JP5774264B2 - 肥満および糖尿病、ならびにそれらに関連する病態の処置のため、ならびに血中ｇｌｐ−１レベルを増大させることによって緩和される病態の処置のための、併用療法 - Google Patents

肥満および糖尿病、ならびにそれらに関連する病態の処置のため、ならびに血中ｇｌｐ−１レベルを増大させることによって緩和される病態の処置のための、併用療法 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、肥満症及び糖尿病並びにそれらに関連する病態を処置又は予防する組成物及び方法に関する。本発明は更に、哺乳動物の血中ＧＬＰ−１レベルを増大させる組成物及び方法にも関する。本発明は又、ＧＬＰ−１分泌促進物質を遮蔽するためにＧタンパク質共役受容体を使用する方法にも関する。
発明の背景
以下の考察は、本発明の理解を容易にすることを意図するものであるが、本発明の従来の技術であることを意図するものでも、認めるものでもない。
Ａ．肥満症及び糖尿病
肥満症は、先進国で最も多く見られる代謝性疾患である。国民の間で健康への教育や取組みが行われているにもかかわらず、肥満症の罹患率は上昇を続けており、米国では３０％を超える成人が肥満であり、６０％を超える成人が過体重又は肥満である。世界保健機構は、世界中で１０億人を超える成人が過体重であり、その内の少なくとも３億人が肥満であると推定している。肥満症は、高血圧症、うっ血性心筋症、冠状性心疾患、脳卒中、脂肪異常症、代謝症候群、及び２型糖尿病［Ｂａｙｓ， Ｏｂｅｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２００４） １２：１１９７−１２１１］、並びに早期死亡を含むがこれらに限定されない広範な共存症に罹患する危険性をもたらすか、又はそれを著しく増大させる。従って、世界的な肥満症の流行を減少させる治療選択肢となる安全且つ有効な坑肥満薬に対する医学的な需要は未だに満たされていない。
米国における２型糖尿病の発症率は約７％であり、全医療費の約１０％を占めている。更に、世界における２型糖尿病の発症率は増大しており、今や２型糖尿病は世界的な流行であると考えられている。２型糖尿病は、絶食及び食後の高血糖並びに相対的なインスリン不全を特徴とする。高血糖症は、腎症、神経障害、網膜症、及び抹消血管性疾患等の長期的な微小血管及び巨大血管合併症を生じる場合がある。更に、２型糖尿病は、高脂血症、アテローム性粥状硬化症、及び高血圧症をしばしば複合する共存症である。高脂血症は、アテローム性粥状硬化症による心臓血管疾患の主要な危険因子である。２型糖尿病は、著しい罹患率及び死亡率をもたらし、患者、その家族、及び社会に大きな代償を生む。
Ｂ．グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、プログルカゴンの翻訳後修飾から誘導され、腸管内内分泌細胞により分泌されるインクレチンホルモンである。ＧＬＰ−１は、特異的Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、即ちＧＬＰ−１Ｒを介してその作用を媒介する。ＧＬＰ−１は、グルコースホメオスタシスを調節するホルモンとして特徴付けられるのが最も良い。ＧＬＰ−１は、グルコース依存インスリン分泌を刺激し、膵臓β細胞の質量を増大させることが示されている。ＧＬＰ−１は又、胃内容排出率を減少させ、満腹を促進することも示されている。２型糖尿病において血液グルコースを制御するＧＬＰ−１ペプチド作動薬の効能は、体重を減少させるのに効能を有するのと同じく［非特許文献１］、幾つかの臨床研究において実証されている［例えば、非特許文献２を参照］。
ＧＬＰ−１受容体作動薬は更に、心筋梗塞、並びに認知症及び神経変性障害に対する保護においても有用である。ＧＬＰ−１は、心筋梗塞のラットモデルにおいて心臓を保護することが示されており［非特許文献３］、ＧＬＰ−１Ｒは、学習及び神経保護に関わることが齧歯モデルにおいて示されている［非特許文献４；及び非特許文献５］。
２型糖尿病等の特定の疾患は、ＧＬＰ−１の欠損によって特徴付けられる［例えば、Ｎａｕｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ （２００４） ５３Ｓｕｐｐｌ３：Ｓ１９０−１９６を参照］。
現在のＧＬＰ−１ペプチド作動薬は、経口生物学的利用能の欠如による悪影響を受けており、患者のコンプライアンスに悪影響を与える。ＧＬＰ−１Ｒの経口生物学的利用可能な非ペプチド作用性の低分子作動薬を開発する取組みは、これまでのところ成功に至っていない［非特許文献６］。有力な代替手法としては、血液におけるＧＬＰ−１の内因性レベルを増大させる経口活性組成物を開発する方法がある。
Ｃ．ＢＰＳ−３
ボンベシンは、カエルの皮膚から単離された１４アミノ酸ペプチドである。ボンベシン受容体サブタイプ−３ ＢＲＳ−３ Ｇタンパク質共役受容体（ＢＲＳ−３；例えば、ヒトＢＲＳ−３、ジェンバンク（登録商標）受入番号受入番号ＡＡＡ３５６０４及びそのアレル；例えば、マウスＢＲＳ−３、ジェンバンク受入番号ＡＹ２８８４２３及びそのアレル）は、胃放出ペプチド受容体（ＧＰＲ−Ｒ）及びニューロメディンＢ受容体（ＮＭＢ−Ｒ）に対して約５０％の相同性を示し、共にボンベシン様受容体グループを形成する。ＢＲＳ−３は、視床下部及び子宮を含めた組織において選択的に発現される。ＢＲＳ−３の活性化により、ＢＲＳ−３がＧｑに結合するのと一貫して、細胞内イノシトール−１，４，５−三リン酸塩（ＩＰ３）の蓄積が増大する。最近の研究では、ＢＲＳ−３ノックアウトマウスは、肥満症、糖尿病、及び高血圧を発症している［非特許文献７］。
Ｄ．ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ、ＥＣ３．４．１４．５）は、ペプチドホルモン、ニューロペプチド、及びケモカインを含む広範なペプチド基質に対して触媒作用を示す。グルコース依存インスリン分泌を刺激し、血液グルコースホメオスタシスを促進するインクレチングルカゴン様ペプチドＩ（ＧＬＰ−１）及びグルコース依存インスリン分泌性ポリペプチド（ＧＩＰ）は、位置２のアラニンにおいてＤＰＰ−ＩＶにより迅速に開裂され、その生物学的活性は非活性化される。ＤＰＰ−ＩＶ活性の薬理学的減衰及び遺伝的減衰の両方とも、ｉｎ ｖｉｖｏでのインクレチン作用の増大、インスリンの増大、及び血液グルコースの低下に関連する。ＤＰＰ−ＩＶ活性の遺伝的減衰は、肥満症への耐性を提供し、インスリン感度を向上させることが示されている。第２世代ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、ＬＡＦ２３７（それぞの開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ａｈｒｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ （２００４） ８９：２０７８−２０８４；及びＶｉｌｌｈａｕｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｔ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ （２００３） ４６：２７７４−２７８９）が、現在、２型糖尿病について段階３の臨床試行にあり、追加のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、臨床的に開発されている。
インクレチンホルモンは、ＤＰＰ−ＩＶの唯一の基質ではないため、その他の内因性ＤＰＰ−ＩＶ基質の開裂を阻害することにより、望ましくない副作用が生じる可能性があることが懸念されている［例えば、開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｈｏｍｅｏｓｔ Ａｇｅｎｔｓ （２００４） １８：４７−５４を参照］。従って、実質的に低い濃度のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤に伴う血液グルコースホメオスタシスを促進する活性を同定することが有利である。
Ｅ．Ｇタンパク質共役受容体
ＧＰＣＲは、共通の構造モチーフを共有し、それぞれが膜をスパンする（各スパンは数字によって識別される；即ち、膜貫通−１（ＴＭ−１）、膜貫通−２（ＴＭ−２）等）７つのαらせん体を形成する２２〜２４の疎水性アミノ酸の７つの配列を有する。膜貫通らせん体は、細胞膜の外面又は「細胞外」面の上において膜貫通−２と膜貫通−３の間、膜貫通−４と膜貫通−５の間、及び膜貫通−６と膜貫通−７の間のアミノ酸の鎖によって接合される（これらはそれぞれ「細胞外」領域１、２及び３（ＥＣ−１、ＥＣ−２、及びＥＣ−３）と呼ばれる）。膜貫通らせん体は又、細胞膜の内面又は「細胞内」面の上において、膜貫通−１と膜貫通−２の間、膜貫通−３と膜貫通−４の間、及び膜貫通−５と膜貫通−６の間においてアミノ酸の鎖によって接合される（これらはそれぞれ「細胞内」領域１、２及び３と呼ばれる）。受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は、細胞内の細胞内空間にあり、受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は、細胞の外部の細胞外空間にある。
一般的に、作動薬がＧタンパク質共役受容体に結合する時（しばしば受容体の「活性化」と呼ばれる）、細胞内領域と細胞内「Ｇタンパク質」の間の結合を容易にする受容体のコンフォメーションの変化が起きる。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質に関して「乱交雑」である、即ち、ＧＰＣＲは、複数のＧタンパク質と相互作用することができることが報告されている。Ｋｅｎａｌｄｎ， Ｔ．， ４３ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０９５ （１９８８） を参照されたい。他のＧタンパク質が存在することが可能であるが、現在、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、及びＧｏが、特定されているＧタンパク質である。リガンド活性化ＧＰＣＲがＧタンパク質と結合することにより、シグナリングカスケードプロセスが開始される（「信号導入」と呼ばれる）。通常の条件下では、信号導入は、最終的に、細胞を活性化させる、又は細胞を阻害することになる。
Ｇｓは、酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。一方、Ｇｉ（並びにＧｚ及びＧｏ）は、アデニリルシクラーゼを阻害する。アデニリルシクラーゼは、ＡＴＰからｃＡＭＰへの転換に触媒作用を及ぼす。従って、Ｇｓタンパク質を結合する活性化ＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの細胞レベルの増大に関連する。一方、Ｇｉ（又はＧｚ、Ｇｏ）タンパク質を結合する活性化ＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの細胞レベルの減少に関連する。一般的には、“Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，” Ｃｈｐｔ． ８， Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ （３ｒｄ Ｅｄ．） Ｎｉｃｈｏｌｓ， Ｊ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ． （１９９２） を参照されたい。従って、ｃＡＭＰを検出する検定を使用して、候補化合物が、例えばＧｓ−関連受容体に対する作動薬であるか（即ち、このような化合物は、ｃＡＭＰのレベルを増大させる）を判定することができる。Ｇｑ及びＧｏは、酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関連し、酵素ホスホリパーゼＣは、リン脂質ＰＩＰ２を加水分解し、２つの細胞内メッセンジャー：ジアシクルグリセロール（ＤＡＧ）及びイノシトール１，４，５−三リン酸塩（Ｐ３）を放出する。ＩＰ３の蓄積の増大は、Ｇｑ関連受容体及びＧｏ関連受容体の活性化に関連する。一般的には、“Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，” Ｃｈｐｔ． ８， Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ （３ｒｄ Ｅｄ．） Ｎｉｃｈｏｌｓ， Ｊ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ． （１９９２）を参照されたい。ＩＰ３の蓄積を検出する検定を使用して、候補化合物が、例えば、Ｇｑ関連受容体又はＧｏ関連受容体に対する作動薬であるか（即ち、このような化合物は、ＩＰ３のレベルを増大させる）を判定することができる。細胞内遊離カルシウムのレベルを検出する検定を使用して、候補化合物が、例えばＧｑ関連受容体又はＧｏ関連受容体に対する作動薬であるか（即ち、このような化合物は、細胞内遊離カルシウムのレベルを増大させる）を判定することができる。
例えば、表Ａを参照されたい（「Ｎ／Ａ」：「該当なし」）。
Figure 0005774264
 又、幾つかのクラスのＧＰＣＲをホスホリパーゼＣ経路に結合するとされる乱交雑Ｇタンパク質（例えば、Ｇα１５又はＧα１６）［Ｏｆｆｅｎｒｎａｎｎｓ ＆ Ｓｉｍｏｎ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （１９９５） ２７０：１５１７５−８０］、又は多くの異なるＧＰＣＲを同じ経路に結合するように設計されたキメラＧタンパク質（例えば、ホスホリパーゼＣ）［Ｍｉｌｌｉｇａｎ ＆ Ｒｅｅｓ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９９９） ２０：１１８−２４］も存在する。細胞内遊離カルシウムのレベルを検出する検定を使用して、候補化合物が、例えばホスホリパーゼＣ経路に結合されたＧＰＣＲに対する作動薬であるか（即ち、このような化合物は、細胞内遊離カルシウムのレベルを増大させる）を判定することができる。
生理学的条件下において、ＧＰＣＲは、「非活性」状態と「活性」状態の２つの異なるコンフォメーションの間において均衡して細胞膜に存在する。非活性状態の受容体は、生物学的応答をもたらす信号導入を開始するように細胞内シグナリング導入経路に連結することができない。受容体コンフォメーションを活性状態に変化させることにより、導入経路に連結することが可能になり（Ｇタンパク質を介して）、生物学的応答を生成する。
受容体は、リガンド又は医薬品等の化合物によって活性状態において安定させることが可能である。受容体のアミノ酸配列の修飾を含むがこれに限定されない最近の発見は、活性状態のコンフォメーションにおいて受容体を促進する及び安定させるリガンド又は薬剤以外の手段を提供する。これらの手段は、リガンドが受容体に結合する効果を刺激することによって、活性状態において受容体を有効に安定させる。このようなリガンド非依存手段による安定化は、「構成的受容体活性化」と呼ばれる。内因性受容体リガンドの非存在下で活性を示す内因性受容体は、構成的活性内因性受容体と呼ばれる。
Ｚａｎｄｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ （２００２） ３５９：８２４−８３０ Ｎａｕｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ （２００３） １６：４１３−４２２ Ｂｏｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ （２００５） ５４：１４６−１５１ Ｄｕｒｉｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ （２００３） ９：１１７３−１１７９ Ｇｒｅｉｇ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ （２００４） １０３５：２９０−３１５ Ｍｅｎｔｌｅｉｎ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ （２００５） １４：５７−６４ Ｏｈｋｉ−Ｈａｍａｚａｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９９７） ３９０：１６５−１６９
発明の要旨
本発明は、一定量のＢＲＳ−３作動薬と一定量のジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤との組み合わせに関し、それにより、組み合わせは、その量のＢＲＳ−３作動薬単独又はその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独によって提供される場合より対象における血中グルコースレベルを低下させる効果を提供し、又糖尿病及びそれに関連する病態を処置又は予防するためのこのような組み合わせの使用に関する。本発明は、一定量のＢＲＳ−３作動薬と一定量のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤の組み合わせに関し、それにより、組み合わせは、その量のＢＲＳ−３作動薬単独又はその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独によって提供される場合より対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させる効果を提供し、又、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防し、或いはＧＬＰ−１が欠損している対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるためのこのような組み合わせの使用に関する。本発明は又、ＧＬＰ−１分泌促進物質を遮蔽するためにＢＲＳ−３Ｇタンパク質共役受容体を使用する方法にも関する。
第１態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、糖尿病又はそれに関連する病態を処置又は予防する方法を特徴とする。特定の実施形態において、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、対象における血中グルコースレベルを低下させるのに十分な量で投与される。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。
本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、を必要とする対象に投与することを含む、ボディマスを減少させる方法を更に特徴とする。特定の実施形態において、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量で投与される。特定の実施形態において、必要とする対象は、２７以上のＢＭＩを有する。特定の実施形態において、必要とする対象は、過体重である。特定の実施形態において、必要とする対象は、肥満である。
本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、肥満症又はそれに関連する病態を処置又は予防する方法を更に特徴とする。特定の実施形態において、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量で投与される。
本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防する方法を更に特徴とする。特定の実施形態において、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量で投与される。
本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、ＧＬＰ−１が欠損している対象に投与することを含む、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させる方法を更に特徴とする。特定の実施形態において、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量で投与される。
特定の実施形態において、糖尿病は、２型糖尿病である。
特定の実施形態において、糖尿病に関連する病態は、高血糖症、耐糖能異常、インスリン抵抗性、膵臓β細胞不全、腸内分泌細胞不全、糖尿、代謝性アシドーシス、白内障、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿性網膜症、糖尿性冠状動脈疾患、糖尿性心臓血管疾患、糖尿性抹消血管性疾患、代謝症候群、高脂血症、アテローム性粥状硬化症、脳卒中、高血圧症、及び肥満症からなる群から選択される。
特定の実施形態において、肥満症に関連する病態は、高血圧症、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓、冠状性心疾患、脳卒中、突発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動症、変性骨関節炎、腰痛、皮膚裂線又は「伸展裂創」、下肢の静脈うっ血、リンパ浮腫、細胞歯肉炎、間擦疹、カンブンケル、黒色表皮腫、懸垂線維腫、胃食道逆流疾患、非アルコール性脂肪肝／脂肪肝炎、胆石症、ヘルニア、大腸がん、ストレス失禁、肥満症に関係する糸球体症、乳がん及び子宮がん、抑うつ及び低自己評価、生活の質の低下、代謝症候群、２型糖尿病、脂肪異常症、女性のハイパーアンドロゲネミア、多嚢胞卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、及び男性性機能低下症からなる群から選択される。特定の実施形態において、肥満症に関連する病態は、高血圧症、うっ血性心筋症、冠状性心疾患、脳卒中、脂肪異常症、代謝症候群、及び２型糖尿病からなる群から選択される。
特定の実施形態において、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態は、糖尿病、糖尿病に関連する病態、心筋梗塞、学習障害、記憶障害、及び神経変性障害からなる群から選択される。
特定の実施形態において、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態は、重度のてんかん性発作によって生じる興奮毒性脳障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、プリオン関連疾患、脳卒中、運動ニューロン疾患、学習障害又は記憶障害、外傷性脳傷害、脊髄損傷、及び抹消神経障害からなる群から選択される神経変性障害である。
特定の実施形態において、対象はヒトである。
第２態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物を特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中グルコースレベルを低下させるのに十分な量である、組成物の投与形態に関する。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量である。組成物の投与形態に関する。
特定の実施形態において、対象はヒトである。
第３態様において、本発明は、治療によってヒト又は動物の身体を処置する方法で使用される、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物を特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤あ対象における血中グルコースレベルを低下させるのに十分な量である組成物の投与形態に関する。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量である組成物の投与形態に関する。
本発明は、治療によってヒト又は動物の身体の糖尿病又はそれに関連する病態を処置又は予防する方法で使用される、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物を特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中グルコースレベルを低下させるのに十分な量である組成物の投与形態に関する。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。
本発明は、治療によってヒト又は動物の身体のボディマスを減少させる方法で使用される、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物を更に特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量である組成物の投与形態に関する。
本発明は、治療によってヒト又は動物の身体の糖尿病又はそれに関連する病態を処置又は予防する方法で使用される、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物を更に特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量である組成物の投与形態に関する。
本発明は、治療によってヒト又は動物の血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防する方法で使用される、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物を更に特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量である組成物の投与形態に関する。
本発明は、治療によってヒト又は動物の身体のＧＬＰ−１の欠損を処置又は予防する方法で使用される、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物を更に特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量である組成物の投与形態に関する。
特定の実施形態において、対象はヒトである。
第４態様において、本発明は、薬学的組成物を調製する方法を特徴とし、前記方法は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を少なくとも１つの薬学的に許容される担体と混和することを本質的に含むか、又はそれからなる。特定の実施形態において、この方法は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中グルコースレベルを低下させるのに十分な量である、薬学的組成物の投与形態を調製する手順を更に含む。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。特定の実施形態において、この方法は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量である、薬学的組成物の投与形態を調製する手順を更に含む。
特定の実施形態において、対象はヒトである。
第５態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを本質的に含むか、又はそれからなる薬学的組成物を特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中グルコースレベルを低下させるのに十分な量である、薬学的組成物の投与形態に関する。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量である、薬学的組成物の投与形態に関する。
特定の実施形態において、対象はヒトである。
第６態様において、本発明は、第５態様による治療上有効量の薬学的組成物を、必要とする対象に投与することを含む、糖尿病又はそれに関連する病態を処置又は予防する方法を特徴とする。特定の実施形態において、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、対象における血中グルコースレベルを低下させるのに十分な量で投与される。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。特定の実施形態において、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量で投与される。
本発明は、第５態様による治療上有効量の薬学的組成物を、必要とする対象に投与することを含む、ボディマスを減少させる方法を更に特徴とする。特定の実施形態において、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量で投与される。特定の実施形態において、必要とする対象は、２７以上のＢＭＩを有する。特定の実施形態において、必要とする対象は、過体重である。特定の実施形態において、必要とする対象は、肥満である。
本発明は、第５態様による治療上有効量の薬学的組成物を、必要とする対象に投与することを含む、肥満症又はそれに関連する病態を処置又は予防する方法を更に特徴とする。特定の実施形態において、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量で投与される。
本発明は、第５態様による治療上有効量の薬学的組成物を、必要とする対象に投与することを含む、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防する方法を更に特徴とする。特定の実施形態において、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量で投与される。
本発明は、第５態様による治療上有効量の薬学的組成物を、血液ＧＬＰ−１が欠損している対象に投与することを含む、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させる方法を更に特徴とする。特定の実施形態において、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量で投与される。
特定の実施形態において、対象はヒトである。
第７態様において、本発明は、糖尿病又はそれに関連する病態を処置又は予防する薬物を製造するための、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる化合物の使用を更に特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中グルコースレベルを低下させるのに十分な量である薬物の投与形態に関する。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量である薬物の投与形態に関する。
本発明は、ボディマスを減少させる薬物を製造するための、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に含むか、又はそれからなる組成物の使用を更に特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量である薬物の投与形態に関する。
本発明は、肥満症又はそれに関連する病態を処置又は予防する薬物を製造するための、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に含むか、又はそれからなる組成物の使用を更に特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量である薬物の投与形態に関する。
本発明は、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防する薬物を製造するための、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に含むか、又はそれからなる組成物の使用を更に特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量である薬物の投与形態に関する。
本発明は、ＧＬＰ−１の欠損を処置又は予防する薬物を製造するための、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に含むか、又はそれからなる組成物の使用を更に特徴とする。特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに十分な量である薬物の投与形態に関する。
