JP5744926B2 - 脊髄小脳性運動失調５型に関する遺伝子の同定、及び使用方法 - Google Patents
脊髄小脳性運動失調５型に関する遺伝子の同定、及び使用方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、２００５年２月２２日に出願された米国仮出願番号６０／６５５，１７２号の利益を主張し、その全内容を本出願中に援用する。
本発明の一部は、国立衛生研究所により承認された認可番号第ＮＳ３３９５８号、及び同第ＰＯ１ＮＳ３３７１８号の下、政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
優性脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ）は、歩行、四肢及び目の動きの協調運動失調、不明瞭な発語、並びに嚥下困難により特徴付けられる神経変性障害の混成群である。ＳＣＡ変異として知られる１１個のうち９個は、マイクロサテライト反復拡張である｛非特許文献１：Schols et al.,Lancet Neurol 3, 291-304 (2004)｝。１９９４年に、ＳＣＡ５は、抑制された組み換えを有するセントロメア領域である１１ｑ１３にマップされた｛非特許文献２：Ranum et al.,Nature Genetics 8, 280-284 (1994)｝。ＭＲＩ、及び剖検所見は、小脳皮質萎縮、プルキンエ細胞消失、及び分子層の非薄化を示す｛非特許文献３：Liquori et al.,Spinocerebellar ataxia type 5 (SCA5) in cerebellar Ataxias ed. M. Pandolfo, Cambridge University Press pp445-450. in The cerebellum and its Disorders (eds. Manto, M. U. & Pandolfo, M.) 445-450 (Cambridge University Press, Cambridge, 2002)｝。フランス及びドイツ出身のさらなるＳＣＡ５ファミリーは、似たような臨床所見、神経放射線所見を報告された｛非特許文献４：Stevanin et al., Neurology 53, 1355-1357 (1999)、及び非特許文献５：Burk et al., Neurology 62, 327-329 (2004)｝。
運動失調遺伝子を同定する重要性は、当該疾患を有する個人の診断のための改良方法を提供し、運動失調のよりよい分類のための出生前診断／発症前診断の可能性を考慮に入れる。
Schols et al.,Lancet Neurol 3, 291-304 (2004)
Ranum et al.,Nature Genetics 8, 280-284 (1994)
Liquori et al.,Spinocerebellar ataxia type 5 (SCA5) in cerebellar Ataxias ed. M. Pandolfo, Cambridge University Press pp445-450. in The cerebellum and its Disorders (eds. Manto, M. U. & Pandolfo, M.) 445-450 (Cambridge University Press, Cambridge, 2002)
Stevanin et al., Neurology 53, 1355-1357 (1999)
Burk et al., Neurology 62, 327-329 (2004)
本発明は、（ＳＰＴＢＮ２遺伝子によりコードされる）タンパク質β−ＩＩＩスペクトリンと、脊髄小脳性運動失調５型疾患（ＳＣＡ５）との間の新たに発見された相関関係に関する。β−ＩＩＩスペクトリン変異は、リンカ−ン大統領の祖父の子孫である１１世代に及ぶアメリカ人親族、及び２つのさらなる家系において、ＳＣＡ５を引き起こすことが発見されている。β−ＩＩＩスペクトリンは、プルキンエ細胞中に高発現され、グルタミン酸輸送体であるＥＡＡＴ４を細胞膜表面で安定化することが示される。ＥＡＡＴ４とＧｌｕＲδ２との劇的な違いは、ＳＣＡ５病理解剖組織におけるウエスタン、及び細胞画分法により見出された。細胞培養試験は、野生型β−ＩＩＩスペクトリンは、ＥＡＡＴ４を細胞膜で安定化するが、変異型β−ＩＩＩスペクトリンはしないことを示した。スペクトリンの変異は、グルタミン酸シグナル伝達に関与する膜タンパク質に影響を与える、運動失調及び神経変性疾患の新たな原因である。
ある態様において、本発明は、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドを分析し、そして当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドが変異を含むかどうかを決定することを含む方法を提供する。当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、被験者から入手され得、ここで、ＳＣＡ５を有する危険にさらされている被験者は、ＳＣＡ５ポリヌクレオチド中に変異を有し、又はＳＣＡ５を有する危険にさらされていない被験者はＳＣＡ５中に変異を有さない。当該被験者は、少なくとも１つの運動失調の症状を示すかもしれないし又は示さないかもしれない。当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、ゲノムのＳＣＡ５ポリヌクレオチドか又はプロセスされたＳＣＡ５ポリヌクレオチドとなり得る。当該分析は、当該ＳＣＡポリヌクレオチドの増幅、第２ポリヌクレオチドとの当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのハイブリダイゼ−ション、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドの一部のシ−クエンシング、又はそれらの組み合わせを含み得る。当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドは変異を含み得、そして当該変異はエキソン中に存在し得る。エキソン中の変異は、配列番号２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＳＣＡ５ポリペプチドをもたらし得る。当該変異の型は、例えば、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン７に相当するヌクレオチドにおける変異、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン１２に相当するヌクレオチドにおける変異、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン１４に相当するヌクレオチドにおける変異、又はそれらの組み合わせとなり得る。
本発明は、脊髄小脳性運動失調５型を発現する危険にさらされていない被験者を識別するための方法も提供する。当該方法は、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのヌクレオチドを分析し、そして当該ポリヌクレオチドが変異を含むかどうか決定することを含み、ここで、ＳＣＡ５を有する危険にさらされていない被験者はＳＣＡ５ポリヌクレオチドにおける変異を有さない。
当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、ゲノムのＳＣＡ５ポリヌクレオチド又はプロセスされたＳＣＡ５ポリヌクレオチドとなり得る。当該分析は当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドの増幅、第２ポリヌクレオチドとの当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのハイブリダイゼ−ション、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドの一部のシ−クエンシング、又はそれらの組み合わせを含む。当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドは変異を含み得、そして当該変異はエキソン中に存在し得る。エキソン中の変異は、配列番号２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＳＣＡ５ポリペプチドをもたらし得る。当該変異の型は、例えば、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン７に相当するヌクレオチドにおける変異、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン１２に相当するヌクレオチドにおける変異、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン１４に相当するヌクレオチドにおける変異、又はそれらの組み合わせとなり得る。
本発明は、脊髄小脳性運動失調５型を発現する危険にさらされている被験者を識別するための方法をさらに提供する。当該方法は、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのヌクレオチドを分析し、そして当該ポリヌクレオチドが変異を含むかどうか決定することを含み、ここで、ＳＣＡ５を有する危険にさらされている被験者はＳＣＡ５ポリヌクレオチドにおける変異を有する。
当該被験者は、少なくとも１つの運動失調の症状を示すかもしれないし、示さないかもしれない。当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、ゲノムのＳＣＡ５ポリヌクレオチド又はプロセスされたＳＣＡ５ポリヌクレオチドとなり得る。当該分析は当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドの増幅、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼ−ション、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドの一部のシ−クエンシング、又はそれらの組み合わせを含む。当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドは変異を含み得、そして当該変異はエキソン中に存在し得る。エキソン中の変異は、配列番号２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＳＣＡ５ポリペプチドをもたらす。当該変異の型は、例えば、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン７に相当するヌクレオチドにおける変異、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン１２に相当するヌクレオチドにおける変異、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン１４に相当するヌクレオチドにおける変異、又はそれらの組み合わせとなり得る。
本発明は、被験者が脊髄小脳性運動失調５型（ＳＣＡ５）を有するかどうかを決定するための方法を提供する。当該方法は、変異についてＳＣＡ５ポリヌクレオチドを分析し、そして当該被験者がＳＣＡ５の症状を示すかどうか測定することを含み、ここで、ＳＣＡ５ポリヌクレオチド中に変異を有すること、及びＳＣＡ５の症状を示すことは、当該被験者がＳＣＡ５を有することを示す。
