JP5721320B2 - Yeast with the tyrosinase gene integrated into the chromosome - Google Patents
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Description
本発明はチロシナーゼ遺伝子が染色体に組み込まれた酵母、並びに当該酵母を用いたチロシナーゼの製造方法及びメラニン前駆体の製造方法に関する。 The present invention relates to a yeast in which a tyrosinase gene is integrated into a chromosome, a method for producing tyrosinase using the yeast, and a method for producing a melanin precursor.
メラニンは、動物及び植物に広く存在する黄色〜黒色の色素であり、紫外線吸収機能、ラジカル捕獲機能、酸化防止機能などを有することが知られている。メラニンは、生体由来の物質であり安全性が高いことから、化粧品、食品等の添加剤として広く使用されている。 Melanin is a yellow to black pigment widely present in animals and plants, and is known to have an ultraviolet absorption function, a radical capture function, an antioxidant function, and the like. Melanin is widely used as an additive for cosmetics, foods and the like because it is a biologically derived substance and has high safety.
例えば、メラニンは、日焼け防止クリーム、サングラス等に配合することにより、これらに紫外線吸収機能を持たせるために用いられている。また、食品やプラスティックの酸化防止剤としても使用されている。さらに、色素として白髪染めなどにも添加されている。 For example, melanin is used in order to give an ultraviolet absorbing function to sunscreen creams, sunglasses and the like. It is also used as an antioxidant for foods and plastics. Furthermore, it is also added to white hair dyeing as a pigment.
このように、メラニンは非常に有益な物質であるため、その製造方法が種々検討されてきた。 Thus, since melanin is a very useful substance, the manufacturing method has been variously examined.
図１に示すように、生体内において、メラニンは、メラニン生成酵素であるチロシナーゼが、基質であるチロシン又は3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アラニン（DOPA）の酸化を触媒することによりドーパキノンを経て生成するメラニン前駆体(ドーパクロム、5,6-ジヒドロキシインドール、5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸など)が重合することにより生合成される。このようにして生成するメラニンは、皮膚や髪等のメラニン産生細胞内に小粒となって存在しており、水に不溶で、熱濃硫酸や強アルカリを用いなければ溶解しない高分子化合物であり、その構造は明らかになっていない。 As shown in FIG. 1, in vivo, melanin is converted to dopaquinone by catalyzing the oxidation of tyrosinase, which is a melanin-producing enzyme, of the substrate tyrosine or 3- (3,4-dihydroxyphenyl) alanine (DOPA). Melanin precursors (such as dopachrome, 5,6-dihydroxyindole, and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid) produced through polymerization are biosynthesized. Melanin produced in this way is a high molecular compound that exists in small particles in melanin-producing cells such as skin and hair, is insoluble in water, and does not dissolve unless hot concentrated sulfuric acid or strong alkali is used. The structure is not clear.
このようにメラニンは水に不溶であるため、繊維や皮革などの染料として利用する場合、組織に浸透することができず、対象を染めることはできない。 Thus, since melanin is insoluble in water, when it is used as a dye for fibers, leather, etc., it cannot penetrate into tissues and cannot dye an object.
特許文献１には、水溶性であるメラニン前駆体(メラニンの構成モノマーの混合物)の効率的な製造方法が開示されている。具体的には、特許文献１には、チロシン、DOPA及びこれらの類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の基質化合物を、カテコールオキシダーゼ活性を示す細胞を用いて酸化して、メラニン前駆体に変換する酸化工程と、得られた反応液からメラニン前駆体を回収する回収工程とを含むメラニン前駆体の製造方法が開示されている。 Patent Document 1 discloses an efficient method for producing a water-soluble melanin precursor (a mixture of constituent monomers of melanin). Specifically, Patent Document 1 discloses that at least one substrate compound selected from the group consisting of tyrosine, DOPA and analogs thereof is oxidized using a cell exhibiting catechol oxidase activity to form a melanin precursor. The manufacturing method of the melanin precursor including the oxidation process to convert and the collection | recovery process of collect | recovering a melanin precursor from the obtained reaction liquid is disclosed.
かくして調製されるメラニン前駆体は水溶性であるため、染色対象物に浸透しやすく、メラニン前駆体を染色対象物内に浸透させた後に重合させてメラニンを生成することにより効率良く対象物を染色することができる。 Since the melanin precursor thus prepared is water-soluble, it easily penetrates into the object to be dyed, and after the melanin precursor has penetrated into the object to be dyed, it is polymerized to produce melanin efficiently. can do.
特許文献１の実施例ではチロシナーゼ遺伝子の一種であるmelB遺伝子が１コピー組み込まれたベクターで酵母を形質転換している。 In the example of Patent Document 1, yeast is transformed with a vector in which one copy of the melB gene, which is a kind of tyrosinase gene, is incorporated.
しかしながら、この酵母ではメラニン前駆体の工業的生産を行うためにはチロシナーゼ活性が十分ではない。そのため、メラニン前駆体の工業的生産が可能となるようなより高いチロシナーゼ活性を有する酵母を開発することが必要である。 However, this yeast does not have sufficient tyrosinase activity for industrial production of melanin precursors. Therefore, it is necessary to develop a yeast having higher tyrosinase activity that enables industrial production of melanin precursors.
本発明は、高いチロシナーゼ活性を有する上に、継代培養により活性が低下せず、メラニン前駆体の工業的生産が可能な酵母を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a yeast that has a high tyrosinase activity and that can be industrially produced as a melanin precursor without decreasing its activity by subculture.
本発明者らは、ウラシル要求性のみを付与した酵母を、チロシナーゼ遺伝子が複数コピー導入されたベクターで形質転換したが、この酵母は、継代培養によりチロシナーゼ活性が低下するという問題があった。また、変異処理によるウラシル要求性と変異処理によるリジン要求性を付与した酵母をチロシナーゼ遺伝子を有するベクターで形質転換したが、この酵母も高濃度培養が可能でないという問題があった。 The present inventors transformed a yeast imparted only with uracil requirement with a vector into which a plurality of copies of the tyrosinase gene were introduced, but this yeast had a problem that the tyrosinase activity was reduced by subculture. In addition, a yeast having uracil requirement by mutation treatment and lysine requirement by mutation treatment was transformed with a vector having a tyrosinase gene, but this yeast also had a problem that high concentration culture was not possible.
そこで、本発明者らは、宿主酵母に変異処理を施してウラシル要求性を付与した後に、ジーンターゲッティングを施してリジン要求性を付与した酵母に対して、チロシナーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換することによって上記目的を達成することができるという知見を得た。本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次のチロシナーゼ遺伝子が染色体に組み込まれた酵母、チロシナーゼの製造方法、及びメラニン前駆体の製造方法を提供すものである。 Therefore, the present inventors perform transformation with a vector containing a tyrosinase gene on a yeast that has been subjected to gene targeting and given a lysine requirement after performing a mutation treatment on the host yeast to impart a requirement for uracil. As a result, the above-mentioned object can be achieved. The present invention has been completed based on these findings, and has been completed. The present invention provides a yeast in which the following tyrosinase gene is integrated into a chromosome, a method for producing tyrosinase, and a method for producing a melanin precursor. is there.
酵母
(1-1) 以下の工程A〜Eを含む方法により製造されるチロシナーゼ遺伝子が染色体に組み込まれた酵母：
(A) 宿主酵母に変異処理を施しウラシル要求性を付与する工程、
(B) 工程Aで得られた酵母にジーンターゲッティングを施し、リジン要求性を付与する工程、
(C) 工程Bで得られた酵母を、チロシナーゼ遺伝子を含みウラシル要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程、
(D) 工程Cで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程、及び、
(E) 工程Dで得られた酵母からリジン要求性が生じたホモ型発現株を選択する工程。
(1-2) 更に以下の工程Fを含む方法により製造される、請求項１に記載の酵母：
(F) 工程Eで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程。
(1-3) 前記宿主酵母が清酒酵母である、(1-1)又は(1-2)に記載の酵母。
(1-4) 前記清酒酵母が「きょうかい9号」である、(1-3)に記載の酵母。
(1-5) 導入されたチロシナーゼ遺伝子のコピー数が3〜8であることを特徴とする、(1-1)〜(1-4)のいずれか１項に記載の酵母。
(1-6) チロシナーゼ遺伝子のコピー数が6〜16であることを特徴とする、(1-1)〜(1-5)のいずれか１項に記載の酵母。
(1-7) 前記変異処理がEMS処理である、(1-1)〜(1-6)のいずれか１項に記載の酵母。
(1-8) 前記形質転換ベクターがSED1プロモーターを含む、(1-1)〜(1-7)のいずれか１項に記載の酵母。
(1-9) 前記チロシナーゼ遺伝子がアスペルギルス属糸状菌のチロシナーゼ遺伝子である、(1-1)〜(1-8)のいずれか１項に記載の酵母。
(1-10) 前記チロシナーゼ遺伝子がmelB遺伝子である、(1-9)に記載の酵母。
yeast
(1-1) Yeast in which a tyrosinase gene produced by a method including the following steps A to E is integrated into a chromosome:
(A) A step of subjecting the host yeast to a mutation treatment to impart uracil requirement,
(B) subjecting the yeast obtained in step A to gene targeting and imparting lysine requirement,
(C) transforming the yeast obtained in step B with a transformation vector containing a tyrosinase gene and complementing uracil requirement,
(D) transforming the yeast obtained in step C with a transformation vector that complements the lysine requirement, and
(E) A step of selecting a homo-type expression strain having lysine requirement from the yeast obtained in step D.
(1-2) The yeast according to claim 1, which is produced by a method further comprising the following step F:
(F) A step of transforming the yeast obtained in step E with a transformation vector that complements lysine requirement.
