JP5767591B2 - The method of manufacturing artificial cartilage - Google Patents

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本発明は、生体軟骨の成分を原料とした着色のない弾力性に富んだ人工軟骨を製造する方法に関し、詳しくは、着色が発生せずに、十分な架橋が可能な熱脱水架橋処理の方法に関する。 The present invention relates to a method of manufacturing rich artificial cartilage component of the living cartilage with no elastic colored as a raw material, particularly, without coloration occurs, the method of crosslinking sufficient capable thermal dehydration crosslinking treatment on.

軟骨組織は軟骨細胞と軟骨基質(マトリックス)とからなる。 Cartilage tissue consists of chondrocytes and cartilage matrix (matrix). 軟骨細胞は、高度に分化した細胞であり、軟骨組織中の約10%を占めるに過ぎず、また細胞分裂によって増殖することはほとんどないが、軟骨組織内で軟骨基質成分を産生し、軟骨組織の約90%を占める軟骨基質の維持を担っている。 Cartilage cells are highly differentiated cells, only accounts for about 10% of the cartilage tissue, Although rarely that proliferate by cell division, produce cartilage matrix components in the cartilage tissue, the cartilage tissue It is responsible for the maintenance of cartilage matrix, which accounts for about 90 percent of.

軟骨細胞を用いて人工的に軟骨組織を再現し、軟骨の破壊・変性に対する治療に利用する試みがなされているが、軟骨様組織を形成するためには、軟骨細胞自体に軟骨基質成分を産生させるプロセスが不可欠である。 Reproduced artificially cartilage tissue using chondrocytes, but an attempt to use the treatment for destruction and degeneration of cartilage have been made, in order to form a cartilage-like tissue, producing cartilage matrix components in chondrocytes themselves process to be is essential. しかしながら、現状の技術では、欠損部補填に十分な量の軟骨基質を軟骨細胞に効率よく作らせることは困難であり、未だ解決すべき問題が多く存在している。 However, the state of the art, be made efficiently sufficient amount of cartilage matrix into the defect filling the chondrocyte is difficult, and there are many problems to be solved yet.

軟骨組織を模した組織再生用材料を化学的に調製する研究もなされている。 Studies of chemically prepared tissue regeneration material for cartilage tissue resembling have also been made. 例えば、特開2002-80501号(特許文献1)は、グリコサミノグリカンとポリカチオンを縮合反応により架橋した組織再生マトリックス用グリコサミノグリカン−ポリカチオン複合体を開示しており、軟骨、肝臓、血管、神経等、さまざまな組織の優れた再生材料として有用であると記載している。 For example, JP 2002-80501 (Patent Document 1), glycosaminoglycan and polycation tissue regeneration matrix for glycosaminoglycans cross-linked by a condensation reaction - discloses polycation complex, cartilage, liver , blood vessels, nerves, etc., are described as being useful as an excellent reproduction material of various tissues. しかしながら、特許文献1に記載の複合体は、製造過程で架橋剤及び縮合剤を使用しているため、これらの架橋剤、縮合剤、及びこれらの副生成物を洗浄除去する必要があり、多くの手聞がかかってしまう。 However, the complex described in Patent Document 1, due to the use of cross-linking agent and a condensing agent in the manufacturing process, these crosslinking agents, condensing agent, and it is necessary to wash and remove these by-products, many it takes a long of Te聞. またこれらを体内に移植した場合は、化学物質の残留問題が生じるリスクがある。 In the case of transplanting them into the body, there is a risk that residual problems of chemicals. さらには、架橋剤や縮合剤を用いて作られた上記複合体の構造がナノレベルで、生体組織を模したものにならないため、軟骨の機能として必要な低摩擦性、耐荷重性や生体親和性を満たすことができない恐れがある。 Furthermore, in the structure nano level crafted the complex using a crosslinking agent or condensing agent, for the living tissue does not become imitates the required low friction as a function of cartilage, load bearing and bioaffinity it may not be possible to meet the sex.

国際公開第2007/032404号(特許文献2)は、(a)グリコサミノグリカンとプロテオグリカンとを混合し、グリコサミノグリカンプロテオグリカン凝集体を調製する工程、及び(b)前記グリコサミノグリカンプロテオグリカン凝集体にコラーゲンを混合する工程を含む、自己組織化グリコサミノグリカン/プロテオグリカン/コラーゲン複合体の製造方法を開示しており、このグリコサミノグリカン/プロテオグリカン/コラーゲン複合体は、軟骨再生医療のバイオマテリアルとして極めて適した性質を有するとともに、自己組織化によって製造されるため架橋剤等の化学物質を使用しないで製造することができると記載している。 WO 2007/032404 (Patent Document 2), (a) a mixture of glycosaminoglycan and proteoglycan, preparing a glycosaminoglycan proteoglycan aggregates, and (b) wherein the glycosaminoglycan proteoglycans comprising the step of mixing the collagen aggregates, discloses a process for the preparation of self-assembled glycosaminoglycans / proteoglycans / collagen composite, the glycosaminoglycan / proteoglycan / collagen composite is cartilage regenerative medicine and it has a very suitable properties as biomaterials has been described that can be manufactured without using chemicals such crosslinking agents because they are produced by self-organization. しかしながら、特許文献2に記載の方法によって得られる複合体は、架橋処理を行っていないため、生体内に使用したときの強度低下が大きく、改良が望まれている。 However, the complex obtained by the method described in Patent Document 2, since not performed crosslinking process, greatly reduced strength when used in vivo, improvement is desired.