当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、ゲノムのＳＣＡ５ポリヌクレオチド又はプロセスされたＳＣＡ５ポリヌクレオチドとなり得る。当該分析は当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドの増幅、第２ポリヌクレオチドと当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのハイブリダイゼ−ション、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドの一部のシ−クエンシング、又はそれらの組み合わせを含む。当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドは変異を含み得、そして当該変異はエキソン中に存在し得る。エキソン中の変異は、配列番号２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＳＣＡ５ポリペプチドをもたらす。当該変異の型は、例えば、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン７に相当するヌクレオチドにおける変異、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン１２に相当するヌクレオチドにおける変異、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン１４に相当するヌクレオチドにおける変異、又はそれらの組み合わせとなり得る。
本発明において、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドの一部を増幅するだろうプライマ−対を含む、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドを検出するためのキットも含まれる。本発明は、配列番号１の変異体又はその一部を含む、単離ポリヌクレオチドも提供する。当該ポリヌクレオチド中に存在する変異は、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン７に相当するヌクレオチド中の変異、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン１２に相当するヌクレオチド中の変異、当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのエキソン１４に相当するヌクレオチド中の変異、又はそれらの組み合わせとなり得る。当該単離ポリヌクレオチドは、１５〜５００ヌクレオチドとなり得る。本発明の単離ポリヌクレオチドを含むベクター、及び当該ベクターを含む細胞もまた本発明に含まれる。
用語「含む」、及びそれらの変化形は、これらの用語が明細書及び請求項中に見られるところを限定する意味を有さない。特段の定めがなければ、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ」は、相互交換的に使用され、１又は１超（複数）を意味する。
構成
本発明は、ＳＣＡ５関連ポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、並びにかかるポリヌクレオチド、及びポリペプチドを同定する方法を含む。
本発明は、ＳＣＡ５関連ポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、並びにかかるポリヌクレオチド、及びポリペプチドを同定する方法を含む。
本明細書中において使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかのいかなる長さのヌクレオチドの多量体型をいう。ポリヌクレオチドは、異なる機能を有するヌクレオチド配列を含み得、当該配列は、例えば、エキソンの如きコード配列、及びイントロンの如き非コード配列、調節配列などである。ポリヌクレオチドは、天然起源から直接的に入手され得、又は組み換え技術、酵素技術又は化学技術で製造され得る。ポリペプチドは、トポロジーにおいて直線状又は環状となり得、及び例えば、発現ベクター又はクローニングベクターの如きベクターの一部、あるいはその断片となり得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖となり得、第二相補鎖の配列は、第一鎖の配列により決定される。それ故、当該用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖核酸ポリマー、その相補体、及びそれらにより形成される二本鎖を包含するように、広範に解釈される。
ポリヌクレオチドの「相補性」は、互いに塩基対となる２つの一本鎖ポリヌクレオチドの能力をいい、１つのポリヌクレオチドのアデニンは、他方のポリヌクレオチドのチミジン（ＲＮＡの場合にはウラシル）と塩基対になるだろうし、１つのポリヌクレオチドのシチジンは、他方のポリヌクレオチドのグアニンと塩基対になるだろう。２つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列が第２ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列と塩基対になり得るとき、互いに相補的である。例えば、５’−ＡＴＧＣと５’−ＧＣＡＴは完全に相補的であり、５’−ＧＣＴＡと５’−ＴＡＧＣも同様である。
本明細書中に使用されるような用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合により互いに結合した複数のアミノ酸のポリマーを広範にはいう。当該用語「ポリペプチド」は、ジスルフィド結合により連結される複数のポリペプチドを含む分子、あるいはマルチマー（例えば、ダイマー、テトラマー）のように、共有的又は非共有的に共に結合されるポリペプチドの複合体も含む。それ故、当該用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、及び「タンパク質」は、ポリペプチドの定義に全て含まれ、そしてこれらの用語は、相互交換的に使用される。これらの用語は、特定の長さのアミノ酸ポリマーを暗示するわけではなく、当該ポリペプチドが組み換え技術、化学又は酵素的合成を使用して製造されたかどうか、あるいは天然に生じたのかどうかを暗示又は識別することを意図するものでもないことを理解すべきである。
ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離され得る。用語「単離」ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、自然環境から抽出されたポリペプチド又はポリヌクレオチドを意味する。ポリペプチド又はポリヌクレオチドは精製され得、すなわち、いかなる他のポリペプチド又はポリヌクレオチド、及び関連細胞生産物又は他の不純物も本質的に存在しなくなり得る。「精製された」ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、天然に関連する他成分が少なくとも６０％存在しない、好ましくは７５％存在しない、及び最も好ましくは９０％存在しないものである。例えば、化学的又は組み換え手段を通じた、天然に生ずる生体外部で製造されたポリペプチド、及びヌクレオチドは、定義により単離及び精製されたと考えられる、というのは、それらは決して自然環境には存在しないからである。
本発明のポリヌクレオチドは、ＳＣＡ５ポリヌクレオチド及びＳＰＴＢＮ２ポリヌクレオチドとして相互交換的に本明細書中において言及され、マイクロサテライトマーカーのＫＡＤＳＣＡ５−１８４とＤ１１Ｓ９７０の間のヒト１１番染色体の長腕（１１ｑ１３）に由来するポリヌクレオチドである。ＳＣＡ５ポリペプチドは、ゲノムポリヌクレオチド又はプロセスポリヌクレオチドとなり得る。ゲノムのＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、非プロセスｐｒｅＲＮＡ（すなわち、エキソンとイントロンの両方を含むＲＮＡ分子）、及びｐｒｅＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ゲノムのＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを製造する。当該ゲノムのＳＣＡ５ポリヌクレオチドの境界は、通常、その５’末端での転写開始部位、及びその３’末端の転写ターミネーターにより決定される。ゲノムのＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、通常、イントロンとエキソンを含む。調節配列は、実施可能に連結されるゲノム配列の発現を調節するポリヌクレオチドである。調節配列の非制限的な例は、プロモーターを含む。用語「実施可能に連結」とは、近位をいい、記載された構成成分が所望のやり方で機能できる関係にある。調節配列は、ゲノム配列の発現が当該調節配列と適合性のある条件下で達成されるように連結するとき、ゲノム配列に「実施可能に連結」する。
ゲノムＳＣＡ５ポリヌクレオチドの例を、図６（配列番号１）に示す。他の例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００６９４６、及びＡＢ００８５６７で開示される。ゲノムＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、通常、３７個のエキソンを含み、２，３９０アミノ酸のポリペプチドをコードする｛Ｓｔａｎｋｅｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４１５８−１４１６３（１９９８）｝、例えば、配列番号２である。このポリペプチドは、しばしば本分野において、βＩＩＩスペクトリンとして言及される。プロセスされたＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、ゲノムのＳＣＡ５ポリヌクレオチドの転写に由来するｍＲＮＡであり、その後イントロンに相当するヌクレオチドを除去される。プロセスされたＳＣＡ５ポリヌクレオチドの例は、イントロンに相当するヌクレオチドのない配列番号１である。プロセスされたＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡの如き、ｍＲＮＡ由来のＤＮＡポリヌクレオチドも含む。さらに、本発明のＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、当該ゲノムの又はプロセスされたＳＣＡ５ポリヌクレオチドの相補体も含む。
本発明のＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、１又は複数の変異を含む。配列番号１として記載される当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、正常な変異していないゲノムＳＣＡ５ポリヌクレオチドの例であり、本明細書中において、野生型ゲノムＳＣＡ５ポリヌクレオチドとしても言及される。同様に、野生型でプロセスされたＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、イントロンに相当する配列のない配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する。いくつかの一塩基変異多型（ＳＮＰ）は、正常なＳＣＡ５ポリヌクレオチド中に同定される。これらのＳＮＰの位置を図６に示す。当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチド中のＳＮＰの存在は、変異とは考えない。当業者は、さらなるＳＮＰが、継続的に、及び増加的に、ヒトゲノムの最近のシ−クエンシングに関して発見されそうであることを理解するだろう。配列番号１と比較されるとき、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列中のいかなる変化も変異と考える。
変異は、５’上流領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、エキソン、イントロン、３’ＵＴＲ又は３’下流領域に相当するヌクレオチド中に存在する。変異は、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドにより、例えばゲノムＳＣＡ５ポリヌクレオチドの転写を変化させること又は（例えば、不安定化する）ｍＲＮＡの翻訳を変化させることにより、産生されるポリペプチドの量に影響を与え得る。変異は、ＳＣＡ５ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させ得る。変異の例は、例えば、欠失、挿入、重複、及び点変異を含む。変異は、例えば、フレームシフト、アミノ酸置換、アミン酸の挿入又は欠失、及び／又はストップコドンの存在を介する翻訳の未成熟終了をもたらす。