(1-3) The yeast according to (1-1) or (1-2), wherein the host yeast is sake yeast.
(1-4) The yeast according to (1-3), wherein the sake yeast is “Kyokai No. 9”.
(1-5) The yeast according to any one of (1-1) to (1-4), wherein the introduced tyrosinase gene has a copy number of 3 to 8.
(1-6) The yeast according to any one of (1-1) to (1-5), wherein the tyrosinase gene has a copy number of 6 to 16.
(1-7) The yeast according to any one of (1-1) to (1-6), wherein the mutation treatment is EMS treatment.
(1-8) The yeast according to any one of (1-1) to (1-7), wherein the transformation vector contains a SED1 promoter.
(1-9) The yeast according to any one of (1-1) to (1-8), wherein the tyrosinase gene is an Aspergillus filamentous fungus tyrosinase gene.
(1-10) The yeast according to (1-9), wherein the tyrosinase gene is a melB gene.
チロシナーゼの製造方法
(2-1) (1-1)〜(1-10)のいずれか１項に記載の酵母を培養し、培養物からのチロシナーゼを利用する ことを特徴とするチロシナーゼの製造方法。
Method for producing tyrosinase
(2-1) A method for producing tyrosinase, comprising culturing the yeast according to any one of (1-1) to (1-10) and utilizing tyrosinase from the culture.
メラニン前駆体(メラニンの構成モノマーの混合物)の製造方法
(3-1) 反応液中で、(1-1)〜(1-10)のいずれか１項に記載の酵母の存在下で、DOPA及びこれらの類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の基質化合物を酸化してメラニン前駆体に変換する酸化工程と、
反応液からメラニン前駆体を回収する回収工程と
を含むメラニン前駆体の製造方法。
Method for producing melanin precursor (mixture of constituent monomers of melanin)
(3-1) At least one selected from the group consisting of DOPA and analogs thereof in the reaction solution in the presence of the yeast according to any one of (1-1) to (1-10) An oxidation step of oxidizing the substrate compound of the compound into a melanin precursor,
The manufacturing method of a melanin precursor including the collection | recovery process which collect | recovers a melanin precursor from a reaction liquid.
本発明の酵母は、高いチロシナーゼ活性を有する上に、継代培養により活性が低下せず、メラニン前駆体の工業的生産が可能という優れた特性を有している。そして、当該酵母を使用することによりメラニン前駆体の生産性を向上させることができる。 The yeast of the present invention has high tyrosinase activity, and has excellent characteristics that the activity is not reduced by subculture and industrial production of melanin precursor is possible. And productivity of a melanin precursor can be improved by using the said yeast.
以下、本発明のチロシナーゼ遺伝子が染色体に組み込まれた酵母及びメラニン前駆体の製造方法について詳細に説明する。 Hereinafter, the method for producing yeast and melanin precursor in which the tyrosinase gene of the present invention is incorporated into a chromosome will be described in detail.
チロシナーゼ遺伝子が染色体に組み込まれた酵母
本発明のチロシナーゼ遺伝子が組み込まれた酵母は、以下の工程A〜Eを含む方法により製造されることを特徴としている：
(A) 宿主酵母に変異処理を施しウラシル要求性を付与する工程、
(B) 工程Aで得られた酵母にジーンターゲッティングを施し、リジン要求性を付与する工程、
(C) 工程Bで得られた酵母を、チロシナーゼ遺伝子を含みウラシル要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程、
(D) 工程Cで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程、及び
(E) 工程Dで得られた酵母からリジン要求性が生じたホモ型発現株を選択する工程。
Yeast with Tyrosinase Gene Integrated in Chromosome Yeast with the tyrosinase gene of the present invention integrated therein is characterized by being produced by a method comprising the following steps A to E:
(A) A step of subjecting the host yeast to a mutation treatment to impart uracil requirement,
(B) subjecting the yeast obtained in step A to gene targeting and imparting lysine requirement,
(C) transforming the yeast obtained in step B with a transformation vector containing a tyrosinase gene and complementing uracil requirement,
(D) transforming the yeast obtained in step C with a transformation vector that complements the lysine requirement, and
(E) A step of selecting a homo-type expression strain having lysine requirement from the yeast obtained in step D.
また、本発明のチロシナーゼ遺伝子が組み込まれた酵母は、更に以下の工程Fを含む方法により製造されることを特徴としている：
(F) 工程Eで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程。
In addition, the yeast in which the tyrosinase gene of the present invention is incorporated is characterized by being produced by a method including the following step F:
(F) A step of transforming the yeast obtained in step E with a transformation vector that complements lysine requirement.
本発明の酵母は、導入されたチロシナーゼ遺伝子のコピー数が3〜8であり、また、本発明の酵母の他の態様は、上記の形質転換された酵母にLOH(ヘテロ接合性の消失)が生じることによって得られる、その酵母自体のチロシナーゼ遺伝子のコピー数が6〜16であることを特徴とする酵母である。ここで「導入されたチロシナーゼ遺伝子のコピー数」とは、 ウラシル要求性を相補する形質転換ベクターが有するチロシナーゼ遺伝子の合計数を意味する。 In the yeast of the present invention, the copy number of the introduced tyrosinase gene is 3 to 8, and in another embodiment of the yeast of the present invention, LOH (loss of heterozygosity) is present in the transformed yeast. It is a yeast characterized in that the number of copies of the tyrosinase gene of the yeast itself obtained by the generation is 6-16. Here, “the copy number of the introduced tyrosinase gene” means the total number of tyrosinase genes contained in the transformation vector that complements the uracil requirement.
LOHは、ある座位において、対立染色体の一方の情報が失われることであり、自然に生じるものであり（酵母遺伝子実験マニュアル、丸善株式会社、平成１４年１２月１０日発行、pp31-39）、LOHが起った株を効率よく検出することもできる。２倍体の酵母は、それ自体でLOHが通常自然に生じる。LOHが生じることにより、２倍体の一方の核に導入されたプラスミドが他方の核と組み換えられ、核が均一化するために、チロシナーゼ遺伝子のコピー数が最大２倍になる。 LOH is the loss of information on one of the allelic chromosomes at a certain locus, which occurs naturally (Yeast Genetic Experiment Manual, Maruzen Co., Ltd., issued December 10, 2002, pp31-39), It is also possible to efficiently detect strains in which LOH has occurred. In diploid yeast, LOH usually occurs naturally by itself. When LOH is generated, the plasmid introduced into one nucleus of the diploid is recombined with the other nucleus, and the nucleus is homogenized, so that the copy number of the tyrosinase gene is doubled at most.
以下、各工程について説明する。 Hereinafter, each step will be described.
・(A)工程
工程Aでは、宿主酵母に変異処理を施しウラシル要求性を付与する。
-(A) In step A, the host yeast is subjected to mutation treatment to impart uracil requirement.
宿主酵母は、好ましくは清酒酵母であり、特に好ましくは「きょうかい９号」である。清酒酵母は2倍体であるため、ベクターが2コピー導入される可能性がある。「きょうかい９号」は、財団法人日本醸造協会(東京都北区滝野川2丁目6番30号)から入手可能である。 The host yeast is preferably sake yeast, and particularly preferably “Kyokai No. 9”. Since sake yeast is diploid, two copies of the vector may be introduced. “Kyokai No. 9” is available from the Japan Brewing Association (2-6-30 Takinogawa, Kita-ku, Tokyo).
ウラシル要求性を付与するための変異処理は、例えば突然変異誘発物質や紫外線により処理することにより行うことができる。突然変異誘発物質としてはアルキル化剤やアクリジン色素が挙げられ、好ましくはEMS(エチルメタンスルホン酸)である。ウラシル要求性が付与された株は、５−フルオロオロチジン酸を含む培地を用いるポジティブ選別法又はウラシル欠損培地を使用したネガティブ選別法により選択することができる。EMS処理は常法に従い行うことができる（酵母遺伝子実験マニュアル、丸善株式会社、平成１４年１２月１０日発行、pp9-17；Can. J. Genet. Cytol., 7:491-499 (1965)；生物工学実験書、培風館、２００２年４月１０日改訂版発行、pp139-140）。 Mutation treatment for imparting uracil requirement can be performed, for example, by treatment with a mutagen or ultraviolet rays. Examples of mutagens include alkylating agents and acridine dyes, preferably EMS (ethyl methanesulfonic acid). Strains to which uracil requirement is imparted can be selected by a positive selection method using a medium containing 5-fluoroorotidine acid or a negative selection method using a uracil-deficient medium. EMS treatment can be performed according to a conventional method (Yeast Genetic Experiment Manual, Maruzen Co., Ltd., issued on December 10, 2002, pp9-17; Can. J. Genet. Cytol., 7: 491-499 (1965) Biotechnological experiment book, Baifukan, Revised April 10, 2002, pp139-140).
・(B)工程
工程Bでは、工程Aで得られた酵母にジーンターゲッティングを施し、リジン要求性を付与する。
(B) In step B, gene targeting is performed on the yeast obtained in step A to impart lysine requirement.
ジーンターゲッティングとは、細胞レベルで特定遺伝子座のみに目的とした変異を導入することであり、相同組換えを行った後に標的遺伝子組換え体を選別することにより行う。 Gene targeting refers to introducing a targeted mutation only at a specific locus at the cellular level, and is performed by selecting a target gene recombinant after homologous recombination.
ジーンターゲッティングは常法に従い行うことができ、例えば、Methods in Enzymology, vol.194, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, 1991 by Academic Press, Inc., pp281-301やMol. Gen. Genet., 193: 557 (1984)の記載に従い行なうことができる。 Gene targeting can be performed according to conventional methods, for example, Methods in Enzymology, vol. 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, 1991 by Academic Press, Inc., pp281-301 and Mol. Gen. Genet., 193: 557 (1984).
