JP5511268B2 - Melanin precursor-containing solution and method for producing the same - Google Patents
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Description
本発明はメラニン前駆体含有溶液、及び当該メラニン前駆体含有溶液の製造方法に関する。 The present invention relates to a melanin precursor-containing solution and a method for producing the melanin precursor-containing solution.
メラニンは、動物及び植物に広く存在する黄色〜黒色の色素であり、紫外線吸収機能、ラジカル捕捉機能、酸化防止機能などを有することが知られている。メラニンは、生体由来の物質であり安全性が高いことから、化粧品、食品等の添加剤として広く使用されている。 Melanin is a yellow to black pigment widely present in animals and plants, and is known to have an ultraviolet absorption function, a radical scavenging function, an antioxidant function, and the like. Melanin is widely used as an additive for cosmetics, foods and the like because it is a biologically derived substance and has high safety.
例えば、メラニンは、日焼け防止クリーム、サングラス等に配合することにより、これらに紫外線吸収機能を持たせるために用いられている。また、食品やプラスティックの酸化防止剤としても使用されている。さらに、色素として白髪染めなどにも添加されている。 For example, melanin is used in order to give an ultraviolet absorbing function to sunscreen creams, sunglasses and the like. It is also used as an antioxidant for foods and plastics. Furthermore, it is also added to white hair dyeing as a pigment.
このように、メラニンは非常に有益な物質であるため、その製造方法が種々検討されてきた。 Thus, since melanin is a very useful substance, the manufacturing method has been variously examined.
図１に示すように、生体内において、メラニンは、メラニン生成酵素であるチロシナーゼが、基質化合物である3-（3,4-ジヒドロキシフェニル）アラニン（DOPA）の酸化を触媒することによりドーパキノンを経て生成するメラニン前駆体(ドーパクロム、5,6-ジヒドロキシインドール、5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸など)が重合することにより生合成される。このようにして生成するメラニンは、皮膚や髪等のメラニン産生細胞内に小粒となって存在しており、水に不溶で、熱濃硫酸や強アルカリを用いなければ溶解しない高分子化合物である。 As shown in FIG. 1, in vivo, melanin passes through dopaquinone by catalyzing the oxidation of 3- (3,4-dihydroxyphenyl) alanine (DOPA), which is a substrate compound, by tyrosinase, which is a melanin producing enzyme. The resulting melanin precursor (dopachrome, 5,6-dihydroxyindole, 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, etc.) is biosynthesized by polymerization. Melanin produced in this way is a high molecular compound that exists as small particles in melanin-producing cells such as skin and hair, is insoluble in water, and does not dissolve unless hot concentrated sulfuric acid or strong alkali is used. .
このように、メラニンは水に不溶であるため、繊維や皮革などの染料として利用する場合、組織に浸透することができず、対象を染めることができない。 Thus, since melanin is insoluble in water, when it is used as a dye for fibers, leather, etc., it cannot penetrate into tissues and cannot dye an object.
特許文献１には、水溶性であるメラニン前駆体(メラニンの構成モノマーの混合物)の効率的な製造方法が開示されている。具体的には、特許文献１には、チロシン、DOPA及びこれらの類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の基質化合物を、カテコールオキシダーゼ活性を示す細胞を用いて酸化して、メラニン前駆体に変換する酸化工程と、得られた反応液からメラニン前駆体を回収する回収工程とを含むメラニン前駆体の製造方法が開示されている。 Patent Document 1 discloses an efficient method for producing a water-soluble melanin precursor (a mixture of constituent monomers of melanin). Specifically, Patent Document 1 discloses that at least one substrate compound selected from the group consisting of tyrosine, DOPA and analogs thereof is oxidized using a cell exhibiting catechol oxidase activity to form a melanin precursor. The manufacturing method of the melanin precursor including the oxidation process to convert and the collection | recovery process of collect | recovering a melanin precursor from the obtained reaction liquid is disclosed.
かくして調製されるメラニン前駆体は水溶性であるため、染色対象物に浸透しやすく、メラニン前駆体を染色対象物内に浸透させた後に重合させてメラニンを生成することにより効率良く対象物を染色することができる。 Since the melanin precursor thus prepared is water-soluble, it easily penetrates into the object to be dyed, and after the melanin precursor has penetrated into the object to be dyed, it is polymerized to produce melanin efficiently. can do.
しかしながら、特許文献１では、上記製造方法により製造されたメラニン前駆体含有溶液の純度に関する検討はなされてない。 However, in patent document 1, examination regarding the purity of the melanin precursor containing solution manufactured by the said manufacturing method is not made | formed.
メラニン前駆体含有溶液を染料溶液として用いる場合、メラニン前駆体含有溶液に含まれる5,6-ジヒドロキシインドール以外の不揮発成分の割合が高いと結晶が生成する上、染料溶液の色合いが濃くなる。そのため、これらの量が少ないほど染料溶液としての商品価値が高くなる。 When the melanin precursor-containing solution is used as the dye solution, crystals are generated and the color of the dye solution becomes dark when the proportion of non-volatile components other than 5,6-dihydroxyindole contained in the melanin precursor-containing solution is high. Therefore, the smaller the amount, the higher the commercial value of the dye solution.
メラニン前駆体含有溶液に含まれる5,6-ジヒドロキシインドールは安全性に関する公開情報（Opinion of The Scientific Committee on Cosmetic Products and Non-Food Products Intended for Consumers (SCCNFP) 18 Mar 2003）があるものの、5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸は公開情報が存在しないため、多量に含有していると安全上のリスク要因となりうる。すなわち、5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸は5,6-ジヒドロキシインドールに対して、低濃度で安定的に管理されることが望ましい。 Although 5,6-dihydroxyindole contained in the melanin precursor-containing solution has public information on safety (Opinion of the Scientific Committee on Cosmetic Products and Non-Food Products Intended for Consumers (SCCNFP) 18 Mar 2003), Since 6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid has no public information, it can be a risk factor for safety if contained in large amounts. That is, it is desirable that 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid is stably managed at a low concentration relative to 5,6-dihydroxyindole.
本発明は、メラニン前駆体含有溶液の製造において不揮発成分重量に占める5,6-ジヒドロキシインドール以外の成分の重量を減少させ、且つ5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸の含有割合を減少させることが出来る方法を特徴とする、メラニン前駆体含有溶液の製造方法を提供することを目的とする。 The present invention reduces the weight of components other than 5,6-dihydroxyindole in the weight of nonvolatile components in the production of the melanin precursor-containing solution, and reduces the content of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid It aims at providing the manufacturing method of the melanin precursor containing solution characterized by the method which can be performed.
また、不揮発成分重量に占める5,6-ジヒドロキシインドール以外の成分の重量、及び5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸の含有割合が低いメラニン前駆体含有溶液を提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide a melanin precursor-containing solution in which the weight of components other than 5,6-dihydroxyindole and the content of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid in the nonvolatile component weight is low.
