JP5783522B2

JP5783522B2 - Fish GTH protein and fish maturation induction method using the protein

Info

Publication number: JP5783522B2
Application number: JP2010036050A
Authority: JP
Inventors: 浩一郎玄; 行紀風藤; 和晴野村; 田中　秀樹; 秀樹田中
Original assignee: Fisheries Research Agency
Current assignee: Fisheries Research Agency
Priority date: 2010-02-22
Filing date: 2010-02-22
Publication date: 2015-09-24
Anticipated expiration: 2030-02-22
Also published as: JP2011168562A

Description

本発明は、魚類ＧＴＨタンパク質および該タンパク質を用いる魚類の成熟誘導方法に関する。さらに詳しくは、哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質、および生体内寿命が延長化された該タンパク質を用いる魚類の成熟誘導方法に関する。 The present invention relates to a fish GTH protein and a method for inducing fish maturation using the protein. More specifically, the present invention relates to a fish GTH protein to which a mammalian sugar chain is added, and a method for inducing fish maturation using the protein with an extended in vivo life span.

魚類の完全養殖のためには人工種苗の生産が不可欠である。しかし、飼育環境下では、ある一定の段階から生殖腺が発達しなくなる成熟停止が起こりやすい。魚種によって成熟停止の段階は異なるが、いずれにおいても、人為催熟を続けるには、成熟停止に至った段階で、外因性の成熟誘導ホルモン（例えば、生殖腺刺激ホルモンＧｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ（以下、「ＧＴＨ」とする）等）を投与することが必須となる。
しかし、ＧＴＨは複雑な構造を持つ糖タンパク質ホルモンであるため化学合成が難しく、哺乳類のＧＴＨ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Ｈｕｍａｎｃｈｏｒｉｏｎｉｃｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ（以下、「ｈＣＧ」とする））や魚のＧＴＨを含む組織抽出物が代用品として用いられているのが現状である。 Production of artificial seedlings is indispensable for the complete aquaculture of fish. However, in the breeding environment, maturation is stopped because the gonads do not develop from a certain stage. Although the stage of maturation differs depending on the fish species, in any case, in order to continue artificial ripening, at the stage of reaching maturation, an exogenous maturation-inducing hormone (for example, gonadotropin (hereinafter referred to as “GTH”) And the like) is essential.
However, GTH is a glycoprotein hormone having a complex structure, so that chemical synthesis is difficult, and tissue extracts containing mammalian GTH (human chorionic gonadotropin (hereinafter referred to as “hCG”)) and fish GTH. Is currently used as a substitute.

ウナギ等の卵原細胞から卵黄形成の初期の段階で成熟停止してしまう魚種においては、このような人為催熟によって完全養殖を行うことがかなり難しく、より有効な方法の提供が望まれていた。
そこで、近年、海水養殖池環境中において、養殖関係を構成する水流や温度などの要素を周期的に変動させることによって、外因性の成熟誘導ホルモンを投与することなく、ウナギ雌魚を催熟する方法が開発されている（例えば、特許文献１参照）。
また、ゼブラフィッシュ由来の細胞を用いて、魚類のホルモンを産生する細胞を作製し、この細胞を移植することで、ウナギ等の魚類の成熟を促進する方法が開発されている（例えば、特許文献２参照）。さらに、金魚やウナギ由来の遺伝子からＧＴＨを合成し、これを投与することでウナギの人為催熟を行う方法も検討されている（例えば、非特許文献１，２参照）。しかし、これらの方法においても、ウナギ等の人為催熟が困難な魚類においては、特に成熟誘導率が低い、卵質が不安定、仔魚の生残率が低い等、十分な結果が得られていない。 In fish species that ripen at the early stage of egg yolk formation from eel and other oocyte cells, it is quite difficult to carry out complete aquaculture by artificial ripening, and it is desired to provide a more effective method. It was.
Therefore, in recent years, eel female fish are ripened without administering exogenous maturation-inducing hormone by periodically changing the water flow and temperature that make up the aquaculture relationship in the seawater pond environment. A method has been developed (see, for example, Patent Document 1).
Also, a method for promoting the maturation of fish such as eel has been developed by producing cells that produce fish hormones using cells derived from zebrafish and transplanting the cells (for example, patent documents). 2). Furthermore, a method for artificially ripening eels by synthesizing GTH from a gene derived from goldfish or eel and administering it has been studied (for example, see Non-Patent Documents 1 and 2). However, even in these methods, sufficient results have been obtained such as low induction of maturation, unstable egg quality, and low survival rate of larvae, especially in fish that are difficult to artificially ripen, such as eels. Absent.

ヒト、ラット等の哺乳類のホルモン合成において、糖鎖結合部位を付加した各ホルモン遺伝子をチャイニーズハムスター等の哺乳類を由来とする細胞で合成することにより、哺乳類型糖鎖が付加された哺乳類ＧＴＨやエリスロポエチン等を合成する方法が行われている。そして、この方法によって得られたホルモンが、ヒト、ラット等において生体内寿命が延長化され、生物活性が高められたことが確認されている（非特許文献３〜６）。
近年、魚類においても、糖鎖結合部位を付加したＧＴＨ遺伝子をマイクロインジェクション法により導入することで、魚類の成熟を調節する方法や、これを昆虫細胞に発現させて得た昆虫型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨを魚類に導入することで、ウナギ等の人為催熟を行うことが検討されているが、十分な結果は得られておらず、有用な魚類の成熟誘導方法の提供が望まれている。 In the synthesis of hormones in mammals such as humans and rats, mammalian GTH and erythropoietin to which mammalian sugar chains are added by synthesizing each hormone gene with a sugar chain binding site in cells derived from mammals such as Chinese hamsters. Etc. are synthesized. And it has been confirmed that the hormone obtained by this method has an extended in-vivo life and increased biological activity in humans, rats and the like (Non-Patent Documents 3 to 6).
In recent years, in fish, GTH gene with added sugar chain-binding site has been introduced by microinjection method to control the maturation of fish and insect-type sugar chains obtained by expressing it in insect cells have been added. Although artificial ripening of eels and the like has been studied by introducing the fish GTH thus prepared into fish, sufficient results have not been obtained, and provision of a useful fish maturation induction method is desired. ing.

