaCl concentration condition. The process was examined. The culture was performed at 37 ° C., and 50 mL of LB medium with NaCl concentration increased to 6% or 15% was used as the medium. Analysis was performed in the same manner as in Example 1.

その結果を図１６に示した。LB培地に6％のNaClを添加した条件下で24時間培養した組換型ハロモナス菌株より、22 mMのグリシンベタイン抽出液が得られた（6％, 24時間）。その一方で、LB培地に6％のNaClを添加した条件下で24時間培養した後、さらに継続して15％のNaClを添加した条件で12時間の二段培養を行った当該組換型菌株からは、50 mMのグリシンベタイン抽出液が得られ（6％, 24時間→15％, 12時間）、24時間まで二段目の培養を行った当該組換型菌株からは、60 mMのグリシンベタイン抽出液が得られた（6％, 24時間 → 15％, 24時間）。   The results are shown in FIG. A 22 mM glycine betaine extract was obtained from the recombinant Halomonas strain cultured for 24 hours under the condition where 6% NaCl was added to the LB medium (6%, 24 hours). On the other hand, the recombinant strain was cultured for 24 hours under the condition where 6% NaCl was added to the LB medium, followed by 12-hour two-stage culture under the condition where 15% NaCl was further added. , A 50 mM glycine betaine extract was obtained (6%, 24 hours → 15%, 12 hours), and the recombinant strain that had been cultured in the second stage for up to 24 hours contained 60 mM glycine. A betaine extract was obtained (6%, 24 hours → 15%, 24 hours).

上記の結果、二段階培養を開始して12時間目で50 mMのグリシンベタイン抽出液を得ることができた。さらに24時間目には、60 mMのグリシンベタイン抽出液が得られた。以上の結果により、二段階培養により、ハロモナス菌株の細胞増殖を確保したうえで、グリシンベタインを高生産することに成功した。   As a result, a 50 mM glycine betaine extract could be obtained 12 hours after the start of the two-stage culture. Further, at 24 hours, a 60 mM glycine betaine extract was obtained. Based on the above results, glycine betaine was successfully produced by two-stage culture while securing cell growth of Halomonas strains.

（実施例４）人工海水培地によるグリシンベタイン生産
実施例２及び３で使用したLB培地の成分中には、コリンやグリシンベタインそのものなどが含まれるため、コリンやグリシンベタインを取り込む活性が生産性の評価に影響を及ぼすことが懸念された。また、実施例１で使用したM63最少培地ではグリシンベタイン生合成量が低いため、塩ストレス下での細胞増殖自体が悪いという結果が得られた。そのため、グリシンベタイン生合成に適した無機塩培地を検討した。 (Example 4) Production of glycine betaine by artificial seawater medium Since the components of LB medium used in Examples 2 and 3 include choline and glycine betaine itself, the activity of taking in choline and glycine betaine has a high productivity. There was concern that it would affect the evaluation. Moreover, since the amount of glycine betaine biosynthesis was low in the M63 minimal medium used in Example 1, the result that the cell growth itself under a salt stress was bad was obtained. Therefore, an inorganic salt medium suitable for glycine betaine biosynthesis was examined.

ハロモナス菌株を使用する利点として、水資源枯渇問題に対応するため、海水を直接使用可能である点があげられる。そこで、本実施例では、微細藻類の培養用に開発されたダイゴIMK培地を含む人工海水培地の利用を検討した。微細藻類の細胞増殖が良くなるとされる、2×ダイゴIMK培地を含む人工海水を使用した。また、炭素源として、植物バイオマス由来の主要な炭素源であるグルコース、グリセロール、キシロースの３種について検討を行った。   As an advantage of using the Halomonas strain, seawater can be used directly to cope with the water resource depletion problem. Therefore, in this example, the use of an artificial seawater medium containing a Daigo IMK medium developed for culturing microalgae was examined. Artificial seawater containing 2 × Daigo IMK medium, which is considered to improve cell growth of microalgae, was used. In addition, three types of carbon sources, glucose, glycerol, and xylose, which are main carbon sources derived from plant biomass, were examined.