本発明者らは、DOPAをはじめとする基質化合物を非溶解状態で含む混合物を原料として、酸素の存在下で反応させてメラニン前駆体を生成することにより、基質化合物を酸を用いて溶解させた後、反応させるという特許文献1に記載の方法に比べて、5,6-ジヒドロキシインドール以外の不揮発成分の割合を減少させることができるという知見を得た。このことは、メラニン前駆体含有溶液を配合した染料溶液において結晶の生成を防止すると共に、その染料溶液の色合いを薄くする効果がある。 The present inventors use a mixture containing DOPA and other substrate compounds in an undissolved state as a raw material to react in the presence of oxygen to produce a melanin precursor, thereby dissolving the substrate compound using an acid. After that, it was found that the proportion of non-volatile components other than 5,6-dihydroxyindole can be reduced as compared with the method described in Patent Document 1 in which the reaction is performed. This has the effect of preventing the formation of crystals in the dye solution containing the melanin precursor-containing solution and reducing the color of the dye solution.
また、反応に使用する微生物懸濁液又は酸化酵素溶液の電気伝導度を0.8 mS/cm以下に調整することにより、メラニン前駆体含有溶液の5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸の含有割合を減少させることができるという知見を得た。このことは、メラニン前駆体含有溶液を配合した染料溶液を、例えば染毛剤等の用途で人が使用する場合の安全上のリスクを下げる効果がある。 In addition, by adjusting the electrical conductivity of the microbial suspension or oxidase solution used for the reaction to 0.8 mS / cm or less, the content ratio of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid in the melanin precursor-containing solution The knowledge that can be reduced. This has the effect of lowering the safety risk when a person uses the dye solution containing the melanin precursor-containing solution in applications such as hair dyes.
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、下記に説明する(I)メラニン前駆体含有溶液、(II)メラニン前駆体含有溶液の製造方法、(III)5,6-ジヒドロキシインドール以外の不揮発成分の割合を低減させる方法及び(IV)5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸の量を低減させる方法を提供すものである。 The present invention has been completed based on these findings, and has been completed. (I) A melanin precursor-containing solution, (II) a method for producing a melanin precursor-containing solution, and (III) 5 The present invention provides a method for reducing the proportion of non-volatile components other than 6-dihydroxyindole and (IV) a method for reducing the amount of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid.
(I)メラニン前駆体含有溶液
(I-1) 以下の(1)及び(2)の特徴を有するメラニン前駆体含有溶液：
(1)HPLC分析における5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸のピーク面積が、5,6-ジヒドロキシインドールのピーク面積の10%以下、
(2)不揮発成分重量に占める5,6-ジヒドロキシインドール以外の成分の重量が70重量%未満。
(I-2) (I-1)に記載のメラニン前駆体含有溶液を配合した染料溶液。
(I) Melanin precursor-containing solution
(I-1) Melanin precursor-containing solution having the following characteristics (1) and (2):
(1) The peak area of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid in HPLC analysis is 10% or less of the peak area of 5,6-dihydroxyindole,
(2) The weight of components other than 5,6-dihydroxyindole in the non-volatile component weight is less than 70% by weight.
(I-2) A dye solution containing the melanin precursor-containing solution described in (I-1).
(II)メラニン前駆体含有溶液の製造方法
(II-1) 水、酸化酵素を産生し得る微生物又は酸化酵素、並びにDOPA及びDOPAの類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の基質化合物を非溶解状態で含む混合物を酸素の存在下で反応させてメラニン前駆体を生成することを特徴とする、(I-1)に記載のメラニン前駆体含有溶液の製造方法。
(II-2) 前記水がイオン交換水である、(II-1)に記載の製造方法。
(II-3) 前記混合物が水、酸化酵素を産生し得る微生物懸濁液又は酸化酵素溶液、並びにDOPA及びDOPAの類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の基質化合物を混合して調製されるものであって、微生物懸濁液又は酸化酵素溶液の電気伝導度が0.8 mS/cm以下に調整されてなるものであることを特徴とする、(II-1)又は(II-2)に記載の製造方法。
(II-4) 前記酸化酵素がカテコールオキシダーゼ活性を有する酵素である、(II-1)〜(II-3)のいずれか一項に記載の製造方法。
(II-5) 前記カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素がチロシナーゼである、(II-4)に記載の製造方法。
(II-6) 前記微生物が酵母である、(II-1)〜(II-5) のいずれか一項に記載の製造方法。
(II) Method for producing melanin precursor-containing solution
(II-1) a mixture containing at least one substrate compound selected from the group consisting of water, a microorganism capable of producing an oxidase or an oxidase, and DOPA and an analog of DOPA in an undissolved state in the presence of oxygen The method for producing a melanin precursor-containing solution according to (I-1), wherein a melanin precursor is produced by reaction.
(II-2) The production method according to (II-1), wherein the water is ion-exchanged water.
(II-3) The mixture is prepared by mixing at least one substrate compound selected from the group consisting of water, a microorganism suspension or oxidase solution capable of producing oxidase, and DOPA and DOPA analogs. (II-1) or (II-2), wherein the electrical conductivity of the microbial suspension or oxidase solution is adjusted to 0.8 mS / cm or less. The manufacturing method as described.
(II-4) The production method according to any one of (II-1) to (II-3), wherein the oxidase is an enzyme having catechol oxidase activity.
(II-5) The production method according to (II-4), wherein the enzyme having catechol oxidase activity is tyrosinase.
(II-6) The production method according to any one of (II-1) to (II-5), wherein the microorganism is yeast.
(III)5,6-ジヒドロキシインドール以外の不揮発成分を低減させる方法
(III-1) 水、酸化酵素を産生し得る微生物又は酸化酵素、並びにDOPA及びDOPAの類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の基質化合物の混合物を、酸素の存在下で反応させてメラニン前駆体を生成する、メラニン前駆体含有溶液の製造において、当該混合物中に基質化合物が非溶解状態になるように調製することを特徴とする、メラニン前駆体含有溶液中の5,6-ジヒドロキシインドール以外の不揮発成分を低減させる方法。
(III-2) 前記酸化酵素がカテコールオキシダーゼ活性を有する酵素である、 (III-1)に記載の方法。
(III-3) 前記カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素がチロシナーゼである(III-2)に記載の方法。
(III-4) 前記微生物が酵母である、(III-1)〜(III-3) のいずれか一項に記載の方法。
(III) Method for reducing non-volatile components other than 5,6-dihydroxyindole
(III-1) Melanin is produced by reacting water, a microorganism capable of producing oxidase or an oxidase, and a mixture of at least one substrate compound selected from the group consisting of DOPA and DOPA analogs in the presence of oxygen. 5,6-dihydroxyindole in a melanin precursor-containing solution, characterized in that, in the production of a melanin precursor-containing solution that produces a precursor, the substrate compound is prepared in an undissolved state in the mixture. A method for reducing non-volatile components other than the above.