特開２００８−１５４４５９号公報JP 2008-15459 A 特開２００８−５２８２０７号公報JP 2008-528207 A

Ｈａｙａｋａｗａｅｔａｌ．，２００９Hayaka et al. , 2009 Ｋａｚｅｔｏｅｔａｌ．，２００８Kazeto et al. , 2008 Ｄｅｖｒｏｅｙｅｔａｌ．，２００４Devroyy et al. , 2004 Ｆｕａｓｅｔａｌ．，１９９２Fuas et al. , 1992 Ｆａｒｅｓｅｔａｌ．，２００７Fares et al. , 2007 Ｌａｐｏｌｔｅｔａｌ．，１９９２Lapolt et al. , 1992

本発明は、魚類ＧＴＨタンパク質の提供および該タンパク質を用いる魚類の成熟誘導方法を提供することを課題とする。 It is an object of the present invention to provide a fish GTH protein and a method for inducing fish maturation using the protein.

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、哺乳類細胞を用いて魚類ＧＴＨタンパク質を発現させることにより、哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質を得られることを見出した。この哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質は、生体内寿命が延長化された魚類体内において長期間の安定性を有する分解されにくいタンパク質であり、本発明者らはこのタンパク質を用いることによって魚類の成熟誘導が可能であることを見出し、本発明を完成方するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that fish GTH protein to which a mammalian sugar chain is added can be obtained by expressing fish GTH protein using mammalian cells. The fish GTH protein to which the mammalian sugar chain is added is a protein that has long-term stability and is difficult to be degraded in the fish body with an extended in-vivo life. The present inventors have found that fish maturation can be induced and have completed the present invention.

即ち、本発明は次の（１）〜（９）の魚類ＧＴＨタンパク質、魚類の成熟誘導方法および成熟が誘導された魚類等に関する。
（１）哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
（２）糖鎖結合部位を付加した魚類ＧＴＨを哺乳類細胞によって合成することにより得られる哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
（３）糖鎖結合部位を２つ以上付加した魚類ＧＴＨを合成することにより得られる上記（２）に記載の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
（４）糖鎖結合部位が配列表配列番号１あるいは２で示されるアミノ酸配列またはこれらのアミノ酸配列が保存的修飾された配列からなる部位である上記（１）または（２）に記載の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
（５）魚類ＧＴＨがウナギ由来のＧＴＨである上記（１）〜（４）のいずれかに記載の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質を用いる魚類の成熟誘導方法。
（７）上記（６）に記載の魚類の成熟誘導方法によって成熟が誘導された魚類。
（８）上記（６）に記載の魚類の成熟誘導方法によって成熟が誘導されたウナギ。
（９）上記（８）に記載のウナギより得られる精子または卵。 That is, the present invention relates to the following fish GTH proteins (1) to (9), a method for inducing maturation of fish, a fish in which maturation has been induced, and the like.
(1) Fish GTH protein to which a mammalian sugar chain is added.
(2) A fish GTH protein to which a mammalian sugar chain is added, which is obtained by synthesizing fish GTH to which a sugar chain binding site has been added, using mammalian cells.
(3) The fish GTH protein to which the mammalian sugar chain is added according to (2) above, which is obtained by synthesizing fish GTH to which two or more sugar chain binding sites are added.
(4) The mammalian type according to (1) or (2) above, wherein the sugar chain binding site is a site comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing or a sequence in which these amino acid sequences are conservatively modified. Fish GTH protein with added sugar chain.
(5) The fish GTH protein to which the mammalian sugar chain is added according to any one of (1) to (4) above, wherein the fish GTH is GTH derived from eel.
(6) A method for inducing fish maturation using a fish GTH protein to which the mammalian sugar chain is added according to any one of (1) to (5) above.
(7) Fish whose maturity has been induced by the method for inducing maturity of fish according to (6) above.
(8) An eel whose maturity has been induced by the method for inducing maturity of fish according to (6) above.
(9) A sperm or egg obtained from the eel described in (8) above.

本発明の魚類ＧＴＨタンパク質は、魚類における生体内寿命が延長化されていることから、安定して魚類の性成熟を誘導することができる。本発明の魚類の成熟誘導方法を用いることにより、ウナギ等の人為催熟が困難であった魚種についても、人工種苗が生産でき、完全養殖を行うことが可能となる。 The fish GTH protein of the present invention has a prolonged in vivo life in fish, and thus can stably induce sexual maturation of fish. By using the fish maturation inducing method of the present invention, artificial seedlings can be produced and complete aquaculture can be performed for fish species such as eel that have been difficult to artificially ripen.

組換えＧＴＨの発現を確認した図である（実施例１）。It is the figure which confirmed the expression of recombinant GTH (Example 1). 精製組換えＧＴＨの糖鎖解析の結果を示した図である（実施例１）。It is the figure which showed the result of the sugar chain analysis of purified recombinant GTH (Example 1). 精子形成誘導ステロイド産生量を示した図である（実施例２）。It is the figure which showed the spermatogenesis induction steroid production amount (Example 2). 精巣の組織観察の結果を示した図である（実施例２）。It is the figure which showed the result of the structure | tissue observation of a testis (Example 2).

本発明の「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」とは、糖鎖結合部位を付加した魚類ＧＴＨを哺乳類細胞によって合成することにより得られる哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質のことをいい、哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質であればいずれのものも含まれる。
ここで、「ＧＴＨタンパク質」には、濾胞刺激ホルモン（Ｆｏｌｌｉｃｌｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ；以下、「ＦＳＨ」とする）、黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ；以下、「ＬＨ」とする）が挙げられ、これらのホルモンを分泌する魚類であればいずれの魚類由来のＧＴＨタンパク質も含まれる。
また、「哺乳類型糖鎖」としては、哺乳類細胞がタンパク質合成を行う際に、タンパク質に付加する糖鎖であればいずれのものも含まれるが、例えば、マンノース、ガラクトース、Ｎ-アセチルグルコサミンおよびノイラミン酸で構成されるＮ型糖鎖、ガラクトース、Ｎ-アセチルグルコサミン、Ｎ-アセチルガラクトサミンおよびノイラミン酸で構成されるＯ型糖鎖等が挙げられる。 The “fish GTH protein to which a mammalian sugar chain is added” of the present invention refers to a fish GTH protein to which a mammalian sugar chain is added, which is obtained by synthesizing a fish GTH to which a sugar chain binding site has been added by a mammalian cell. That is, any fish GTH protein to which a mammalian sugar chain is added is included.
Here, examples of the “GTH protein” include follicle stimulating hormone (hereinafter referred to as “FSH”) and luteinizing hormone (hereinafter referred to as “LH”). GTH proteins derived from any fish are included as long as they are secreted fish.
The “mammalian sugar chain” includes any sugar chain that is added to a protein when a mammalian cell synthesizes the protein. For example, mannose, galactose, N-acetylglucosamine, and neuramin Examples include N-type sugar chains composed of acids, galactose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, and O-type sugar chains composed of neuraminic acid.