特開2011-36320号(特許文献3)は、気孔率の低い多孔質ゼラチン層と、気孔率の高い多孔質ゼラチン層とが積層されてなる多層構造のブロック状軟骨用移植材を開示しており、凍結乾燥後の発泡ゼラチン溶液を常圧にて熱架橋する方法を記載している。 JP 2011-36320 (Patent Document 3), discloses a low porous gelatin layer porosity, blocky cartilage for transplant of a multilayer structure in which a high porous gelatin layer porosity are laminated cage, describes a method for thermal crosslinking foaming gelatin solution after lyophilization under normal pressure. しかしながら、特許文献3に記載の熱架橋方法を、引用文献2のグリコサミノグリカン/プロテオグリカン/コラーゲン複合体に適用したところ、前記複合体が着色してしまい、また弾力性が著しく低下してしまった。 However, the method of thermal crosslinking described in Patent Document 3, was applied to glycosaminoglycans / proteoglycans / collagen composite references 2, the complex will be colored, also elasticity got significantly reduced It was.

Haugh et al., “Novel Freeze-Drying Methods to Produce a Range of Collagen-Glycosaminoglycan Scaffolds with Tailored Mean Pore Sizes,” Tissue Engineering: Part C, vol. 16, No. 5, pp. 887-894.(非特許文献1)は、コラーゲン/グリコサミノグリカン足場材の架橋方法として、0.05 bar及び105℃の条件で24時間水熱処理する方法が記載されている。 . Haugh et al, "Novel Freeze-Drying Methods to Produce a Range of Collagen-Glycosaminoglycan Scaffolds with Tailored Mean Pore Sizes," Tissue Engineering:... Part C, vol 16, No. 5, pp 887-894 (non-patent Document 1), as a method of crosslinking collagen / glycosaminoglycan scaffold, it describes a method of heat treating water for 24 hours under the conditions of 0.05 bar and 105 ° C.. しかしながら、非特許文献1に記載の方法を人工軟骨の架橋に適用した場合でも、材料の着色の発生、及び弾力性の低下を完全に防止することができない。 However, even when applying the method described in Non-Patent Document 1 to cross the artificial cartilage, the occurrence of coloring materials, and it is impossible to completely prevent the deterioration of the elasticity.

特開2002-80501号公報 JP 2002-80501 JP 国際公開第2007/032404号パンフレット WO 2007/032404 pamphlet 特開2011-36320号公報 JP 2011-36320 JP

従って、本発明の目的は、グリコサミノグリカン/プロテオグリカン/コラーゲン複合体からなる人工軟骨を、着色させず、使用時に弾性率の低下を招かないように架橋処理する方法を提供することである。 Accordingly, an object of the present invention, an artificial cartilage consisting of glycosaminoglycans / proteoglycans / collagen composite, without coloring, is to provide a method of cross-linking treatment so as not to cause reduction of the elastic modulus at the time of use.

上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者らは、グリコサミノグリカン/プロテオグリカン/コラーゲン複合体からなる人工軟骨を、105〜110℃で16〜23時間熱脱水架橋することにより、人工軟骨の着色が起こらず、かつ使用時に弾性率が低下しないような架橋度で架橋処理することが可能であることを見出し、本発明に想到した。 As a result of intense research in view of the above object, the present inventors have artificial cartilage consisting of glycosaminoglycans / proteoglycans / collagen composite, by 16 to 23 hours heat dehydration cross-linking at devices 105 through 110 ° C., artificial cartilage coloring does not occur, and the elastic modulus found that it is possible to crosslinking treatment with a crosslinking degree that does not decrease at the time of use, and conceived the present invention.

すなわち、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる人工軟骨を製造する本発明の方法は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる成形体を105〜110℃及び0 Pa〜大気圧で16〜23時間熱脱水架橋する工程を有することを特徴とする。 In other words, collagen, the method of the present invention for producing artificial cartilage made of proteoglycans and hyaluronic acid, collagen, a molded body composed of proteoglycans and hyaluronic acid devices 105 through 110 ° C. and 0 Pa to 16 to 23 hours heat dehydration cross-linking at atmospheric pressure It characterized by having a step of.

前記成形体は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる組成物を凍結乾燥して得るのが好ましい。 The molded body is collagen, that a composition comprising proteoglycans and hyaluronic acid obtained by freeze-drying preferred.

前記組成物は、15〜95質量%のコラーゲン、4.9〜70質量%のプロテオグリカン及び0.1〜20質量%のヒアルロン酸を含むのが好ましい。 The composition, 15-95 wt% of collagen, preferably contain hyaluronic acid in 4.9 to 70 wt% of proteoglycans and 0.1 to 20 mass%.

架橋後の人工軟骨にガンマ線照射処理するのが好ましい。 Preferably gamma irradiation treatment artificial cartilage after crosslinking.