(III-2) The method according to (III-1), wherein the oxidase is an enzyme having catechol oxidase activity.
(III-3) The method according to (III-2), wherein the enzyme having catechol oxidase activity is tyrosinase.
(III-4) The method according to any one of (III-1) to (III-3), wherein the microorganism is yeast.
(IV)5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸の量を低減させる方法
(IV-I) 水、酸化酵素を産生し得る微生物又は酸化酵素、並びにDOPA及びDOPAの類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の基質化合物の混合物を、酸素の存在下で反応させてメラニン前駆体を生成する、メラニン前駆体含有溶液の製造において、当該溶液に含まれる5,6-ジヒドロキシインドールに対する5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸の量を低減させる方法であって、当該混合物が水、酸化酵素を産生し得る微生物懸濁液又は酸化酵素溶液、並びに基質化合物を混合して調製される、基質化合物を非溶解状態で含むものであり、微生物懸濁液又は酸化酵素溶液の電気伝導度を0.8 mS/cm以下に調整することを特徴とする方法。
(IV-2) 前記酸化酵素がカテコールオキシダーゼ活性を有する酵素である、(IV-1)に記載の方法。
(IV-3) 前記カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素がチロシナーゼである、(IV-2)に記載の方法。
(IV-4) 前記微生物が酵母である、(IV-1)〜(IV-3)のいずれか一項に記載の方法。
(IV) Method for reducing the amount of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid
(IV-I) A mixture of at least one substrate compound selected from the group consisting of water, a microorganism capable of producing an oxidase or an oxidase, and DOPA and an analog of DOPA, is reacted with melanin in the presence of oxygen. A method for reducing the amount of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid relative to 5,6-dihydroxyindole contained in the solution in the production of a melanin precursor-containing solution for producing a precursor, the mixture Is prepared by mixing water, a microbial suspension or oxidase solution capable of producing oxidase, and a substrate compound, in a non-dissolved state. Adjusting the electrical conductivity to 0.8 mS / cm or less.
(IV-2) The method according to (IV-1), wherein the oxidase is an enzyme having catechol oxidase activity.
(IV-3) The method according to (IV-2), wherein the enzyme having catechol oxidase activity is tyrosinase.
(IV-4) The method according to any one of (IV-1) to (IV-3), wherein the microorganism is yeast.
本発明により、5,6-ジヒドロキシインドール以外の不揮発成分の割合を減少させ、且つ5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸含有割合を減少させたメラニン前駆体含有溶液を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a melanin precursor-containing solution in which the proportion of non-volatile components other than 5,6-dihydroxyindole is reduced and the content of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid is reduced.
本発明のメラニン前駆体含有溶液は、5,6-ジヒドロキシインドール以外の不揮発成分(大半が無機塩類及び水溶性メラニンオリゴマー)の割合が減少しているため二つの効果がある。一つは、メラニン前駆体含有溶液を配合した染料溶液において結晶の生成を防止すると共に、その染料溶液の色合いを薄くする効果がある。染料溶液の色合いは、濃くても薄くてもその染色性能に影響しないが、薄色の染料溶液が空気中に出した際、数分で進行するメラニン重合反応のため急速に黒色に変化する様子は、例えば染毛剤として使用した場合、使用者が目で見た色の変化に驚き、商品特性を使用者に印象付けることができる。 The melanin precursor-containing solution of the present invention has two effects because the proportion of non-volatile components (mostly inorganic salts and water-soluble melanin oligomers) other than 5,6-dihydroxyindole is reduced. One is the effect of preventing the formation of crystals in the dye solution containing the melanin precursor-containing solution and reducing the color of the dye solution. The color of the dye solution, whether it is dark or light, does not affect the dyeing performance, but when the light dye solution is exposed to the air, it rapidly turns black due to the melanin polymerization reaction that takes several minutes. For example, when used as a hair dye, the user can be surprised by the color change visually seen by the user and impress the product characteristics on the user.
また、本発明のメラニン前駆体含有溶液は、安全性に関する公開情報のない5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸含有割合が減少しているため、安全上のリスクが少ない。 In addition, the melanin precursor-containing solution of the present invention has a low safety risk because the content of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, which has no public information on safety, is reduced.
本発明の製造方法では、基質化合物を非溶解状態で反応させるため、基質化合物を溶解する硫酸配合工程が不要である。また、DOPA等の基質化合物を溶解する必要がないため、基質化合物の添加量の上限が制限されず、メラニン前駆体生成量を増加させることができる。 In the production method of the present invention, since the substrate compound is reacted in an undissolved state, a sulfuric acid blending step for dissolving the substrate compound is unnecessary. In addition, since it is not necessary to dissolve a substrate compound such as DOPA, the upper limit of the amount of the substrate compound added is not limited, and the amount of melanin precursor production can be increased.
以下、本発明のメラニン前駆体含有溶液及び当該メラニン前駆体含有溶液の製造方法について詳細に説明する。 Hereinafter, the melanin precursor-containing solution of the present invention and the method for producing the melanin precursor-containing solution will be described in detail.
メラニン前駆体含有溶液
本発明のメラニン前駆体含有溶液は、
(1)HPLC分析における5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸のピーク面積が、5,6-ジヒドロキシインドールのピーク面積の10%以下、
(2) 不揮発成分重量に占める5,6-ジヒドロキシインドール以外の重量が70重量%未満、
であることを特徴とする。
Melanin precursor-containing solution The melanin precursor-containing solution of the present invention is
(1) The peak area of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid in HPLC analysis is 10% or less of the peak area of 5,6-dihydroxyindole,
(2) The weight other than 5,6-dihydroxyindole in the nonvolatile component weight is less than 70% by weight,
It is characterized by being.
ここで、メラニン前駆体としては、メラニンの構成モノマー、例えばドーパクロム、5,6-ジヒドロキシインドール、5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸、並びにこれらのモノマーが2〜5分子程度重合してなる水溶性オリゴマーを挙げることが出来る。本発明のメラニン前駆体含有溶液とはこれらのメラニン前駆体のうち少なくとも5,6-ジヒドロキシインドール及び5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸を含むものであり、その限りにおいて他のメラニン前駆体を任意に含むものであってもよい。また、メラニン前駆体含有溶液には、後述する製造方法によって得られるものも含まれる。メラニン前駆体含有溶液の溶媒は、水、極性溶媒又はこれらの混合物であって、極性溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、酢酸、アンモニア等が挙げられる。 Here, as the melanin precursor, melanin constituent monomers such as dopachrome, 5,6-dihydroxyindole, 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, and these monomers are polymerized in about 2 to 5 molecules. A water-soluble oligomer can be mentioned. The melanin precursor-containing solution of the present invention contains at least 5,6-dihydroxyindole and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid among these melanin precursors, as long as other melanin precursors are included. May be optionally included. Moreover, what is obtained by the manufacturing method mentioned later is also contained in a melanin precursor containing solution. The solvent of the melanin precursor-containing solution is water, a polar solvent, or a mixture thereof, and examples of the polar solvent include methanol, ethanol, propanol, acetic acid, ammonia, and the like.