本発明の「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」は、糖鎖結合部位を付加した魚類ＧＴＨを哺乳類細胞によって合成することにより得られるものである。
「糖鎖結合部位を付加した魚類ＧＴＨ」とは、タンパク質合成の対象となる魚類ＧＴＨの塩基配列に、糖鎖結合部位の塩基配列を付加したもののことをいう。
「糖鎖結合部位」には、哺乳類細胞が糖鎖を結合し得る部位であればいずれのものも含まれるが、例えば、配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣａｒｂｏｘｙｌ-ｔｅｒｍｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｏｆｈｕｍａｎｃｈｏｒｉｏｎｉｃｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ β（ヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモンβサブユニットＣ-末端ペプチド、以下「ＣＴＰ」とする）（配列番号３にＣＴＰの塩基配列を示す）や、配列表配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＧｌｙｃｏｓｉｌａｔｉｏｎｓｉｔｅｏｆｒａｉｎｂｏｗｔｒｏｕｔｐｏｌｙｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ニジマスポリシアロ糖タンパク質糖鎖結合部位）の糖鎖結合部位と推定された部分等が挙げられる。本発明においては、この配列表配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる糖鎖結合部位と推定された部分をＰＳＧＰとする。配列番号４にこのＰＳＧＰの塩基配列を示す。
本発明の「糖鎖結合部位」は、これらの配列表配列番号１または２に示されたアミノ酸配列のみならず、これらの保存的修飾されたアミノ酸配列によって示される、哺乳類細胞が糖鎖を結合し得る部位であってもよい。ここで「保存的修飾されたアミノ酸配列」とは、ＣＴＰまたはＰＳＧＰのアミノ酸配列において１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列修飾を示し、かつ正常に哺乳類型糖鎖が付加されるアミノ酸配列のことをいう。 The “fish GTH protein to which a mammalian sugar chain is added” of the present invention is obtained by synthesizing a fish GTH to which a sugar chain binding site has been added by a mammalian cell.
“Fish GTH to which a sugar chain-binding site has been added” refers to a fish GTH to which a protein synthesis target has been added with the base sequence of the sugar chain-binding site.
The “sugar chain binding site” includes any site where mammalian cells can bind sugar chains. For example, a carboxy-terminal peptide of human consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 from chorionic gonadotropin β (human chorionic gonadotropin β subunit C-terminal peptide, hereinafter referred to as “CTP”) (SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of CTP) and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 Examples include a portion presumed to be a sugar chain binding site of a glycosylation site of rainbow bow polysialoglycoprotein (rainbow trout polysialoglycoglycoprotein sugar chain binding site). In the present invention, a portion estimated as a sugar chain binding site consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is referred to as PSGP. SEQ ID NO: 4 shows the base sequence of this PSGP.
The “sugar chain binding site” of the present invention is not limited to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 in these Sequence Listings, but is expressed by these conservatively modified amino acid sequences, and mammalian cells bind sugar chains. It may be a possible part. As used herein, a “conservatively modified amino acid sequence” refers to an amino acid sequence modification in which one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, and / or additions are made in the amino acid sequence of CTP or PSGP, and normal An amino acid sequence to which a mammalian sugar chain is added.

更に、本発明の「糖鎖結合部位を付加した魚類ＧＴＨ」には、タンパク質合成の対象となる魚類ＧＴＨの塩基配列に、上記の糖鎖結合部位の塩基配列を２種類付加したり、同じ糖鎖結合部位の塩基配列を２つ以上付加したりしたものも含まれる。 Furthermore, in the “fish GTH to which a sugar chain binding site is added” of the present invention, two types of base sequences of the above-mentioned sugar chain binding sites are added to the base sequence of fish GTH to be subjected to protein synthesis. Also included are those obtained by adding two or more base sequences of chain binding sites.

「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」を合成する「哺乳類細胞」は、「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」を合成し得る哺乳類細胞であればいずれの細胞も用いることができる。例えば、ヒト腎臓由来２９３細胞またはチャイニーズハムスター卵巣由来の細胞（ＣＨＯ）等が挙げられ、これらの細胞はさらに大量培養が可能であり好ましい。 “Mammalian cells” that synthesize “fish GTH proteins with added mammalian sugar chains” should be any mammalian cells that can synthesize “fish GTH proteins with added mammalian sugar chains”. Can do. Examples thereof include human kidney-derived 293 cells or Chinese hamster ovary-derived cells (CHO), and these cells are preferable because they can be further cultured in large quantities.

哺乳類細胞による「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」の合成においては、従来知られているいずれのタンパク質合成方法も用いることができる。
例えば、「糖鎖結合部位を付加した魚類ＧＴＨ」を組み込んだベクターをリポソーマルまたはノンリポソーマルの市販のトランスフェクション試薬を用いる方法やＤＥＡＥ-デキストラン法やリン酸カルシウム沈降法等によって哺乳類細胞に導入し、この哺乳類細胞を培養することで「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」を合成する方法などが挙げられる。また、動物細胞のゲノム上に魚類ＧＴＨタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ哺乳類細胞（ステーブルセルライン）を作製し、この細胞によって恒常的に「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」を合成させる方法なども挙げられる。
この方法において使用するベクターとしては、哺乳類由来の株化細胞で発現するタンパク質発現ベクターであればいずれのものも用いることができるが、例えば、ｐＣＡＧＧＳベクター（Ｎｉｗａｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ１９９１）、ｐｃＤＮＡ６／Ｖ５-Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることが好ましい。 In the synthesis of “fish GTH protein with added mammalian sugar chain” by mammalian cells, any conventionally known protein synthesis method can be used.
For example, a vector incorporating a “fish GTH with an added sugar chain binding site” is introduced into a mammalian cell by a method using a commercially available transfection reagent such as liposomal or non-liposomal, DEAE-dextran method, calcium phosphate precipitation method, etc. And a method of synthesizing “fish GTH protein to which a mammalian sugar chain is added”. In addition, a mammalian cell (stable cell line) in which a gene encoding a fish GTH protein is incorporated on the genome of the animal cell is produced, and a “fish GTH protein to which a mammalian sugar chain is added” is constantly added. The method of synthesizing is also mentioned.
As a vector used in this method, any protein expression vector can be used as long as it is a protein expression vector expressed in a mammalian cell line. For example, pCAGGS vector (Niwa et al. Gene 1991), pcDNA6 / V5. It is preferable to use a His vector (Invitrogen) or the like.

