JP5785165B2 - 分子に対するレトロウイルス分離株の感受性または耐性を判定するための方法、ウイルスプロテアーゼ阻害剤に基づく治療的レトロウイルス処置および診断用キット - Google Patents

Description

関連出願
本願は、２００９年７月１５日および２００９年７月１６日出願の米国特許出願第１２／５０３，１７４号および同第１２／５０４，４５６号に基づく優先権を主張する。これらの出願は、参照により本願明細書に援用したものとする。

本開示は、分子に対するレトロウイルス分離株の感受性または耐性を判定するための方法、ウイルスプロテアーゼ阻害剤に基づく治療的レトロウイルス処置、および本方法の実施から導かれる診断用キットに関する。

ＡＩＤＳの病原体はヒト免疫不全ウイルス１型および２型である。これらのウイルスは、特定の臨床的特徴および生物学的特徴を共有するが、これらのウイルスは、特に宿主が感染する方法に関して、大きな差異を有する。従って、ＨＩＶ−２による感染はＨＩＶ−１による感染よりも困難であり（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）、ＨＩＶ−２に感染した個体の血漿ウイルス量は、ＨＩＶ−１に感染した個体におけるよりも、高さが少なくかつ／または低く（非特許文献５；非特許文献６）、そしてＨＩＶ−２に感染した個体は、よりゆっくりとこの疾病を発症する（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。

ＨＩＶ−２は、１９８６年に西アフリカで初めて特定された（非特許文献１０）。この地域では、ＨＩＶ−２の罹患率は、１％〜１０％の間で変動する（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。西アフリカ外での、ＨＩＶ−２による感染のこれらの症例の大多数は、欧州諸国およびとりわけポルトガルで見出され、ポルトガルではＨＩＶ−２に感染した個体は、ヒト免疫不全ウイルスに感染した集団の１３％を占める（非特許文献１４）。フランスでは、ＨＩＶに感染した集団のうちの１％は２型ウイルスに感染していると見積もられてきた。

先進国では、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２に感染した個体は、２つのウイルス酵素、逆転写酵素およびプロテアーゼ、のうちの一方または他方に対する阻害活性を有する分子から構成される化学医療によって処置される。

さらに、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２に感染した個体は、ウイルス侵入過程に対するまたはウイルス酵素、すなわち逆転写酵素、プロテアーゼ、およびインテグラーゼ、に対する阻害活性を有する分子から構成される化学医療によっても処置される。

この処置は、ＨＩＶ感染によって引き起こされる罹患率および死亡率を下げることに著しく役立ったが（非特許文献１５；非特許文献７）、治療が不調に終わったいくつかの症例が観察されている。

血漿から、ＨＩＶ−１に感染した個体および治療が不調に終わった個体のＲＮＡまたは細胞ＤＮＡを増幅することができることは、治療的処置の自然発生的なまたは進行性の無効力を分子レベルで理解することが可能になった。特に、２つのウイルス酵素、逆転写酵素およびプロテアーゼ、の核酸配列の決定から、ある数の変異の出現が示された。野生型ウイルス株（それゆえ、処置に感受性がある）が変異を保有していたインビトロでの研究の中で得られた結果から、処置に対するそのウイルスの耐性に、これらの変異が関連していることが明確に示された。

それゆえ、研究者らは、治療的処置の選択を方向付けて導き、そしてその有効性を最適化するために、これらの変異およびこれらの変異が発生させる耐性について、ある量の研究を行ってきた。

治療的処置を方向付けるために、２つの異なる技術的アプローチが開発された。１つは、ウイルスタンパク質をコードする核酸配列内のすでに公知の変異のみを検索することからなり、遺伝子型判定アプローチと呼ばれる。他方は、ウイルスの配列内での耐性変異の存在がわかっている必要はなく、細胞ベースの系で、阻害性分子の存在下でのウイルス複製の阻害を試験することからなり、表現型判定アプローチと呼ばれる。

残念ながら、研究所の経済的戦略は、大多数の時間を、一般的に科学界の中に、ＨＩＶ−２に感染した患者の処置に対する関心がない（ＨＩＶ−２によって最も影響を受ける集団は、主に発展途上国の集団である）ことに向け、または不適切な解決策に向けた：余りに高価な処置、試験および分析、診断、例えば、余りに時間がかかるかまたはその場で実施するのが不可能である表現型判定診断、関係国の中に要求にかなう体制がないことなど。

このように、ＨＩＶ−２に関して行われた種々の研究の中で得られた結果は、ＨＩＶ−２プロテアーゼの特定の変異と、耐性表現型との間の相関を定式化することを可能にするのに十分な一貫性がなかった。

疾病の進行はＨＩＶ−１に感染した個体においてよりもＨＩＶ−２に感染した個体において遅いので、Ｔ ＣＤ４細胞の計数および血漿ウイルス量の決定は、処置中の患者の中に耐性株が出現することをすぐには考慮しないということに留意されたい。

感染した患者から単離されたＨＩＶ株の耐性プロファイルを、表現型判定を通して提供する会社が、現在、いくつか存在する。概念上は、上記３つの試験は互いに似ており、それらは、各プロテアーゼ阻害剤が、患者を感染させるウイルスのプロテアーゼを含む感染性の組み換えウイルスの放出を阻害することができる能力に基づく。それらの会社は、Ｐｈｅｎｏｓｃｒｉｐｔ（商標）を製造するユーロフィン−ブイアイアール・アライアンス（ＥＵＲＯＦＩＮＳ−Ｖｉｒａｌｌｉａｎｃｅ）（フランス）、Ａｎｔｉｖｉｒｏｇｒａｍ（商標）を製造するヴィルコ−ジョンソン・エンド・ジョンソン（Ｖｉｒｃｏ−Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）（ベルギー−米国）、およびＰｈｅｎｏｓｅｎｓｅ（商標）を製造するモノグラム・バイオサイエンシズ（Ｍｏｎｏｇｒａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（元ヴィロロジック（Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ））（米国）である。これら３つの場合、それらの試験を実施するためには、大きな物流機構、分子生物学およびウイルス学に熟知した人材、およびＰ３レベルが確保された試験室タイプという高価な基幹施設（プロファイルの完成には、現在、１試料あたり８００〜１，０００ユーロの費用がかかることになろうと思われる）が必要である。生物由来物質が試験室に到着する時と、耐性プロファイルが確立される時との間に存在する遅延は、ＨＩＶ−１の各株については、２週間〜３週間の間で変わる。

これらの状況下で、信頼性が高く高速の試験、例えば、実施するのが簡単で、かつ安価である表現型判定試験を市場に出すことは、急を要するものになった。このような試験は、処置する医師が、特に貧しい集団について、レトロウイルス、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２、に感染した患者の中での耐性株の出現をモニターすることを支援することになろう。さらに、この試験は、レトロウイルスプロテアーゼに対する阻害活性を有する新しい分子に向けた「高速」かつ／または「高スループット」研究のためにも使用することができるであろう。

