JP5751563B2 - 周波数領域蛍光測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、周波数領域蛍光測定装置、特に測定対象の蛍光分子の蛍光寿命と回転相関時間の高精度かつ高感度な測定を短時間に行うための周波数領域蛍光測定装置に関する。

時間分解蛍光測定法は、生体分子に結合した蛍光分子や機能性色素分子の計測に有用であり、生体分子の構造変化、生体分子間相互作用、生体分子の動的構造、蛍光分子間の共鳴、そして機能性色素分子の性質についての情報を得るために広く用いられている。蛍光試料を一回励起することで発生する蛍光の強度の時間減衰の時定数が蛍光寿命である。また、蛍光色素に対して直線偏光励起光を照射して偏光面に平行な吸収双極子モーメントを持つ蛍光色素を選択的に一回励起することで発生する蛍光の偏光度の時間減衰の時定数が回転相関時間である。蛍光寿命と回転相関時間とが、時間分解蛍光測定法で得られる主たる測定値である。時間分解蛍光測定法には、周波数領域蛍光法および時間相関単一光子計数法の２つがある。

生体分子に結合させる蛍光分子として、可視光域に吸光帯を持つ蛍光色素であるローダミンやフルオロセインやＣｙ３等が広く用いられ、これらの蛍光色素の蛍光寿命は室温では１００ピコ秒程度〜１０ナノ秒程度であり、これらの蛍光色素の水中での回転相関時間は室温では１００ピコ秒以上であることが一般的である。

一般的な蛍光異方性測定装置は、励起光調整光学系に第１の偏光子を備え、蛍光調整光学系に第２の偏光子を備えたものである。光源からの光を第１の偏光子を通過させることによって発生させた、光の進行方向に対して垂直な面における垂直直線偏光または水平直線偏光を測定対象に照射する。測定対象から発生した蛍光から蛍光調整光学系の第２の偏光子によって抽出された、蛍光の進行方向に対して垂直な面における垂直直線偏光成分または水平直線偏光成分を光検出器に入射させて、これらの蛍光の２つの偏光成分を測定し、蛍光異方性値や蛍光偏光度を算出する。

時間相関単一光子計数法は、１回の励起光パルスを測定対象に照射して、測定対象から発生した蛍光の光子のうち光検出器に最初に検出された光子の到着時間を記録するという測定を繰り返し、蛍光光子の到着時間のヒストグラムを取得する方法である。このヒストグラムの解析によって、測定対象の蛍光寿命を求めることができる。また、励起光調整光学系に第１の偏光子を備え、かつ蛍光調整光学系に第２の偏光子を備えて、時間相関単一光子計数法に基づく蛍光偏光測定を行うことにより、測定対象に含まれる蛍光分子の回転相関時間を算出することができる（例えば、非特許文献１参照）。

周波数領域蛍光法は、所定の変調周波数で強度変調された励起光を測定対象に照射し、測定対象から発生した変調蛍光を光検出器で測定し、変調励起光に対して相対的な変調蛍光の変調位相と変調振幅とを算出する方法である。所定の周波数範囲で周波数掃引しながら測定を行い、蛍光の変調位相の周波数特性と蛍光の変調振幅の周波数特性とを取得して解析することにより、測定対象の蛍光寿命を求めることができる。また、励起光調整光学系に第１の偏光子を備え、かつ蛍光調整光学系に第２の偏光子を備えて蛍光偏光測定をおこなうことにより、測定対象に含まれる蛍光分子の回転相関時間を算出することができる（例えば、非特許文献１参照）。

従来の周波数領域蛍光法の励起光の発生方式には、交流信号発生器と高電圧電源で駆動されたポッケルスセルとによって定常連続光光源からの光を変調させる方式（例えば、非特許文献１参照）、発光ダイオードを交流信号で駆動して変調光を発生させる方式（例えば、非特許文献１参照）、ダイオードレーザーを交流信号で駆動して変調光を発生させる方式（例えば、特許文献１または非特許文献１参照）、そして超短パルスレーザーが発生する繰り返しパルス光を用いる方式がある（例えば、非特許文献２参照）。

従来の周波数領域蛍光法における蛍光検出系の光検出器からの電気信号を処理する方式としては、ヘテロダイン検出または位相検波検出が使われている（例えば、非特許文献１参照）。

