JP5745229B2 - 疎水性が高められたセリシンおよびその製造方法 - Google Patents
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Description
(1)アミノ酸組成としてバリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニンを20モル%以上含み、
(2)重量平均分子量が1,000〜70,000であり、かつ、
(3)0.1重量%水溶液の表面張力が60mN/m以下である。
また、80重量%エタノールに対する溶解度は2g/100gであることが好ましい。
前記疎水性が高められたセリシン加水分解物は、有機溶剤系または油脂性の組成物に好ましく配合して用いられる。
繭糸から水とアルカリを用いて重量平均分子量1,000〜70,000のセリシン加水分解物を抽出し、
得られたセリシン加水分解物と、
エタノールと水との混合溶媒であって、エタノールの割合が70重量%以上である混合溶媒とを混合し、
前記混合溶媒に可溶な画分のみを回収する
ことを含んでなる、製造方法が提供される。
本発明による疎水性が高められたセリシン(以下、「疎水化セリシン」という場合がある)は、前記したように、アミノ酸組成として疎水性アミノ酸を15モル%以上含み、重量平均分子量が1,000〜70,000であり、かつ、その0.1重量%水溶液の表面張力が60mN/m以下であるという性質を有するものである。
はじめに、繭糸からセリシンを抽出する。
セリシンは、水を用いて繭糸から抽出することができる。例えば、蚕繭や生糸など、繭糸を含んでなる原料を熱水に浸漬して処理することにより、原料中のセリシンを加水分解させて水中に溶出させることができる。このとき、必要に応じて、酸、アルカリまたは酵素を併用してもよい。
さらに、必要に応じて、公知の方法により、水溶液を濃縮してもよいし、乾燥してセリシンを固体化してもよい。
さらに、必要に応じて、公知の方法により、水溶液を濃縮してもよいし、乾燥して疎水化セリシンを固体化してもよい。
(1)セリシンA(分画前、比較例)
家蚕の切り繭200gを水洗した後、蒸留水1kgに浸漬し、炭酸ナトリウム8gを添加した。この条件で繭を1時間煮沸し、セリシンの抽出と加水分解を行った。
次いで、得られた抽出液にクエン酸を添加して中和した。次いで、抽出液を10℃の低温室に15時間静置し、不溶物を沈殿させた。次いで、遠心機H−501FR(株式会社コクサン製)を用いて20℃、6,000rpmの条件にて10分間遠心分離を行い、上清を回収した。次いで、回収した上清を平均孔径0.2μmのセルロース膜を用いて濾過し、膜透過画分約200gを回収した。
回収した膜透過画分を凍結乾燥して、セリシン(セリシンAとする)の粉末52.34gを得た。
前記セリシンAの粉末10gを蒸留水40gに溶解させて、セリシンAの水溶液を調製した。このセリシンAの水溶液にエタノール160gを添加し(エタノールと水との総量に対するエタノールの割合:80重量%、エタノールと水との総量に対するセリシンAの割合:5重量%)、室温で約10分間撹拌した後、−30℃で2時間静置した。
次いで、遠心機H−501FR(株式会社コクサン製)を用いて20℃、6,000rpmの条件にて20分間遠心分離を行い、上清を回収した。次いで、回収した上清を平均孔径0.2μmのセルロース膜を用いて濾過し、膜透過画分約200gを回収した。
次いで、膜透過画分に含まれているエタノールを減圧エバポレーターにより除去し、得られた溶液を凍結乾燥して、80重量%エタノールに可溶なセリシン(セリシンBとする)の粉末1.43gを得た。
前記(2)において、上清を回収して残る沈殿約8.5gを回収した。次いで、回収した沈殿を水100gに溶解させた後、僅かに含まれているエタノールを減圧エバポレーターにより除去し、得られた溶液を凍結乾燥して、80重量%エタノールに不溶なセリシン(セリシンCとする)の粉末6.71gを得た。
セリシンA〜Cについて以下の物性を評価した。
ゲル濾過クロマトグラフィーにより、重量平均分子量を測定した。測定機器としてLC9A(株式会社島津製作所製)を用い、カラムとしてSuperdex 75HR 10/30(ファルマシア社製)を用いた。溶離液には0.2M塩化ナトリウムを含む0.05Mトリス塩酸緩衝液(pH7.0)を用い、流速0.7mL/分、カラム温度25℃、ペプチド検出波長275nmの条件で測定した。分子量マーカーには、Gel Filtraion Calibration Kit LMW(GEヘルスケア社製)とAprotinin(シグマアルドリッチ社製)を併せて使用した。
結果は、表1に示される通りであった。
セリシンを塩酸で加水分解処理した後、高速液体クロマトグラフィーにより、アミノ酸組成を測定した。測定機器としてLC10A(株式会社島津製作所製)を用い、カラムとしてshim−pack Amino−Na(株式会社島津製作所製)を用い、OPA法により検出した。
結果は、表1に示される通りであった。
表中、酸性アミノ酸とはアスパラギン酸、グルタミン酸をさし、塩基性アミノ酸とはヒスチジン、アルギニン、リジンをさし、極性アミノ酸とはセリン、スレオニン、グリシン、チロシン、システインをさし、疎水性アミノ酸とは、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニンをさす。
セリシンBは、セリシンAやセリシンCと比較して、疎水性アミノ酸の割合が高いことが確認された。