[1]人工軟骨 人工軟骨は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなり、15〜95質量%のコラーゲン、4.9〜70質量%のプロテオグリカン及び0.1〜20質量%のヒアルロン酸を含むのが好ましい。 [1] Artificial Cartilage artificial cartilage, collagen consists proteoglycans and hyaluronic acid, 15-95% by weight of collagen, preferably contain hyaluronic acid in 4.9 to 70 wt% of proteoglycans and 0.1 to 20 mass%. コラーゲン線維に、ヒアルロン酸及び/又はプロテオグリカンを添加することにより、柔軟性に優れた人工軟骨を得ることができる。 The collagen fibers, the addition of hyaluronic acid and / or proteoglycan, it is possible to obtain an excellent artificial cartilage flexibility. 人工軟骨中のコラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の量は、それぞれ45〜65質量%、20〜40質量%及び2〜5質量%であるのがより好ましい。 The amount of collagen, proteoglycans and hyaluronic acid in artificial cartilage, respectively 45 to 65 wt%, and more preferably 20 to 40% by weight and 2-5% by weight.

コラーゲン含有量が15質量%未満の場合、生体中に挿入したときの膨張率が増加し、軟骨欠損部へ適合させにくくなり、また膨張により気孔率が低下する傾向となる。 If collagen content is less than 15 wt% increases the expansion ratio when inserted into a living body, hardly adapted to the cartilage defect and porosity tends to decrease due to expansion. コラーゲン含有量が95質量%超の場合、着色が大きくなる。 If collagen content is more than 95 wt%, coloring is increased. プロテオグリカン含有量が4.9質量%未満の場合、弾性率が低下して軟骨としての性能が低下する。 If proteoglycan content is less than 4.9 mass%, the elastic modulus decreases the performance of the cartilage decreases. プロテオグリカン含有量が70質量%超の場合、膨張による大きさの変化が大きくなり、気孔率が低下する傾向となる。 If proteoglycan content greater than 70 wt%, the change in size due to the expansion is increased, the porosity tends to decrease. ヒアルロン酸含有量が0.1質量%未満の場合弾性率が低下して軟骨としての性能が低下するとともに、人工軟骨表面の潤滑性(低摩擦性)が低下する。 With hyaluronate content is less than 0.1 wt% modulus decreases the performance of the cartilage decreases, the lubricity of the artificial cartilage surface (low friction) decreases. ヒアルロン酸含有量が20質量%超の場合、生体軟骨に含まれている割合を大きく超え、生体軟骨とは異なる成分の材料になってしまうため、適用部位によっては、コラーゲンとプロテオグリカンの所望の含有割合を確保することが難しくなる。 When hyaluronic acid content greater than 20 wt%, greatly exceeds the percentage contained in the normal cartilage, since become materials of different components with normal cartilage, the application site, containing the desired collagen and proteoglycans it is difficult to ensure a percentage.

コラーゲンとしては特に限定されず、動物等から抽出したものを使用できる。 Is not particularly limited as collagen, it can be used those extracted from animal or the like. また由来する動物の種、組織部位、年齢等も特に限定されない。 The derived animal species, tissue site, also age and the like are not particularly limited. 一般的には哺乳動物(例えばウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等)や鳥類(例えばニワトリ等)の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンが使用できる。 In general, mammals (e.g. cows, pigs, horses, rabbits, rats, etc.) skin and birds (e.g., chickens, etc.), bone, cartilage, tendon, collagen obtained from an organ or the like can be used. また魚類(例えばタラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ、サメ等)の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を使用してもよい。 The fish (such as cod, flounder, flounder, salmon, trout, tuna, mackerel, Thailand, sardine, shark, etc.) skin, bone, cartilage, fins, scales, may be used collagen-like protein obtained from an organ, such as . なおコラーゲンの抽出方法は特に限定されず、一般的な抽出方法を使用することができる。 Note extraction method of collagen is not particularly limited, a common extraction methods can be used. また動物組織からの抽出ではなく、合成コラーゲンや遺伝子組み替え技術によって得られたコラーゲンを使用してもよい。 Also rather than extracted from animal tissues, it may be used collagen obtained by synthetic collagen or genetic recombination technology.

グリコサミノグリカンとは、アミノ糖とウロン酸又はガラクトースが結合した2糖の繰り返し構造からなる酸性多糖類である。 The glycosaminoglycan, an acidic polysaccharide amino sugar and uronic acid or galactose comprising repeating structure of the disaccharide attached. 本発明において用いられるグリコサミノグリカンとしては、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸いずれでも良いが、ヒアルロン酸を用いるのが好ましい。 The glycosaminoglycan employed in the present invention, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, heparan sulfate, keratan sulfate, heparin, may be any hyaluronic acid, it is preferred to employ a hyaluronic acid.

プロテオグリカンとは、一つの核となるタンパク質に、一本又は多数のグリコサミノグリカン鎖が結合したものである。 The proteoglycans, a protein which is one of the core, in which one or a number of glycosaminoglycan chains are attached. プロテオグリカンとしては特に制限はなく、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、デコリン、ビグリカン、セルグリシン、パールカン、シンデカン、グリピカン、ルミカン、ケラトカン等が挙げられるが、アグリカンを用いるのが好ましい。 There is no particular limitation on the proteoglycan, aggrecan, versican, neurocan, brevican, decorin, biglycan, serglycin, perlecan, syndecan, glypican, lumican, but keratocan and the like, it is preferable to use aggrecan.