特定の実施形態において、対象はヒトである。
第８態様において、本発明は、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物を同定する方法を特徴とし、
（ａ）Ｇタンパク質共役受容体を発現する宿主細胞又は宿主細胞の膜と試験化合物を接触させ、Ｇタンパク質共役受容体が、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３３５と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３９９と、
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸２〜３３５と、
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２〜３９９と、
（ｖ）受容体が配列番号２のアミノ酸位置１においてメチオニン残基を備えないことを条件とする配列番号２のアミノ酸２〜３３５と、
（ｖｉ）受容体が配列番号２のアミノ酸位置１においてメチオニン残基を備えないことを条件とする配列番号２のアミノ酸２〜３９９と、
（ｖｉｉ）ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列であって、前記ヌクレオチド配列が、特有のプライマー配列番号３及び配列番号４を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対しポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を実施することからなるプロセスによって得ることが可能な配列である、アミノ酸配列と、
（ｖｉｉｉ）ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１の相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる配列であるアミノ酸配列と、
（ｉｘ）（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の何れか１つの生物学的活性フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、手順；並びに
（ｂ）受容体の機能性を刺激する試験化合物の能力を判定する手順、を含み、
受容体の機能性を刺激する試験化合物の能力によって、試験化合物が、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物であるか、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を予防又は処置するのに有用な化合物であることが表される。
特定の実施形態において、この方法は、ＧＬＰ−１分泌促進物質を同定する方法である。
特定の実施形態において、この方法は、ボディマスを減少させるのに有用な化合物を同定する方法である。
特定の実施形態において、この方法は、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物を同定する方法である。
本発明は、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物を同定する方法を更に特徴とし、この第８態様の手順（ａ）及び（ｂ）からなり、更に：
（ｃ）手順（ｂ）において該受容体の機能性を刺激する化合物を、哺乳動物の腸内分泌細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる手順；及び
（ｄ）化合物が哺乳動物の腸内分泌細胞からのＧＬＰ−１の分泌を刺激するかを判定する手順、を含み、
哺乳動物の腸内分泌細胞からのＧＬＰ−１の分泌を刺激する試験化合物の能力によって、試験化合物が、ボディマスを減少させるに有用な試験化合物がＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物であるか、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物であることが表される。特定の実施形態において、哺乳動物の腸内分泌細胞は、ＧＬＵＴａｇ腸内分泌Ｌ細胞系統である。
本発明は、ボディマスを減少させるのに有用な試験化合物がＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物を同定する方法を更に特徴とし、この第８態様の手順（ａ）及び（ｂ）からなり、更に
（ｃ）手順（ｂ）において受容体の機能性を刺激する化合物を哺乳動物に投与する手順；及び
（ｄ）化合物が哺乳動物の血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるかを判定する手順、を含み、
化合物が哺乳動物の血中ＧＬＰ−１レベルを増大させる試験化合物の能力によって、試験化合物が、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物であるか、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物であることが表される。特定の実施形態において、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物である。
特定の実施形態において、ボディマスを減少させるのに有用な特定されたＧＬＰ−１分泌促進物質又は特定された化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な特定された化合物は、受容体の作動薬である。幾つかの実施形態において、作動薬は、部分作動薬である。
特定の実施形態において、受容体は、Ｇタンパク質に結合する。特定の実施形態において、タンパク質はＧｑである。
特定の実施形態において、プロセスは、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ鎖反応）である。ＲＴ−ＰＣＲ技法は、当業者に周知である。
特定の実施形態において、ヒトＤＮＡサンプルは、ヒトｃＤＮＡである。特定の実施形態において、ｃＤＮＡは、ＢＲＳ−３を発現するヒト組織からである。幾つかの実施形態において、ＢＲＳ−３を発現するヒト組織は、視床下部又は子宮である。
特定の実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣ１、１５ｍＭのクエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌ変性剪断鮭精子ＤＮＡを備える溶液において４２℃でハイブリダイズし、続いて０．１×ＳＳＣを備える溶液において６５℃で洗浄することからなる。ハイブリダイゼーション法は、当業者に周知である。
特定の実施形態において、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、前記ヌクレオチド配列が配列番号１の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるＧタンパク質受容体は、細胞内ＩＰ３のレベルを増大させることと、ＢＲＳ−３の既知のリガンドを結合することとからなる群から選択される生物学的活性を示す。特定の実施形態において、コードされるＧタンパク質共役受容体は、細胞内ＩＰ３のレベルを上げ、ＢＲＳ−３の既知のリガンドを結合する。
幾つかの実施形態において、Ｇタンパク質共役受容体は、Ｇタンパク質を備える融合タンパク質の一部である。ＧＰＣＲ：Ｇ融合構造体を作成する技法は、当業者に周知である（例えば、国際出願ＷＯ０２／４２４６１を参照）。
幾つかの実施形態において、Ｇタンパク質共役受容体は組換え体である。
特定の実施形態において、宿主細胞は、発現ベクターを備え、前記発現ベクターは、Ｇタンパク質共役受容体をコードするポリヌクレオチドを備える。幾つかの実施形態において、発現ベクターはｐＣＭＶである。このベクターは、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅの規定により、１９９８年１０月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ）に寄託された。ＤＮＡはＡＴＣＣによって試験され、生存可能であると判定された。ＡＴＣＣは、以下の寄託番号をｐＣＭＶに割り当てた：ＡＴＣＣ＃２０３３５１。その他の適切な発現ベクターも当業者には容易に明らかとなり、広範な発現ベクターが市販されている（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ［米国カリフォルニア州パロ・アルト］；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ［米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ］；及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州カールズバッド］）。
本発明の適切な宿主細胞には、本発明のタンパク質結合受容体を発現することができる任意の真核細胞が含まれる。真核細胞は、動物細胞（例えば、昆虫、哺乳動物、魚類、両生類、鳥類、又は爬虫類の細胞）、植物細胞（例えば、トウモロコシ又はシロイヌナズナの細胞）、或いは真菌細胞（例えば、Ｓ．セレビシアエ細胞）であってもよい。幾つかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物である。例示的な哺乳動物宿主細胞には、猿腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、ＳＶ４０によって形質転換された猿の腎臓ＣＶＩ細胞（ＣＯＳ−７；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３［“２９３”］；Ｇｒａｈａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９ （１９７７））；ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３Ｔ［“２９３Ｔ”］；当初は２９３ｔｓＡ１６０９ｎｅｏと呼ばれた；ＤｕＢｒｉｄｇｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：３７９−３８７ （１９８７））；ベビーハムスターの腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ；Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ７７：４２１６ （１９８０）；シリアンゴールデンハムスター細胞ＭＣＢ３９０１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９５９５）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４；Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３−２５１ （１９８０））；猿腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカンミドリザルの腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（ｈｅｐ Ｇ２；ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ３８３：４４−６８ （１９８２））；ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）、及びマウスＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１）が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、哺乳動物宿主細胞は、２９３、２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＭＣＢ３９０１、及びＣＯＳ−７からなる群から選択される。特定の実施形態において、メラニン保有細胞細胞が使用される。幾つかの実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞である（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ昆虫Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７１１））。幾つかの実施形態において、宿主細胞は真菌細胞である（例えばＳ．セレビシアエ細胞）。幾つかの実施形態において、宿主細胞は腸内分泌細胞である。幾つかの実施形態において、腸内分泌細胞は、ＧＬＵＴａｇ腸内分泌Ｌ細胞系統である。その他の好適な宿主細胞も当業者には容易に明らかとなり、広範な細胞系統がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９）から市販されている。
特定の実施形態において、前記判定は、Ｇタンパク質共役受容体がＧｑに結合することと一貫する。
幾つかの実施形態において、前記判定は、Ｇタンパク質共役受容体が、Ｇα１５又はＧα１６等の乱交雑Ｇタンパク質を介して、ホスホリパーゼＣ経路に結合することと一貫する。乱交雑Ｇタンパク質は、当業者に周知である［例えば、Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （１９９５） ２７０：１５１７５−１５１８０を参照］。幾つかの実施形態において、前記判定は、Ｇタンパク質結合が、キメラＧタンパク質を介して、例えばホスホリパーゼＣ経路に結合することと一貫する。キメラＧタンパク質は、当業者に周知である［例えば、Ｍｉｌｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９９９） ２０：１１８−１２４；及びＷＯ ０２／４２４６１を参照］。
幾つかの実施形態において、前記判定は、第２メッセンジャーのレベルを測定することによる。
幾つかの実施形態において、前記判定は、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール１，４，５−三リン酸塩（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＭＡＰキナーゼ活性、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ−１（ＭＥＫＫ１）活性、及びＣａ２＋からなる群から選択される、第２メッセンジャーのレベルを測定することによる。幾つかの好ましい実施形態において、第２メッセンジャーはＩＰ３である。特定の好ましい実施形態において、細胞内Ｃａ２＋のレベルは増大する。幾つかの好ましい実施形態において、第２メッセンジャーはＣａ２＋である。特定の好ましい実施形態において、細胞内Ｃａ２＋のレベルは増大する。幾つかの実施形態において、前記Ｃａ２＋の測定は、ＦＬＩＰＲによって実施される。
特定の実施形態において、前記判定は、Ｇタンパク質共役受容体を含む膜で実施される。
特定の実施形態において、前記判定は、メラニン保有細胞検定を使用することによる。特定の好ましい実施形態において、染料分散レベルは増大する。
幾つかの実施形態において、前記判定は、細胞内ＩＰ３レベルが増大することによって媒介される活性の測定による。幾つかの実施形態において、前記活性は、ＧＬＰ−１の分泌の刺激である。
幾つかの実施形態において、前記判定は、ＡＰＩ−レポーター検定による。幾つかの実施形態において、前記判定は、ＳＲＦ−レポーター検定による。幾つかの実施形態において、前記レポーターは、β−ルシフェラーゼである。幾つかの実施形態において、前記レポーターは、β−ガラクトシダーゼである。特定の実施形態において、ルシフェラーゼ活性又はβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルは上昇する。
幾つかの実施形態において、前記判定は、Ｇタンパク質共役受容体を含む膜に結合するＧＴＰＴＳの測定による。幾つかの好ましい実施形態において、前記ＧＴＰγＳは、［３５Ｓ］で標識される。幾つかの好ましい実施形態において、前記Ｇタンパク質共役受容体を含む膜に結合するＧＴＰＴＳは増大する。
幾つかの実施形態において、候補化合物は低分子である。幾つかの実施形態において、候補化合物は、低分子がポリペプチドではないことを条件とする低分子である。幾つかの実施形態において、候補化合物は、低分子が抗体又はその抗原結合フラグメントではないことを条件とする低分子である。幾つかの実施形態において、候補化合物は、低分子が脂質ではないことを条件とする低分子である。幾つかの実施形態において、候補化合物は、低分子がポリペプチド又は脂質ではないことを条件とする低分子である。幾つかの実施形態において、候補化合物は、ポリペプチドである。幾つかの実施形態において、候補化合物は、ポリペプチドが抗体又はその抗原結合フラグメントではないことを条件とするポリペプチドである。幾つかの実施形態において、候補化合物は脂質である。幾つかの実施形態において、候補化合物は、抗体又はその抗原結合フラグメントではない。幾つかの実施形態において、候補化合物は、抗体又はその抗原結合フラグメントである。
幾つかの実施形態において、この方法は、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又はその化合物を合成することを更に含む。
幾つかの実施形態において、この方法は、必要に応じて、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物の構造を決定すること、並びに、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物を提供し、或いはボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、又は血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物の名称又は構造を提供することを更に備える。
幾つかの実施形態において、前記方法は更に、必要に応じて、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物の構造を決定すること、必要に応じて、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物を提供すること、並びに、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物を生成又は合成することからなる。
第９態様において、本発明は、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物を同定する方法を特徴とし、
（ａ）試験化合物の存在下又は非存在下において、Ｇタンパク質共役受容体を、この受容体に対する必要に応じて標識された既知のリガンドに接触させ、Ｇタンパク質共役受容体が、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３３５；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３９９；
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸２〜３９５；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２〜３９９；
（ｖ）受容体が配列番号２のアミノ酸位置１においてメチオニン残基を備えないことを条件とする配列番号２のアミノ酸２〜３３５；
（ｖｉ）受容体が配列番号２のアミノ酸位置１においてメチオニン残基を備えないことを条件とする配列番号２のアミノ酸２〜３９９；
（ｖｉｉ）ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列であって、前記ヌクレオチド配列が、特有のプライマー配列番号３及び配列番号４を使用して、ヒトＤＮＡサンプルに対しポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を実施することからなるプロセスによって得られる配列である、アミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列であって、このヌクレオチド配列は、配列番号１の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる配列である、アミノ酸配列；及び
（ｉｘ）（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の何れか１つの生物学的活性フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、手順；
（ｂ）前記既知のリガンドと前記受容体の間の複合体を検出する手順；並びに
（ｃ）前記複合体が、試験化合物が存在しない場合より、試験化合物が存在する状態において少ないかを判定する手順、を含み、
前記判定によって、試験化合物が、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物である、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物であることが表される。
特定の実施形態において、この方法は、ＧＬＰ−１分泌促進物質を同定する方法である。
特定の実施形態において、この方法は、ボディマスを減少させるのに有用な化合物を同定する方法である。
特定の実施形態において、この方法は、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物を同定する方法である。
特定の実施形態において、既知のリガンドは、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５、化合物１６、化合物１７、化合物１８、化合物１９、化合物２０、化合物２１、化合物２２、化合物２３、化合物２４、化合物２５、化合物２６、化合物２７、化合物２８、化合物２９、化合物３０、化合物３１、化合物３２、化合物３３、及び化合物３４からなる群から選択される。
特定の実施形態において、必要に応じて標識されるリガンドは、標識された既知のリガンドである。特定の実施形態において、必要に応じて標識されるリガンドは、放射性標識リガンドである。本発明のＧタンパク質共役受容体の既知のリガンドを標識する等、化合物を放射性標識する技法は、当業者に周知である。例えば、国際出願ＷＯ ０４／０６５３８０を参照されたい。
Ｇタンパク質共役受容体とＧタンパク質共役受容体のリガンドであることが既知である化合物の間の複合体を検出する技法が、当業者に周知である。例えば、国際出願ＷＯ ０４／０６５３８０を参照されたい。
本発明は、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物を同定する方法を更に特徴とし、この第９態様の手順（ａ）〜（ｃ）からなり、更に
（ｄ）存在する状態においてより少ない前記複合体が手順（ｃ）において形成される化合物を哺乳動物の腸内分泌細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる手順；並びに
（ｅ）化合物が哺乳動物の腸内分泌細胞からのＧＬＰ−１の分泌を刺激するかを判定する手順、を含み、
化合物が哺乳動物の腸内分泌細胞からのＧＬＰ−１の分泌を刺激する能力によって、試験化合物が、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物である、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有効な化合物であることが表される。特定の実施形態において、哺乳動物の腸内分泌細胞は、ＧＬＵＴａｇ腸内分泌Ｌ細胞系統である。
本発明は、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物を同定する方法を更に特徴とし、この第９態様の手順（ａ）〜（ｃ）からなり、更に：
（ｄ）存在する状態においてより少ない前記複合体が手順（ｃ）において形成される化合物を哺乳動物に投与する手順；及び
（ｅ）化合物が哺乳動物の血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるかを判定する手順、からなり；
化合物が哺乳動物の腸内分泌細胞からのＧＬＰ−１の分泌を刺激する能力によって、試験化合物が、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有効な化合物であることが表される。特定の実施形態において、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物である。
特定の実施形態において、受容体は組換え体である。
本出願は、記載の日付に米国郵便を介して米国特許商標庁に出願された以下の仮出願の優先権を主張する：米国仮出願番号６０／６７５，７３０（２００５年４月２７日出願）。上記の出願の開示内容は、全体が参考として本明細書に組み入れられている。
発明の詳細な説明
本発明は、糖尿病及びそれに関連する病態を処置又は予防するためのある化合物又はその薬学的に許容される塩の組み合わせに関する。本発明は、ボディマスを減少させるためのある化合物又はその薬学的に許容される塩の組み合わせに更に関する。本発明は、肥満症及びそれに関連する病態を処置又は予防するためのある化合物又はその薬学的に許容される塩の組み合わせに更に関する。本発明は、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するためのある化合物又はその薬学的に許容される塩の組み合わせに更に関する。本発明は、試験化合物をＧＬＰ−１分泌促進物質として遮蔽するために本発明のＧタンパク質共役受容体を使用する方法に更に関する。出願人は、ＢＲＳ−３が、腸内分泌Ｌ細胞を生成する哺乳動物ＧＬＰ−１によって発現されることを発見した。ＢＲＳ−３は、ＧＬＰ−１分泌促進物質受容体である。ＢＲＳ−３の作動薬は、ＧＬＰ−１分泌促進物質である。
本発明によるＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを使用することで、糖尿病及びそれに関連する病態の治療に使用されることが現在考慮されているよりも実質的に少ないＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の投与量で、糖尿病及びそれに関連する病態を処置又は予防し、それによって活性の阻害に関連する望ましくない副作用の可能性を低減することが可能である。本発明によるＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを使用することで、ボディマスを減少させるために現在考慮されているよりも実質的に少ないＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の投与量で、ボディマスを減少させ、それによってＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害に関連する望ましくない副作用の可能性を低減することが可能である。本発明によるＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを使用することで、肥満症及びそれに関連する病態の治療に使用されることが現在考慮されているよりも実質的に少ないＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の投与量で、肥満症及びそれに関連する病態を処置又は予防し、それによってＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害に関連する望ましくない副作用の可能性を低減することが可能である。本発明によるＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを使用することで、前記病態の治療に使用されることが現在考慮されているよりも実質的に少ないＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の投与量で、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防し、それによってＤＰＰ−ＩＶ活性の阻害に関連する望ましくない副作用の可能性を低減することが可能である。更に、本発明によるＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを使用することで、肥満症及びそれに関連する病態の治療に使用されることが現在考慮されているよりも実質的に少ないＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の投与量で、肥満症及びそれに関連する病態を処置又は予防し、それによって、望ましくない副作用がＢＲＳ−３受容体の活性化に関連することが判明している場合に、望ましくない副作用の可能性を低減することが可能である。本発明は更に、対象における血中グルコースレベルを低下させる新規で予想外の有利な手法も提供する。本発明は更に、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させる新規で予想外の有利な手法も提供する。本発明は更に、試験化合物をＧＬＰ−１分泌促進物質として遮蔽する新規で予想外の有利な手法も提供する。
本明細書で使用される「リガンド」という用語は、ＧＰＣＲに特異的に結合する分子を意味する。リガンドは、例えば、ポリペプチド、脂質、低分子、抗体とすることが可能である。内因性リガンドは、天然ＧＰＣＲの内因性自然リガンドであるリガンドである。リガンドは、ＧＰＣＲの「拮抗薬」、「作動薬」、「部分作動薬」、又は「逆作動薬」等とすることが可能である。
本明細書で使用される「作動薬」という用語は、ＧＰＣＲに結合することによって、ＧＰＣＲによって媒介される細胞内応答を誘起するようにＧＰＣＲを活性化させる剤（例えば、リガンド候補化合物）を意味する。
本明細書で使用される「部分作動薬」という用語は、ＧＰＣＲに結合することによって、完全作動薬よりは劣る程度又は度合いではあるが、ＧＰＣＲによって媒介される細胞内応答を誘起するようにＧＰＣＲを活性化させる剤（例えば、リガンド候補化合物）を意味する。
本明細書で使用される「拮抗薬」という用語は、作動薬又は部分作動薬とほぼ同じ部位においてＢＰＣＲに結合する、及び好ましくは競合的に結合するが、ＧＰＣＲの活性形態によって開始される細胞内応答を活性化せず、それにより、作動薬又は部分作動薬の細胞内応答を阻害することができる剤（例えば、リガンド候補化合物）を意味する。拮抗薬は、通常、作動薬又は部分作動薬が存在しない場合、基準細胞内応答を減少させない。
「逆作動薬」という用語は、作動薬又は部分作動薬の非存在下で認められる通常基準レベル活性よりも低い受容体の活性形態によって開始される基準細胞内応答を阻止する物質（例えば、リガンド候補化合物）を意味する。
本明細書で使用される「ＢＲＳ−３作動薬」という用語は、ＢＲＳ−３受容体に結合し、作動薬として作用する化合物を指す。
本明細書で使用される「ＢＲＳ−３作動薬」という用語は、胃放出ペプチド受容体（ＧＰＲ−Ｒ）又はニューロメディンＢ受容体（ＮＭＢ−Ｒ）等、１つ以上の密接に関係する受容体に対してＢＲＳ−３受容体の選択性を有するＢＲＳ−３作動薬を指す。
本明細書で使用される「ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤」という用語は、ＤＰＰ−ＩＶに結合し、ＤＰＰ−ＩＶジペプチジルペプチダーゼ活性を阻害する化合物を指す。
本明細書で使用される「ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤」という用語は、ポストプロリン酵素（ＰＰＣＥ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ（ＤＰＰ−ＩＩ）、ジペプチジルペプチダーゼ８（ＤＰＰ−８）、及びジペプチジルペプチダーゼ９（ＤＰＰ−９）の１つ以上等、密接に関係するペプチダーゼに対してＤＰＰ−ＩＶの選択性を有するＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を指す。