その結果、いずれの炭素源においても、組換型ハロモナス菌株((d)△ect::mCherry-GSMT-DMT株及び(e)△ect::mCherry-GSMT-SAMS-DMT株)において、グリシンベタインの生合成が確認できたことから、海水及び植物バイオマス由来炭素源を用いたグリシンベタインの生合成が可能であることが示唆された（図１７〜１９）。   As a result, in any carbon source, glycine betaine in the recombinant halomonas strains ((d) △ ect :: mCherry-GSMT-DMT strain and (e) △ ect :: mCherry-GSMT-SAMS-DMT strain) It was suggested that biosynthesis of glycine betaine using seawater and a plant biomass origin carbon source was possible (FIGS. 17-19).

以上詳述したように本発明の製造方法により、所望の適合溶質（Ａ）を微生物内で生合成し、高密度で蓄積し、かつ容易に分離・回収することができる。本発明の方法により、所望の適合溶質（Ａ）を大量に安定的に供給することが可能となる。   As described above in detail, the production method of the present invention allows the desired compatible solute (A) to be biosynthesized in microorganisms, accumulated at high density, and easily separated and recovered. By the method of the present invention, a desired compatible solute (A) can be stably supplied in a large amount.

適合溶質の具体例としてメチル化グリシンについて、グリシンからのサルコシン、サルコシンからジメチルグリシン、ジメチルグリシンからグリシンベタインへの三段階のメチル化反応によるグリシンベタイン合成のための代謝経路を、例えばハロモナス菌に導入する本発明の製造方法により、豊富な炭素源から生合成する必須アミノ酸のグリシンを出発物質として、ハロモナス菌内にグリシンベタインを生合成し、高密度に蓄積させることができる。更に、グリシンベタインの合成にメチル基供与体として使われるS-アデノシルメチオニン（SAM）の合成系を並行して強化することで、より大量のグリシンベタインを生合成することができる。本発明の製造方法により、植物バイオマス由来の単純な炭素源からメチル化グリシン、例えばグリシンベタインを微生物内で高密度に蓄積することができ、さらには淡水などの低浸透圧条件下でグリシンベタインを排出させ、容易に分離・回収することができる。さらには、使用した微生物を繰り返し利用することで、グリシンベタインを連続して高生産することができる。   As a specific example of compatible solutes, for methylated glycine, a metabolic pathway for glycine betaine synthesis by three-step methylation reaction from sarcosine from glycine, sarcosine to dimethylglycine, and dimethylglycine to glycine betaine, for example, is introduced into Halomonas bacteria By the production method of the present invention, glycine betaine can be biosynthesized in Halomonas bacteria and accumulated at high density using glycine, an essential amino acid biosynthesized from abundant carbon sources, as a starting material. Furthermore, a larger amount of glycine betaine can be biosynthesized by enhancing the synthesis system of S-adenosylmethionine (SAM) used as a methyl group donor in the synthesis of glycine betaine in parallel. According to the production method of the present invention, methylated glycine such as glycine betaine can be accumulated in a microorganism at a high density from a simple carbon source derived from plant biomass, and further glycine betaine can be obtained under low osmotic pressure conditions such as fresh water. It can be discharged and easily separated and recovered. Furthermore, glycine betaine can be continuously produced in high yield by repeatedly using the used microorganism.

Claims (13)