プロテオグリカンの由来に特に制限はなく、複合体の使用目的に応じて、ほ乳類(ヒト、ウシ、ブタ等)、鳥類(ニワトリ等)、魚類(サメ、鮭等)、甲殻類(カニ、エビ等)等の各種動物由来の中から適宜選択することができる。 There is no particular restriction on the origin of proteoglycans, depending on the intended use of the complex, mammals (human, bovine, porcine, etc.), birds (chickens, etc.), fishes (shark, salmon, etc.), crustaceans (crabs, shrimp, etc.) it can be appropriately selected from various kinds of animal origin like. 特に本発明の人工軟骨をヒトの軟骨欠損又は変性の治療用として用いるのであれば、ヒトにおける免疫原性の低い由来の中から選択するのが望ましい。 In particular, if the artificial cartilage of the present invention of using for the treatment of cartilage defects or degenerative human, it is desirable to select among from low immunogenicity in humans.

人工軟骨中のコラーゲンは、UV吸収の測定、HPLC等により定量できる。 Collagen in artificial cartilage, measurement of UV absorption can be quantified by HPLC or the like. ヒアルロン酸は、カルバゾール硫酸法、ヒアルロン酸結合性タンパク質を利用した阻害法、HPLC等により定量できる。 Hyaluronic acid, carbazole-sulfuric acid method, the inhibition method using hyaluronic acid binding protein can be quantified by HPLC or the like. プロテオグリカンは、色素DMMBを用いた比色法、HPLC等により定量できる。 Proteoglycans, colorimetric method using a pigment DMMB, can be quantitated by HPLC or the like.

人工軟骨は、機械的強度を高めるとともに、体内に挿入された人工軟骨を長期間に渡って保持し得るようにするため、熱脱水架橋処理が施されている。 Artificial cartilage, to increase the mechanical strength, in order to be held for a long time the inserted artificial cartilage in the body, thermal dehydration crosslinking treatment is applied. また人工軟骨はガンマ線処理等の方法により滅菌処理されているのが好ましい。 Also preferably artificial cartilage is sterilized by a method such as gamma ray treatment.

[2]製造方法 人工軟骨を製造する本発明の方法は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる成形体を105〜110℃及び0 Pa〜大気圧で16〜23時間熱脱水架橋する工程を有する。 [2] The method of the present invention to produce a method for manufacturing artificial cartilage has collagen, a step of a molded article comprising the proteoglycan and hyaluronic acid 16-23 hours heat dehydration cross-linking at devices 105 through 110 ° C. and 0 Pa to atmospheric pressure. コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる成形体は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の混合物を得る工程、及び前記混合物を凍結乾燥する工程からなるのが好ましい。 Collagen, molded article comprising proteoglycans and hyaluronic acid, collagen, to obtain a mixture of proteoglycans and hyaluronic acid, and that comprises the step of freeze-drying the mixture preferred. なお、前記凍結乾燥物を粉砕し水に分散させた後、その分散物を再度凍結乾燥する工程を有しても良い。 Incidentally, it was dispersed in water by grinding the freeze-dried product may have a step of freeze drying the dispersion again.

(a)調液及び混合 コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の混合物を得る工程は、ヒアルロン酸及びコラーゲンからなる第1の組成物を得る工程と、プロテオグリカン及びコラーゲンからなる第2の組成物を得る工程と、前記第1及び第2の組成物を混合する工程とからなるのが好ましい。 (A) liquid preparation and mixing collagen to obtain a mixture of proteoglycans and hyaluronic acid, a step of obtaining a first composition comprising hyaluronic acid and collagen, and obtaining a second composition comprising proteoglycans and collagen , it consists of a step of mixing the first and second composition.

前記第1の組成物を得る工程において、ヒアルロン酸及びコラーゲンの混合比は、10000:1〜1:10000(質量比)であるのが好ましく、5000:1〜1:5000(質量比)であるのがより好ましく、15:1〜1:15(質量比)であるのが最も好ましい。 In the step of obtaining the first composition, the mixing ratio of hyaluronic acid and collagen, 10000: 1 to 1: is preferably from 10000 (mass ratio), 5000: 1 to 1: is 5000 (weight ratio) more preferably, 15: 1 to 1: and most preferably 15 (mass ratio). コラーゲンはあらかじめ希塩酸(5〜50 mM程度の濃度)に0.1〜20質量%の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。 Collagen is preferably used after dissolved in a concentration of pre-dilute hydrochloric acid 0.1 to 20% by mass (concentration of approximately 5 to 50 mM). またヒアルロン酸は、あらかじめ無菌水(注射用水等)に0.1〜20質量%の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。 The hyaluronic acid is preferably used after dissolved in a concentration of 0.1 to 20 mass% in the previously sterile water (water for injection, etc.). ヒアルロン酸及びコラーゲンの水溶液の混合は3〜25℃で行うのが好ましい。 Mixing an aqueous solution of hyaluronic acid and collagen are preferably carried out at 3 to 25 ° C..