Ａｎｃｅｌｌｅ Ｒ、Ｏ Ｂｌｅｔｒｙ、Ａ Ｃ Ｂａｇｌｉｎ、Ｆ Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔ、Ｍ Ａ ＲｅｙおよびＰ Ｇｏｄｅａｕ、「Ｌｏｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ｆｏｒ ＨＩＶ−２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｌａｎｃｅｔ．、１９８７年、第１巻、６８８−９頁 Ｍａｒｌｉｎｋ Ｒ、Ｐ Ｋａｎｄｋｉ、Ｉ Ｔｈｉｏｒ、Ｋ Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｇ Ｅｉｓｅｎ、Ｔ Ｓｉｂｙ、Ｉ Ｔｒａｏｒｅ、Ｃ Ｃ Ｈｓｉｅｈ、Ｍ Ｃ ＤｉａおよびＥ Ｈ Ｇｕｅｙｅ、「Ｒｅｄｕｃｅｄ ｒａｔｅ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｆｔｅｒ ＨＩＶ−２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ＨＩＶ−１」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４年、第２６５巻、１５８７−９０頁 Ａｄｊｏｒｌｏｌｏ−Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｇ、Ｋ Ｍ Ｄｅ Ｃｏｃｋ、Ｅ Ｅｋｐｉｎｉ、Ｋ Ｍ Ｖｅｔｔｅｒ、Ｔ Ｓｉｂａｉｌｌｙ、Ｋ Ｂｒａｔｔｅｇａａｒｄ、Ｄ Ｙａｖｏ、Ｒ Ｄｏｏｒｌｙ、Ｊ Ｐ ＷｈｉｔａｋｅｒおよびＬ Ｋｅｓｔｅｎｓ、「Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｏｔｈｅｒ−ｔｏ−ｃｈｉｌｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ−１ ａｎｄ ＨＩＶ−２ ｉｎ Ａｂｉｄｊａｎ、Ｉｖｏｒｙ Ｃｏａｓｔ」、ＪＡＭＡ、１９９４年、第２７２巻、４６２−６頁 Ｍａｒｌｉｎｋ、Ｒ．、「Ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ＡＩＤＳ ｖｉｒｕｓ， ＨＩＶ−２」、ＡＩＤＳ、１９９６年、第１０巻、６８９−９９頁 Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｓ、Ｈ Ｎｏｒｒｇｒｅｎ、Ｚ ｄａ Ｓｉｌｖａ、Ａ Ｂｉａｇｕｅ、Ｓ Ｂａｍｂａ、Ｓ Ｋｗｏｋ、Ｃ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ、Ｇ Ｂｉｂｅｒｆｅｌｄ、およびＪ Ａｌｂｅｒｔ、「Ｐｌａｓｍａ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ｉｎ ＨＩＶ−１ ａｎｄ ＨＩＶ−２ ｓｉｎｇｌｙ ａｎｄ ｄｕａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｉｎ Ｇｕｉｎｅａ−Ｂｉｓｓａｕ， Ｗｅｓｔ Ａｆｒｉｃａ： ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｐｌａｓｍａ ｖｉｒｕｓ ｓｅｔ ｐｏｉｎｔ ｉｎ ＨＩＶ−２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｈａｎ ｉｎ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、２０００年、第１６０巻、２８６−９３頁 Ｐｏｐｐｅｒ Ｓ Ｊ、Ａ Ｄ Ｓａｒｒ、Ｋ Ｕ Ｔｒａｖｅｒｓ、Ａ Ｇｕｅｙｅ−Ｎｄｉａｙｅ、Ｓ Ｍｂｏｕｐ、Ｍ Ｅ Ｅｓｓｅｘ、およびＰ Ｊ Ｋａｎｋｉ、「Ｌｏｗｅｒ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ （ＨＩＶ） ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ｒｅｆｌｅｃｔｓ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＨＩＶ−１ ａｎｄ ＨＩＶ−２」、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．、１９９９年、第１８０巻、１１１６−２１頁 Ｖｉｔｔｉｎｇｈｏｆｆ Ｅ、Ｓ Ｓｃｈｅｅｒ、Ｐ Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ、Ｇ Ｃｏｌｆａｘ、Ｓ Ｄ ＨｏｌｍｂｅｒｇおよびＳ Ｐ Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｃｌｉｎｅｓ ｉｎ ＡＩＤＳ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ」、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．、１９９９年、第１７９巻、７１７−２０頁 Ｂｌａｎｃｏ Ｒ、Ｃａｒｒａｓｃｏ，Ｌ、およびＶｅｎｔｏｓｏ，Ｉ．、「Ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｂｙ ＨＩＶ−Ｉ ｐｒｏｔｅａｓｅ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、第２７８巻、１０８６−９３頁 Ｌｉｕ Ｈ、Ｋｒｉｚｅｋ Ｊ、およびＢｒｅｔｓｃｈｅｒ Ａ．、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＧＡＬ１−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｙｅａｓｔ ｃＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｗｈｏｓｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｕｓｅｓ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ｙｅａｓｔ」、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９２年、第１３２巻、６６５−６７３頁 Ｃｌａｖｅｌ Ｆ、Ｄ Ｇｕｅｔａｒｄ、Ｆ Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔ、Ｓ Ｃｈａｍａｒｅｔ、Ｍ Ａ Ｒｅｙ、Ｍ ０ Ｓａｎｔｏｓ−Ｆｅｒｒｅｉｒａ、Ａ Ｇ Ｌａｕｒｅｎｔ、Ｃ Ｄａｕｇｕｅｔ、Ｃ Ｋａｔｌａｍａ、およびＣ Ｒｏｕｚｉｏｕｘ、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ Ｗｅｓｔ Ａｆｒｉｃａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＩＤＳ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８６年、第２３３巻、３４３−６頁 Ｌａｎｇｌｅｙ Ｃ Ｌ、Ｅ Ｂｅｎｇａ−Ｄｅ、Ｃ Ｗ Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗ、Ｉ Ｎｄｏｙｅ、Ｍ Ｄ Ｍｂｅｎｇｕｅ−Ｌｙ、Ｊ Ｋｕｙｐｅｒｓ、Ｇ Ｗｏｔｏ−Ｇａｙｅ、Ｓ Ｍｂｏｕｐ、Ｃ Ｂｅｒｇｅｒｏｎ、Ｋ Ｋ Ｈｏｌｍｅｓ、およびＮ Ｂ Ｋｉｖｉａｔ、「ＨＩＶ−１， ＨＩＶ−２， ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ｉｎ ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ Ａｆｒｉｃａｎ ｗｏｍｅｎ」、ＡＩＤＳ、１９９６年、第１０巻、４１３−７頁 Ｐｏｕｌｓｅｎ Ａ Ｇ、Ｂ Ｋｖｉｎｅｓｄａｌ、Ｐ Ａａｂｙ、Ｋ Ｍｏｌｂａｋ、Ｋ Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ、Ｆ ＤｉａｓおよびＥ Ｌａｕｒｉｔｚｅｎ、「Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｎ Ｂｉｓｓａｕ， Ｗｅｓｔ Ａｆｒｉｃａ」、Ｌａｎｃｅｔ、１９８９年、第１巻、８２７−３１頁 Ｗｉｌｋｉｎｓ Ａ、Ｄ Ｒｉｃａｒｄ、Ｊ Ｔｏｄｄ、Ｈ Ｗｈｉｔｔｌｅ、Ｆ Ｄｉａｓ、およびＡ Ｐａｕｌｏ Ｄａ Ｓｉｌｖａ、「Ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒｕｒａｌ ａｒｅａ ｏｆ Ｇｕｉｎｅａ−Ｂｉｓｓａｕ」、ＡＩＤＳ、１９９３年、第７巻、１１１９−２２頁 Ｓｏｒｉａｎｏ Ｖ、Ｐ Ｇｏｍｅｓ、Ｗ Ｈｅｎｅｉｎｅ、Ａ Ｈｏｌｇｕｉｎ、Ｍ Ｄｏｒｕａｎａ、Ｒ Ａｎｔｕｎｅｓ、Ｋ Ｍａｎｓｉｎｈｏ、Ｗ Ｍ Ｓｗｉｔｚｅｒ、Ｃ Ａｒａｕｊｏ、Ｖ Ｓｈａｎｍｕｇａｍ、Ｈ Ｌｏｕｒｅｎｃｏ、Ｊ Ｇｏｎｚａｌｅｚ−ＬａｈｏｚおよびＦ Ａｎｔｕｎｅｓ、「Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ （ＨＩＶ−２） ｉｎ Ｐｏｒｔｕｇａｌ： ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ， ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｓｕｂｔｙｐｅｓ， ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、２０００年、第６１巻、１１１−６頁 Ｐａｌｅｌｌａ Ｆ Ｊ，Ｊｒ、Ｋ Ｍ Ｄｅｌａｎｅｙ、Ａ Ｃ Ｍｏｏｒｍａｎ、Ｍ Ｏ Ｌｏｖｅｌｅｓｓ、Ｊ Ｆｕｈｒｅｒ、Ｇ Ａ Ｓａｔｔｅｎ、Ｄ Ｊ ＡｓｃｈｍａｎおよびＳ Ｄ Ｈｏｌｍｂｅｒｇ、「Ｄｅｃｌｉｎｉｎｇ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｍｏｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． ＨＩＶ Ｏｕｔｐａｔｉｅｎｔ Ｓｔｕｄｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９９８年、第３３８巻、８５３−６０頁

出願人らは、分子に対するＨＩＶレトロウイルスの分離株の感受性または耐性を判定する方法であって、ａ）研究するべきレトロウイルスのプロテアーゼをコードする配列を、アミノ酸配列が存在している前駆体の切断部位の上流および下流に存在しているそのアミノ酸配列のうちの一部とともに、またはそのアミノ酸配列のうちの一部を伴わずに、増幅する工程と、ｂ）ＤＮＡの断片と、上記増幅の最終産物と、研究するべきレトロウイルスのプロテアーゼをコードする配列の発現を、公知の誘導性プロモーターの制御下で許容する発現ベクターとを、当該ベクターおよびＤＮＡ断片と少なくとも１つの酵母細胞との同時形質転換を介して、組み換える工程と、ｃ）同時形質転換された酵母細胞を培養して、感受性または耐性の試験を実施するのに十分な数の形質転換体を得て、そして同時形質転換された細胞から生じる形質転換体を、任意の適切な培地上に回収する工程と、ｄ）試験するべき分子の存在下で、当該形質転換体をインキュベーションする工程と、ｅ）当該生細胞を定性的にまたは定性的に分析する工程と、ｆ）感受性または耐性の表現型を推定する工程と、を含む方法を提供する。

出願人らは、当該方法を実施する診断用キットであって、配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４８、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７および５８からなる群から選択されるヌクレオチドプライマーと、少なくとも１つの発現ベクターと、少なくとも１つの酵母株と、少なくとも１つの多穴プレートまたは他の支持体とを含む、キットをも提供する。

誘導性プロモーターＧａｌ１の制御下のＨＩＶ−２プロテアーゼの配列を有する形質転換された酵母細胞を得るための、ＮｏｔＩ制限酵素によって切断されたｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０Ｍベクターと第２のＰＣＲの産物との同時形質転換の略図である。 誘導性プロモーターＧａｌ１の制御下でＨＩＶ−２プロテアーゼの配列を有する形質転換された酵母細胞を得るための、ＮｏｔＩ制限酵素によって切断されたｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０Ｍベクターと第２のＰＣＲの産物との同時形質転換の略図である。 生細胞および死細胞の計数ならびに表現型の判定の略図である。 診断用キットの略図である。 阻害剤濃度の関数としての、生細胞の百分率の、一対のグラフを示す。 阻害剤に対する耐性に応じた、細胞成長の写真を示す。