本発明の「魚類の成熟誘導方法」は、魚類の性成熟を誘導する方法のことをいい、「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」を用いる方法であればいずれの方法も含まれる。本発明の「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」を、性成熟の対象とする魚類に投与することで、成熟誘導を行う方法等が挙げられる。
性成熟の対象となる魚種と、「哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質」におけるＧＴＨの由来となる魚種が同一である方が、成熟誘導の効率がよく好ましい。 The “fish maturation induction method” of the present invention refers to a method for inducing sexual maturation of fish, and includes any method as long as it uses a “fish GTH protein to which a mammalian sugar chain is added”. . Examples thereof include a method for inducing maturation by administering the “fish GTH protein to which a mammalian sugar chain is added” of the present invention to a fish to be sexually matured.
It is preferable that the fish species to be sexually matured and the fish species from which GTH is derived in the “fish GTH protein to which a mammalian sugar chain is added” are the same in terms of efficiency of maturation induction.

以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが，本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to these.

＜哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質の産生＞
１．発現ベクターの構築
１−１：サンプル
愛知県水産試験場より譲渡された実験用の雌ニホンウナギを用いて、サケ脳下垂体抽出液をウナギの体重１ｋｇあたりサケ脳下垂体アセトン乾燥品２０ｍｇの割合で、週１回投与することにより、人為催熟を施した（参考文献１、参照）。人為催熟により成熟期に達したウナギおよび未処理の未熟なウナギから脳下垂体を摘出した。また、前卵黄形成期のニジマスより卵巣を摘出し同様にサンプルとした。
［参考文献１］ＯｈｔａＨ．，ＫａｇａｗａＨ．，ＴａｎａｋａＨ．，ＯｋｕｚａｗａＫ．，ＩｉｎｕｍａＮ．，ＨｉｒｏｓｅＫ．，ＦｉｓｈＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：１６３−１６９，１９９７ <Production of fish GTH protein with added mammalian sugar chain>
1. Construction of Expression Vector 1-1: Sample Using a female eel for experiments transferred from the Aichi Prefectural Fisheries Experiment Station, the salmon pituitary extract was used at a ratio of 20 mg of dried salmon pituitary acetone per kg of eel body weight. Then, artificial ripening was performed by administering once a week (see Reference 1). The pituitary gland was extracted from eels that reached maturity by artificial ripening and untreated immature eels. In addition, ovaries were extracted from rainbow trout in the pre-yolk formation phase and used as samples.
[Reference 1] Ohta H. et al. , Kagawa H .; , Tanaka H. , Okuzawa K. et al. , Iinuma N .; Hirose K .; , Fish Physiology and Biochemistry, 17: 163-169, 1997.

１−２：ＲＮＡの調整
未熟および成熟雌ウナギの脳下垂体、ニジマスの前卵黄形成期の卵巣から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡをそれぞれ抽出した（参考文献２、参照）。
［参考文献２］ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉＰ，ＳａｃｃｈｉＮ．，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２：１５６−１５９，１９８７ 1-2: Preparation of RNA Total RNA was extracted from the pituitary gland of immature and mature female eels, and from the ovary of the rainbow trout in the pre-yolk formation phase using TRIzol reagent (Invitrogen) (see Reference Document 2).
[Reference 2] Chomczynski P, Sacchi N. et al. , Analytical Biochemistry, 162: 156-159, 1987.

１−３：ｃＤＮＡライブラリーの作製
ウナギ脳下垂体およびニジマス卵巣から得られた全ＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写を行い、それぞれのｃＤＮＡライブラリーを作製した。 1-3: Preparation of cDNA library Reverse transcription was performed from total RNA obtained from eel pituitary gland and rainbow trout ovary using SuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen) to prepare each cDNA library.

１−４：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅および発現ベクターの構築
既に単離されている濾胞刺激ホルモンβサブユニット（以下、「ＦＳＨβ」とする：参考文献３、参照）をコードするｃＤＮＡ（配列表配列番号５）を未熟脳下垂体ｃＤＮＡから、黄体形成ホルモンβサブユニット（以下、「ＬＨβ」とする）をコードするｃＤＮＡ（配列表配列番号６）および糖タンパクホルモンαサブユニット（以下、「ＧＰＨα」とする：参考文献４、参照）をコードするｃＤＮＡ（配列表配列番号７）をそれぞれ成熟脳下垂体ｃＤＮＡから、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅＰｆｘＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたＰＣＲにより増幅した。またＰＣＲの際に、ＧＰＨαに関してはＣ末端に６つのヒスチヂンからなるタグ（Ｈｉｓタグ）を付加した。 1-4: Amplification of cDNA by Polymerase chain reaction (PCR) and construction of an expression vector cDNA encoding an already isolated follicle stimulating hormone β subunit (hereinafter referred to as “FSHβ”: Reference 3) (SEQ ID NO: 5) was prepared from immature pituitary cDNA, cDNA encoding luteinizing hormone β subunit (hereinafter referred to as “LHβ”) and glycoprotein hormone α subunit (hereinafter referred to as “LHβ”). , Which is referred to as “GPHα” (see Reference 4), was amplified from the mature pituitary cDNA by PCR using AccuPrime Pfx DNA polymerase (Invitrogen). During PCR, a tag consisting of six histidines (His tags) was added to the C-terminal of GPHα.