前記第2の組成物を得る工程において、プロテオグリカン及びコラーゲンの混合比は、10000:1〜1:10000(質量比)であるのが好ましく、5000:1〜1:5000(質量比)であるのがより好ましく、10:1〜1:10(質量比)であるのが最も好ましい。 In the step of obtaining the second composition, the mixing ratio of proteoglycans and collagen, 10000: in the range of 5000 (mass ratio): 1 to 1: is preferably from 10000 (mass ratio), 5000: 1 to 1 still more preferably, 10: 1 to 1: and most preferably 10 (mass ratio). コラーゲンはあらかじめ希塩酸(5〜50 mM程度の濃度)に0.1〜20質量%の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。 Collagen is preferably used after dissolved in a concentration of pre-dilute hydrochloric acid 0.1 to 20% by mass (concentration of approximately 5 to 50 mM). またプロテオグリカンは、あらかじめ無菌水(注射用水等)に0.1〜20質量%の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。 The proteoglycan is preferably used after dissolved in a concentration of previously sterile water (water for injection, etc.) in 0.1 to 20 mass%. プロテオグリカン及びコラーゲンの水溶液の混合は3〜25℃で行うのが好ましい。 Mixing an aqueous solution of proteoglycans and collagen is preferably carried out in 3 to 25 ° C..

ヒアルロン酸及びコラーゲンの水溶液の混合(第1の組成物)及びプロテオグリカン及びコラーゲンの水溶液の混合(第2の組成物)は、特に高いせん断を必要とするものではないので通常用いられているスターラー、ミキサー等の器具を用いて行うことができる。 Mixing an aqueous solution of hyaluronic acid and collagen (the first composition) and mixing an aqueous solution of proteoglycan and collagen (the second composition), stirrers commonly used because it is not intended to require particularly high shear, device, such as the mixer can be carried out using. 混合は、ヒアルロン酸及びコラーゲン、又はプロテオグリカン及びコラーゲンが均一に混合されるように、3〜25℃で、1秒〜3分程度行う。 Mixing hyaluronic acid and collagen, or as proteoglycans and collagen are uniformly mixed at 3 to 25 ° C., for about 3 minutes 1 second.

第1及び第2の組成物の混合比は、混合後に15〜95質量%のコラーゲン、4.9〜70質量%のプロテオグリカン及び0.1〜20質量%のヒアルロン酸を含む組成となるように行う。 The mixing ratio of the first and second compositions, 15-95% by weight of collagen after mixing, carried out such that the composition comprising hyaluronic acid for from 4.9 to 70 wt% of proteoglycans and 0.1 to 20 mass%. 第1及び第2の組成物の混合は、ホモジナイザー、ディゾルバー等の器具を用いて、せん断力を有する方法により行うのが好ましい。 Mixing the first and second compositions, a homogenizer, by using a tool such as a dissolver, preferably carried out by a method having the shearing force. 例えば、ホモジナイザーを使用する場合、1,000〜12,000 rpmの回転数で、30秒〜3分の攪拌を1〜5回繰り返して行うのが好ましい。 For example, when using a homogenizer at a rotation speed of 1,000~12,000 rpm, preferably carried out by repeating 5 times the stirring for 30 seconds to 3 minutes. 混合時の試料は、3〜25℃程度に保温して行うのが好ましい。 Samples during mixing is preferably carried out by incubating at about 3 to 25 ° C.. 第1及び第2の組成物を別々に用意し、その後、混合することで、合成の進行をより促すことができる。 The first and second compositions were prepared separately and then, by mixing, it is possible to encourage more progress of the synthesis.

なおコラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の混合物は、前述のように第1及び第2の組成物を調製しそれらを混合する方法ではなく、以下に記載するように、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を直接混合して作製しても良い。 Incidentally collagen, mixtures of proteoglycans and hyaluronic acid is not a method of mixing them to prepare a first and second composition as described above, as described below, mixing the collagen, proteoglycan and hyaluronic acid directly it may be prepared by.

コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の混合比は、混合後に15〜95質量%のコラーゲン、4.9〜70質量%のプロテオグリカン及び0.1〜20質量%のヒアルロン酸を含む組成となるように行う。 Collagen, the mixing ratio of proteoglycans and hyaluronic acid, 15-95% by weight of collagen after mixing, carried out such that the composition comprising hyaluronic acid for from 4.9 to 70 wt% of proteoglycans and 0.1 to 20 mass%. コラーゲンはあらかじめ水又は希塩酸(5〜50 mM程度の濃度)に0.1〜20質量%の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。 Collagen is preferably used after dissolved in a concentration of water in advance or dilute hydrochloric acid 0.1 to 20% by mass (concentration of approximately 5 to 50 mM). プロテオグリカンは、あらかじめ無菌水(注射用水等)に0.1〜20質量%の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。 Proteoglycan is preferably used after dissolved in a concentration of previously sterile water (water for injection, etc.) in 0.1 to 20 mass%. ヒアルロン酸は、あらかじめ無菌水(注射用水等)に0.1〜20質量%の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。 Hyaluronic acid is preferably used after dissolved in a concentration of previously sterile water (water for injection, etc.) in 0.1 to 20 mass%.

コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の各溶液は、ホモジナイザー、ディゾルバー等の器具を用いて、せん断力をかけて混合するのが好ましい。 Collagen, the solution of proteoglycans and hyaluronic acid, a homogenizer, by using a tool such as a dissolver, preferably mixed over a shear force. 例えば、ホモジナイザーを使用する場合、1,000〜12,000 rpmの回転数で、30秒〜3分の攪拌を1〜5回繰り返して行うのが好ましい。 For example, when using a homogenizer at a rotation speed of 1,000~12,000 rpm, preferably carried out by repeating 5 times the stirring for 30 seconds to 3 minutes. コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の水溶液の調製及び混合は3〜25℃に保温して行うのが好ましい。 Collagen, preparation and mixing of the aqueous solution of proteoglycans and hyaluronic acid is preferably carried out by incubating the 3 to 25 ° C..