また、光導波路型ＬＮ光変調器を駆動する方式としては、交流信号と直流バイアス電圧とを受電したバイアスティーから出力される、交流信号と直流バイアス電圧との重畳信号をＬＮ光変調器に受電させ、終端側に終端器を設置して直流バイアス電圧及び交流信号両方の成分を終端器に受電させる方式（例えば、非特許文献３または非特許文献４参照）、あるいはＬＮ光変調器の入力側に交流信号を受電させるとともに、終端側に直流バイアス電圧を受電させる方式（例えば、非特許文献４参照）などが採用されている。

特開２００６−２２６６９８号公報

J.R. Lakowicz, "Principles of Fluorescence Spectroscopy" 3rd Ed.,Springer, 2004 Gabor laczko, ignacy Grvczynski, Zygmunt Gryczynski, Wieslaw Wiczk,Henryk Malak, and Joseph R. Lakowcz, "A 10GHz frequencydomain fluorometer", Rev.Sci. Instrum., 1990, 61, p.2331-2337 [online]、［２０１３年７月８日検索］、インターネット〈URL:http://www.socnb.com/product/hproduct/ln_appnote03.html〉 [online]、［２０１３年７月８日検索］、インターネット〈http://www.jenoptik-inc.com/literature/doc_download/54-4-modulator-selection-critiera.html〉, Fig.4.1,Fig.4.2, Fig. 4.3

しかしながら、従来の単一光子計数法による時間分解蛍光測定は、光検出器への蛍光光子の到着時間のヒストグラムを得る必要がある。蛍光寿命を高精度で算出するためには、光子の積算数のピーク値は１００００カウント以上が望ましいとされている。また、単一光子を計数するという条件から、１回の励起光パルスに伴う時間掃引あたりの蛍光光子を検出する確率は数％以下が望ましいとされている。以上から、単一光子計数法の測定には、長い時間を要するという課題があった。

また、周波数領域蛍光測定法は、時間相関単一光子計数法に比べて短時間で測定可能であることが期待できるが、周波数領域蛍光測定法における従来の交流信号発生器と高電圧電源で駆動されたポッケルスセルとによって定常連続光光源からの光を変調させる方式、発光ダイオードを交流信号で駆動して変調光を発生させる方式、そしてダイオードレーザーを交流信号で駆動して変調光を発生させる方式では、励起光強度の変調周波数の上限は２００ＭＨｚ以下であった。しかし、よく使われる蛍光色素の蛍光寿命や回転相関時間を高精度で算出するには、２００ＭＨｚ以上の励起光強度の変調周波数が必要であり、これらの方式ではそれらの蛍光色素の蛍光寿命や回転相関時間を高精度で測定するのに十分な高い変調周波数の変調励起光を発生することができないという課題があった。

また、周波数領域蛍光測定法における超短パルスレーザーが発生する繰り返しパルス光を用いる方式は、パルス光の光強度の時間変化をフーリエ変換したときに含まれる高次変調モードを利用するものである。パルスレーザーの繰り返し周波数をｆ_ｒｅｐ（Ｈｚ）、パルス幅をΔｔ（秒）とすると、高次変調モードの変調周波数は、ｎ×ｆ_ｒｅｐ（Ｈｚ）（ｎ＝１，２，…）であり、存在可能な高次変調モードの上限である遮断周波数は、（２×ｌｎ２）／Δｔ（Ｈｚ）であることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。これによって、１ＧＨｚ以上の変調周波数の励起光を得ることができる。しかし、この方式では、変調励起光に含まれる高次変調モードが広い周波数範囲に渡って同時に多数個存在するため、高次変調モードの１個あたりの励起光の変調振幅は小さい。このため、測定を高精度に行うためには、長い測定時間による積算または強い励起光強度が必要となる。しかるに、この方式では、発生する蛍光強度が微弱な蛍光色素や光化学的に不安定で褪色の速い蛍光色素の測定が困難であるという課題があった。

本発明は、このような課題に着目してなされたもので、短時間で高感度かつ高精度に時間分解蛍光測定を行う手段および、発生する蛍光強度が微弱な蛍光色素や光化学的に不安定で褪色しやすい蛍光色素の時間分解蛍光測定を高精度かつ短時間で行う手段として、これまでに実現されていなかったＤＣから数ＧＨｚまでの広い周波数範囲の単一変調周波数の強度変調励起光を発生させることができ、かつ周波数掃引可能な周波数領域蛍光測定装置を提供することを目的とする。