ある態様において、ＳＣＡ５ポリヌクレオチド中の変異はエキソン中にあり、配列番号２に記載されるアミノ酸配列と比較したとき異なるアミノ酸配列をもたらす。よく知られるように、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対する多くの変異は、サイレント変異をもたらし得る、すなわち、当該ヌクレオチド変異は、アミノ酸配列上に影響を与えない。コドンに存在する第３番目の塩基の縮重に起因して、当該コドンの第３番目の塩基はしばしば重要ではなく、コドンの３番目のヌクレオチドは、しばしば異なるアミノ酸をもたらさない。例えば、コドンＡＡＡとコドンＡＡＧは両方ともアミノ酸リジンをコードする。ＳＣＡ５ポリヌクレオチドにおける変異は、変化された活性を有するＳＣＡ５ポリペプチドをもたらし得る。変化された活性は、プルキンエ細胞の細胞膜でのＥＡＡＴ４の低減された安定性を含む。
変異は、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドの本質的にいかなる位置にも存在し得、好ましくはエキソンに相当する位置に存在することが見込まれる。例えば、変異は、アクチン結合ドメイン、又は第３スペクトリン反復ドメインを非制限的に含むスペクトリン反復ドメインの内の１つの如き、ＳＣＡ５ポリペプチドのアミノ末端領域をコードする領域内に存在し得る。限定する意図はないが、いくつかの変異がＳＣＡ５ポリヌクレオチド中に検出されている。例えば、変異は、７６５４−７７６９全ヌクレオチドを含む、エキソン７に相当する配列中に検出され、特に、７７５５ヌクレオチドでＴをＣに（非コード鎖においてＡをＧにする）する。変異は、１３５８２−１３８８４全ヌクレオチドを含む、エキソン１２に相当する配列中に検出され、特に、１３，８２３−１３，８６１又は１３，８２７−１３，８６５ヌクレオチドの欠失である。変異は、１５９３２−１６８０２全ヌクレオチドを含む、エキソン１４に相当する配列中に検出され、特に、１６０１０−１６０２４ヌクレオチドの欠失である。
本発明は、ゲノムの又はプロセスされたＳＣＡ５ポリヌクレオチドの一部に相当する、より短いポリヌクレオチドも含む。ある態様において、当該より短いポリヌクレオチドは、プライマー、及びプローブとして本明細書中に言及される。本発明のこの態様のポリヌクレオチドは、ゲノムのＳＣＡ５ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列又はそれらの相補体を含む。
ある態様において、本発明のこの態様のポリヌクレオチドは、配列番号１の１−１５９、１６０−３１６、３１７−５４１８、５４１９−５５７０、５５７１−６００４、６００５−６１７８、６１７９−６９９２、６９９３−７０８４、７０８５−７２２８、７２２９−７３０９、７３１０−７６５３、７６５４−７７６９、７７７０−１０３７０、１０３７１−１０４８３、１０４８４−１０６３０、１０６３１−１０８１８、１０８１９−１２３８０、１２３８１−１２４９８、１２４９９−１３１００、１３１０１−１３２５９、１３２６０−１３５８１、１３５８２−１３８８４、１３８８５−１５５６２、１５５６３−１５７１６、１５７１７−１５９３１、１５９３２−１６８０２、１６８０３−１９６７８、１９６７９−１９８１６、１９８１７−２０１１７、２０１１８−２０８７４、２０８７５−２１７９１、２１７９２−２１９９４、２１９９５−２２３１７、２２３１８−２２４０８、２２４０９−２２６１４、２２６１５−２２７６１、２２７６２−２４８５９、２４８６０−２５１２３、２５１２４−２７０３６、２７０３７−２７２６１、２７２６２−２７５３８、２７５３９−２７６２８、２７６２９−２７９５３、２７９５４−２８２１４、２８２１５−２８３９９、２８３００−２８４３０、２８４３１−２８６５９、２８６６０−２８８６４、２８８６５−２９７４１、２９７４２−３０１１６、３０１１７−３１１１５、３１１１６−３１３６０、３１３６１−３１４５５、３１４５６−３１５９４、３１５９５−３２２１８、３２２１９−３２３０３、３２３０４−３２５４９、３２５５０−３２７４６、３２７４７−３３０８７、３３０８８−３３２３０、３３２３１−３３３１９、３３３２０−３３３９５、３３３９６−３３４８０、３３４８１−３３５３１、３３５３２−３３７５１、３３７５２−３３９７２、３３９７３−３４２３１、３４２３２−３４４０５、３４４０６−３４９５８、３４９５９−３５００１、３５００２−３５２９４、３５２９５−３５５２５、３５５２６−３６１４７ヌクレオチドから選択された連続ヌクレオチド、又はそれらの相補体を含む。これらのポリヌクレオチドの一部も含まれ、ここで当該部分は、少なくとも１００連続ヌクレオチド、少なくとも２００連続ヌクレオチド、少なくとも３００連続ヌクレオチド、少なくとも４００連続ヌクレオチド、又は少なくとも５００連続ヌクレオチドである。本発明のこの態様の他のポリヌクレオチドは、表１で示されるポリヌクレオチド（配列番号３〜７７）、又はそれらの相補体を含む。
ある態様において、本発明のこの態様のポリヌクレオチドは変異を含む。例えば、ポリヌクレオチドは、１３７７３−１３８２２及び１３８６７− １３９１７ヌクレオチド（すなわち、本明細書中に詳細に記載されるアメリカ系変異の内の１つを反映する）を含み、１３７７７−１３８２６及び１３８６７−１３９２０ヌクレオチド（すなわち, 本明細書中に詳細に記載されるアメリカ系変異の内の１つを反映する）を含み、１５８７９−１５９２９及び１６８０３−１６８５３ヌクレオチド（すなわち, 本明細書中に詳細に記載されるアメリカ系変異の内の１つを反映する）を含む、又はそれらの相補体を含む。典型的に、本発明のこの態様のポリヌクレオチドは、当該プライマーがハイブリダイズする標的配列と、少なくとも約９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、最も好ましくは約１００％の配列同一性を有する。
プライマー対も本発明に含まれる。本明細書中に使用される用語「プライマー対」は、増幅させるために、ポリペプチドの領域の側面に位置するように設計された２つのオリゴヌクレオチドを意味する。当該増幅されるポリペプチドは、鋳型ポリヌクレオチドとして言及され得る。ある態様において、当該鋳型ポリヌクレオチドは、ゲノムのＳＣＡ５ポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドを増幅する方法を本明細書内において議論する。１つのプライマーは、鋳型ポリヌクレオチドの一方の端の一本鎖に存在するヌクレオチドと相補的であり、そしてもう１つのプライマーは、当該鋳型ポリヌクレオチドの他の末端の他の鎖に存在するヌクレオチドと相補的である。
例えば、ある態様において、当該プライマー対のプライマーは、１又は複数のエキソンに相当するヌクレオチド、又はエキソンの一部に相当するヌクレオチドを増幅するために使用され得る。当該鋳型ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから入手されるとき、当該プライマー対のプライマーの一方又は両方は、イントロンに相当するヌクレオチドと相補的となり得る。プライマー対の例は、表１に開示され、当業者は、他のプライマー対が、配列番号１の配列、及び決まりきったやり方を使用して容易に作り得ることを認識するだろう。
本発明のこの態様のポリヌクレオチドは、好ましい増大順に、少なくとも１５連続ヌクレオチド、少なくとも１８連続ヌクレオチド、少なくとも２０連続ヌクレオチド、少なくとも２４連続ヌクレオチド、又は少なくとも２７連続ヌクレオチドを含む。典型的には、本発明のこの態様のポリヌクレオチドは、当該プライマーがハイブリダイズする標的配列と、少なくとも約９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、最も好ましくは約１００％の配列同一性を有する。
本発明のポリヌクレオチドは、ベクターに挿入され得る。ベクターは、プラスミド、ファージ又はコスミドの如き複製ポリヌクレオチドであり、もう１つのポリヌクレオチドは、接合されたポリヌクレオチドの複製を引き起こすために接合され得る。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターの構築は、本分野において知られる標準的ライゲーション技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと。
ベクターは、さらなるクローニング（当該ポリペプチドの増幅）すなわちクローニングベクター、あるいはコーディング領域によりコードされるポリペプチドの発現、すなわち発現ベクターを提供する。当該用語「ベクター」は、非制限的に、プラスミドベクター、ウイルス性ベクター、コスミドベクター、又は人工染色体ベクターを含む。典型的に、ベクターは、大腸菌の如きバクテリア性宿主の中で複製できる。好ましくは、当該ベクターはプラスミドである。ベクターの選択は、選択マーカー、ベクター複製速度などの如きコンストラクトをもたらす際の様々な所望の特徴に依存する。本明細書中に記載されるベクターをクローニング又は発現するための好適な宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞である。当該ベクターは、全ＳＣＡ５ポリヌクレオチド、あるいはエキソン、イントロンに相当するヌクレオチドの領域の如きそれらの一部、あるいはそれらの組み合わせを含み得る。本発明は、ベクターに挿入される本発明のポリヌクレオチドを含む細胞、及びベクターに挿入される本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む細胞も含む。
本発明は、１又は複数の変異を含むＳＣＡ５ポリペプチドも含む。配列番号２に記載される当該ＳＣＡ５ポリペプチドは、正常な変異のないゲノムＳＣＡ５ポリペプチドの例であり、本明細書中において、野生型ＳＣＡ５ポリペプチドとしても言及される。いくつかの一塩基変異多型（ＳＮＰ）は、正常なＳＣＡ５ポリペプチド中に同定される。これらのＳＮＰの位置を図６に示す。ＳＣＡ５ポリペプチド中のＳＮＰに起因する変化したアミノ酸配列の存在は、変異とは考えない。配列番号２と比較されるとき、ＳＣＡ５ポリペプチドのアミノ酸配列中のいかなる変化も変異と考え、本発明のポリヌクレオチドとする。変異は、アクチン結合ドメインの如きアミノ末端内、第３スペクトリン反復ドメインを非制限的に含むスペクトリン反復ドメインの内の１つ、あるいはカルボキシ末端内に変異を含むＳＣＡ５ポリペプチドをもたらす。
使用方法
疾患に関連するゲノム配列の同定は、当該疾患の改良された診断を可能とする。本発明は、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドにおける変異が脊髄小脳性運動失調５型（ＳＣＡ５）に関連することを開示する。本発明は、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドにおいて変異を含むＳＣＡ５ポリヌクレオチドの如き本発明のポリヌクレオチドを、検出する方法、ＳＣＡ５を発現する危険にさらされていない被験者を同定する方法、及びＳＣＡ５を発現する危険性を有する又は有している被験者を同定する方法を含む。本発明の方法は、典型的に、ＳＣＡ５ポリヌクレオチド、通常はＳＣＡ５ポリヌクレオチドの一部分を分析すること、そして当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドが変異を含むかどうか決定することを含む。