(b)第1の凍結乾燥 得られた混合物は、熱伝導性のよい容器(金属のバット等)に入れ、-80〜-60℃で一晩以上凍結する。 (B) first lyophilized resulting mixture placed in a good thermal conductivity container (metal bat, etc.), frozen over night at -80 to-60 ° C.. 凍結した混合物は、棚温度-50〜-5℃程度(好ましくは-40〜-5℃)で混合物の水分(氷)がほぼなくなるまで10時間〜10日程度真空引きし(第1の乾燥)、真空引きしたまま棚温度を20〜40℃程度(好ましくは25〜40℃)に上げてさらに3〜24時間乾燥(第2の乾燥)する。 Frozen mixture, shelf temperature -50 to-5 ° C. of about (preferably -40 to-5 ° C.) mixture of water (ice) is substantially eliminated until 10 hours to 10 days approximately evacuated by (first drying) vacuuming the left shelf temperature of about 20 to 40 ° C. (preferably 25 to 40 ° C.) for further 3 to 24 hours drying raised (second drying). このように、二段階に温度を変化させて凍結乾燥することにより、結合水までもが除去され、より乾燥されたものとなり、得られる凍結乾燥物は保存性に優れたものとなる。 Thus, by lyophilization by changing the temperature in two stages, even bound water is removed, it is assumed that more drying, freeze-drying product obtained has an excellent storage stability.

得られた凍結乾燥物は後述の架橋及び滅菌を施し、そのまま人工軟骨としても良いが、さらに後述の粉砕、分散及び凍結乾燥を施してもよい。 The freeze-dried product obtained was subjected to cross-linking and sterilization below, but it may be an artificial cartilage, further described below pulverization may be subjected to dispersion and lyophilization. このように粉砕工程を経ることにより、高密度の人工軟骨が得られる。 Through these grinding process, high-density artificial cartilage is obtained.

(c)粉砕 得られた凍結乾燥物はミル等の固体粉砕器で粉砕する。 (C) freeze-dried product obtained ground is ground in a solid pulverizer such mills. 粉砕の方法は特に限定されるものではないが、凍結乾燥物があまり高い温度にならないように行うのが好ましい。 The grinding method is not particularly limited, lyophilisate is preferably carried out so as not to excessively high temperatures.

(d)分散 粉砕した凍結乾燥物は3〜20質量%の濃度となるように生理食塩水と混合し、ホモジナイザー等の器具を用いて、3〜25℃及び1,000〜15,000 rpmの条件で、30秒〜3分間×1〜5回分散する。 (D) freeze-dried product dispersed milled is mixed with physiological saline to a concentration of 3 to 20 wt%, by using an instrument such as a homogenizer, under the conditions of 3 to 25 ° C. and 1,000 to 15,000 rpm, 30 s × dispersed 1-5 times 3 minutes.

(e)ゲル化 得られた分散物は、シャーレ等の容器に入れフタをし、30〜40℃で1〜5時間静置してゲル化させる。 (E) gelling the resulting dispersion, and the lid placed in a container such as a Petri dish, allowed to gel on standing for 1-5 hours at 30 to 40 ° C..

(f)第2の凍結乾燥 ゲル化させた分散物は再度凍結乾燥し成形体とする。 (F) dispersion was second lyophilization gelation lyophilized and moldings again. ゲル化させた分散物を2〜10℃で1〜20時間冷蔵し、さらに-20〜-60℃程度で一晩凍結する。 The dispersion was gelled for 1 to 20 hours refrigerated at 2 to 10 ° C., further freezing overnight at about -20 to-60 ° C.. 凍結する際には、ステンレスバット内に置いた網皿の上に容器をのせて行うのが好ましい。 When freezing is preferably performed by placing the container on a Amisara placed in a stainless steel vat. 凍結した分散物は、前述の第1の凍結乾燥の場合と同様にして乾燥する。 Frozen dispersion is dried in the same manner as in the first freeze-drying described above.

(g)架橋 凍結乾燥後の分散物は、機械的強度を高めるとともに、体内に挿入された人工軟骨を長期間に渡って保持し得るようにするため、熱脱水架橋処理を行いコラーゲン及び/又はプロテオグリカンを架橋する。 (G) the dispersion after crosslinking lyophilization, to increase the mechanical strength, in order to be held for a long time the inserted artificial cartilage in the body, the collagen subjected to thermal dehydration crosslinking treatment and / or crosslinking the proteoglycan. 熱脱水架橋は、凍結乾燥後の分散物を105〜110℃及び0 Pa〜大気圧の真空オーブン中に16〜23時間保持することにより行う。 Thermal dehydration crosslinking is performed by holding 16 to 23 hours in a vacuum oven dispersion of devices 105 through 110 ° C. and 0 Pa to atmospheric pressure after lyophilization. 保持時間は、好ましくは16〜20時間である。 Holding time is preferably 16 to 20 hours.

