JP5773392B2 - A prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy containing L-serine - Google Patents
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Description
本発明は、末梢神経障害の予防・治療剤や、末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy and a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy.
末梢神経は、中枢神経系以外のすべての神経、すなわち脳と脊髄（せきずい）以外のすべての神経であり、運動神経や感覚神経を含む。末梢神経が、虚血、抗癌剤投与、糖尿病、感染症などの内的因子や、事故による外傷などの外的因子により侵されると、末梢神経の機能障害（末梢神経障害）が起こり、感覚障害、麻痺、疼痛、筋力低下、筋肉萎縮、深部腱反射低下、血管運動神経症状等の末梢神経障害症状が生じる。末梢神経障害の症状は長期間持続することが多く、患者の生活の質（Quality of life：ＱＯＬ）を低下させる。 Peripheral nerves are all nerves other than the central nervous system, that is, all nerves other than the brain and spinal cord, and include motor and sensory nerves. When peripheral nerves are affected by internal factors such as ischemia, administration of anticancer drugs, diabetes, infections, or external factors such as trauma caused by an accident, peripheral nerve dysfunction (peripheral neuropathy) occurs, sensory disorders, Peripheral neuropathy symptoms such as paralysis, pain, muscle weakness, muscle atrophy, deep tendon reflexes, and vasomotor symptoms occur. The symptoms of peripheral neuropathy often persist for a long period of time, reducing the patient's quality of life (QOL).
末梢神経障害の中でも、抗癌剤投与や糖尿病によるものは、症状が重篤になり得ることや、障害に罹患している患者数が多いことから、特に問題とされている。例えば、パクリタキセル（タキソール（登録商標））は、卵巣癌、乳癌、肺癌など多くの種類の悪性腫瘍に対して用いられる最も効果的な抗癌剤のひとつである。しかし、パクリタキセルを投与すると、副作用として末梢神経障害（機械誘発性アロディニア、冷感アロディニア、継続する灼熱痛、うずき、しびれ）や骨髄抑制が高率で発生することが知られている。このような末梢神経障害に対しては、鎮痛剤、ビタミン剤（ビタミンＢ剤）、ステロイド等の対症療法が行われているが、十分な効果は得られない。そのため、末梢神経障害がパクリタキセルの用量規制因子となり、化学療法中断の原因となることも少なくない。 Among peripheral neuropathies, those caused by administration of anticancer drugs and diabetes are particularly problematic because symptoms can be serious and the number of patients suffering from the disorder is large. For example, paclitaxel (Taxol (registered trademark)) is one of the most effective anticancer agents used for many types of malignant tumors such as ovarian cancer, breast cancer, and lung cancer. However, it is known that administration of paclitaxel causes peripheral neuropathy (mechanical allodynia, cold allodynia, continuous burning pain, tingling, numbness) and bone marrow suppression as side effects at a high rate. For such peripheral neuropathy, symptomatic treatments such as analgesics, vitamins (vitamin B agents), steroids and the like are performed, but sufficient effects cannot be obtained. For this reason, peripheral neuropathy is a dose-limiting factor for paclitaxel and often causes chemotherapy interruption.
以上のようなことから、末梢神経障害を改善する手段が強く求められている。そのため、末梢神経障害を改善する試みがこれまでにもなされている。例えば特許文献１には、ホスファチジルセリンを有効成分とする末梢神経障害改善剤が記載されている。また、特許文献２には、脳下垂体アデニレートサイクラーゼ活性化ポリペプチドを有効成分とする薬剤投与による末梢神経障害の軽減剤が記載されている。 From the above, there is a strong demand for means for improving peripheral neuropathy. For this reason, attempts have been made to improve peripheral neuropathy. For example, Patent Document 1 describes a peripheral neuropathy improving agent containing phosphatidylserine as an active ingredient. Patent Document 2 describes a peripheral neuropathy alleviating agent by administration of a drug comprising a pituitary adenylate cyclase activating polypeptide as an active ingredient.
Ｌ−セリン（(Ｓ)−２−アミノ−３−ヒドロキシプロピオン酸）は、非必須アミノ酸の１種である。Ｌ−セリンは、プリン、ピリミジン、システインなどの生合成に関与するため、代謝において重要である。生体内では、Ｌ−セリンは、解糖系の中間体である３−ホスホグリセリン酸から、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.95）、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（EC 2.6.1.52）、及び、ホスホセリンホスファターゼ（EC 3.1.3.3）の３つの酵素の働きを順に経て合成される。 L-serine ((S) -2-amino-3-hydroxypropionic acid) is a kind of non-essential amino acid. L-serine is important in metabolism because it is involved in the biosynthesis of purines, pyrimidines, cysteines and the like. In vivo, L-serine is converted from 3-phosphoglycerate, a glycolytic intermediate, to 3-phosphoglycerate dehydrogenase (EC 1.1.1.95), phosphoserine aminotransferase (EC 2.6.1.52), and It is synthesized through the action of three enzymes, phosphoserine phosphatase (EC 3.1.3.3).
非特許文献１には、Ｌ−セリンが、ニワトリの胚細胞における後根神経節の神経突起の伸長をインビトロにおいて促進することが記載されている。また、非特許文献２には、Ｌ−セリンが、ラット胎児細胞由来の海馬ニューロンの生存をインビトロにおいてサポートすることが記載されている。さらに、非特許文献３には、Ｌ−セリンが、ラット胎児由来の小脳のプルキンエニューロンの生存や分化をインビトロにおいて促進することが記載されている。このように、非特許文献１〜３はいずれも、Ｌ−セリンが発生期における中枢神経系に対してどのような作用を示すかをインビトロにおいて確認したに過ぎない。 Non-Patent Document 1 describes that L-serine promotes neurite outgrowth of dorsal root ganglia in chicken embryo cells in vitro. Non-Patent Document 2 describes that L-serine supports the survival of rat fetal cell-derived hippocampal neurons in vitro. Furthermore, Non-Patent Document 3 describes that L-serine promotes survival and differentiation of rat fetal cerebellar Purkinje neurons in vitro. As described above, all of Non-Patent Documents 1 to 3 merely confirm in vitro what action L-serine has on the central nervous system during development.
本発明の課題は、実用的な末梢神経障害の予防・治療剤を提供することや、実用的な末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a practical preventive / therapeutic agent for peripheral neuropathy and to provide a screening method for a practical prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy.
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行い、以下の（Ａ）〜（Ｆ）の知見を見い出した。
（Ａ）インビボにおいて、パクリタキセルは、坐骨神経や脊髄におけるＬ−セリン濃度は低下させないが、末梢神経である後根神経節（ＤＲＧ）におけるＬ−セリン濃度を低下させること。
（Ｂ）インビボにおいて、パクリタキセルが、ＤＲＧにおける３ＰＧＤＨ（３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ）の発現を低下させること。
（Ｃ）免疫組織化学染色によると３ＰＧＤＨはＤＲＧのニューロンではなく、衛星細胞に局在していること。
（Ｄ）パクリタキセル（抗癌剤）によって誘導される末梢神経障害が、Ｌ−セリンの投与によって、改善すること。
（Ｅ）オキサリプラチン（抗癌剤）によって誘導される末梢神経障害が、Ｌ−セリンの投与によって、改善すること。
（Ｆ）ストレプトゾトシン（糖尿病誘発剤）によって誘導される末梢神経障害が、Ｌ−セリンの投与によって、予防・改善すること。In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted intensive research and found the following findings (A) to (F).
(A) In vivo, paclitaxel does not decrease the L-serine concentration in the sciatic nerve or spinal cord, but decreases the L-serine concentration in the dorsal root ganglion (DRG), which is a peripheral nerve.
(B) In vivo, paclitaxel reduces the expression of 3PGDH (3-phosphoglycerate dehydrogenase) in DRG.
(C) According to immunohistochemical staining, 3PGDH is localized not in DRG neurons but in satellite cells.
(D) The peripheral neuropathy induced by paclitaxel (anticancer agent) is improved by administration of L-serine.
(E) Peripheral neuropathy induced by oxaliplatin (anticancer agent) is improved by administration of L-serine.
(F) Peripheral neuropathy induced by streptozotocin (diabetes-inducing agent) is prevented or improved by administration of L-serine.
つまり、本発明者らは、Ｌ−セリンがインビボにおいて各種の末梢神経障害を改善すること等の知見を見い出し、本発明を完成するに至った。 That is, the present inventors have found out that L-serine improves various peripheral neuropathies in vivo, and have completed the present invention.
すなわち本発明は、（１）Ｌ−セリンを含有する末梢神経障害の予防・治療剤や、（２）末梢神経障害が、抗癌剤投与による末梢神経障害、又は、糖尿病による末梢神経障害であることを特徴とする上記（１）に記載の末梢神経障害の予防・治療剤や、（３）末梢神経障害が、抗癌剤投与による末梢神経障害であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の末梢神経障害の予防・治療剤に関する。 That is, the present invention relates to (1) a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy containing L-serine, and (2) the peripheral neuropathy is a peripheral neuropathy caused by administration of an anticancer agent or a peripheral neuropathy caused by diabetes. The prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy as described in (1) above, or (3) the peripheral neuropathy is a peripheral neuropathy caused by administration of an anticancer agent, as described in (1) or (2) above The present invention relates to the prophylactic / therapeutic agent for the described peripheral neuropathy.