メラニン前駆体含有溶液中のメラニン前駆体の濃度は、反応系に添加した基質濃度に依存する。反応系に添加する基質濃度は任意であるが、低濃度の場合は染色効果を得るために染料溶液に配合する際に高倍率の濃縮を要するため経済的に不利であり、高濃度の場合は基質からメラニン前駆体へ至る反応変換率が低下するため、同じく経済的に不利である。反応系中の好ましい基質濃度は10〜60 mMで、より好ましくは15〜40 mM である。 The concentration of the melanin precursor in the melanin precursor-containing solution depends on the substrate concentration added to the reaction system. The substrate concentration to be added to the reaction system is arbitrary, but in the case of a low concentration, it is economically disadvantageous because it requires concentration at a high magnification when blended into a dye solution in order to obtain a dyeing effect. It is also economically disadvantageous because the reaction conversion rate from the substrate to the melanin precursor is reduced. A preferable substrate concentration in the reaction system is 10 to 60 mM, more preferably 15 to 40 mM.
・(1)について
本発明のメラニン前駆体含有溶液は、HPLC分析における5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸のピーク面積が、5,6-ジヒドロキシインドールのピーク面積の10%以下であることを特徴とし、この範囲であれば安全上のリスクが少ない。好ましくは6%以下、より好ましくは0.1〜3%である。
About (1) In the melanin precursor-containing solution of the present invention, the peak area of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid in HPLC analysis is 10% or less of the peak area of 5,6-dihydroxyindole In this range, there are few safety risks. Preferably it is 6% or less, More preferably, it is 0.1-3%.
「5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸のピーク面積が、5,6-ジヒドロキシインドールのピーク面積のX%以下」とは、HPLC(高性能液体クロマトグラフィー)分析において、5,6-ジヒドロキシインドールのピーク面積＝A、5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸のピーク面積＝Bとしたとき、100×B／AがX以下になることをいう。尚、本明細書において、このX(%)を5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸含有割合としている。 "The peak area of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid is less than X% of the peak area of 5,6-dihydroxyindole" means that in HPLC (high performance liquid chromatography) analysis, 5,6-dihydroxy When the peak area of indole = A and the peak area of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid = B, 100 × B / A is X or less. In the present specification, this X (%) is the content ratio of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid.
5,6-ジヒドロキシインドール及び5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸のHPLC分析は以下のようにして行うことができる。
（１）試験液の処理
50 ml容メスフラスコに1%(w/v)のアスコルビン酸ナトリウムを含む0.1%(w/v)リン酸溶液を10 ml分注する。ここに試験液1.0 gを秤量して入れた後0.1%(w/v)リン酸溶液で50 ml標線までメスアップする。
（２）HPLC分析
斯くして調製した試験液の遠心上清を下記条件のHPLCに供し、5,6-ジヒドロキシインドールおよび5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸のピーク面積を求める。
HPLC装置：Waters社製HPLC Alliance2695-2996
カラム：Waters社製SunfireC18（4.6×150 mm）
移動相：A液−1.5%(w/v)リン酸溶液、Ｂ液−99.9%メタノール（Ｂ液が初発0%、5分後に50%となるようにグラジエントを設定）
試験液注入量：10μl
流速：1.0 ml/min
検出：極大吸収波長である280 nmにおける吸光度でモニター
メラニン前駆体含有溶液中の5,6-ジヒドロキシインドールの濃度は、反応系に添加した基質濃度に依存するため、基質濃度を40 mMとした場合を例示すると、好ましくは10〜30 mMであり、より好ましくは15〜25 mM程度であり、更に好ましくは17〜20 mM程度である。
HPLC analysis of 5,6-dihydroxyindole and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid can be performed as follows.
(1) Test solution treatment
Dispense 10 ml of 0.1% (w / v) phosphoric acid solution containing 1% (w / v) sodium ascorbate into a 50 ml volumetric flask. After weighing 1.0 g of the test solution into this, the volume is made up to the 50 ml mark with 0.1% (w / v) phosphoric acid solution.
(2) HPLC analysis The centrifugal supernatant of the test solution thus prepared is subjected to HPLC under the following conditions to determine the peak areas of 5,6-dihydroxyindole and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid.
HPLC apparatus: HPLC Alliance2695-2996 manufactured by Waters
Column: Sunfire C18 (4.6 x 150 mm) manufactured by Waters
Mobile phase: Solution A-1.5% (w / v) phosphoric acid solution, Solution B-99.9% methanol (Set the gradient so that solution B is 0% initially and 50% after 5 minutes)
Test solution injection volume: 10 μl
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection: Monitored by absorbance at 280 nm, the maximum absorption wavelength. The concentration of 5,6-dihydroxyindole in the melanin precursor-containing solution depends on the substrate concentration added to the reaction system. Is preferably 10 to 30 mM, more preferably about 15 to 25 mM, and still more preferably about 17 to 20 mM.
・(2)について
本発明のメラニン前駆体含有溶液は、不揮発成分重量に占める5,6-ジヒドロキシインドール以外の重量が70重量%未満であることを特徴とする。70重量%未満とすれば、メラニン前駆体含有溶液を配合した染料溶液において結晶の生成がせず、色合いが官能的に十分薄いと判断される。好ましくは65重量%未満、より好ましくは50〜60重量%である。
-(2) The melanin precursor-containing solution of the present invention is characterized in that the weight other than 5,6-dihydroxyindole in the nonvolatile component weight is less than 70% by weight. If it is less than 70% by weight, no crystals are formed in the dye solution containing the melanin precursor-containing solution, and it is judged that the hue is functionally thin. Preferably it is less than 65 weight%, More preferably, it is 50-60 weight%.
5,6-ジヒドロキシインドールの重量は、上記のHPLC分析方法で、5,6-ジヒドロキシインドール標準品(BIO SYNTH社製など)を用いて、絶対検量線法により定量する。 The weight of 5,6-dihydroxyindole is quantified by an absolute calibration curve method using a standard product of 5,6-dihydroxyindole (manufactured by BIO SYNTH, etc.) by the above HPLC analysis method.