前述した目的を達するために、本発明に係る周波数領域蛍光測定装置は、測定対象の蛍光を測定する装置であって、前記測定対象を蛍光励起可能な波長の連続光を発生する連続光光源と、直流バイアス電圧を発生する直流電源および周期的変動電圧を発生する周期的変動信号源に接続され、前記直流バイアス電圧および前記周期的変動電圧の重畳電気信号を出力する第１のバイアスティーと、電気信号入力端子と電気信号終端端子とを有し、前記連続光を受光しかつ前記重畳電気信号を前記電気信号入力端子に受電する光導波路型ＬＮ光変調器と、前記電気信号終端端子と前記直流電源と終端器とに接続され、前記電気信号終端端子に前記直流バイアス電圧を受電させ、かつ前記電気信号終端端子から出力される電気信号に含まれる交流成分を前記終端器に受電させる第２のバイアスティーと、前記光導波路型ＬＮ光変調器から出力される強度変調光を励起光として前記測定対象に照射することによって発生する蛍光の測定手段とを、具備することを特徴とする。

このような周波数領域蛍光測定装置によれば、重畳電気信号で駆動された光導波路型ＬＮ光変調器に連続光を受光させることによって、重畳電気信号に応答して強度変調された励起光を発生させることができる。このような構成を採ることにより、広い周波数範囲において単一周波数で強度変調された励起光を発生させることが可能となる。

このような周波数領域蛍光測定装置によれば、周期的変動信号源と直流電源に接続された第１のバイアスティーによって合成された周期的変動電圧と直流バイアスとの重畳信号が電気信号入力端子に供給される。電気信号終端端子には直流電源と終端器とを接続した第２のバイアスティーが接続される。このような構成をとることにより、電気信号終端端子から出力される電気信号に含まれる交流成分を第２のバイアスティーで分離して終端器に受電させて終端することができる。さらに、重畳電気信号で光導波路型ＬＮ光変調器を駆動しながら、直流バイアス電圧を電気信号入力端子および電気信号終端端子の間で均衡させることによって、これら２つの端子間の電流発生を抑止することが可能となり、光導波路型ＬＮ光変調器内での熱発生を低減することができる。このような熱発生の低減により、光導波路型ＬＮ光変調器の動作電圧のドリフトの抑制が可能となり、変調振幅の安定な強度変調励起光の発生が容易となる。

また、周期的変動電圧の周波数を所定の範囲で掃引させながら、強度変調励起光に照射された測定対象から発生する変調蛍光を測定することによって、蛍光試料の変調蛍光の周波数特性を取得することも、好適である。変調蛍光の周波数特性を解析することにより、測定対象に含まれる蛍光試料の蛍光寿命を算出することができる。

また、本発明に係る周波数領域蛍光測定装置において、強度変調励起光を第１の偏光子に通過させることによって発生した直線偏光を測定対象に照射し、測定対象から発生した蛍光を第２の偏光子に通過させることによって行う蛍光の偏光成分の測定を、異なる複数の偏光子の角度で行う変調蛍光偏光測定も、好適である。また、光導波路型ＬＮ光変調器から出力される光に含まれるノイズ光を除去するために、強度変調励起光を第３の偏光子に通過させることも、好適である。さらに、周期的変動電圧の周波数を所定の範囲で掃引させながら変調蛍光偏光測定を行うことにより、測定対象の変調蛍光偏光の周波数特性を取得することも、好適である。変調蛍光偏光の周波数特性を解析することにより、測定対象に含まれる蛍光試料の回転相関時間を算出することができる。

本発明によれば、短時間で高感度かつ高精度に時間分解蛍光測定を行う手段および、発生する蛍光強度が微弱な蛍光色素や光化学的に不安定で褪色しやすい蛍光色素の時間分解蛍光測定を高精度かつ短時間で行う手段として、これまでに実現されていなかったＤＣから数ＧＨｚまでの広い周波数範囲の単一変調周波数の強度変調励起光を発生させることができ、かつ周波数掃引可能な周波数領域蛍光測定装置を提供できる。