増幅されたＦＳＨβをコードするｃＤＮＡまたはＬＨβｃＤＮＡをコードするｃＤＮＡと、ＧＰＨαをコードするｃＤＮＡとをそれぞれ混合して鋳型としたオーバーラッピングＰＣＲ（参考文献５、参照）により、ＦＳＨβをコードするｃＤＮＡまたはＬＨβｃＤＮＡをコードするｃＤＮＡの次にＧＰＨαをコードするｃＤＮＡとなる順番で連結した一本鎖キメラｃＤＮＡを増幅した。
即ち、オーバーラッピングＰＣＲによって、１）ＦＳＨβの配列より設計したフォワードプライマーと、これに連結したいＧｐＨαの上流部分の配列より選択したリバースプライマーを用いてＦＳＨβの最後にＧｐＨαの配列が少し含まれるｃＤＮＡを増幅し、２）ＧｐＨαの前に連結したいＦＳＨβの下流部分の配列より選択したフォワードプライマーと、ＧｐＨαの配列より設計したリバースプライマーを用いてＧｐＨαの最初にＦＳＨβの配列が少し含まれるｃＤＮＡを増幅し、３）これら２種のＰＣＲ産物を混合して、ＦＳＨβの配列のみ設計したフォワードプライマーとＧｐＨαの配列のみで設計リバースプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより、ＦＳＨβをコードするｃＤＮＡの次にＧＰＨαをコードするｃＤＮＡが連結した一本鎖キメラｃＤＮＡを得た。以下、同様に、ＬＨβｃＤＮＡをコードするｃＤＮＡの次にＧＰＨαをコードするｃＤＮＡが連結した一本鎖キメラｃＤＮＡを得た。
これを、それぞれｐＣＡＧＧＳベクター（参考文献６、参照、大阪大学大学院医学系研究科の宮崎純一先生より譲受）に挿入し、魚類ＧＴＨタンパク質を発現するための発現ベクターとした。 By using overlapping PCR (see Reference 5), a mixture of the cDNA encoding the amplified FSHβ or cDNA encoding LHβ cDNA and the cDNA encoding GPHα, respectively, the cDNA or LHβ cDNA encoding FSHβ The single-stranded chimeric cDNA linked in the order of cDNA encoding GPHα next to the encoding cDNA was amplified.
That is, by overlapping PCR, 1) a cDNA containing a little GpHα sequence at the end of FSHβ using a forward primer designed from the sequence of FSHβ and a reverse primer selected from the sequence of the upstream portion of GpHα to be linked to this. 2) Amplify a cDNA containing a little FSHβ sequence at the beginning of GpHα using a forward primer selected from the sequence of the downstream portion of FSHβ to be ligated before GpHα and a reverse primer designed from the GpHα sequence. 3) By mixing these two PCR products and performing PCR using a forward primer designed only with the sequence of FSHβ and a reverse primer designed with only the sequence of GpHα, GPHα is added next to the cDNA encoding FSHβ. One linked cDNA encoding To obtain a chimeric cDNA. Hereinafter, similarly, a single-stranded chimeric cDNA in which a cDNA encoding LPHβ cDNA and a cDNA encoding GPHα were linked was obtained.
Each of these was inserted into a pCAGGS vector (reference document 6, reference, assigned by Prof. Junichi Miyazaki, Osaka University Graduate School of Medicine) to obtain an expression vector for expressing fish GTH protein.

また市販のヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＣＴＰをコードするｃＤＮＡ断片（配列表配列番号３）を、ニジマス卵巣ｃＤＮＡからはＰＳＧＰ（参考文献７、参照（糖鎖結合部位））をコードするｃＤＮＡ断片（配列表配列番号４）を同様にＰＣＲにより増幅した。
得られたＣＴＰをコードするｃＤＮＡ断片またはＰＳＧＰをコードするｃＤＮＡ断片を、上述のＦＳＨβをコードするｃＤＮＡまたはＬＨβをコードするｃＤＮＡとＧＰＨαをコードするｃＤＮＡとをそれぞれ混合して鋳型としたオーバーラッピングＰＣＲにより、ＦＳＨβをコードするｃＤＮＡとＣＴＰあるいはＰＳＧＰをコードするｃＤＮＡの次にＧＰＨαをコードするｃＤＮＡ、またはＬＨβをコードするｃＤＮＡとＣＴＰあるいはＰＳＧＰをコードするｃＤＮＡの次にＧＰＨαをコードするｃＤＮＡとなる順番で連結した一本鎖キメラｃＤＮＡを増幅した。これを、それぞれｐＣＡＧＧＳベクターに挿入し、哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質を発現するための発現ベクターとした。
［参考文献３］
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The obtained CTP-encoding cDNA fragment or PSGP-encoding cDNA fragment was subjected to overlapping PCR using the above FSHβ-encoding cDNA or LHβ-encoding cDNA and GPHα-encoding cDNA as templates, respectively. , CDNA encoding FSHβ and cDNA encoding CTP or PSGP, followed by cDNA encoding GPHα, or cDNA encoding LHβ and cDNA encoding CTP or PSGP, followed by cDNA encoding GPHα The single stranded chimeric cDNA was amplified. These were each inserted into a pCAGGS vector and used as an expression vector for expressing a fish GTH protein to which a mammalian sugar chain was added.
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２．組換えＧＴＨの発現、精製および性状解析
２−１：哺乳類細胞の培養および発現ベクターの導入
組換えＧＴＨを発現させる細胞としてはヒト腎臓由来２９３Ｆ細胞（２９３細胞：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。細胞は、３７度、８％のＣＯ₂存在下、１３０回転毎分で、２-３ｘ１０⁶細胞／ｍｌ-培養液になるまで懸濁培養し、適宜２-５倍に希釈することで経代を繰り返した。経代培養を５回以上行なった後、１ｘ１０⁶細胞／ｍｌに希釈した細胞に、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＭａｘＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて構築したウナギＧＴＨの発現ベクターおよびウナギＧＴＨの発現ベクターの発現活性を高めるために哺乳動物発現促進ベクターとしてｐＡｄＶａｎｔａｇｅＶｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を導入した。遺伝子を導入した細胞を５-６日間懸濁培養した後、遠心操作により細胞と培養液に分離、得られた培養液を組換えＧＴＨの精製のためのサンプルとした。 2. Expression, purification and characterization of recombinant GTH 2-1: Culture of mammalian cells and introduction of expression vector Human kidney-derived 293F cells (293 cells: Invitrogen) were used as cells for expressing recombinant GTH. Cells are cultured in suspension at 37 ° C. in the presence of 8% CO ₂ at 130 rpm for _{2 to 3} × 10 ⁶ cells / ml-culture solution, and diluted to 2-5 times as appropriate. Was repeated. After 5 or more subcultures, increase the expression activity of eel GTH expression vector and eel GTH expression vector constructed using FreeStyle Max Reagent (Invitrogen) in cells diluted to 1 × 10 ⁶ cells / ml Therefore, pAdVantage Vector (Promega) was introduced as a mammalian expression promoting vector. The cells into which the gene was introduced were suspended and cultured for 5-6 days, and then separated into cells and a culture solution by centrifugation, and the resulting culture solution was used as a sample for purification of recombinant GTH.