「血中グルコースレベル」又は「血中ＧＬＰ−１レベル」という用語は、それぞれ血液グルコース濃度又は血液ＧＬＰ−１濃度を指す。特定の実施形態において、血中ＧＬＰ−１レベルは、生物学的活性ＧＬＰ−１の血液におけるレベルであり、ＧＬＰ−１Ｒにおいて作動薬活性を有するＧＬＰ−１は、生物学的に活性である。特定の実施形態において、血中グルコースレベル又は血中ＧＬＰ−１レベルは、血漿グルコースレベル又は血漿ＧＬＰ−１レベルである。
「上昇した血中グルコースレベル」という用語は、臨床的に不適切な基礎及び食後高血糖症を示す対象に認められるもの、又は経口グルコース耐性試験（ｏＧＴＴ）で対象に認められるもの等の上昇した血中グルコースレベルを意味するものとする。
本明細書で使用される「対象」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、豚、犬、猫、非ヒト霊長類、及びヒトを含むがこれらに限定されない哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット、最も好ましくはヒトを指すものとする。
本明細書で使用される「予防又は処置を必要とする」という用語は、対象が処置を必要とする、又は処置から利益を得るという介護者によって行われる判断を指す（例えば、ヒトの場合は医師、看護師、ナースプラクティショナ、非ヒト哺乳動物の場合は獣医師）。
「治療上有効量」又は「治療上有効な投与量」という用語は、所望の生物学的応答又は医療的応答を誘起する薬剤の量を意味することを意図する。特定の実施形態において、治療上有効量は、マウスｏＧＴＴ検定において３０％を超えるＡＵＣ阻害を生成する薬剤の量である。
「治療上無効な量」又は「治療上無効な投与量」という用語は、治療上有効量の薬剤より少ない薬剤の量を意味することを意図する。特定の実施形態において、治療上無効な量は、マウスｏＧＴＴ検定において３０％以下のＡＵＣ阻害を生成する薬剤の量である。
「予防するのに有効な量」という用語は、防止されることが追求される生物学的事象又は医療的事象が出現する危険性を防止又は低下させる薬剤の量を指す。多くの場合、予防するのに有効な量は、治療上有効量と同じである。
「組成物」という用語は、少なくとも１つの成分を含む物質を意味する。
「活性成分」という用語は、疾患の診断、治療、軽減、処置、又は予防において薬理学的活性又は他の直接的な効果を提供する任意の成分を意味する。
「薬学的組成物」という用語は、少なくとも１つの活性成分を備える組成物を意味し、それにより、組成物は、哺乳動物において特定された有効な結果を調査するために適用することができる。
投与形態という用語は、タブレット、カプセル、又は注射可能物等、薬剤が生成され、分与される物理的な形態を意味する。
本明細書で使用される「肥満症」という用語は、ＷＨＯの体重分類によると、肥満指数（ＢＭＩ）が３０以上と定義される［開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｋｏｐｅｌｍａｎ， Ｎａｔｕｒｅ （２０００） ４０４：６３５−６４３］。
肥満症に関連する病態という用語には、高血圧症、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓、冠状性心臓疾患、脳卒中、突発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動症、変性骨関節炎、腰痛、皮膚裂線又は「伸展裂創」、下肢の静脈うっ血、リンパ浮腫、細胞歯肉炎、間擦疹、カンブンケル、黒色表皮腫、懸垂線維腫、胃食道逆疾患、非アルコール性脂肪肝／脂肪肝炎、胆石症、ヘルニア、大腸ガン、ストレス失禁、肥満症に関係する糸球体症、乳がん及び子宮がん、抑うつよび低自己評価、生活の質の低下、代謝症候群、２型糖尿病、脂肪異常症、女性のハイパーアンドロゲネミア、多嚢胞卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、及び男性性機能低下症が含まれるが、これらに限定されず、肥満症に関連する病態は、実施形態に個別に又は任意に組み合わせて含まれてもよいことが理解される。
「過体重」という用語は、２７〜２９．９の肥満指数（ＢＭＩ）として定義される。
本明細書で使用される際、「糖尿病」という用語は、インスリン依存型糖尿病（１型糖尿病としても知られる）及び非インスリン依存型糖尿病（２型糖尿病としても知られる）の両方を含む。
「糖尿病の関連する病態」という用語には、高血糖症、グルコース耐性障害、インスリン抵抗性、膵臓β細胞不全、腸内分泌細胞不全、糖尿、代謝性アシドーシス、白内障、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿性網膜症、糖尿病性冠状動脈疾患、糖尿性脳血管、疾患、糖尿性抹消血管性疾患、代謝症候群、高脂血症、アテローム性粥状硬化症、脳卒中、高血圧症、及び肥満症が含まれるが、これらに限定されず、糖尿病に関連する病態は、実施形態に個別に又は任意に組み合わせて含まれてもよいことが理解される。
「血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態」という用語には、糖尿病、糖尿病に関連する病態、心筋梗塞、学習障害、記憶障害、及び神経変性障害が含まれるが、これらに限定されず、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態は、実施形態に個別に又は任意に組み合わせて含まれてもよいことが理解される。
本明細書で使用される「アテローム性粥状硬化症」という用語は、大きなサイズ及び中程度のサイズの動脈の壁の最内層の上にコレステロール及び脂質を含むアテローム斑が付着することを特徴とする血管疾患の形態を指す。
本明細書にされ、且つＡｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ＩＩＩ（ＡＴＰ ＩＩＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ：Ｔｈｉｒｄ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＮａｔｉｏｎａｌＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ（Ａｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ＩＩＩ）、Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ Ｓｕｍｍａｒｙ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ２００１， （ＮＩＨ ｐｕｂ．Ｎｏ ０１−３６７０）による「代謝症候群」という用語は、肥満症、高トリグリセリド血症、低レステロール、高血圧、及び高い絶食グルコースに関係する５つの基準の３つ以上を満たす時、生じる。
「神経変性障害」という用語は、非限定的に、重症のてんかん性発作、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、プリオン関連疾患、脳卒中、運動ニューロン疾患、学習又は記憶障害、外傷性脳傷害、脊髄損傷、及び抹消神経障害によって生じる興奮毒性脳損傷を含むことを意図する。
化学群、成分、又は遊離基
「Ｃ１−５アシル」という用語は、カルボニルに結合されたＣ１−５アルキル遊離基を表し、アルキルの定義は、本明細書において記述されるものと同じ定義を有する。幾つかの例は、非限定的に、アセチル、プロピオニル、ｎ−ブタノイル、イソ−ブタノイル、セク−ブタノイル、ｔ−ブタノイル（即ち、ピバロイル）、ペンタノイル等を含む。
「Ｃ１−５アシロキシ」という用語は、酸素原子に結合されたアシル遊離基を表し、アシルは、本明細書において記述されるものと同じ定義を有する。幾つかの例は、アセチロキシ、プロピオニロキシ、ブタノイロキシ、イソ−ブタノイロキシ、セク−ブタノイロキシ、ｔ−ブタノイロキシ等を含む。
「Ｃ１−６アシルスルホンアミド」という用語は、スルホンアミドの窒素に直接結合されたＣ１−６アシルを表し、Ｃ１−６アシル及びスルホンアミドの定義は、本明細書において記述されるものと同じ定義を有し、Ｃ１−６アシルスルホンアミドは、以下の化学式によって表すことができる。
Figure 0005774264
 本発明の幾つかの実施形態は、アシルスルホンアミドがＣ１−４アシルスルホンアミドの時であり、幾つかの実施形態は、Ｃ１−４アシルスルホンアミドであり、幾つかの実施形態は、Ｃ１−３アシルスルホンアミドであり、幾つかの実施形態は、Ｃ１−２アシルスルホンアミドである。アシルスルホンアミドの例には、非限定的に、アセチルスルファモイル［−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨＣ（＝）Ｍｅ］、プロピオニルスルファモイル［−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｅｔ］、イソブチリルスルファモイル、ブチリルスルファモイル、２−メチル−ブチリルスルファモイル、３−メチル−ブチリルスルファモイル、２，２−ジメチル−プロピオニルスルファモイル、ペンタノイルスルファモイル、２−メチル−ペンタノイルスルファモイル、３−メチル−ペンタノイルスルファモイル、４−メチル−ペンタノイルスルファモイル等がある。
「Ｃ２−６アルケニル」という用語は、２から６の炭素を含む遊離基を表し、少なくとも１つの炭素−炭素２重結合が存在し、幾つかの実施形態は、２から４の炭素であり、幾つかの実施形態は、２から３の炭素であり、幾つかの実施形態は、２の炭素を有する。Ｅ同位体及びＺ同位体の両方が、「アルケニル」という用語によって包含される。更に、「アルケニル」という用語は、ジアルケニル及びトリアルケニルを含む。従って、複数の２重結合が存在する場合、結合は、全てＥ又はＺ或いはＥ及びＺの混合物である。アルケニルの例には、ビニル、アリール、２−ブテニル、３−ブテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキサニル、２，４−ヘキサジニル等がある。
本明細書で使用される「Ｃ１−４アルコキシ」という用語は、本明細書に定義される通り、酸素原子に直接結合された遊離基アルキルを表す。例には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、イソ−ブトキシ、セク−ブトキシ等がある。
「Ｃ１−８アルキル」という用語は、１〜８個の炭素を含む直鎖又は分枝の炭素遊離基を表し、幾つかの実施形態は、１〜６個の炭素であり、幾つかの実施形態は、１から３の炭素であり、幾つかの実施形態は、１〜２個の炭素である。アルキルの例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、セク−ブチル、イソ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソ−ペンチル、ｔ−ペンチル、ネオ−ペンチル、１−メチルブチル［即ち、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３］、２−メチルブチル［即ち、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３］、ｎ−ヘキシル等が含まれるが、これらに限定されない。
「Ｃ１−４アルキルカルボキサミド」又は「Ｃ１−４アルキルカルボキサミド」という用語は、アミド基の窒素に結合した単一のＣ１−４アルキル基を表し、アルキルは、本明細書に記載されるものと同じ定義を有する。Ｃ１−５アルキルカルボキサミドは、以下によって表される場合がある：
Figure 0005774264
 例には、非限定的に、Ｎ−メチルアルキルカルボキサミド、Ｎ−エチルカルボキサミド、Ｎ−ｎ−プロピルアルキルカルボキサミド、Ｎ−イソ−プロピルアルキルカルボキサミド、Ｎ−ｎ−ブチルアルキルカルボキサミド、Ｎ−セク−ブチルカルボキサミド、Ｎ−イソ−ブチルアルキルカルボキサミド、Ｎ−ｔ−ブチルアルキルカルボキサミド等がある。
「Ｃ１−３アルキレン」は、Ｃ１−３２価直鎖炭素基を表す。幾つかの実施形態において、Ｃ１−３アルキレンは、例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−等を指す。幾つかの実施形態において、Ｃ１−３アルキレンは、−Ｃ１−３−、−ＣＨＣＨ２−、−ＣＨＣＨ２ＣＨ２−等を指し、これらの例は、一般的に「Ａ」を指す。
「Ｃ１−４アルキルスルフィニル」という用語は、化学式−Ｓ（Ｏ）−のスルホキシド遊離基に結合されたＣ１−４アルキル遊離基を表し、アルキル遊離基は、本明細書において記述されるものと同じ定義を有する。例には、非限定的に、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ｎ−プロピルスルフィニル、イソ−プロピルスルフィニル、ｎ−ブチルスルフィニル、セク−ブチルスルフィニル、イソ−ブチルスルフィニル、ｔ−ブチル等がある。
「Ｃ１−４アルキルスルホンアミド」という用語は、以下の基を指し、
Figure 0005774264
 Ｃ１−４アルキルは、本明細書において記述されるものと同じ定義を有する。
「Ｃ１−４アルキルスルホニル」という用語は、化学式のスルホン遊離基：−Ｓ（Ｏ）２−に結合されたＣ１−４アルキル遊離基を表し、アルキル遊離基は、本明細書において記述されるものと同じ定義を有する。例には、非限定的に、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニル、イソ−プロピルスルホニル、ｎ−ブチルスルホニル、セク−ブチルスルホニル、イソ−ブチルスルホニル、ｔ−ブチル等がある。
「Ｃ１−４アルキルチオ」という用語は、化学式−Ｓ−の硫化物に結合されたＣ１−４アルキル遊離基を表し、アルキル遊離基は、本明細書において記述されるものと同じ定義を有する。例には、非限定的に、メチルスルファニル（即ち、ＣＨ３Ｓ−）、エチルスルファニル、ｎ−プロピルスルファニル、イソ−プロピルスルファニル、ｎ−ブチルスルファニル、セク−ブチルスルファニル、イソ−ブチルスルファニル、ｔ−ブチル等がある。
「Ｃ１−４アルキルチオアルキルカルボキサミド」という用語は、以下の化学式のチオアミドを表し、
Figure 0005774264
 Ｃ１−４アルキルは、本明細書において記述されるものと同じ定義を有する。
「Ｃ１−４アルキルチオウレイル」という用語は、化学式−ＮＣ（Ｓ）Ｎ−の基を表し、窒素の一方又は両方は、同じ又は異なるＣ１−４アルキル基であり、アルキルは、本明細書において記述されるものと同じ定義を有する。アルキルチオウレイルの例には、非限定的に、ＣＨ３ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−、ＮＨ２Ｃ（Ｓ）ＮＣＨ３−、（ＣＨ３）２Ｎ（Ｓ）ＮＨ−、（ＣＨ３）２Ｎ（Ｓ）ＮＨ−、（ＣＨ３）２Ｎ（Ｓ）ＮＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−、ＣＨ３ＣＨ２ＮＨＣ（Ｓ）ＮＣＨ３−等がある。
「Ｃ１−４アルキルウレイル」という用語は、化学式−ＮＣ（Ｏ）Ｎ−の基を表し、窒素の一方又は両方は、同じ又は異なるＣ１−４アルキル其であり、アルキルは、本明細書において記述されるものと同じ定義を有する。アルキルウレイルの例には、非限定的に、ＣＨ３ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、ＮＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３−、（ＣＨ３）２Ｎ（Ｏ）ＮＨ−、（ＣＨ３）２Ｎ（Ｏ）ＮＨ−、（ＣＨ３）２Ｎ（Ｏ）ＮＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、ＣＨ３ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＣＨ３−等がある。
「Ｃ２−６アルキニル」という用語は、２から６の炭素及び少なくとも１つの炭素−炭素３重結合を含む遊離基を表し、幾つかの実施形態は２から４の炭素であり、幾つかの実施形態は２から３の炭素であり、幾つかの実施形態は２の炭素を有する。アルキニルの例には、非限定的に、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ベンキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル等がある。「アルキニル」は、ジイエン及びトリイエンを含む。
「アミノ」という用語は、−ＮＨ２基を表す。
「Ｃ１−４アルキルアミノ」という用語は、アミノ遊離基に結合された１つのアルキル遊離基を表し、アルキル遊離基は、本明細書において記述されるのと同じ意味を有する。幾つかの例は、非限定的に、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、イソ−プロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、セク−ブチルアミノ、イソ−ブチルアミノ、ｔ−ブチルアミノ等がある。幾つかの実施形態は、「Ｃ１−２アルキルアミノ」である。
「アリール」という用語は、６から１０の環式炭素を含む芳香族環式遊離基を表す。例には、フェニル及びナフチルがある。
「アリールアルキル」という用語は、アリール基で更に置換される−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−等、Ｃ１−Ｃ４アルキレンを表す。アリールアルキルの例には、ベンジル、ベンジル、フェネチレン等がある。
「アリールカルボキサミド」という用語は、アミド基の窒素に結合された単一アリール基を表し、アリールは、本明細書に記載されるものと同じ定義を有する。例は、Ｎ−フェニルアルキルカルボキサミドである。
「アリールウレイル」という用語は、窒素の１つがアリールで置換される−ＮＣ（Ｏ）Ｎ−基を表す。
「ベンジル」という用語は、−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５基を表す。
「カルボ−Ｃ１−６−アルコキシ」という用語は、カルボン酸のＣ１−６アルキルエステルを指し、アルキル基は、本明細書に定義されるものである。幾つかの実施形態において、カルボ−Ｃ１−６−アルコキシ基は、窒素原子に結合され、共にカルバメート基（例えば、Ｎ−ＣＯＯ−Ｃ１−６−アルキル）を形成する。幾つかの実施形態において、カルボ−Ｃ１−６−アルコキシ基はエステルである（例えば、−ＣＯＯ−Ｃ１−６−アルキル）。例には、非限定的に、カルボメトキシ、カルボエトキシ、カルボプロポキシ、カルボイソプロポキシ、カルボブトキシ、カルボ−セク−ブトキシ、カルボ−イソ−ブトキシ、カルボ−ｔ−ブトキシ、カルボ−ペントキシ、カルボ−イソ−ペントキシ、カルボ−ｔ−ペントキシ、カルボ−ペントキシ、カルボ−ヘキシロキシ等がある。
「アルキルカルボキサミド」という用語は、−ＣＯＮＨ２基を指す。
「カルボキシ」又は「カルボキシル」は、カルボン酸基とも呼ばれる−ＣＯ２Ｈ基を表す。
「シアノ」という用語は、−ＣＮ基を表す。
「Ｃ３−７シクロアルケニル」という用語は、３から６の環式炭素及び少なくとも１つの２重結合を含む非芳香族環式遊離基を表す。幾つかの実施形態は３から５の炭素を含む。幾つかの実施形態は３から４の炭素を含む。例には、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等がある。
「Ｃ３−７シクロアルキル」という用語は、３から６の炭素を含む飽和環式遊離基を表す。幾つかの実施形態は３から５の炭素を含む。幾つかの実施形態は３から４の炭素を含む。例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペニル、シクロヘキシル、シクロヘプチル等がある。
「Ｃ４−８ジアシルアミノ」という要素は、本明細書に定義された２つのアシル基と結合したアミノ基を表し、アシル基は、以下等、同じ又は異なるとすることが可能である。
Figure 0005774264
 Ｃ４−８ジアシルアミノ基の例には、非限定的に、ジアセチルアミノ、ジプロピオニルアミノ、アセチルプロピオニルアミノ等がある。
「Ｃ２−６ジアルキルアミノ」という要素は、同じ又は異なるアルキル遊離基の２つで置換されたアミノを表す。幾つかの例には、非限定的に、ジメチルアミノ、メチルエチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルプロピルアミノ、メチルイソプロピルアミノ、エチルプロピルアミノ、エチルイソプロピルアミノ、ジプロピルアミノ、プロピルイソプロピルアミノ等がある。幾つかの例は、「Ｃ２−４ジアルキルアミノ」である。
「Ｃ１−４アルキルカルボキサミド」又は「Ｃ１−４ジアルキルアルキルカルボキサミド」は、アミド基に結合された同じ又は異なる２つのアルキル遊離基を表し、アルキルは、本明細書に定義されるものと同じ定義を有する。Ｃ１−４ジアルキルカルボキサミドは、以下によって表されることが可能であり、
Figure 0005774264
 Ｃ１−４は、本明細書に定義されるものと同じ定義を有する。ジアルキルアルキルカルボキサミドの例には、非限定的に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアルキルカルボキサミド、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアルキルカルボキサミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアルキルカルボキサミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアルキルカルボキサミド等がある。
「Ｃ２−６ジアルキルスルホンアミド」という用語は、以下に示された以下の基の１つを指す。
Figure 0005774264
 Ｃ１−３は、非限定的にメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル等、本明細書において記述されるものと同じ定義を有する。
「Ｃ２−６ジアルキルチオカルボキサミド」又は「Ｃ２−６ジアルキルチオアルキルカルボキサミド」は、チオアミド基に結合された同じ又は異なる２つのアルキル遊離基を表し、アルキルは、本明細書に定義されたものと同じ定義を有する。Ｃ１−４ジアルキルチオカルボキサミドは、以下の基によって表されることが可能である。
Figure 0005774264
 ジアルキルチオアルキルカルボキサミドの例には、非限定的に、Ｎ，Ｎ−ジメチルチオアルキルカルボキサミド、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルチオアルキルカルボキサミド等がある。
「Ｃ２−６ジアルキルスルホニルアミノ」という用語は、本明細書に定義された２つのＣ１−３アルキルスルホニル基と結合したアミノ基を指す。
「エチニレン」という用語は、以下のように表される炭素−炭素３重結合を指す。
Figure 0005774264
 「ホルミル」という用語は、−ＣＨＯを指す。
「Ｃ１−４ハロアルコキシ」という用語は、酸素原子に直接結合する本明細書に定義されるハロアルキルを表す。例には、非限定的に、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、ペンタフルオロエトキシ等がある。
「Ｃ１−４ハロアルキル」という用語は、本明細書に定義されるＣ１−４４アルキル基を表し、アルキルは、１つのハロゲンで置換され、又は完全に置換され、完全に置換されたＣ１−４ハロアルキルは、化学式ＣｎＬ２ｎ＋１で表すことができ、Ｌはハロゲンであり、「ｎ」は１、２、３又は４である。複数のハロゲンが存在し、それらは、同じ又は異なるとすることができ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、好ましくはＦとすることが可能である。Ｃ１−４ハロアルキル基の例には、非限定的に、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロジフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、ペンタフルオロエチル等がある。
「Ｃ１−４ハロアロキルカルボキサミド」は、本明細書に定義されたアルキルアルキルカルボキサミド基を表し、アルキルは、１つのハロゲンで置換され、又は完全に置換され、化学式ＣｎＬ２ｎ＋１によって表され、Ｌはハロゲンであり、「ｎ」は１、２、３又は４である。複数のハロゲンが存在し、それらは、同じ又は異なるとすることができ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、好ましくはＦとすることが可能である。
「Ｃ１−４ハロアルキルスルフィニル」という用語は、化学式−Ｓ（Ｏ）−のスルホキシド基に結合されたハロアルキル遊離基を表し、ハロアルキル遊離基は、本明細書において記述されるものと同じ定義を有する。例には、非限定的に、トリフルオロメチルスルフィニル、２，２，２−トリフルオロエチルスルフィニル、２，２−ジフルオロエチルスルフィニル等がある。
「Ｃ１−４ハロアルキルスルホニル」という用語は、化学式−Ｓ（Ｏ）２−のスルホン基に結合されたハロアルキル遊離基を表し、ハロアルキルは、本明細書において記述されるものと同じ定義を有する。例には、非限定的に、トリフルオロメチルスルホニル、２，２，２−トリフルオロエチルスルホニル、２，２−ジフルオロエチルスルホニル等がある。
「Ｃ１−４ハロアルキルチオ」という用語は、本明細書において記述されるものと同じ意味を有する。例には、非限定的に、ジフルオロメチルチオ（即ち、ＣＦ３Ｓ−）、１，１−ジフルオロエチルチオ、２，２，２−トリフルオロエチルチオ等がある。
「ハロゲン」又は「ハロ」という用語は、クロロ基、ブロモ基、イオド基を表す。
「Ｃ１−４ヘテロアルキレン」という用語は、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、及びＮＨから選択されるヘテロ原始に結合したＣ１−２アルキレンを指す。幾つかの表された例は、非限定的に、以下の化学式の基：
Figure 0005774264
 等を含む。
「ヘテロアリール」という用語は、１つの環、２つの融合環、又は３つの融合環である場合がある芳香族環系を表し、この場合、少なくとも１つの環式炭素は、Ｓ及びＮからなる群等から選択されるヘテロ原子で置き換えられ、Ｎは、必要に応じてＨ、Ｃ１−４アシル、又はＣ１−４アルキルで置換されてもよい。ヘテロアリール基の例には、ピリジル、ベンゾフラニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、キノリン、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、１Ｈ−ベンズイミダゾール、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリン等が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、ヘテロアリール原子は、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、その例にはピロール、インドール等が含まれるが、これらに限定されない。
「複素環式」という用語は、非芳香族炭素環（即ち、本明細書に定義されるシクロアルキル又はシクロアルケニル）を表し、この場合、１つ、２つ又は３つの環式炭素は、Ｏ、Ｓ、Ｎからなる群等から選択されるヘテロ原子によって置き換えられ、Ｎは、必要に応じてＨ、Ｃ１−４アシル、又はＣ１−４アルキルで置換されてもよく、環式炭素原子は、必要に応じてオキソ又はチオオキソで置換され、それによってカルボニル又はチオカルボニル基を形成してもよい。複素環式基は、３員、４員、５員、６員又は７員包含環である。複素環式基の例には、アジリジン−１−イル、アジリジン−２−イル、アゼチジン−ｌ−イル、アゼチジン−２−イル、アゼチジン−３−イル、ピペリジン−ｌ−イル、ピペリジン−４−イル、モルホリン−４−イル、ピペルジン−１−イル、ピペルジン−４−イル、ピロリジン−ｌ−イル、ピロリジン−３−イル、［１，３］−ジオキソラン−２−イル等が含まれるが、これらに限定されない。
「複素環式−カルボニル」という用語は、本明細書に定義される通り、カルボニル基（即ち、Ｃ＝Ｏ）の炭素に直接結合する複素環式基を表す。幾つかの実施形態において、複素環式基の環式窒素は、カルボニル基に結合してアミドを形成する。例としては、
Figure 0005774264
 等が含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、環式炭素は、カルボニル基に結合し、ケトン基を形成する。例としては、
Figure 0005774264
 等が含まれるが、これらに限定されない。
「複素環式−オキシ」という用語は、本明細書に定義される通り、酸素原子に直接結合する複素環式基を指す。例としては、
Figure 0005774264
 等が含まれるが、これらに限定されない。
「複素環式カルボキサミド」という用語は、本明細書に定義される通り、カルボニルに直接結合してアミドを形成する環式窒素を有する複素環式基を表す。例としては、
Figure 0005774264
 等が含まれるが、これらに限定されない。
「複素環式スルホニル」という用語は、本明細書に定義される通り、ＳＯ２基に直接結合してスルホンアミドを形成する環式窒素を有する複素環式基を表す。例としては、
Figure 0005774264
 等が含まれるが、これらに限定されない。
「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨ基を指す。
「ヒドロキシルアミノ」という用語は、−ＮＨＯＨ基を表す。
「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２基を表す。
「Ｃ４−７オキソ−シクロアルキル」は、環式炭素の１つはカルボニルで置き換えられる本明細書に定義されたＣ４−７シクロアルキルを指す。Ｃ４−７オキソ−シクロアルキルの例には、２−オキソ−シクロブチル、３−オキソ−シクロブチル、３−オキソ−シクロペンチル、４−オキソ−シクロヘキシル等が含まれるが、これらに限定されず、これらはそれぞれ以下の構造によって表される：
Figure 0005774264
 「ペルフルオロアルキル」という用語は、化学式−ＣｎＦ２ｎ＋１の基を表す。即ち、ペルフルオロアルキルは、本明細書に定義されるアルキルであり、アルキルがフッ素原子で完全に置換され、従って、ハロアルキルのサブセットと考慮される。ペルフルオロアルキルの例には、ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、ＣＦ（ＣＦ３）２、ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ（ＣＦ３）２、ＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２ＣＦ３等がある。
「フェノキシ」という用語は、Ｃ６Ｈ５Ｏ−基を指す。
「フェニル」という用語は、Ｃ６Ｈ５−基を指す。
「ホスホノオキシ」という用語は、以下の化学構造を有する基を指す：
Figure 0005774264
 「スルホンアミド」は、−ＳＯ２ＮＨ２基を指す。
「スルホン酸」は、−ＳＯ３Ｈ基を指す。
「テトラゾリル」という用語は、以下の化学式の５員ヘテロアリールを指す：
Figure 0005774264
 幾つかの実施形態において、テトラゾリル基は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ１−３ハロアルキル、及びＣ１−３アルコキシからなる群から選択される基で、それぞれ１位又は５位において更に置換される。
「チオール」という用語は、−ＳＨ基を表す。
「アパ」という用語は、アミノ−３−フェニルプロピオン酸を指す。
「ＧＬＰ−１分泌促進物質」という用語は、腸内分泌細胞等の細胞からのＧＬＰ−１の分泌を促進する物質（例えば、化合物）を意味する。
「内因性」は、哺乳動物が自然に生成する材料を意味する。
「Ｇタンパク質共役受容体の生物学的活性フラグメント」は、自然に生じるＧＰＣＲの構造及び生化学的機能を有するＧＰＣＲのフラグメントを意味する。特定の実施形態において、生物学的活性フラグメントは、Ｇタンパク質に結合する。特定の実施形態において、生物学的活性フラグメントは、ＧＰＣＲの既知のリガンドに結合する。