また本発明は、（４）以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程を有することを特徴とする、末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法：（Ａ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程：（Ｂ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物の後根神経節におけるＬ−セリン濃度を測定する工程：（Ｃ）工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定値を、被検物質を投与しなかった場合のＬ−セリン濃度の測定値と比較する工程：（Ｄ）工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のＬ−セリン濃度の測定値と比較して高い場合に、該被検物質を末梢神経障害の予防・治療剤と評価する工程：や、（５）以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を有することを特徴とする、末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法：（ａ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程：（ｂ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物の後根神経節における３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（３ＰＧＤＨ）の発現量を測定する工程：（ｃ）工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量を、被検物質を投与しなかった場合の３ＰＧＤＨの発現量と比較する工程：（ｄ）工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量が、被検物質を投与しなかった場合の３ＰＧＤＨの発現量と比較して高い場合に、該被検物質を末梢神経障害の予防・治療剤と評価する工程：に関する。 The present invention also includes (4) a method for screening a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy, comprising the following steps (A) to (D): (A) a peripheral neuropathy model non-human mammal (B) A step of measuring the L-serine concentration in the dorsal root ganglia of a peripheral neuropathy model non-human mammal: (C) a measured value of the L-serine concentration in step (B) Is a step of comparing the measured value of L-serine concentration with no test substance administered: (D) When the measured value of L-serine concentration in step (B) is not administered with the test substance The step of evaluating the test substance as a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy when the L-serine concentration is higher than the measured value of: or (5) the following steps (a) to (d) A screening agent for the prevention and treatment of peripheral neuropathy, Method: (a) A step of administering a test substance to a peripheral neuropathy model non-human mammal: (b) 3-phosphoglycerate dehydrogenase (3PGDH) in the dorsal root ganglion of the peripheral neuropathy model non-human mammal The step of measuring the expression level: (c) The step of comparing the expression level of 3PGDH in step (b) with the expression level of 3PGDH when the test substance was not administered: (d) 3PGDH level in step (b) The present invention relates to a step of evaluating the test substance as a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy when the expression level is higher than the expression level of 3PGDH when the test substance is not administered.
本発明によれば、末梢神経障害を予防又は治療することができる。しかも、本発明における末梢神経障害の予防・治療効果は、インビボにおいても実証されているため、実用性がきわめて高い。また、本発明を、抗癌剤による末梢神経障害に用いる場合は特に、抗癌剤の選択の幅が広がったり、抗癌剤の投与量を十分に確保することが可能となり、その結果、癌患者の生存率や予後の改善が期待できる。さらに、本発明のスクリーニング方法によれば、末梢神経障害の予防・治療剤を効率的にスクリーニングすることができる。 According to the present invention, peripheral neuropathy can be prevented or treated. In addition, since the effect of preventing and treating peripheral neuropathy in the present invention has been demonstrated in vivo, it is extremely practical. In addition, when the present invention is used for peripheral neuropathy caused by an anticancer agent, the range of selection of the anticancer agent can be widened, and a sufficient dose of the anticancer agent can be secured. As a result, the survival rate and prognosis of cancer patients can be ensured. Improvement can be expected. Furthermore, according to the screening method of the present invention, a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy can be efficiently screened.
本発明の末梢神経障害の予防・治療剤（以下、単に「本発明の予防・治療剤」とも表示する。）としては、Ｌ−セリンを含有している組成物であれば特に制限されず、また本発明と技術的に同範疇の発明として、末梢神経障害の予防・治療方法や、Ｌ−セリンの使用方法の発明を挙げることができる。上記末梢神経障害の予防・治療方法としては、Ｌ−セリンを対象に投与する方法であれば特に制限されず、そしてまた、Ｌ−セリンの使用方法としては、Ｌ−セリンを末梢神経障害の予防・治療剤の調製のために使用する方法であれば特に制限されない。後述の実施例の結果から明らかなように、Ｌ−セリンは様々な原因による末梢神経障害に対する予防・治療効果を有しているからである。なお、本明細書における「末梢神経障害に対する予防・治療効果」とは、末梢神経障害の発症を抑制（予防）、及び／又は、末梢神経障害を改善（治療）する効果を意味し、中でも、機械誘発性アロディニアや痛覚過敏や感覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ）の低下を予防及び／又は治療する効果を好適に含む。 The preventive / therapeutic agent for peripheral neuropathy of the present invention (hereinafter also simply referred to as “the preventive / therapeutic agent of the present invention”) is not particularly limited as long as it is a composition containing L-serine, In addition, examples of inventions that are technically equivalent to the present invention include inventions for methods for preventing and treating peripheral neuropathy and methods for using L-serine. The method for preventing and treating peripheral neuropathy is not particularly limited as long as L-serine is administered to a subject, and L-serine is used as a method for preventing peripheral neuropathy. -It will not be restrict | limited especially if it is the method used for preparation of a therapeutic agent. This is because L-serine has a prophylactic / therapeutic effect on peripheral neuropathy caused by various causes, as is apparent from the results of Examples described later. As used herein, the “prophylactic / therapeutic effect on peripheral neuropathy” means the effect of suppressing (preventing) the onset of peripheral neuropathy and / or improving (treating) peripheral neuropathy, It preferably includes the effect of preventing and / or treating mechanically induced allodynia, hyperalgesia and decreased sensory nerve conduction velocity (SNCV).
本発明におけるＬ−セリンとしては、市販のものを用いることができ、天然物由来であってもよいし、合成したものであってもよい。 As L-serine in the present invention, a commercially available product can be used, which may be derived from a natural product or synthesized.
本発明の予防・治療剤中のＬ−セリンの含有量としては、特に制限されないが、該予防・治療剤全量に対して例えば０．０１〜１００質量％、好ましくは０．５〜１００質量％、より好ましくは５〜１００質量％、さらに好ましくは２０〜１００質量％、より好ましくは５０〜１００質量％、さらに好ましくは７０〜９５質量％を好適に例示することができる。 The content of L-serine in the preventive / therapeutic agent of the present invention is not particularly limited, but is, for example, 0.01 to 100% by mass, preferably 0.5 to 100% by mass, based on the total amount of the prophylactic / therapeutic agent. More preferably, 5-100 mass%, More preferably, 20-100 mass%, More preferably, 50-100 mass%, More preferably, 70-95 mass% can be illustrated suitably.
本発明の予防・治療剤中に含まれる全アミノ酸（又はアミノ酸残基）のモル数に対する、Ｌ−セリンのモル数の好適な割合（％）としては、例えば１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上、最も好ましくはＬ−セリン以外のアミノ酸を含まないことを好適に例示することができる。また、本発明の予防・治療剤中のＤ−セリンのモル数に対するＬ−セリンのモル数の好適な割合（％）としては、例えば４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上を好適に例示することができ、さらには、Ｄ−セリンを含まないことを最も好適に例示することができる。 A suitable ratio (%) of the number of moles of L-serine to the number of moles of all amino acids (or amino acid residues) contained in the preventive / therapeutic agent of the present invention is, for example, 10% or more, preferably 20% or more. More preferably 40% or more, still more preferably 60% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 99% or more, and most preferably other than L-serine. It is possible to suitably illustrate that the amino acid is not contained. Moreover, as a suitable ratio (%) of the number of moles of L-serine to the number of moles of D-serine in the preventive / therapeutic agent of the present invention, for example, 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60%. Or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 99% or more. Most preferably, it does not contain serine.
本発明の末梢神経障害の予防・治療効果を確認する方法としては、特に制限されないが、感覚障害、麻痺、疼痛、筋力低下、筋肉萎縮、深部腱反射低下、血管運動神経症状等の末梢神経障害症状が軽減するかを確認する公知の方法を利用することができる。 The method for confirming the effect of preventing or treating peripheral neuropathy of the present invention is not particularly limited, but peripheral neuropathy such as sensory disorder, paralysis, pain, muscle weakness, muscle atrophy, deep tendon reflex reduction, vasomotor symptoms, etc. A known method for confirming whether the symptoms are reduced can be used.
本発明の予防・治療剤における末梢神経障害の予防・治療効果の好適な程度としては、２ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを隔日で４回（Ｄ１、Ｄ３、Ｄ５、Ｄ７）腹腔内注入したラットに、本発明の予防・治療剤をＤ１〜Ｄ２８まで毎日腹腔内投与または経口投与したときのＤ２９におけるvon Frey刺激（４ｇ、８ｇ又は１５ｇ）に対する引込み反応の割合が、本発明の予防・治療剤を投与しなかった場合のその割合と比較して、２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上低下することを好適に例示することができる。 As a suitable degree of the preventive / therapeutic effect of peripheral neuropathy in the prophylactic / therapeutic agent of the present invention, 2 mg / kg paclitaxel was intraperitoneally injected four times every other day (D1, D3, D5, D7). When the prophylactic / therapeutic agent of the invention is administered intraperitoneally or orally daily from D1 to D28, the ratio of the pull-in response to von Frey stimulation (4 g, 8 g, or 15 g) at D29 is determined by administering the prophylactic / therapeutic agent of the present invention. 20% or more, preferably 30% or more, more preferably 40% or more, still more preferably 50% or more, more preferably 60% or more, and even more preferably 70% or more, compared with the ratio in the absence This can be preferably exemplified.
また、本発明の予防・治療剤における末梢神経障害の予防・治療効果の好適な程度の他の態様としては、２ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを隔日で４回（Ｄ１、Ｄ３、Ｄ５、Ｄ７）腹腔内注入したラットに、本発明の予防・治療剤をＤ１〜Ｄ２８まで毎日腹腔内投与または経口投与したときのＤ２９における感覚神経伝導速度試験（記録用の針電極は尾部の肛門から２ｃｍ及び８ｃｍの位置に注入し、刺激電極は肛門から１２ｃｍの位置に設置し、また、ラットの皮膚温度は３６〜３７℃に維持して行った試験）で、２箇所の記録用針電極で記録された電位の潜時が、本発明の予防・治療剤を投与しなかった場合のその潜時と比較して、４％以上、好ましくは６％以上、さらに好ましくは８％以上低下することを好適に例示することができる。 Moreover, as another aspect of the suitable degree of the prevention / treatment effect of the peripheral neuropathy in the preventive / therapeutic agent of the present invention, 2 mg / kg paclitaxel is administered four times every other day (D1, D3, D5, D7) intraperitoneally. Sensory nerve conduction velocity test at D29 when the prophylactic / therapeutic agent of the present invention was intraperitoneally administered daily or orally from D1 to D28 to the injected rat (the needle electrodes for recording were positioned 2 cm and 8 cm from the tail anus) The stimulation electrode was placed at a position 12 cm from the anus, and the rat skin temperature was maintained at 36 to 37 ° C.). A preferable example is that the latency is decreased by 4% or more, preferably 6% or more, more preferably 8% or more, compared to the latency when the preventive / therapeutic agent of the present invention is not administered. be able to.