本発明において、不揮発成分とは、メラニン前駆体溶液を凍結乾燥法で乾燥した際に固形分として残留する成分のことを意味し、かかる不揮発成分の重量は、100 mLのメラニン前駆体溶液を窒素雰囲気下、-80℃において凍結し、凍結乾燥装置で48時間乾燥させた後に固形分重量を測定することにより求めることができる。その重量をAグラムとすると、不揮発成分濃度は10×A g/Lで表される。 In the present invention, the non-volatile component means a component remaining as a solid content when the melanin precursor solution is dried by freeze-drying, and the weight of the non-volatile component is 100 mL of the melanin precursor solution. It can be determined by measuring the solid content weight after freezing at −80 ° C. in an atmosphere and drying with a freeze-drying apparatus for 48 hours. When the weight is A gram, the non-volatile component concentration is expressed by 10 × A g / L.
メラニン前駆体含有溶液中の不揮発成分の濃度は、反応系に添加した基質濃度に依存するため、基質濃度を40 mMとした場合を例示すると、好ましくは3〜10 g/L、より好ましくは5〜9 g/L、更に好ましくは6〜8 g/Lである。 Since the concentration of the non-volatile component in the melanin precursor-containing solution depends on the substrate concentration added to the reaction system, for example, when the substrate concentration is 40 mM, preferably 3 to 10 g / L, more preferably 5 -9 g / L, more preferably 6-8 g / L.
メラニン前駆体含有溶液の製造方法
本発明のメラニン前駆体含有溶液の製造方法は、水、酸化酵素を産生し得る微生物又は酸化酵素、並びにDOPA及びDOPAの類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の基質化合物を非溶解状態で含む混合物を酸素の存在下で反応させてメラニン前駆体を生成することを特徴とする。
Method for Producing Melanin Precursor-Containing Solution The method for producing a melanin precursor-containing solution of the present invention is at least one selected from the group consisting of water, microorganisms capable of producing oxidase or oxidase, and DOPA and DOPA analogs A melanin precursor is produced by reacting a mixture containing the substrate compound in an undissolved state in the presence of oxygen.
＜微生物＞
本発明の方法で用いる微生物は、酸化酵素を産生し得るものであればよく、この限りにおいて特に制限されない。微生物の増殖能力は問わず、不活性化処理した微生物も含まれる。また、酸化酵素を産生し得る微生物に破砕処理や溶菌処理などを施し、酵素溶液としたものについても同様に扱うことができる。
<Microorganism>
The microorganism used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it can produce an oxidase. Regardless of the ability of microorganisms to grow, inactivated microorganisms are also included. Further, a microorganism that can produce an oxidase is subjected to crushing treatment, lysis treatment, or the like to obtain an enzyme solution, which can be handled in the same manner.
本発明の方法で用いる微生物としては、大腸菌、酵母及び糸状菌等を挙げることができる。中でも、安全で、さらに単細胞であり、かつ細胞の沈降速度が速いため、比較的低速回転の遠心分離で反応後の細胞を分離できる点で酵母を用いることが好ましい。中でも、菌体が堅牢であるために菌体由来のタンパク質の反応液中への流出が抑えられ、かつ遺伝子操作が容易である点で、サッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae)が好ましい。 Examples of microorganisms used in the method of the present invention include Escherichia coli, yeast and filamentous fungi. Among them, it is preferable to use yeast because it is safe, is a single cell, and has a high cell sedimentation rate, so that the cells after reaction can be separated by centrifugation at a relatively low speed. Among them, Saccharomyces cerevisiae is preferable in that the microbial cells are robust, so that the outflow of the protein derived from the microbial cells into the reaction solution is suppressed and the genetic manipulation is easy.
本発明で用いる微生物は、本来的に上記酵素を産生し得る能力を有する微生物であっても、また、上記酵素を産生し得る能力を外来的に付与されたか又は当該酵素の活性を高める処理をされた微生物であってもよい。 Even if the microorganism used in the present invention is a microorganism that originally has the ability to produce the enzyme, it has been given an ability to produce the enzyme exogenously or a treatment for enhancing the activity of the enzyme. It may be a microorganism.
酸化酵素は、後述する基質化合物を酸化する活性を有するものであればよく、好ましくはカテコールオキシダーゼ活性を有する酵素である。ここでカテコールオキシダーゼ活性とは、カテコールの酸化によるo-キノンの生成を触媒する活性をいい、かかるカテコールオキシダーゼ活性を有する酵素としては、モノフェノールオキシダーゼ、ジフェノールオキシダーゼ、o-ジフェノラーゼ、およびチロシナーゼ等が含まれる。カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素としては、L-DOPAに対して親和性が高いために天然型メラニン前駆体を効率よく製造できる点で、チロシナーゼを使用することが好ましい。 The oxidase is not particularly limited as long as it has an activity to oxidize a substrate compound described later, and is preferably an enzyme having catechol oxidase activity. Here, catechol oxidase activity refers to the activity of catalyzing the production of o-quinone by oxidation of catechol. Examples of enzymes having such catechol oxidase activity include monophenol oxidase, diphenol oxidase, o-diphenolase, and tyrosinase. included. As the enzyme having catechol oxidase activity, it is preferable to use tyrosinase from the viewpoint that a natural melanin precursor can be efficiently produced because of its high affinity for L-DOPA.
酸化酵素は、どのような生物に由来する酵素であってもよいが、特に、発現効率がよく、かつ宿主微生物内で安定であることから、糸状菌由来のチロシナーゼが好ましい。このような糸状菌としては、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌、ニューロスポラ（Neurospora）属糸状菌、リゾムコール（Rhizomucor）属糸状菌、トリコデルマ（Trichoderma）属糸状菌、ペニシリウム（Penicillium）属糸状菌などが挙げられる。中でも、熱に対して比較的安定であり、かつ安全性が確かめられている点で、アスペルギルス属糸状菌のチロシナーゼが好ましく、具体的には、アスペルギルス・オリゼのmelB遺伝子（特開2002-191366号公報）、melD遺伝子（特開2004-201545号公報）又はmelO遺伝子（Molecular cloning and nucleotide sequence of the protyrosinase gene, melO, from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells.Biochim Biophys Acta. 1995 Mar 14;1261(1):151-154.）にコードされるチロシナーゼ又はかかるチロシナーゼと実質的に同一である酵素を挙げることができる。 The oxidase may be an enzyme derived from any organism, but tyrosinase derived from filamentous fungi is particularly preferable because of its good expression efficiency and stability in the host microorganism. Examples of such filamentous fungi include Aspergillus fungi, Neurospora fungi, Rhizomucor fungi, Trichoderma fungi, Penicillium fungi, etc. Can be mentioned. Among them, tyrosinase of Aspergillus filamentous fungi is preferable because it is relatively stable against heat and has been confirmed to be safe. Specifically, Aspergillus oryzae melB gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-191366) Publication), melD gene (JP 2004-201545) or melO gene (Molecular cloning and nucleotide sequence of the protyrosinase gene, melO, from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells. Biochim Biophys Acta. 1995 Mar 14; 1261 (1): 151-154.) Or an enzyme that is substantially identical to such tyrosinase.