本出願人らは、酵母の使用による、分子に対するレトロウイルス（ＨＩＶなど）の感受性または耐性を判定するための方法、ウイルスプロテアーゼ阻害剤に基づく治療的処置を提供する。換言すれば、本出願人らは、分子および／または治療プロトコルの中で使用される化学分子に対するウイルスプロテアーゼの耐性または感受性を判定するための、酵母の使用を提供する。本出願人らは、当該方法を実施するために必要な要素を含む診断用キットも提供する。

より具体的には、当該方法によって、感染した患者の中でのＨＩＶ−２プロテアーゼの耐性表現型を、素早くかつ低費用で判定することが可能になる。当該方法によって、感染した患者の中でのＨＩＶ−１プロテアーゼの耐性表現型を、素早くかつ低費用で判定することも可能になる。さらに、当該方法により、新規な治療的処置を開発するという観点からの、ウイルスプロテアーゼに対する阻害活性を有する新しい化学分子に向けた「高速」かつ／または「高スループット」の研究が可能になる。

従って、本出願人らは、酵母の使用によって、感染した患者の中でのＨＩＶ−２プロテアーゼまたはＨＩＶ−１プロテアーゼの耐性表現型の、迅速かつ低費用の決定を可能にする手段を提供する。当該方法は、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、または任意の他のレトロウイルスのプロテアーゼの耐性表現型を判定するために実施することもできる。

いくつかの治療標的、例えば、逆転写酵素プロテアーゼ、およびインテグラーゼ、ならびにいわゆる「構造タンパク質」（マトリクス、カプシド、ヌクレオカプシド）をコードする配列は、ｇａｇ−ｐｏｌウイルス遺伝子によってコードされるＧａｇ−Ｐｏｌと呼ばれる共通のポリペプチド前駆体内に存在している（Ｃｌａｖｅｌ Ｆ、Ｇｕｙａｄｅｒ Ｍ、Ｇｕｅｔａｒｄ Ｄ、Ｓａｌｌｅ Ｍ、Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ Ｌ、Ａｌｉｚｏｎ Ｍ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２」、Ｎａｔｕｒｅ、１９８６年、第３２４巻、６９１−５頁）。その前駆体の種々の構成要素の一次配列を構成する切断部位と呼ばれる特定のペプチド結合の加水分解によって、これらのタンパク質の放出に関与するのが、ウイルスプロテアーゼの作用である（Ｏｒｏｓｚｌａｎ ＳおよびＬｕｆｔｉｇ ＲＢ、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ」、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９０年、第１５７巻、１５３−８５頁）。ＨＩＶ−１プロテアーゼについては、この切断部位の上流および下流に存在しているアミノ酸配列が、酵素がその基質を認識する事象において重要な役割を果たし、それゆえそのタンパク質分解活性についての決定因子であるということが示されている（Ｐｅｔｔｉｔ Ｓ Ｃ、Ｓｉｍｓｉｃ Ｊ、Ｌｏｅｂ Ｄ Ｄ、Ｅｖｅｒｉｔｔ Ｌ、Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ ＣＡ ３ｒｄ、Ｓｗａｎｓｔｒｏｍ Ｒ．、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｗｏ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐ１ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１年、第２６６巻、１４５３９−４７頁、Ｐｅｔｔｉｔ Ｓ Ｃ、Ｍｏｏｄｙ Ｍ Ｄ、Ｗｅｈｂｉｅ Ｒ Ｓ、Ｋａｐｌａｎ Ａ Ｈ、Ｎａｎｔｅｒｍｅｔ Ｐ Ｖ、Ｋｌｅｉｎ Ｃ Ａ、Ｓｗａｎｓｔｒｏｍ Ｒ．、１９９４年）。１型ヒト免疫不全ウイルスＧａｇのｐ２ドメインは、逐次的なタンパク質分解性のプロセシングを制御し、十分に感染性のウイルス粒子（ビリオン）を生成するために必要とされる（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、第６８巻、８０１７−２７頁、Ｍｏｏｄｙ Ｍ Ｄ、Ｐｅｔｔｉｔ Ｓ Ｃ、Ｓｈａｏ Ｗ、Ｅｖｅｒｉｔｔ Ｌ、Ｌｏｅｂ Ｄ Ｄ、Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ Ｃ Ａ ３ｒｄ、Ｓｗａｎｓｔｒｏｍ Ｒ．、１９９５年）。１型ヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼフラップの４８位にある側鎖は、付加的な特異性決定因子を提供する（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２０７巻、４７５−８５頁、Ｂｏｒｏｓｓ Ｐ、Ｂａｇｏｓｓｉ Ｐ、Ｃｏｐｅｌａｎｄ Ｔ Ｄ、Ｏｒｏｓｚｌａｎ Ｓ、Ｌｏｕｉｓ Ｊ Ｍ、Ｔｏｚｓｅｒ Ｊ．、「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｐ２’ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ」、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９９年、第２６４巻、９２１−９頁）。

２００３年に現れた科学論文は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ、出芽酵母）によるＨＩＶ−１プロテアーゼの発現が、未だ知られていない機構を通して酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ、出芽酵母）の死を引き起こし、その結果が、当該酵母の細胞溶解であるということを示した（Ｂｌａｎｃｏ Ｒ、Ｃａｒｒａｓｃｏ ＬおよびＶｅｎｔｏｓｏ Ｉ．、「Ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｂｙ ＨＩＶ−１ ｐｒｏｔｅａｓｅ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、第２７８巻、１０８６−９３頁）。

本出願人らは、その酵母がＨＩＶ−２プロテアーゼを発現するときに同じ現象が起こるということを示した。その結果、ウイルス酵素の触媒的部位を修飾することによってウイルス酵素による活性を阻害することにより、本出願人らは、この細胞事象の出現を予防することに成功した。

加えて、Ｂｌａｎｃｏら（Ｂｌａｎｃｏ Ｒ、Ｃａｒｒａｓｃｏ Ｌ、およびＶｅｎｔｏｓｏ Ｉ、「Ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｂｙ ＨＩＶ−１ ｐｒｏｔｅａｓｅ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、第２７８巻、１０８６−９３頁）は、抗ＨＩＶ治療で使用される阻害剤のうちの１つによるＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害が、そのウイルスプロテアーゼの発現によって引き起こされる酵母の細胞死を阻害するということも示した。この事実のため、種々の阻害された分子に対する感染した個体のプロテアーゼの感受性および耐性を定量的に測定することが可能である。

さらに、本出願人らは、ひとたび酵母の中で発現されると、プロテアーゼ活性を通して細胞死を誘導する最小の活性なＧａｇ−Ｐｏｌ前駆体に関して研究した。機能的プロテアーゼ前駆体タンパク質の定義は、プロテアーゼが逐次的に切断されるもととなる可能性がありかつその後に当該発現酵母を死滅させうるもの、であるので、本出願人らは、特定の核酸変異によってプロテアーゼ切断部位が存在するかまたは存在しない非常に多くの切断されたＧａｇ−Ｐｏｌ前駆体を作製し、酵母の中で発現させた。本出願人らは、驚くべきことに、当該プロテアーゼ配列のＮ末端部分に存在している切断部位が存在するときに酵母細胞の死を誘導するに過ぎないその前駆体の切断部位に隣接するプロテアーゼを含有する、最も小さい活性なプロテアーゼ前駆体が、最小のＧａｇ−Ｐｏｌ配列として定められるということを見出した。この最小のＧａｇ−Ｐｏｌ配列が存在下しないと、発現された前駆体は、細胞成長を妨げることができない。

本出願人らは、驚くべきことに、切断部位の６つのアミノ酸で始まり他の切断部位の少なくとも１つのアミノ酸がそれに続くプロテアーゼをコードする配列が、酵母の中で発現されたときに細胞死を誘導する最も小さい活性な前駆体の形態であるということを見出した。

それゆえ本発明の方法によって、酵母の細胞に関して、阻害活性を有する薬物に対する、ＨＩＶ−２またはＨＩＶ−１などのレトロウイルスのウイルスプロテアーゼの感受性表現型を判定することが可能になる。

換言すれば、本発明の方法によって、ウイルスプロテアーゼに対する阻害活性を有する化学分子に対する、またはウイルスプロテアーゼの阻害剤に基づく治療的処置に対する、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）などのレトロウイルスの分離株の感受性または耐性を判定することが可能になり、当該方法は、この目的のための、レトロウイルスプロテアーゼの発現によって細胞溶解が引き起こされる少なくとも１つの酵母の使用を特徴とする。

本出願人らは、驚くべきことに、プロテアーゼをコードする特定の配列だけでなく、発現ベクターに組み込まれたときのＨＩＶ−１プロテアーゼの前駆体配列も、酵母の中で進行する同時形質転換を介して、プロテアーゼの発現を可能にし、その酵母の死を引き起こすということを見出した。換言すれば、出願人らは、例えば感染した血液または細胞から抽出されたプロテアーゼＨＩＶ−１コード配列を含む配列が酵母の中で機能的に発現されるということを見出した。

それゆえ、本発明の方法により、レトロウイルスプロテアーゼの自然の基質の存在下で、細胞ベースの非感染系において、分子に対するそのレトロウイルスプロテアーゼの感受性または耐性を判定することが可能になる。さらには、本発明の方法により、プロテアーゼの活性およびそのプロテアーゼの発現に対する効果を有する分子を試験することが可能になる。さらに、本発明の方法により、例えば、プロテアーゼ前駆体であるプロテアーゼの自然の基質に対するプロテアーゼの活性に対して直接の効果を有する分子を試験することが可能になる。例えば、当該方法により、プロテアーゼをコードする配列、および／またはプロテアーゼ前駆体をコードする配列に対して作用することにより、プロテアーゼの翻訳に対して作用することにより、転写メカニズムにおよび／またはプロテアーゼ活性に対して作用することにより、プロテアーゼの活性を阻害する分子を試験することが可能になる。