疾患に関連するゲノム配列の同定は、当該疾患の改良された診断を可能とする。本発明は、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドにおける変異が脊髄小脳性運動失調５型（ＳＣＡ５）に関連することを開示する。本発明は、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドにおいて変異を含むＳＣＡ５ポリヌクレオチドの如き本発明のポリヌクレオチドを、検出する方法、ＳＣＡ５を発現する危険にさらされていない被験者を同定する方法、及びＳＣＡ５を発現する危険性を有する又は有している被験者を同定する方法を含む。本発明の方法は、典型的に、ＳＣＡ５ポリヌクレオチド、通常はＳＣＡ５ポリヌクレオチドの一部分を分析すること、そして当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドが変異を含むかどうか決定することを含む。
本明細書中に記載される用語「危険にさらされている」は、変異を含むＳＣＡ５ポリヌクレオチドを有する被験者を記載する。好ましくは、当該変異は、エキソンに相当するヌクレオチド中に存在する。好ましくは、当該変異は、配列番号２で開示されるアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するＳＣＡ５ポリヌクレオチドをもたらす。複数の変異が存在し得る。危険にさらされている被験者は、ＳＣＡ５の少なくとも１つの症状を現し得る個体、並びに、将来ＳＣＡ５の少なくとも１つの症状を発現し得る個体を含む。ＳＣＡ５の症状は、歩行、手足、及び目の動きの協調運動失調、不明瞭な発語、及び嚥下障害を含む。かかる症状の査定は、ありふれたものであり、当業者により容易に達成される。本明細書中に記載の変異を含むＳＣＡ５ポリヌクレオチドを有さない被験者は、彼又は彼女の人生の間、ＳＣＡ５の症状を発現することはないと予想され、「危険にさらされていない」と考えられる。
本発明の方法は、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドを分析すること、そして当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドが変異を有するかどうか決定することを含む。当該ポリヌクレオチドの起源は、通常、ゲノムＤＮＡ、及び／又はプロセスされたＲＮＡを含む生体サンプルである。本明細書中に記載される用語「生体サンプル」とは、例えば、非制限的に、血液、血しょう、血清又は組織を含む個体から得られた材料のサンプル（固体又は液体）をいう。生体サンプルは、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであるポリヌクレオチドを得るために処理され得る。個体は、ラット、マウス、ヒト、チンパンジー又はゴリラとなり得、好ましくはヒトである。分析される当該ＳＣＡ５ポリヌクレオチドは、全ＳＣＡ５ポリヌクレオチドなり得、そして、典型的には、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドの一部である。
本発明は、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドの少なくとも一部を含む、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドを分析するための方法を提供する。ある態様において、当該方法は、好ましくはエキソンに相当する増幅されたヌクレオチドを含む、増幅されたポリヌクレオチドを形成するために被験者のＳＣＡ５ポリヌクレオチドのヌクレオチドを増幅すること、及び当該増幅されたポリヌクレオチドを検出することを含む。好ましくは、ヌクレオチドはＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲにおいて、プライマー対のモル過剰分が、ポリヌクレオチド、好ましくはゲノムのＤＮＡを含む生体サンプルに添加される。当該プライマーは伸長され、所望の増幅されたポリヌクレオチドを合成するための鋳型として作用する相補的プライマー伸長産物を形成する。ＰＣＲによるポリヌクレオチドを増幅するための条件は、使用されたプライマーのヌクレオチド配列に依存して変化し、かかる条件を決定するための方法は、本分野においてありふれたものである。
様々なタイプの増幅技術が知られ、ごく普通に使用されており、当該技術は、例えば、対立遺伝子特異性ＰＣＲ、コールドＰＣＲ、ホットＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲなどである。これらの及び他の増幅技術は、本分野において知られており、ごく普通に使用される。配列番号１の開示に関して、当業者は、ＳＣＡ５ポリヌクレオチド中の変異を特定する際に使用される増幅技術を、容易に適応させ得る。本発明の方法において使用され得るプライマーの例は、表１に記載されるものを含む（配列番号３〜７７）。
増幅後、増幅されたポリヌクレオチドのサイズが、例えばゲル電気泳動により決定され得、そして比較される。当該増幅されたポリヌクレオチドは、（例えばエチジウムブロマイドで）染色すること、又は放射性及び非放射性標識を含む当業者に知られた好適な標識で標識することにより視覚化され得る。典型的な放射標識は、３３Ｐを含む。非放射性標識は、例えば、ビオチン又はジゴキシゲニンの如きリガンド、並びにホスファターゼ又はペルオキシダーゼの如き酵素、又はルシフェリンの如き化学発光剤、又はフルオレセインのような蛍光化合物、及びその類似体を含む。場合により、増幅されたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、決定され得る。
変異を含むＳＣＡ５ポリヌクレオチドを分析するための方法の他の態様において、ポリヌクレオチドプローブは、ポリヌクレオチドにハイブリダイズするものを使用した。本明細書中における用語「ハイブリダイズしている」、及び「ハイブリダイズ」は、プローブが、標準条件下で標的ポリヌクレオチドと非共有相互作用を形成することを意味する。標準ハイブリダイズ条件とは、プローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能とする条件である。かかる条件は、本分野においてよく知られる技術を使用して、プローブと当該標的ポリヌクレオチドについて容易に決定され、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａＬ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと。本発明において使用される好ましいプローブは、６０℃で１時間、ハイブリダイゼーションバッファー、好ましくはＲＡＰＩＤ−ＨＹＢバッファー（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）におけるプレハイブリダイゼーション、及び６０℃で一晩のハイブリダイゼーションを使用することにより、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする。好ましくは、１分あたり少なくとも４×１０７カウント（ｃｐｍ）の当該標識された総プローブが、当該ハイブリダイゼーションにおいて使用される。
使用されるプローブが少なくとも約２００ヌクレオチドであるとき、使用される洗浄条件は、２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの１リットルは、ｐＨ７．０で、１７５．３グラムのＮａＣｌ、及び８８．２グラムのクエン酸ナトリウムを含む）及び０．０５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶液における、室温で各々５分間の２回洗浄、その後、０．１５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液における、５２℃で各々３０分間の２〜３回洗浄である。
プローブが少なくとも約２００ヌクレオチドであるときに使用される他のハイブリダイゼーション条件は、上記のような同様のプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション条件を使用するが、使用される洗浄条件は、２×ＳＳＣ及び０．０５％ＳＤＳを含む溶液における、室温で各々５分間の２回洗浄、その後０．１５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液における、５０℃で１５分間の１回洗浄、その後０．１５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液における、５０℃で１０分間の１回洗浄である。
使用されるプローブが約２０〜２２ヌクレオチドであるとき、上記のような同様のプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション条件を使用するが、使用される洗浄条件は、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液における、４５℃で１５分間の２回洗浄である。
標的ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、通常、当該プローブに相補的な配列である。ハイブリダイズするプローブは、非共有相互作用を形成することに干渉しない１〜１０のハイブリダイズしないヌクレオチド、好ましくは５超、より好ましくは２超のハイブリダイズしないヌクレオチドを含み得る。プローブの当該ハイブリダイズしないヌクレオチドは、ハイブリダイズするプローブの末端及びその中に位置し得る。それ故、プローブは、標準条件下でハイブリダイゼーションされる限り、標的ＤＮＡの全ヌクレオチドに相補的である必要はない。
本発明の態様において、本方法は、制限エンドヌクレアーゼで被験者のゲノムＤＮＡを消化しポリヌクレオチドを入手すること、及びハイブリダイズする条件下、検出可能に標識されたプローブで当該ポリヌクレオチドをプローブすることを含む。エンドヌクレアーゼでのゲノムＤＮＡの消化は本分野においてありふれており、多くのエンドヌクレアーゼが知られている。通常、消化により得られるポリヌクレオチドは、例えばゲル電気泳動により画分され、変性され一本鎖ポリヌクレオチドを得、次いで、ハイブリダイズする条件下、当該プローブにさらされる。当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズされたプローブは、次いで、検出され、次いで、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドの大きさが決定され得る。
変異の有無は、当該検出されたポリヌクレオチドのおよその分子量により推測される。変異の存在は、そのヒトが危険にさらされているか否かを示唆し、変異の不存在はそのヒトが危険にさらされてはいないことを示唆する。
他の方法が、ＳＣＡ５ポリヌクレオチドを分析するために使用され得る。例としては、リガーゼ媒介検出技術（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、米国特許第４，９８８，６１７号）、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｓｔｏｋｋｅ，米国特許第５，６３３，３６５号、及びＰｉｎｋｅｌ，米国特許第５，６６５，５４９号）、ダイレクトＤＮＡシークエンシング、ＰＦＧＥ分析、サザン又はノザンブロッティング、一本鎖配座解析（ＳＳＣＡ）、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（Ｗａｌｌａｃｅ，米国特許第５，６３９，６１１号）、ドットブロット分析、変性勾配ゲル電気泳動（Ｂｏｒｒｅｓｅｎ，米国特許第５，１９０，８５６号）、ＲＦＬＰ（Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ，米国特許第５，３２４，６３１号）、及びＰＣＲ−ＳＳＣＰを非制限的に含む。例えば生体液中における、変異された遺伝子及びがん遺伝子の如き遺伝子配列を検出し定量するための方法がＳｏｒｅｎｓｏｎ（米国特許第５，４９６，６９９号）に記載される。
本発明は、被験者がＳＣＡ５を発現する危険にさらされているか否かを同定するためのキットも提供する。当該キットは、少なくとも１つのアッセイのために十分な量で、好適な包装材料中に、上記のプライマー及び／又はプローブを含む。場合により、本発明を実施するために必要とされる緩衝液及び溶液の如き他の試薬もまた含まれる。