なお、上記チロシナーゼと「実質的に同一」とは、これらの遺伝子（melB遺伝子、melD遺伝子又はmelO遺伝子）によってコードされるチロシナーゼのアミノ酸配列と、70％以上、更に好ましくは80％以上、最も好ましくは90％以上が同一のアミノ酸配列を有し、かつカテコールオキシダーゼ活性、好ましくはチロシナーゼ活性を有している酵素をいう。 The “substantially identical” to the above tyrosinase is 70% or more, more preferably 80% or more, most preferably the amino acid sequence of tyrosinase encoded by these genes (melB gene, melD gene or melO gene). Refers to an enzyme having 90% or more of the same amino acid sequence and having catechol oxidase activity, preferably tyrosinase activity.
微生物、好ましくは前述する酵母に上記酵素を産生させるためには、例えば、タンパク質の大量発現用に通常用いられているベクターに上記酵素の遺伝子をクローニングしたものを上記微生物に導入し、その染色体に組み込むか、又はこれをプラスミド状態で有する微生物を培養することにより酸化酵素を大量に産生させることができる。 In order to produce the enzyme in a microorganism, preferably the yeast described above, for example, a gene obtained by cloning the gene of the enzyme into a vector usually used for mass expression of proteins is introduced into the microorganism, and the chromosome is introduced into the chromosome. A large amount of oxidase can be produced by culturing a microorganism that incorporates or has this in a plasmid state.
本発明の製造方法においては、反応系にメラニン前駆体を効率良く蓄積させるために、基質化合物から生成したメラニン前駆体がさらに重合してメラニンが生成する速度より速く基質化合物からメラニン前駆体が生成するような高い活性を微生物が有している必要がある。 In the production method of the present invention, in order to efficiently accumulate the melanin precursor in the reaction system, the melanin precursor generated from the substrate compound is generated faster than the rate at which the melanin precursor generated from the substrate compound is further polymerized to produce melanin. It is necessary for the microorganism to have such a high activity.
＜基質化合物＞
基質化合物としては、DOPA及びDOPA類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を使用する。DOPA及びDOPA類縁体は、L体又はD体のいずれであってもよい。DOPA類縁体としては、ドーパミン（Dopamine）や、DOPAメチルエステル、DOPAエチルエステルおよびα−メチルDOPA等が挙げられ、これらの異性体であってもよい。中でも、天然型メラニン前駆体が得られる点で、L-DOPAを用いることが好ましく、酵素に対する親和性の点でもL-DOPAを用いることが好ましい。
<Substrate compound>
As the substrate compound, at least one compound selected from the group consisting of DOPA and DOPA analogs is used. DOPA and DOPA analogs may be either L-form or D-form. Examples of DOPA analogs include dopamine, DOPA methyl ester, DOPA ethyl ester and α-methyl DOPA, and these isomers may be used. Among these, L-DOPA is preferably used from the viewpoint of obtaining a natural melanin precursor, and L-DOPA is also preferably used from the viewpoint of affinity for the enzyme.
基質化合物は1種を単独で、又は2種以上を組み合わせて用いることができる。 The substrate compounds can be used alone or in combination of two or more.
＜混合物＞
本発明の方法で用いる混合物は、水、前述する酸化酵素を産生し得る微生物又は酸化酵素、並びに前述する基質化合物を非溶解状態で含むことを特徴とする。
<Mixture>
The mixture used in the method of the present invention is characterized in that it contains water, a microorganism or oxidase capable of producing the above-mentioned oxidase, and the above-mentioned substrate compound in an undissolved state.
一方、基質化合物を溶解させて反応を行う場合は、基質化合物を完全に溶解させるために強酸を用いてpHを1〜3に調整する必要がある。そして、酵素反応を行う前には、強アルカリを用いて中和する必要がある。その結果、反応液中の無機塩類の含有量が増加することになる。 On the other hand, when the reaction is performed by dissolving the substrate compound, it is necessary to adjust the pH to 1 to 3 using a strong acid in order to completely dissolve the substrate compound. And before performing an enzyme reaction, it is necessary to neutralize using a strong alkali. As a result, the content of inorganic salts in the reaction solution increases.
これに対して、本発明では基質化合物を非溶解状態で反応させるため、上記のようなpH調整が不要であり、その結果、製造されるメラニン前駆体含有溶液中の無機塩類及び水溶性メラニンオリゴマー、すなわち5,6-ジヒドロキシインドール以外の不揮発成分を70%未満まで減少させることができる。更に、DOPA等の基質化合物を非溶解状態で使用できるために、基質化合物の添加量の上限が制限されず、その結果メラニン前駆体生成量を増加させることができる。 In contrast, in the present invention, since the substrate compound is reacted in an undissolved state, pH adjustment as described above is unnecessary, and as a result, inorganic salts and water-soluble melanin oligomers in the produced melanin precursor-containing solution That is, non-volatile components other than 5,6-dihydroxyindole can be reduced to less than 70%. Furthermore, since a substrate compound such as DOPA can be used in an undissolved state, the upper limit of the amount of substrate compound added is not limited, and as a result, the amount of melanin precursor produced can be increased.
混合物の調製に用いる水は、好ましくはイオン交換水である。イオン交換水を使用することにより、メラニン前駆体含有溶液に含まれる無機塩類の量を更に減少させることができる。 The water used for the preparation of the mixture is preferably ion-exchanged water. By using ion-exchanged water, the amount of inorganic salts contained in the melanin precursor-containing solution can be further reduced.
本発明の混合物は、好ましくは、上記微生物として微生物懸濁液を、酸化酵素として酸化酵素溶液を用いて調製されるものである。当該微生物懸濁液又は酸化酵素溶液の添加量を混合物全体の10容量%として、その電気伝導度を好ましくは0.8 mS/cm以下、より好ましくは0.73 mS/cm以下、更に好ましくは0.20〜0.50 mS/cmに調整されてなるものを用いる。当該微生物懸濁液又は酸化酵素溶液の添加量は任意であり、10容量%と異なる場合は、電気伝導度を10容量%に濃縮又は希釈したものとして換算する。 The mixture of the present invention is preferably prepared using a microorganism suspension as the microorganism and an oxidase solution as the oxidase. The addition amount of the microbial suspension or oxidase solution is 10% by volume of the total mixture, and the electrical conductivity is preferably 0.8 mS / cm or less, more preferably 0.73 mS / cm or less, and still more preferably 0.20 to 0.50 mS. Use one adjusted to / cm. The addition amount of the microbial suspension or oxidase solution is arbitrary, and when it is different from 10% by volume, the electrical conductivity is converted as being concentrated or diluted to 10% by volume.