「プライマー」は、対象ヌクレオチド配列に対して相補的であり、且つ対象ヌクレオチド配列を交雑するために使用される特定のオリゴヌクレオチド配列を表すために本明細書では使用される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素によって特徴付けられるヌクレオチド重合の開始点として作用する。
「発現ベクター」という用語は、発現ベクターの適切な宿主細胞組換え体におけるクローンＤＮＡの転写及びｍＲＮＡの転写に必要とされるＤＮＡ配列を意味する。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自律複製のための複製の起点、選択マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高いコピー数の可能性、及び活性促進剤を含むはずである。転写されるクローンＤＮＡは、発現ベクター内の構成的又は条件的な活性促進剤に動作式に連結される。
「候補化合物」又は「試験化合物」は、遮蔽に適している化合物（例えば非限定的に化学化合物）を意味する。
「接触」又は「接触している」という用語は、少なくとも２つの成分を共に結合することを意味する。
「変調する」又は「修飾する」という用語は、特定の活性、機能、又は分子の量、質、あるい効果の増大又は低減を指すと解釈されるべきである。例として非限定的に、Ｇタンパク質共役受容体の作動薬、部分作動薬、逆作動薬、及び拮抗薬は、受容体の変調物質である。
「低分子」という用語は、モル当たり約１０，０００グラム未満の分子量を有し、ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機化合物、又は無機化合物（即ち、ヘテロ有機化合物、又は有機金属化合物を含む）、並びにその塩、エステル、及び他の薬学的に許容される形態を含む化合物を意味すると解釈されるべきである。特定の好ましい実施形態において、低分子は、モル当たり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機化合物又は無機化合物である。特定の好ましい実施形態において、低分子は、モル当たり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機化合物又は無機化合物である。特定の好ましい実施形態において、低分子は、モル当たり約５００グラム未満の分子量を有する有機化合物又は無機化合物である。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単鎖又は２重形態のる複数のヌクレオチドのＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を指す。本発明のポリヌクレオチドは、合成、組換え体、ｅｘ ｖｉｖｏ生成、又はその組み合わせを含む任意の既知の方法によって、並びに当該技術分野で既知の任意の精製方法を使用して調製されることが可能である。
「ポリペプチド」は、ポリマーの長さに関係なく、アミノ酸のポリマーを指す。従って、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質が、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語は又、ポリペプチドの後発現を規定又は排除しない。例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸塩基、脂質基等の共有結合を含むポリペプチドが、ポリペプチドという用語によって明示的に包含される。
「抗体」という用語は、本明細書において、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を包含することが意図される。
「第２メッセンジャー」は、受容体活性化の結果として生成された細胞内応答を意味する。第２メッセンジャーは、例えば、イノシトール１，４，５−三リン酸塩（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環式ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、ＭＡＰキナーゼ活性、ＭＡＰ／ＥＰＫキナーゼキナーゼ−１（ＭＥＫＫ−１）活性、及びＣａ２＋を含んでもよい。第２メッセンジャーの応答は、受容体の活性化を判定するために測定することができる。
「受容体の機能」は、刺激を受信し、非限定的に遺伝子の転写を調節する、イオンの流入若しくは流出を調節する、触媒反応を実施する、及び／又は第２メッセンジャー応答を誘起する等、Ｇタンパク質により活性を変調することを含めて、細胞における効果を緩徐にする受容体の通常の動作を指す。
受容体の「応答」又は「機能」という用語に関する「刺激する」又は「刺激している」という用語は、受容体の応答又は機能が、化合物が存在しない場合とは対照的に、化合物が存在する場合に増大されることを意味する。
受容体の「応答」又は「機能」という用語に関する「阻害する」又は「阻害している」という用語は、受容体の応答又は機能が、化合物が存在しない場合とは対照的に、化合物が存在する場合に低減又は防止されることを意味する。
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と加減の間にある各介在値、及びその指定範囲におけるあらゆる他の指定値又は介在値は、文脈が明瞭に指示しない限り、下限の１０分の１まで、本発明の範囲内にあることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、指定範囲において任意の明確に排除された限界を条件として、より小さい範囲において独立に含まれることが可能であり、本発明の範囲内にも包含される。指定範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの一方又は両方を排除する範囲も、本発明において含まれる。
ＢＲＳ−３作動薬
ＢＲＳ−３は、哺乳動物のＥＲＳ−３であることが好ましい。ＢＲＳ−３は、齧歯類又は霊長類のＢＲＳ−３であることがより好ましい。ＢＲＳ−３は、ヒトのＢＲＳ−３であることが最も好ましい。
本発明の新規の治療組み合わせにおいて有用なＢＲＳ−３作動薬は、ＢＲＳ−３受容体について許容可能に高い親和性を示す化合物を含む。ＢＲＳ−３作動薬又は薬学的に許容される塩は、任意の作動薬、より好ましくは選択的ＢＲＳ−３作動薬とすることが可能である。
ＢＲＳ−３作動薬の例は、開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｗｅｂｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ （２００３） ４６：１９１８−１９３０に記載されている。
ＢＲＳ−３作動薬の例は、開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｍａｎｔｅｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ （２００４） ３１０：１１６１−１１６９に記載されている。
ＢＲＳ−３作動薬の例は、開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｂｏｙｌｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ （２００５） １１：１３６−１４１に記載されている。
ＢＲＳ−３作動薬の例は、開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｌａｍｍｅｒｉｃｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ （２００３） １３８：１４３１−１４４０に記載されている。
一態様において、ＢＲＳ−３作動薬は、表Ｂの左列から選択される。
一態様において、ＢＲＳ−３作動薬は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５、化合物１６、化合物１７、化合物１８、化合物１９、化合物２０、化合物２１、化合物２２、化合物２３、化合物２４、化合物２５、化合物２６、及び化合物２７から選択され、これらの化合物は、Ｂｏｙｌｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ （２００５） １１：１３６−１４１において見ることが可能であり、選択的ＢＲＳ−３作動薬として記載されている。
一態様において、ＢＲＳ−３作動薬は、化合物２８、化合物２９、及び化合物３０から選択され、これらの化合物は、Ｍａｎｔｅｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ （２００４） ３１０：１１６１−１１６９において見ることが可能であり、選択的ＢＲＳ−３作動薬として記載されている。
一態様において、ＢＲＳ−３作動薬は、化合物３１、化合物３２、及び化合物３３から選択され、これらの化合物は、Ｂｏｙｌｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｙｌｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ （２００５） １１：１３６−１４１において見ることが可能であり、選択的ＢＲＳ−３作動薬として記載されている。
一態様において、ＢＲＳ−３作動薬は、化合物３４であり、この化合物は、Ｍａｎｔｅｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ （２００４） ３１０：１１６１−１１６９において見ることが可能であり、ＧＰＲ−Ｒ及びＮＭＢ−Ｒに対してＢＲＳ−３について非選択的であると記載されている。
本発明の一態様において、任意の１つ以上のＢＲＳ−３作動薬を本発明の任意の実施形態から排除することができる。
本発明の一態様において、ＢＲＳ−３作動薬は、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ、未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。ＢＲＳ−３作動薬は、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ、又は約１ｎＭ未満のＥＣ５０を有することが好ましい。
本発明の一態様において、ＢＲＳ−３作動薬は、選択的ＢＲＳ−３作動薬が胃放出ペプチド受容体（ＧＰＲ−Ｒ）又はニューロメディンＢ受容体（ＮＭＢ−Ｒ）に対してＢＲＳ−３について、少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍の選択性を有する、選択的ＢＲＳ−３作動薬である。本発明の一態様において、ＢＲＳ−３作動薬は、選択的ＢＲＳ−３作動薬あ、胃放出ペプチド受容体（ＧＰＲ−Ｒ）及びニューロメディンＢ受容体（ＮＭＢ−Ｒ）に対してＢＲＳ−３について、少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍の選択性を有する、選択的ＢＲＳ−３作動薬である。
本発明の一態様において、ＢＲＳ−３作動薬は、経口活性である。
本発明の一態様において、ＢＲＳ−３作動薬は、ヒトＢＲＳ−３の作動薬である。
ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤
本発明の新規の治療組み合わせにおいて有用なＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、ＤＰＰ−ＩＶについて許容可能に高い親和性を示す化合物を含む。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤又は薬学的に許容される塩は、任意のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、より好ましくは選択的ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤、最も好ましくは選択的ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤である。
ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の例は、それぞれの開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｖｉｌｌｈａｕｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ （２００３） ４６：２７７４−２７８９（ＬＡＦ２３７の例）；Ａｈｒｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ （２００４） ８９：２０７８−２０８４；Ｖｉｌｌｈａｕｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ （２００２） ４５：２３６２−２３６５（ＮＶＰ−ＤＰＰ７２８の例）；Ａｈｒｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ （２００２） ２５：８６９−８７５（ＮＶＰ−ＤＰＰ７２８の例）；Ｐｅｔｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ （２００４） １４：１４９１−１４９３；Ｃａｌｄｗｅｌｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ （２００４） １４：１２６５−１２６８；Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ （２００４） １４：５１５１−５１５５；及びＡｂｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ （２００４） ６７：９９９−１００４に記載されている。
ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の具体的な例には、例えば、開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、米国特許第６，３０３，６６１号に記載の通り、アラニン−ピロリジド、イソロイシン−チアゾリジド、及び偽基質Ｎ−バリルプロリル、Ｏ−ベンゾイルヒドロキシルアミン等のジペプチド誘導体又はジペプチド擬似体が含まれるが、これらに限定されない。
ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の例は、それぞれの開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、米国特許第６，８１２，３５０号、第６，８０３，３５７号、第６，７１０，０４０号、第６，６１７，３４０号、第６，６９９，８７１号、第６，５７３，２８７号、第６，４３２，９６９号、第６，３９５，７６７号、第６，３０３，６６１号、第６，２４２，４２２号、第６，１６６，０６３号に記載されている。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の例は、それぞれの開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、米国特許出願番号第２００４２４２８９８号、第２００４１８０９２５号、第２００４１１０８１７号、第２００４１０６６５６号、第２００３２３２７８８号、第２００３２１６４５０号、第２００３１３４８０２号、第２００３１２５３０４号、第２００３１３０２８１号、第２００３１１９７３８号、第２００３−１００５６３号、第２００３１１９７５０号、第２００３１３０１９９号、第２００２１８３３６７号、第２００２０４９１６４号、第２００２００６８９９号に記載されている。
ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の例は、それぞれの開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、国際出願第ＷＯ ０４／１０３９９３号、第ＷＯ ０４／１０３２７６号、第ＷＯ ０４／９９１３４号、第ＷＯ ０４／８７０５３号、第ＷＯ ０４／７６４３４号、第ＷＯ ０４／７６４３３号、第ＷＯ ０４／６９１６２号、第ＷＯ ０４／６４７７８号、第ＷＯ ０４／７１４５４号、第ＷＯ ０４／６９１６２号、第ＷＯ ０４／６７５０９号、第ＷＯ ０４／５８２６６号、第ＷＯ ０４／５２８５０号、第ＷＯ ０４／５００２２号、第ＷＯ ０４／５０６５８号、第ＷＯ ０４／３２８３６号、第ＷＯ ０４／４６１０６号、第ＷＯ ０４／４３９４０号、第ＷＯ ０４／４１７９５号、第ＷＯ ０４／３７１６９号、第ＷＯ ０４／３７８１号、第ＷＯ ０３／０１９５８号、第ＷＯ０４／１４８６０号、第ＷＯ ０４／０７４６８号、第ＷＯ ０４／０４６６１号、第ＷＯ ０３／８２８１７号、第ＷＯ ０３／７２５２８号、第ＷＯ ０３／５７６６６号、第ＷＯ ０３／５７１４４号、第ＷＯ ０３／４０１７４号、第ＷＯ ０３／３７３２７号、第ＷＯ ０３／３５０６７号、第ＷＯ ０３／３５０５７号、第ＷＯ ０３／２２８７１号、第ＷＯ ０３／１５７７５号、第ＷＯ ０３／０４４９８号、第ＷＯ ０３／０２５３０号、第ＷＯ ０３／０２５９６号、第ＷＯ ０３／０２５９５号、第ＷＯ ０３／０２５９３号、第ＷＯ ０３／０２５５３号、第ＷＯ ０３１０２５３１号、第ＷＯ ０３／００１８１号、第ＷＯ ０３／００１８０号、第ＷＯ ０３／００２５０号、第ＷＯ ０２／８３１０９号、第ＷＯ ０２／８３１２８号、第ＷＯ ０２／７６４５０号、第ＷＯ ０２／５１８３６号、第ＷＯ ０２／３４９００号、第ＷＯ ０１／９６２９５号、第ＷＯ ０１／８１３３７号、第ＷＯ ０１／８１３０４号、第ＷＯ ０１／６８６０３号、第ＷＯ ０１／３４５９４号、第ＷＯ ００／３４２４１号、第ＷＯ ００／２３４２１号、第ＷＯ ９９／６７２７８号、第ＷＯ ９９／６１４３１号、第ＷＯ ９８／１９９９８号、第ＷＯ ９７／４０８３２号、第ＥＰ １４８０９６１号、第ＥＰ １４６９８７３号、第ＥＰ １４６５８９１号、第ＥＰ １４５０７９４号、第ＥＰ １４４６１１６号、第ＥＰ １４１２３５７号、第ＥＰ １３９９４２０号、第ＥＰ １３９９４７１号、第ＥＰ １３９９４７０号、第ＥＰ １３９９４６９号、第ＥＰ １３９９４３３号、第ＥＰ １４０６８７３号、第ＥＰ １４０６６２２号、第ＥＰ １４０６８７２号、第ＥＰ １３９９１５４号、第ＥＰ １３７７２８８号、第ＥＰ １３８５５０８号、第ＥＰ １３５４８８２号、第ＥＰ １３０４３２７号、第ＥＰ １２９６９７４号、第ＥＰ １２８０７９７号、第ＥＰ １２８２６００号、第ＥＰ １２６１５８６号、第ＥＰ １２１５２０７号、第ＥＰ １２２８０６１号、第ＥＰ １１３７６３５号、第ＥＰ １１２３２７２号、第ＥＰ １０８２３１４号、第ＣＡ ２４３３０９０号、第ＤＥ １９８２８１１３号、第ＤＥ １９８２３８３１号、第ＤＥ １９６１６４８６号、第ＤＥ １０２５６２６４号、第ＤＥ １０１４３８４０号、第ＪＦ ２００４２４４４１２号、第ＪＰ ２００４０２６８２０号、第ＪＰ ２００３３００９７７号、第ＪＰ ２００４５２１１４９号、第ＪＰ ２００４５３０７２９号、第ＪＰ ２００４５２５１７９号、第ＪＰ ２００４５２５９２９号、第ＪＰ ２００４５０３５３１号、第ＪＰ ２００３５３５０３４号、第ＪＰ ２００３５３１２０４号、第ＪＰ ２００３５３１１９１号、第ＪＰ ２００３５３１１１８号、第ＪＰ ２００３５２４５９１号、第ＪＰ ２００２５３１５４７号、第ＪＰ ２００２５２７５０４号、第ＪＰ ２００２５１６３１８号、第ＪＰ ２００１５１０４４２号、第ＪＰ ２０００５１１５５９号、第ＪＰ ２０００１９１６１６号に記載されている。
本発明の一態様において、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、バリン−ピロリジドである［開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｄｅａｃｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ （１９９８） ４７：７６４−７６９］。
本発明の一態様において、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、３−（Ｌ−イソロイシル）チアゾリジン（イソロイシン−チアゾリジド）である。イソロイシン−チアゾリジドについては、それぞれの開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、第ＪＰ ２００１５１０４４２号、第ＷＯ ９７／４０８３２号、米国第６，３０３，６６１号、及び第１Ｅ １９６１６４８６号に記載されている。イソロイシン−チアゾリジドは、経口活性及び選択的ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤として記載されている［開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｐｅｄｅｒｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ （１９９８） ４７：１２５３−１２５８］。
本発明の一態様において、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、１−［２−［５−シアノピリジン−２−イル）アミノ］エチルアミノ］アセチル−２−シアノ−（Ｓ）−ピロリジン（ＮＶＰ−ＤＰＰ７２８）である。ＮＶＰ−ＤＰＰ７２８については、それぞれの開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、第ＷＯ ９８／１９９９８号及び第ＪＰ ２０００５１１５５９号に記載されている。ＮＶＰ−ＤＰＰ７２８は、経口活性及び選択的ＤＤＰ−ＩＶ阻害剤として記載されている［Ｖｉｌｌｈａｕｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ （２００２） ４５：２３６２−２３６５］。
本発明の一態様において、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、３（Ｒ）−アミノ−１−［３−（トリフルオロメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロ［１，２，４］トリアゾロ［４，３−アルピラジン−７−イル］−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ブタン−１−オン（ＭＸ−０４３１）である。ＭＸ−０４３１については、それぞれの開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、第ＥＰ １４１２３５７号、第ＷＯ ０３／０４４９８号、米国第６６９９８７１号、及び米国特許第２００３１００５６３号に記載されている。ＭＫ−０４３１は、経口活性及び選択的ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤として記載されている［開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｗｅｂｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ （２００４） ５３（Ｓｕｐｐ１．２）：Ａ１５１， ６３３−Ｐ（Ａｂｓｔｒａｃｔ）］。
本発明の一態様において、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、（１−［［３−ヒドロキシ−１−アダマンチルアミノ］アセチル］−２−シアノ−（Ｓ）−ピロリジン（ＬＡＦ２３７）である。ＬＡＦ２３７については、それぞれの開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、米国第６，１６６，０６３号、第ＷＯ ００／３４２４１号、第ＥＰ １１３７６３５号、及び第ＪＰ ２００２５３１５４７号に記載されている。ＬＡＦ２３７は、経口活性及び選択的ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤として記載されている［Ｖｉｌｌｈａｕｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ （２００３） ４６：２７７４−２７８９］。
本発明の一態様において、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、（１Ｓ，３５，５Ｓ）−２−［２（Ｓ）−アミノ−２−（３−ヒドロキシアダマンタン−ｌ−イル）アセチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル（ＢＭＳ−４７７１１８）である。
本発明の一態様において、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、表Ｂの右列から選択される。
本発明の一態様において、任意の１つ以上のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、本発明の任意の実施形から排除することができる。
本発明の一態様において、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ、未満、約２０ｎＭ未満、約１５未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭのＩＣ５０である。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ、又は約１ｎＭ未満のＣＩ５０を有することが好ましい。
本発明の一態様において、ＤＤＰ−ＩＶ阻害剤は、選択的ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、ＰＰＣＥ、ＤＰＰ−ＩＩ、ＤＰＰ−８、及びＤＰＰ−９の１つ以上に対して、ヒトの血漿について少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、及び最も好ましくは少なくとも約１００倍の選択性を有する、選択的ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤である。
本発明の一態様において、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、経口活性である。
本発明の一態様において、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、ヒトＤＰＰ−ＩＶの阻害剤である。
ＢＲＳ−３作動薬とＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせ
例示及び非限定として、本発明によるＢＲＳ−３作動薬とＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の例示的な組み合わせが、表Ｂの左列からＢＲＳ−３作動薬を選択し、表Ｂの右列からＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を選択することによって提供される。表Ｂの左列からＢＲＳ−３作動薬を選択し、表Ｂの右列からＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を選択することによって提供されるＢＲＳ−３作動薬とＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の各個々の組み合わせが本発明の範囲内の別の実施形態であることが、明らかに考慮される。
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 更に、本発明の化合物は、表Ｂに示すものも含め、その薬学的に許容される塩、溶媒化合物、及び水和物を包含する。例えば、開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｂｅｒｇｅ， ｅｔ ａｌ．， （１９７７）， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６６：１−１９；及びＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｏｌｉｄｓ （１９９９） Ｂｒｉｔｔａｉｎ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．を参照されたい。
上述の組み合わせ治療に関して、本発明による化合物は、任意の適切な方式で投与することができる。適切な投与経路は、当該技術分野で既知の方法を使用する経口、鼻、直腸、経粘膜、経皮、又は腸投与、筋肉内射、皮下射、髄内注射を含む非経口的送達、並びに鞘内注射、直接心室内注射、静脈内注射、腹膜内注射、鼻腔内注射、肺内（吸入）注射、又は眼球内注射がある。他の適切な投与経路は、エアロゾル及びデポー調合物である。発明された医薬品の徐放性調合物、特にデポーが、明確に考慮される。特定の好ましい実施形態において、本発明による化合物は、経口投与される。本発明による化合物は、タブレット、カプセル、粉末、シロップ、エリキシル等、エアロゾル、無菌溶液、懸濁液、エマルジョン等の固体又は液体の形態で作成することができる。特定の実施形態において、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の一方又は両方が、経口投与される。
経口投与される調合物は、固体のタブレット及びカプセルの調合物の他に、水溶液及び水性懸濁液の形態とすることが可能である。水溶液及び水性懸濁液は、無菌の粉末又は顆粒から調製されることが可能である。化合物は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、綿実油、ピーナツ油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、及び／又は種々の緩衝剤に溶解することが可能である。他の補助剤が、当該技術分野で周知である。
ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、糖尿病又はそれに関連する病態の処置又は予防のために同時、別個又は順番に使用される混合製剤である場合があることが理解されるであろう。このような混合製剤は、例えば、２重パックの形態である場合がである。
従って、本発明は、糖尿病又はそれに関連する病態の予防又は処置において、同時に、別々に、又は順番に使用される混合製剤としてＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる産物を考慮することが更に理解されるであろう。
ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる本発明の組み合わせは、本明細書において記述される薬学的に許容される担体、賦形剤、結合剤、希釈液等と共に、又は独立にＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を混合し、１つ以上の混合物を薬学的組成物として経口的又は非経口的に投与することによって調製することができる。
従って、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤又は薬学的組成物は、別々の投与形態又は単一の投与形態において投与することができることが更に理解されるであろう。
ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が別々の投与形態にある時、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、異なる経路によって投与することができる。
個々の又は組み合わされたＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、従来の混合、溶解、顆粒化、糖剤作成、研和、エマルジョン化、カプセル化、飛沫同伴、凍結乾燥のプロセス、又は噴霧乾燥等、当該技術分野で周知の方法によって調製されることが可能である。