本発明の第１の実施の形態の周波数領域蛍光測定装置を示すブロック図である。 図１に示す周波数領域蛍光測定装置の、連続光光源の光を光導波路型ＬＮ光変調器へ導入する部分を示すブロック図である。 図１に示す周波数領域蛍光測定装置の、光導波路型ＬＮ光変調器への電気信号の入力と、電気信号終端部の回路とを示すブロック回路図である。 図１に示す周波数領域蛍光測定装置の、蛍光寿命測定を行うための、励起光調整光学系と試料部と蛍光調整光学系とを示すブロック図である。 図１に示す周波数領域蛍光測定装置の、信号処理部を示すブロック図である。 図１に示す周波数領域蛍光測定装置の、励起光強度の時間変化と測定対象から発生した蛍光強度の時間変化とを示すグラフである。 本発明の第２の実施の形態の周波数領域蛍光測定装置の、励起光調整光学系と試料部と蛍光調整光学系とを示すブロック図である。 本発明の第３の実施の形態の周波数領域蛍光測定装置の、励起光調整光学系と試料部と蛍光調整光学系とを示すブロック図である。 本発明の第１の実施の形態の周波数領域蛍光測定装置により、純水中のＣｙ３の蛍光寿命測定を行ったときの、相対変調比および変調位相シフトの周波数特性を示すグラフである。 本発明の第１の実施の形態の周波数領域蛍光測定装置により、純水中のＲｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇの蛍光寿命測定を行ったときの、相対変調比および変調位相シフトの周波数特性を示すグラフである。 本発明の第２の実施の形態の周波数領域蛍光測定装置により、純水中のＲｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇの回転相関時間測定を行ったときの、変調異方性および変調位相シフトの周波数特性を示すグラフである。 本発明の第３の実施の形態の周波数領域蛍光測定装置により、アクチンタンパク質に結合したＲｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇの回転相関時間測定を行ったときの、変調異方性および変調位相シフトの周波数特性を示すグラフである。

以下、本発明の実施の形態を図を参照しながら詳細に説明する。
図１は、本発明の第１の実施の形態の周波数領域蛍光測定装置を示す概略図である。周波数領域蛍光測定装置１は、連続光光源１１と、光導波路型ＬＮ光変調器１２と、第１のバイアスティー１３ａと、第２のバイアスティー１３ｂと、周期的変動信号源１４と、直流電源１５と、終端器１６と、励起光調整光学系１７と、測定対象１８と、蛍光調整光学系１９と、光検出器２０と、信号処理系２１とを備えている。

図２は、連続光光源１１と、光導波路型ＬＮ光変調器１２とを含む部分の概略図である。図１では省略されているが、連続光光源１１の光は、偏光子２２を通って特定の偏光角の成分のみが透過され、１／２波長板２３を通って偏光角が調整され、対物レンズ２４で集光されて、光導波路型ＬＮ光変調器１２の入射側光ファイバー２５に入射される。なお、連続光光源１１としては、測定対象を励起できる波長の光を発生できることが条件で、例えば、キセノンランプまたは発光ダイオードとモノクロメータとから構成される単色連続光光源や、ＣＷレーザーを使うことができる。

図３は、光導波路型ＬＮ光変調器１２と、第１のバイアスティー１３ａと、第２のバイアスティー１３ｂと、周期的変動信号源１４と、直流電源１５と、終端器１６とを含む構成の概略図である。第１のバイアスティー１３ａは、周期的変動信号源１４からの周期的変動電圧と、直流電源１５からの直流バイアス電圧とを受電し、周期的変動電圧と直流バイアス電圧との重畳信号を、光導波路型ＬＮ光変調器１２のホット電極入力側３１へ供給する。第２のバイアスティー１３ｂは、直流バイアス電圧を受電し、光導波路型ＬＮ光変調器１２のホット電極終端側３２へ直流バイアス電圧を供給することで、ホット電極入力側３１およびホット電極終端側３２の両端に印加する直流バイアス電圧を均衡させるとともに、接地電極３３とホット電極３４との間には、重畳信号を印加する。ホット電極終端側３２から出力される信号のうちの交流成分は、バイアスティー１３ｂで分離されて終端器１６へ導かれて終端される。ここで、ホット電極入力側３１の端子が電気信号入力端子に対応し、ホット電極終端側３２の端子が電気信号終端端子に対応している。なお、光導波路型ＬＮ光変調器１２としては、たとえばＭａｃｈ−Ｚｅｈｎｄｅｒ干渉計型の光強度変調器である、ＪＥＮＯＰＴＩＫ社の「ＡＭ５３２」や「ＡＭ６３５」を使用してよい。

図４は、光導波路型ＬＮ光変調器１２と、励起光調整光学系１７と、測定対象１８と、蛍光調整光学系１９と、光検出器２０とを含む部分の概略を示す図である。なお、図１では省略したが、強度変調励起光の平均強度や変調振幅のドリフト補正を行う測定モードであるＳ／Ｒモード測定のレファレンスを計測するための光学系として、ビームサンプラ４１、レンズ４２ａ、光検出器４３を図示しているが、強度変調励起光の平均強度と強度変調のドリフトが少なければ、これらの設置は省略しても良い。