本発明の予防・治療剤は、所望の末梢神経障害の予防・治療効果が得られる限り、Ｌ−セリンの他に、他の末梢神経障害の予防・治療剤等の任意成分を含んでいてもよい。 The prophylactic / therapeutic agent of the present invention may contain any component such as a prophylactic / therapeutic agent for other peripheral neuropathy in addition to L-serine as long as the desired prophylactic / therapeutic effect for peripheral neuropathy is obtained. Good.
本発明の予防・治療剤に含有されるＬ−セリンは、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、末梢神経障害の優れた予防・治療効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えばＬ−セリンを溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明におけるＬ−セリンを製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。 L-serine contained in the preventive / therapeutic agent of the present invention can be made into an appropriate preparation by a conventional method. The dosage form of the preparation may be a solid preparation such as a powder or a granule, but from the viewpoint of obtaining an excellent preventive / therapeutic effect on peripheral neuropathy, a liquid such as a solution, an emulsion, or a suspension is used. It is preferable. As a method for producing the above liquid agent, for example, a method of mixing L-serine with a solvent and a method of further mixing a suspending agent or an emulsifier can be exemplified. As described above, when L-serine in the present invention is used as a preparation, an appropriate pharmaceutically acceptable carrier, for example, an excipient, a binder, a solvent, a solubilizing aid, as necessary in preparation. Agent, suspending agent, emulsifier, tonicity agent, buffer, stabilizer, soothing agent, preservative, antioxidant, coloring agent, lubricant, disintegrant, wetting agent, adsorbent, sweetener An optional component such as a diluent can be blended.
本発明の予防・治療剤の投与方法としては、所望の末梢神経障害の予防・治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与等を例示することができ、中でも、静脈内投与、経口投与を好適に例示することができる。また、本発明の予防・治療剤の投与量や投与回数や投与濃度は、投与対象の末梢神経障害の状態や、投与対象の体重等に応じて、適宜調節することができるが、一日あたりのＬ−セリン換算で、例えば、０．００１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜１ｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜１００ｍｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜１０ｍｍｏｌ／ｋｇ、さらに好ましくは１０ｎｍｏｌ／ｋｇ〜５ｍｍｏｌ／ｋｇを投与することができる。 The method for administering the prophylactic / therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as the desired prophylactic / therapeutic effect for peripheral neuropathy is obtained, and can be exemplified by intravenous administration, intraperitoneal administration, oral administration, etc. Especially, intravenous administration and oral administration can be illustrated suitably. Further, the dose, frequency and dose of the preventive / therapeutic agent of the present invention can be appropriately adjusted according to the state of peripheral neuropathy to be administered, the body weight of the subject to be administered, etc. In terms of L-serine, for example, 0.001 nmol / kg to 1 mol / kg, preferably 0.1 nmol / kg to 100 mmol / kg, more preferably 1 nmol / kg to 10 mmol / kg, more preferably 10 nmol / kg to 5 mmol. / Kg can be administered.
本発明の予防・治療剤の適用対象となる末梢神経障害の種類としては、特に制限されず、抗癌剤投与、糖尿病、虚血、感染症などの内的因子により引き起こされる末梢神経障害であってもよいし、事故による外傷などの外的因子によって引き起こされる末梢神経障害であってもよいが、抗癌剤投与、糖尿病、虚血、感染症などの内的因子により引き起こされる末梢神経障害を好適に例示することができ、中でも、抗癌剤投与や、糖尿病により引き起こされる末梢神経障害をより好適に例示することができ、中でも、抗癌剤投与により引き起こされる末梢神経障害をさらに好適に例示することができる。かかる抗癌剤としては、投与により末梢神経障害を引き起こし得る抗癌剤である限り特に制限されないが、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン系抗癌剤；オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン等の白金錯体系抗癌剤；ビンクリスチン等のビンカアルカロイド系抗癌剤；イホスファミド等のアルキル化剤系抗癌剤；メトトレキサート、フルオロウラシル、シタラビン等の代謝拮抗性抗癌剤；ドキソルビシン、ブレオマイシン等の抗生物質系抗癌剤；を好適に例示することができ、中でも、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン系抗癌剤；オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン等の白金錯体系抗癌剤；をより好適に例示することができ、中でも、パクリタキセル、オキサリプラチンを特に好適に例示することができる。また、本発明の予防・治療剤の適用対象となるその他の好ましい末梢神経障害としては、ＤＲＧにおけるＬ−セリン濃度の低下が関与する末梢神経障害を例示することができる。 The type of peripheral neuropathy to which the prophylactic / therapeutic agent of the present invention is applied is not particularly limited, and it may be peripheral neuropathy caused by internal factors such as administration of an anticancer drug, diabetes, ischemia, infection, etc. It may be a peripheral neuropathy caused by an external factor such as trauma due to an accident, but preferably a peripheral neuropathy caused by an internal factor such as administration of an anticancer drug, diabetes, ischemia or infection Among them, the administration of an anticancer agent and peripheral neuropathy caused by diabetes can be exemplified more preferably, and the peripheral neuropathy caused by administration of an anticancer agent can be exemplified more preferably. Such an anticancer agent is not particularly limited as long as it is an anticancer agent that can cause peripheral neuropathy by administration, but is a taxane anticancer agent such as paclitaxel or docetaxel; a platinum complex anticancer agent such as oxaliplatin, cisplatin or carboplatin; a vinca alkaloid such as vincristine Preferred examples include anticancer agents; alkylating agent anticancer agents such as ifosfamide; antimetabolite anticancer agents such as methotrexate, fluorouracil, and cytarabine; and antibiotic anticancer agents such as doxorubicin and bleomycin; and taxanes such as paclitaxel and docetaxel. Anti-cancer agents such as platinum complex anti-cancer agents such as oxaliplatin, cisplatin, carboplatin, etc. can be more preferably exemplified, and paclitaxel and oxaliplatin are particularly preferably exemplified. Door can be. Examples of other preferable peripheral neuropathies to which the preventive / therapeutic agent of the present invention is applied include peripheral neuropathies involving a decrease in L-serine concentration in DRG.
本発明の予防・治療剤の投与対象としては、哺乳動物である限り特に制限されず、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。 The administration target of the prophylactic / therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as it is a mammal, and humans, monkeys, mice, rats, hamsters, guinea pigs, cows, pigs, horses, rabbits, sheep, goats, cats, dogs Etc. can be preferably exemplified, and among these, humans can be more suitably exemplified.
本発明の末梢神経障害の予防・治療方法におけるＬ−セリンの投与方法等については、本発明の予防・治療剤について前述したのと同様である。また、本発明の予防・治療剤の調製のための使用において、Ｌ−セリンを本発明の予防・治療剤に調製する方法も、本発明の予防・治療剤について前述したのと同様である。 The L-serine administration method and the like in the method for preventing and treating peripheral neuropathy of the present invention are the same as those described above for the agent for preventing and treating the present invention. Moreover, in the use for preparation of the preventive / therapeutic agent of the present invention, the method for preparing L-serine into the prophylactic / therapeutic agent of the present invention is the same as described above for the prophylactic / therapeutic agent of the present invention.
本発明の末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法としては、（Ａ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程：（Ｂ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物の後根神経節におけるＬ−セリン濃度を測定する工程：（Ｃ）工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定値を、被検物質を投与しなかった場合のＬ−セリン濃度の測定値と比較する工程：及び、（Ｄ）工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のＬ−セリン濃度の測定値と比較して高い場合に、該被検物質を末梢神経障害の予防・治療剤と評価する工程：を有するか、又は、（ａ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程：（ｂ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物の後根神経節における３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（３ＰＧＤＨ）の発現量を測定する工程：（ｃ）工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量を、被検物質を投与しなかった場合の３ＰＧＤＨの発現量と比較する工程：及び、（ｄ）工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量が、被検物質を投与しなかった場合の３ＰＧＤＨの発現量と比較して高い場合に、該被検物質を末梢神経障害の予防・治療剤と評価する工程：を有している限り特に制限されない。このような本発明の末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法によれば、末梢神経障害の予防・治療剤を効率良くスクリーニングすることができ、すなわち、実用性の高い末梢神経障害の予防・治療剤を効率良くスクリーニングすることができる。 As a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy of the present invention, (A) a step of administering a test substance to a peripheral neuropathy model non-human mammal: (B) after a peripheral neuropathy model non-human mammal Step of measuring L-serine concentration in root ganglia: (C) The measured value of L-serine concentration in step (B) is compared with the measured value of L-serine concentration when the test substance was not administered. Step: (D) If the measured value of the L-serine concentration in step (B) is higher than the measured value of the L-serine concentration when the test substance is not administered, the test substance Or (a) administering a test substance to a peripheral neuropathy model non-human mammal: (b) peripheral neuropathy model non-human mammal 3-phos in animal dorsal root ganglia A step of measuring the expression level of glycerate dehydrogenase (3PGDH): (c) a step of comparing the expression level of 3PGDH in step (b) with the expression level of 3PGDH when the test substance is not administered: d) When the expression level of 3PGDH in step (b) is higher than the expression level of 3PGDH when the test substance is not administered, the test substance is evaluated as a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy As long as it has: According to such a method for screening a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy of the present invention, it is possible to efficiently screen for a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy, that is, the prevention / A therapeutic agent can be efficiently screened.
上記のスクリーニング方法における末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物としては、末梢神経障害を自然に発症した非ヒト哺乳動物であってもよいし、抗癌剤（好ましくはパクリタキセル、オキサリプラチン）や糖尿病誘発剤（好ましくはストレプトゾトシン）等の末梢神経障害誘導剤を投与することによって末梢神経障害を人為的に発症させた非ヒト哺乳動物であってもよい。 The peripheral neuropathy model non-human mammal in the above screening method may be a non-human mammal that naturally developed peripheral neuropathy, an anticancer agent (preferably paclitaxel, oxaliplatin) or a diabetes inducer (preferably May be a non-human mammal in which peripheral neuropathy is artificially developed by administering a peripheral neuropathy inducer such as streptozotocin).