本明細書中に使用される語句「包装材料」は、当該キットの内容物を収納するために使用される１又は複数の物理的構造をいう。当該包装材料は、よく知られた方法により構築され、一般的に滅菌された汚染物質のない環境を提供する。当該ポリペプチドは、被験者がＳＣＡ５を発現する危険にさらされているか否かを同定するために、使用され得ることを示唆する標識を、当該包装材料は有し得る。さらに、当該包装材料は、どのように当該キット内の材料が使用されるかを示唆する説明書を含む。
本明細書中に使用される用語「包装」又は「容器」は、定められた限度内で当該プライマー及び／又はプローブを保持し得る、ガラス、プラスチック、紙、ホイルなどの如き容器をいう。それ故、例えば、包装は、ミリグラム量のプライマー対を含むために使用されるプラスチックバイアルとなり得る。「使用のための説明書」は、試薬濃度又は少なくとも１つのアッセイ方法パラメーターを記載する具体的な表現を通常含む、ここで当該パラメーターとは、例えば、混ぜるための試薬とサンプルとの相対量、試薬／サンプル混合物の維持時間、温度条件、緩衝液条件などである。
本発明は、以下の実施例により例証される。特定の実施例、材料、量、及び手法は、上述のような本発明の範囲及び本質に従って広く解釈されることが理解される。
材料及び方法
ヒト被験者。この試験に参加する全ての被験者、及び対照となる個人は、ミネソタ大学の被験者委員会又は参加機関により認可されたインフォームドコンセント用紙にサインした。関係のない対照ＤＮＡサンプルを、ＣＥＰＨパネル、及び健常な北アメリカの住人から入手した（ｎ＝５００）。ＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅキット（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）を使用して抹消静脈血から抽出した。
ヒト被験者。この試験に参加する全ての被験者、及び対照となる個人は、ミネソタ大学の被験者委員会又は参加機関により認可されたインフォームドコンセント用紙にサインした。関係のない対照ＤＮＡサンプルを、ＣＥＰＨパネル、及び健常な北アメリカの住人から入手した（ｎ＝５００）。ＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅキット（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）を使用して抹消静脈血から抽出した。
染色体分離細胞系の産生。１１番染色体の病気に冒された又は正常なコピーについてのマウス／ヒトのハイブリッド細胞系ハプロイドを、前述の｛Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １１，９９−１０２（１９９５）｝のように、マウスＥ２細胞と病気に冒されたアメリカ系家族由来のヒトリンパ芽球様細胞とを融合することによりＧＭＰジェネティクス（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で産生した。概要として、病気に冒された個人由来のリンパ芽球様細胞を、マウスＥ２細胞に電気融合し、そしてＨＡＴプラスジェネティシンを使用し、非融合のＥ２細胞とリンパ芽球様細胞とをそれぞれ選択した。生き残りのコロニーを拡大させ、そして病気に冒された又は正常な１１番染色体の単一コピーのみを含むクローンを、ＳＣＡ５領域をつなぐマイクロサテライトマーカーを検査することにより選択した。
ＳＣＡ５領域におけるマイクロサテライト反復マーカーのスクリーニング。マイクロサテライト反復マーカーを、［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ標識されたプライマーを使用するＰＣＲにより増大した。生成物を、４％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、そしてオートラジオグラフィーにより視覚化した。
単一の病気に冒された染色体の遺伝型は、非多型マーカーにおける反復拡張変異の排除を可能とした。Ｅ２マウスＤＮＡをネガティブコントロールとして使用し、増幅された生成物がマウスＤＮＡではなくヒトＤＮＡに特異的であることを確認した。全ての多型マーカーを、ＳＣＡ５ファミリーの各々の病気に冒されたハプロタイプを決定するために、その後使用した。
病気に冒されたＳＣＡ５ハプロイド細胞系由来のＢＡＣライブラリーの構築、及びショットガンＤＮＡシークエンシング。不十全なＨｉｎｄＩＩＩ消化を、病気に冒された１１番染色体を含むハプロイド細胞系由来のＤＮＡで実施し、ｐｌｎｄｉｇｏＢＡＣ−５ベクター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に導入し、次いで、それを使用し、約３５２，０００個の組み換えクローンのＢＡＣライブラリーを準備した。当該ＢＡＣライブラリーを、マイクロサテライトマーカーを使用するＰＣＲによりスクリーニングし、その後、ポジティブＢＡＣクローンをハイブリダイゼーションにより単離した。
Ｌａｒｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）は、ショットガン・シークエンシングを実施し、組み立てた。簡潔にいうと、ショットガン・ライブラリーを、３つのＢＡＣ（ＶＩ−Ｃ、ＶＩ−Ｃ１１、ＩＶ−Ｈ４）について構築し、そして当該断片化されたＤＮＡをｐＵＣ５７ベクター中にサブクローニングすることにより、アメリカ系のＳＣＡ５ファミリーとフランス系のＳＣＡ５ファミリーとの間のハプロタイプ保存領域をつないだ。当該３つのショットガン・ライブラリーのシークエンシング反応を実施し、その後、ＡＢＩ３７３０ｘｌＤＮＡ配列上で分析した。当該配列データをＰｈｒｅｄ−Ｐｈｒａｐ−Ｃｏｎｓｅｄソフトウエアを使用して組み立て（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ８，１９５−２０２（１９９８））、そしてインターネットサイトであるＵＣＳＣゲノムバイオインフォマティックス及び全米バイオテクノロジー情報センターを通じた有用なオンラインのデータを使用し、特異的遺伝子に対してＢＬＡＳＴした。
ＳＣＡ５ファミリーにおけるＳＰＴＢＮ２遺伝子のシークエンシング、及び対照における変異シークエンシング。病気に冒されたフランス人及びドイツ人のＳＣＡ５患者のゲノムＤＮＡを使用し、ＰＣＲによりＳＰＴＢＮ２エキソンを増幅し、そして得られた産生物をシークエンシングした。アメリカ人とフランス人の変異を同定した後、家族及び１，０００人の対照染色体を、ＰＣＲによりこれらの欠失変異についてスクリーンした。ＰＣＲを、［γ−３３Ｐ］ＡＴＰで、各フォワードプライマーの５’末端を標識することにより実施した。当該得られた産生物を４％の変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、オートラジオグラフィーにより視覚化した。対立遺伝子特異的ＰＣＲ分析を使用し、ドイツ人のミスセンス変異についてスクリーンした。２つのフォワードプライマーであって、１つはその３’末端で変化したヌクレオチド（Ｃ）を含み、もう１つは５’末端で１９ｂｐの尾を含む当該プライマーを、単一反応に使用し、変異のある対立遺伝子（より短い産生物）、及び正常な対立遺伝子（より長い産生物）の両方を、各々増幅した。得られた産生物を、４％のアガロースゲル上で分離し、そしてエチジウムブロマイドにより視覚化した。その後、ＰＣＲを、関係のない１０００人の染色体について実施し、ドイツ人の変異についてスクリーンした。当該ＰＣＲプライマー配列とＳＰＴＢＮ２シークエンシング及び変異スクリーニングのために使用される条件を、表１に示す。
ＲＴ−ＰＣＲ分析。ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、アメリカ人のＳＣＡ５患者、及び対照個人由来の小脳病理解剖組織の〜１００ｍｇから収穫した。第１鎖合成を、ＲＴ−ＰＣＲキットとしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、及びエキソン１４由来のＳＰＴＢＮ２遺伝子特異的プライマーを使用して実施した。当該アメリカ人のＳＣＡ５欠損領域の側面に位置するＰＣＲプライマーを、エキソン１２及び１３のそれぞれの中に位置づけた。産生物を２％アガロースゲル上で分離し、そしてエチジウムブロマイドで視覚化した。当該アメリカ人のＳＣＡ５欠損のＲＴ−ＰＣＲ分析のプライマー、及び条件を表１に示す。
免疫組織化学。アメリカ系ＳＣＡ５家族、及び神経系の病気のない対照個人由来の病理解剖組織、並びに対照、及びＳＣＡ１Ｂ０５遺伝子導入マウス由来の脳を、パラフィン中に埋め込み、そして５μｍ部分を分離した。これらの部分を０．３％Ｈ２０２中に、３０分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性を失活させ、次いで、ｐＨ６．０で１０ｍＭのクエン酸塩緩衝液中、スチーマーにより加熱した。当該部分を、２次抗体を産生する動物由来の５％の正常血清中でブロックした。スライドを、β−ＩＩＩスペクトリンあるいは、１：５００又は１：１００で各々希釈されたＥＡＡＴ４抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）と共に、４℃で、一晩、インキュベートした。ポジティブ染色法を、色原体としてのジアミノベンジジンと共に、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ・コンプレックス方法（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）により視覚化し、そしてヘモトキシリンで対比染色した。
免疫分析。ＳＣＡ５アメリカ系家族、対照となるヒト、対照となるマウス、及びＳＣＡ１Ｂ０５遺伝子導入マウス由来の小脳組織を、ウエスタン分析のために使用した。組織を、ＲＩＰＡ溶解バッファー（１×ＰＢＳ，１％のＮｏｎｉｄｅｔP−４０，０．５%のデオキシコール酸ナトリウム，０．１％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌのＰＭＳＦ，５０ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン，１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム）中、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモゲナイザーで抽出した。タンパク質抽出の効率性を確実なものとするために、当該同じ小脳組織を、８M尿素、４%ＳＤＳ、O．１２５MのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１２ｍＭのＥＤＴＡ、３％β−メルカプトエタノール、及び１×プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含む、より強い溶解バッファー中で再抽出した。ＥＥＡＴ４がプルキンエ細胞の損失に起因して予期される量を超えて低減されるかどうか決定するために、ロードされるタンパク質の量をプルキンエ細胞特異的タンパク質カルビンジンと比較して標準化した。可溶化後、サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして、ニトロセルロース膜に移し、そして４℃で一晩、それぞれ１：２００又は１：６，０００で希釈されたＥＡＡＴ４又はカルビンジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）抗体と共に、インキュベートした。
免疫ブロットを、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合二次抗体で視覚化し、そして化学発光分析（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で強化した。
免疫ブロットを、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合二次抗体で視覚化し、そして化学発光分析（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で強化した。