110℃超の高い温度又は23時間超の長い時間の条件で熱脱水処理を行うと人工軟骨の着色が発生し、105℃未満の低い温度又は16時間未満の短い時間の条件では架橋が不十分であるため、含水により人工軟骨が収縮してしまう。 When subjected to thermal dehydration treatment under conditions of 110 ° C. greater than the high temperature or 23 hours than a long time colored artificial cartilage occurs, insufficient crosslinking in a short time conditions of less than a low temperature or 16 hours of less than 105 ° C. because it is, artificial cartilage may shrink by water. なお人工軟骨の架橋度は、例えば含水後の弾性率が時間の経過によって低下する度合いによって評価することができる。 Note crosslinking degree of the artificial cartilage, for example, it can be evaluated by the degree of elastic modulus after water is reduced over time. 弾性率の低下が少ないものほど架橋度が高いといえる。 It can be said that there is a high degree of cross-linking as those lowering of the elastic modulus is small.

(h)滅菌処理 人工軟骨は紫外線、γ線、電子線、乾燥加熱等により滅菌処理するのが好ましい。 (H) sterilizing the artificial cartilage UV, gamma rays, electron beams, preferably sterilized by dry heating or the like. 特に、25 kGy以下のガンマ線を照射することにより滅菌するのが好ましい。 Particularly preferably sterilized by irradiation with following gamma ray 25 kGy.

本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。 It will be described in more detail by the present invention through examples, but the invention is not limited to them.

実施例1 Example 1
(1)原料溶液の調製 (1) Preparation of raw material solution
5m M塩酸にコラーゲンを溶解し、1質量%コラーゲン溶液を作製した。 It was dissolved collagen 5 m M hydrochloric acid, to prepare a 1 wt% collagen solution. また注射用水にプロテオグリカンを溶解し、1質量%プロテオグリカン溶液を作製し、さらに、注射用水にヒアルロン酸を溶解し、0.2質量%ヒアルロン酸溶液を作製した。 The dissolved proteoglycan in water for injection to prepare a 1 wt% proteoglycan solution, further water for injection to dissolve the hyaluronic acid, was prepared 0.2 wt% hyaluronic acid solution. なおこれらの調製は全て4℃で行った。 Incidentally preparation of these were carried out in all 4 ° C..

(2)原料の混合前記コラーゲン溶液及びプロテオグリカン溶液を、1:1(質量比)で混合し、ミキサーで攪拌し混合液Aを得た。 (2) mixing the collagen solution and proteoglycans solution raw material, they were mixed in a 1: 1 (mass ratio), to obtain a stirred mixture A in a mixer. 同様に、前記コラーゲン溶液及びヒアルロン酸溶液を、2:1(質量比)で混合し、ミキサーで攪拌し混合液Bを得た。 Similarly, the collagen solution and hyaluronic acid solution, 2: 1 mixture (mass ratio), to obtain a stirred mixture B in a mixer. 混合液A及びBを1.5:1(質量比)で混合し、ホモジナイザーで2,OOO rpmの回転数で1分間の攪拌を30秒のインターバルをおいて3回行った。 The mixture A and B 1.5: 1 were mixed with (mass ratio), was carried out three times stirring for 1 minute at intervals of 30 seconds at a rotation speed of 2, OOO rpm by a homogenizer. なお攪拌は試料の温度を5℃に保温して行った。 The stirring was carried out and kept the temperature of the sample to 5 ℃.

(3)第1の凍結乾燥 得られた混合物をバットに流し込み-80℃で6日間凍結した後、棚温度-5℃で8日間真空引きし第1の乾燥を行った。 (3) After the first freeze-drying the resulting mixture was frozen for 6 days at -80 ° C. poured into a vat and was first dried to pull a vacuum for 8 days at a shelf temperature -5 ° C.. この第1の乾燥で、混合物の水分(氷)はほぼなくなった。 In this first drying, the moisture of the mixture (ice) was almost gone. 引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに4時間第2の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。 Continuing the shelf temperature while vacuuming is performed for a further 4 hours secondary drying was raised to 25 ° C., to obtain a freeze-dried product.

(4)粉砕及び分散 得られた凍結乾燥物をミルで粉砕した後、粉砕した凍結乾燥物を1O.7質量%となるように生理食塩水を混合し、ホモジナイザーで10,OOO rpmの条件で、1分間の分散を5回(インターバル:1分)行った。 (4) After pulverizing the pulverized and dispersed resulting lyophilizates a mill, a lyophilizate obtained by grinding a mixture of physiological saline so that 1O.7 mass%, under the conditions of a homogenizer at 10, OOO rpm , the variance of 1 minute 5 times (interval: 1 minute) were carried out. なお、ホモジナイザーによる分散は5℃に保温して行った。 In addition, dispersion by the homogenizer was carried out and kept at 5 ℃.

(5)脱泡 得られた分散物を、自転・公転ミキサー(シンキー社製、あわとり練太郎ARE-250)で1分攪拌し、分散物中に含まれる気泡を取り除いた。 (5) defoaming the resulting dispersion, planetary centrifugal mixer (Thinky Co., Awatori Rentaro AREs-250) was stirred for 1 minute to remove air bubbles contained in the dispersion.

(6)ゲル化 得られた分散物をガラス製のシャーレに入れフタをし、37.5℃で3時間静置してゲル化した後、5℃で3時間冷蔵した。 (6) the gelation resulting dispersion was capped placed in a glass petri dish, after the gel on standing for 3 hours at 37.5 ° C., and refrigerated for 3 hours at 5 ° C..