上記の工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定は、ＨＰＬＣ等を用いて行うことができ、上記の工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量の測定は、後根神経節細胞についてのウェスタンブロット等により行うことができる。 The measurement of the L-serine concentration in the above step (B) can be performed using HPLC or the like, and the expression level of 3PGDH in the above step (b) is measured by Western blot or the like for dorsal root ganglion cells. Can be performed.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
［使用した動物、及び、該動物の一般的な健康状態］
本願実施例のすべての実験は、札幌医科大学動物実験委員会により承認され（Ｎｏ．０８−０２８）、アメリカ国立衛星研究所（National Institutes of Health）の倫理指針に従って行われた。本願実施例の実験には、成熟した雄のSprague-Dawley ラット(実験開始時の体重１６０〜２００ｇ；日本エスエルシー社製)を用いた。ラットは、温度制御（２１±１℃）された室内で１２時間の明暗周期で飼育し、食品及び水は自由に与えた。[Animal used and general health of the animal]
All experiments in the examples of the present application were approved by the Animal Care Committee of Sapporo Medical University (No. 08-028) and conducted according to the ethical guidelines of the National Institutes of Health. In the experiment of the present example, mature male Sprague-Dawley rats (body weight 160 to 200 g at the start of the experiment; manufactured by SLC Japan, Inc.) were used. Rats were housed in a temperature-controlled (21 ± 1 ° C.) room with a 12-hour light-dark cycle, and food and water were given ad libitum.
なお、実験開始時のラットの平均体重は、ビヒクル処理群、パクリタキセル処理群でそれぞれ、１６７ｇ及び１７５ｇであった。ビヒクル処理群及びパクリタキセル処理群の各ラットは、通常通りに体重が増加し続け、実験期間終了時（Ｄ４３）のラットの平均体重は、ビヒクル処理群、パクリタキセル処理群でそれぞれ、４０３ｇ及び４０７ｇであった。実験の４３日間中の、２つの群の平均体重増加量に有意な差はなかった。全てのラットは、脱毛症（alopecia）や下痢を含む健康障害を示すことなく、実験の終了時まで生存した。 The average body weight of the rats at the start of the experiment was 167 g and 175 g in the vehicle-treated group and the paclitaxel-treated group, respectively. The rats in the vehicle-treated group and the paclitaxel-treated group continued to gain weight as usual, and the average weight of the rats at the end of the experiment period (D43) was 403 g and 407 g in the vehicle-treated group and the paclitaxel-treated group, respectively. It was. There was no significant difference in the average weight gain between the two groups during the 43 days of the experiment. All rats survived until the end of the experiment without showing health problems including alopecia and diarrhea.
また、以下のすべての実施例におけるデータは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍで表した。また、各データは、Mann-Whitney U test又はKruskal-Wallis test及びその後のBonferroni’s testにより分析した。ｐ＜０．０５で有意差ありとした。統計分析は、Statview 5.0ソフトウェア（Abacus Concepts社製）及びNP Multi (Nagata T 社製)を用いて行った。 In addition, the data in all the following examples are average values ± S. E. Indicated by M. Each data was analyzed by Mann-Whitney U test or Kruskal-Wallis test and subsequent Bonferroni's test. There was a significant difference at p <0.05. Statistical analysis was performed using Statview 5.0 software (Abacus Concepts) and NP Multi (Nagata T).
［パクリタキセルによる末梢神経障害モデルラットの作製］
パクリタキセル（Sigma社製）を、６ｍｇ／ｍＬでクレモフォールＥＬ／無水エタノールに溶解し、次いで、最終濃度２ｍｇ／ｋｇ／ｍＬになるまで生理食塩水で希釈することによって、投与用のパクリタキセル溶液を調製した。また、パクリタキセルを用いずに、前述のパクリタキセル溶液と同様の割合でクレモフォールＥＬ／無水エタノールと生理食塩水とを混合することによって、ビヒクル（コントロール溶液）を調製した。[Preparation of rat model of peripheral neuropathy with paclitaxel]
Prepare paclitaxel solution for administration by dissolving paclitaxel (Sigma) at 6 mg / mL in Cremophor EL / anhydrous ethanol and then diluting with saline to a final concentration of 2 mg / kg / mL did. Further, without using paclitaxel, a vehicle (control solution) was prepared by mixing Cremophor EL / anhydrous ethanol and physiological saline at the same ratio as the paclitaxel solution described above.
実施例１で用意したパクリタキセル処理群のラットには前述のパクリタキセル溶液を、また、ビヒクル処理群のラットには前述のビヒクルを、Polomano et al（Pain 2001; 94:293-304）記載の方法で、隔日４回（Ｄ１、Ｄ３、Ｄ５、Ｄ７）腹腔内注入した。なお、パクリタキセル処理又はビヒクル処理の開始前と開始後に各ラットの体重を測定し、記録した。 The paclitaxel-treated rats prepared in Example 1 were treated with the aforementioned paclitaxel solution, and the vehicle-treated rats were treated with the aforementioned vehicle according to the method described in Polomano et al (Pain 2001; 94: 293-304). Injected intraperitoneally four times every other day (D1, D3, D5, D7). The body weight of each rat was measured and recorded before and after the start of paclitaxel treatment or vehicle treatment.
（von Freyテスト）
これらの両群のラットについて、文献（Pain 2006; 122: 245-57）記載のvon Freyテストを行い、機械感受性の評価を行った。具体的には以下のような方法で行った。(Von Frey test)
The rats in both groups were subjected to the von Frey test described in the literature (Pain 2006; 122: 245-57) to evaluate the mechanical sensitivity. Specifically, the following method was used.
透明のプラスチック製の折畳み式ケージ (寸法２９×１８×１３ｃｍ)内に、金網床をある程度の高さになるように配置した。この金網床の上に、各ラットを収容して２０分間放置し、この環境に順応させた。次に、曲げに要する力が４ｇ、８ｇ、及び１５ｇである３本のvon Freyフィラメントを用意し、それぞれのvon Freyフィラメントで、ラットの後肢の足裏の皮膚に１回につき５秒ずつ、１０回の刺激を与えた。von Freyフィラメントに対する後肢の引込み反応を計測し、後肢の引込み反応の回数を、与えた刺激の回数に対する割合（％）として表した。 The wire mesh floor was placed in a transparent plastic folding cage (dimensions 29 × 18 × 13 cm) so as to have a certain height. On this wire mesh floor, each rat was housed and left for 20 minutes to adapt to this environment. Next, three von Frey filaments having a bending force of 4 g, 8 g, and 15 g were prepared, and each von Frey filament was applied to the skin on the sole of the hind limb of the rat for 5 seconds each time. Irritation was given. The hind limb withdrawal response to the von Frey filament was measured, and the number of hind limb withdrawal responses was expressed as a percentage of the number of applied stimuli.
このvon Freyテストを、パクリタキセル又はビヒクル処理前（Ｄ０）及び、処理開始後のＤ８、Ｄ１５、Ｄ２２、Ｄ２９、Ｄ３６及びＤ４３に、両群（各群ｎ＝６）について行った。なお、パクリタキセルに誘導される４ｇに対する反応は、一般的にアロディニアと呼ばれ、１５ｇに対する反応は知覚過敏症と呼ばれ、８ｇに対する反応はそれらの中間である（Pain 2004; 109:150-161）。このvon Freyテストの結果を図１Ａに示す。図１Ａの結果から分かるように、パクリタキセル溶液又はビヒクルの初回の注入前のＤ０には、パクリタキセル処理群とビヒクル処理群との間に、４ｇ、８ｇ又は１５ｇのvon Frey 刺激に対する反応に有意な差はみられなかった。しかし、パクリタキセル処理群の４ｇ及び１５ｇのvon Frey刺激に対する引込み反応の割合は、ビヒクル処理群と比較して、Ｄ２２、Ｄ２９、及びＤ３６で有意に上昇した（図１Ａ）。さらに、パクリタキセル処理群の８ｇに対する反応も、ビヒクル処理群と比較して、Ｄ２２及びＤ２９で有意に上昇した（図１Ａ）。これらの結果から、パクリタキセルに誘導される機械的アロディニア／知覚過敏症の発症が示された。 This von Frey test was performed for both groups (each group n = 6) on paclitaxel or vehicle before treatment (D0) and at D8, D15, D22, D29, D36 and D43 after the start of treatment. The response to 4 g induced by paclitaxel is generally called allodynia, the response to 15 g is called hypersensitivity, and the response to 8 g is between them (Pain 2004; 109: 150-161) . The result of this von Frey test is shown in FIG. 1A. As can be seen from the results in FIG. 1A, D0 before the first infusion of paclitaxel solution or vehicle has a significant difference in response to 4 g, 8 g or 15 g of von Frey stimulation between the paclitaxel treated group and the vehicle treated group. Was not seen. However, the rate of withdrawal response to 4 g and 15 g of von Frey stimulation in the paclitaxel treated group was significantly increased at D22, D29, and D36 compared to the vehicle treated group (FIG. 1A). Furthermore, the response to 8 g of the paclitaxel-treated group was also significantly increased at D22 and D29 compared to the vehicle-treated group (FIG. 1A). These results indicated the development of paclitaxel-induced mechanical allodynia / hypersensitivity.
（感覚神経伝導速度試験）
次に、前述のパクリタキセル処理群のラット及びビヒクル処理群のラットについて、感覚神経伝導速度試験を行った。各ラットにおけるvon Freyフィラメントに対する後肢の引込み反応を測定した直後、すなわち、パクリタキセル又はビヒクル処理前（Ｄ０）及び、処理開始後のＤ８、Ｄ１５、Ｄ２２、Ｄ２９、Ｄ３６及びＤ４３に、各ラットの尾部の感覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ）を、刺激及び、記録用の電子機器（Neuropak 2: 日本光電工業株式会社製）を使用して測定した。尾部のＳＮＣＶは、文献（Clin Cancer Res 2003; 9: 5756-67）記載の通りに測定した。具体的には、以下のような方法で行った。(Sensory nerve conduction velocity test)
Next, the sensory nerve conduction velocity test was performed on the rats in the paclitaxel treatment group and the rats in the vehicle treatment group. Immediately after measuring the hind limb withdrawal response to von Frey filaments in each rat, ie, before paclitaxel or vehicle treatment (D0) and after initiation of treatment at D8, D15, D22, D29, D36 and D43, Sensory nerve conduction velocity (SNCV) was measured using stimulation and recording electronics (Neuropak 2: Nihon Kohden Co., Ltd.). Tail SNCV was measured as described in the literature (Clin Cancer Res 2003; 9: 5756-67). Specifically, the following method was used.