さらに、本発明の方法により、例えばプロテアーゼをコードする核酸配列およびプロテアーゼ前駆体をコードする核酸配列の中に少なくとも１つの変異を有するプロテアーゼの感受性または耐性の判定が可能になる。

概略的に、当該方法は、発現ベクター、細胞系の選択、感染した個体のプロテアーゼを発現する方法および薬物に対する易罹患性の試験を含む。

当該方法は、以下の工程を含む：
任意に、レトロウイルスに感染した個体または動物から採取された体液または細胞（血液など）から、任意の適切な手段によって核酸、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを抽出する工程；
研究するべきレトロウイルスのプロテアーゼをコードする配列を増幅する工程；
当該ＤＮＡの断片と、上記増幅の最終産物と、研究するべきレトロウイルスのプロテアーゼ、および／またはいずれの形態または長さのプロテアーゼ前駆体をコードする配列の発現を、公知の誘導性プロモーターの制御下で許容する発現ベクターとを、当該ベクターおよびＤＮＡ断片と、レトロウイルスプロテアーゼの発現によって細胞溶解が引き起こされる少なくとも１つの酵母細胞との同時形質転換を介して、組み換える工程；
同時形質転換された酵母細胞を培養して、感受性または耐性の試験を実施するのに十分な数の形質転換体を得て、そして同時形質転換された細胞から生じる形質転換体を、任意の適切な培地上に回収する工程；
好ましくは増加する濃度の、試験するべき各分子の存在下で、当該形質転換体をインキュベーションする工程；
当該生細胞を定性的にまたは定性的に分析する工程；および
耐性表現型を推定する工程。

核酸は、レトロウイルスに感染した細胞、および／もしくは感染した個体もしくは動物由来の体液、および／もしくは感染した個体もしくは動物由来の血液から、ならびに／または感染した培養細胞培地から抽出されてもよい。

「試験分子」とも呼ばれる試験するべき分子は、ライブラリーの分子、化学分子、天然分子および植物から抽出された分子を含む群から選択される。

試験分子は、ウイルスプロテアーゼに対する阻害活性を有する化学分子、ウイルスプロテアーゼの阻害剤またはウイルス成熟の阻害剤に基づく治療的処置を含む群から選択されてもよい。

当該方法に従って増幅されるプロテアーゼの配列としては、単離されたタンパク質をコードする配列、またはそのタンパク質をコードしかつアミノ酸配列が存在しているタンパク質前駆体の切断部位の上流および下流に存在しているそのアミノ酸配列のすべてもしくは一部を含む配列が挙げられる。

このレトロウイルスはＨＩＶ−１であってもよい。

当該方法に係る、研究するべきレトロウイルスのプロテアーゼをコードする増幅された配列は、変異配列または非変異配列であることができる。研究するべきレトロウイルス、例えばＨＩＶ−１のプロテアーゼをコードする増幅された配列は、配列番号１０〜３７を含む群から選択されてもよい。

当該方法で使用される酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）の種類の酵母であってもよい。

核酸は、例えば配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４８、５１〜５８を含む群から選択されるプライマーの組を使用するポリメラーゼ連鎖反応によって増幅されてもよい。

外来の遺伝子をコードする酵母形質転換体を得るという観点で試験室で使用されるプロトコルは、一般に、遺伝子増幅（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術）によって、または注目する配列を含有するＤＮＡを切る制限酵素の作用による遺伝子の放出によって、注目する遺伝子をコードするＤＮＡの断片を得るための第１の工程で始まる。この第１の工程は、時間では、半日の作業に相当する。

次いで、放出されるＤＮＡ断片は、ＤＮＡリガーゼ酵素の作用（一晩続く操作）により発現ベクターの中でサブクローニングされ、この反応の産物は、細菌の形質転換後にその細菌の中で増幅される（プラスミドＤＮＡが組み込まれた細菌を得るために１日、ならびに求められる、注目する遺伝子をコードするプラスミドを含有する形質転換体を得て特性解析するのに１日半）。

さらに、酵母の形質転換の観点で十分な量の、注目する遺伝子を含有するプラスミドを生成するために、それまでの工程で得られた細菌クローンは、（一晩）増幅されてもよく、当該プラスミドは、従来の公知の方法（１日）によって精製されてもよい。

得られた精製されたプラスミドは、次いで、選択された酵母株を形質転換するために使用される（１／２日）。

形質転換された酵母株は、形質転換事象からおよそ４日後に得られる。

その結果、当業者にとっては周知である従来のプロトコルを使用することにより、注目する遺伝子のその後の研究のために、例えば感受性または耐性の試験を開発するために、十分な量の酵母形質転換体を得ることが可能であり、注目する遺伝子をコードするＤＮＡ断片の調製とそのＤＮＡ断片を発現する酵母株を得ることとの間に経過する時間は最短で８日間である。さらに、上に開示されたように、いくつかの技術が使用される。

これらの遅延の大きさおよび使用される技術の多重性は必然的に高い生産費用を生じ、これは、実施するのが簡単でおよび安価な、迅速な感受性または耐性の試験の開発とは合致しない。

換言すれば、酵母形質転換体を得る先行技術の方法は望ましくない。

当該形質転換体の培養は、例えば、液体培地および／または固形培地の中で行うことができる。本発明の方法で使用される培地は、いずれかの公知のかつ当該形質転換体の培養に適した培地、例えば、炭素源（グルコースまたはガラクトースなど）を含有しかつ特定の栄養分、例えば、ウラシルを欠くかまたは欠かない最小合成培地（ｍｉｎｉｍａｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｄｉａ）であることができる。

「定性的または定量的な分析」は、当該技術分野で公知の生細胞のいずれかの分析を意味する。例えば、「定性的または定量的な分析」は、例えば液体培地の吸光度を、例えば６００ｎｍで測定することにより、または目視で数えることにより、形質転換体が、例えば固形培地上で培養されるときの観察により、生細胞を数えるまたは採点する工程であることができる。「定性的または定量的な分析」は、例えば、試験分子に対する当該形質転換体の感受性についての試験室試験または試験分子の使用を伴う別の方法の結果であることもできる。例えば、「定性的または定量的な分析」は、拡散に基づく半定量的な方法（Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒ法）であることができる；試験分子を含有する小ディスクまたは含浸したペーパーディスクを、例えば寒天板（これは、当該形質転換体が成長することができる栄養分豊富な環境である）上の培養液の異なるゾーンに落とされる。試験するべき分子は、各ディスクを取り囲む領域に拡散する。「定性的または定量的な分析」は、例えば、希釈に基づく定量的な方法であることもできる：試験するべき分子の希釈系列が、つまり、例えば一系列の漸次的に下がる分子物質の濃度を有する反応バイアルが、確立される。

プロテアーゼの感受性または耐性は、例えば５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を測定することにより、分子とインキュベーションした形質転換体と分子とインキュベーションしていない形質転換体との間で生細胞数を比較することにより、推定することができる。

酵母が「切断されたＤＮＡ」（ニックの入ったＤＮＡ）を相同組み換えメカニズムによって修復する能力についての研究を考慮して、本出願人らは、この細胞事象の際に、ＤＮＡ分子は、相同配列を「ニッキング」部位に導入することおよび別のＤＮＡ分子の中に取り込まれることにより、その配列の中の正確な位置で修復されるということを見出した。明確な配列が、両側で、「ニッキング」部位の周囲に存在している配列と同一の配列によって構成されているのであれば、この生理現象を使用することにより、明確な配列を「ニックの入った」ＤＮＡ内に導入することが可能である。

組み換え事象が起こることができるための、２つのＤＮＡ分子に存在する相同配列の最小サイズは、およそ３０〜４０塩基対である。

この技術は、非常に有利なことに、特に操作の数を低減させることにより形質転換体を得ることを簡単にし、これは、必要な実験時間（公知のプロトコルと比べておよそ半分）および生産費用の著しい低減を伴う。この技術の使用により、非常に多くの試料を同時に取り扱うことも可能になる。

本発明の方法の実施の好ましい例の詳細な説明が以下に提供される。

実施例１
この実施例は、発現されたプロテアーゼが単離されたタンパク質であるとき、好ましく使用される。このプロテアーゼが、切断部位を含有するタンパク質前駆体のその切断部位の上流および下流に存在しているアミノ酸配列のすべてまたは一部とともに発現される場合、上で開示されたプライマーおよびヌクレオチド断片は、それに応じて改変されることになる。

１）発現ベクターの調製および修飾：
修飾の目的は、研究した各感染した個体を感染させているウイルスに由来するプロテアーゼの遺伝子をサブクローニングできるようにし、かつ得たプロテアーゼ遺伝子を用いて、簡単でかつ迅速な手順（一工程手順）によって、酵母を形質転換できるようにすることである。

本出願人らは、発現するべき遺伝子のクローニング部位の５’位に誘導性プロモーターＧＡＬ１／１０を含むベクターｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０（Ｌｉｕ Ｈ、Ｋｒｉｚｅｋ Ｊ、およびＢｒｅｔｓｃｈｅｒ Ａ．、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＧＡＬ−１ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｙｅａｓｔ ｃＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｗｈｏｓｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｕｓｅｓ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ｙｅａｓｔ」、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９２年、第１３２巻、６６５−６７３頁）の改変版を作成した。