光導波路型ＬＮ光変調器１２の放出側光ファイバー２６から放出された光は、励起光調整光学系１７のレンズ４２ｂを通ってコリメートされ、偏光解消板４４を通って無偏光光になり、測定対象１８に入射する。測定対象１８から発生した蛍光は、蛍光調整光学系１９のレンズ４２ｃでコリメートされ、分光素子４５で所定の波長帯の光が選択的に透過され、レンズ４２ｄで導かれて光検出器２０で受光される。光検出器２０が受光した蛍光は電気信号に変換され、信号処理系２１に入力される。

一方、Ｓ／Ｒモードのレファレンスを計測する系統として、ビームサンプラ４１で反射した光はレンズ４２ａによって導かれ、光検出器４３で受光され、電気信号に変換される。光検出器４３からの電気信号は、信号処理系２１に入力される。なお、分光素子４５としては、蛍光を通過させ励起光波長の通過を阻止するものであり、光学フィルタまたはモノクロメータを使用してもよい。光検出器２０および光検出器４３としては、例えば光電子増倍管やフォトダイオードを使用することができる。また、励起光の変調データを測定するときは、試料部４６にシリカコロイド懸濁液等の散乱物質を設置し、分光素子４５を迂回して測定対象１８からの散乱光を光検出器２０に入射する迂回光路４７を設置してもよい。

図５は、図４における信号処理系２１の概略図である。測定対象１８からの光を受光する光検出器２０からの電気信号は、アンプ５１ａで増幅され、バイアスティー５２ａに導入され、低周波成分と高周波成分とに分割される。低周波成分は少なくとも２チャンネルを有するＡＤ変換器５３によってデジタル変換され、ＰＣ（パーソナルコンピュータ）５５で記録される。バイアスティー５２ａの出力の高周波成分は、高周波信号解析装置５４に導入される。高周波信号解析装置５４は、周期的変動信号源１４からの信号を参照信号として、バイアスティー５２ａの出力の高周波成分の変調振幅と変調位相とを測定する。

図４のビームサンプラ４１によって分割された励起光の部分反射光を受光する光検出器４３から出力される電気信号は、アンプ５１ｂで増幅され、バイアスティー５２ｂに入力され、低周波成分と高周波成分とに分割される。バイアスティー５２ｂの出力の低周波成分は、ＡＤ変換器５３によってデジタル変換され、ＰＣ５５で記録されるが、これはＳ／Ｒモード測定のレファレンスのデータとして用いる。バイアスティー５２ｂの出力の高周波成分は、高周波信号解析装置５４へ導入される。高周波信号解析装置５４は、周期的変動信号源１４からの信号を参照信号として、バイアスティー５２ｂの出力の高周波成分の変調振幅と変調位相とを測定するが、これらのデータはＳ／Ｒモード測定時に用いる。

ＰＣ５５から周期的変動信号源１４へＧＰＩＢ等の通信手段でコマンド送信を行うことによって、交流信号源が発生する交流信号の周波数と振幅とを設定する。ＰＣ５５から高周波信号解析装置５４へＧＰＩＢ等の通信手段でコマンド送信することによって高周波信号解析装置５４の測定周波数を設定し、高周波信号解析装置５４が測定した変調振幅と変調位相のデータをＰＣ５５が受信し記録する。高周波信号解析装置５４としては、たとえばアドバンテスト社製「クロスドメイン・アナライザＵ３８５１」、Ｚｕｒｉｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社の「ロックインアンプＵＨＦＬＩ」、またはＳｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ社の「ロックインアンプＳＲ８４４」などを使ってもよい。

図６は、周波数領域蛍光測定における、励起光強度の時間変化と蛍光強度の時間変化の模式図である。平均強度がＩ_０で振幅がＡ_０の強度変調励起光を測定対象に入射し、平均強度Ｉ_１で振幅がＡ_１の強度変調蛍光が発生したとする。このとき、測定対象を構成する蛍光分子は、励起してから蛍光発光するまでに遅れを生じるために、強度変調励起光と強度変調蛍光との間には変調位相のシフトΔφが生じ、かつ相対変調振幅比ｍ＝（Ａ_１／Ｉ_１）／（Ａ_０／Ｉ_０）は１より小さい値を示す。たとえば、励起光の変調周波数ｆ（Ｈｚ）で測定を行ったとき、測定対象が蛍光寿命τ（秒）の単一成分から構成される場合には、位相シフトΔφと相対変調振幅比ｍの解析解は、以下の式で与えられる。