ペントバルビタール腹腔内注射でラットに軽麻酔を施した。次いで、記録用の針電極を、尾部の肛門から２ｃｍ及び８ｃｍの位置に注入した。刺激電極は、肛門から１２ｃｍの位置に設置した。神経刺激後、２箇所で記録された電位の潜時（ピークからピークまで）を測定し、それによりＳＮＣＶを算出した。なお、ラットの皮膚温度は、実験中３６〜３７℃に維持した。算出したＳＮＣＶの結果を図１Ｂに示す。図１Ｂの結果から分かるように、Ｄ０では、パクリタキセル処理群とビヒクル処理群ではＳＮＣＶは同程度だった。しかし、処理後においては、パクリタキセル処理群では、ビヒクル処理群と比較してＳＮＣＶが低下した（図１Ｂ）。特に、Ｄ１５（３４．６±０．７ ｖｓ ３８．４±０．９ｍ／ｓ、Ｐ＜０．０５）、Ｄ２９（３９．５±０．９ ｖｓ ４２．８±１．１ｍ／ｓ、Ｐ＜０．０５）及びＤ３６（４１．６±０．５ ｖｓ ４３．０±０．６ｍ／ｓ、Ｐ＜０．０５）においては、パクリタキセル処理群では、ビヒクル処理群と比較してＳＮＣＶが有意に低下した（図１Ｂ）。 Rats were lightly anesthetized by intraperitoneal injection of pentobarbital. A recording needle electrode was then injected into the 2 cm and 8 cm positions from the tail anus. The stimulation electrode was placed at a position 12 cm from the anus. After nerve stimulation, the potential latencies (from peak to peak) recorded at two locations were measured, thereby calculating SNCV. The rat skin temperature was maintained at 36 to 37 ° C. during the experiment. The calculated SNCV result is shown in FIG. 1B. As can be seen from the results in FIG. 1B, at D0, the SNCV was comparable between the paclitaxel treated group and the vehicle treated group. However, after the treatment, the SNCV decreased in the paclitaxel-treated group compared to the vehicle-treated group (FIG. 1B). In particular, D15 (34.6 ± 0.7 vs 38.4 ± 0.9 m / s, P <0.05), D29 (39.5 ± 0.9 vs 42.8 ± 1.1 m / s, P <0.05) and D36 (41.6 ± 0.5 vs 43.0 ± 0.6 m / s, P <0.05), the paclitaxel treated group had a significant SNCV compared to the vehicle treated group (FIG. 1B).
以上のことから、パクリタキセル処理により、末梢神経障害モデルラットが作製されたことが示された。 From the above, it was shown that peripheral neuropathy model rats were prepared by paclitaxel treatment.
［パクリタキセル処理の、神経におけるセリン量への効果］
神経におけるセリン量が、パクリタキセル処理によりどのような影響を受けるかを調べるために、以下の実験を行った。[Effect of paclitaxel treatment on serine level in nerves]
In order to examine how the amount of serine in the nerve is affected by the treatment with paclitaxel, the following experiment was performed.
von Freyフィラメントへの反応測定及びＳＮＣＶの測定前のＤ０、並びに、測定後のＤ８、Ｄ１５、Ｄ２２、Ｄ２９及びＤ４３に、ウレタンでラットに深麻酔を施し、ラットを断頭した。そのラットから脊髄、坐骨神経及びＬ３／４／５ＤＲＧを迅速に除去し、−８０℃で凍結した。脊髄、坐骨神経及びＤＲＧのサンプルを、氷上のメタノールでホモジネートした。メタノールの添加量は、サンプル重量の１０倍であった。ホモジネートを、１５，０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離した。上清を、１０倍量の蒸留水で希釈し、１／４量（ｖ）の５ｍＭ オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）／Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）溶液を添加した。室温で２分間静置させた後、反応液を２０μＬ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）システムに注入した。ＨＰＬＣシステムは、２つのＥＰ−３００ポンプ（Eicom Corporation社製）、ＤＧ−３００移動相脱ガス装置（Eicom Corporation社製）、ＡＴＣ−３００カラムオーブン（Eicom Corporation社製）及びＦＬＤ−３７０蛍光検出器（Eicom Corporation社製）を備える。サンプルと標準溶液を自動的に誘導体化し、Ｍ−２３１ＳＬオートサンプラー（Eicom Corporation社製）にてＭＰＬＣシステムに注入した。ＯＰＡ／ＮＡＣ中のＤ−セリン及びＬ−セリンのジアステレオマー誘導体を、ＳＣ−５ＯＤＳ逆相カラム（１５０×３ｍｍ i.d.、粒径５μｍ；Eicom Corporation社製）にて分離し、３４０ｎｍの励起波長及び４４５ｎｍの発光波長でモニタリングした。５ｍｇ／ＬのＥＤＴＡ−２Ｎａを含むメタノールと０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）との混合物（８６：１４、ｖ／ｖ）を移動相として使用した。Ｄ−セリン及びＬ−セリン誘導体の溶出後、５ｍｇ／ＬのＥＤＴＡ−２Ｎａを含むメタノールと０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）との混合物（８：２、ｖ/ｖ）で遅い溶出ピークを流出させた。流出は、注入後１４．０分から１５．０分にかけて行った。移動相流出速度は、０．５ｍＬ／分に設定し、カラム温度は、３０℃に設定した。Ｄ−セリン及びＬ−セリンの保持時間は、それぞれ１１．４５分と１２．５分であった。この方法は、本発明者が修正したAswad（Anal Biochem 1984; 137: 405-9）の方法にしたがった、アミノ酸の光学的異性体分離法に基づくものである。 Rats were deeply anesthetized with urethane at D0 before measurement of von Frey filament and SNCV and at D8, D15, D22, D29 and D43 after measurement, and the rat was decapitated. The spinal cord, sciatic nerve and L3 / 4 / 5DRG were rapidly removed from the rat and frozen at -80 ° C. Samples of spinal cord, sciatic nerve and DRG were homogenized with methanol on ice. The amount of methanol added was 10 times the sample weight. The homogenate was centrifuged at 15,000 xg for 20 minutes at 4 ° C. The supernatant was diluted with 10 volumes of distilled water, and a 1/4 volume (v) of 5 mM orthophthalaldehyde (OPA) / N-acetylcysteine (NAC) solution was added. After allowing to stand at room temperature for 2 minutes, 20 μL of the reaction solution was injected into a high performance liquid chromatography (HPLC) system. The HPLC system consists of two EP-300 pumps (Eicom Corporation), DG-300 mobile phase degasser (Eicom Corporation), ATC-300 column oven (Eicom Corporation) and FLD-370 fluorescence detector. (Eicom Corporation). Samples and standard solutions were automatically derivatized and injected into the MPLC system with an M-231SL autosampler (Eicom Corporation). The diastereomeric derivatives of D-serine and L-serine in OPA / NAC were separated by SC-5ODS reverse phase column (150 × 3 mm id, particle size 5 μm; manufactured by Eicom Corporation), and the excitation wavelength of 340 nm and Monitoring was performed at an emission wavelength of 445 nm. A mixture (86:14, v / v) of methanol containing 5 mg / L EDTA-2Na and 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) was used as the mobile phase. After elution of D-serine and L-serine derivatives, slow elution with a mixture (8: 2, v / v) of methanol containing 5 mg / L EDTA-2Na and 0.05 M phosphate buffer (pH 6.0) The peak was drained. The outflow was from 14.0 to 15.0 minutes after injection. The mobile phase efflux rate was set at 0.5 mL / min and the column temperature was set at 30 ° C. The retention times of D-serine and L-serine were 11.45 minutes and 12.5 minutes, respectively. This method is based on the optical isomer separation method of amino acids according to the method of Aswad (Anal Biochem 1984; 137: 405-9) modified by the present inventor.
これらのＨＰＬＣの結果を図２に示す。図２Ａの左のグラフには、Ｌ−セリン及びＤ−セリンを含む標準溶液についてのＨＰＬＣの結果を示し、図２Ａの右のグラフには、ＤＲＧサンプルについてのＨＰＬＣの結果を示す。図２Ａの結果から分かるように、このＨＰＬＣにおいて、Ｌ−セリン及びＤ−セリンを同時に分離し、測定することができることが示された。図２Ｂには脊髄におけるＬ−セリン量の測定結果を示し、図２Ｃには坐骨神経におけるＬ−セリン量の測定結果を示し、図２ＤにはＤＲＧにおけるＬ−セリン量の測定結果を示す。坐骨神経及び脊髄におけるＬ−セリン濃度に関しては、ビヒクル処理群とパクリタキセル処理群との間に有意な差は見られなかった（図２Ｂ及びＣ）。一方、末梢神経であるＤＲＧにおけるＬ−セリン濃度に関しては、パクリタキセル処理群では、ビヒクル処理群と比較して低下傾向を示し、特に、Ｄ１５（５．９±０．４２ ｖｓ １０．０±０．９９ｎｇ／ｍｇ、Ｐ＜０．０５）及びＤ２２（７．７±０．５ ｖｓ ９．５±０．５ｎｇ／ｍｇ、Ｐ＜０．０５）においては、有意な低下を示した（図２Ｄ）。なお、Ｄ−セリン濃度についても同様の測定を行ったが、坐骨神経、脊髄及びＤＲＧのいずれにおいても、ビヒクル処理群とパクリタキセル処理群との間に有意な差は見られなかった（データは示さず）。 These HPLC results are shown in FIG. The left graph in FIG. 2A shows the HPLC results for the standard solution containing L-serine and D-serine, and the right graph in FIG. 2A shows the HPLC results for the DRG sample. As can be seen from the results in FIG. 2A, it was shown that L-serine and D-serine can be separated and measured simultaneously in this HPLC. FIG. 2B shows the measurement result of the L-serine amount in the spinal cord, FIG. 2C shows the measurement result of the L-serine amount in the sciatic nerve, and FIG. 2D shows the measurement result of the L-serine amount in DRG. Regarding the L-serine concentration in the sciatic nerve and spinal cord, there was no significant difference between the vehicle-treated group and the paclitaxel-treated group (FIGS. 2B and C). On the other hand, regarding the L-serine concentration in DRG, which is a peripheral nerve, the paclitaxel-treated group showed a tendency to decrease as compared to the vehicle-treated group, and in particular, D15 (5.9 ± 0.42 vs 10.0 ± 0.00). 99 ng / mg, P <0.05) and D22 (7.7 ± 0.5 vs 9.5 ± 0.5 ng / mg, P <0.05) showed a significant decrease (FIG. 2D). . The same measurement was performed for D-serine concentration, but no significant difference was observed between the vehicle-treated group and the paclitaxel-treated group in any of the sciatic nerve, spinal cord and DRG (data not shown). )
［パクリタキセル処理の３ＰＧＤＨ発現への効果］
ＤＲＧにおける３ＰＧＤＨの発現量が、パクリタキセル処理によりどのような影響を受けるかを調べるために、以下のウェスタンブロットを行った。なお、３ＰＧＤＨは、３−ホスホグリセリン酸からのＬ−セリン生合成における初期酵素であり、３−ホスホグリセリン酸から３−ホスホヒドロキシピルビン酸を生成する酵素である。[Effect of paclitaxel treatment on 3PGDH expression]
In order to examine how the expression level of 3PGDH in DRG is affected by paclitaxel treatment, the following Western blot was performed. 3PGDH is an initial enzyme in L-serine biosynthesis from 3-phosphoglycerate, and is an enzyme that generates 3-phosphohydroxypyruvic acid from 3-phosphoglycerate.