このため、細胞がこのベクターを用いてガラクトースの存在下で形質転換されるとき、当該ウイルス遺伝子は発現され、細胞が炭素源としてのグルコースの存在下で形質転換されるとき、当該遺伝子は発現されない。

増幅したウイルスのＤＮＡの断片が相同組み換えによって発現ベクターに挿入されることが可能なように、このベクターは、このベクターに、誘導性プロモーターの配列の直後に、およそ４０塩基対のプライマー５’、次いで（このベクターを直線化することができるための）１つの制限酵素部位、およびおよそ４０塩基対のプライマー３’を付加することにより、改変する必要がある。この改変して直線化したベクターは、相同組み換え事象にとっては良好な基質であるが、５’位（遺伝子とプロモーターとの間）に導入される配列は、この遺伝子の転写を阻害してはならない。

発現ベクターｐＲＳ３１６−Ｇａｌ １／１０の改変版を生成するために、本出願人らは、この部位のＢａｍＨＩ−Ｓａｃ１断片を、同じく（５’から３’へ）：
−当該ベクターの中でユニークな、ＢａｍＨ１制限酵素部位、次いで
−当該プロテアーゼのすぐ上流に存在しているＨＩＶ−２配列の３５〜４５ヌクレオチド、次いで
−当該ベクターの中でユニークな、ＮｏｔＩ制限酵素部位、次いで
−当該プロテアーゼのすぐ下流に存在しているＨＩＶ−２配列の３５〜４５ヌクレオチド、次いで
−当該ベクターの中でユニークな、Ｓａｃ１制限酵素部位
を含有する、ＢａｍＨ１−Ｓａｃ１制限酵素部位によって構成される別のＤＮＡ断片と交換した。

およそ８０〜９０塩基対というこの断片のサイズへの改変は、実験上のクローニング、形質転換および発現系を最適化するために行った。試験した１０種の異なる改変した断片のうちのただ１つの改変した断片が、当該ウイルスプロテアーゼの相同組み換えおよび発現のためには十分であった。

この断片の配列は以下のとおりである：
（配列番号１）
５’ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＣＡＣＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＡＧＡＧＣＣＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＡＡＡＧＣＧＡＧＣＴＣ ３’
このように改変したｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０発現ベクターをｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０Ｍと呼ぶ。

２）細胞系の選択
当該ウイルスプロテアーゼを発現する形質転換体の選択を可能にするために必要な栄養素要求性マーカーを有する任意の酵母株、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）のいずれかの株。

３）レトロウイルスに感染した個体のプロテアーゼのサブクローニング、および一工程での酵母の形質転換
当該ＨＩＶ−２プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲ技術によって２回増幅する。

第１の増幅で、なかりの量のＤＮＡが生成する。この反応は、感染した個体の末梢血のリンパ球から抽出したＤＮＡを使用して行う。使用したヌクレオチドプライマーは下記の種類のものである：
（配列番号２）
センスプライマー：５’−ＧＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＣＧＣＡＡＣＴＴＣ−３’
（配列番号３）
アンチセンスプライマー：５’−ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡ−３’。

第２の増幅は、転写の開始コドン（ＡＴＧ）および転写の終止コドン（ＴＡＡ）をもつプロテアーゼを構成し、そして両側に、本出願人らがベクターを改変したときに本出願人らがそのベクターに導入したおよそ４０ヌクレオチドの配列を付加する。このＰＣＲ反応は、下記の種類のプライマーを用いて、第１のＰＣＲの産物に対して行う：
（配列番号４）
センスプライマー：５’−ＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＣＡＣＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＴＧＣＣＴＣＡＡＴＴＣ−３’
（配列番号５）
アンチセンスプライマー：５’ＧＣＧＧＡＧＣＴＣＧＣＴＴＴＡＧＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＣＴＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＧＡＴＴ−３’。

開始コドンおよび終止コドンによってプロテアーゼを構成することは、単離したプロテアーゼまたは切断部位が存在している前駆体のその切断部位の上流および下流に存在しているアミノ酸配列のすべてもしくは一部を含むタンパク質を構成することである。

ＮｏｔＩ制限酵素によって切断されたｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０Ｍベクターと第２のＰＣＲの産物との同時形質転換により、細胞の中で起こる相同組み換え事象を通して、誘導性プロモーターＧａｌの制御下のＨＩＶ−２プロテアーゼの配列を保有する形質転換された酵母細胞を得ることが可能になる（図１および図２）。

４）試験
末梢血の試料を、ＨＩＶ−２に感染した個体から採取する。この試料採取から生じるリンパ球を精製するかまたは精製せず、そしてそれらのＤＮＡを公知の方法によって抽出する。

このＤＮＡは２つの上述のＰＣＲ反応を経て、切断部位が存在している前駆体のその切断部位の上流および下流に存在しているアミノ酸配列の一部を有するかまたは有しないプロテアーゼの配列を保有しかつ形質転換された細胞の中で相同組み換えの現象を引き起こすために発現ベクターと適合する、ＤＮＡの断片を作製する。

第２のＰＣＲの産物の精製後、遺伝子型ｕｒａ３を有する酵母株を、ｐＲＳ３１６Ｇａｌ１／１０Ｍ線状ベクター（そのＮｏｔＩ部位による）を用いて同時形質転換する。

当該プロテアーゼを産生する可能性がある形質転換体を、例えば寒天から構成されるゲロース、炭素源としてのグルコース、およびウラシルを欠く合成環境などのいずれかの適切な担体上に回収する。

１つの形質転換体から生じるおよそ１０^５細胞を、９６穴プレートを用いて、１２のウェルに入れて分配し、試験するべき各阻害剤の１１の増加する濃度の存在下で、ガラクトース中でインキュベーションする。１２番目のウェルは、阻害剤をまったく含有しない。

３０℃で３６〜４８時間後、この生細胞を、６００ｎｍでのデンシトメトリー法による読み取りによって数える（図３）。

薬物の不存在下でかつグルコースの存在下での細胞成長と比べて、これらの条件下で細胞成長の半分を阻害するために必要な用量（ＩＣ^５０）は、この特定の株の易罹患性または耐性を決定する。

この試験を、この試料採取から生じる、精製されたかまたは精製されていない血漿に対しても行い、そしてそれらのＲＮＡまたはＤＮＡを公知の方法によって抽出した。この場合、これらの核酸は、それらがＲＮＡタイプのものであれば上述のＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ反応を受け、それらがＤＮＡタイプのものであればＲＴ段階はなかった。

採血と耐性プロファイルの決定との間の時間間隔は、わずか一週間であった。

実施例２
この実施例では、発現ベクターを以下のとおりに修飾した。

ベクターｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０の第１の改変版を、このベクターのＢａｍＨ１−Ｓａｃ１断片を、同じく（５’から３’へ）：
−当該ベクターの中でユニークな、ＢａｍＨ１制限酵素部位、次いで
−ＨＩＶ−１プロテアーゼコード配列の後に存在しているアミノ酸をコードする約４０ヌクレオチド、次いで
−終止コドン、次いで
−当該ベクターの中でユニークな、Ｓａｃ１制限酵素部位
を含有する、ＢａｍＨ１−Ｓａｃ１制限酵素部位によって構成されるＤＮＡ断片と交換することにより作製した。

プロテアーゼコード配列の後に存在しているアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の修飾を、実験上のクローニング、形質転換および発現系のために行った。当該プロテアーゼコード配列およびそれに続く１３のアミノ酸からなる、ウイルスプロテアーゼの前駆体形態の選択された相同組み換えおよび発現のために作製し試験したいくつかの改変した断片の中から、１つの例として：
（配列番号５６）
５’−ＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＧＡＧＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＡＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣ−３’（ｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０ Ｍ−３の作製用）
が挙げられる。

ベクターｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０の第２の改変版を、このベクターのＢａｍＨ１−Ｓａｃ１断片を、同じく（５’から３’へ）：
−当該ベクターの中でユニークな、ＢａｍＨ１制限酵素部位、次いで
−開始コドン、次いで
−ＨＩＶ−１プロテアーゼコード配列の前に存在しているアミノ酸をコードするおよそ２０ヌクレオチド、次いで
−当該ベクターの中でユニークな、ＸｈｏＩ制限酵素部位、次いで
−ＨＩＶ−１プロテアーゼコード配列の後に存在しているアミノ酸をコードするおよそ４０ヌクレオチド、次いで
−終止コドン、次いで
−当該ベクターの中でユニークな、Ｓａｃ１制限酵素部位
を含有する、ＢａｍＨ１−Ｓａｃ１制限酵素部位によって構成されるＤＮＡ断片と交換することにより作製した。

プロテアーゼコード配列の前後に存在しているアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の修飾を、実験上のクローニング、形質転換および発現系のために行った。ウイルスプロテアーゼの前駆体形態、この場合は配列番号１５のタイプの短鎖前駆体、の選択された相同組み換えおよび発現のために作製し試験したいくつかの改変した断片の中から、１つの例として：
（配列番号５７）
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＴＣＣＴＡＴＴＧＡＧＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＡＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣ（ｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０Ｍ−４の作製用）
が挙げられる。