逆相クロマトグラフィーによる溶出挙動を解析することにより、疎水性を評価した。逆相クロマトグラフィーによる分離では、疎水性が高い物質ほどカラムに対する親和性が強く、溶出時間が長くなる。
測定機器としてLC10A(株式会社島津製作所製)を用い、カラムとして、MERCK Chromolith Performance HPLC−Saule RP−18e 100−4.6(メルク社製)を用いた。溶離液には20容量%アセトニトリルを用い、流速1mL/分、検出波長275nmの条件で測定した。試験溶液には、溶離液に対し、セリシンを0.1重量%となるように溶解させたものを用いた。
結果は、表1に示される通りであった。
セリシンBは、セリシンAやセリシンCと比較して、疎水性が高いことが確認された。
蒸留水、70重量%エタノール、80重量%エタノール、エタノール、50重量%アセトン、70重量%アセトン、ジメチルスルホキシド、グリセリン、ブチレングリコールに対する溶解性を評価した。
それぞれの溶媒1gに対し、セリシンを10mg添加し、撹拌後、60℃で1時間加温した。次いで、遠心機M150−IV(株式会社佐久間製作所製)を用いて室温、16,000rpmの条件にて5分間遠心分離を行い、不溶物を沈殿させた。沈殿の有無および量を目視にて確認し、下記の基準に従って判定した。
○:沈殿なし
×:少量の沈殿あり
××:多量の沈殿あり
結果は、表1に示される通りであった。
セリシンBは、セリシンAやセリシンCと比較して、高濃度の有機溶剤に対する溶解性が高いことが確認された。
また、セリシンBの70重量%エタノールおよび80重量%エタノールに対する溶解度を同様の方法で求めたところ、70重量%エタノールに対する溶解度は7.5g/100gであり、80重量%エタノールに対する溶解度は4.5g/100gであった。
接触角・表面張力測定装置FTA1000(First ten angstroms社製)を用い、ペンダントドロップ法により、セリシン水溶液の表面張力および接触角を測定した。
表面張力は、20ゲージの針を用いて5μLの液滴を作成し、10秒間静置後画像を撮影し、画像処理にてその表面張力を算出した。接触角は、同様に液滴を作成後、ポリエステルフィルム ルミラーTタイプ(株式会社東レ製)に液滴を接触させて半円の液滴を作成し、10秒間静置後画像を撮影し、画像処理にてその接触角を測定した。試験溶液には、超純水に対し、セリシンを0.1重量%となるよう溶解させたものを用いた。なお、超純水の表面張力は液温20℃にて72.75mN/mであり、接触角は77.7°であった。
結果は、表1に示される通りであった。
セリシンBは、セリシンAやセリシンCと比較して、両親媒性の性質が上昇したことから、表面張力を低下させる作用が高くなり、接触角が小さくなることが確認された。
健常なパネラーに対し以下の試験を行い、皮膚浸透性を評価した。試験溶液には、蒸留水に対し、セリシンAおよびBをそれぞれ0.5重量%となるように溶解させたものを用いた。
前腕内側を石鹸で洗浄した後、室温25℃、湿度40%の環境下で15分間以上馴化させた。次いで、試験溶液10μLを前腕内側に塗布した。1分後にコットンで拭き取り、その直後から、15、30、45、60秒後の角層水分量を、SKICON−200(IBS社製)を用いて測定した。
結果は、図1に示される通りであった。
セリシンBは、セリシンAと比較して拭き取り直後の角層水分量が高く、皮膚浸透性に優れることが確認された。また、拭き取り60秒後の角層水分量がセリシンAと比較して同等、またはそれ以上であることが確認された。つまり、セリシンBは、セリシンが本来持ち合わせている水に対する親和性を失っていないものと考えられる。また、セリシンBがセリシンAと比較して、角層への即時給水力に優れているのは、疎水性が高められた結果、皮膚親和性および皮膚浸透性が高められたことによるものと考えられる。
Claims (6)
- 以下の性質を有する、疎水性が高められたセリシン加水分解物:
(1)アミノ酸組成としてバリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニンを20モル%以上含み、
(2)重量平均分子量が1,000〜70,000であり、かつ、
(3)0.1重量%水溶液の表面張力が60mN/m以下である。 - 70重量%エタノールに対する溶解度が3g/100g以上である、請求項1に記載の疎水性が高められたセリシン加水分解物。
- 80重量%エタノールに対する溶解度が2g/100g以上である、請求項1または2に記載の疎水性が高められたセリシン加水分解物。
- 有機溶剤系または油脂性の組成物に配合して用いられる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の疎水性が高められたセリシン加水分解物。
- 請求項1に記載の疎水性が高められたセリシン加水分解物の製造方法であって、
繭糸から水とアルカリを用いて重量平均分子量1,000〜70,000のセリシン加水分解物を抽出し、
得られたセリシン加水分解物と、
エタノールと水との混合溶媒であって、エタノールの割合が70重量%以上である混合溶媒とを混合し、
前記混合溶媒に可溶な画分のみを回収する
ことを含んでなる、製造方法。 - 混合溶媒におけるエタノールの割合が80〜95重量%である、請求項5に記載の製造方法。
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