２−２：組換えＧＴＨの精製
組換えＧＴＨを含む培養液を１０ｋＤａ以下の物質を排除する限外濾過膜により濃縮し、高分子物質のみを含む濃縮培養液を調整した。得られた濃縮液は５０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、３００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ｐＨ８．０）で透析した後、Ｎｉ-ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いた固相化金属アフィニティークロマトグラフィーに供し、組換えＧＴＨを含むＨｉｓタグタンパク質を精製した。更に得られたサンプルを、５０ｍＭＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒＳａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、１．５Ｍ硫酸アンモニウムで透析することにより塩析した。塩析後、析出したタンパク質を遠心分離し、得られた上清をＰＢＳにより再度透析し、精製組換えウナギＧＴＨとした。 2-2: Purification of recombinant GTH A culture solution containing recombinant GTH was concentrated by an ultrafiltration membrane that excludes substances of 10 kDa or less, and a concentrated culture solution containing only a polymer substance was prepared. The obtained concentrated solution was dialyzed with 50 mM NaH ₂ PO ₄ , 300 mM NaCl, 10 mM imidazole (pH 8.0), and then subjected to solid phase metal affinity chromatography using Ni-NTA Agarose (Qiagen), followed by recombination. His tag protein containing GTH was purified. Furthermore, the obtained sample was salted out by dialyzing with 50 mM Phosphate Buffer Saline (PBS) and 1.5 M ammonium sulfate. After salting out, the precipitated protein was centrifuged, and the resulting supernatant was dialyzed again with PBS to obtain purified recombinant eel GTH.

２−３：精製組換えＧＴＨの生化学的解析
ＦＳＨβあるいはＬＨβとαサブユニットのみの一本鎖組換えＧＴＨ（ＦＳＨおよびＬＨ）の生化学的解析の結果を一例として示す（図１）。先ず組換えＦＳＨおよびＬＨをＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｆａｔｅ-ＰｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅＧｅｌ電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）に供したのち、クマシーブリリアントブルーにより染色した（図１Ａ）。その結果、ＦＳＨ、ＬＨ共に３０-３５ｋＤａ程度のタンパク質が高度に精製されている事が示された。更に、独自に作製したαサブユニットまたは各βサブユニットに対する特異抗体を用いたウェスタンブロット解析を行なった。αサブユニットに対する特異抗体は、大腸菌で発現させた組換えタンパク（ＧｐＨα）を抗原として、各βサブユニットに対する特異抗体は、ショウジョウバエＳ２細胞で発現させた各組換えタンパク（ＦＳＨβ抗体またはＬＨβを抗原として、それぞれ家兎に免疫することにより作製した（参考文献８、参照）。
その結果、ＦＳＨおよびＬＨに共通して含まれるＧＰＨαの抗体に対してはＦＳＨ、ＬＨ共に陽性反応を示した（図１Ｂ）のに対し、各抗β抗体を用いた場合では、それぞれ対応するＧＴＨのみが陽性反応を示した（図１ＣおよびＤ）。以上の事から、組換えＦＳＨおよびＬＨは設計通り正しく発現しており、且つ上述の方法で高度に精製される事が明らかとなった。また、ＣＴＰあるいはＰＳＧＰを各βおよびＧＰＨαの間に挿入したＦＳＨ（ＦＳＨ-ＣＴＰおよびＦＳＨ-ＰＳＧＰ）およびＬＨ（ＬＨ-ＣＴＰおよびＬＨ-ＰＳＧＰ）に関しても同様の解析を行なった結果、糖鎖結合配列を挿入したために分子量が５-１０ｋＤａ程度大きくなるものの、同様の結果が得られた。
［参考文献８］
ＫａｚｅｔｏＹ．，ＫｏｈａｒａＭ．，ＭｉｕｒａＴ．，ＭｉｕｒａＣ．，ＹａｍａｇｕｃｈｉＳ．，ＴｒａｎｔＪＭ．，ＡｄａｃｈｉＳ．，ＹａｍａｕｃｈｉＫ．，ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，７９：９３８−９４６，２００８ 2-3: Biochemical analysis of purified recombinant GTH The results of biochemical analysis of single-chain recombinant GTH (FSH and LH) only with FSHβ or LHβ and α subunit are shown as an example (FIG. 1). First, recombinant FSH and LH were subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and then stained with Coomassie brilliant blue (FIG. 1A). As a result, it was shown that a protein of about 30-35 kDa was highly purified for both FSH and LH. Furthermore, Western blot analysis was performed using specific α-subunits or specific antibodies against each β-subunit. The specific antibody for α subunit is a recombinant protein (GpHα) expressed in E. coli, and the specific antibody for each β subunit is each recombinant protein (FSHβ antibody or LHβ expressed in Drosophila S2 cells). Each of these was prepared by immunizing rabbits (see Reference 8).
As a result, both FSH and LH showed positive reaction with respect to the antibody of GPHα contained in both FSH and LH (FIG. 1B), whereas when each anti-β antibody was used, the corresponding GTH Only showed a positive reaction (FIGS. 1C and D). From the above, it has been clarified that recombinant FSH and LH are correctly expressed as designed and highly purified by the method described above. In addition, as a result of the same analysis for FSH (FSH-CTP and FSH-PSGP) and LH (LH-CTP and LH-PSGP) in which CTP or PSGP is inserted between β and GPHα, the sugar chain binding sequence Similar results were obtained although the molecular weight was increased by about 5-10 kDa due to the insertion of.
[Reference 8]
Kazeto Y. et al. , Kohara M .; , Miura T. , Miura C.I. , Yamaguchi S., et al. , Trant JM. , Adachi S. , Yamauchi K .; , Biology of Reproduction, 79: 938-946, 2008.