２）細胞系の選択
当該ウイルスプロテアーゼを発現する形質転換体の選択を可能にするために必要な栄養素要求性マーカーを有する任意の酵母株、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）のいずれかの株。この実施例では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）を使用した。

３）レトロウイルスに感染した個体のプロテアーゼのサブクローニング、および一工程での酵母の形質転換
ＨＩＶプロテアーゼをコードする核酸配列、またはその前駆体形態のいずれかを、ＲＴ−ＰＣＲ技術、次いで実施例１にあるようなＰＣＲ反応によって増幅した。

ＲＴ−ＰＣＲ反応のために使用したヌクレオチドプライマーは、下記の種類のものである：
（配列番号５２）
プライマー５’ＧＰ７：ＡＴＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴＧＴＧＡＧＧＧＡＧ、および
（配列番号５３）
プライマー３’Ｒ７７２：ＣＣＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＡＹＡＡＹＡＣ。

第２のＰＣＲ反応は、下記の種類のプライマーのいずれかを用いて、第１のＰＣＲの産物に対して行う：
（配列番号５５）
プライマーＲ２１３９Ｓ１：ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＴＧＧＡＣ、および
（配列番号５８）
プライマー５’Ｆ−ｐｃ−ｒｈ：ＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣ
または、下記の種類のプライマー：
（配列番号５５）
プライマーＲ２１３９Ｓ１：、および
（配列番号４２）
プライマー５’Ｆ３：ＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＧＣＣＴＣＡＧＡＴＣ。

１つの場合では、プライマー配列番号４２および５５を用いて実施した、ＢａｍＨ１制限酵素によって切断したｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０Ｍ−３ベクターと、第２のＰＣＲの産物との同時形質転換により、細胞の中で起こる相同組み換え事象を通して、誘導性プロモーターＧａｌの制御下の、当該プロテアーゼコード配列、およびそれに続く１３のアミノ酸からなる、ＨＩＶ−１プロテアーゼの前駆体形態の配列を保有する形質転換された酵母細胞を得ることが可能になる。

他の場合では、プライマー配列番号５４および５５を用いて実施した、ＸｈｏＩ制限酵素によって切断したｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０Ｍ４ベクターと、第２のＰＣＲの産物との同時形質転換により、細胞の中で起こる相同組み換え事象を通して、誘導性プロモーターＧａｌの制御下の、ＨＩＶ−１プロテアーゼの前駆体形態の配列（配列番号１５と同様）を保有する形質転換された酵母細胞を得ることが可能になる。

４）試験
末梢血の試料を、ＨＩＶ−１に感染した個体から採取する。この試料採取から生じる血漿またはリンパ球を精製するかまたは精製せず、そしてそれらのＲＮＡまたはＤＮＡを、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）（オランダ）製のＱ１Ａａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔのような、公知の抽出キットによって抽出する。

これらのウイルス核酸は、実施例１で明記した処理と同じ処理を受け、当該プロテアーゼ前駆体をコードするＤＮＡ配列を増幅させる。

第２のＰＣＲの産物の精製後、遺伝子型ｕｒａ３を有する酵母株を、ｐＲＳ３１６Ｇａｌ１／１０Ｍ−３線状ベクター（そのＢａｍＨ１部位による）を用いて同時形質転換するか、またはｐＲＳ３１６Ｇａｌ１／１０Ｍ−４線状ベクター（そのＸｈｏＩ部位による）を用いて同時形質転換する。

当該プロテアーゼを産生する可能性がある形質転換体を、例えば寒天から構成されるゲロース、炭素源としてのグルコース、およびウラシルを欠く合成環境などのいずれかの適切な担体上に回収する。

１つの形質転換体から生じるおよそ１０^５細胞を、９６穴プレートを用いて、１２のウェルに入れて分配し、試験するべき各阻害剤の少なくとも８の増加する濃度の存在下で、液体または固体のガラクトース含有培地のいずれかの中でインキュベーションした。１つのウェルは、阻害剤をまったく含有しない。

３０℃で３６〜４８時間後、この生細胞を、試験を液体培地中で実施したときは６００ｎｍでのデンシトメトリー法による読み取りによって数え（図４）、または試験を固形培地中で実施したときは目視によって数えた。

薬物の不存在下でかつグルコースの存在下での細胞成長と比べて、これらの条件下で細胞成長の半分を阻害するために必要な用量（ＩＣ^５０）は、この特定の株の易罹患性または耐性を決定する。

採血と耐性プロファイルの決定との間の時間間隔は、わずか一週間であった。

実施例３
プロテアーゼ配列増幅の例
１）完全なプロテアーゼ前駆体配列
完全なプロテアーゼ前駆体配列を、実験用ウイルスのｐＮＬ４．３ ＤＮＡ株から、以下のプライマーを使用してＰＣＲによって増幅した：
（配列番号３８）
５’プライマー Ｆ−ＧａｇＰｏｌ ＧＣＧＧＡＧＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡ、および
（配列番号３９）
３’プライマー Ｒ−ＧａｇＰｏｌ ＣＴＡＡＴＣＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＧＴＴＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＡＣＴＴＧ。

使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりであった。

９５℃で３分、次いで３５サイクルの、９５℃で１分、５５℃で３０秒、７２℃で２分、そして７２℃で７分の１ラウンドで終わる。

ＰＣＲ産物（配列番号１８）を標準的手順によって精製し、製造業者の推奨手順に従って制限酵素ＸｂａＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）によって消化し、そして一晩のＤＮＡライゲーション（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、米国製のＴ４ ＤＮＡリガーゼ）を通して、製造業者の推奨手順のとおりに、それまでにＸｂａＩで消化したｐＲＳ３１６−Ｇａｌ／１０ベクターへと導入した。

２）プロテアーゼコード配列の始まりで始まり、かつおよびＰｏｌコード領域の末端で終わるプロテアーゼ前駆体配列（配列番号３７）
精製したＤＮＡ構築物に対して、項目１で得たｐＲＳ３１６−Ｇａｌ／１０ベクターの中でＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ条件および他の実験は、これまでの項目１に記載した条件と同じ条件であった。

ｇａｇ−ｐｏｌコード配列の末端までのプロテアーゼコード配列由来のプロテアーゼ前駆体配列を、以下のプライマーを使用して得た：
（配列番号４２）
５’プライマーＦ３：ＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＡＴ ＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＧＣＣＴＣＡＧＡＴＣ、および
（配列番号４３）
３’プライマーＭ１３Ｆ：ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＣＡＣＧ（増幅工程用）。

これらのプライマーは、当該発現ベクターの中のクローニング部位の両側に存在している配列を提供するために選択した。

線状のｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０ベクター（ＢａｍＨ１で消化した）と、ＰＣＲ産物との同時形質転換により、細胞の中での組み換え事象によって、誘導性のＧａｌプロモーターの制御下の、前駆体配列を保有する形質転換された酵母を生成した。

３）異なるサイズのプロテアーゼ前駆体配列
この実施例では、これまでの項目２で得た構築物を使用した。

プロテアーゼで始まりｐｏｌ領域の末端で終わるｇａｇ−ｐｏｌ前駆体配列を含有するプラスミドを、製造業者の推奨手順に従って制限酵素ＸｈｏＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）を用いた消化によって直線化した。

その後、６μｇの直線化したプラスミドを、製造業者の推奨手順に従って、１単位のＢａｌ３１エキソヌクレアーゼ酵素（バイオラブズ（ＢｉｏＬａｂｓ）、米国）を用いて３０℃で消化した。２時間のインキュベーションの間、２０分ごとに等しい一定分量を採取し、２５ｍＭ ＥＤＴＡを用いてこの反応を停止した。これにより、異なるサイズのＤＮＡの部分消化物および断片が生成された。これらの断片は各Ｂａｌ３１消化アリコートの中に存在し、これらを、１μｇのＤＮＡに対して５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドの比で以下の二重鎖オリゴヌクレオチドにライゲーションした：
（配列番号４４）
センスＧａｌ−ｇｐ−ｒｈ：ＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＡＣＧＡＴＧＴＡＣＧＡＴＧ
（配列番号４５）
アンチセンスＧａｌ−ｇｐ−ｒｈ：ＡＴＡＴＧＡＡＡＴＴＧＣＡＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＴＡＧＧＴＡＣＡＴＧＣＴＡＣＡＴＧＣＴＡＣ
（配列番号４６）
センスＭ１３−ｇｐ−ｒｈ：ＴＡＡＴＡＧＧＴＡＡＴＡＧＧＴＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣＡＡＴ
（配列番号４７）
アンチセンスＭ１３−ｇｐ−ｒｈ：ＡＴＴＡＴＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＧＣＧＧＧＡＴＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＴＡＡＴＧＴＴＡ。

これらのオリゴヌクレオチドは、開始コドンおよび終止コドンならびにｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０ベクターと同一の配列をさらに含有する。

製造業者の推奨手順に従った、ＢａｍＨ１−Ｓａｃ１酵素によって直線化したｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０ベクターと、Ｋｐｎ１制限酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）で予め消化したライゲーション産物との同時形質転換により、細胞で行われる相同組み換えによって、各々が、誘導性プロモーターＧａｌの制御下の、プロテアーゼ配列で始まるｇａｇ−ｐｏｌ前駆体の１つのＣ末端が欠失した形態を保有する形質転換された酵母のライブラリーが生成される。