(6)第2の凍結乾燥 ステンレスパット内に置いた網皿の上に前記冷蔵した材料をシャーレごと置き-60℃で3日間凍結した後、棚温度-40℃で7日間真空引きし第1の乾燥を行った。 (6) After the chilled material over Amisara placed in the second lyophilization stainless inside pad frozen 3 days at -60 ° C. Place each dish, first Shi pulling vacuum for 7 days at a shelf temperature -40 ℃ It was dry. この第1の乾燥で、混合物の水分(氷)はほぼなくなった。 In this first drying, the moisture of the mixture (ice) was almost gone. 引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに4時間第2の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。 Continuing the shelf temperature while vacuuming is performed for a further 4 hours secondary drying was raised to 25 ° C., to obtain a freeze-dried product.

(7)架橋処理 得られた凍結乾燥物を、直径4.2 mm及び厚さ4 mmに成形し、真空オーブンで真空下(0 Pa)で105℃、110℃、115℃、及び表1に示す時間条件で熱脱水架橋処理し人工軟骨を得た。 (7) a cross-linked resulting lyophilisate was formed into a diameter of 4.2 mm and a thickness of 4 mm, 105 ° C. under vacuum (0 Pa) in a vacuum oven, 110 ° C., 115 ° C., and the time shown in Table 1 to obtain a thermal dehydration crosslinking treatment was artificial cartilage conditions.

得られた人工軟骨の着色及び架橋度を下記の通り評価した。 Color and degree of crosslinking of the resulting artificial cartilage was evaluated as follows. 着色は、目視で判断し、着色がないものを○、やや着色したものを△、着色したものを×として評価した。 Colored judges visually colored ○ what is not, what a slightly colored △, was evaluated as × those colored. また架橋度は、得られた人工軟骨の含水直後と4週間後の弾性率を粘弾性測定装置(wave cyber社製、ベスメーター, E-200DT)により測定し、4週間後の弾性率が含水直後の70%以上のものを○、50%以上70%未満のものを△、50%未満のものを×として評価した。 The degree of crosslinking, resulting viscoelasticity measuring apparatus the water immediately after the elastic modulus after 4 weeks of artificial cartilage (wave cyber Co., Beth meter, E-200DT) was measured by elastic modulus after 4 weeks hydrous ○ those of more than 70% immediately after, those less than 50% 70% △, was evaluated as × a of less than 50%. 着色及び架橋度の評価がともに○である場合に、人工軟骨として実用性を有する。 If the evaluation of the color and degree of crosslinking are both ○, it has utility as an artificial cartilage. 結果を表1に示す。 The results are shown in Table 1.

表1から明らかなように、105〜110℃の間で、16時間以上24時間未満で熱脱水架橋処理したときに、着色せずに十分な架橋度を有する人工軟骨が得られた。 As it is evident from Table 1, among the devices 105 through 110 ° C., when thermal dehydration crosslinking treatment in less than 16 hours or more 24 hours, artificial cartilage having a sufficient degree of crosslinking without coloration was obtained.

実施例2 Example 2
実施例1と同様にして得られた凍結乾燥物を、直径4.2 mm及び厚さ4 mmに成形し、真空オーブンで大気圧下で105℃20時間で熱脱水架橋処理して人工軟骨を得た。 The lyophilisate obtained in the same manner as in Example 1 was formed into a diameter of 4.2 mm and a thickness of 4 mm, to obtain an artificial cartilage by thermal dehydration crosslinking treatment at 105 ° C. 20 hours under atmospheric pressure in a vacuum oven . 得られた人工軟骨は、真空下で105℃20時間で熱脱水架橋処理した人工軟骨と同様の着色及び架橋度の評価であった。 The resulting artificial cartilage were evaluated in the same manner as the color and degree of crosslinking and artificial cartilage thermal dehydration crosslinking treatment at 105 ° C. 20 hours under vacuum.

Claims (4)

  1. コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる人工軟骨を製造する方法であって、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる成形体を105〜110℃及び0 Pa〜大気圧で16〜23時間熱脱水架橋する工程を有することを特徴とする人工軟骨の製造方法。 Collagen, a method for producing an artificial cartilage made of proteoglycans and hyaluronic acid, collagen, a molded article comprising proteoglycans and hyaluronic acid devices 105 through 110 ° C. and 0 Pa to a step of 16 to 23 hours heat dehydration cross-linking at atmospheric pressure process for producing an artificial cartilage, comprising.
  2. 請求項1に記載の人工軟骨の製造方法において、前記成形体は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる組成物を凍結乾燥して得ることを特徴とする方法。 The method of manufacturing a prosthetic cartilage according to claim 1, wherein the shaped body is a method which is characterized in that collagen, a composition comprising proteoglycans and hyaluronic acid obtained by freeze-drying.
  3. 請求項2に記載の人工軟骨の製造方法において、前記組成物が、15〜95質量%のコラーゲン、4.9〜70質量%のプロテオグリカン及び0.1〜20質量%のヒアルロン酸を含むことを特徴とする方法。 The method of manufacturing a prosthetic cartilage according to claim 2, wherein said composition is characterized by containing 15-95% by mass of collagen, hyaluronic acid from 4.9 to 70 wt% of proteoglycans and 0.1 to 20 mass% .
  4. 請求項1〜3のいずれかに記載の人工軟骨の製造方法において、架橋後の人工軟骨にガンマ線照射処理することを特徴とする方法。 The method of manufacturing a prosthetic cartilage according to claim 1, wherein the to gamma irradiation treatment artificial cartilage after crosslinking.
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