ジーンターゲッティングでは、特定の遺伝子座のみを目的とするので、変異処理を行うのに比べて目的とする変異以外の不特定の変異が入る可能性がない。 In gene targeting, only a specific gene locus is intended, and therefore, there is no possibility of introducing an unspecified mutation other than the intended mutation as compared to performing mutation treatment.
・(C)工程
工程Cでは、チロシナーゼ遺伝子を含みウラシル要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する。
-(C) In step C, transformation is performed with a transformation vector containing a tyrosinase gene and complementing uracil requirement.
チロシナーゼは、L-DOPAに対して親和性が高いために天然型メラニン前駆体を効率よく製造できる。チロシナーゼは、どのような生物に由来する酵素であってもよいが、特に、発現効率がよく、かつ宿主細胞内で安定であることから、糸状菌由来のチロシナーゼが好ましい。このような糸状菌としては、アスペルギルス(Aspergillus)属糸状菌、ニューロスポラ(Neurospora)属糸状菌、リゾムコール(Rhizomucor)属糸状菌、トリコデルマ(Trichoderma)属糸状菌、ペニシリウム(Penicillium)属糸状菌などが挙げられる。中でも、熱に対して比較的安定であり、かつ安全性が確かめられている点で、アスペルギルス属糸状菌のチロシナーゼが好ましく、具体的には、アスペルギルス・オリゼのmelB遺伝子（特開2002-191366号公報）、melD遺伝子（特開2004-201545号公報）及びmelO遺伝子（Molecular cloning and nucleotide sequence of the protyrosinase gene, melO, from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells.Biochim Biophys Acta. 1995 Mar 14;1261(1):151-154.）にコードされるチロシナーゼ又はかかるチロシナーゼと実質的に同一である酵素を挙げることができる。 Since tyrosinase has high affinity for L-DOPA, natural melanin precursor can be produced efficiently. The tyrosinase may be an enzyme derived from any organism, but tyrosinase derived from a filamentous fungus is particularly preferable because of its high expression efficiency and stability in the host cell. Examples of such filamentous fungi include Aspergillus fungi, Neurospora fungi, Rhizomucor fungi, Trichoderma fungi, and Penicillium fungi. Can be mentioned. Among them, tyrosinase of Aspergillus filamentous fungi is preferable because it is relatively stable against heat and has been confirmed to be safe. Specifically, Aspergillus oryzae melB gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-191366) Publication), melD gene (JP 2004-201545) and melO gene (Molecular cloning and nucleotide sequence of the protyrosinase gene, melO, from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells. Biochim Biophys Acta. 1995 Mar 14; 1261 (1): 151-154.) Or an enzyme that is substantially identical to such tyrosinase.
なお、上記チロシナーゼと「実質的に同一」とは、これらの遺伝子（melB遺伝子、melD遺伝子又はmelO遺伝子）によってコードされるチロシナーゼのアミノ酸配列と、70％以上、更に好ましくは80％以上、最も好ましくは90％以上が同一のアミノ酸配列を有し、チロシナーゼ活性を有している酵素をいう。 The “substantially identical” to the above tyrosinase is 70% or more, more preferably 80% or more, most preferably the amino acid sequence of tyrosinase encoded by these genes (melB gene, melD gene or melO gene). Refers to an enzyme having 90% or more of the same amino acid sequence and having tyrosinase activity.
このようなチロシナーゼ遺伝子の取得に際しては、PCR法(Science, 230, 1350-1354 (1985))によるDNA増幅法が好適に利用できる。かかるPCR法の採用に際して使用されるプライマーは、配列情報に基づいて適宜設定することができ、これは常法に従い合成することができる。 In obtaining such a tyrosinase gene, a DNA amplification method by PCR (Science, 230 , 1350-1354 (1985)) can be suitably used. Primers used in adopting such a PCR method can be appropriately set based on sequence information, and can be synthesized according to a conventional method.
尚、増幅させたDNA断片の単離精製は常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法などによればよい。 In addition, isolation and purification of the amplified DNA fragment can be performed according to a conventional method, for example, gel electrophoresis.
上記で得られるチロシナーゼ遺伝子の塩基配列の決定も、常法に従うことができ、例えばジデオキシ法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977))やマキサム-ギルバート法(Method in Enzymology, 65, 499 (1980))などにより行なうことができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシークエンスキットなどを用いても容易に行ない得る。 Determination of the base sequence of the tyrosinase gene obtained above can also be carried out in accordance with a conventional method, for example, dideoxy method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 , 5463-5467 (1977)) or maxam-Gilbert method (Method in Enzymology, 65 , 499 (1980)). Such a base sequence can be easily determined using a commercially available sequence kit or the like.
形質転換に用いるベクターとしては、例えばpRS406(GenBank Accession no.U03446)などを利用できる。形質転換ベクターは、ウラシル要求性を相補する配列(例えば、URA3(YEL021W)(SGD:S000000747))を有するものを使用する。 For example, pRS406 (GenBank Accession no. U03446) can be used as a vector used for transformation. A transformation vector having a sequence (for example, URA3 (YEL021W) (SGD: S000000747)) that complements uracil requirement is used.
ウラシル要求性を相補するベクターに存在するチロシナーゼ遺伝子のコピー数は、少なくとも１、好ましくは１〜８である。 The copy number of the tyrosinase gene present in the vector that complements the uracil requirement is at least 1, preferably 1-8.
形質転換ベクターのチロシナーゼ遺伝子の上流に位置するプロモーターは、SED1プロモーター、ADH1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、TDH1プロモーター、PHO5プロモーター、GAL4プロモーター、GAL10プロモーター、CUP1プロモーターなどが挙げられる。中でも、SED1プロモーター、ADH1プロモーター、PGKプロモーター、及びGAPDHプロモーターが好ましく、SED1プロモーターがより好ましい。 Examples of the promoter located upstream of the tyrosinase gene of the transformation vector include SED1 promoter, ADH1 promoter, PGK promoter, GAPDH promoter, TDH1 promoter, PHO5 promoter, GAL4 promoter, GAL10 promoter, and CUP1 promoter. Among these, the SED1 promoter, ADH1 promoter, PGK promoter, and GAPDH promoter are preferable, and the SED1 promoter is more preferable.
形質転換ベクターによる酵母の形質転換方法としては、酢酸リチウム法(J. Bacteriol., 153: 163-168 (1983))、スフェロプラスト法やエレクトロポレーション法などの一般的な各種方法を採用でき、一方の核のURA3座位に相同組み換えにより形質転換を行う。 Various methods such as lithium acetate method (J. Bacteriol., 153: 163-168 (1983)), spheroplast method and electroporation method can be adopted as a method for transformation of yeast with a transformation vector. The transformation is performed by homologous recombination at the URA3 locus of one nucleus.
・（D）工程
工程Dでは、工程Cで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する。この場合、工程Cで形質転換ベクターを形質転換したURA3座位と対のURA3座位に、リジン要求性を相補する形質転換ベクターを相同組み換えにより形質転換する。
(D) In step D, the yeast obtained in step C is transformed with a transformation vector that complements lysine requirement. In this case, a transformation vector complementary to the lysine requirement is transformed by homologous recombination into the URA3 locus paired with the URA3 locus transformed with the transformation vector in Step C.
形質転換に用いるベクターとしては、例えばpRS406(GenBank Accession no.U03446)などを利用できる。形質転換ベクターは、リジン要求性を相補する配列(例えばLYS2（YBR115C, SGD:S000000319）, LYS5（YGL154C, SGD:S000003122）)を有するものを使用する。 For example, pRS406 (GenBank Accession no. U03446) can be used as a vector used for transformation. A transformation vector having a sequence complementary to lysine requirement (for example, LYS2 (YBR115C, SGD: S000000319), LYS5 (YGL154C, SGD: S000003122)) is used.
形質転換ベクターによる酵母の形質転換方法としては、酢酸リチウム法(J. Bacteriol., 153: 163-168 (1983))、スフェロプラスト法やエレクトロポレーション法などの一般的な各種方法を採用できる。 Various transformation methods such as lithium acetate method (J. Bacteriol., 153: 163-168 (1983)), spheroplast method and electroporation method can be adopted as a method for transforming yeast with a transformation vector. .
・(E)工程
工程Eでは、工程Dで得られた酵母からLOHでリジン要求性が生じたホモ型発現株を選択する。
(E) In step E, a homozygous expression strain in which lysine requirement is generated with LOH is selected from the yeast obtained in step D.
工程Dで得られた酵母は、２倍体の一方の核のURA3の座位にチロシナーゼ遺伝子とウラシル要求性を相補する遺伝子を有し、他方の核の同じ座位にリジン要求性を相補する遺伝子を有するため、ウラシル要求性とリジン要求性の栄養要求性が回復している。 The yeast obtained in Step D has a gene that complements the tyrosinase gene and uracil requirement in the URA3 locus of one nucleus of the diploid, and a gene that complements lysine requirement in the same locus of the other nucleus. Therefore, the nutritional requirement of uracil requirement and lysine requirement is restored.
工程Dで得られた酵母を培養し、LOHが生じたリジン要求性を示す株を選択することにより、チロシナーゼ遺伝子が存在する一方の核の座位がリジン要求性を相補する遺伝子が存在する他方の核の座位と組み換えられ、核が均一化するために、チロシナーゼ遺伝子のコピー数が最大２倍になるホモ型発現株が得られる。 By culturing the yeast obtained in step D and selecting a strain exhibiting lysine requirement in which LOH is generated, the other locus in which the locus of one nucleus in which the tyrosinase gene is present is complementary to the lysine requirement is present. Recombining with the nuclear locus and homogenizing the nucleus results in a homotypic expression strain in which the copy number of the tyrosinase gene is doubled at most.