ビヒクル又はパクリタキセル処理後のＤ８、Ｄ１５、Ｄ１２、Ｄ２２、Ｄ２９及びＤ４３に、ウェスタンブロットを行った。具体的には以下のような方法で行った。ラットの腹腔内にウレタン（３．０ｇ／ｋｇ）を注入して深麻酔を施した後、ラットを断頭した。そのラットから、両側のＬ３−５ ＤＲＧを迅速に除去し、そのＤＲＧを、氷上のＰＢＳ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma社製）中でホモジネートした。粗ホモジネートを、１５，０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離した。上清を回収した後、上清中のタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準としたＤＣタンパク質アッセイ（Bio-Rad Laboratories社製）により測定した。等量のタンパク質を、ラウリル酸硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（４％）で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（Millipore社製）に転写した。この膜を、１０％スキムミルクを含むＰＢＳ中のモルモット抗３ＰＧＤＨ抗体（１μｇ／ｍＬ）にて、４℃で、一晩インキュベートした。次いで、上記膜におけるモルモット抗３ＰＧＤＨ抗体を免疫反応で検出することにより、ＤＲＧ中の３ＰＧＤＨ濃度を測定した。また、ハウスキーピングタンパク質である、アクチンの濃度も、ウサギ抗アクチン抗体（１：５，０００；Ａ２０６６、Sigma社製）を用いて測定した。なお、免疫反応については、化学発光増幅法及び化学発光検出システム（AmershamBiosciences社製）を用いて可視化した。なお、バンドの強度は、イメージデンシトメーター（ＮＩＨImage 1.63; National Institutes of Health社製）を用いて判定し、β−アクチンの強度で標準化した。 Western blots were performed on D8, D15, D12, D22, D29 and D43 after vehicle or paclitaxel treatment. Specifically, the following method was used. After deep anesthesia was performed by injecting urethane (3.0 g / kg) into the abdominal cavity of the rat, the rat was decapitated. From the rat, the L3-5 DRG on both sides was rapidly removed and the DRG was homogenized in PBS and protease inhibitor cocktail (Sigma) on ice. The crude homogenate was centrifuged at 15,000 xg for 20 minutes at 4 ° C. After collecting the supernatant, the protein concentration in the supernatant was measured by a DC protein assay (Bio-Rad Laboratories) using bovine serum albumin as a standard. Equal amounts of protein were separated by sodium laurate sulfate-polyacrylamide electrophoresis (4%) and transferred to a polyvinylidene fluoride membrane (Millipore). The membrane was incubated overnight at 4 ° C. with guinea pig anti-3PGDH antibody (1 μg / mL) in PBS containing 10% skim milk. Next, the concentration of 3PGDH in DRG was measured by detecting the guinea pig anti-3PGDH antibody in the membrane by an immune reaction. The concentration of actin, which is a housekeeping protein, was also measured using a rabbit anti-actin antibody (1: 5,000; A2066, manufactured by Sigma). The immune reaction was visualized using a chemiluminescence amplification method and a chemiluminescence detection system (Amersham Biosciences). The intensity of the band was determined using an image densitometer (NIH Image 1.63; manufactured by National Institutes of Health) and standardized with the intensity of β-actin.
これらのウェスタンブロットの結果を図３に示す。図３の結果から分かるように、パクリタキセル処理群におけるＤＲＧの３ＰＧＤＨタンパク質レベル（３ＰＧＤＨ／βアクチン）は、ビヒクル処理群のそのレベルと比較して、Ｄ１５（２．５±０．２ ｖｓ ３．９±０．３、Ｐ＜０．０５）、及びＤ２２（３．０±０．３ ｖｓ ４．６±０．２、Ｐ＜０．０５）に有意な低下が示された。ＤＲＧにおける３ＰＧＤＨ発現のこの経時変化は、ＤＲＧにおけるＬ−セリン濃度の経時変化（図２Ｄ）と一致した。 The results of these Western blots are shown in FIG. As can be seen from the results in FIG. 3, the DPG 3PGDH protein level (3PGDH / β-actin) in the paclitaxel treated group was D15 (2.5 ± 0.2 vs 3.9) compared to that level in the vehicle treated group. Significant decreases were shown for ± 0.3, P <0.05), and D22 (3.0 ± 0.3 vs 4.6 ± 0.2, P <0.05). This time course of 3PGDH expression in DRG was consistent with the time course of L-serine concentration in DRG (FIG. 2D).
［ＤＲＧにおける３ＰＧＤＨの局在］
ＤＲＧにおける３ＰＧＤＨの局在を調べるために、以下の免疫組織化学的解析を行った。[Localization of 3PGDH in DRG]
In order to investigate the localization of 3PGDH in DRG, the following immunohistochemical analysis was performed.
免疫組織化学的解析には、以下のポリクロナール抗体を使用した。モルモット抗３ＰＧＤＨ抗体（１．０μｇ／ｍＬ；北海道大学から提供）、ウサギ抗タンパク質遺伝子産物９．５（ＰＧＰ９．５）（１：４０００、ＲＡ９５１０１；Ultraclone社製）、マウス抗ＣＤ３１抗体（１：１００、１０Ｒ−ＣＤ３１ｇＲＴ；Fitzgerald社製）及びウサギ抗Ｓ−１００β抗体（１：１００、ＲＹ３３０；矢内原研究所製）。なお、これまでの研究により、上記の抗３ＧＰＤＨ抗体の特異性が確認されている（J. Neurosci 2001; 21: 7691-704; Arch Histol Cytol2003; 66: 429-36）。ラットに５０ｍｇ／ｋｇのケタミンを腹腔内注射して、深麻酔を施した後、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むリン酸緩衝液（９６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ及び２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４−２Ｈ２Ｏを含む水溶液）で経心的に灌流を行った。左側のＬ４ ＤＲＧを除去し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むリン酸緩衝液（ＰＢ）に２時間浸漬して固定した。次にＤＲＧを、２５％スクロースを含むＰＢＳ（９．６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ、２．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４−２Ｈ２Ｏ及び１３６ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液）内で一晩４℃にて凍結保護した。このＤＲＧを、Tissue-Tek包埋培地（Sakura社製）内に入れた後、急速凍結した。凍結した切片を、スライディングクリオスタット（Sakura社製）を用いて２０μｍに切断し、ゼラチンでコーティングされたスライド上に解凍して載せた。この組織切片をＰＢＳ中で洗浄し、１０％の正常ロバ血清及び０．２％のTritonX-100(Sigma社製)を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）からなるブロッキング溶液で、室温にて１時間インキュベートした。その後、切片を、一次抗体の混合物中で一晩インキュベートした。切片をＰＢＳ−Ｔでリンスした後、ＰＢＳ−Ｔで５０１倍希釈したAlexa Fluor 488-、Alexa 597-、及びAlexa 647 標識種特異的二次抗体（Invitrogen社製）溶液でその切片を室温にて２時間インキュベートした。２次抗体の蛍光イメージは、共焦点レーザー走査顕微鏡（Digital Eclipse C1; Nikon社製）で得た。にじみや蛍光色素分子の交差励起を防ぐために、line-by-line 連続スキャニングにより、各イメージにつき１つのスタックを得た。The following polyclonal antibodies were used for immunohistochemical analysis. Guinea pig anti-3PGDH antibody (1.0 μg / mL; provided by Hokkaido University), rabbit antiprotein gene product 9.5 (PGP9.5) (1: 4000, RA95101; manufactured by Ultraclone), mouse anti-CD31 antibody (1: 100 10R-CD31gRT; manufactured by Fitzgerald) and rabbit anti-S-100β antibody (1: 100, RY330; manufactured by Yanaihara Institute). In addition, the specificity of the above anti-3GPDH antibody has been confirmed by previous studies (J. Neurosci 2001; 21: 7691-704; Arch Histol Cytol 2003; 66: 429-36). Rats were injected intraperitoneally with 50 mg / kg ketamine and given deep anesthesia, followed by phosphate buffer containing 4% paraformaldehyde (PFA) (96 mM NaH 2 PO 4 -12H 2 O and 25 mM Na 2 HPO It was subjected hearts perfused with an aqueous solution) containing 4 -2H 2 O. The L4 DRG on the left side was removed, and fixed by being immersed in a phosphate buffer solution (PB) containing 4% paraformaldehyde (PFA) for 2 hours. DRG is then added overnight at 4 ° C. in PBS containing 25% sucrose (9.6 mM NaH 2 PO 4 -12H 2 O, 2.5 mM Na 2 HPO 4 -2H 2 O and 136 mM NaCl in water). Cryoprotected. The DRG was placed in a Tissue-Tek embedding medium (Sakura) and then quickly frozen. The frozen section was cut to 20 μm using a sliding cryostat (Sakura) and thawed on a gelatin-coated slide. This tissue section was washed in PBS and incubated for 1 hour at room temperature with a blocking solution consisting of PBS (PBS-T) containing 10% normal donkey serum and 0.2% TritonX-100 (Sigma). did. The sections were then incubated overnight in the primary antibody mixture. After rinsing the section with PBS-T, the section was incubated at room temperature with Alexa Fluor 488-, Alexa 597-, and Alexa 647-labeled species-specific secondary antibody (Invitrogen) solution diluted 501 times with PBS-T. Incubated for 2 hours. The fluorescence image of the secondary antibody was obtained with a confocal laser scanning microscope (Digital Eclipse C1; manufactured by Nikon). One stack was obtained for each image by line-by-line continuous scanning to prevent bleeding and cross-excitation of fluorophore molecules.