本発明により使用される薬学的組成物は、薬剤として使用することができる調剤に活性化合物を処理するのを容易にする賦形剤及び補助剤を備える１つ以上の薬学的に許容される担体を使用する従来の方式で、調合することが可能である。適切な薬学的に許容される担体は、当業者に入手可能である［例えば、開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．）， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２０００， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ （Ｒｏｗｅ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．）、４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００３， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓを参照］。適切な調合物は、選択される投与経路に依存する。本明細書の「担体」材料又は「賦形剤」材料という用語は、取扱い又は貯蔵の特性を向上させるために、或いは経口投与に適切なカプセル又はタブレット等の離散物品に組成物の投与単位を形成するのを可能する又は容易にするために、それ自体は治療剤ではないが、治療剤を対象に送達するために担体及び／若しくは希釈液及び／若しくは補助剤又はビヒクルとして使用される、或いは薬学的組成物に追加された任意の物質を意味する。補助剤には、例えば、希釈液、崩壊剤、結合剤、接着剤、湿潤剤、ポリマー、潤滑剤、滑剤、不快な味又は匂いを遮断又は相殺するために追加される物質、香料、染料、芳香剤、組成物の外見を改善するために追加される物質が含まれてもよいが、これらに限定されない。許容される賦形剤には、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム塩及びカルシウム塩、炭酸マグネシウム、ゲラチン、アカシア、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、デキストリン、マニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、スターチ、ゲラチン、セルロース材料、アルカノイック酸のセルロースエステル及びセルロースアルカリエステル等のセルロース材料、低融点ワックスココアバター又は粉末、ビニル−ピロリドン、ポリビニルアルコール、及びポリエチレングリコール等のポリマー、並びに他の薬学的に許容される材料が含まれる。薬学的組成物の成分は、投与に好都合であるようにカプセル化又はタブレット化することができる。
「薬学的に許容される」とは、組成物、調合物、安定性、患者許容性、及び生物学的利用能について、薬理学的／毒物学的観点から患者にとって、及び物理／化学的観点から薬剤製造化学者にとって許容される特性及び／又は物質を指す。
ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が別々の投与形態にある時、ＢＲＳ−３作動薬調合物に使用される薬学的に許容される担体は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤調合物に使用される薬学的に許容される担体と同一である必要はないことを理解されたい。
糖剤のコアは、コーティングを備える。このために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに適切な有機溶媒又は溶媒混合物を必要に応じて含むことが可能である濃縮糖溶液が使用されることが可能である。染料又は色素が、活性化合物投与の異なる組み合わせを識別する又は特徴付けるために、タブレット又は糖剤のコーティングに追加されることが可能である。
経口的に使用することができる薬学的組成物には、グリセロール又はソルビトール等、ゲラチンで作成された押込みばめカプセル、並びにゲラチン及び可塑剤で作成された柔軟封止カプセルがある。押込みばめカプセルは、ラクトース等の充填剤、スターチ等の結合剤、及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、必要に応じて安定剤と混和した活性成分を含んでもよい。柔軟カプセルでは、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコール、クレモフォア、カプムル、中鎖又は長鎖のモノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリド等、適切な液体において溶解する又は懸濁することが可能である。
更に、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、徐放性システムを使用して送達することが可能である。種々の徐放性材料が確立されており、当業者に周知である。徐放性タブレット又はカプセルが、特に好ましい。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の時間遅延材料が使用されることが可能である。投与形態は又、制御された放出のために浸透性治療タブレットを形成するように、米国特許第４２５６１０８号、第４１６６４５２号、及び第４２６５８７４号に記載されている技法によってコーティングされることも可能である。
本発明の組み合わせ治療は、単独で、或いは１つ以上の他の薬学的又は生理学的に許容される化合物と組み合わせて、投与又は提供されることが可能である。本発明の一態様において、他の薬学的又は生理学的に許容される化合物は、ＢＲＳ−３作動薬ではなく、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤ではない。
本発明の一態様において、他の薬学的又は生理学的に許容される化合物は、スルホニル尿素（例えば、グリベンクラミド、グリピジド、グリクラジド、グリメピリド）、メグリチニド（例えば、レパグリニド、ナテグリニド）、ビグアニド（例えば、メタホルミン）、αグリコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、エパルレスタット、ミグリトール、ボグリボース）、チザオリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン）、インスリン類似体（例えば、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン）、ピコリン酸クロム／ビオチン、及び生物学的剤（例えば、アジポネクチン、又はそのＣ末端球状ドメインを備えるフラグメント、或いはアジポネクチン又はその前記フラグメントのマルチマ、或いはアジポネクチン受容体ＡｄｉｐｏＲｌ又はＡｄｉｐｏＲ２の作動薬、前記作動薬は経口活性であることが好ましい）。本発明の一態様において、薬剤はメトホルミンである。本発明の一態様において、薬剤は、アジポネクチン受容体ＡｄｉｐｏＲｌ又はＡｄｉｐｏＲ２に対する作動薬であり、前記作動薬は経口活性であることが好ましい。
本発明の一態様において、他の薬学的又は生理学的に許容される化合物はアポリポタンパク質−Ｂ分泌／ミクロソマルトリグリセリド伝達タンパク質（ａｐｏ−Ｂ／ＭＴＰ）阻害剤、ＭＣＲ−４作動薬、コレシストキニン−Ａ（ＣＣＫ−Ａ）作動薬、セロトニン、及びノルエピネフリン再取込み阻害剤（例えば、シブトラミン）、交感神経様作用剤、β３アドレナリン受容体作動薬、ドーパミン作動薬（例えば、ブロモクリプチン）、メラニン細胞刺激ホルモン受容体類似体、カンナビノイドＩ受容体拮抗薬［例えば、ＳＲ１４１７１６：Ｎ−（ピペリジン−ｌ−イル）−５−（４−クロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−アルキルカルボキサミド］、メラニン濃縮ホルモン拮抗薬、レプトン（ＯＢタンパク質）、レプチン類似体、レプチン受容体作動薬、ガラニン拮抗薬、リパーゼ阻害剤（テトラヒドロリプスタリン、即ちオルリスタット）、食欲抑制剤（ボンベシン作動薬等）、ニューロペプチド−Ｙ拮抗薬、チロミメティック剤、デヒドロエピアンドロステロン又はその類似体、グルココルチコイド受容体作動薬又は拮抗薬、オレキシン受容体拮抗薬、ウルコルチン結合タンパク質拮抗薬、グルカゴン様ペプチド−１受容体作動薬、毛様神経栄養因子（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．［米国ニューヨーク州テリータウン］及びＰｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙ［米国オハイオ州シンシナティ］から入手可能なアキソインＴＭ）、ヒトアグーチ関係タンパク質（ＡＧＲＰ）、グレリン受容体拮抗薬、ヒスタミン３受容体拮抗薬又は逆作動薬、ニューロメディンＵ受容体作動薬、ノルアドレナリン食欲抑制剤（例えば、フェンテルミン、マジンドール等）、及び食欲抑制剤（例えば、ブプロピン）等、抗肥満症剤である。幾つかの実施形態において、抗肥満症剤は、オルリスタット、シブトラミン、ブロモクリプチン、エフェドリン、レプチン、及びプソイドエフェドリンからなる群から選択される。
本発明による組み合わせ治療では、本発明によるＢＲＳ−３作動薬及び本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、同時に又は別々の間隔で投与することができる。同時に投与される時、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、単一の薬学的組成物に組み込むことができ、又は一方の組成物においてＢＲＳ−３作動薬及び他の組成物においてＤＰＰ−ＩＶ阻害剤等、別々の組成物に組み込むことができる。これらの組成物のそれぞれは、共通の賦形剤、希釈液、又は担体と共に調合し、タブレット、或いは処方されたエリキシル又は溶液に圧縮することが可能であり、及び徐放性投与形態等として処方することが可能である。ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、異なる経路を介して投与することが可能である。例えば、ＢＲＳ−３作動薬は、タブレットを介して経口的に投与することが可能であり、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、吸入を介して投与することが可能である。
別々に投与される時、本発明によるＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の治療上有効量は、異なるスケジュールで投与される。一方は、２つの投与間の時間が治療に有効な間隔の範囲内にある限り、他方の前に投与されることが可能である。治療に有効な間隔は、（ａ）ＢＲＳ−３作動薬又は（ｂ）ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の一方が哺乳動物に投与される時に開始し、（ａ）及び（ｂ）の組み合わせの処置において有益な効果の限界において終了する時間期間である。
一態様において、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に、一定量の本発明によるＢＲＳ−３作動薬及び一定量の本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを本質的に備える、又はそれからなる薬学的組成物を特徴とする。
一態様において、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に、一定量の本発明によるＢＲＳ−３作動薬及び一定量の本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを本質的に備える、又はそれからなる薬学的組成物を特徴とする。本発明は又、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中グルコースレベルを低下させる効果を与えるのに十分な量である、薬学的組成物の投与形態にも関する。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。
一態様において、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に、一定量の本発明によるＢＲＳ−３作動薬及び一定量の本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを本質的に備える、又はそれからなる薬学的組成物を特徴とする。本発明は又、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が対象における血中グルコースレベルを低下させる効果を与えるのに十分な量であり、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中グルコースレベルを低下させるには治療に無効である、薬学的組成物の投与形態にも関する。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。
一態様において、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に、一定量の本発明によるＢＲＳ−３作動薬及び一定量の本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを本質的に備える、又はそれからなる薬学的組成物を特徴とする。本発明は又、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中グルコースレベルを低下させる効果を与えるのに十分な量であり、効果が相乗効果である、薬学的組成物の投与形態にも関する。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。
一態様において、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に、一定量の本発明によるＢＲＳ−３作動薬及び一定量の本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを本質的に備える、又はそれからなる薬学的組成物に関する。本発明は又、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中グルコースレベルを低下させる効果を与えるのに十分な量であり、効果が相乗効果であり、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中グルコースレベルを低下させるには治療として無効である、薬学的組成物の投与形態にも関する。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは血中グルコースレベルである。
一態様において、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に、一定量の本発明によるＢＲＳ−３作動薬及び一定量の本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを本質的に備える、又はそれからなる薬学的組成物に関する。本発明は又、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中グルコースレベルを低下させる効果を与えるのに十分な量であり、その量のＢＲＳ−３作動薬及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせによって与えられる効果が、その量のＢＲＳ−３作動薬単独によって与えられる効果、及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独によって与えられる効果より優れている、薬学的組成物の投与形態にも関する。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは血中グルコースレベルである。
一態様において、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に、一定量の本発明によるＢＲＳ−３作動薬及び一定量の本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを本質的に備える、又はそれからなる薬学的組成物を特徴とする。本発明は又、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるように十分な量である、薬学的組成物の投与形態にも関する。
一態様において、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に、一定量の本発明によるＢＲＳ−３作動薬及び一定量の本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを本質的に備える、又はそれからなる薬学的組成物を特徴とする。本発明は又、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるように十分な量であり、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるには治療として無効である、薬学的組成物の投与形態にも関する。
一態様において、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に、一定量の本発明によるＢＲＳ−３作動薬及び一定量の本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを本質的に備える、又はそれからなる薬学的組成物を特徴とする。本発明は又、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるように十分な量であり、効果が相乗効果である、薬学的組成物の投与形態にも関する。
一態様において、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に、一定量の本発明によるＢＲＳ−３作動薬及び一定量の本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを本質的に備える、又はそれからなる薬学的組成物を特徴とする。本発明は又、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるように十分な量であり、効果が相乗効果であり、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるには治療といして無効である、薬学的組成物の投与形態にも関する。
一態様において、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に、一定量の本発明によるＢＲＳ−３作動薬及び一定量の本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせを本質的に備える、又はそれからなる薬学的組成物を特徴とする。本発明は又、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるように十分な量であり、その量のＢＲＳ−３作動薬及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせによって与えられる効果が、その量のＢＲＳ−３作動薬単独によって与えられる効果、及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独によって与えられる効果より優れている、薬学的組成物の投与形態にも関する。
本発明において使用するのに適切な薬学的組成物にはその意図した目的を達成する量で、活性成分が含まれる組成物がある。幾つかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、糖尿病及びそれに関連する病態を処置又は予防するのに有用であることが理解される。肥満症及びそれに関連する病態は、本発明による。幾つかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用であることが理解される。血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態は、本発明による。
本発明の組み合わせ治療の特定の実施形態において、本発明によるＢＲＳ−３作動薬の量及び本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の量は、対象における血中グルコースレベルを低下させるのに相乗効果を与える量で提供される。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。対象における血中グルコースレベルを低下させるのに相乗効果を与えるＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の量の決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内にある。本発明の組み合わせ治療の一実施形態において、本発明によるＢＲＳ−３作動薬の量及び本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の量は、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中グルコースレベルを低下させるには治療として無効である、対象における血中グルコースレベルを低下させるのに相乗効果を与える量で提供される。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中グルコースレベルを低下させるには治療として無効である、対象における血中グルコースレベルを低下させることについて相乗効果を提供するＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の量の決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内にある。
本発明の組み合わせ治療の特定の実施形態において、本発明によるＢＲＳ−３作動薬の量及び本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の量は、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて相乗効果を与えるような量で提供される。対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに相乗効果を与えるＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の量の決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内にある。本発明の組み合わせ治療の一実施形態において、本発明によるＢＲＳ−３作動薬の量及び本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の量は、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるには治療として無効である、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるのに相乗効果を与える量で提供される。その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させるには治療として無効である、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて相乗効果を提供するＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の量の決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内にある。
非限定的にマウス、ラット、ウサギ、豚、及び非ヒト霊長類を使用する研究を含めて、動物研究から得られたデータは、ヒトに使用されるある範囲の投与量を処方する際に使用することができる。一般的に、当業者は、動物モデルにおいて得られたｉｎ ｖｉｖｏデータをヒト等のその他にどのように外挿するかを理解している。幾つかの環境では、これらの外挿は、ヒト等のその他と比較して動物モデルの重量にのみ基づくことが可能である。他の環境では、これらの外挿は、単に重量に基づくだけでなく、種々の因子を組み込む。代表的な因子には、患者のタイプ、年齢、体重、性別、食餌、及び医療条件、疾患の深刻さ、投与経路、使用される特定の化合物の活性、効能、薬物動態学的及び毒物学的プロファイル等の医療条件、薬剤送達システムが使用されるか、急性若しくは慢性の疾患状態が処置されているか、又は予防が実施されるか、或いは、本発明の化合物の他に、及び薬剤組み合わせの一部として他の活性化合物が投与されるか、がある。本発明の化合物及び／又は組成物で疾患条件を処置する投与体系は、上述された種々の因子により選択される。それゆえ、使用される実際の投与体系は、広範に変化する可能性があり、従って、好ましい投与量体系から逸脱する可能性があり、当業者であれば、これらの通常の範囲外の投与量及び投与体系は試験することができ、適切であれば、本発明の方法において使用することが可能であることを理解するであろう。
例示的で好ましい動物モデル系は、マウスにおける経口グルコース耐性試験（ｏＧＴＴ）である（実施例１を参照）。このモデルでは、例示として非限定的に、治療には無効であるＢＲＳ−３作動薬単独の量又はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独の量は、約３０％以下、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満、より好ましくは約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満の糖血可動域の曲線下面積（ＡＵＣ）阻害を生成するＢＲＳ−３作動薬単独の量又はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独の量である。このモデルでは、例示として非限定的に、治療には無効であるＢＲＳ−３作動薬単独の量又はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独の量は、約０〜３０％、約０〜２５％、約０〜２０％、約０〜１５％、約０〜１０％、又は約０〜５％、より好ましくは約０〜２５％、約０〜２０％、約０〜１５％、約０〜１０％、又は約０〜５％の糖血可動域の曲線下面積（ＡＵＣ）阻害を生成するＢＲＳ−３作動薬単独の量又はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独の量である。このモデルでは、例示として非限定的に、本発明によるＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせの治療上有効量は、約３０％を超える、約３５％を超える、約４０％を超える、約４５％を超える、約５０％を超える、約５５％を超える、約６０％を超える、約６５％を超える、約７０％を超える、約７５％を超える、約８０％を超える、約８５％を超える、約９０％を超える、又は約９５％を超える、より好ましくは約３５％を超える、約４０％を超える、約４５％を超える、約５０％を超える、約５５％を超える、約６０％を超える、約６５％を超える、約７０％を超える、又は約７５％を超える、約８０％を超える、約８５％を超える、約９０％を超える、又は約９５％を超える糖血可動域の曲線下面積（ＡＵＣ）阻害を生成するＢＲＳ−３作動薬単独の量又はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独の量である。
投与量及び間隔は、本発明による対象における血中グルコースレベルを低下させることにおいて相乗効果を提供するように、又は本発明による対象における血中ＧＬＰ−１レベル上げることにおいて相乗効果を提供するように、調節することが可能である。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。本発明によるＢＲＳ−３作動薬又はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の正確な投与量は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせ、その効力、投与モード、患者の年齢及び体重、処置される条件の深刻さに応じて変化することが理解されるであろう。正確な調合物、投与形態、及び投与量は、患者の条件を考慮して、個々の医師によって選択することができる。例示として非限定的に、本発明による対象における血中グルコースレベルを低下させることにおいて相乗効果を提供する、又は本発明による対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることにおいて相乗効果を提供するＢＲＳ−３作動薬又はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重未満、約１ｍｇ／ｋｇ体重未満、約５ｍｇ／ｋｇ体重未満、約１０ｍｇ／ｋｇ体重未満、約５０ｍｇ／ｋｇ体重未満、又は約１００ｍｇ／ｋｇ体重未満である。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。幾つかの実施形態において、本発明による対象における血中グルコースレベルを低下させることにおいて相乗効果を提供する、又は本発明による対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることにおいて相乗効果を提供するＢＲＳ−３作動薬又はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の量は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜５ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１から０．５ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜０．１ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ体重未満、約０．００１〜０．０１ｍｇ／ｋｇ体重未満、又は約０．００１〜０．００５ｍｇ／ｋｇ体重未満である。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。幾つかの実施形態において、本発明による対象における血中グルコースレベルを低下させることにおいて相乗効果を提供する、或いは本発明による対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて相乗効果を提供ＢＲＳ−３作動薬又はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の量は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１から１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１〜０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、又は約０．００１〜０．００５ｍｇ／ｋｇ体重である。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。
追加の例示的で好ましい動物モデル系は、マウスにおけるグルコースチャレンジ試験後の血中ＧＬＰ−１レベルの上昇である（実施例１５を参照）。
投与量及び間隔は、本発明による対象における血中グルコースレベルを低下させることについて相乗効果を提供する、又は本発明による対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて相乗効果を提供する本発明によるＢＲＳ作動薬及び本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の血漿レベルを提供するように、個々に調節されることが可能である。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。投与間隔も、本発明による対象における血中グルコースレベルを低下させることについて相乗効果を提供する、又は本発明による対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて相乗効果を提供するＢＲＳ作動薬濃度の選択範囲の値及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤濃度の選択範囲の値を使用して決定することもできる。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、時間の１０％〜９０％、好ましくは時間の３０％〜９９％の間、最も好ましくは時間の５０％〜９０％の間について、血漿レベルをそれぞれＢＲＳ−３作動薬濃度及びＤＤＰ−ＩＶ阻害剤濃度の選択範囲内に維持する体系を使用して投与されるべきである。局所投与又は選択的摂取の場合、本発明による対象における血中グルコースレベルを低下させることについて相乗効果を提供する、又は本発明による対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて相乗効果を提供するＢＲＳ−３作動薬濃度の範囲又はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤濃度の範囲は、血漿濃度に関係しない可能性がある。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。