リジン要求性が生じたホモ型発現株の選択は、例えばα−アミノアジピン酸(α-AA)を含有する培地での選択により行うことができる。 Selection of a homo-type expression strain in which lysine requirement has occurred can be performed, for example, by selection in a medium containing α-aminoadipic acid (α-AA).
・(F)工程
工程Fでは、工程Eで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する。
(F) In step F, the yeast obtained in step E is transformed with a transformation vector that complements the lysine requirement.
形質転換に用いるベクターとしては、例えばpRS406(GenBank Accession no.U03446)などを利用できる。形質転換ベクターは、リジン要求性を相補する配列(例えばLYS2（YBR115C, SGD:S000000319）, LYS5（YGL154C, SGD:S000003122）)を有するものを使用する。当該形質転換ベクターにはチロシナーゼ遺伝子が含まれていてもよく、チロシナーゼ遺伝子は複数コピー含まれていてもよい。当該チロシナーゼ遺伝子は前述する工程Cで記載されているものが使用される。また、前記形質転換ベクターの挿入される染色体上の座位は問わない。 For example, pRS406 (GenBank Accession no. U03446) can be used as a vector used for transformation. A transformation vector having a sequence complementary to lysine requirement (for example, LYS2 (YBR115C, SGD: S000000319), LYS5 (YGL154C, SGD: S000003122)) is used. The transformation vector may contain a tyrosinase gene, and a plurality of tyrosinase genes may be contained. As the tyrosinase gene, those described in Step C described above are used. The locus on the chromosome into which the transformation vector is inserted does not matter.
形質転換ベクターによる酵母の形質転換方法としては、酢酸リチウム法(J. Bacteriol., 153: 163-168 (1983))、スフェロプラスト法やエレクトロポレーション法などの一般的な各種方法を採用できる。 Various transformation methods such as lithium acetate method (J. Bacteriol., 153: 163-168 (1983)), spheroplast method and electroporation method can be adopted as a method for transforming yeast with a transformation vector. .
得られる形質転換酵母は、常法に従い培養でき、該培養によりチロシナーゼが生産、発現される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主酵母に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、その培養も宿主酵母の生育に適した条件下で実施できる。 The resulting transformed yeast can be cultured according to a conventional method, and tyrosinase is produced and expressed by the culture. As the medium used for the culture, various media commonly used according to the adopted host yeast can be appropriately selected and used, and the culture can also be performed under conditions suitable for the growth of the host yeast.
上記により、形質転換酵母の細胞内、細胞外又は細胞膜上に目的とする組換え蛋白が発現、生産、蓄積又は分泌される。 As described above, the desired recombinant protein is expressed, produced, accumulated, or secreted inside, outside, or on the cell membrane of the transformed yeast.
チロシナーゼは、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第1版第1刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274-8277 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313-321 (1987) など参照〕により分離、精製できる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。 If desired, tyrosinase can be used in various separation operations utilizing its physical and chemical properties ("Biochemical Data Book II", pages 1175-1259, 1st edition, 1st edition, June 23, 1980) Published by Tokyo Chemical Co., Ltd .; see Biochemistry, 25 (25), 8274-8277 (1986); Eur. J. Biochem., 163 , 313-321 (1987), etc.]. Specific examples of the method include normal reconstitution treatment, treatment with a protein precipitating agent (salting out method), centrifugation, osmotic shock method, ultrasonic crushing, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration). And various liquid chromatography such as adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC), dialysis method, and combinations thereof.
メラニン前駆体の製造方法
本発明のメラニン前駆体の製造方法は、反応液中で、本発明の酵母の存在下で、DOPA及びこれらの類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の基質化合物を酸化してメラニン前駆体に変換する酸化工程と、反応液からメラニン前駆体を回収する回収工程とを含むことを特徴とする。
Method for Producing Melanin Precursor The method for producing a melanin precursor of the present invention comprises at least one substrate compound selected from the group consisting of DOPA and these analogs in a reaction solution in the presence of the yeast of the present invention. It includes an oxidation step of oxidizing to convert to a melanin precursor and a recovery step of recovering the melanin precursor from the reaction solution.
本発明の製造方法が対象とするメラニン前駆体は、DOPA及びその類縁体からなる群から選択される少なくとも１種の基質化合物から、酵素を用いた酸化反応により製造される化合物またはそれらの化合物群である。これらの化合物または化合物群は、空気中の酸素ですみやかに酸化重合しメラニンを形成するため、メラニン前駆体と総称される。具体的には、メラニンの構成モノマー（例えば、ドーパクロム、5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸、5,6-ジヒドロキシインドール、5,6-ジヒドロキシインドリン、5,6-ジヒドロキシインドリン-2-カルボン酸）、並びにこれらのモノマーが２〜５分子程度重合してなる水溶性オリゴマーを挙げることができる。好ましくはドーパクロム、5,6-ジヒドロキシインドール、および5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸である。 The melanin precursor targeted by the production method of the present invention is a compound produced by an oxidation reaction using an enzyme from at least one substrate compound selected from the group consisting of DOPA and its analogs, or a group of these compounds It is. These compounds or groups of compounds are collectively referred to as melanin precursors because they oxidatively polymerize quickly with oxygen in the air to form melanin. Specifically, melanin constituent monomers (for example, dopachrome, 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, 5,6-dihydroxyindole, 5,6-dihydroxyindoline, 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid) Acid) and water-soluble oligomers obtained by polymerizing these monomers in about 2 to 5 molecules. Preferred are dopachrome, 5,6-dihydroxyindole, and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid.
以下、各工程について説明する。 Hereinafter, each step will be described.
・基質化合物の酸化工程
＜基質化合物＞
基質化合物としては、DOPA及びDOPA類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を使用する。DOPA及びDOPA類縁体は、L体又はD体のいずれであってもよい。DOPA類縁体としては、ドーパミン（Dopamine）、DOPAメチルエステル、DOPAエチルエステル、α−メチルDOPA等が挙げられ、これらの異性体であってもよい。基質化合物として、中でも、天然型メラニン前駆体が得られる点、酵素に対する親和性の点でL-DOPAを用いることが好ましい。
・ Substrate compound oxidation process
<Substrate compound>
As the substrate compound, at least one compound selected from the group consisting of DOPA and DOPA analogs is used. DOPA and DOPA analogs may be either L-form or D-form. Examples of DOPA analogs include dopamine, DOPA methyl ester, DOPA ethyl ester, α-methyl DOPA, and the like, and these isomers may be used. Among them, it is preferable to use L-DOPA as a substrate compound from the viewpoint of obtaining a natural melanin precursor and the affinity for an enzyme.
これらの基質は１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 These substrates can be used singly or in combination of two or more.
また、基質化合物にシステイン又はグルタチオンのようなチオール化合物、コウジ酸などの異種化合物を添加しておいてもよい。かかる異種化合物を添加することにより、前述したメラニン前駆体にこれらの異種化合物が結合するか、又は／及び、これらの異種化合物が混在するメラニン前駆体が得られる。これらの異種化合物は、酸化反応の途中又はその後、又は、後述するメラニン前駆体の変換の途中又はその後に反応液に添加することもできる。上記基質化合物(DOPA又はDOPA類縁体)に加えて、DOPA又はDOPA類縁体のいずれにも該当しない異種化合物を用いることにより得られる修飾されたメラニン前駆体も、本発明のメラニン前駆体に含まれる。 Further, a thiol compound such as cysteine or glutathione, or a different compound such as kojic acid may be added to the substrate compound. By adding such a heterogeneous compound, these heterogeneous compounds bind to the melanin precursor described above and / or a melanin precursor in which these heterogeneous compounds are mixed is obtained. These heterogeneous compounds can also be added to the reaction solution during or after the oxidation reaction, or during or after the conversion of the melanin precursor described below. In addition to the substrate compound (DOPA or DOPA analog), a modified melanin precursor obtained by using a heterogeneous compound that does not fall under either DOPA or DOPA analog is also included in the melanin precursor of the present invention. .
＜反応＞
反応開始時の基質の濃度は、通常10〜60 mM程度とすることが好ましく、15〜40 mM程度とすることがより好ましい。
<Reaction>
The concentration of the substrate at the start of the reaction is usually preferably about 10 to 60 mM, more preferably about 15 to 40 mM.
また反応液のpHは、前述する酵母から産生される酵素が基質の酸化反応を触媒できる範囲であればよく、特に限定されないが、通常４〜９程度に調整することが好ましく、５〜７程度に調整することがより好ましい。余りに低pHであると基質の酸化が進行せず、逆に余りに高pHであると生成したメラニンが蓄積せずに重合してしまうが、上記範囲であれば、メラニンの生成を抑えて反応液中に効率よくメラニン前駆体を蓄積させることができる。 The pH of the reaction solution is not particularly limited as long as the enzyme produced from the yeast described above can catalyze the oxidation reaction of the substrate, but it is usually preferably adjusted to about 4 to 9, preferably about 5 to 7 It is more preferable to adjust to. If the pH is too low, the oxidation of the substrate will not proceed. Conversely, if the pH is too high, the produced melanin will polymerize without accumulating. The melanin precursor can be efficiently accumulated therein.
反応液のpHは、反応液として緩衝液を用いることにより上記範囲に維持することもできるが、塩濃度が高いとメラニン前駆体の重合によるメラニンの生成が促進される場合がある。このため、KOH、NaOHのような強アルカリ及びH2SO4、HClのような強酸を少量添加することにより、反応液中のpHを上記範囲に調整しコントロールすることが好ましい。 The pH of the reaction solution can be maintained in the above range by using a buffer solution as the reaction solution. However, when the salt concentration is high, the production of melanin by polymerization of the melanin precursor may be promoted. Therefore, it is preferable to adjust and control the pH in the reaction solution within the above range by adding a small amount of a strong alkali such as KOH or NaOH and a strong acid such as H 2 SO 4 or HCl.