これらの免疫組織化学的解析の結果を図４に示す。図４Ａは、ＤＲＧの組織切片を、３ＰＧＤＨ、ＰＧＰ９．５（ニューロンのマーカー）、ＣＤ３１（血管マーカー）について三重染色したイメージを表している。３ＰＧＤＨの強力な免疫染色が、ＤＲＧニューロンの体細胞の多くを取り巻く大きなリング様構造として観察された（図４Ａ）。次に、ＤＲＧの組織切片を、３ＰＧＤＨ、Ｓ１００β（衛星細胞のマーカー）について二重染色した。図４Ｂ１は３ＰＧＤＨについて染色したイメージを示し、図４Ｂ２はＳ１００βについて染色したイメージを示し、図４Ｂ３は図４Ｂ１と図４Ｂ２のイメージを重ねたイメージを示す。図４Ｂ１〜Ｂ３から分かるように、３ＰＧＤＨの免疫染色と、Ｓ１００β（衛星細胞のマーカー）の免疫染色とが重複することが観察された。このことから、３ＰＧＤＨは、文献（Neurosci Res 1998; 30: 195-9）記載の通り、衛星細胞に局在していることが示された。さらに３ＰＧＤＨの免疫染色は、血管マーカーであるＣＤ３１の免疫染色と隣接していた（図４Ａ）。以上の結果から、３ＰＧＤＨが、血管とＤＲＧニューロンの細胞体との間に位置する衛星細胞に局在していることが示された。 The results of these immunohistochemical analyzes are shown in FIG. FIG. 4A shows an image obtained by triple-staining a tissue section of DRG for 3PGDH, PGP9.5 (a neuronal marker), and CD31 (a blood vessel marker). A strong immunostaining of 3PGDH was observed as a large ring-like structure surrounding many of the DRG neuron somatic cells (FIG. 4A). Next, DRG tissue sections were double-stained for 3PGDH, S100β (satellite cell marker). 4B1 shows an image stained with 3PGDH, FIG. 4B2 shows an image stained with S100β, and FIG. 4B3 shows an image obtained by superimposing the images of FIGS. 4B1 and 4B2. As can be seen from FIGS. 4B1 to B3, it was observed that 3PGDH immunostaining and S100β (satellite cell marker) immunostaining overlap. This indicates that 3PGDH is localized in satellite cells as described in the literature (Neurosci Res 1998; 30: 195-9). Furthermore, the immunostaining of 3PGDH was adjacent to the immunostaining of CD31, which is a vascular marker (FIG. 4A). From the above results, it was shown that 3PGDH is localized in the satellite cell located between the blood vessel and the cell body of the DRG neuron.
［パクリタキセルによる末梢神経障害モデルラットに対する、Ｌ−セリン投与の効果］
末梢神経障害（特に、機械的アロディニア／知覚過敏症、及び、ＳＮＣＶの低下）に対するＬ−セリンの効果を確認するために、上記実施例２で作製した末梢神経障害モデルラットを用いたＬ−セリン投与を行い、von Freyテスト及び感覚神経伝導速度試験を行った。具体的には、腹腔内投与群については、ラットにパクリタキセル溶液を注入した日から、２８日間連続して毎日１回、０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ（１ｍＬ）、０．０３ｍｍｏｌ／ｋｇ（１ｍＬ）若しくは０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン溶液（１ｍＬ）、又は、ビヒクル（０．９％の生理食塩水）（１ｍＬ）をさらに腹腔内投与したこと以外は、前述の実施例２に記載の方法と同じ方法でvon Freyテスト及び感覚神経伝導速度試験を行った。また、経口投与群については、ラットにパクリタキセル溶液を注入した日から、２８日間連続して毎日１回、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン溶液（１ｍＬ）をさらに経口投与（胃管を経口的に挿入して投与）したこと以外は、前述の実施例２に記載の方法と同じ方法でvon Freyテスト及び感覚神経伝導速度試験を行った。[Effect of L-serine administration on rat model of peripheral neuropathy caused by paclitaxel]
In order to confirm the effect of L-serine on peripheral neuropathy (especially mechanical allodynia / hypersensitivity and reduction of SNCV), L-serine using the peripheral neuropathy model rat prepared in Example 2 above After administration, a von Frey test and a sensory nerve conduction velocity test were performed. Specifically, in the intraperitoneal administration group, 0.01 mmol / kg (1 mL), 0.03 mmol / kg (1 mL) or 0 once daily every day for 28 consecutive days from the day when the paclitaxel solution was injected into the rat. The same method as described in Example 2 except that 1 mmol / kg L-serine solution (1 mL) or vehicle (0.9% physiological saline) (1 mL) was further administered intraperitoneally. The method was von Frey test and sensory nerve conduction velocity test. As for the oral administration group, a 0.1 mmol / kg L-serine solution (1 mL) was further orally administered once daily for 28 consecutive days from the day when the paclitaxel solution was injected into the rat (the stomach tube was administered orally). The von Frey test and the sensory nerve conduction velocity test were performed in the same manner as described in Example 2 except that the drug was inserted into and administered.
これらのvon Freyテストの結果を図５Ａに示し、感覚神経伝導速度試験の結果を図５Ｂに示す。図５Ａの結果から分かるように、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群や０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン経口投与群では、ビヒクル腹腔内投与群と比較して、機械的アロディニア／知覚過敏症が改善された。特に、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群や０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン経口投与群では、Ｄ２２及びＤ２９における４ｇのvon Frey刺激に対する引っ込み反応の割合、Ｄ２９における８ｇのvon Frey刺激に対する引っ込み反応の割合、及び、Ｄ２９における１５ｇのvon Frey刺激に対する引っ込み反応の割合が、ビヒクル腹腔内投与群のその割合と比較して有意に減少した。また、０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群でも、Ｄ２２における４ｇのvon Frey刺激に対する引っ込み反応の割合がビヒクル腹腔内投与群のその割合と比較して有意に減少した。なお、各群はｎ＝６で実験を行った。 The results of these von Frey tests are shown in FIG. 5A, and the results of sensory nerve conduction velocity tests are shown in FIG. 5B. As can be seen from the results in FIG. 5A, mechanical allodynia was observed in the 0.1 mmol / kg intraperitoneal administration group of L-serine and the oral administration group of 0.1 mmol / kg L-serine as compared with the intraperitoneal administration group of vehicle. / Hypersensitivity improved. In particular, in the 0.1 mmol / kg intraperitoneal administration group of L-serine and the 0.1 mmol / kg oral administration group of L-serine, the ratio of the withdrawal reaction to 4 g von Frey stimulation in D22 and D29, 8 g von in D29 The rate of withdrawal response to Frey stimulation and the rate of withdrawal response to 15 g von Frey stimulation at D29 were significantly reduced compared to that in the vehicle ip group. Also, in the intraperitoneal administration group of 0.01 mmol / kg L-serine, the rate of withdrawal response to 4 g of von Frey stimulation in D22 was significantly reduced compared to that in the intraperitoneal administration group of vehicle. Each group was tested with n = 6.
また、図５Ｂの結果から分かるように、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群や０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン経口投与群では、ビヒクル腹腔内投与群と比較して、ＳＮＣＶの低下が改善された。特に、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群や０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン経口投与群のＤ１５、Ｄ２２、Ｄ２９及びＤ３６におけるＳＮＣＶは、ビヒクル腹腔内投与群のＳＮＣＶと比較して有意に上昇していた。また、０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ又は０．０３ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群のＤ２２におけるＳＮＣＶは、ビヒクル腹腔内投与群のＳＮＣＶと比較して有意に上昇していた。なお、本実施例６においては、いずれのＬ−セリンの用量でも、ラットは標準通り体重が増加し、好ましくない行動的影響は示されなかった。 Further, as can be seen from the results of FIG. 5B, the SNCV in the 0.1 mmol / kg L-serine intraperitoneal administration group and the 0.1 mmol / kg L-serine oral administration group were compared with the vehicle intraperitoneal administration group. The decline of was improved. In particular, the SNCV in D15, D22, D29 and D36 of the 0.1 mmol / kg L-serine intraperitoneal administration group and the 0.1 mmol / kg oral administration group of L-serine were compared with the SNCV of the vehicle intraperitoneal administration group. Was significantly increased. Moreover, SNCV in D22 of the L-serine intraperitoneal administration group of 0.01 mmol / kg or 0.03 mmol / kg was significantly increased compared with SNCV of the vehicle intraperitoneal administration group. In Example 6, at any dose of L-serine, rats gained weight as standard, and no undesirable behavioral effects were shown.
以上の結果から、Ｌ−セリンは、パクリタキセルによる末梢神経障害の改善効果を有していることがin vivoにおいて実証された。 From the above results, it was demonstrated in vivo that L-serine has an effect of improving peripheral neuropathy by paclitaxel.