第１の実施形態において、強度変調励起光の測定は、図４の試料部４６にシリカコロイド懸濁液等の散乱物質を設置し、かつ励起光を照射された散乱物質からの励起光の散乱光を、迂回光路４７を経由して光検出器２０へ導入することで行う。測定試料の蛍光測定は、試料部４６に測定試料を設置して励起光を照射し、測定試料から発生した蛍光を分光素子４５に通過させ、次いで光検出器２０へ導入することで行う。変調励起光と変調蛍光との測定データから、相対変調比と変調位相シフトとを求めることができる。周期的変動信号源１４からの周期的変動信号の周波数ｆを１０^５Ｈｚから１０^９Ｈｚの範囲で掃引して測定を行うことで得られた相対変調比の周波数特性および変調位相シフトの周波数特性に対して、（１）式を最小自乗法でフィッティングすることによって、測定対象が有する１０^−１１秒から１０^−３秒の範囲の蛍光寿命τを求めることができる。

第２の実施形態は、蛍光偏光測定を行うものである。図７に示したように、第１の実施形態の図４における励起光調整光学系１７に偏光子７１ａを加え、かつ蛍光調整光学系１９に偏光子７１ｂを加えるものである。偏光子７１ａの角度を調節することにより、光の進行方向に垂直な面における垂直偏光また水平偏光の励起光を発生させる。また、蛍光調整光学系１９に設置する偏光子７１ｂの角度を調節することによって、光の進行方向に垂直な面における垂直偏光また水平偏光の成分を光検出器２０に導く。測定対象１８に試料を設置し、励起光が垂直偏光の場合の測定対象１８からの蛍光の垂直偏光成分および水平成分、そして励起光が水平偏光の場合の測定対象１８からの蛍光の垂直偏光成分および水平成分を測定する。

励起光を水平偏光としたときに、測定対象１８から発生する蛍光の垂直成分の変調振幅と平均強度、および蛍光の水平成分の変調振幅と平均強度から、蛍光測定装置の垂直偏光と水平偏光とに対する感度の周波数特性を補正するための装置定数のデータを求め、公知の方法で補正することができる。

強度変調励起光を垂直偏光としたときに、測定対象１８から発生する変調蛍光の垂直偏光成分の水平偏光成分を測定し、蛍光の垂直偏光成分の変調振幅と変調位相とをそれぞれＡ_ＶＶとΦ_ＶＶ、蛍光の水平偏光成分の変調振幅と変調位相とをそれぞれＡ_ＶＨとΦ_ＶＨ、垂直偏光成分と水平偏光成分との変調位相の差をΔΦとすると、変調蛍光異方性ｒ_ｆと変調位相差ΔΦは、次の式で与えられる。

蛍光寿命がτ（秒）の単一の蛍光寿命成分をもち、単一の回転相関時間θ（秒）の成分を有する蛍光異方性減衰が、ｒ×ｅｘｐ（−ｔ／θ）＋ｒ_∞で記述できる試料を測定対象として、励起光の変調周波数ｆ（Ｈｚ）で測定を行った場合、位相シフトΔΦおよび変調蛍光異方性ｒ_ｆの解析解は、以下の式で与えられる。

周期的変動信号源１４からの周期的変動電気信号の周波数ｆを１０^５Ｈｚから１０^９Ｈｚの範囲で掃引しながら測定試料の測定を行うことによって得られた変調蛍光の垂直偏光成分の変調振幅Ａ_ＶＶと変調位相Φ_ＶＶ、変調蛍光の水平偏光成分の変調振幅Ａ_ＶＨと変調位相Φ_ＶＨから、変調蛍光異方性ｒ_ｆの周波数特性と変調位相差ΔΦの周波数特性とを、（２）式を用いて算出する。このようにして得られた変調蛍光異方性ｒ_ｆの周波数特性と変調位相差ΔΦの周波数特性に対して、（３）式を最小自乗法でフィッティングすることによって、測定対象が有する１０^−１１秒から１０^−３秒の範囲の回転相関時間θ（秒）を求めることができる。

図８に示すように、第３の実施形態は、図７に示す第２の実施形態において、光導波路型ＬＮ光変調器１２とビームサンプラ４１との間に、偏光子７１ｃを設置したものである。偏光子７１ｃは、光導波路型ＬＮ光変調器１２から出力される光に含まれるノイズ光を除去するために用いられる。