反応液中の酵素産生酵母の量は、1molのL-DOPAを基質とした場合のチロシナーゼ活性が、5×105U/mol以上となる範囲内で、少なければ少ないほど良い。尚、チロシナーゼ活性は実施例に記載の方法で測定することができる。反応液への酵母投入量は、通常反応液の体積に対して20容量％以下が好ましく、10容量％以下がより好ましい。上記の範囲内であれば、反応後の菌体分離を容易に行えること、また菌体へのメラニンにより、メラニン前駆体の収率を高くすることができる。 The amount of enzyme-producing yeast in the reaction solution is preferably as small as possible within the range where the tyrosinase activity is 5 × 10 5 U / mol or more when 1 mol of L-DOPA is used as a substrate. Tyrosinase activity can be measured by the method described in the examples. The amount of yeast added to the reaction solution is usually preferably 20% by volume or less, more preferably 10% by volume or less, relative to the volume of the reaction solution. If it is in said range, the microbial cell isolation | separation after reaction can be performed easily, and the yield of a melanin precursor can be made high by the melanin to a microbial cell.
反応温度は、酵素が基質の酸化反応を触媒できる範囲であればよく、特に限定されないが、通常15〜35℃程度に調整することが好ましく、20〜30℃程度に調整することがより好ましい。上記範囲内であれば、十分に酸化反応が進行するとともに、酵素が失活し難く、またメラニン化が進行し難い。 The reaction temperature is not particularly limited as long as the enzyme can catalyze the oxidation reaction of the substrate, but is usually preferably adjusted to about 15 to 35 ° C, more preferably about 20 to 30 ° C. Within the above range, the oxidation reaction proceeds sufficiently, the enzyme is hardly deactivated, and melanization is difficult to proceed.
反応開始直後は、酸化反応に大量の酸素が必要であるため、大量に通気することが好ましい。但し、攪拌速度が速すぎると酵母が損傷するため、反応液中の酸素濃度を監視し、酸素濃度が低下しなくなれば通気量および攪拌速度を減少することが好ましい。反応液中の酸素濃度は0.1〜8 ppm程度に調整することが好ましく、1〜2 ppm程度に調整することがより好ましい。通気や撹拌により反応液中に大量の泡が生じる場合は、シリコーン樹脂のような消泡剤を添加してもよい。 Immediately after the start of the reaction, a large amount of oxygen is required for the oxidation reaction. However, if the stirring speed is too high, the yeast will be damaged. Therefore, it is preferable to monitor the oxygen concentration in the reaction solution and reduce the aeration rate and stirring speed if the oxygen concentration does not decrease. The oxygen concentration in the reaction solution is preferably adjusted to about 0.1 to 8 ppm, more preferably about 1 to 2 ppm. When a large amount of foam is generated in the reaction solution by aeration or stirring, an antifoaming agent such as a silicone resin may be added.
反応は、バッチ式又は連続式の何れであってもよい。未反応の基質と生成物を分離できる点でバッチ式が好ましい。バッチ式の場合の反応時間は、通常10分〜2時間程度とするのが好ましく、30分〜1時間程度とするのがより好ましい。余りに長時間反応させると生成したメラニン前駆体の重合反応(メラニン化)が進行してしまうため収率が低下するが、上記程度の反応時間であれば、基質化合物を十分メラニン前駆体に変換できるとともに、メラニン化を最小限に抑えることができる。 The reaction may be either batch type or continuous type. The batch method is preferable in that the unreacted substrate and the product can be separated. In the case of a batch system, the reaction time is usually preferably about 10 minutes to 2 hours, more preferably about 30 minutes to 1 hour. If the reaction is carried out for too long, the polymerization reaction (melanization) of the produced melanin will proceed and the yield will decrease, but if the reaction time is as above, the substrate compound can be sufficiently converted into a melanin precursor. At the same time, melanization can be minimized.
連続式の場合は、酵母を含む反応容器に、基質化合物の濃度が10〜60 mM程度、特に15〜25 mM程度になるように基質を供給しつつ反応を行い、反応と生成物の分離を連続的に行えばよい。あるいは酵母を固定化した担体を充填したカラムに1〜10 mM程度、特に3〜6 mM程度になるような基質化合物を、電子供与体として基質の2倍濃度の過酸化水素とともに添加しても実施することができる。 In the case of a continuous type, the reaction is performed while supplying the substrate to a reaction vessel containing yeast so that the concentration of the substrate compound is about 10 to 60 mM, particularly about 15 to 25 mM, and the reaction and the product are separated. It may be performed continuously. Alternatively, a substrate compound of about 1 to 10 mM, particularly about 3 to 6 mM, may be added to a column packed with a carrier on which yeast is immobilized together with hydrogen peroxide having a concentration twice that of the substrate as an electron donor. Can be implemented.
基質化合物としてDOPAを用いる場合は、上記酵素反応により基質化合物が酸化されてドーパクロムが生成する。この反応を静置すれば酵母中に含まれるドーパクロムトートメラーゼにより、あるいは非酵素的な異性化によりドーパクロムから5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸が生成し、続いて脱炭酸により5,6-ジヒドロキシインドールが生成する。これにより、ドーパクロム、5,6-ジヒドロキシインドール及び5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸を含むメラニン前駆体が得られる。 When DOPA is used as the substrate compound, the substrate compound is oxidized by the above enzyme reaction to produce dopachrome. If this reaction is allowed to stand, 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid is produced from dopachrome by dopachrome tomerase contained in yeast or by non-enzymatic isomerization, followed by 5,5 by decarboxylation. 6-Dihydroxyindole is produced. Thus, a melanin precursor containing dopachrome, 5,6-dihydroxyindole and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid is obtained.
かくして得られる反応液(反応終了液)は、必要に応じて、酵母を除去する工程に供してもよい。ここで酵母の除去は遠心分離やろ過などの定法の固液分離法を用いて行うことが出来る。除去した酵母は、前述する酸化反応に再利用することができる。 The reaction solution (reaction completion solution) thus obtained may be subjected to a step of removing yeast, if necessary. Here, the yeast can be removed by a conventional solid-liquid separation method such as centrifugation or filtration. The removed yeast can be reused in the oxidation reaction described above.
なお、前述の方法で得られる反応終了液を保存しておく場合は、下記(i)〜(iii)の方法で保存することが好ましい。
(i)塩の存在下での保存
(ii)酸素非存在下pH３〜５、酸素非存在下pH５〜１０、又は酸素存在下pH５〜７に維持した状態での保存
(iii)水溶性有機溶媒の存在下での保存
かかる各保存は特開2000-158304号公報(特許文献１)の［0066］〜［0077］の記載に従って実施することが出来る。かかる条件で保存することにより保存時にメラニン前駆体が重合してメラニン化することを抑制することができる。酸化反応終了後は、酸化を防止するため、反応液は酸素を遮断した状態とするのが望ましい。
In addition, when the reaction completion liquid obtained by the above-mentioned method is preserve | saved, it is preferable to preserve | save by the method of following (i)-(iii).
(i) Storage in the presence of salt
(ii) Storage in a state maintained at pH 3-5 in the absence of oxygen, pH 5-10 in the absence of oxygen, or pH 5-7 in the presence of oxygen
(iii) Preservation in the Presence of Water-Soluble Organic Solvent Such preservation can be performed according to the description of [0066] to [0077] of JP-A-2000-158304 (Patent Document 1). By storing under such conditions, it is possible to suppress polymerization and melanization of the melanin precursor during storage. After the oxidation reaction is completed, it is desirable that the reaction solution is in a state of blocking oxygen in order to prevent oxidation.
・メラニン前駆体の回収工程
反応終了液には、通気及び撹拌により酵母が破損して生じたタンパク質又は酵母から流出したタンパク質が含まれている場合がある。従って、限外ろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等の公知の方法で除タンパクを行うことが好ましい。
-Melanin precursor recovery step The reaction end solution may contain proteins produced by the damage of the yeast by aeration and stirring or proteins that have flowed out of the yeast. Therefore, it is preferable to perform protein removal by a known method such as ultrafiltration or gel filtration chromatography.
また、反応終了液中には、通常メラニン前駆体の他にこれらが重合したメラニンも含まれる。従って、限外ろ過などの方法でメラニンを除去することが好ましい。 In addition, the reaction completion liquid usually contains melanin obtained by polymerization of these in addition to the melanin precursor. Therefore, it is preferable to remove melanin by a method such as ultrafiltration.
さらに、逆浸透濃縮、スプレードライ、凍結濃縮、減圧濃縮などの公知の方法で水分を除去してメラニン前駆体を濃縮することが好ましい。 Further, it is preferable to concentrate the melanin precursor by removing water by a known method such as reverse osmosis concentration, spray drying, freeze concentration, or vacuum concentration.