［オキサリプラチンによる末梢神経障害モデルラットに対する、Ｌ−セリン投与の効果］
パクリタキセル以外の要因による末梢神経障害へのＬ−セリンの効果を確認するために、別の抗癌剤であるオキサリプラチンを用いた実験を行った。具体的には、実施例２及び実施例６の実験において、パクリタキセルに代えてオキサリプラチン（２ｍｇ／ｋｇ）を用い、１週間に２回、計９回腹腔内投与したこと以外は同様の実験を行った。このオキサリプラチンによる末梢神経障害モデルラットを用いたvon FreyテストのＤ２９における結果、及び、感覚神経伝導速度試験のＤ２９における結果を図６に示す。図６の結果から分かるように、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群（ＯＸ＋０．１Ｓ）では、ビヒクル腹腔内投与群（ＯＸ）と比較して、von Frey刺激（４ｇ、８ｇ、１５ｇ）に対する反応が有意に減少した。また、感覚神経伝導速度についても、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群（ＯＸ＋０．１Ｓ）では、ビヒクル腹腔内投与群（ＯＸ）と比較して、有意に上昇していた。なお、各群はｎ＝６で実験を行った。[Effect of L-serine administration on peripheral neuropathy model rats with oxaliplatin]
In order to confirm the effect of L-serine on peripheral neuropathy caused by factors other than paclitaxel, an experiment using oxaliplatin, another anticancer agent, was performed. Specifically, in the experiments of Example 2 and Example 6, the same experiment was performed except that oxaliplatin (2 mg / kg) was used instead of paclitaxel and administered intraperitoneally twice a week for a total of 9 times. went. The result in D29 of the von Frey test using the peripheral neuropathy model rat by this oxaliplatin and the result in D29 of the sensory nerve conduction velocity test are shown in FIG. As can be seen from the results in FIG. 6, in the 0.1 mmol / kg intraperitoneal administration group of L-serine (OX + 0.1S), von Frey stimulation (4 g, 8 g, The response to 15 g) was significantly reduced. The sensory nerve conduction velocity was also significantly increased in the 0.1 mmol / kg intraperitoneal administration group of L-serine (OX + 0.1S) as compared with the intraperitoneal administration group of vehicle (OX). Each group was tested with n = 6.
以上の結果から、Ｌ−セリンは、オキサリプラチンによる末梢神経障害に対しても、改善効果を有していることがin vivoにおいて実証された。 From the above results, it was demonstrated in vivo that L-serine has an improving effect on peripheral neuropathy caused by oxaliplatin.
［糖尿病性末梢神経障害モデルラットに対する、Ｌ−セリン投与の効果］
抗癌剤投与以外の要因による末梢神経障害へのＬ−セリンの効果を確認するために、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を用いた実験を行った。具体的には、前述の実施例１で用意したのと同様のラットを３群に分け、非投与群（ＮＳ）、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ (i.p.)）、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(p.o.)）とした。ＳＴＺ腹腔内投与群には、Ｄ１に５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを腹腔内注入し、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群には、Ｄ１に５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを腹腔内注入した後、Ｄ１から連日０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリンを腹腔内注入した。また、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群には、Ｄ１に５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを腹腔内注入した後、Ｄ１から連日０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリンを経口投与した。なお、ストレプトゾトシンは膵臓のβ細胞に取り込まれ、そこでラジカル反応を生じることによって、β細胞を破壊する性質を有しているため、糖尿病モデルを作製する際に一般的に用いられている。上記の４群（非投与群、ＳＴＺ腹腔内投与群、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群）のラットについて、上記実施例２に記載の方法で行ったvon FreyテストのＤ２９における結果、及び、感覚神経伝導速度試験のＤ２９における結果を図７の上パネルに示す。図７の上パネルの結果から分かるように、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）では、非投与群と比較してvon Frey刺激（４ｇ、８ｇ、１５ｇ）に対する反応が上昇し、また、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(i.p.)）や、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(p.o.)）では、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）と比較して、von Frey刺激（４ｇ、８ｇ、１５ｇ）に対する反応が有意に減少した。さらに、感覚神経伝導速度については、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）では、非投与群と比較して有意に低下し、また、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(i.p.)）や、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(p.o.)）では、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）と比較して、有意に上昇した。なお、上記の４群について、Ｄ２９における血糖値と体重を測定した結果を図７の下パネルに示す。図７の下パネルの結果から分かるように、ＳＴＺ腹腔内投与群や、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群や、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ (p.o.)）では、非投与群と比較して血糖値（ＢＳ）が有意に増加しており、また、体重が有意に低下していた。すなわち、ＳＴＺ腹腔内投与群や、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群や、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ (p.o.)）は糖尿病を発症していることが示された。なお、各群はｎ＝６で実験を行った。[Effect of L-serine administration on diabetic peripheral neuropathy model rats]
In order to confirm the effect of L-serine on peripheral neuropathy caused by factors other than the administration of anticancer agents, experiments using streptozotocin (STZ) were conducted. Specifically, rats similar to those prepared in Example 1 described above were divided into three groups, the non-administration group (NS), the STZ intraperitoneal administration group (STZ), the STZ and L-serine intraperitoneal administration group ( STZ + 0.1S (ip)), STZ intraperitoneal administration and L-serine oral administration group (STZ + 0.1S (po)). In the intraperitoneal administration group of STZ, 50 mg / kg of STZ was intraperitoneally injected into D1, and in the intraperitoneal administration group of STZ and L-serine, intraperitoneal injection of 50 mg / kg of STZ into D1 0.1 mmol / kg L-serine was injected intraperitoneally. Further, in the intraperitoneal administration of STZ and L-serine oral administration, 50 mg / kg of STZ was intraperitoneally injected into D1, and then 0.1 mmol / kg of L-serine was orally administered every day from D1. Streptozotocin is generally used when preparing a diabetes model because it has the property of destroying β cells by being taken up by β cells in the pancreas and causing a radical reaction there. With respect to the rats of the above-mentioned 4 groups (non-administration group, STZ intraperitoneal administration group, STZ and L-serine intraperitoneal administration group, STZ intraperitoneal administration and L-serine oral administration group), the method described in Example 2 above. The results of the von Frey test performed at D29 and the sensory nerve conduction velocity test at D29 are shown in the upper panel of FIG. As can be seen from the results in the upper panel of FIG. 7, in the intraperitoneal administration group (STZ) of STZ, the response to von Frey stimulation (4 g, 8 g, 15 g) increased compared to the non-administration group, and STZ and L -In serine intraperitoneal administration group (STZ + 0.1S (ip)), STZ intraperitoneal administration and L-serine oral administration group (STZ + 0.1S (po)), compared with STZ intraperitoneal administration group (STZ), Response to von Frey stimulation (4g, 8g, 15g) was significantly reduced. Furthermore, the sensory nerve conduction velocity was significantly decreased in the STZ intraperitoneal administration group (STZ) compared to the non-administration group, and STZ and L-serine intraperitoneal administration group (STZ + 0.1S (ip)) In addition, STZ intraperitoneal administration and L-serine oral administration group (STZ + 0.1S (po)) significantly increased compared to STZ intraperitoneal administration group (STZ). In addition, about the said 4 groups, the result of having measured the blood glucose level and body weight in D29 is shown in the lower panel of FIG. As can be seen from the results of the lower panel of FIG. 7, in the STZ intraperitoneal administration group, STZ and L-serine intraperitoneal administration group, STZ intraperitoneal administration and L-serine oral administration group (STZ + 0.1S (po)) Compared with the non-administration group, the blood glucose level (BS) was significantly increased, and the body weight was significantly decreased. That is, STZ intraperitoneal administration group, STZ and L-serine intraperitoneal administration group, STZ intraperitoneal administration and L-serine oral administration group (STZ + 0.1S (po)) are shown to develop diabetes. It was. Each group was tested with n = 6.
以上の結果から、Ｌ−セリンは、糖尿病による末梢神経障害に対して、予防・改善効果を有していることがin vivoにおいて実証された。 From the above results, it was demonstrated in vivo that L-serine has a preventive / ameliorating effect on peripheral neuropathy caused by diabetes.
本発明は、末梢神経障害の予防・治療に関する分野や、末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法の分野において特に好適に利用することができる。 The present invention can be particularly suitably used in the field of prevention / treatment of peripheral neuropathy and the field of screening methods for prophylactic / therapeutic agents of peripheral neuropathy.
Claims (4)
（Ａ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程：
（Ｂ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物の後根神経節におけるＬ−セリン濃度を測定する工程：
（Ｃ）工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定値を、被検物質を投与しなかった場合のＬ−セリン濃度の測定値と比較する工程：及び、
（Ｄ）工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のＬ−セリン濃度の測定値と比較して高い場合に、該被検物質を末梢神経障害の予防・治療剤と評価する工程：
を有し、かつ、前記末梢神経障害が、抗癌剤投与による末梢神経障害、又は、糖尿病による末梢神経障害であることを特徴とする、末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法。 A screening method for a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy,
(A) A step of administering a test substance to a peripheral neuropathy model non-human mammal:
(B) Measuring the L-serine concentration in the dorsal root ganglia of a peripheral neuropathy model non-human mammal:
(C) A step of comparing the measured value of the L-serine concentration in step (B) with the measured value of the L-serine concentration when the test substance was not administered: and
(D) When the measured value of the L-serine concentration in the step (B) is higher than the measured value of the L-serine concentration when the test substance is not administered, the test substance is treated with peripheral neuropathy. Process for evaluating as a prophylactic / therapeutic agent:
A method for screening a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy, wherein the peripheral neuropathy is peripheral neuropathy caused by administration of an anticancer agent or peripheral neuropathy caused by diabetes.
（ａ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程：
（ｂ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物の後根神経節における３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（３ＰＧＤＨ）の発現量を測定する工程：
（ｃ）工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量を、被検物質を投与しなかった場合の３ＰＧＤＨの発現量と比較する工程：及び、
（ｄ）工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量が、被検物質を投与しなかった場合の３ＰＧＤＨの発現量と比較して高い場合に、該被検物質を末梢神経障害の予防・治療剤と評価する工程：
を有し、かつ、前記末梢神経障害が、抗癌剤投与による末梢神経障害、又は、糖尿病による末梢神経障害であることを特徴とする、末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法。 A screening method for a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy,
(A) A step of administering a test substance to a peripheral neuropathy model non-human mammal:
(B) Measuring the expression level of 3-phosphoglycerate dehydrogenase (3PGDH) in the dorsal root ganglia of a peripheral neuropathy model non-human mammal:
(C) comparing the expression level of 3PGDH in step (b) with the expression level of 3PGDH when the test substance was not administered: and
(D) When the expression level of 3PGDH in step (b) is higher than the expression level of 3PGDH when the test substance is not administered, the test substance is used as a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy. Process to evaluate:
A method for screening a prophylactic / therapeutic agent for peripheral neuropathy, wherein the peripheral neuropathy is peripheral neuropathy caused by administration of an anticancer agent or peripheral neuropathy caused by diabetes.
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