投与される組成物の量は、当然、処置される対象、対象の体重、苦痛の深刻さ、投与方式、及び処方医師の判断に依存する。
従って、一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、糖尿病又はそれに関連する病態を処置又は予防する方法を更に特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、糖尿病又はそれに関連する病態を処置又は予防する方法を更に特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中グルコースレベルを低下させることについて効果を与えるのに十分な量で投与される、前記方法を特徴とする。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、糖尿病又はそれに関連する病態を処置又は予防する方法を更に特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中グルコースレベルを低下させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中グルコースレベルを低下させることについて治療として無効である、前記方法を特徴とする。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、糖尿病又はそれに関連する病態を処置又は予防する方法を更に特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中グルコースレベルを低下させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、効果が相乗効果である、前記方法を特徴とする。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、糖尿病又はそれに関連する病態を処置又は予防する方法を更に特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中グルコースレベルを低下させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、効果が相乗効果であり、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中グルコースレベルを低下させることについて治療として無効である、前記方法を特徴とする。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、糖尿病又はそれに関連する病態を処置又は予防する方法を更に特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中グルコースレベルを低下させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、その量のＢＲＳ−３作動薬及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせによって与えられる効果が、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独によって与えられる効果より優れている、前記方法を特徴とする。特定の実施形態において、血中グルコースレベルは、上昇した血中グルコースレベルである。
本発明の組み合わせ治療は、ヒトを含む哺乳動物において、最も好ましくはヒトにおいて、糖尿病又はそれに関連する病態を処置又は予防するのに有用である。幾つかの実施形態において、糖尿病は、１型糖尿病である。幾つかの実施形態において、２型糖尿病である。糖尿病に関連する病態には、高血糖症、グルコース耐性障害、インスリン抵抗性、膵臓β細胞不全、腸内分泌細胞不全、糖尿、代謝性アシドーシス、白内障、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿性網膜症、糖尿病性冠状動脈疾患、糖尿病性脳血管性疾患、糖尿性抹消血管性疾患、代謝症候群、高脂血症、アテローム性粥状硬化症、脳卒中、高血圧症、及び肥満症が含まれるが、これらに限定されない。糖尿病に関連する病態は、実施形態に個別に又は任意に組み合わせて含まれてもよいことが理解される。
相応して、一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、ボディマスを減少させる方法を特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、ボディマスを減少させる方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与される、前記方法を特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、ボディマスを減少させる方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて治療として無効である、前記方法を特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、ボディマスを減少させる方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、効果が相乗効果である、前記方法を特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、ボディマスを減少させる方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、効果が相乗効果であり、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて治療として無効である、前記方法を特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、ボディマスを減少させる方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、その量のＢＲＳ−３作動薬及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせによって与えられる効果が、その量のＢＲＳ−３作動薬単独によって与えられる効果、又はその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独によって与えられる効果より優れている、前記方法を特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、肥満症又はそれに関連する病態を予防又は処置置する方法を相応して特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、肥満症又はそれに関連する病態を予防又は処置する方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与される、前記方法を特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、肥満症又はそれに関連する病態を予防又はｈ措置する方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、
、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて治療として無効である、前記方法を特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、肥満症又はそれに関連する病態を予防又はｈ措置する方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、効果が相乗効果である、前記方法を特徴とする。
一態様において、一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、肥満症又はそれに関連する病態を予防又はｈ措置する方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、効果が相乗効果であり、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて治療として無効である、前記方法を特徴とする。
一態様において、一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、肥満症又はそれに関連する病態を予防又はｈ措置する方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、その量のＢＲＳ−３作動薬及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせによって与えられる効果が、その量のＢＲＳ−３作動薬単独によって与えられる効果、又はその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独によって与えられる効果より優れている、前記方法を特徴とする。
本発明の組み合わせ治療は、ヒトを含む哺乳動物において、最も好ましくはヒトにおいて、肥満症又はそれに関連する病態を処置又は予防するのに有用である。肥満症に関連する病態には、高血圧症、うっ血性心筋症、静脈瘤、肺塞栓、冠状性心疾患、脳卒中、突発性頭蓋内高血圧症、知覚異常性大腿神経痛、呼吸困難、閉塞性睡眠無呼吸、低換気症候群、ピックウィック症候群、喘息、不動症、変性骨関節炎、腰痛、皮膚裂線又は「伸展裂創」、下肢の静脈うっ血、リンパ浮腫、細胞歯肉炎、間擦疹、カンブンケル、黒色表皮腫、懸垂線維腫、胃食道逆流疾患、非アルコール性脂肪肝／脂肪肝炎、胆石症、ヘルニア、大腸がん、ストレス失禁、肥満症に関係する糸球体症、乳がん及び子宮がん、抑うつ及び低自己評価、生活の質の低下、代謝症候群、２型糖尿病、脂肪異常症、女性のハイパーアンドロゲネミア、多嚢胞卵巣症候群、月経困難症、不妊症、妊娠合併症、及び男性性機能低下症が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、肥満症に関連する病態は、高血圧症、うっ血性心筋症、冠状性心疾患、脳卒中、脂肪異常症、代謝症候群、及び２型糖尿病からなる群から選択される。肥満症に関連する病態は、実施形態に個別に又は任意に組み合わせて含まれてもよいことが理解される。
相応して、一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防する方法を特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防する方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与される、前記方法を特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防する方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて治療として無効である、前記方法を特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防する方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、治療が相乗効果である、前記方法を特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防する方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、治療が相乗効果であり、その量のＢＲＳ−３作動薬単独及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて治療として無効である、前記方法を特徴とする。
一態様において、本発明は、本発明による一定量のＢＲＳ−３作動薬及び本発明による一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を本質的に備える、又はそれからなる組成物の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防する方法を特徴とする。関係する態様において、本発明は、ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、対象における血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることについて効果を与えるのに十分な量で投与され、その量のＢＲＳ−３作動薬及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせによって与えられる効果が、その量のＢＲＳ−３作動薬単独の量によって与えられる効果、及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独の量によって与えられる効果より優れている、前記方法を特徴とする。
発明の組み合わせ治療は、ヒトを含む哺乳動物において、最も好ましくはヒトにおいて、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用である。肥満症に関連する病態には、非限定的に、糖尿病、糖尿病に関連する病態、心筋梗塞、学習障害、記憶障害、及び神経変性障害あり、糖尿病に関連する病態には、非限定的に、高血糖症、耐糖能異常、インスリン抵抗性、膵臓β細胞不全、腸内分泌細胞不全、糖尿、代謝性アシドーシス、白内障、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿性網膜症、糖尿性冠状動脈疾患、糖尿性心臓血管疾患、糖尿性抹消血管性疾患、代謝症候群、高脂血症、アテローム性粥状硬化症、脳卒中、高血圧症、及び肥満症があり、神経変性障害には、重度のてんかん性発作によって生じる興奮毒性脳障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、プリオン関連疾患、脳卒中、運動ニューロン疾患、学習障害又は記憶障害、外傷性脳傷害、脊髄損傷、及び抹消神経障害が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、糖尿病は、１型糖尿病である。幾つかの実施形態において、糖尿病は、２型糖尿病である。血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態は、実施形態に個別に又は任意に組み合わせて含まれてもよいことが理解される。
当業者であれば上の説明を利用して本発明を完全に実践できることが、容易に考えられる。以上の詳細な説明は、理解を明瞭にするためにのみ示されており、本発明の適用範囲に含まれる改変が当業者には明らかであることから、不必要な限定を目的としたものではないことがこれらの説明から理解されるはずである。
本発明の主題に関連し、当業者に周知である組換え体ＤＮＡ技法については、例えば、開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２００１） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている。
本出願を通して、種々の刊行物、特許、及び特許出願が引用されている。本明細書で参照されているこれらの刊行物、特許、及び特許出願の開示内容は、参考として全体が本開示内容に組み入れられている。本明細書における出願人による刊行物、特許、又は特許出願の引用は、前記刊行物、特許、及び特許出願を従来技術として本出願人が承認するものではない。
当業者であれば上の説明を利用して本発明を完全に実践できることが、容易に考えられる。以下の詳細な実施例は、単に例示を目的としたものであり、先行する開示内容を何ら限定するものではないと解釈されなければならない。当業者であれば、手順からの適切な変更を即座に理解するであろう。
実施例１
内因性ヒトＢＲＳ−３の完全長クローニング
ＢＲＳ−３特異プライマー５’−ＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡＧＧＣＡ−３’（配列番号３；ＥｃｏＲＩ部位でのセンス、開始コドンとしてのＡＴＧ）、及び、
５’−ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＡＡＧＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＴＣＣ−３’（配列番号４；ＢａｍＨＩ部位でのアンチセンス、停止コドンのアンチセンスとしてのＣＴＡ）、及び、
テンプレートとしてヒト子宮ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ポリヌクレオチドコード内因性ヒトＢＲＳ−３をクリーニングした。ＴａｑＰｌｕｓ ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、手順２から手順４を２５回繰り返して以下のサイクルによって増幅するために使用した：
９４℃、３分；９４℃、１分；５６℃、１分；７２℃、１分２０秒；７２℃、１０分。
予測されたサイズの１．２３Ｋｂ ＰＣＲフラグメントを単離し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＣＭＶ発現ベクターにクリーニングし、Ｔ７ ＤＮＡ配列キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して配列した。核酸配列について配列番号１及び推定アミノ酸配列について配列番号２を参照されたい。
実施例２
受容体の発現
種々の細胞が、Ｇタンパク質共役受容体の発現のための分野に利用可能であるが、哺乳動物細胞又はメラニン保有細胞が使用されることが最も好ましい。以下がその例であり；当業者は、技術者の要求に対して優先的に有益である技法を特定する能力を持つ。例えば、メラニン保有細胞に関する以下の実施例６を参照されたい。
ａ．過渡的なトランスフェクション
１日目、２９３細胞の６×１０６／１０ｃｍ皿をプレートアウトした。２日目、２つの反応管を用意する（各管についての以下の割合はプレート当たりである）：０．５ｍｌ血清なしＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）において４μｇＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；受容体ｃＤＮＡを有するｐＣＭＶベクター等）を混合することによって管Ａを準備する；０．５ｍｌ血清なしＤＭＥＭにおいて２４μＬリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を混合することによって管Ｂを準備する。管Ａ及びＢを倒置によって混和し（数回）、続いて室温にて３０分〜４５分間培養する。混和物は、「トランスフェクション混合物」と呼ばれる。プレートアウトした２９３細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、続いて５ｍｌ血清なしＤＭＥＭを追加する。１ｍｌのトランスフェクション混合物を細胞に追加し、続いて３７℃／５％ＣＯ２において４時間培養する。トランスフェクション混合物を吸引によって除去し、続いて、１０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清を追加する。細胞を３７℃／５％ＣＯ２において培養する。４８時間培養した後、細胞を回収し、分析に使用する。
ｂ．安定細胞系統
約１２×１０６の２９３細胞を１５ｃｍ組織培養プレートの上にプレート（実施例アウトする。１０パーセントのウシ胎仔血清及び１パーセントのピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、及び抗生物質を含むＤＭＥ高グルコース培地で成長させる。２９３細胞のプレートアウト（又は〜８０％までの細胞密度）を２４時間続け、１２μｇのＤＮＡを使用して（例えば、受容体ｃＤＮＡを有するｐＣＭＶベクター）細胞をトランスフェクトする。１２μｇのＤＮＡを６０μＬのリポフェクタミン及び血清のない２ｍｌのＤＭＥ高グルコース培地と組み合わせる。培地をプレートから吸引し、血清を有さない培地で細胞を１回洗浄した。ＤＮＡ、リポフェクタミン、及び培地混合物を、血清のない１０ｍｌの培地と共にプレートに追加する。３７℃で４時間〜５時間培養した後、培地を吸引し、２５ｍｌの血清含有培地を追加する。トランスフェクションから２４時間後、培地を再び吸引し、血清を有する新規の培地を追加する。トランスフェクションから４８時間後、培地を吸引し、約１２×１０６の２９３細胞の最終濃度においてゲネチシン（Ｇ４１８薬剤）を含む血清を有する培地を追加し、１５ｃｍ組織培養プレート上でプレートアウトする。１０パーセントのウシ胎仔血清及び１パーセントのピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、及び抗生物質を含むＤＭＥ高グルコース培地で成長させる。２９３細胞のプレートアウト（又は〜８０％までの細胞密度）の２４時間、１２μｇのＤＮＡを使用して（例えば、受容体ｃＤＮＡを有するｐＣＭＶベクター）細胞をトランスフェクトする。１２μｇのＤＮＡを６０μＬのリポフェクタミン及び血清のない１２ｍｌのＤＭＥ高グルコース培地と組み合わせる。培地をプレートから吸引し、血清を有さない培地で１回洗浄した。ＤＮＡ、リポフェクタミン、及び培地混合物を、血清のない１０ｍｌの培地と共にプレートに追加する。３７℃で４時間から５時間培養した後、培地を吸引し、２５ｍｌの血清含有培地を追加する。トランスフェクションから２４時間後、培地を再び吸引し、血清を有する新規の培地を追加する。トランスフェクションから４８時間後、培地を吸引し、５００μｇ／ｍｌの最終濃度においてゲネチシン（Ｇ４１８薬剤）を含む血清を有する培地を追加する。この段階で、トランスフェクション細胞は、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を含む陽性トランスフェクション細胞の選択を受ける。選択が行われる４日から５日ごとに培地を交換する。選択中、細胞は成長して、安定したプールを生成する、又は安定したクローン選択のために分割する。
実施例３
ＢＲＳ３作動薬として候補化合物を遮蔽するための検定
ＢＲＳ３作動薬として候補化合物を遮蔽する手法は、種々のものが利用可能である。以下がその例であり；当業者は、技術者の要求に対して優先的に有益である技法を特定する能力を持つ。Ｇタンパク質共役受容体の作動薬として化合物を遮蔽する検定は、当業者に周知である（例えば、国際出願第ＷＯ ０２／４２４６１号を参照）。
１．膜結合検定：［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ検定
Ｇタンパク質共役受容体がリガンド結合又は構成活性化の結果として活性状態にある時、受容体は、Ｇタンパク質に結合し、ＧＤＰの放出及びその後のＧタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。Ｇタンパク質受容体複合体のαサブユニットは、ＧＴＰａｓｅとして作用し、ＧＴＰをＧＤＰにゆっくり加水分解し、この時点で受容体は通常不活性化される。活性化受容体は、ＧＤＰをＧＴＰと交換し続ける。非加水分解可能ＧＴＰ類似体［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを使用して、活性化受容体を発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合の向上を実証することができる。活性化を測定するために［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を使用する利点は、（ａ）一般に全てのＧタンパク質共役受容体に適用可能である、（ｂ）膜表面の近傍において、細胞内カスケードに影響を与える分子を拾い上げるする可能性を低くすることである。
検定は、関係受容体を発現する膜に［３５Ｓ］ＧＴＰγＳが結合するのを刺激するＧタンパク質共役受容体の能力を使用する。検定は包括的であり、全てのＧタンパク質共役受容体における薬剤送達に適用される。
膜の調製
幾つかの実施形態において、本発明のＧタンパク質共役受容体を備え、且つ受容体の作動薬等の候補化合物の特定に使用される膜は、以下のように調製されることが好ましい。
ａ．材料
「膜掻取り緩衝液」は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１０ｍＭのＦＤＴＡ、ｐＨ７．４からなる；「膜洗浄緩衝液」は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び０．１のｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４からなる；「結合緩衝液」は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣ１及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４からなる。
ｂ．手順
手順を通して全材料を氷の上において維持する。まず、培地を細胞のコンフルエントな単層から吸引し、続いて、１０ｍｌの冷ＰＢＳで濯ぎ、続いて吸引する。その後、細胞を掻き取るために、５ｍｌの膜掻取り緩衝液を追加する；これに続いて、細胞抽出物を５０ｍｌの遠心分離管に移す（４℃で１７分間２０，０００ｒｐｍにおいて遠心分離する）。その後、上澄み液を吸引し、ペレットを３０ｍｌの膜洗浄緩衝液に再懸濁させ、続いて４℃で１７分間２０，０００ｒｐｍにおいて遠心分離する。次いで、上澄み液を吸引し、ペレットを結合緩衝液に再懸濁させる。ついで、これをＢｒｉｎｋｍａｎ ＰｏｌｙｔｒｏｎＴＭホモジナイザーを使用して均質化する（全ての材料が懸濁するまでの１５秒〜２０秒のバースト）。本明細書では、これを「膜タンパク質」と呼ぶ。
ブラッドフォードタンパク質検定
均質化に続いて、ブラッドフォードタンパク質検定を使用して膜のタンパク質濃度を決定する（タンパク質は、約１．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、後の使用のために小分けし、凍結する（−８０℃）ことができる。凍結している時、使用するプロトコルは以下のとおりである：検定の日に、凍結膜タンパク質を室温にて解凍し、続いて撹拌し、次いで約１２×１，０００ｒｐｍにおいて約５秒〜１０秒間ポリトロンで均質化する。複数の製剤の場合、ホモジナイザーは、均質化の異なる準備間において完全に清浄されるべきであることに留意されたい）。
ａ．材料
結合緩衝材（上記の通り）；ブラッドフォード染料試薬；製造業者の指示（Ｂｉｏｒａｄ，カタログ番号５００−０００６）に従って、ブラッドフォードタンパク質標準を使用する。
ｂ．手順
２重管を準備し、一方は膜を含み、一方は制御「ブランク」としてである。それぞれ、８００μＬの結合緩衝液を含んでいた。その後、１０μＬのブラッドフォードタンパク質標準（１ｍｇ／ｍｌ）を各管に追加し、次いで１０μＬの膜タンパク質を１つの管にのみ追加する（ブランクには追加しない）。その後、２００μＬのブラッドフォード染料試薬を各管に追加し、続いてそれぞれを撹拌する。５分後、管を再び撹拌し、内部の材料をキュベットに移す。次いで、波長５９５において、ＣＥＣＩＬ３０４１分光光度計を使用して、キュベットを読み取る。
特定検定
ａ．材料
ＧＤＰ緩衝液は、３７．５ｍｌの結合緩衝液及び２ｍｇのＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｇ−７１２７）からなっており、続いて結合緩衝液において一連の希釈を行い、０．２μＭＧＤＰ（各ウェルのＧＤＰの最終濃度は、０．１μＭのＧＤＰであった）を得た。候補化合物を備える各ウェルは、２００μＬの最終容積を有し、１００μＬのＧＤＰ緩衝液（最終濃度、０．１μＭのＧＤＰ）、結合緩衝液における５０μＬの膜タンパク質、及び結合緩衝液における５０μＬの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）（１０ｍｌ結合緩衝液当たり２．５μＬ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ）からなる。
ｂ．手順
９６ウェルプレート（実施例フォーマット（これらは、−８０℃で凍結することができる）を使用して候補化合物を遮蔽することが好ましい。膜タンパク質（又は、制御として、対象ＧＰＣＲを除く発現ベクターを有する膜）を懸濁するまで短時間均質化する。次いで、上述されたブラッドフォードタンパク質検定を使用して、タンパク質濃度を決定する。次いで、膜タンパク質（及び制御）を結合緩衝液において０．２５ｍｇ／ｍ１に希釈する（最終検定濃度、１２．５μｇ／ウェル）。その後、１００μＬのＧＤＰ緩衝液をＷａｌｌａｃ ＳｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐＴＭ（Ｗａｌｌａｃ）の各ウェルに追加した。次いで、５μＬのピンツールを使用して、５μＬの候補化合物をこのようなウェルに移す（即ち、２００μＬの全検定容積における５μＬは、候補化合物の最終遮蔽濃度が１０μＭであるように、１：４０の比率である）。再び、汚染を避けるために、各移動手順後、ピンツールを、水（１×）、エタノール（１×）、及び水（２×）を備える３つのリザーバにおいて濯がなければならない−過剰な液体は、各濯ぎ後、ツールからふるい落とされ、紙及びキムワイプで乾燥されるべきである。その後、５０μＬの膜タンパク質を各ウェルに追加し（対象ＧＰＣＲを有さない膜を備える制御ウェルも使用した）、室温にて５分〜１０分間事前培養した。その後、結合緩衝液における５０μＬの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）を各ウェルに追加し、続いて、室温にて６０分間シェーカー上において培養する（再び、この例では、プレートをフォイルで覆った）。次いで、２２℃で１５分間４０００ＲＰＭでプレートをスピンさせることによって、検定を停止する。次いで、プレートを８チャンネルマニホルドで吸引し、プレートカバーで封止する。次いで、設定条件「Ｐｒｏｔ．＃３７」を使用してＷａｌｌａｃ１４５０の上において、プレートを読み取る（製造業者の指示通り）。
２．アデニリルシクラーゼ検定
粗血漿膜と共に使用するように、細胞に基づく検定用に設計されたＦｌａｓｈＰｌａｔｅＴＭアデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）を修正することができる。ＦｌａｓｈＰｌａｔｅウェルは、ｃＡＭＰを認識する特定の抗体をも含むシンチラントコーティングを含んでもよい。ウェルにおいて生成されたｃＡＭＰ遺伝子は、放射性ｃＡＭＰトレーサをｃＡＭＰ抗体に結合するための直接的な競合によって定量化することができる。以下は、受容体を発現する全細胞においてｃＡＭＰレベルの変化を測定する簡潔なプロトコルとして作用する。
特定の実施形態において、修正されたＦｌａｓｈ ＰｌａｔｅＴＭアデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）が、以下のプロトコルに従って、ＢＲＳ−３作動薬等の候補化合物を同定するために使用される。