逆浸透濃縮装置は海水から純水を製造するのに用いられており、大量の溶液の処理が可能であることから、工業的にメラニン溶液を濃縮するのに適している。逆浸透濃縮装置にはバッチ型とクロスフロー型の2種類があるが、酸素が存在するとメラニン前駆体の化学的酸化が徐々に進んでしまうため、バッチ型を使用する場合は容器に空気が入らないように工夫することが望ましい。また圧力源となる窒素は出来る限り酸素含有量の少ないものを使用した方が良い。クロスフロー型装置は通常ポンプにより加圧するが、非透過液を循環させる必要があるので、あらかじめメラニン前駆体溶液を高純度窒素などにより置換し、液受けタンクも密閉型にすることが望ましい。 The reverse osmosis concentrator is used for producing pure water from seawater, and since it can process a large amount of solution, it is suitable for industrially concentrating a melanin solution. There are two types of reverse osmosis concentrators, the batch type and the cross flow type. When oxygen is present, the chemical oxidation of the melanin precursor gradually proceeds, so when using the batch type, air enters the container. It is desirable to devise so that there is no. Also, it is better to use nitrogen as a pressure source with as little oxygen content as possible. The cross-flow type apparatus is usually pressurized by a pump, but it is necessary to circulate the non-permeated liquid. Therefore, it is desirable to replace the melanin precursor solution with high-purity nitrogen in advance and to make the liquid receiving tank sealed.
回収工程では、メラニン前駆体溶液を密閉容器に入れ、又はさらに上部気体を窒素、希ガス、二酸化炭素ガス等で置換することにより、酸素を遮断することが好ましい。これにより、メラニン前駆体の酸化の進行を抑えることができ、所望の組成のメラニン前駆体とすることができる。 In the recovery step, it is preferable to shut off oxygen by placing the melanin precursor solution in a sealed container or further replacing the upper gas with nitrogen, rare gas, carbon dioxide gas or the like. Thereby, progress of the oxidation of a melanin precursor can be suppressed and it can be set as the melanin precursor of a desired composition.
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例及び試験例を挙げる。しかし、本発明はこれら実験例等になんら限定されるものではない。 Examples and test examples will be given below to explain the present invention in more detail. However, the present invention is not limited to these experimental examples.
試験例で使用した酵母の調製方法
１．使用菌株
下記の試験例１−３で使用した菌株とその原ホスト酵母の一覧を以下の表１に示す。
Preparation method of yeast used in test examples
1. Strains used in strain used in Test Example 1-3 described below and a list of the original host yeast in Table 1 below.
ホスト酵母の由来は次の通りである。 The origin of the host yeast is as follows.
・GRI-117U株：グルコース資化能力○／エタノール資化能力○
市販の「きょうかい9号」酵母に、EMS変異処理を施し、ウラシル要求性を付与した酵母である。
・ GRI-117U strain: Glucose utilization ability ○ / Ethanol utilization ability ○
It is yeast which gave uracil requirement by giving EMS mutation treatment to commercially available "Kyokai No. 9" yeast.
・GRI-117UK株：グルコース資化能力○／エタノール資化能力×
ウラシル要求性のGRI-117U株にEMS変異処理を施し、リジン要求性を付与した酵母である。
・ GRI-117UK strain: glucose utilization capacity ○ / ethanol utilization capacity ×
It is a yeast in which uracil-requiring GRI-117U strain has been subjected to EMS mutation treatment to give lysine-requiring requirements.
・GKT-1001株：グルコース資化能力○／エタノール資化能力○
ウラシル要求のGRI-117U株にジーンターゲッティングを施し、リジン要求性を付与した酵母である。
・ GKT-1001: Glucose utilization ability ○ / Ethanol utilization ability ○
A yeast that has been gene-targeted to the uracil-required GRI-117U strain to give lysine requirement.
EMS処理とジーンターゲッティングは以下に示すように行った。 EMS treatment and gene targeting were performed as follows.
・EMS処理 -GRI-117U,UK株の取得-
EMS処理は常法に従い行った。詳しくは、きょうかい9号を5 ml YPD培地に接種し、30℃で細胞濃度2×108 cells/mlまで増殖させ、2.5 mlを遠心集菌した。菌体を50 mMリン酸カルシウムバッファー（pH7.0）で2回洗浄し、10 mlの同じバッファーに懸濁した。この懸濁液に300μlのEMSを加え、激しく混合した後、30℃で30分振とうした。3 mlの10%チオ硫酸ナトリウムを加えよく混合し、その後遠心集菌し、滅菌水で2回洗浄した。洗浄菌体を細胞濃度2×105 cells/mlとなるように滅菌水にて希釈し、100〜200μlを5-FOA寒天培地にまいた。30℃にて5〜7日間静置し、ウラシル要求性を付与したGRI-117U株を取得した。
・ EMS processing -GRI-117U, UK stock acquisition-
EMS processing was performed according to a conventional method. Specifically, Kyoto 9 was inoculated into 5 ml YPD medium, grown at 30 ° C. to a cell concentration of 2 × 10 8 cells / ml, and 2.5 ml was collected by centrifugation. The cells were washed twice with 50 mM calcium phosphate buffer (pH 7.0) and suspended in 10 ml of the same buffer. 300 μl of EMS was added to this suspension and mixed vigorously, followed by shaking at 30 ° C. for 30 minutes. 3 ml of 10% sodium thiosulfate was added and mixed well, then the cells were collected by centrifugation and washed twice with sterile water. The washed cells were diluted with sterilized water to a cell concentration of 2 × 10 5 cells / ml, and 100-200 μl was spread on 5-FOA agar medium. GRI-117U strain | stump | stock which gave uracil requirement was acquired by leaving still at 30 degreeC for 5 to 7 days.
GRI-117Uを親株としてさらにEMS処理を行い、今度は 20 g/l ウラシルを含むα-AA寒天培地にまいた。30℃にて5〜7日間静置し、ウラシル要求性に加えてリジン要求性を付与したGRI-117UK株を取得した。 GRI-117U was used as the parent strain and further EMS treatment was performed, and this time it was spread on α-AA agar medium containing 20 g / l uracil. The strain was allowed to stand at 30 ° C. for 5 to 7 days to obtain GRI-117UK strain imparted with lysine requirement in addition to uracil requirement.
・ジーンターゲッティング -GKT-1001株の取得-
相同組換えに用いるDNA断片をジャンクションPCRで合成した。表２に示すプライマー（配列番号1〜8）を用い、酵母X21801A株ゲノムDNAをテンプレートとし、5’末端側の相同組換え配列としてLYS2（-250〜220）、ループアウト形成配列としてLYS2（1881〜2380）、マーカー遺伝子としてURA3マーカー、3’末端側の相同組換え配列としてLYS2（1381〜1880）の各DNA断片をPCRにて増幅した。これらの断片を精製後、各断片を混合して、1F（配列番号1）および4R（配列番号8）のプライマーを用いて2回目のPCRを行うことにより2,602 bpの遺伝子置換用DNA断片lys2-URA3を作製した。この断片で清酒酵母GRI-117-U（ウラシル要求性）を形質転換し、片方の染色体のLYS2がlys2-URA3に置換された株を得た。この株をYPDで3日間培養し、5-FOAプレートに塗布すると、1.0×10-4の頻度でコロニーが出現した。コロニーを形成する菌体は、染色体からURA3マーカー遺伝子が除去されたものである。5'- AAATACGCTGTCGCTTTGAGTGTATGGGCT -3'（配列番号9）及び5'-GACCTCACCTTGAGATGATCCACCCGATGA-3'（配列番号10）の２つのプライマーを用いて、コロニーから直接PCRを行い、増幅断片が2.6 kbと0.9 kbの２種類である株をLYS2遺伝子とマーカー遺伝子URA3とがループアウトにより脱落した株として選抜した。得られた株をLYS2へテロ破壊株GKT-1000とした。GKT-1000は、相同染色体の一方のみにLys2遺伝子を有する。このGKT-1000をYPDで3日間培養し、α-AAプレートに塗布すると、1.1×10-4の頻度でコロニーが出現した。出現したコロニーは、選択マーカーURA3がLOHにより消失し（ウラシル要求性を示し）、かつリジン要求性を示したため、これをLYS2ホモ破壊株GKT-1001とした。
-Gene targeting-Acquisition of GKT-1001 stock-
DNA fragments used for homologous recombination were synthesized by junction PCR. Using the primers (SEQ ID NOs: 1 to 8) shown in Table 2, using yeast X21801A strain genomic DNA as a template, LYS2 (-250 to 220) as a homologous recombination sequence on the 5 ′ end side, and LYS2 (1881) as a loopout forming sequence ˜2380), each DNA fragment of URA3 marker as a marker gene and LYS2 (1381 to 1880) as a 3 ′ terminal homologous recombination sequence was amplified by PCR. After purifying these fragments, the respective fragments are mixed and subjected to a second PCR using the 1F (SEQ ID NO: 1) and 4R (SEQ ID NO: 8) primers to obtain a 2,602 bp gene replacement DNA fragment lys2- URA3 was made. Sake yeast GRI-117-U (requiring uracil) was transformed with this fragment to obtain a strain in which LYS2 of one chromosome was replaced with lys2-URA3. When this strain was cultured in YPD for 3 days and applied to a 5-FOA plate, colonies appeared at a frequency of 1.0 × 10 −4 . The bacterial cells forming the colony are those obtained by removing the URA3 marker gene from the chromosome. PCR was performed directly from the colony using two
２．形質転換ベクターの調製
各形質転換ベクターの調製方法を以下に示す。
2. Preparation of transformation vector The preparation method of each transformation vector is shown below.
・チロシナーゼ遺伝子のコピー数が１つのウラシル要求性を相補するベクター
酵母ベクターpRS406（STRATAGENE社より販売）(GenBank Accession no.U03446)を基にして、発現プラスミド（pGEK11, 図２)を作製した。
-A vector in which the copy number of the tyrosinase gene complements one uracil requirement The expression plasmid (pGEK11, Fig. 2) was prepared based on the yeast vector pRS406 (sold by STRATAGENE) (GenBank Accession no. U03446).