微生物を用いた適合溶質（Ａ）の製造方法であり、
１）適合溶質（Ｂ）の生合成能を低下又は欠失させ、且つ適合溶質（Ａ）生合成に関連する外来遺伝子を導入した微生物を高浸透圧条件下で培養し、微生物中で適合溶質（Ａ）を生合成させる工程と、
２）前記微生物中で生合成した適合溶質（Ａ）を、低浸透圧条件下で微生物から排出させ、回収する工程と、を含み、
前記適合溶質（Ａ）がグリシンベタインであり、
前記適合溶質（Ｂ）がエクトインであり、
前記微生物が、ハロモナス属に属する微生物であり、
前記適合溶質（Ａ）の生合成に関連する外来遺伝子が、少なくともグリシンサルコシンメチル基転移酵素（GSMT）に関連する遺伝子とジメチルグリシンメチル基転移酵素（DMT）に関連する遺伝子であり、
前記GSMTに関連する遺伝子は、以下に示す１）または２）の塩基配列からなり、
１）配列表の配列番号１に示す塩基配列；
２）前記１）に記載の塩基配列のうち、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加といった変異された配列からなる塩基配列であって、GSMTをコードする塩基配列；
前記DMTに関連する遺伝子は、以下に示す３）または４）の塩基配列からなり、
３）配列表の配列番号２に示す塩基配列；
４）前記３）に記載の塩基配列のうち、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加といった変異された塩基配列であって、DMTをコードする塩基配列；
グリシンベタインが、少なくともグルコース、グリセロール及び／又はキシロースを炭素源として生合成されることを特徴とする、製造方法。 A method for producing a compatible solute (A) using a microorganism,
1) A microorganism in which the biosynthetic ability of the compatible solute (B) is reduced or deleted and a foreign gene related to the compatible solute (A) biosynthesis is introduced under high osmotic pressure conditions, and the compatible solute is contained in the microorganism. Biosynthesizing (A) ;
2) discharging the solute (A) biosynthesized in the microorganism from the microorganism under low osmotic pressure conditions and recovering the solute ,
The compatible solute (A) is glycine betaine;
The compatible solute (B) is ectoine,
The microorganism is a microorganism belonging to the genus Halomonas,
The foreign gene related to biosynthesis of the compatible solute (A) is at least a gene related to glycine sarcosine methyltransferase (GSMT) and a gene related to dimethylglycine methyltransferase (DMT),
The gene related to GSMT consists of the base sequence of 1) or 2) shown below,
1) the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
2) A base sequence consisting of a mutated sequence in which one or several bases are substituted, deleted, inserted or added in the base sequence described in 1) above and which encodes GSMT;
The gene related to DMT consists of the base sequence of 3) or 4) shown below,
3) the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
4) A nucleotide sequence in which one or several bases in the nucleotide sequence described in 3) are mutated such as substitution, deletion, insertion or addition, and encodes DMT;
A production method, wherein glycine betaine is biosynthesized using at least glucose, glycerol and / or xylose as a carbon source. 高浸透圧条件が、塩化ナトリウム濃度（NaCl)で換算した場合に0.5〜4 Mであり、低浸透圧条件が、同様に塩化ナトリウム濃度で換算した場合に0〜0.5 Mであることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。 The high osmotic pressure condition is 0.5 to 4 M when converted to sodium chloride concentration (NaCl), and the low osmotic pressure condition is similarly 0 to 0.5 M when converted to sodium chloride concentration. The manufacturing method according to claim 1. ハロモナス属に属する微生物が、Halomonas elongataに属する微生物であることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。 The production method according to claim 1 or 2 , wherein the microorganism belonging to the genus Halomonas is a microorganism belonging to Halomonas elongata . 適合溶質（Ｂ）の生合成能を低下又は欠失させることが、前記微生物のゲノム上に存在するエクトイン生合成オペロンのうち、エクトイン生合成に特異的な遺伝子の一部若しくは全部を除去することである、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。 Decreasing or deleting the biosynthetic ability of the compatible solute (B) removes part or all of a gene specific for ectoin biosynthesis from the ectoine biosynthesis operon present on the genome of the microorganism. The manufacturing method in any one of Claims 1-3 which are these . グリシンベタインが、グリシンからサルコシンを合成する経路を介して生合成されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。 The production method according to any one of claims 1 to 4, wherein glycine betaine is biosynthesized through a pathway for synthesizing sarcosine from glycine. 適合溶質（Ａ）の生合成に関連する外来遺伝子が、さらにＳ−アデノシルメチオニン（SAM）合成酵素に関連する遺伝子である、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。 The production method according to any one of claims 1 to 5, wherein the foreign gene related to biosynthesis of the compatible solute (A) is a gene related to S-adenosylmethionine (SAM) synthase. Ｓ−アデノシルメチオニン（SAM）合成酵素に関連する遺伝子が、以下に示すいずれかの塩基配列からなる、請求項６に記載の製造方法：
１）配列表の配列番号３に示す塩基配列；