細胞下分画。細胞下分画分析を、わずかな改良を施した｛Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４１，６８０−６９２（２００１）｝に記載のように実施した。簡潔にいうと、アメリカ系ＳＣＡ５、及び対照の病理解剖脳由来の小脳組織（各５００mg）を、５ｍｌのバッファー源｛０．３２Mのスクロース、５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５），０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１×プロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）｝におけるＰｏｌｙｔｒｏｎ均質化により再懸濁した。組織を、１８ゲージ針を繰り返し通過させることによりせん断し、そして、そのライセートを５００×ｇ、１０分間で、ペレットとした（Ｐ１画分）。その上清（Ｓ１）を、２つの０．５ｍｌの分割量に分離し、そして全分割量を１０，５００×ｇで１５分間、遠心した。当該分割量の１つについて、上清（Ｓ２）及びペレット（Ｐ２）を単離した。他の分割量について、１０，５００×ｇ回転からのペレット（Ｐ２）を再懸濁し、（１×プロテアーゼインヒビターと共に）５０μｌの氷冷Ｈ２０の添加、及び１０回の１８ゲージ針の通過より低浸透圧で溶解した。
この混合物を、次いで、２５，０００×ｇで２０分間、遠心し、ＬＳ１（上清）、及びＬＰ１（ペレット）画分を産生した。全てのペッレットとなり得る画分（Ｐ１、Ｐ２、及びＬＰ１）を、８Mの尿素、４%ＳＤＳ、０．１２５MのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１２ｍＭのＥＤＴＡ、３%のβ−メルカプトエタノール、及び１×プロテアーゼインヒビターを含む、溶解バッファー中で再懸濁した。全ての得られた画分を、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びウエスタンブロッティングにより分析した。細胞下分画分析において試験されたタンパク質に対する抗体を、以下の希釈： ＥＡＡＴ４（１：２００）、ＧｌｕＲδ２（１：１，０００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、及びクラスリン軽鎖（１：１，０００、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で使用した。
ＥＡＡＴ４及びβ−ＩＩＩスペクトリンのコンストラクトのクローニング、細胞培養、及びトランスフェクション。標準的技術を、β−ＩＩＩスペクトリンの対照及び欠損コンストラクト、並びにＥＡＡＴ４−ＧＦＰコンストラクトの構築において使用した。簡潔には、全長ＳＰＴＢＮ２ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのｃＤＮＡクローン（ＫＩＡＡ０３０２、Ｋａｚｕｓａ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、哺乳類発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の中に再クローンし、そして重なり合うプライマーセット（セット１：ＳＰΔ３９−１ｆ、及びＳＰΔ３９−１ｒ、並びにセット２：ＳＰΔ３９−２ｆ、及びＳＰΔ３９−２ｒ）を使用するＰＣＲにより修飾した。アメリカ系ファミリーの欠損を、分離ＰＣＲ産物（ＳＰΔ３９プライマーセット１及び２）を産生することにより作り出し、その後、第３ＰＣＲ反応（プライマーＳＰΔ３９−１ｆ、及びＳＰΔ３９−２ｒ）により、当該アメリカ系親族において見出される３９ｂｐ欠損変異体（ＳＰ−Δ３９）を産生した。
これらのＰＣＲ産物を、次いで、ＢｓｍＢＩ、及びＡｇｅＩ消化を使用してサブクローンした。その後、ｍｙｃタグを、野生型（ＳＰ−ＷＴ）及び変異コンストラクトの両方のＡＴＧスタートコドンのすぐ下流に、ＰＣＲ（ｍｙｃ−ｆ１及びｍｙｃ−ｒ、その後、ｍｙｃ−ｆ２及びｍｙｃ−ｒプライマー）により導入し、そして次いで、ＫｐｎＩ及びＰｍｌＩの消化を使用してサブクローンした。シークエンシングを実施し、当該タグ及び全ＣＤＮＡの完全性を照合し、コーディングエラーを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して修理した。当該β−ＩＩＩスペクトリンコンストラクトを産生するためのプライマー配列、及びＰＣＲ条件を、表１に示す。
当該ＥＡＡＴ４−ＧＦＰコンストラクトを、適切な制限酵素認識部位を含むプライマー、及び重複伸長ＰＣＲに基づく戦略を使用して産生した。得られたＥＡＡＴ４ＰＣＲ産物を、真核生物発現ベクターであるｐＥＧＦＰ−Ｃ２（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）中にクローンし、コーディング領域をシークエンシングにより確かめた。
ＨＥＫ２９３細胞を、標準的プロトコールに従って、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用してトランスフェクト（０．５μｇ／皿）した。細胞を、ガラス底の培養皿上に直接蒔き（ＭａｔＴｅｋ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）、トランスフェクション後２４時間撮影した。
ＴＩＲＦ顕微鏡検査及び分析。イオンレーザーからの光を、反転落射蛍光顕微鏡（ＩＸ８１，オリンパス）に誘導し、当該光をＴＩＲＦＭ対物レンズ（ＰｌａｎＡｐｏ ６０×／１．４５ＮＡ，オリンパス）の後焦点面に焦点を合わせた。ガラスカバースリップ上のトランスフェクトされた細胞を、温度調節機（Ｈａｒｖａｒｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して３７℃で維持し、１０ｍＭのＨｅｐｅｓによりｐＨ７．４とした。画像をＭｅｔａｍｏｒｐｈ６．３（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ）で動作されたEM電荷結合素子カメラ（オリンパス）により集めた。コマ抜き画像を、４５０ｍｓｅｃ毎に得た。トラッキング（異なる画像の単一射影）及び領域計算を含む分析を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈを使用して実施した。各回折点を、（高域フィルター＞３ピクセル）及び（低域フィルター＜３０ピクセル）の２度フィルターにかけた。ＥＡＡＴ４の側方運動は、単一画像を重ね合わせて画像化し輸送運動の総領域を測定した、一方、回折点の総トラッキング距離を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈトラッキングモジュールを使用して計算した。
結論
当該アメリカ系ファミリーは、エイブラハム・リンカーン大統領の父方の祖父母から降りる２つの主要分枝を有する（図１）。家族による「リンカーン病」といわれるＳＣＡ５は、リンカーン大統領の父方の伯父であるジョサイア、及び伯母であるメアリーの子孫に見られ、このことは、リンカーン大統領の父方の祖父母のいずれかがＳＣＡ５変異を有していることを示唆する。家族のこれらの２つの分鎖を、図１に示す。
当該アメリカ系ファミリーは、エイブラハム・リンカーン大統領の父方の祖父母から降りる２つの主要分枝を有する（図１）。家族による「リンカーン病」といわれるＳＣＡ５は、リンカーン大統領の父方の伯父であるジョサイア、及び伯母であるメアリーの子孫に見られ、このことは、リンカーン大統領の父方の祖父母のいずれかがＳＣＡ５変異を有していることを示唆する。家族のこれらの２つの分鎖を、図１に示す。
臨床評価、及びＤＮＡ採取を、病気に冒された９０人（発病年齢４〜６８歳）を含む２９９家族に実施した。幾人かの疾患は比較的軽く、大統領、彼の父であるトーマス、及びトーマスの子孫（１９６０年以後全員死亡）の臨床状態は知られていないので、大統領がＳＣＡ５変異を引き継いでいた事前確率は、２５％である。遺伝子組み換えを使用し、当該危険領域を、〜１００遺伝子を含む２．９９メガ塩基対に絞り込んだ。家族間のハプロタイプ比較は、アメリカ系家族とフランス系家族との間で２５５ｋｂの有力な保存領域を同定した。このハプロタイプは、対照の染色体の３／８４（３．５％）にも見つかるけれども、この保存が共通の先祖の変異によりもたらされる可能性があるため、この領域を優先させた。
アメリカ系ＳＣＡ５変異を含むことが知られる、病気に冒された染色体分離細胞系由来のＤＮＡを使用して、ＢＡＣライブラリー、及び当該領域のコンティグを構築し、ハプロタイプ保存領域にかかる患者由来のＢＡＣクローン（ＶＩ−２、ＶＩ−Ｃ１１、及びＩＶ−Ｈ４）のショットガン・シークエンシングを、実施した（図２ｂ）。
３９塩基対の欠損を、β−ＩＩＩスペクトリン遺伝子（ＳＰＴＢＮ２）のエキソン１２内に見つけた、ここで当該欠損は、１７スペクトリン反復の内の３番目内にフレーム単位で１３アミノ酸の欠失（ｐ．Ｅ５３２ Ｍ５４４ｄｅｌ）を引き起こす（図２ｃ、３Ａ、表２）。ＰＣＲにより検出可能な変異（図３Ａ）を、全９０人の病気に冒された個人（試験時の年齢は、７〜８０歳であって、平均４５歳）、及び発病前のキャリアである３５人の（試験時の年齢は、１３〜６７歳であって、平均３４歳）に見出した。
アメリカ系とフランス系ファミリーは、共通のハプロタイプを共有しているけれども、当該３９ｂｐのアメリカ系の欠失は、フランス系ファミリーには見出されなかった。当該アメリカ系のファミリーと同様に、フランス系のファミリーは、エキソン１４内の１５塩基対の欠失からなる同じスペクトリンの反復におけるフレーム単位の欠失を有する（ｃ．１８８６−１９００ｄｅｌ；ｐ．Ｌ６２９−Ｒ６３４ｄｅｌｉｎｓＷ）（図２ｃ、３Ｂ）。
トリプトファンの挿入を除いて、この欠失は、オープンリーディングフレームの残余を中断させない（図３Ｂ）。フランス系の変異を、全６人の病気に冒されている可能性のある個人、及び１人の明らかに発病の前段階のキャリア（２４歳）中に見出した。
ドイツ系ファミリーにおいて、ロイシンからプロリンへの変化（ｐ．Ｌ２５３Ｐ）を引き起こすエキソン７におけるＴをＣとする対変異（ｃ．７５８Ｔ＞Ｃ）を、アクチン／ＡＲＰ１結合部位を含むカルポニン相同ドメイン内に見出した。この領域は、全５人のヒトのβスペクトリンタンパク質内に見られるロイシン２５３残基を伴い高く保存され、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、及びハエについても同様である（図３Ｃ）。当該ドイツ系の変異は、１２人の病気に冒されている可能性のある個人における病気と一緒に分離される。３つのＳＣＡ５変異は、１０００人の対照染色体上に見出されなかった。
プルキンエ細胞内に高発現される２，３９０アミノ酸タンパク質である｛Ｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ＭｏＩ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ５７，１８１−１９２（１９９８）｝、｛Ｓｔａｎｋｅｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，１４１５８−１４１６３（１９９８）｝、β−ＩＩＩスペクトリンは、ゴルジ及び小胞膜と関連するタンパク質として記載され｛Ｓｔａｎｋｅｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，１４１５８−１４１６３（１９９８）｝、及びダイナクチン・サブユニットＡＲＰ１に結合することが報告され、輸送において可能性のある役割を示唆している｛Ｈｏｌｌｅｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６，３６５９８−３６６０５（２００１）｝。
βスペクトリンの他の機能は、膜タンパク質の安定化である｛Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２９，６１−６５（２００１）｝；特に、β−ＩＩＩスペクトリンは、プルキンエ細胞特異的グルタミン酸輸送体ＥＡＡＴ４を安定化する｛Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１０，８９−９３（２００１）｝。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、正常及び欠失β−ＩＩＩスペクトリン転写産物の両方が、病気に冒されている小脳病理解剖組織において発現されること（図３Ｄ）を、ＳＣＡ５における著しいプルキンエ細胞の欠損を有するSCA５及び対照の両方の小脳におけるプルキンエ細胞体、樹状突起、及び軸索の染色を示す免疫組織化学（図３Ｅ）と共に示す。