・チロシナーゼ遺伝子のコピー数が３のウラシル要求性を相補するベクター
上記のプラスミド(pGEK11)を基にして、目的とする発現プラスミド(pGEK13, 図３)を作製した。
-A vector that complements the uracil requirement with a copy number of tyrosinase gene of 3 Based on the above plasmid (pGEK11), a target expression plasmid (pGEK13, Fig. 3) was prepared.
・リジン要求性を相補する遺伝子を染色体上のURA3遺伝子座位に導入するベクター
pRS406を基にして、目的とするプラスミド(pURA3-UTR, 図４)を作製した。
A vector that introduces a gene that complements lysine requirement into the URA3 locus on the chromosome
Based on pRS406, the target plasmid (pURA3-UTR, FIG. 4) was prepared.
・チロシナーゼ遺伝子のコピー数が８のウラシル要求性を相補するベクター
pRS406を基にして、目的とするプラスミド(pK199-8, 図５)を作製した。
A vector that complements the uracil requirement with a copy number of the tyrosinase gene of 8.
The target plasmid (pK199-8, FIG. 5) was prepared based on pRS406.
・リジン要求性を相補するベクター
pRS406を基にして、目的とするプラスミド(pAKK1, 図６)を作製した。
・ Vector complementing lysine requirement
The target plasmid (pAKK1, FIG. 6) was prepared based on pRS406.
３．形質転換の方法
プラスミドを制限酵素にて消化した後、常法どおり酢酸リチウム法(J. Bacteriol.,153: 163-168 (1983))にて宿主とする酵母に導入し、形質転換した。
3. Transformation Method After the plasmid was digested with a restriction enzyme, it was introduced into a yeast as a host by the lithium acetate method (J. Bacteriol., 153: 163-168 (1983)) as usual, and transformed.
尚、ウラシル要求性を相補する発現プラスミドを導入した形質転換体を取得する際は0.67％ Yeast nitrogen base w/o amino acids（Difco社）、0.077％ CSM-URA（MPBIO社）、及び2％グルコースを含むSD-U寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。リジン要求性を相補するプラスミドを導入した形質転換体を取得する際は0.67％ Yeast nitrogen base w/o amino acids（Difco社）、0.067％ CSM-LYS-URA（MPBIO社）、及び2％グルコースを含むSD-UK寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。 When obtaining a transformant introduced with an expression plasmid that complements uracil requirement, 0.67% Yeast nitrogen base w / o amino acids (Difco), 0.077% CSM-URA (MPBIO), and 2% glucose The yeast that had grown on the SD-U agar medium containing the yeast was selected. When obtaining a transformant introduced with a plasmid that complements lysine requirement, 0.67% Yeast nitrogen base w / o amino acids (Difco), 0.067% CSM-LYS-URA (MPBIO), and 2% glucose The yeast which grew after culture | cultivating on the SD-UK agar medium containing was selected.
各ホスト酵母の形質転換法を以下に示す。 The transformation method of each host yeast is shown below.
・TY1株：
酵母GRI-117Uを宿主として、StuI消化したpGEK11を導入した。
・ TY1 shares:
SGE digested pGEK11 was introduced using yeast GRI-117U as a host.
・TY2株：
酵母GRI-117Uを宿主として、StuI消化したpGEK13を導入した。
・ TY2 shares:
SGE digested pGEK13 was introduced using yeast GRI-117U as a host.
・TY3株：
酵母GRI-117UKを宿主として、StuI消化したpGEK13を導入した株で、ウラシル要求性を示さず、リジン要求性を示す。
・ TY3 shares:
A strain into which pGEK13 digested with StuI is introduced using yeast GRI-117UK as a host, and does not show uracil requirement but shows lysine requirement.
・TY6株：
酵母GKT-1001を宿主として、StuI消化したpK119-8を２倍体の一方の核のURA3座位に１コピー導入しTY5株を得た。このTY5株に、HpaI消化したpURA3-UTRを、TY5の２倍体のpK119-8を含まない他方の核のURA3座位に導入し、リジン要求性が回復した株としてTY5マーキング株を得た。TY5マーキング株に対して、YPD培地で培養した後、リジン要求性を選択するためにα-AAプレートへ塗布し、生育してきた酵母TY5-HOM株を選択した。TY5-HOM株は、TY5マーキング株のpK119-8が存在する一方のURA3座位が、TY5マーキング株のpURA3-UTRが存在する他方のURA3座位とLOHが生じて組み換えが起こり、リジン要求性が復帰したホモ型発現株として選択されたものである。さらに、TY5-HOM株を、stuI消化したpAKK1を導入してTY6株を取得した。TY6株は、ウラシル要求性を示さず、リジン要求性を示さない。
・ TY6 shares:
Using yeast GKT-1001 as a host, one copy of pK119-8 digested with StuI was introduced into the URA3 locus of one nucleus of the diploid to obtain a TY5 strain. To this TY5 strain, HURA-digested pURA3-UTR was introduced into the URA3 locus of the other nucleus not containing TY5 diploid pK119-8, and a TY5 marking strain was obtained as a strain in which lysine requirement was restored. After culturing in the YPD medium for the TY5 marking strain, it was applied to an α-AA plate to select the lysine requirement, and the growing yeast TY5-HOM strain was selected. In the TY5-HOM strain, one URA3 locus where the pK119-8 of the TY5 marking strain is present is recombined by LOH with the other URA3 locus where the pURA3-UTR of the TY5 marking strain is present, and the lysine requirement is restored. Selected as a homo-type expression strain. Furthermore, TY6-HOM strain was introduced into pAKK1 digested with stuI to obtain TY6 strain. The TY6 strain does not show uracil requirement and does not show lysine requirement.
チロシナーゼ活性測定
菌体のチロシナーゼ活性の測定は次のようにして行った。すなわち、回収した菌体の一部を水に懸濁し、その0.1 mlに対して30℃に保温しておいた10 mM L-DOPA（0.005Nの塩酸に溶解）0.8 ml及び1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)0.1 mlを添加し、30℃で5分間反応させた後、15,000 rpmで30秒間遠心分離を行うことにより菌体を取り除き、DOPAの吸収極大波長である475 nmにおける吸光度を測定した。菌体の懸濁量は、実験の便宜上、反応の後の反応液の475 nmにおける吸光度が0.1〜0.3に収まるように調整した。
Measurement of tyrosinase activity The tyrosinase activity of the bacterial cells was measured as follows. That is, 10 ml L-DOPA (dissolved in 0.005N hydrochloric acid) 0.8 ml and 1 M sodium phosphate, which was suspended in water and kept at 30 ° C for 0.1 ml After adding 0.1 ml of buffer solution (pH 6.0) and reacting at 30 ° C for 5 minutes, the cells were removed by centrifuging at 15,000 rpm for 30 seconds, and the absorbance at 475 nm, the maximum absorption wavelength of DOPA. Was measured. For the convenience of the experiment, the suspension amount of the bacterial cells was adjusted so that the absorbance at 475 nm of the reaction solution after the reaction was 0.1 to 0.3.
本発明において、チロシナーゼ活性(U/mg)は、菌体の湿重量1mg当たりのチロシナーゼの活性(U)として記載した。前記チロシナーゼの活性である１Uは0.8μmolのL-DOPAを含む溶液1 mlを30℃で5分間反応させた場合の475 nmにおける吸光度を１増加させる活性とした。 In the present invention, tyrosinase activity (U / mg) is described as tyrosinase activity (U) per 1 mg wet weight of the cells. The activity of the tyrosinase, 1 U, was defined as an activity that increases the absorbance at 475 nm by 1 when 1 ml of a solution containing 0.8 μmol of L-DOPA was reacted at 30 ° C. for 5 minutes.
グルコース濃度の測定方法
（株）アークレイファクトリー製、グルコース分析装置（アダムスグルコース GA-1152）により測定した。
Glucose concentration measurement method The glucose concentration was measured with a glucose analyzer (Adams Glucose GA-1152) manufactured by Arkray Factory.
エタノール濃度の測定方法
理研計器（株）製、簡易アルコール分析器（アルコメイトAL-3）により測定した。
Measurement Method of Ethanol Concentration It was measured with a simple alcohol analyzer (alcomate AL-3) manufactured by Riken Keiki Co., Ltd.
試験例1 各菌株の継代試験
YNB+2% グルコース平板培地、またはYPD+2% グルコース平板培地に種菌を植菌した（この株を初代とする）。コロニーが十分生育した数日後、任意のコロニーを1つ選び、次の平板培地に植菌した（この株を2代目とする）。同様に継代を繰り返した。
Test Example 1 Passage test of each strain
Inoculum was inoculated into YNB + 2% glucose plate medium or YPD + 2% glucose plate medium (this strain is the first). A few days after the colonies were sufficiently grown, one arbitrary colony was selected and inoculated into the following plate medium (this strain is the second generation). The passage was repeated in the same manner.
チロシナーゼ活性の測定は、各継代で共通の次の条件で実施した。 Tyrosinase activity was measured under the following conditions common to each passage.
平板培地のコロニーを、YNB+2% グルコース液体培地に植菌し、30℃で2日間培養し、得られた菌体の活性測定を行った。 A colony of a flat plate medium was inoculated into a YNB + 2% glucose liquid medium, cultured at 30 ° C. for 2 days, and the activity of the obtained bacterial cells was measured.
得られた結果を以下の表に示す。 The results obtained are shown in the table below.
上記結果から、TY6株は、１種類のベクターで形質転換されたTY1、TY2と比較してチロシナーゼ活性が高い上に、継代培養しても種々の条件で活性の低下が無いことが分かる。 From the above results, it can be seen that the TY6 strain has higher tyrosinase activity than TY1 and TY2 transformed with one kind of vector, and there is no decrease in activity under various conditions even when subcultured.