ここで、酸化酵素溶液とは酸化酵素を水に懸濁あるいは溶解したものを言う。また、微生物懸濁液は、例えば次の手順により調製することが出来る。すなわち、前記微生物を常法により液体培養した後、培養液を遠心分離し培地を除去する。この微生物を水に懸濁して遠心分離し、上清を除去する。この最後の工程を繰り返すことにより微生物を洗浄する。そして、得られた微生物を水に懸濁したものを微生物懸濁液とする。 Here, the oxidase solution refers to a solution in which oxidase is suspended or dissolved in water. The microbial suspension can be prepared, for example, by the following procedure. That is, after culturing the microorganisms by a conventional method, the culture solution is centrifuged to remove the medium. The microorganism is suspended in water and centrifuged, and the supernatant is removed. Microorganisms are washed by repeating this last step. And what obtained suspension of the microorganisms in water is made into a microorganism suspension.
このように微生物を洗浄することにより、微生物懸濁液の電気伝導度を0.8 mS/cm以下、好ましくは0.73 mS/cm以下、更に好ましくは0.20〜0.50 mS/cmになるように調整する。かくして、微生物を洗浄することで、培養液からの不純物の混入を減少させることができる。微生物懸濁液又は酸化酵素溶液の電気伝導度を0.8 mS/cm以下にすることで、メラニン前駆体含有溶液に含まれる5,6-ジヒドロキシインドールに対する5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸の量をHPLC分析による面積比において10/100以下、好ましくは6/100以下、より好ましくは1/1000〜3/100まで低減させることができる。 By washing the microorganisms in this way, the electric conductivity of the microorganism suspension is adjusted to 0.8 mS / cm or less, preferably 0.73 mS / cm or less, more preferably 0.20 to 0.50 mS / cm. Thus, contamination of impurities from the culture solution can be reduced by washing the microorganisms. By reducing the electrical conductivity of the microbial suspension or oxidase solution to 0.8 mS / cm or less, the 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid with respect to 5,6-dihydroxyindole contained in the melanin precursor-containing solution is reduced. The amount can be reduced to 10/100 or less, preferably 6/100 or less, more preferably 1/1000 to 3/100 in area ratio by HPLC analysis.
電気伝導度の測定は、微生物懸濁液又は酸化酵素溶液を遠心分離し、得られた上清を電気伝導度計(堀場製作所製、電気伝導率計B-173など)により測定する。 The electrical conductivity is measured by centrifuging the microorganism suspension or oxidase solution, and measuring the resulting supernatant with an electrical conductivity meter (such as an electrical conductivity meter B-173 manufactured by Horiba, Ltd.).
反応開始時の基質化合物の濃度は、通常10〜60 mMとすることが好ましく、15〜40 mMとすることがより好ましい。反応開始前の基質濃度が10〜20 mMでは、仕込み後数時間程度、非溶解状態の基質化合物が含まれおり、基質濃度が20 mM以上では時間が経過しても常時非溶解状態の基質化合物が含まれている。 The concentration of the substrate compound at the start of the reaction is usually preferably 10 to 60 mM, more preferably 15 to 40 mM. When the substrate concentration before starting the reaction is 10 to 20 mM, the undissolved substrate compound is included for several hours after preparation. When the substrate concentration is 20 mM or more, the substrate compound is always insoluble even if time passes. It is included.
また混合物のpHは、前述する酵素が基質化合物の酸化反応を触媒できる範囲であればよく特に限定されないが、通常pH4〜9程度に維持することが好ましく、pH5〜7程度に維持することがより好ましい。余りに低pHであると基質化合物の酸化が進行せず、逆に余りに高pHであると生成したメラニン前駆体が蓄積せずに重合してしまうが、上記範囲であれば、メラニン前駆体の重合を抑えて反応液中に効率よくメラニン前駆体を蓄積させることができる。 The pH of the mixture is not particularly limited as long as the above-described enzyme can catalyze the oxidation reaction of the substrate compound, but is usually preferably maintained at about pH 4-9, more preferably about pH 5-7. preferable. If the pH is too low, the oxidation of the substrate compound will not proceed. Conversely, if the pH is too high, the generated melanin precursor will polymerize without accumulating, but if it is in the above range, polymerization of the melanin precursor will occur. The melanin precursor can be efficiently accumulated in the reaction solution while suppressing the above.
混合物のpHは、KOH、NaOHのような強アルカリ及びH2SO4、HClのような強酸を少量添加することにより調整することが好ましく、無機塩類が増加するため緩衝液を使用する場合は最低限の濃度に留めるのが好ましい。 The pH of the mixture is preferably adjusted by adding a small amount of a strong alkali such as KOH or NaOH and a strong acid such as H 2 SO 4 or HCl, and it is the lowest when using a buffer because of the increase in inorganic salts. It is preferable to keep the concentration at the limit.
混合物中の微生物又は酸化酵素の量は、30〜60分程度で基質の90%以上を酸化できる量が適当で、L-DOPA 1molに対しては、1×107U程度が適当である。尚、微生物又は酸化酵素の活性は実施例に記載の方法で測定することができる。微生物懸濁液を用いる場合、その添加量は任意であるが、含まれる微生物湿重量は反応液量の10重量%以下が好ましく、5重量%以下がより好ましい。この 範囲内であれば、反応後の固液分離を容易に行えることにより、メラニン前駆体の収率を高くすることができる。酸化酵素溶液を用いる場合、その添加量は任意であるが、含まれるタンパク質濃度が少ないほど、反応後の除タンパク操作が容易である。 The amount of microorganisms or oxidase in the mixture is suitably an amount that can oxidize 90% or more of the substrate in about 30 to 60 minutes, and about 1 × 10 7 U is appropriate for 1 mol of L-DOPA. The activity of the microorganism or oxidase can be measured by the method described in the examples. When a microbial suspension is used, the amount added is arbitrary, but the microbial wet weight contained is preferably 10% by weight or less, more preferably 5% by weight or less of the amount of the reaction solution. Within this range, the yield of the melanin precursor can be increased by easily performing solid-liquid separation after the reaction. When an oxidase solution is used, the addition amount is arbitrary, but the protein removal operation after the reaction is easier as the concentration of the contained protein is smaller.
＜反応＞
前述する混合物は、酸化反応の反応原料として用いられる。
<Reaction>
The aforementioned mixture is used as a reaction raw material for the oxidation reaction.