２−４：精製組換えＧＴＨの糖鎖解析
各種組換えＧＴＨをＳＤＳ-ＰＡＧＥに供したのち、ＤＩＧＧｌｙｃａｎＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｋｉｔ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いたレクチンブロットを行ない、付加されている糖鎖を解析した（図２）。
ＦＳＨおよびＬＨの糖鎖は、Ｓａｍｂｕｃｕｓｎｉｇｒａ凝集素（ＳＮＡ：下記（１）参照）およびＤａｔｕｒａｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ凝集素（ＤＳＡ：下記（２）参照）に対し強い陽性反応を示したことから、ガラクトースあるいはＮ-アセチルガラクトサミンを含み、その末端にノイラミン酸が位置する糖鎖およびＮ-アセチルガラクトサミンを含み、その末端にガラクトースが位置する糖鎖など、哺乳類型の糖鎖を多く含むことが明らかとなった。
また、Ｇａｌａｎｔｈｕｓｎｉｖａｌｉｓ凝集素（ＧＮＡ：下記（３）参照）およびＭａａｃｋｉａａｍｕｒｅｎｓｉｓ凝集素（ＭＡＡ：下記（４）参照）に対しても弱いながら陽性反応を示したことから、無脊椎動物の糖タンパクに典型的なハイマンノース型の糖鎖や、ガラクトースに糖鎖の末端で結合しているノイラミン酸も存在することが示された。
また、ＦＳＨ、ＬＨともに脱ノイラミン酸処理の有無にかかわらずＰｅａｎｕｔ凝集素（ＰＮＡ：下記（５）参照）に対しては陰性であることから、Ｏ-型糖鎖は含んでいないことが明らかとなった。一方、ＦＳＨ-ＣＴＰおよびＬＨ-ＣＴＰでは脱ノイラミン酸処理前はＰＮＡに陰性であったのに対し、ノイラミン酸除去後は非常に強い陽性シグナルが検出された。このことから、挿入したＣＴＰにＮ-アセチルガラクトサミンと結合しているガラクトースの末端にノイラミン酸が存在するＯ-型糖鎖が多量に結合していることが明らかとなった。
＜参考＞各凝集素の結合特異性
（１）ＳＮＡ：ガラクトースあるいはＮ-アセチルガラクトサミンに［２-６］の位置で結合しているノイラミン酸を認識する。
（２）ＤＳＡ：Ｎ-アセチルグルコサミンに［１-４］の位置で結合しているガラクトースを認識する。
（３）ＧＮＡ：ハイマンノース型糖鎖（無脊椎動物の糖タンパク質に典型的）を認識する。
（４）ＭＡＡ：ガラクトースに［２-３］の位置で結合しているノイラミン酸を認識する。
（５）ＰＮＡ：Ｎ-アセチルガラクトサミンとこれに［１-３］の位置で結合しているガラクトース（哺乳類のＯ-型糖鎖の典型的な核の構造）を認識する。 2-4: Sugar chain analysis of purified recombinant GTH After subjecting various recombinant GTH to SDS-PAGE, lectin blotting using DIG Glycan Differentiation kit (Roche Diagnostics) was performed and the added sugar chain was analyzed (FIG. 2).
Since the sugar chains of FSH and LH showed strong positive reactions to Sambucus nigra agglutinin (SNA: see (1) below) and Datatra stronumium agglutinin (DSA: see (2) below), galactose or N- It has been clarified that it contains many mammalian sugar chains such as a sugar chain containing acetylgalactosamine, including a sugar chain in which neuraminic acid is located at the terminal and N-acetylgalactosamine, and a sugar chain in which galactose is located at the terminal.
Moreover, since it showed a weak positive reaction against Galanthus nivaris agglutinin (GNA: see (3) below) and Macackia amurensis agglutinin (MAA: see (4) below), It was also shown that typical high-mannose sugar chains and neuraminic acid bound to galactose at the sugar chain ends were also present.
In addition, since both FSH and LH are negative for Peant agglutinin (PNA: see (5) below) regardless of whether or not deneuraminic acid treatment is performed, it is clear that O-type sugar chains are not included. became. On the other hand, FSH-CTP and LH-CTP were negative for PNA before deneuraminic acid treatment, whereas a very strong positive signal was detected after neuraminic acid removal. This revealed that a large amount of O-type sugar chain having neuraminic acid at the terminal of galactose bound to N-acetylgalactosamine is bound to the inserted CTP.
<Reference> Binding specificity of each agglutinin (1) SNA: Recognizes neuraminic acid bound to galactose or N-acetylgalactosamine at position [2-6].
(2) DSA: Recognizes galactose bound to N-acetylglucosamine at position [1-4].
(3) GNA: Recognizes a high-mannose sugar chain (typical for invertebrate glycoproteins).
(4) MAA: Recognizes neuraminic acid bound to galactose at the position [2-3].
(5) PNA: Recognizes N-acetylgalactosamine and galactose (a typical nuclear structure of mammalian O-type sugar chains) bound to this at the [1-3] position.

＜組換えＧＴＨの生物活性の検討＞
３．生体外実験系における生物活性
３−１：未熟ウナギ精巣の培養
未熟なウナギの精巣、約３０ｍｇを、ホルモン未添加（対照群）あるいは様々な濃度の各種組換えＧＴＨ（ＦＳＨ、ＬＨ、ＦＳＨ-ＣＴＰおよびＬＨ-ＣＴＰ）を添加した培養液、Ｌ-１５、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、２５０μｌ中で、２０度、１８時間培養した。 <Examination of biological activity of recombinant GTH>
3. Biological activity in in vitro experimental system 3-1: Culture of immature eel testis About 30 mg of immature eel testis, no hormone added (control group) or various concentrations of various recombinant GTH (FSH, LH, FSH-CTP) And LH-CTP) were added in a culture solution, L-15, 10 mM Hepes, pH 7.4, 250 μl, and cultured at 20 degrees for 18 hours.