２）前記１）に記載の塩基配列のうち、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加といった変異された塩基配列であって、SAM合成酵素をコードする塩基配列。 The production method according to claim 6 , wherein the gene related to S-adenosylmethionine (SAM) synthase comprises any of the following base sequences:
1) the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing;
2) A nucleotide sequence in which one or several bases in the nucleotide sequence described in 1) are mutated such as substitution, deletion, insertion or addition , and encodes a SAM synthase. 外来遺伝子の導入が、ハロモナス属に属する微生物のゲノム上に存在するエクトイン生合成オペロンのうち、浸透圧応答性プロモーターの制御下にある領域に、請求項１に記載のGSMTに関連する遺伝子を導入することによる、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。 The GSMT-related gene according to claim 1 is introduced into a region under the control of an osmotic response promoter in an ectoine biosynthesis operon existing on the genome of a microorganism belonging to the genus Halomonas. The manufacturing method in any one of Claims 1-7 by doing. 外来遺伝子の導入が、ハロモナス属に属する微生物のゲノム上に存在するエクトイン生合成オペロンのうち、浸透圧応答性プロモーターの制御下にある領域に、さらに請求項１に記載のDMTに関連する遺伝子を導入することによる、請求項８に記載の製造方法。 The gene related to DMT according to claim 1 is further introduced into a region under the control of an osmotic response promoter among ectoine biosynthetic operons existing on the genome of microorganisms belonging to the genus Halomonas. The manufacturing method of Claim 8 by introduce | transducing. 外来遺伝子の導入が、ハロモナス属に属する微生物のゲノム上に存在するエクトイン生合成オペロンのうち、浸透圧応答性プロモーターの制御下にある領域に、請求項７に記載のいずれかの遺伝子を導入することによる、請求項８又は９に記載の製造方法。 The introduction of a foreign gene introduces any of the genes according to claim 7 into a region under the control of an osmotic response promoter among ectoine biosynthesis operons present on the genome of a microorganism belonging to the genus Halomonas. The manufacturing method of Claim 8 or 9 by this. 浸透圧応答性プロモーターが、ハロモナス属に属する微生物のゲノム上に存在するエクトインの生合成オペロンの上流配列（UectA）中に含まれることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれかに記載の製造方法。 The osmotic response promoter is contained in an upstream sequence (UectA) of an ectoine biosynthetic operon existing on the genome of a microorganism belonging to the genus Halomonas, according to any one of claims 8 to 10 . Production method. 受託番号FERM P-22094で特定される微生物にグリシンサルコシンメチル基転移酵素（GSMT）に関連する遺伝子とジメチルグリシンメチル基転移酵素（DMT）に関連する遺伝子を導入した微生物であり、It is a microorganism in which a gene related to glycine sarcosine methyltransferase (GSMT) and a gene related to dimethylglycine methyltransferase (DMT) are introduced into the microorganism specified by accession number FERM P-22094,
前記GSMTに関連する遺伝子は、以下に示す１）または２）の塩基配列からなり、The gene related to GSMT consists of the base sequence of 1) or 2) shown below,
１）配列表の配列番号１に示す塩基配列；1) the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
２）前記１）に記載の塩基配列のうち、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加といった変異された配列からなる塩基配列であって、GSMTをコードする塩基配列；2) A base sequence consisting of a mutated sequence in which one or several bases are substituted, deleted, inserted or added in the base sequence described in 1) above and which encodes GSMT;
前記DMTに関連する遺伝子は、以下に示す３）または４）の塩基配列からなる、微生物：The gene related to the DMT is composed of the following 3) or 4) base sequence:
３）配列表の配列番号２に示す塩基配列；3) the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
４）前記３）に記載の塩基配列のうち、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加といった変異された塩基配列であって、DMTをコードする塩基配列。4) A nucleotide sequence in which one or several bases in the nucleotide sequence described in 3) are mutated such as substitution, deletion, insertion or addition, and encodes DMT. さらにＳ−アデノシルメチオニン（SAM）合成酵素に関連する遺伝子を導入した微生物であり、Furthermore, it is a microorganism introduced with a gene related to S-adenosylmethionine (SAM) synthase,
前記SAM合成酵素に関連する遺伝子は、以下に示す１）または２）の塩基配列からなる、請求項１２に記載の微生物：The microorganism according to claim 12, wherein the gene related to the SAM synthase comprises the following base sequence 1) or 2):
１）配列表の配列番号３に示す塩基配列；1) the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing;
２）前記１）に記載の塩基配列のうち、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加といった変異された塩基配列であって、SAM合成酵素をコードする塩基配列。2) A nucleotide sequence in which one or several bases in the nucleotide sequence described in 1) are mutated such as substitution, deletion, insertion or addition, and encodes a SAM synthase.
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