本発明のＧタンパク質共役受容体がトランスフェクトされた細胞をトランスフェクションの約３日後に回収する。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液において懸濁細胞を均質化することによって、膜を調製する。均質化をＢｒｉｎｋｍａｎ ＰｏｌｙｔｒｏｎＴＭを使用して約１０秒間氷の上において実施する。結果として得られたホモジネートを４℃で１５分間４９，０００Ｘｇで遠心分離する。次いで、結果として得られたペレットを２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４及び０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液において再懸濁させ、１０秒間均質化し、続いて４℃で１５分間４９，０００Ｘｇにおいて遠心分離する。次いで、結果として得られたペレットを使用まで−８０℃で貯蔵する。直接特定遮蔽の当日、膜ペレットを室温でゆっくり解凍し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液において再懸濁させ、０．６０ｍｇ／ｍ１の最終的なタンパク質濃度を得る（再懸濁膜を使用まで氷の上に置く）。
ｃＡＭＰ標準及び検出緩衝液（１１ｍｌの検出緩衝液に対して２μＣｉのトレーサ｛［１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（１００μＬ）を備える｝を調製し、製造業者の命令に従って維持する。検定緩衝液を遮蔽のために新たに調製し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのホスホクレアチン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭのＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、及び０．２ｍＭのＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を含んでいた；次いで、検定緩衝液を使用まで氷の上で貯蔵する。
候補化合物を、４０μＬの膜タンパク質（３０μｇ／ウェル）及び５０μＬの検定緩衝液と共に、例えば９６ウェルプレートウェル（３μＬ／ウェル；１２μＭの最終検定濃度）に追加することが好ましい。次いで、この混和物を緩徐に振りながら室温で３０分間培養した。
培養に続いて、１００μＬの検出緩衝液を各ウェルに追加し、続いて、２時間〜２４時間培養した。次いで、プレートを「Ｐｒｏｔ．＃３１」を使用してＷａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴＭプレートリーダーにおいて計数した（製造業者の指示通り）。
３．レポーター検定
ａ．ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーター検定
製造業者の指示に従って、２９３及び２９３Ｔ細胞をウェル当たり２×１０４細胞の密度で９６ウェルプレートの上にプレートアウトし、次の日、リポフェクタミン試薬（ＢＲＬ）を使用してトランスフェクトした。以下のようにＤＮＡ／脂質混合物を各６ウェルのトランスフェクションのために調製した：１００μＬのＤＭＥＤにおける２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを１００μＬのＤＭＥＭにおける２０μＬの脂質と共に緩徐に混合する（２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは、２００ｎｇの８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド、本発明のＧタンパク質共役受容体を含む５０ｎｇのｐＣＭＶ又はｐＣＭＶ単独、及び１０ｎｇのＧＰＲＳ発現プラスミド［ｐｃＤＮＡ３におけるＧＰＲＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる］。８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを以下のように調製した：ｐβｇａｌ−ベーシックベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢｇｌＶ−Ｈｉｎｄｉｌｌ部位においてラットソマトスタチン促進剤（−７１／＋５１）をクリーニングすることによって、ベクターＳＲＩＦ−β−ガルを得た。ｃＡＭＰ応答要素の８のコピーを、アデノウィルステンプレートＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８からＰＣＲによって獲得し（例えば、開示内容全体が参考として本明細書に組み入れられている、Ｓｕｚｕｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ （１９９６） ７：１８８３−１８９３を参照）、Ｋｐｎ−ＢｇｌＶ部位においてＳＲＩＦ−β３−ガルベクターにクリーニングし、８ｘＣＲＥ−β−ガルレポーターベクターを得た。８ｘＣＲＥ−β−ガルレポーターベクターのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をｐＧＬ３−ベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）から得たルシフェラーゼ遺伝子とＨｉｒｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部において置き換えることによって、８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを生成した。３０分間室温にて培養した後、ＤＮＡ／脂質混合物を４００μＬのＤＭＥＭで希釈し、１００μＬの希釈混合物を各ウェルに追加する。細胞培養物培養器において４時間培養した後、１０％ＦＣＳを有する１００μＬのＤＭＥＭを各ウェルに追加する。次の日、トランスフェクション細胞を１００のＤＭＥＭを、１０％ＦＣＳを有する２００μＬ／ウェルのＤＭＥＭで変化させる。８時間後、ＰＢＳで１回洗浄した後、ウェルを、フェノールレッドを有さない１００μＬ／ウェルのＤＭＥＭに変化させる。次の日、製造業者の指示に従って、ＬｕｃＬｉｔｅＴＭレポーター遺伝子検定キット（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定し、１４５０ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴＭシンチレーション及びルミネセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ）の上で読み取る。
ｂ．ＡＰ１レポーター検定（Ｇｑ関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出する方法は、プロモーターにおいてＡＰ１要素を含む遺伝子を活性化させるＧｑ依存ホスホリパーゼＣの既知の特性に依存する。ＣＲＥＢレポーター検定に関して上述されたプロトコルに従って、ＰａｔｈｄｅｔｅｃｔＴＭ ＡＰ−１シス−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２−１９０７３）を使用することができるが、リン酸カルシウム沈殿物の成分が、４１０ｎｇのｐＡＰ１−Ｌｕｃ、８０ｎｇのｐＣＭＶ受容体発現プラスミド、及び２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰであったことは除く。
ｃ．ＳＲＦ−ＬＵＣレポーター検定（Ｇｑ関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出する方法は、プロモーターにおいて血清応答因子を含む遺伝子を活性化させるさせるＧｑ依存ホスホリパーゼＣの既知の特性に依存する。ＰａｔｈｄｅｔｅｃｔＴＭ ＳＲＦ−Ｌｕｃ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、例えばＣＯＳ７細胞におけるＧｑ結合活性を検定することができる。即ち、製造業者の指示に従って、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＴＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００２８５）を使用して、細胞にシステムのプラスミド成分及び指示された発現プラスミドコード内因性又は非内因性ＧＰＣＲをトランスフェクションする。製造業者の指示に従って、４１０ｎｇのＳＲＦ−Ｌｕｃ、８０ｎｇのｐＣＭＶ受容体発現プラスミド、及び２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌されたアルカリホスファターゼ発現プラスミド；アルカリホスファターゼ活性は、サンプル間のトランスフェクション効率のばらつきを制御するために、トランスフェクション細胞の培地において測定される）をリン酸カルシウム沈殿物において組み合わせる。沈殿物の半分を９６ウェルプレートの３つのウェルに均等に分配し、血清のない培地において２４時間細胞の上に維持する。最後の５時間、細胞を例えば１μＭの試験化合物で培養する。次いで、製造業者の指示に従って細胞を濯ぎ、ルシフェラーゼ活性について、ＬｕｃｌｉｔＴＭ キット（Ｐａｃｋａｒｄ、カタログ番号６０１６９１１）及び「Ｔｒｉｌｕｘ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ」液体シンチレーション及びルミネセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ）を使用して検定する。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍＴＭ ２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して、データを分析することができる。
４．細胞内ＩＰ３蓄積検定（Ｇｑ関連受容体）
１日目、本発明のＧタンパク質共役受容体をトランスフェクトされる細胞を、２４ウェルプレートの上に、通常は１×１０５細胞／ウェル（しかしこの数は最適化することができる）で培養することができる。２日目、５０μＬ血清なしＤＭＥＭ／ウェルにおける０．２５μｇのＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；受容体ｃＤＮＡを有するｐＣＭＶベクター等）及び５０μＬ血清なしＤＭＥＭ／ウェルにおける２μＬのリポフェクタミンとまず混合することによって、細胞をトランスフェクトすることができる。溶液を緩徐に混合し、室温にて１５分〜３０分間培養する。細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、４００μＬの血清なし培地をトランスフェクション培地と混合し、細胞に追加する。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ２において３〜４時間培養し、次いでトランスフェクション培地を除去し、１ｍｌ／ウェルの正規成長培地と置き換える。３日目、細胞に３Ｈ−ミオ−イノシトールで標識する。即ち、培地を除去し、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄する。次いで、０．５ｍｌのイノシトールなし／血清なし培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を０．２５μＣｉの３Ｈ−ミオ−イノシトール／ウェルと共に追加し／ウェル、細胞を３７℃／％ＣＯ２で１６時間〜１８時間培養する。４日目、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、イノシトールなし／血清なし培地１０μＭパルギリン１０ｍＭ塩化リチウム又は０．４ｍｌの検定培地を含む０．４５ｍｌの検定培地及び５０ｍμＬの１０×試験化合物を１０μＭの最終濃度に追加する。次いで、細胞を３７℃で３０分間培養する。次いで、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、２００μＬの新規／氷停止溶液（１ＭのＫＯＨ；１８ｍＭのホウ酸ナトリウム；３．８ｍＭのＥＤＴＡ）を追加する／ウェル。溶液を氷の上において５分〜１０分間、又は細胞を溶解するまで維持し、次いで２００の新規／氷停止中和ゾル（７．５％ＨＣＬ）によって中和する。溶解産物を１．５ｍｌエッペンドルフ管に移し、１ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：２）を追加する／管。溶液を１５秒間撹拌し、上相をＢｉｏｒａｄ ＡＧ１−Ｘ８ＴＭ陰イオン交換樹脂（１００〜２００メッシュ）に追加する。まず、樹脂を１：１．２５Ｗ／Ｖにおいて水で洗浄し、０．９ｍｌの上相をカラムに装填する。カラムを１０ｍｌの５ｍＭミオ−イノシトール及び１０ｍｌの５ｍＭホウ酸ナトリウム／６０ｍＭギ酸ナトリウムで洗浄する。イノシトール三リン酸塩を２ｍｌの０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムを有する１０ｍｌのシンチレーションカクテルを含むシンチレーションバイアルの中に溶出する。１０ｍｌの０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸アンモニウムで洗浄することによって、カラムを再生しｄｄＨ２Ｏで２回濯ぎ、水において４℃で貯蔵する。
実施例４
細胞内カルシウム濃度を測定するための蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）検定（例えば、Ｇ１関連受容体）
翌日の検定のために、対象受容体（実験）及びそれぞれのクローン系統からのｐＣＭＶ（負の制御）安定トランスフェクション細胞を、完全培養培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを有するＤＭＥＭ）と共に５．５×１０４細胞／ウェルで、ポリ−Ｄ−リシン前処置９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、＃３５６６４０）の中に接種する。Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、＃Ｆ１４２０２）培養緩衝液ストックを調製するために、１ｍｇのＦｌｕｏ４−ＡＭを４６７μＬのＤＭＳＯ及び４６７μＬのプルオロニック酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、＃Ｐ３０００）に溶解し、２０℃で１月貯蔵することができる１ｍＭｍｐ貯蔵溶液を得る。Ｆｌｕｏ４−ＡＭは、蛍光カルシウムインジケーター染料である。
候補化合物を洗浄緩衝液において調製する（ｐＨ７．４における１×ＨＢＳＳ／２．５ｍＭプロベニシド／２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）。
検定時、培養培地をウェルから除去し、細胞に、１００μＬの４μＭフルオロ４−ＡＭ／２．５ｍＭプロベニシド（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ８７６１）／２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／完全培地をｐＨ７．４において装填する３７℃／５％ＣＯ２における培養を６０分間進行させることが可能である。
１時間培養した後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭ培養緩衝液を除去し、細胞を１００μＬ洗浄緩衝液で２回洗浄する。各ウェルに１００μＬの洗浄緩衝液を残す。プレートを３７℃／５％ＣＯ２において６０分間培養基に戻す。
５０μＬの候補化合物を３０秒後に追加し、候補化合物によって誘起された細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）の過渡的変化を更に１５０秒間記録するように、ＦＬＩＥＲ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）をプログラムする。ＦＬＩＰＲソフトウェアを使用して作動薬の活性を決定するために、全蛍光変化計数を使用する。計測器ソフトウェアは、ゼロにおいて等しい初期読取りを与えるように、蛍光読取りを正規化する。
幾つかの実施形態において、対象受容体を含む細胞は更に、Ｇα１５、Ｇα１６、又はキメラＧｑ／Ｇｉ α単位も備える。
以上は、安定トランスフェクション細胞を使用する作動薬活性のＦＬＴＰＲ分析を提供するが、当業者であれば、作動薬活性を特徴付けるために、検定を容易に修正することができる。或いは、当業者であれば又、過渡的にトランスフェクトされた細胞を使用することができることも容易に理解するであろう。
実施例５
ＭＡＰキナーゼ検定
ＭＡＰキナーゼ（ミトゲン活性化キナーゼ）を監視して、受容体活性化を評価することが可能である。ＭＡＰキナーゼは、幾つかの手法によって検出することができる。１つの手法は、非リン酸化（不活性）又はリン酸化（活性）のリン酸エステル化状態の評価に基づく。リン酸化タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてより緩慢な可動性を有し、従って、ウェスタンブロット法を使用して、非刺激タンパク質と比較することができる。或いは、リン酸化キナーゼの増大を検出するために使用できるリン酸タンパク質に特有な抗体が利用可能である（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。何れも方法でも、細胞を試験化合物で刺激し、次いで、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で抽出する。可溶性断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに加え、タンパク質をニトロセルロース又はイモビリンに電気泳動により移動させる。免疫活性帯を標準的なウェスタンブロット法によって検出する。可視信号又は化学ルミネセンス信号を膜上において記録し、濃度測定によって定量化することが可能である。
別の手法は、リン酸化検定によるＭＡＰキナーゼ活性の評価に基づく。細胞を試験化合物で刺激し、可溶性抽出物を調製する。抽出物を、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生システム、並びにインスリン又はＰＨＡＳ−Ｌによって調節されるリン酸化熱及び酸安定タンパク質等ＭＡＰキナーゼに特有の基板と共に、３０℃で１０分間培養する。Ｈ３ＰＯ４を追加することによって反応を停止し、サンプルを氷に移す。リン酸化タンパク質を保持するＷｈａｔｍａｎ Ｐ８１クロマトグラフィーペーパーの上にアリコットをたらす。クロマトグラフィーペーパーを洗浄し、液体シンチレーションカウンターで３２Ｐについて計数する。或いは、細胞抽出物を、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生システム、及びストレプトアビジンによってフィルター支持に結合されたビオチン化ミエリン塩基性タンパク質と共に培養する。ミエリン塩基性タンパク質は、活性化ＭＡＰキナーゼの基板である。リン酸化反応を３０℃で１０分間実施する。次いで、リン酸化ミエリン塩基性タンパク質を保持するフィルターを経て、抽出物を吸引することができる。フィルターを洗浄し、液体シンチレーション計数によって３２Ｐについて計数する。
実施例６
メラニン保有細胞技術
メラニン保有細胞は、下級脊椎動物に存在する皮膚細胞である。メラニン保有細胞は、メラノソームと呼ばれる色素細胞器官を含む。メラニン保有細胞は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）活性化の際に微小管網に沿ってこれらのメラノソームを再分配することができる。この色素移動により、細胞の外見は明るくなるか、又は暗くなる。メラニン保有細胞では、Ｇｉ結合受容体の活性化の結果である細胞内ｃＡＭＰのレベルの低下により、メラノソームは細胞の中心に泳動し、その結果、色は劇的に明るくなる。次いで、Ｇｓ結合受容体の活性化に続いてｃＡＭＰレベルが上昇する場合、メラノソームは再分配され、細胞は、再び暗くなる。Ｇｑ結合受容体の活性化の結果であるジアシルグリセロールのレベルの上昇も、この再分配を誘起することができる。更に、この技術は又、ある受容体チロシンキナーゼの研究にも適している。メラニン保有細胞の応答は、受容体活性化の数分以内に行われ、簡単且つ堅調な色の変化が起きる。応答は、従来の吸収ミクロプレートリーダー又は適度なビデオイメージングシステムを使用して容易に検出することができる。他の皮膚細胞とは異なり、メラニン保有細胞は、神経堤から誘導され、シグナリングタンパク質の完全な相補体を発現すると思われる。特に、細胞は、極めて広範囲のＧタンパク質を発現し、従ってほぼ全てのＧＰＣＲを機能的に発現することができる。
メラニン保有細胞を使用して、ＧＰＣＲに対して、自然リガンドを含む化合物を同定することができる。この方法は、特定の刺激に応答して色素を分散又は集合させることができる色素細胞系統の試験細胞を導入し、ＧＰＣＲについて外因性クローンコーディングを発現することによって実施することができる。メラノトニン等の刺激剤が、色素配置の初期状態を設定し、色素は、ＧＰＣＲの活性化が色素の分散を誘起する場合、試験細胞内で集合する。しかし、ＧＰＣＲの活性化が色素凝集を誘起する場合、細胞を刺激剤で刺激することにより、色素配置の初期状態が設定される。次いで、試験細胞は化学化合物と接触し、細胞における色素配置が、色素配置の初期状態から変化したかが決定される。リガンドに限定しないが、候補化合物がＧＰＣＲに結合することによる色素細胞の配置は、ペトリ皿の上で暗く見え、一方、色素細胞の集合により、明るく見える。
材料及び方法は、米国特許第５４６２８５６号及び米国特許第６０５１３８６号の開示内容に従う。これらの特許の開示内容は、全体が参考として本明細書に組み入れられている。
細胞を例えば９６ウェルプレートにおいて培養する（プレート当たり１つの受容体）。トランスフェクションから４８時間後、各プレート上の細胞の半分を、１０ｎＭメラトニンで処置する。メラトニンは、メラニン保有細胞の内因性Ｇｉ結合受容体を活性化し、それらに色素を集合させる。細胞の残りの半分を血清なし培地０．７×Ｌ−１５（Ｇｉｂｃｏ）に移す。１時間後、血清なし培地の細胞は、色素分散状態にあり、一方、メラノトニン処置細胞は、色素集合状態にある。この時点で、細胞を試験／候補化合物の投与応答で処置する。プレートアウトされたＧＰＣＲが試験／候補化合物に結合する場合、メラニン保有細胞は、化合物に応答して色の変化を受けることが予期される。受容体がＧｓ結合受容又はＧｑ結合受容体である場合、メラノトニン集合メラニン保有細胞は、色素分散を受ける。対照的に、受容体がＧｉ結合受容体である場合、色素分散細胞は、投与量に依存する色素集合を受けることが予測される。
実施例７
放射性標識化合物
特定の実施形態において、本発明のＧタンパク質共役受容体のリガンドとして既知の化合物は、放射性標識される。本明細書において記述される放射性標識化合物は、化合物を特定／評価するために、遮蔽検定において使用することができる。一般的に、新たに合成又は特定された化合物（即ち、試験化合物）は、既知の放射性標識リガンドと受容体の間の複合体の形成を低減する能力によって、既知の放射性標識リガンドが受容体に結合するのを低減する能力について評価することができる。本発明の化合物において組み込むことができる適切な放射性核種には、３Ｈ（Ｔとも書かれる）、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、１２５Ｉ、８２Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、１５Ｏ、１３Ｎ、３５Ｓ、及び７７Ｂｒが含まれるが、これらに限定されない。３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、８２Ｂｒを組み込む化合物が、一般的には最も有用である。
「放射性標識」化合物は、少なくとも１つの放射性核種を組み込んでいる化合物であることを理解されたい。幾つかの実施形態において、放射性核種は、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、及び８２Ｂｒからなる群から選択される。幾つかの実施形態において、放射性核種は、３Ｈ又は１４Ｃである。更に、本発明のＧタンパク質共役受容体のリガンドであることが既知の化合物において表される全ての原子は、このような原子の最も一般的に生じる同位体、或いはよりまれな放射性同位体又は非放射性同位体とすることができることを理解されたい。
本発明のＧタンパク質共役受容体のリガンドであることが既知の化合物に適用可能であるものを含めて、放射性同位体を有機化合物に組み込む合成方法は、当該技術分野で周知であり、トリチウムの活性レベルを対象分子に組み込むことを含み、以下を含む：Ａ．トリチウム気体での触媒還元−この手順は、通常、高特異活性産物をもたらし、ハロゲン化又は不飽和先駆物質を必要とする。Ｂ．ホウ化水素ナトリウム［３Ｈ］での還元−この手順はかなり安価であり、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステル等、還元可能官能基を含む先駆物質を必要とする。Ｃ．アルミニウム水素リチウム［３Ｈ］の還元−この手順は、せいぜい理論的な比放射能において産物を生成する。これは又、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステル等、還元可能官能基を含む先駆物質を必要とする。Ｄ．トリチウム気体暴露標識−この手順は、適切な触媒の存在下で、交換性タンパク質を含む先駆物質をトリチウム気体に暴露することを含む。Ｅ．ヨウ化メチル［３Ｈ］を使用するＮ−メチル化−この手順は、適切な先駆物質を高比放射能ヨウ化メチルで処置することによって、Ｏメチル又はＮメチルを調製するために通常使用される。この方法は一般的に、約８０〜８７Ｃｉ／ｍｍｏｌ等、高い比放射能が可能である。
１２５Ｉの活性レベルを対象分子に組み込む合成方法は、以下を含む：Ａ．ザンドマイヤ及び同様の反応−この手順は、アリール又はヘテロアリールアミンをテトラフルオロボレート塩等のジアゾニウム塩に変換し、その後Ｎａ１２５Ｉを使用して１２５Ｉ標識付き化合物に変換する。代表的な手順は、Ｚｈｕ， Ｄ．−Ｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ６７， ９４３−９４８に報告されている。Ｂ．フェノールのオルソ１２５ヨウ素化−この手順は、Ｃｏｌｌｉｅｒ， Ｔ．Ｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ． １９９９， ４２， Ｓ２６４−Ｓ２６６に報告されているように、フェノールのオルソ位置において１２５Ｉを組み込むことが可能である。Ｃ．１２５Ｉとのアリール及びヘテロアリール臭化物の交換−この方法は一般的に、２段階プロセスである。第１段階は、トリアルキル錫ハロゲン化物又はヘキサアルキルジチンが存在する状態で、例えばＰｄ触媒反応［即ち、Ｐｄ（Ｐｈ３Ｐ）４］を使用して、或いはアリール又はヘテロアリールリチウムを経て、アリール又はヘテロアリール臭化物の対応するトリアルキ錫中間物に変換することである。代表的な手順は、Ｂａｓ， Ｍ．−Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ． ２００１， ４４、Ｓ２８０−Ｓ２８２に報告されている。
以上の技法は、例示を目的としたものであり、限定を目的としたものではないことが意図される。本発明のＧタンパク質共役受容体のリガンドとして既知の化合物を放射性標識するその他の技法も、当業者に周知である。
実施例８
受容体結合検定
試験化合物は、本発明のＧタンパク質共役受容体のリガンドとして既知の化合物と受容体の間の複合体の形成を低減する能力について評価することができる。特定の実施形態において、既知のリガンドは放射性標識されている。既知の放射性標識リガンドは、化合物を特定／評価するために、遮蔽検定において使用することができる。一般的に、新たに合成又は特定された化合物（即ち試験化合物）は、既知の放射性標識リガンドと受容体の間の複合体の形成を低減する能力によって、既知の放射性標識リガンドを受容体に結合するのを低減する能力について評価することができる。
本発明のタンパク質結合受容体のリガンドであることが既知である化合物と受容体の間の複合体を検出する検定プロトコル
Ａ．受容体の調製
２９３個の細胞に、６０μｌのリポフェクタミン（１５ｃｍ皿当たり）を使用して本発明のＧタンパク質共役受容体をコードするポリヌクレオチドを備える１０μｇ発現ベクターを過渡的にトランスフェクトする。過渡的にトランスフェクトされた細胞を皿において培地変化と共に２４時間培養し（７５％コンフルエンシー）、１０ｍｌ／皿のＨｅｐｅｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（２０ｍＭＨｅｐｅｓ＋１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）と共に除去する。次いで、細胞をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ遠心分離器において、１７，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する（ＪＡ−２５．５０ローター）。その後、ペレットを２０ｍＭＨｅｐｅｓ＋１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４に再懸濁し、５０ｍｌダウンスホモジナイザーで均質化し、再び遠心分離する。上澄み液を除去した後、結合検定において使用するまで、ペレットを−８０℃で貯蔵する。検定に使用する時、膜を氷の上で２０分間解凍し、次いで１０ｍＬの培養緩衝液（２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣ１、ｐＨ７．４）を追加する。次いで、膜を撹拌して粗膜ペレットを再懸濁させ、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ＰＴ−３１００ポリトロンホモジナイザーで設定条件６において１５秒間均質化する。ＢＲＬブラッドフォードタンパク質検定を使用して膜タンパク質の濃度を決定する。
Ｂ．結合検定
完全に結合するために、適切に希釈した５０μＬの全容積（５０ｍＭトリスＨＣＩ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのＥＤＴＡ；５−５０μｇのタンパク質を含む検定緩衝液において希釈）を９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートに追加し、続いて、１００ｕ１の検定緩衝液及び５０ｕ１の既知の放射性標識リガンドを追加する。非特異的結合では、１００μＬの代わりに５０μＬの検定緩衝液を追加し、５０μＬの前記放射能標識つきの既知のリガンドを追加する前に、放射性標識されていない１０ｕＭの前記既知のリガンドの追加の５０μＬを追加する。次いで、プレートを室温にて６０分〜１２０分培養する。ブランデル９６ウェルプレートハーベスターでＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＧＦ／Ｃユニフィルター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ）ろ過プレートを経て検定プレートをろ過することによって結合反応を終了し、続いて、０．９％ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄した。次いで、ろ過プレートの底部を封止し、５０ｕ１のＯｐｔｉｐｈａｓｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘを各ウェルに追加し、プレートの上部を封止し、プレオートをＴｒｉｌｕｘ ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターにおいて計数する。前記既知の放射性標識リガンドと前記受容体の間で形成される複合体がより少ないかを判定するために、１００ｕ１の検定緩衝液を追加する代わりに、１００ｕ１の適切に希釈した前記試験化合物を適切なウェルに追加し、次いで、５０ｕ１の前記既知の放射性標識リガンドを追加する。
試験化合物の非存在下における既知の放射性標識リガンドの特異的結合のレベルよりに比べて、試験化合物の存在下における既知の放射性標識リガンドの特異的結合のレベルの方が低いことは、試験化合物の非存在下よりも試験化合物の存在下において、前記既知の放射性標識リガンドと前記受容体の間の複合体が形成される量が少ないことを示す。
実施例９
ＢＲＳ−３が細胞内のＩＰ３の蓄積を増大