４）Ｇａｇ−Ｐｏｌ遺伝子転写の天然のオープンリーディングフレームシフトを模倣するための１つの変異（１つのＡヌクレオチドの付加）を含む切断されたプロテアーゼ前駆体配列
ＰＣＲ条件および他の実験は、これまでの項目１に記載した条件と同じであった。

１６３８位に付加的なＡヌクレオチドを含有する変異した前駆体配列を作製した。ＰＣＲ反応のために使用したプライマーは以下のものであった：
（配列番号４９）
プライマー５’−ａ４３５：ＣＡＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＧＧＧ、
（配列番号５０）
プライマーＲ−ａ４３５：ＣＣＣＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＴＧ、
（配列番号５１）
プライマーＦ１０７１Ｂ１：ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＣＣＡＴＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＴＴＴＧ、および
（配列番号５５）
プライマーＲ２１３９Ｓ１：ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＴＧＧＡＣ。

変異した前駆体を２工程のＰＣＲで作製した。第１のＰＣＲでは、これまでの項目２で得た構築物を鋳型として使用する２つの独立の反応には、当該配列の１６３８位にさらなるＡ（アデニン）を導入するために、プライマーの対、１つについては配列番号４９および配列番号５５、そして２つ目については配列番号５０および配列番号５１が関与した。

これらの２つのＰＣＲ産物を混合し、希釈して第２のＰＣＲのための鋳型とし、第２のＰＣＲを、プライマー配列番号５１および配列番号５５を用いて実現した。新しく得たＤＮＡ断片を、製造業者の推奨手順に従ってＢａｍＨ１およびＳａｃ１制限酵素（それぞれ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国およびフェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、カナダ）で消化し、予め製造業者の推奨手順に従ってＢａｍＨ１およびＳａｃ１制限酵素（それぞれ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国およびフェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、カナダ）で消化したｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０ベクターの中で、製造業者の推奨手順に従って、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ギブソ（Ｇｉｂｓｏ）、米国）を用いてライゲーションした。

５）感染した患者由来のＨＩＶ−１プロテアーゼの前駆体配列をクローニングする
ＨＩＶ−１プロテアーゼ前駆体形態コード配列を、実施例２に記載したようにして、感染した患者の血漿から抽出した精製した全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ、次いでＰＣＲ反応によって増幅した。

このＲＴ−ＰＣＲ反応のために使用したプライマーは、以下のとおりである：
（配列番号５２）
プライマー５’ ＧＰ７：ＡＴＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴＧＴＧＡＧＧＧＡＧ、および
（配列番号５３）
プライマー３’ Ｒ７７２：ＣＣＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＡＹＡＡＹＡＣ。

第２の増幅は、転写の開始コドン（ＡＴＧ）と転写の終止コドン（ＴＡＡ）との間にプロテアーゼを構成する。ＡＴＧは、当該プロテアーゼの第１のコドンの７０ヌクレオチド上に存在していた。ＴＡＡは、最後のコドンの１５０ヌクレオチド下に存在していた。さらに、酵母の中で相同組み換えにより当該ベクターに対応する配列をクローニングするために、この第２の増幅は、両側に、その当該ベクターに対応する配列を付加する。このＰＣＲは、以下のプライマーを用いて、第１のＰＣＲ産物に対して行った：
（配列番号５５）
プライマーＲ２１３９Ｓ１：ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＴＧＧＡＣ、および
（配列番号５４）
プライマー５’ Ｆ−ｐｃ−ｒｈ：ＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣ。

実施例４
ＨＩＶ−１感染した個体由来のプロテアーゼの耐性／感受性を判定する実施例

配列番号１５のサイズの、短鎖のＨＩＶ−１プロテアーゼ前駆体形態のコード配列を、ロピナビル（ｌｏｐｉｎａｖｉｒ）、サクイナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）およびダルナビル（ｄａｒｕｎａｖｉｒ）などのプロテアーゼ阻害剤に対して耐性をもつＨＩＶ−１株を保有することがわかっていた感染した患者、つまりＰ＃１０、の血漿から抽出した精製した全ＲＮＡから、実施例２に記載したとおりに、ＲＴ−ＰＣＲ、次いでＰＣＲ反応によって増幅した。

あとの手順は、以下のプライマーを使用するが、実施例３（５）に記載したとおりであった：
ＲＴ−ＰＣＲ工程用に、
（配列番号５２）
プライマー５’ ＧＰ７：ＡＴＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴＧＴＧＡＧＧＧＡＧ、および
（配列番号５３）
プライマー３’ Ｒ７７２：ＣＣＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＡＹＡＡＹＡＣ、
ならびに第２の増幅用に、プライマー：
（配列番号５５）
プライマーＲ２１３９Ｓ１：ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＴＧＧＡＣ、および
（配列番号５４）
プライマー５’ Ｆ−ｐｃ−ｒｈ：ＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣ。

得た最終のＰＣＲ産物を、実施例２（３）に記載した同時形質転換する一工程手順によって、ｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０Ｍ−４へとクローニングした。形質転換された酵母細胞は、以下の遺伝子型を有する株ＢＹ４７４１（ユーロスカーフ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）、ドイツ）のものであった：ＭＡＴａ、ｈｉｓ３．Δ．１、ｌｅｕ２．Δ．０、ｍｅｔ１５．Δ．０、ｕｒａ３．Δ．０。

ロピナビル、サクイナビルおよびダルナビル分子がクローニングされたプロテアーゼを阻害する能力、従って耐性パターンを決定するために、実施例３（５）に記載した手順を実施して、感受性があるプロテアーゼおよび耐性があるプロテアーゼを発現する酵母細胞を得た。クローニングされたプロテアーゼの感受性または耐性は、液体培地中および固形培地中で判定した。

耐性の試験を液体培地中で実施した場合、試験した分子のより高い濃度は、以下のとおりであった：
ロピナビルについては５０μＭ、
ダルナビルについては１００μＭ、
サクイナビルについては４００μＭ、
これらの溶液の７段階希釈が、１対１で、試験において存在した。

並行して、同じ手順に従って、同じプロテアーゼ阻害剤が、ＢＹ４７４１酵母形質転換体の中で発現された短鎖のプロテアーゼ前駆体形態（配列番号１５）に対して作用する能力を試験した。この場合、精製した、全感受性株ＨＩＶ−１ゲノムを保有するｐＮＬ４．３プラスミドに対して、以下のプライマーを使用するＰＣＲ反応によってＤＮＡ増幅を実施した：
（配列番号５５）
プライマーＲ２１３９Ｓ１：ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＴＧＧＡＣ、および
（配列番号５４）
プライマー５’ Ｆ−ｐｃ−ｒｈ：ＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣ。

得られた結果は、阻害剤濃度の関数としての生細胞の百分率として図５ａに提示するが、その結果は：
ｉ）患者Ｐ＃１０から増幅したウイルスプロテアーゼの前駆体に関する、試験した３つの阻害性分子によるウイルスプロテアーゼの阻害の欠如
ｉｉ）野生型ＨＩＶ−１株、つまりｐＮＬ４．３から増幅した感受性ウイルスプロテアーゼの前駆体に関する、試験した３つの阻害性分子による感受性ウイルスプロテアーゼの阻害。

データをソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ５．０（グラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｃ）、米国）によって処理し、対応するＩＣ５０値を得た。このＩＣ５０値を表１に示す：

それゆえ、患者Ｐ＃１０由来のウイルスプロテアーゼは、試験した阻害剤分子に対して耐性を有する。

固形培地中で耐性の試験を実施した場合、各ウイルスプロテアーゼを発現する酵母形質転換体を、２％ガラクトースの存在下で合成最小培地、寒天板上にプレーティングした。０．５ｍＭロピナビル、０．５ｍＭダルナビル、または１ｍＭサクイナビルのいずれかの１０μｌを含浸した５ｍｍ直径のペーパーディスク（Ｍｉｎｉｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ、バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、米国）を、プレートの中央に置いた。３０℃で３日後、肉眼による観察を実施した。発現されたウイルスプロテアーゼが当該阻害剤に対して感受性であった場合、成長している細胞のハローを観察したが、他方、形質転換された酵母の中で発現されたウイルスプロテアーゼが阻害剤に対して耐性がある場合は、成長する細胞は観察されなかった（図５ｂ）。

この実施例で実証されたように、当該方法により、分子に対するＨＩＶレトロウイルスの分離株の感受性または耐性の判定が可能になる。

実施例５
レトロウイルスに対する耐性についての診断用キット
診断用キットも、ウイルスプロテアーゼの阻害剤に基づく治療的レトロウイルス処置に対する、レトロウイルス分離株の感受性または耐性を判定する。その診断用キットは、以下のものを含んでもよい：
ヌクレオチドプライマーおよび、例えばＰＣＲ技術による、レトロウイルスプロテアーゼをコードするＤＮＡの増幅の実施のためにこれまでに開示されたヌクレオチドプライマー、つまり：
第１の増幅用には、下記の種類のプライマー：
（配列番号２）
センスプライマー：５’−ＧＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＣＧＣＡＡＣＴＴＣ−３’
（配列番号３）
アンチセンスプライマー：５’ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡ−３’
第２の増幅用には、下記の種類のプライマー：
（配列番号４）
センスプライマー：５’ＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＣＡＣＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＴＧＣＣＴＣＡＡＴＴＣ３’
（配列番号５）
アンチセンスプライマー：５’ＧＣＧＧＡＧＣＴＣＧＣＴＴＴＡＧＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＣＴＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡ ＧＡＴＴ３’および／または配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４８、５１〜５８を含む群から選択されるプライマー；
少なくとも１つの発現ベクターおよび、例えば、本発明の方法に従って、そしてこれまでに記載されたとおりに改変され直線化されたプラスミド、例えば、プラスミドｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０Ｍ、Ｍ−３、Ｍ−４；
当該ウイルスプロテアーゼを発現する形質転換体の選択を可能にするための必要な栄養素要求性マーカーを有する少なくとも１つの酵母株、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）の株；および
少なくとも１つの多穴プレートまたは任意の他の適切な支持体。