試験例2 TY2株とTY6株の培養試験
30 L培養槽に基本培地10 Lを入れ、以下の条件でTY2株とTY6株の培養試験を行った。
Test Example 2 Culture test of TY2 and TY6 strains
10 L of basic medium was placed in a 30 L culture tank, and TY2 and TY6 strains were cultured under the following conditions.
30 L培養槽用培地組成 Medium composition for 30 L culture tank
培養20時間〜28時間： 50%グルコースを50 mL/hでフィード
培養28時間〜44時間： 50%グルコースを150 mL/hでフィード
培養44時間〜52時間： 50%グルコースを300 mL/hでフィード
培養52時間〜68時間： 50%グルコースを150 mL/hでフィード
培養の結果を図７に示す。図７に示されているように、TY6株を１種類のベクターで形質転換されたTY2株と同じ条件の培養を行った場合、TY6株とTY2株で増殖性能に顕著な差は認められない。
Cultivation 20 to 28 hours: 50% glucose fed at 50 mL / h Cultivation 28 to 44 hours: 50% glucose fed at 150 mL / h 44 to 52 hours: 50% glucose at 300 mL / h Feed culture 52 hours to 68 hours: FIG. 7 shows the results of feed culture of 50% glucose at 150 mL / h. As shown in FIG. 7, when the TY6 strain was cultured under the same conditions as the TY2 strain transformed with one type of vector, no significant difference in growth performance was observed between the TY6 strain and the TY2 strain. .
試験例3 TY3株の培養試験
10L培養槽に基本培地3 L入れ、培養試験を行った。ただし、TY3株はエタノール資化能力を欠損していることがわかっていたため、グルコース蓄積を避けるため、指数的にグルコースのフィード速度変化させた（グルコース濃度が高いと、エタノール蓄積することが知られている）。
Test Example 3 Culture test of TY3 strain
3 L of basic medium was placed in a 10 L culture tank and a culture test was conducted. However, since the TY3 strain was known to lack ethanol utilization, the glucose feed rate was changed exponentially to avoid glucose accumulation (it is known that ethanol accumulation occurs at high glucose concentrations. ing).
培養の結果を図８及び図９に示す。 The culture results are shown in FIGS.
グルコースのフィード速度変化を変化させた結果、グルコースは常時低濃度に抑えることができたが、エタノールの蓄積は回避できなかった(図８)。 As a result of changing the change in the feed rate of glucose, glucose could always be kept at a low concentration, but ethanol accumulation could not be avoided (FIG. 8).
また、TY2株やTY6株は図７に示すように増殖能を示すOD600が250以上であったが、TY3株はOD600が100以下であり、菌体収量が大幅に低いことが分かる(図９)。 Further, as shown in FIG. 7, the TY2 strain and the TY6 strain had an OD600 of 250 or more indicating the growth ability, but the TY3 strain had an OD600 of 100 or less, and the cell yield was significantly low (FIG. 9). ).
この培養特性から、TY3株は工業利用に適さないことがわかる。 This culture characteristic shows that the TY3 strain is not suitable for industrial use.
結果
上記試験例１−３の結果をまとめると以下の表５のようになる。
Results The results of Test Example 1-3 are summarized as shown in Table 5 below.
a)OD600>250を高濃度培養が可能、OD600≦250を高濃度培養が不可能とした。
b) チロシナーゼ活性は初代活性のものである。
c) すべての培養条件で活性残存数が90%以上の場合を極めて良好、80%以上の場合を良好、一つでも活性残存数が70%未満の場合を悪いとした。
a) High concentration culture was possible when OD600> 250, and high concentration culture was impossible when OD600 ≦ 250.
b) Tyrosinase activity is of primary activity.
c) In all the culture conditions, the case where the remaining number of activities was 90% or more was considered to be very good, the case where it was 80% or more was determined to be good, and the case where even one remaining number of activities was less than 70% was determined to be bad.
尚、TY1株、TY2株及びTY6株は、いずれも同程度の生育性能を示し、菌体湿重量当たりのタンパク量も同程度である。 The TY1 strain, TY2 strain, and TY6 strain all show comparable growth performance, and the protein amount per wet cell weight is also similar.
各酵母の特徴は以下の通りである。 The characteristics of each yeast are as follows.
・TY1株：
melB遺伝子のコピー数が1コピーであるベクターを用いて形質転換を行うことにより作製した特開2006-158304号公報で開示された菌株である。
・ TY1 shares:
This strain is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-158304, which was prepared by performing transformation using a vector having a copy number of the melB gene of 1 copy.
・TY2株：
染色体に組み込むmelB遺伝子のコピー数を３に増加することにより、活性の高いTY2株を作製した。TY2株は、継代培養によりチロシナーゼ活性が低下する欠点を持っていた。
・ TY2 shares:
By increasing the copy number of the melB gene incorporated into the chromosome to 3, a highly active TY2 strain was prepared. The TY2 strain had the disadvantage that tyrosinase activity was reduced by subculture.
・TY3株：
EMS処理によりウラシル要求性とリジン要求性を付与した酵母はエタノール資化能力を失っており、これにmelB遺伝子を組み込んだTY3株は高濃度培養ができなかった。
・ TY3 shares:
Yeast with uracil requirement and lysine requirement by EMS treatment lost ethanol-utilizing ability, and TY3 strain into which melB gene was incorporated could not be cultured at high concentration.
・TY6株：
栄養要求性マーカーを２つ持ちエタノール資化できる株にmelB遺伝子を組み込んだTY6株について、培養試験と活性確認を行った。その結果、TY6株は高活性で、且つ、継代によりチロシナーゼ活性が低下せず、高濃度培養が可能であるという優れた特徴を持つ。
・ TY6 shares:
A culture test and activity confirmation were carried out for the TY6 strain in which the melB gene was incorporated into a strain that had two auxotrophic markers and was capable of assimilating ethanol. As a result, the TY6 strain has an excellent feature that it is highly active, and does not decrease tyrosinase activity by passage, and can be cultured at a high concentration.
以上の結果を総括すると、本発明に係る酵母であるTY6株は、高いチロシナーゼ活性を有し、更に継代により活性が低下せず、また高濃度培養も可能であるためメラニンの工業的生産も可能である。この結果から、本発明による変異処理の次にジーンターゲッティングを施した宿主酵母を使用することで、チロシナーゼ遺伝子のコピー数に関わらず、形質転換された酵母は継代培養によりチロシナーゼ活性が低下せず、高濃度培養も可能という効果を有することが分かる。これに対して、ウラシル要求性変異のみを有する酵母をチロシナーゼ遺伝子を複数コピー有するベクターで形質転換したTY2株は継代することで活性が低下する。また、変異処理によりウラシル要求性とリジン要求性変異を付与された酵母を１種類のベクターで形質転換したTY3株は、高濃度培養を行うことができない。 Summarizing the above results, the strain TY6, which is a yeast according to the present invention, has high tyrosinase activity, does not decrease in activity due to passage, and can be cultured at high concentration, so that industrial production of melanin is also possible. Is possible. From this result, by using the host yeast that was subjected to gene targeting after the mutation treatment according to the present invention, the transformed yeast was not reduced in tyrosinase activity by subculture regardless of the copy number of the tyrosinase gene. It can be seen that the high concentration culture is effective. On the other hand, the activity of the TY2 strain obtained by transforming yeast having only a uracil-requiring mutation with a vector having a plurality of copies of the tyrosinase gene is reduced. Moreover, the TY3 strain obtained by transforming yeast to which a uracil-requiring mutation and a lysine-requiring mutation have been transformed with a single vector cannot be cultured at a high concentration.
Claims (6)
(A) 清酒酵母に変異処理を施しウラシル要求性を付与する工程、
(B) 工程Aで得られた酵母にジーンターゲッティングを施し、リジン要求性を付与する工程、
(C) 工程Bで得られた酵母を、コピー数が３〜８のチロシナーゼ遺伝子を含みウラシル要求性を相補する形質転換ベクターにより相同組換えによりURA3座位に形質転換する工程、
(D) 工程Cで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより工程Cで形質転換ベクターを形質転換したURA3座位と対のURA3座位に相同組換えにより形質転換する工程、及び
(E) 工程Dで得られた酵母からリジン要求性が生じたホモ型発現株を選択する工程。 Yeast in which a tyrosinase gene produced by a method including the following steps A to E is integrated into a chromosome:
(A) A process of giving a uracil requirement by subjecting sake yeast to mutation treatment,
(B) subjecting the yeast obtained in step A to gene targeting and imparting lysine requirement,
(C) transforming the yeast obtained in step B into the URA3 locus by homologous recombination with a transformation vector containing a tyrosinase gene having a copy number of 3 to 8 and complementing uracil requirement,
(D) transforming the yeast obtained in step C by homologous recombination into the URA3 locus paired with the URA3 locus transformed with the transformation vector in step C with a transformation vector that complements lysine requirement; and
(E) A step of selecting a homo-type expression strain having lysine requirement from the yeast obtained in step D.
(F) 工程Eで得られた酵母を、リジン要求性を相補する形質転換ベクターにより形質転換する工程。 Furthermore, the yeast of Claim 1 manufactured by the method containing the following processes F:
(F) A step of transforming the yeast obtained in step E with a transformation vector that complements lysine requirement.
反応液からメラニン前駆体を回収する回収工程と
を含むメラニン前駆体の製造方法。 In the reaction solution, in the presence of the yeast according to any one of claims 1 to 4 , DOPA (3- (3,4-dihydroxyphenyl) alanine), dopamine, DOPA methyl ester, DOPA ethyl ester and α An oxidation step of oxidizing at least one substrate compound selected from the group consisting of methyl DOPA to convert it into a melanin precursor;
The manufacturing method of a melanin precursor including the collection | recovery process which collect | recovers a melanin precursor from a reaction liquid.
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