ウエスタン分析を小脳病理解剖組織に関して実施し、３９ｂｐスペクトリン欠失変異がＥＡＡＴ４に影響を与えるのかどうか調査した。放射性免疫沈降法アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファーにより抽出されるＳＣＡ５小脳におけるＥＡＡＴ４のタンパク質レベルは、プルキンエ細胞特異的な対照であるカルビンジンと比較して劇的に低減された（図４ａ）。驚くべきことに、より厳しい抽出バッファー（８Ｍの尿素、及び４％のＳＤＳ）を使用するとき、ＥＡＡＴ４／カルビンジンのおよそ等しい比率が、ＳＣＡ５及び対照において見られ（図４ｂ）、そのことは、ＥＡＡＴ４の溶解度又は分布が、変異体βＩＩＩスペクトリンにより影響を受けることを示唆する。
低減されたＥＡＡＴ４転写レベルは、プルキンエ細胞の欠失に先立って、ＳＣＡ１トランスジェニックマウスにおいて既に報告されており｛Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３，１５７−１６３（２０００）｝、ＥＡＡＴ４の欠失又は機能障害が共通の下流分子変化となり得ることを示唆する。ＳＣＡ５におけるＥＡＡＴ４の抽出性の違いがプルキンエ細胞の変性により引き起こされる非特異的変化かどうか測定するために、ＥＡＡＴ４抽出性を、著しくプルキンエ細胞を欠失するＳＣＡ１トランスジェニックマウスにおいて試験した（図４ｃ、４ｄ）。
以前の報告と一致するＥＡＡＴ４の低減されたレベルをウエスタンにより見い出し、そしてＳＣＡ５とは対照的に、ＥＡＡＴ４レベルは、ＲＩＰＡ及び尿素抽出物において同様に低減された。
ＳＣＡ５における残りのプルキンエ細胞のＥＡＡＴ４免疫染色は、樹状突起の樹の一貫した菲薄化、及び当該細胞体のより暗い染色を示し（図４ｅ）、一方ＳＣＡ１トランスジェニック動物は、より明るい染色を除いて均一性を示した（図４ｆ）。これらの結果は、ＳＣＡ５におけるＥＡＡ４の再分配がプルキンエ細胞の変性により引き起こされないこと、及びＥＡＡＴ４はＳＣＡ１とＳＣＡ５とにおける異なる機構により変化しそうであることを示唆する。
ＥＡＡＴ４をさらに試験するため、及び変異体スペクトリンがプルキンエ細胞タンパク質を結合する他の膜においても変化を引き起こすのかどうか決定するため、小脳組織の細胞下分画、そしてその後、ウエスタン分析を実施した（図５）。Ｐ１及びＳ１画分内にロードされる総タンパク質量を、ＢＣＡアッセイにより決定した、各レーン内のタンパク質量は以下：Ｐ１対照（４０．５μｇ）、Ｓ１対照（５．５μｇ）、Ｐ１ ＳＣＡ５（７１．４μｇ）、Ｓ１ ＳＣＡ５（３．９μｇ）であった。タンパク質ローディングを、クラスリン軽鎖に対するウエスタンブロット膜の標準化によっても見積もった、ここで当該クラスリン軽鎖は、原形質と小胞膜とを断続的に循環し、膜リッチでペレットとなり得る画分に豊富に存在することで知られる、広く発現する調節タンパク質である。予想通り、かなり豊富なクラスリンを、予測される核画分（Ｐ１）、粗シナプトソーム画分（Ｐ２）、及び豊富なシナプトソーム画分（ＬＰ１）画分において観察した。
ＳＣＡ５ Ｓ１（３．９対５．５μｇ）画分においては対照と比較して僅かに少ないタンパク質であるが、Ｐ１画分（７１．４対４０．５μｇ）、Ｐ２及びＬＰ１画分（クラスリンローディング対照を参照）においてはＳＣＡ５対対照におけるより多くのタンパク質をロードした。ＳＣＡ５小脳抽出物由来のＥＡＡＴ４及びＧｌｕＲδ２の細胞下分画は、対照である小脳と異なる。例えば、より多くのタンパク質を、ＳＣＡ５ Ｐ２及びＬＰ１画分 対 対照Ｐ２及びＬＰ１画分にロードした（クラスリンにより測定される）ので、もしＳＣＡ５のＥＡＡＴ４及び対照ホモジネートが同じように画分化されたならば、過剰なＳＣＡ５ Ｐ２及びＬＰ１画分において、より多くのＥＡＡＴ４が検出されることが予測される。しかしながら、これらのＳＣＡ５シナプトソームリッチ画分内（Ｐ２、ＬＰ１）に見られるＥＡＡＴ４は、劇的に少ない。ＧｌｕＲδ２の似たような再分配において、対照Ｐ２及びＬＰ１と比較してＳＣＡ５ Ｐ２及びＬＰ１において予測される、ＧｌｕＲδ２の量よりも際だって少ないことが見られた。対照と比較して、シナプス膜タンパク質であるＥＡＡＴ４及びＧｌｕＲδ２は、ＳＣＡ５組織のシナプトソーム画分内において豊富とならなかった、このことは、変異β−ＩＩＩスペクトリンがこれらのタンパク質の細胞内局在に影響を与えることを示唆する。
ＥＡＡＴ４に関する変異β−ＩＩＩスペクトリンの生理的影響をさらに特徴付けるため、一連の対照とされる細胞培養実験を実施した。ＨＥＫ２９３細胞をｅＧＦＰ−ＥＡＡＴ４でトランスフェクトし、そして全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡検査を使用して、細胞の膜上のグルタミン酸輸送体の側方運動を追跡した。当該グルタミン酸輸送体は、通常２つの主な状態間を数秒内で変化していた、ここで当該２つの主な状態とは、細胞の膜上における素早い動作とサブマイクロメーター領域内の制限された動作の期間である（図４ｇ〜ｉ）。
ＥＡＡＴ４を空の対照ベクターと共に発現させたとき、細胞膜で又はその付近でおよそ４０％のＥＡＡＴ４回折点が活発に動いており（〜４ミクロン）、一方、ゆっくりと動く回折点は、通常、固定化された小領域（１ミクロン未満）内で動作を制限された（図４ｇ、表３）。
ＥＡＡＴ４と野生型β−ＩＩＩスペクトリンとの間の相互作用の生理的関連性をさらに調査するため、ＥＡＡＴ４をβ−ＩＩＩスペクトリンと共トランスフェクションし、そしてＥＡＡＴ４の細胞内輸送を追跡した。以前の生化学試験｛Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１０，８９−９３（２００１）｝と一致して、野生型β−ＩＩＩスペクトリンの共発現は、膜で又はその付近でたった５％の回折点の動きを伴ってＥＡＡＴ４を安定化し、大きな側方運動（＞４ミクロン）を示さなかった（図４ｈ、表１）。しかしながら、３９ｂｐの欠失を伴う変異β−ＩＩＩスペクトリンの存在する場合、ＥＡＡＴ４の安定はなくなり、当該輸送体は、観察された４ミクロン超の多くの側方運動を伴う高運動性となった（図４ｉ、表３）。
ＥＡＡＴ４とβ−ＩＩＩスペクトリンとの間の特異的相互作用を確認するために、β−ＩＩＩスペクトリンをＥＡＡＴ３と共トランスフェクションした、ここで他のグルタミン酸輸送体もプルキンエ細胞内に発現していた。野生型（表３）も変異型β−ＩＩＩスペクトリンもＥＡＡＴ３安定性に関していかなる実質的効果もなかった。ＥＡＡＴ３に関する影響の欠落は、当該変異型β−ＩＩＩスペクトリンが他の膜タンパク質に影響を与える可能性を排除しない。しかしながら、これらの試験は、変異型β−ＩＩＩスペクトリンがＥＡＡＴ４の安定性を崩壊させ得る証拠を提供する、なぜならば、当該膜におけるＥＡＡＴ４の発現の変化はプルキンエ細胞の損傷／分解を増大することが知られているからであり、それ故、ＳＣＡ５におけるプルキンエ細胞の分解の一因となり得る｛Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｎｅｕｒｏｌ ８９，３３１−３５９（２００２）｝。
表３：変異型β−ＩＩＩスペクトリンは、グルタミン酸輸送体の側方細胞内輸送を変える。ＨＥＫ２９３細胞のＴＩＲＦ顕微鏡検査を実施し、画像化された細胞のデジタルムービーを、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈを使用して評価した。各回折点を別々に分析した。各条件について、３〜６の異なる実験を異なるディッシュ、及び異なる日にちから記録した。当該結果は平均値±SDである。
我々は、ＳＣＡ５に関与するβ−ＩＩＩスペクトリン遺伝子（ＳＰＴＢＮ２）における３つの別々の変異の同定を伴う脊髄小脳性運動失調についての新規変異機構を報告する。アメリカ系及びフランス系ファミリーは、似ているが、第３スペクトリン反復内に別々のフレーム単位の欠失を有し、当該反復の高秩序のトリプル・アルファ・へリックス構造を崩壊させ、四量体アルファ−ベータ−スペクトリン複合体の全形状を変化しそうである。
アメリカ系ファミリーとフランス系ファミリーとの間の共有のハプロタイプのいくつかの特徴は微少欠損を導くことが可能だけれども、当該共有のハプロタイプは、対照染色体の３．５％にこのハプロタイプが見られるのでより明らかに偶然の一致となりそうである。ドイツ系ファミリーは、カルポニン相同ドメイン中に１つのミスセンス変異を有し、それはスペクトリンのアクチン細胞骨格に結合する能力を崩壊させ得、そして同様に、膜タンパク質の安定性に影響を与え得るか、又はＡＲＰ１及びダイニンモーター複合体への結合を崩壊させることにより輸送における変化を引き起こし得る｛Ｈｏｌｌｅｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６，３６５９８−３６６０５）｝。
細胞画分試験は、変異型β−ＩＩＩスペクトリン（３９ｂｐ欠失）がシナプトソームタンパク質であるＥＡＡＴ４及びＧｌｕＲδ２の局在に影響を与えることを示唆する。興味深いことに、ＥＡＡＴ４は、ＳＣＡ１トランスジェニックマウスにおいて、転写量の下方制御にも影響を与える｛Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３，１５７−１６３（２０００）｝及び｛Ｓｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ ＭｏＩ Ｇｅｎｅｔ １３，２５３５−２５４３（２００４）｝。運動失調におけるＥＡＡＴ４の可能な役割についてのさらなる証拠は、進行性失調症をもたらすラットの嚢内アンチセンス・ノックダウン実験に由来する｛Ｒａｉｔｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ６８，２８７−３０９（２００２）｝。さらに、ＧｌｕＲδ２における変異は、ｌｕｒｃｈｅｒ及びｈｏｔｆｏｏｔマウスの両方において、運動失調を引き起こす｛Ｌａｌｏｕｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５０，９−１３（１９９８）｝及び｛Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８８，７６９−７７３（１９９７）｝。ＳＣＡ５における細胞膜でのＥＡＡＴ４及びＧｌｕＲδ２の欠失は、グルタミン酸シグナル伝達異常を導き得、時間の経過により、ＳＣＡ５におけるプルキンエ細胞の死を引き起こし得る。
スペクトリンとダイナクチン−ダイニンモーター複合体との報告された相互作用は、ＳＣＡ５変異が他の神経変性疾患のようにタンパク質細胞内輸送に影響を与え得ることを示唆する。これらの障害は、ｐ１５０Ｇｌｕｅｄ、ダイナクチン（ＤＣＴＮ１）のサブユニットにより引き起こされる優性遺伝性神経疾患｛ＰｕＩｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３３，４５５−４５６（２００３）｝、及びマウス・ダイニン重鎖遺伝子（Ｄｎｃｈｃ１）におけるミスセンス変異により引き起こされるモーター神経細胞傷害｛Ｈａｆｅｚｐａｒａｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００，８０８−８１２（２００３）｝を含む。ハンチントン病において、ハンチントン／ＨＡＰ１／ｐ１５０Ｇｌｕｅｄ複合体の変化は、輸送傷害、及び神経毒性の一因となる神経栄養援助の欠損を導き｛Ｇａｕｔｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１８，１２７−１３８（２００４）｝、そして軸索内輸送欠陥は、アルツハイマーの患者及びマウスのモデルに見られる｛Ｓｔｏｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０７, １２８２−１２８８））.