当然、切断部位を含有するタンパク質前駆体のその切断部位の上流および下流に存在しているアミノ酸配列のすべてもしくは一部を有するレトロウイルスのプロテアーゼをコードするＲＮＡまたはＤＮＡに対して増幅が実施される場合、上記プライマーおよびヌクレオチド断片はそれに応じて改変されることになる。

当該キットの原理は図４にも図示されているが、以下のとおりである。

患者の血液を使用して、当該ウイルスプロテアーゼをコードする遺伝子が、上記方法で記載されかつ当該キットの中に供給されているプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ反応によって増幅される。

細胞ＤＮＡを使用する当該ウイルスプロテアーゼの遺伝子の増幅も可能である。

増幅産物および改変され直線化されたベクター（これも当該キットの中に供給されている）が、多穴プレートの中で酵母株（これも当該キットの中に供給されている）を形質転換するために使用される。

好ましい（が決して限定するわけではない）方法では、グルコースを含有する選択的な培地の中での、乾燥器の中での３０℃でのインキュベーション後に、２μｌの細胞懸濁液を、治療の中で使用される各有効成分の増加する濃度を含有する新しいプレート（当該キットの中に供給されている）に移す。３００μｌの、ガラクトースを含有する選択した培地を各ウェルに加え、その後、乾燥器の中で、３０℃で３６〜４８時間、インキュベーションする。

インキュベーションの終わりで、例えば、支持体が液体培地である場合は、６００ｎｍでのデンシトメトリー法による読み取りによって生細胞を数える。ウイルスプロテアーゼを発現しない酵母株の細胞成長と比べて、半分の細胞成長を阻害するために必要な用量は、各阻害剤についてのＩＣ^５０を決定する。得られたＩＣ_５０と、基準の野生型プロテアーゼのＩＣ_５０とを比較することにより、いずれかの耐性表現型を判定することができる。

インキュベーションの終わりで、例えば、実施例４のように支持体が固体である場合は、形質転換された酵母の成長がある（感受性あり）かまたは成長がない（耐性あり）かどうかを単に判定することにより、肉眼による観察で、分子、例えば特定の阻害剤に対する、感染した個体由来のウイルスプロテアーゼのＨＩＶプロテアーゼの感受性／耐性を決定する。

血液の採取と、耐性プロファイルの決定との間の時間間隔はわずか一週間である。

本発明の方法をその特定の形態に関連して記載してきたが、添付の特許請求の範囲に記載される本開示の趣旨および範囲から逸脱せずに、実に様々な均等物で、本願明細書に記載された特定の要素／工程を置き換えてもよいということは理解されるであろう。

また、本開示は、種々の刊行物を参照し、特定する。それらの刊行物の内容は、参照により本願明細書に援用したものとする。

Claims (21)

1. 分子に対するＨＩＶレトロウイルスの分離株の感受性または耐性を判定する方法であって、
   ａ）活性なプロテアーゼ前駆体であって、
   前記プロテアーゼ前駆体は、Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体に存在するＨＩＶプロテアーゼ配列と、
   前記Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体における前記ＨＩＶプロテアーゼ配列のＮ末端からＮ末端側に数えて少なくとも６つのアミノ酸と、
   前記Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体における前記ＨＩＶプロテアーゼ配列のＣ末端からＣ末端側に数えて少なくとも１つのアミノ酸と、を含むプロテアーゼ前駆体
   をコードする配列を増幅する工程と、
   ｂ）前記増幅の最終産物と、該増幅の最終産物にコードされる、活性なプロテアーゼ前駆体であって、
   前記プロテアーゼ前駆体は、Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体に存在するＨＩＶプロテアーゼ配列と、
   前記Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体における前記ＨＩＶプロテアーゼ配列のＮ末端からＮ末端側に数えて少なくとも６つのアミノ酸と、
   前記Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体における前記ＨＩＶプロテアーゼ配列のＣ末端からＣ末端側に数えて少なくとも１つのアミノ酸と、を含むプロテアーゼ前駆体、
   の発現を誘導性プロモーターの制御下で許容する発現ベクターとを、前記増幅の最終産物及び前記ベクターと少なくとも１つの酵母細胞との同時形質転換を介して、相同組み換えによって発現可能に組み換える工程と、
   ｃ）同時形質転換された酵母細胞を培養して、感受性または耐性の試験を実施するのに十分な数の形質転換体を得て、そして前記同時形質転換された細胞から生じる形質転換体を、任意の適切な培地上に回収する工程と、
   ｄ）試験するべき分子の存在下で、前記形質転換体をインキュベーションする工程と、
   ｅ）前記形質転換体を定性的にまたは定量的に分析する工程と、
   ｆ）前記感受性または耐性の表現型を推定する工程と、
   を含む方法。
2. 前記レトロウイルスはＨＩＶ１である、請求項１に記載の方法。
3. 前記方法は、プロテアーゼ前駆体である前記プロテアーゼの自然の基質に対する前記プロテアーゼの活性に対して直接的な効果を有する分子を試験することを可能にする、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記活性なプロテアーゼ前駆体をコードする配列は、Ｇａｇ−Ｐｏｌ遺伝子転写の天然のオープンリーディングフレームシフトを模倣する、配列番号１８の５’末端から数えて１６３８位に付加的なＡヌクレオチドを含有する変異した前駆体配列である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
5. 工程ａ）の前に、ｉ）レトロウイルスに感染した細胞および／またはｉｉ）感染した動物由来の体液、および／またはｉｉｉ）感染した動物由来の血液、および／またはｉｖ）感染した培養細胞培地から核酸を抽出する工程を含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記核酸はＤＮＡおよび／またはＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
7. 前記核酸は、レトロウイルスに感染した個体もしくは動物、および／またはｉｉ）感染した動物由来の体液、および／またはｉｉｉ）感染した動物由来の血液、および／またはｉｖ）感染した培養細胞培地、から採取された細胞から抽出される、請求項５に記載の方法。
8. 前記分子は、ライブラリーの分子、化学分子、天然分子および植物から抽出された分子からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
9. 前記分子は、前記ウイルスプロテアーゼに対する阻害活性を有する化学分子、前記ウイルスプロテアーゼの阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
10. 前記インキュベーションは、複数の分子濃度で実施される、請求項１に記載の方法。
11. 前記活性なプロテアーゼ前駆体をコードする配列からなる核酸は、配列番号５２および配列番号５３、配列番号５５および配列番号４２、４９、５４、または５８、配列番号３８および配列番号３９、配列番号４２および配列番号４３、ならびに、配列番号５０および配列番号５１からなる群から選択されるプライマー対を用いて増幅される、請求項１に記載の方法。
12. 前記活性なプロテアーゼ前駆体をコードする配列からなる核酸は、配列番号１２である、請求項１に記載の方法。
13. 前記発現ベクターはプラスミドｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０Ｍである、請求項１に記載の方法。
14. 前記発現ベクターは、発現するべき遺伝子のクローニング部位の５’位に誘導性プロモーターＧａｌ１／１０を含むプラスミドｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０Ｍであり、かつ、断片ＢａｍＨ１−Ｓａｃ１は（５’から３’へ）：
    前記ベクターの中でユニークなＢａｍＨ１制限酵素部位、次いで前記プロテアーゼのすぐ上流に存在しているレトロウイルス配列の中の２０ヌクレオチド、次いで前記ベクターの中でユニークな制限酵素部位、次いで前記プロテアーゼの下流に存在している前記レトロウイルス配列、次いで前記ベクターの中でユニークなＳａｃ１制限酵素部位、
    からなる別のＤＮＡの断片で置き換えられている、請求項１２に記載の方法。
15. 前記レトロウイルス配列の中の前記２０ヌクレオチドは、前記プロテアーゼの上流に存在しており、これにＸｈｏＩ制限酵素部位が続く、請求項１４に記載の方法。
16. 前記酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）である、請求項１に記載の方法。
17. 前記同時形質転換された酵母細胞の培地は、グルコースを欠く、請求項１に記載の方法。
18. 前記形質転換体のインキュベーションは、ガラクトースの中で行われる、請求項１に記載の方法。
19. 請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載の方法を実施する診断用キットであって、
    配列番号５２および配列番号５３、配列番号５５および配列番号４２、４９、５４、または５８、配列番号３８および配列番号３９、配列番号４２および配列番号４３、ならびに、配列番号５０および配列番号５１からなる群から選択されるヌクレオチドプライマー対と；
    少なくとも１つの発現ベクターと；
    少なくとも１つの酵母株と；
    少なくとも１つの多穴プレートまたは他の支持体と、
    とを含む、キット。
20. 前記発現ベクターはプラスミドｐＲＳ３１６−Ｇａｌ１／１０Ｍである、請求項１９に記載の診断用キット。
21. 前記酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）である、請求項１９に記載の診断用キット。

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