ＣＯＳ−７細胞に、ｃＤＮＡコード内因性ヒトＢＲＳ−３を含むｐＣＭＶ発現ベクター又はｐＣＭＶベクターのみを過渡的にトランスフェクトする。細胞内ＩＰ３蓄積を全リン酸イノシトールの蓄積として読み取った。
ＣＯＳ−７細胞を９６ウェルプレートにおいてウェル当たり１０，０００細胞でプレートアウトし、一晩結合することを可能にした。次いで、リポフェクタミンＴＭ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１−１６６８−０２７）を使用して、ＣＯＳ−７細胞に０．５又は１．３ｎｇ／ウェルのＢＲＳ−３／ｐＣＭＶ又は１３ｎｇ／ウェルの空ｐＣＭＶを３回トランスフェクトした。約１５時間後、トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞を完全培地に戻し（１０％ＰＢＳ、１％Ｌグルタミン、及び１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ）、細胞の培養を３７℃で約８時間続行した。
本明細書において記述されるように、トランスフェクションから約２４時間後、ＣＯＳ−７細胞をＩＰ３検定において使用した。完全培地を、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム及び４Ｃｉ／ｍｌ［３Ｈ］ミオ−イノシトールが補足された１００μＬイノシトールなし培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ処方０２−５０９２ＥＡ；Ｄ−グルコース、Ｌ−グルタミン、フェノールレッド、及びピリドキシンＨＣｌを含み、イノシトール、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウムを有さないＤＭＥＭ）と置き換え、細胞を３７℃で約１５時間培養することを可能にした。次いで、培地を吸引によって除去し、ＩＰ３培地（１０μＭパルギリン及び１０ｍＭ塩化リチウムを補足したイノシトールなし培地）と置き換え、細胞を７℃で約１５時間培養することを可能にした（試験化合物をＢＲＳ−３作動薬として遮蔽するため、試験化合物は、この３時間の培養に含まれる）。培養に続いて、培地を吸引によって除去し、氷冷０．１Ｍギ酸を含む緩衝液と置き換えた。次いで、ドライアイスの上でまず３０分培養し、完全細胞溶解を達成するために、プレートを−８０℃で一晩凍結した。
完全細胞溶解に続いて、検定プレートを３７℃のオーブンにおいて解凍した。次いで、解凍した内容物を、樹脂（Ｂｉｏｒａｄ、ＡＧ１−Ｘ８ １００〜２００メッシュ、ホルメート形態）を事前に装填した９６ウェルろ過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）に移した。真空マニホルドを使用してプレートをろ過し、樹脂を水で複数回洗浄した。次いで、溶出緩衝液を追加し（２００μＬ、１．０Ｍギ酸アンモニウム／０．１Ｍギ酸）、結果として得られる溶出物を真空下で９６ウェル収集プレートにおいて収集した。溶出物の一部（２００μＬ）を、４ｍｌのシンチレーション流体を含むシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンターで計数した（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ又はＨｉ−Ｓａｆｅ３）。
ＢＲＳ−３は、検出可能なレベルの成分活性を示し、ＣＯＳ−７細胞におけるＩＰ３蓄積のレベルを増大させることが判明した。図１を参照されたい。２９３細胞を使用して同様の結果を得た（図示せず）。
実施例１０
細胞におけるＢＲＳ−３発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
細胞におけるＢＲＳ−３発現を判定するために、ＲＴ−ＰＣＲを使用した。ＧＬＵＴａｇは、ＧＬＰ−１生成マウス腸内分泌細胞Ｌ細胞系統である［Ｂｒｕｂａｋｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ （１９９８） １３９：４１０８−４１１４］
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＢＲＳ−３発現を以下のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲによって評価した：
５’−ＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＡＴＴＡＴＣＴＣＴＧＴＣＴ−３’（配列番号５；センス）、及び、
５’−ＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＴＧＧＣＡＣＴＡＣＴＧ−３’（配列番号６；アンチセンス）
ＰＣＲプライマー配列番号５及び配列番号６は、イントロンにわたってＢＲＳ−３を増幅するように選択され、それにより、ｃＤＮＡ（５０８ｂｐ）の増幅産物は、ゲノムＤＮＡから容易に区別可能である。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したトリゾール試薬を使用して、全ＲＮＡをＧＬＵＴａｇ細胞から単離した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ（ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ）からのｃＤＮＡ合成キットを使用して、ｃＤＮＡ合成を実施した。２μＬのｃＤＮＡ及び１００ｎｇの各プライマーを含む５０μＬの反応混合物において、Ｔａｑ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲを実施した。制御反応は、テンプレートなし制御及びマウスゲノムＤＮＡテンプレート制御を含んでいた。サンプルを熱サイクラに配置し、９４℃で５分間培養し、３０サイクル続け［９４℃で３０秒、５７．５℃で３０秒、及び７２℃で１分］、最後に７２℃で１０分培養した。次いで、５μＬの各ＰＣＲ反応産物を１％／ＴＡＥ アガロースゲル上で分析した。
ＧＬＵＴａｇ細胞は、ＢＲＳ−３を発現することが判明した。図２を参照されたい。
実施例１１
ＧＬＵＴＡＧ細胞における細胞内ＩＰＥ蓄積に対するＢＲＳ−３作動薬の効果
ＧＬＵＴａｇは、ＧＬＰ−１生成マウス腸内分泌細胞Ｌ細胞系統［Ｂｒｕｂａｋｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ （１９９８） １３９：４１０８−４１１４］である。ＧＬＵＴａｇ細胞における細胞内ＩＰ３蓄積レベルに対するＢＲＳ−３作動薬の効果を判定する。
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＩＰ３検定を上述の実施例９において記述されたように実施する。ＧＬＵＴａｇ細胞を、ＩＰ３培地において３時間の培養中、ＢＲＳ−３作動薬を有して又は有さずに、培養する。特定の実施形態において、ＢＲＳ−３作動薬は、表Ｂの左列から選択される。
ＢＲＳ−３作動薬は、ＧＬＵＴａｇ細胞において細胞内ＩＰ３蓄積を増大させることが判明している。
実施例１２
ＧＬＵＴＡＧ細胞におけるＧＬＰ−１の分泌の刺激に対するＢＲＳ−３作動薬の効果
ＧＬＵＴａｇは、ＧＬＰ−１生成マウス腸内分泌細胞Ｌ細胞系統［Ｂｒｕｂａｋｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ （１９９８） １３９：４１０８−４１１４］である。ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１の分泌の刺激に対するＢＲＳ−３作動薬の効果を判定する。
１日目、ＧＬＵＴａｇ細胞を完全培養培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）において２４−ウェルプレート上でプレートアウトする。２日目、培養培地を低グルコース培地と置き換える（ＤＭＥＭ／３ｍＭのグルコース／１０％ＦＢＳ）。３日目、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄する。組織培養培養器において３７℃及び５％ＣＯ２において１時間、１５ｍＭグルコースを有する血清なしＤＭＥＭにおける正の制御として、洗浄したＧＬＵＴａｇ細胞を種々の濃度（約１ｎＭ〜約１０μＭ、例示として非限定的）においてＢＲＳ−３作動薬で、又はフォルスコリン（１μＭ）で刺激する。次いで、上澄み液を収集し、５００ｇ及び４℃で５分間遠心分離によって浄化する。ＬＩＮＣＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ−１（Ａｃｔｉｖｅ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ．カタログ番号ＤＧＬＰ−３５Ｋ］から購入した試薬を使用して、ＥＬＩＳＡによって上澄み液の中に放出されたＧＬＰ−１を決定する。
ＧＬＵＴａｇ細胞は、ＢＲＳ−３作動薬で刺激される時、ＧＬＰ−１を分泌することが判明している。
実施例１３
マウスの経口グルコース耐性試験（ｏＧＴＴ）において上昇した血中グルコースレベルを低下させることにおけるＢＲＳ０３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の効果
マウスの経口グルコース耐性試験（ｏＧＴＴ）を本明細書において記述されるように実施する。
ｏＧＴＴ検定において、治療上有効量は、通常、３０％を超えるＡＵＣ阻害を生成する薬剤の量であり、一方、治療に無効な量は、通常、３０％以下のＡＵＣ阻害を生成する薬剤の量である。
一晩断食したマウス（処置当たりｎ＝６マウス）に経口強制栄養により、ＢＲＳ−３作動薬［例えば、単独で使用される時治療に有効な約０．１ｍｋｇ〜約１ｍｋｇの間の投与量において（体重のキログラム当たりミリグラム化合物）］、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤［例えば、単独で使用される治療に無効な約０．１ｍｋｇ〜約１ｍｋｇの投与量において］、又はＢＲＳ−３作動薬とＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせ（例えば、以上の治療上無効な投与量において）をヒビクル（ＰＥＴ）と共に投与する。３０分後、グルコースの塊（３ｇｒａｍ／ｋｇ）を経口により送達する。尾の切れ目から収集した血液（〜５μＬ）及びグルコースメーターを使用して、血漿グルコースレベルを２時間の期間にわたり約２０分間隔で決定する。６匹のマウスからのデータに基づいて糖血可動域曲線をグラフにし、平均値＋／−ＳＥＭで与える。糖血可動域の曲線下面積（ＡＵＣ）を各マウスについて計算し、ＡＵＣ阻害（％）を決定する。
ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせは、ＢＲＳ−３作動薬単独又はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独と比較して、相乗ＡＵＣ阻害を生成することが判明している。
ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の一定量の組み合わせは、ＢＲＳ−３作動薬単独の量又はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独の量と比較して、相乗ＡＵＣ阻害を生成することが判明している。
実施例１４
糖尿病及びそれに関連する病態を処置又は予防するＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせ
本発明によるＢＲＳ−３作動薬を選択する。本発明によるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を選択する。
マウス経口グルコース耐性試験（ｏＧＴＴ）における曲線下面積（ＡＵＣ）のパーセント阻害に関するＢＲＳ−３作動薬の滴定を、約０．０１ｍｋｇ（体重のキログラム当たりミリグラム化合物）〜約１００ｍｋｇの投与量範囲にわたって決定する。上記の実施例１３を参照されたい。約１５〜２０％の糖血可動域のＡＵＣ阻害を生成するＢＲＳ−３作動薬の投与量を選択する。通常、３０％以下の糖血可動域のＡＵＣ阻害を生成するＢＲＳ−３作動薬の投与量は、このマウスモデルでは治療上無効である。
マウス経口グルコース耐性試験（ｏＧＴＴ）における曲線下面積（ＡＵＣ）のパーセント阻害に関するＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の滴定を、約０．０１ｍｋｇ（体重のキログラム当たりミリグラム化合物）〜約１００ｍｋｇの投与量範囲にわたって決定する。上記の実施例１３を参照されたい。約１５〜２０％の糖血可動域のＡＵＣ阻害を生成するＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の投与量を選択する。通常、３０％以下の糖血可動域のＡＵＣ阻害を生成するＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の投与量は、このマウスモデルにおいて治療上無効である。
ＢＲＳ−３作動薬の選択投与量及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の選択投与量の組み合わせによって生成される糖血のＡＵＣ阻害を、マウスｏＧＴＴ検定において決定する。ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせの治療効率を決定する。通常、約３０％を超えるＡＵＣ阻害を生成する組み合わせの量は、このマウスモデルにおいて治療上有効である。ＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の間の相乗作用を決定する。
このマウスモデルから得たデータを使用して、ヒトに使用される投与量の範囲を処方することができる。一般的に、当業者であれば、動物モデル系において得たｉｎ ｖｉｖｏデータをヒト等のその他にどのように外挿するかを理解している。本発明によるＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせは、糖尿病及びそれに関連する病態を処置又は予防するのに有用である。
以上は、例示であり、限定ではないことを理解されたい。
実施例１５
マウスにおけるグルコースチャレンジ試験後に血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることにおけるＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の効果
Ｃ５７ｂｌｋ／６の雄マウス（８週齢）を１８時間断食させ、各群についてｎ＝６で１２群に無作為に割り当てる。ＢＲＳ−３作動薬［例えば、単独で使用される時治療上有効な約０．０１ｍｋｇ〜約１ｍｋｇ（体重のキログラム当たりミリグラム化合物）の間の投与量における］、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤［例えば、単独で使用される時治療上無効な約０．０１ｍｋｇ〜約１ｍｋｇ（体重のキログラム当たりミリグラム化合物）の間の投与量における］、又はＢＲＳ−３作動薬及びＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の組み合わせ（例えば、上記の治療上無効な量において）をマウスに経口でビヒクル（ＰＥＴ）と共に投与する。処置の３０分後、３ｇ／ｋｇのグルコースの塊を経口で投与し、血漿を０分（グルコースの塊なし）、並びにグルコースの塊の２分後及び５分後に収集する。Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ−１（Ａｃｔｉｖｅ）ＥＬＩＳＡキット、カタログ番号ＤＧＬＰ−３５Ｋ］から購入したＧＬＰ−１ＥＬＩＳＡキットを使用することによって、血漿ＧＬＰ−１レベルを決定する。
ＢＲＳ−３作動薬をＤＰＰ−ＩＶ阻害剤と共に投与することにより、ＧＬＰ−１レベルを増大させることにおいて相乗効果を生成することが判明している。
一定量のＢＲＳ−３作動薬を一定量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤と組み合わせて投与することにより、その量のＢＲＳ−３作動薬単独の量によって与えられる効果及びその量のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤単独の量によって与えられる効果より大きく血中ＧＬＰ−１レベルを増大させる効果が生成されることが判明している。
実施例１６
ＢＲＳ−３作動薬活性の酵母受容体
酵母細胞に基づくレポーター検定は、文献において以前に記載されている（例えば、Ｍｉｒｅｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （２００２） ２７７：６８８１−６８８７；Ｃａｍｐｂｅｌｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ （１９９９） ９：２４１３−２４１８；Ｋｉｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９０） ２５０：１２１−１２３；ＷＯ ９９／１４３４４；ＷＯ ００／１２７０４；及び米国第６１０００４２号を参照されたい）。簡潔には、酵母細胞は、内因性酵母Ｇ−α（ＧＰＡ−１）が排除され、複数の技法を使用して構築されたＧタンパク質キメラと置き換えられるように加工された。更に、内因性酵母α細胞ＧＰＣＲ、Ｓｔｅ３が、選択される哺乳動物ＧＰＣＲが均質に発現することを見込むために、排除された。酵母では、真核細胞（例えば、ミトゲン活性化タンパク質キナーゼ経路）において保存されるフェロモンシグナリング導入経路の要素が、Ｆｕｓｌの発現を駆動する。β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）をＦｕｓｌ促進剤の（Ｆｕｓｌｐ）制御下に置くことによって、システムは発展し、それにより、受容体活性化が酵素の読出しをもたらす。
酵母細胞をＡｇａｔｅｐらによって記載された酢酸リチウム適合法することによって変換する（Ａｇａｔｅｐ， ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｂｙ ｔｈｅ ｌｉｔｈｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ／ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ／ポリエチレングリコール（ＬｉＡｃ／ｓｓ−ＤＮＡ／ＰＥＧ）ｐｒｏｔｏｃｏｌ． Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｔｉｐｓ Ｏｎｌｉｎｅ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｊｏｕｒｎａｌｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）。簡潔には、酵母トリプトンプレート（ＹＴ）上において酵母細胞を一晩成長させる。担体単一鎖ＤＮＡ（１０μｇ）、２つのＦｕｓ１ｐ−ＬａｃＺレポータープラスミドのそれぞれの２μｇ（１つがＵＲＡ選択マーカーを有志、１つがＴＲＰを有する）、酵母発現ベクター（２μｇの複製の元）における２μｇのＢＲＳ−３（例えばヒト受容体）、及び酢酸リチウム／ポリエチレングリコール／ＴＥ緩衝液をエッペンドルフ管にピペットで移す。受容体制御／受容体制御なしを含む酵母発現プラスミドは、ＬＥＵマーカーを有する。酵母細胞をこの混合物に接種し、反応を３０℃で６０分間進行させる。次いで酵母細胞に４２℃で１５分熱ショックを与える。次いで、細胞を洗浄し、選択プレートの上に広げる。選択プレートは、ＬＥＵ、ＵＲＡ、及びＴＲＰ（ＳＤ−ＬＵＴ）を除いた合成確定酵母培地である。３０℃で２日〜３日培養した後、選択プレート上に成長したコロニーをＬａｃＺ調製において試験する。
βガラクトシダーゼについて蛍光酵素検定を実施するために、対象ＢＲＳ−３受容体を搬送する酵母細胞を液体ＳＤ−ＬＵＴ培地において不飽和濃度まで一晩成長させる（即ち、細胞は、依然として分割しており、まだ静止状態に到達していない）。これを新規の培地で最適検定濃度まで希釈し、９０μＬの酵母細胞を９６ウェルブラックポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に追加する。ＤＭＳＯに溶解し、１０％ＤＭＳＯ溶液において１０×濃度まで希釈された試験化合物をプレートに追加することができ、プレートを３０℃で４時間置く。４時間後、βガラクトシダーゼの基質を各ウェルに追加する。これらの実験では、フルオレセインを放出し、蛍光読取りを可能にする酵素基質であるフルオレセインジ（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を使用する（ＦＤＧ）。５００μＭのＦＤＧ／２．５％トリトンＸ１００のウェル当たり２０μＬを追加する（洗浄剤は、細胞を浸透性にするために必要である）。細胞を基質と共に６０分間培養した後、反応を終了させ蛍光信号を促進するために、ウェル当たり２０μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムを追加する。次いで、プレートを４８５／５３５ｎｍにおいて蛍光計で読み取る
空のベクターで変換された酵母細胞の場合に対するＢＲＳ−３変換酵母細胞における蛍光信号色素分散の増大は、試験化合物がＢＲＳ−３受容体の機能性を刺激する化合物であることを示す。
以上の明細書では、例示の目的で示した実施例と共に本発明の原理を教示しているが、本発明の実施は、以下の特許請求の範囲及びその等価物の範囲内に含まれるように、通常の変更、適応又は改変の全てを包含することが理解されるであろう。
本発明は、本明細書に添付する以下の図面と関連させて例示する。
ＢＲＳ−３による細胞内ＩＰ３蓄積の増大を示す。実施例９を参照。 ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＢＲＳ−３の発現を示す。実施例１０を参照。

Claims (17)

  1. ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物を同定する方法であって、
    （ａ）Ｇタンパク質共役受容体を発現する宿主細胞又は該宿主細胞の膜と、試験化合物とを接触させる手順であって、該Ｇタンパク質共役受容体が、
    （ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３３５；
    （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３９９；
    （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸２〜３３５；
    （ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２〜３９９；
    （ｖ）配列番号２のアミノ酸２〜３３５（但し、該受容体が配列番号２のアミノ酸位置１においてメチオニン残基を含まないことを条件とする）；
    （ｖｉ）配列番号２のアミノ酸２〜３９９（但し、該受容体が配列番号２のアミノ酸位置１においてメチオニン残基を含まないことを条件とする）；
    （ｖｉｉ）特異的プライマーである配列番号３及び配列番号４を使用してヒトＤＮＡサンプルにおいてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を実施することを含むプロセスによって得ることができるヌクレオチド配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
    （ｖｉｉｉ）配列番号１の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；及び
    （ｉｘ）（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の何れか１つの生物学的活性フラグメント、
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、手順；
    （ｂ）該受容体の機能性を刺激する該試験化合物の能力を判定する手順、
    （ｃ）手順（ｂ）において該受容体の機能性を刺激する化合物を、哺乳動物の腸内分泌細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる手順；並びに、
    （ｄ）該化合物が該哺乳動物の腸内分泌細胞によるＧＬＰ−１の分泌を刺激するか否かを判定する手順、を含み；
    該哺乳動物の腸内分泌細胞からのＧＬＰ−１の分泌を刺激する該試験化合物の能力は、
    該試験化合物が、ボディマスを減少させるに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物であるか、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物であることを表す、方法。
  2. 前記方法が、ＧＬＰ−１分泌促進物質を同定するためのものである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記宿主細胞が発現ベクターを含み、該発現ベクターが、Ｇタンパク質共役受容体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２の何れか１項に記載の方法。
  4. 前記判定が、セカンドメッセンジャーのレベルを測定することにより行われる、請求項１に記載の方法。
  5. 前記セカンドメッセンジャーが、イノシトール １，４，５−三リン酸塩（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＭＡＰキナーゼ活性、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ−１（ＭＥＫＫ１）活性、及びＣａ２＋からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記判定が、メラニン保有細胞検定を使用することにより、又は前記ＧＰＣＲを含む膜へのＧＴＰγＳの結合を測定することにより行われる、請求項１に記載の方法。
  7. ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有用な化合物を同定する方法であって、
    （ａ）試験化合物の存在下又は非存在下において、Ｇタンパク質共役受容体を、該受容体に対する必要に応じて標識された既知のリガンドと接触させる手順であって、該Ｇタンパク質共役受容体が、
    （ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３３５；
    （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３９９；
    （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸２〜３３５；
    （ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２〜３９９；
    （ｖ）配列番号２のアミノ酸２〜３３５（但し、該受容体が配列番号２のアミノ酸位置１においてメチオニン残基を含まないことを条件とする）；
    （ｖｉ）配列番号２のアミノ酸２〜３９９（但し、該受容体が配列番号２のアミノ酸位置１においてメチオニン残基を含まないことを条件とする）；
    （ｖｉｉ）特異的プライマーである配列番号３及び配列番号４を使用してヒトＤＮＡサンプルにおいてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を実施することを包含するプロセスによって得ることができるヌクレオチド配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；
    （ｖｉｉｉ）配列番号１の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるヌクレオチド配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列；及び
    （ｉｘ）（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の何れか１つの生物学的活性フラグメント、
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、手順；
    （ｂ）該既知のリガンドと該受容体との間の複合体を検出する手順；
    （ｃ）該試験化合物の存在下で形成される該複合体が、該試験化合物の非存在下で形成されるよりも少ないか否かを判定する手順、
    （ｄ）その存在下の方が（ｃ）において形成される該複合体が少ない化合物を、哺乳動物の腸内分泌細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる手順；並びに、
    （ｅ）該化合物が該哺乳動物の腸内分泌細胞によるＧＬＰ−１の分泌を刺激するか否かを判定する手順、を含み；
    該哺乳動物の腸内分泌細胞からのＧＬＰ−１の分泌を刺激する能力は、該試験化合物が、ボディマスを減少させるのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物であるか、或いは血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有効な化合物であることを表す、方法。
  8. 前記方法が、ＧＬＰ−１分泌促進物質を同定するためのものである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記受容体が組換え体である、請求項７〜８の何れか１項に記載の方法。
  10. 血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置または予防するのに有用なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物を同定する方法であって、
    （ａ）ＢＲＳ−３作動薬を、哺乳動物の腸内分泌細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる手順；及び
    （ｂ）該ＢＲＳ−３作動薬が、該哺乳動物の腸内分泌細胞からのＧＬＰ−１の分泌を刺激するか否かを判定する手順、
    を含み、該ＢＲＳ−３作動薬の、該哺乳動物の腸内分泌細胞からのＧＬＰ−１の分泌を刺激する能力は、該作動薬が、血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される病態を処置又は予防するのに有効なＧＬＰ−１分泌促進物質又は化合物であることを表す、方法。
  11. 血中ＧＬＰ−１レベルを増大させることによって緩和される前記病態が、糖尿病、糖尿病に関連する病態、心筋梗塞、学習障害、記憶障害、及び神経変性障害からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記方法がＧＬＰ−１分泌促進物質を同定するためのものである、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記ＢＲＳ−３作動薬が、ヒトＢＲＳ−３の作動薬である、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記ＢＲＳ−３作動薬が低分子であり、該低分子が、モル当たり約１０，０００グラム未満の分子量を有し、ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機化合物、又は無機化合物（ヘテロ有機化合物、又は有機金属化合物を含む）、並びに、その塩、エステル、及び他の薬学的に許容される形態からなる群から選択される化合物である、請求項１０〜１３の何れか１項に記載の方法。
  15. 前記ＢＲＳ−３作動薬が、経口活性である、請求項１０〜１４の何れか１項に記載の方法。
  16. 前記ＢＲＳ−３作動薬が、選択的ＢＲＳ−３作動薬である、請求項１０〜１５の何れか１項に記載の方法。
  17. 前記ＢＲＳ−３作動薬が、１０μＭ未満のＥＣ５０を有する、請求項１０〜１６の何れか１項に記載の方法。
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