未知の変異を有するファミリーにおいて運動失調を引き起こすＳＰＴＢＮ２におけるさらなる変異の同定は、β−ＩＩＩスペクトリンの機能、及び神経変性疾患の分枝機構へのさらなる洞察を提供するだろう。特に、ＳＰＴＢＮ２における変異が、その臨床領域がＳＰＴＢＮ２を含む臨床的に異なる形式の運動失調であるＳＣＡ２０も引き起こすかどうか決定することが着目のものとなるだろう｛Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ １２７，１１７２−１１８１（２００４）｝。
ＳＣＡ１１及びＳＣＡ２５の臨床領域のそれぞれに位置するＳＰＴＢＮ５又はＳＰＴＢＮ１における変異が運動失調も引き起こすのかどうかどうか決定することも重要となるだろう｛Ｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６５，４２０−４２６（１９９９）｝及び｛Ｓｔｅｖａｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ５５，９７−１０４（２００４）｝。βスペクトリンが疾患においてさらなる役割を担う可能性と一致して、ベータスペクトリン相同体における優性遺伝性変異は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける非協調表現型（ｕｎｃ−７０）を引き起こし、ヒトβ−ＩＶスペクトリン（ＳＰＴＢＮ４）の相同分子種である、マウス・スペクトリンβ４遺伝子（Ｓｐｎｂ４）における劣勢変異は、後肢麻痺を伴う進行性失調症、難聴、及び震えるマウス（ｑｖ）における身震いを引き起こす｛Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２９，６１−６５（２００１）｝。
２８の優性運動失調の遺伝子座の推定は、根本的な原因を定義するために人類遺伝学の使用機会を提供し、この群の神経変性疾患を構成する共通の分子経路を提供する｛Ｓｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ３，２９１−３０４（２００４）｝。興味深いことに、２匹のマウス運動失調モデル、ＳＣＡ１トランスジェニックマウス、及びｓｔａｇｇｅｒｅｒマウス｛Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ４０，１１１９−１１３１（２００３）｝において、ＳＣＡ１におけるマイクロアレイ分析により見出されたβ−ＩＩＩスペクトリンとＥＡＡＴ４の転写の両方の下方制御は、異なる変異により引き起こされる相近発病機構を示唆する。
よく知られた細胞骨格タンパク質をコードする遺伝子におけるＳＣＡ５変異の同定は、ＳＣＡ５及び他の神経変性疾患に共通する下流分子機構の洞察を提供するだろう膜タンパク質の不安定化、グルタミン酸調節異常、及び媒体細胞内輸送欠損を含む疾患発病の特定の仮定を試験することを可能とするだろう。
リンカーンファミリーにおける運動失調の歴史は、エイブラハム・リンカーン大統領がＳＣＡ５変異を有していたかどうかという疑問を抱かせる。歴史的記述は、当該大統領は、不規則な歩行、つまり運動失調の初期の徴候を有していたことを示唆する。１８６１年、３月２７日、ロンドンタイムズのレポーターであったウィリアム・ラッセルは、リンカーンについて、「程なく、ぐずぐずした、だらしのない、正規兵ではない、ほとんど不安定な足取りで、背が高く、やせ細ったやせ男が入ってきた」と書いた。ＳＣＡ５変異の同定は、彼のＤＮＡを含む保存された埋蔵物を使用してリンカーン大統領が変異を有するかどうか明白に決定することを、可能とさせた。１９９１年、マルファンの遺伝子の同定が、リンカーン大統領の高い身長がその疾患からもたらされ得たものかどうか決定するためにリンカーン大統領のＤＮＡを試験することを考慮する論議の火付け役となった。マルファン症候群とは違い、リンカーンの家系は、リンカーン大統領がＳＣＡ５を発病する危険にさらされていたことを示唆する。ＳＣＡ５に関連してリンカーン大統領の状態を判定することは、歴史的興味であり、運動失調や神経変性病の社会認識を増大するだろう。
本明細書中に引用された全特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子化され利用可能な材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋやＲｅｆＳｅｑなどのヌクレオチド配列の寄託、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢのアミノ酸配列寄託、及びＧｅｎＢａｎｋやＲｅｆＳｅｑの注釈されたコード領域に由来する翻訳を含む）の完全な開示を、引用によりその全内容を援用する。上記詳細な説明、及び実施例は、理解を明確にするためだけのものである。それらから理解されるものに限定するものではない。本発明は、示され記載された正確な詳細に限定されず、本発明は、当業者にとって明らかな変化について、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲に含まれるものである。
特段の指示がなければ、本明細書、及び特許請求の範囲において使用される構成要素、分子量などの量を表示する全数字は、「約」の条件により、すべての場合において、修正されるものとして理解される。従って、それとは反対の特段の指示がなければ、本明細書及び特許請求の範囲に説明された数値パラメーターは、本発明により得られると思われる所望の特性に依存して変化し得る概算値である。最低限でも、及び特許請求の範囲と同等の原則を制限することを意図せず、各数値パラメーターは、少なくとも、報告された重要な数字の数の観点において、及び通常の端数技術を適用することにより理解すべきである。
広範にわたる本発明を説明する数値範囲及び数値パラメーターが概算値であるにもかかわらず、特定の実施例に説明された数値は、できるだけ正確に報告する。しかしながら、全ての数値は、本質的に、各試験の測定において見られた標準偏差からやむを得ず生ずる領域を含む。
全見出しは、読者の利便性のためのものであり、特に特定されなければ、当該見出しの後の本文の意味を限定するために使用されるべきではない。
Claims (9)
- ヒト対象が脊髄小脳性運動失調５型疾患（ＳＣＡ５）の危険を有するか否かを決定する方法であって、前記ヒト対象由来の核酸試料について、配列番号１のヌクレオチド１３８２３〜１３８６１又は１３８２７〜１３８６５の欠失があるか否かを分析することを含み、ここで配列番号１のヌクレオチド１３８２３〜１３８６１又は１３８２７〜１３８６５の欠失が、ＳＣＡ５の危険を有することを示す、方法。
- 前記核酸試料がＳＣＡ５ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記分析がハイブリダイゼーションを含む、請求項２に記載の方法。
- 前記ＳＣＡ５ポリヌクレオチドがゲノムＳＣＡ５ポリヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
- 前記ＳＣＡ５ポリヌクレオチドが処理されたＳＣＡ５ポリヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
- 前記分析が前記ＳＣＡ５ポリヌクレオチドの増幅を含む、請求項２に記載の方法。
- 前記分析が前記ＳＣＡ５ポリヌクレオチドの部分配列の決定を含む、請求項２に記載の方法。
- 前記増幅がプライマーＡＧＡＧＧＣＡＣＴＧＴＣＣＣＴＴＧＧＴ（配列番号１９）及びＧＣＴＧＧＴＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡＣＡＧＡ（配列番号２０）の使用を含む、請求項６に記載の方法。
- 前記ＳＣＡ５ポリヌクレオチドがエクソン７、エクソン１４、又はその双方に変異を含むか否かを決定することを更に含むとともに、エクソン７の変異が、配列番号１のヌクレオチド７７５５のＴからＣへの変化を含み、エクソン１４の変異が、配列番号１のヌクレオチド１６０１０〜１６０２４の欠失を含む、請求項２に記載の方法。
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