以下に第１の実施例を説明する。ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社のＣｙ３ Ｍｏｎｏ−ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｄｙｅを純水中に２００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で溶解したものを測定試料、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のＬＵＤＯＸを純水中に２％の濃度で分散させたものを散乱物質として用意した。第１の実施形態において、連続光光源１１として５３２ｎｍの半導体レーザー、光導波路型ＬＮ光変調器１２としてＪＥＮＯＰＴＩＫ社のＡＭ５３２、周期的変動信号源１４としてＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＮ５１８１Ａ、図４における波長選択素子として朝日分光社のＣｙ３蛍光観察用フィルタ、図５における光検出器２０として浜松ホトニクス社の光センサモジュールＨ１０７２１−２０ＭＯＤ、アンプ５１ａとして浜松ホトニクス社の広帯域電流アンプＣ１１１８４、高周波信号解析装置５４としてアドバンテスト社のクロスドメイン・アナライザＵ３８５１を用いた。なお、Ｓ／Ｒモード測定のための図４におけるビームサンプラ４１、レンズ４２ａ、光検出器４３からなる参照光学系は省略した。光導波路型ＬＮ光変調器１２を駆動する周期的変動駆動電気信号として、４．９Ｖの直流バイアス電圧に０．６Ｖの振幅の正弦波を重畳した電気信号を用いた。

図９に、２０℃で測定した相対変調比および変調位相シフトの周波数特性を示す。従来のポッケルスセルによる方式、発光ダイオードによる方式、そしてダイオードレーザーによる方式で提供可能な変調周波数は最高２００ＭＨｚまでであったが、本実施例では４００ＭＨｚまでの測定が可能であった。ただし、本実施例で測定可能な変調周波数を制限したのは、図５におけるアンプ５１ａに用いた浜松ホトニクス社のＣ１１１８４の帯域制限であり、本発明にかかる光導波路型ＬＮ光変調器１２を使用した強度変調励起光を発生する光学系の使用可能な帯域は、ＤＣから５ＧＨに及ぶものである。図９では、測定値のデータポイントに対して（１）式を最小自乗フィッティングして得られた理論曲線も掲載した。最小自乗フィッティングによって決定された測定試料Ｃｙ３ Ｍｏｎｏ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｄｙｅの蛍光寿命は２２０ピコ秒であり、文献値とよく合致した。

以下に第２の実施例を説明する。和光純薬工業社製のＲｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇを純水中に２６０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で溶解したものを測定試料、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のＬＵＤＯＸを純水中に２％の濃度で分散させたものを散乱物質として用意した。第１の実施形態において、高周波信号解析装置５４として、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のロックインアンプＳＲ８４４を用いて測定を行った。

図１０に、本実施例で、２０℃で測定した相対変調比および変調位相シフトの周波数特性を示す。図１０は、ロックインアンプＳＲ８４４の測定可能帯域の上限である２００ＭＨｚまで、相対変調比および変調位相シフトを高精度で測定できたことを示している。さらに、図１０では、測定値のデータポイントに対して（１）式を最小自乗フィッティングして得られた理論曲線も掲載した。最小自乗フィッティングによって決定された測定試料Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇの蛍光寿命は３．９２ナノ秒であり、文献値とよく合致した。

以下に第３の実施例を説明する。第２の実施例において、励起光調整光学系１７に偏光子７１ａ、蛍光調整光学系１９に偏光子７１ｂを設置することによって、第２の実施形態を構築した。また、励起光をモニターする蛍光偏光測定を行った。図１１に、本実施例で、２０℃で測定した変調異方性および変調位相シフトの周波数特性を示す。図１１は、ロックインアンプの測定可能帯域の上限である２００ＭＨｚまで、変調異方性および変調位相シフトを高精度で測定できたことを示している。さらに、図１１では、測定値のデータポイントに対して（３）式を最小自乗フィッティングして得られた理論曲線も掲載した。最小自乗フィッティングによって決定された測定試料Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇの回転相関時間は２０８ピコ秒であり、文献値とよく合致した。

以下に第４の実施例を説明する。図７に示す第２の実施形態において、偏光子７１ｃを設置したものを第３の実施形態とした。本実施例では、Ｓ／Ｒモード測定のためのビームサンプラ４１、レンズ４２ａ、光検出器４３からなる参照光学系を使用した。光検出器４３としてＦＥＭＴＯ Ｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ社のフォトレシーバーＨＣＡ−Ｓ−４００−ＳＩを用いた。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇで標識したアクチンタンパク質を２μｍｏｌ／Ｌの濃度でＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ ７．８）緩衝溶液に溶解したものを測定試料、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のＬＵＤＯＸを純水中に２％の濃度で分散させたものを散乱物質として用意した。