３−２：精子形成誘導ステロイド産生量の測定
培養液中の精子形成誘導ステロイド、１１-ケトテストステロン（１１ＫＴ）量の測定は時間分解蛍光免疫測定法で行なった。その結果、ＦＳＨで２００ｎｇ／ｍＬ、ＬＨで５００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度で１１ＫＴ産生が有意に促進された。また、ＣＴＰを挿入したＧＴＨでも有意な１１ＫＴ産生の促進効果が認められ、特にＬＨ-ＣＴＰでは２０ｎｇ／ｍＬの低濃度でも効果が認められると共に、高濃度投与群では１１ＫＴ産生量は対照群に比べ最高で１００倍程度に達した（図３）。 3-2: Measurement of spermatogenesis-inducing steroid production The amount of spermatogenesis-inducing steroid, 11-ketotestosterone (11KT) in the culture solution was measured by a time-resolved fluorescence immunoassay. As a result, 11KT production was significantly promoted at a concentration of 200 ng / mL with FSH and 500 ng / mL or more with LH. GTH with CTP inserted also has a significant effect of promoting 11KT production, particularly LH-CTP has an effect even at a low concentration of 20 ng / mL, and the amount of 11KT produced in the high concentration administration group is higher than that in the control group. The maximum reached about 100 times (FIG. 3).

４．生体内実験系における生物活性
４−１：未熟雄ウナギへの組換えＧＴＨの投与
未熟雄ウナギに対して、ＦＳＨ-ＣＴＰを２００μｇ／ｋｇ-体重で週１回、８週間投与した。また、対照群として、ＦＳＨ-ＣＴＰを溶解しているＰＢＳのみの投与も行なった。 4). Biological activity in in vivo experimental system 4-1: Administration of recombinant GTH to immature male eels FSH-CTP was administered to immature male eels at a dose of 200 μg / kg-body weight once a week for 8 weeks. Moreover, only PBS which melt | dissolved FSH-CTP was also administered as a control group.

４−２：精巣のサンプリング、生殖腺体指数の算出および精巣の組織観察
投与実験終了３日後、実験魚の体重および摘出した精巣の重量を測定、生殖腺体指数（ＧＳＩ：生殖腺重量／体重）を算定した。精巣に関してはブアン氏液により固定したのち常法により組織切片を作製、光学顕微鏡により観察を行なった。その結果、対照群のＧＳＩは約０．２であったのに対し、ＦＳＨ-ＣＴＰを投与した場合、そのＧＳＩは約４．４と非常に高い値を示した。また、組織観察の結果、対照群の精巣では増殖前の精原細胞のみが存在するのに対し、ＦＳＨ-ＣＴＰを投与した個体の精巣では精子を含む様々な発達段階の生殖細胞が観察された（図４）。この結果より、遺伝子工学的手法を用いて作製した魚類自身の組換えＧＴＨがその人為催熟に有効である事が、本発明により初めて示された。 4-2: Testicular sampling, calculation of gonadal index and testicular tissue observation Three days after the completion of the administration experiment, the body weight of the experimental fish and the weight of the extracted testis were measured, and the gonadal index (GSI: gonadal weight / body weight) was calculated. . The testis was fixed with Bouin's solution, and then a tissue section was prepared by a conventional method and observed with an optical microscope. As a result, the GSI of the control group was about 0.2, whereas when FSH-CTP was administered, the GSI showed a very high value of about 4.4. In addition, as a result of tissue observation, only the spermatogonia before growth were present in the testis of the control group, whereas in the testis of the individual administered with FSH-CTP, germ cells at various developmental stages including sperm were observed. (FIG. 4). From this result, it was demonstrated for the first time by the present invention that fish's own recombinant GTH produced using genetic engineering techniques is effective for artificial ripening.

本発明の魚類の成熟誘導方法を用いることにより、ウナギ等の人為催熟が困難であった魚種についても、人工種苗が生産でき、完全養殖を行うことが可能となる。また、本発明の哺乳類型糖鎖が付加された魚類ＧＴＨタンパク質は、生体内寿命が延長化された効果的なホルモンであることから、魚類の成熟誘導にも有効に利用することができる。 By using the fish maturation inducing method of the present invention, artificial seedlings can be produced and complete aquaculture can be performed for fish species such as eel that have been difficult to artificially ripen. In addition, since the fish GTH protein to which the mammalian sugar chain of the present invention is added is an effective hormone with an extended in vivo life, it can be effectively used for inducing fish maturation.

Claims

Mammals obtained by synthesizing fish GTH, to which a sugar chain binding site, which is a site consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing or a sequence consisting of conservative modifications of these amino acid sequences, is added at the C-terminus with mammalian cells A fish GTH protein to which a type sugar chain is added, and a fish GTH protein to which an O type sugar chain is added as a mammalian type sugar chain.

By synthesizing a fish GTH to which two or more sugar chain binding sites, which are amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or a sequence comprising these amino acid sequences conservatively modified, are added to the C-terminal by mammalian cells. The fish GTH protein to which an O-type sugar chain is added as the mammalian-type sugar chain according to claim 1 to be obtained.

The fish GTH protein to which an O-type sugar chain is added as a mammalian sugar chain according to claim 1 or 2 , wherein the fish GTH is an eel-derived GTH.

The fish GTH protein to which an O-type sugar chain is added as a mammalian sugar chain according to any one of claims 1 to 3, wherein the fish GTH is FSH or LH.

CDNA encoding FSH or cDNA encoding LH, and cDNA encoding a sugar chain binding site which is a site consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or a conservatively modified sequence of these amino acid sequences, The O-type sugar chain according to any one of claims 1 to 4, which is obtained by inserting a chimeric cDNA linked in the following order into an expression vector, introducing the approximate expression vector into a mammalian cell, and synthesizing the approximate expression vector with the mammalian cell. Added fish GTH protein.

A method for inducing fish maturation using a fish GTH protein to which an O-type sugar chain is added as the mammalian sugar chain according to any one of claims 1 to 5.

The fish maturation induction method according to claim 6, wherein the fish that is induced to mature is an eel.

The method for inducing maturity of fish according to claim 6, wherein the testis of immature eel is induced to mature.