図１２に、本実施例で、２０℃で測定した変調異方性および変調位相シフトの周波数特性を示す。図１２は、ロックインアンプの測定可能帯域の上限である２００ＭＨｚまで、変調異方性および変調位相シフトを高精度で測定できたことを示している。さらに、図１２では、測定値のデータポイントに対して非特許文献１から計算される理論曲線も掲載した。図１２に示すように、理論曲線からの散らばりが少ない測定データを得ることができ、良好な最小自乗フィッティングを行うことができた。このフィッティングの結果、アクチンタンパク質に結合したＲｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇの回転相関時間は、４５０ピコ秒および２２．６ナノ秒の２つの成分からなるという解析結果を得ることができた。

本発明は、ＤＣから２００ＭＨｚを超える広範囲の単一変調周波数が使用可能で、高感度かつ短時間で測定可能な周波数領域蛍光測定装置や、ハイスループット性が要求されるマイクロプレートリーダーやマイクロアレイ・バイオチップによる分子間相互作用検出のための蛍光測定系として使用することができ、産業上の利用可能性は極めて高いものである。

１ 周波数領域蛍光測定装置
１１ 連続光光源
１２ 光導波路型ＬＮ光変調器
１３ａ，１３ｂ バイアスティー
１４ 周期的変動信号源
１５ 直流電源
１６ 終端器
１７ 励起光調整光学系
１８ 測定対象
１９ 蛍光調整光学系
２０ 光検出器
２１ 信号処理系
２２ 偏光子
２３ １／２波長板
２４ 対物レンズ
２５ 入力側光ファイバー
２６ 放出側光ファイバー
３１ ホット電極入力側
３２ ホット電極終端側
３３ 接地電極
３４ ホット電極
３５ 光導波路
４１ ビームサンプラ
４２ａ，４２ｂ，４２ｃ，４２ｄ レンズ
４３ 光検出器
４４ 偏光解消板
４５ 分光素子
４６ 試料部
４７ 迂回光路
５１ａ，５１ｂ アンプ
５２ａ，５２ｂ バイアスティー
５３ ＡＤ変換器
５４ 高周波信号解析装置
５５ ＰＣ
７１ａ，７１ｂ，７１ｃ 偏光子

Claims (6)

1. 測定対象の蛍光を測定する装置であって、
   前記測定対象を蛍光励起可能な波長の連続光を発生する連続光光源と、
   直流バイアス電圧を発生する直流電源および周期的変動電圧を発生する周期的変動信号源に接続され、前記直流バイアス電圧および前記周期的変動電圧の重畳電気信号を出力する第１のバイアスティーと、
   電気信号入力端子と電気信号終端端子とを有し、前記連続光を受光しかつ前記重畳電気信号を前記電気信号入力端子に受電する光導波路型ＬＮ光変調器と、
   前記電気信号終端端子と前記直流電源と終端器とに接続され、前記電気信号終端端子に前記直流バイアス電圧を受電させ、かつ前記電気信号終端端子から出力される電気信号に含まれる交流成分を前記終端器に受電させる第２のバイアスティーと、
   前記光導波路型ＬＮ光変調器から出力される強度変調光を励起光として前記測定対象に照射することによって発生する蛍光の測定手段とを、
   具備することを特徴とする周波数領域蛍光測定装置。
2. 前記電気信号入力端子および前記電気信号終端端子に、同じ前記直流バイアス電圧が印加されることを特徴とする請求項１記載の周波数領域蛍光測定装置。
3. 前記周期的変動電圧の周波数を所定の範囲で掃引させながら前記蛍光を測定することによって、前記測定手段が前記測定対象に含まれる蛍光分子の蛍光寿命を算出することを特徴とする請求項１または２記載の周波数領域蛍光測定装置。
4. さらに、前記光導波路型ＬＮ光変調器から出力された前記強度変調光を受光し、前記測定対象に励起光を導く励起光調整光学系に、第１の偏光子を備え、
   前記測定対象から発生した前記蛍光を受光して光検出器へ導く蛍光調整光学系に、第２の偏光子を備えることを
   特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の周波数領域蛍光測定装置。
5. 前記光導波路型ＬＮ光変調器と前記測定手段との間に第３の偏光子を備えることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の周波数領域蛍光測定装置。
6. 前記周期的変動電圧の周波数を所定の範囲で掃引させながら前記蛍光を測定することによって、前記測定手段が測定対象に含まれる蛍光分子の回転相関時間を算出することを特徴とする請求項４または５記載の周波数領域蛍光測定装置。