反応温度は、酵素が基質化合物の酸化反応を触媒できる範囲であればよく特に限定されないが、通常15〜35℃程度に維持することが好ましく、20〜30℃程度に維持することがより好ましい。上記範囲内であれば、十分に酸化反応が進行するとともに、酵素が失活し難く、またメラニン化が進行し難い。 The reaction temperature is not particularly limited as long as the enzyme can catalyze the oxidation reaction of the substrate compound, but is usually preferably maintained at about 15 to 35 ° C, more preferably about 20 to 30 ° C. Within the above range, the oxidation reaction proceeds sufficiently, the enzyme is hardly deactivated, and melanization is difficult to proceed.
反応は、通気撹拌槽を用いてバッチ式で行うのが好ましい。反応開始直後は、酸化反応に大量の酸素が必要であるため、大量に通気することが好ましい。但し、攪拌速度が速すぎると微生物が損傷するため、反応液中の酸素濃度を監視し、酸素濃度が低下しなくなれば通気量および攪拌速度を減少することが好ましい。反応液中の酸素濃度は0.1〜8 ppm程度に維持することが好ましく、1〜2 ppm程度に維持することがより好ましい。通気や撹拌により反応液中に大量の泡が生じる場合は、シリコーン樹脂のような消泡剤を添加してもよい。 The reaction is preferably carried out batchwise using an aerated stirring tank. Immediately after the start of the reaction, a large amount of oxygen is required for the oxidation reaction. However, if the stirring speed is too high, microorganisms are damaged. Therefore, it is preferable to monitor the oxygen concentration in the reaction solution and reduce the aeration rate and stirring speed if the oxygen concentration does not decrease. The oxygen concentration in the reaction solution is preferably maintained at about 0.1 to 8 ppm, more preferably about 1 to 2 ppm. When a large amount of foam is generated in the reaction solution by aeration or stirring, an antifoaming agent such as a silicone resin may be added.
反応時間は、通常10分〜2時間程度とするのが好ましく、30分〜1時間程度とするのがより好ましい。余りに長時間反応させると生成したメラニン前駆体の重合反応が進行してしまうためメラニン前駆体の収率が低下するが、この程度であれば、重合反応を最小限に抑えながら基質化合物を十分メラニン前駆体に変換できる。 The reaction time is usually preferably about 10 minutes to 2 hours, more preferably about 30 minutes to 1 hour. If the reaction is carried out for an excessively long time, the polymerization reaction of the produced melanin precursor will proceed, and the yield of the melanin precursor will decrease. Can be converted to a precursor.
基質化合物としてDOPAを用いる場合は、上記酵素反応により基質化合物が酸化されてドーパクロムが生成し、基質が枯渇した時点で反応は終了する。反応終了後の溶液を不活性ガス雰囲気下で保管し、pH 6〜9に調整する。当該条件下で、ドーパクロムからは非酵素的な異性化反応により5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸又は5,6-ジヒドロキシインドールに変換される。この反応は24時間以内に完了する。なお、5,6-ジヒドロキシインドールや5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸は空気と接触することで容易に酸化されるため、取り扱いは不活性ガス雰囲気下で行う。不活性ガスとして、窒素ガス、アルゴンガス等が利用できる。これにより、5,6-ジヒドロキシインドールを主要成分とし、5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸を含むメラニン前駆体含有溶液が得られる。 When DOPA is used as the substrate compound, the enzyme reaction causes the substrate compound to be oxidized to produce dopachrome, and the reaction ends when the substrate is depleted. The solution after completion of the reaction is stored under an inert gas atmosphere and adjusted to pH 6-9. Under such conditions, dopachrome is converted to 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid or 5,6-dihydroxyindole by a non-enzymatic isomerization reaction. The reaction is complete within 24 hours. Since 5,6-dihydroxyindole and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid are easily oxidized by contact with air, handling is performed in an inert gas atmosphere. Nitrogen gas, argon gas, etc. can be used as the inert gas. As a result, a melanin precursor-containing solution containing 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid as a main component is obtained.
＜メラニン前駆体溶液の精製＞
微生物懸濁液を添加して製造したメラニン前駆体含有溶液は、必要に応じて、微生物を除去する固液分離工程に供する。不活性ガス雰囲気下で遠心分離、あるいは膜分離を行うことでメラニン前駆体を劣化させずに、微生物を含まないメラニン前駆体溶液を得ることができる。引き続き不活性ガス雰囲気下で限外ろ過膜を用いた除タンパク工程に供することで、混入タンパク質を除去したメラニン前駆体溶液が得られる。なお、限外ろ過膜を用いて膜分離を行えば、固液分離と除タンパクを単一工程で済ませることもできる。
<Purification of melanin precursor solution>
The melanin precursor-containing solution produced by adding the microbial suspension is subjected to a solid-liquid separation process for removing microorganisms, if necessary. By performing centrifugation or membrane separation in an inert gas atmosphere, a melanin precursor solution containing no microorganisms can be obtained without degrading the melanin precursor. Subsequently, the melanin precursor solution from which the contaminating protein is removed is obtained by subjecting it to a protein removal step using an ultrafiltration membrane under an inert gas atmosphere. If membrane separation is performed using an ultrafiltration membrane, solid-liquid separation and deproteinization can be completed in a single step.
酵素溶液を添加して製造したメラニン前駆体含有溶液は、必要に応じて、上記と同様に除タンパク工程に供することで、タンパク質を除去したメラニン前駆体溶液が得られる。 The melanin precursor-containing solution produced by adding the enzyme solution is subjected to a deproteinization step in the same manner as described above to obtain a melanin precursor solution from which proteins have been removed.
前述の方法で得られるメラニン前駆体含有溶液は、不活性ガス雰囲気下で保管できる。 The melanin precursor-containing solution obtained by the above-described method can be stored in an inert gas atmosphere.
＜染料溶液＞
本発明のメラニン前駆体含有溶液を配合し、染色性能及び保存性に優れた染料溶液を調製することができる。染色性能の観点から、染料溶液に含まれる5,6-ジヒドロキシインドール濃度は、0.01〜10重量％、更には0.05〜5重量％、特に0.2〜1.5重量％が好ましい。この含有量は、染料溶液の使用目的によって適宜変えることができ、染色回数が一回で染色対象物が綿繊維の場合は0.2〜0.5重量%で、染色対象物がヒト白髪の場合は1.0〜1.5重量%程度で黒く染色することができる。染色回数が2回以上である場合は、より低濃度で染色効果が得られる。
<Dye solution>
The melanin precursor containing solution of this invention can be mix | blended and the dye solution excellent in dyeing | staining performance and preservability can be prepared. From the viewpoint of dyeing performance, the concentration of 5,6-dihydroxyindole contained in the dye solution is preferably 0.01 to 10% by weight, more preferably 0.05 to 5% by weight, and particularly preferably 0.2 to 1.5% by weight. This content can be appropriately changed depending on the purpose of use of the dye solution, and is 0.2 to 0.5% by weight when the number of times of dyeing is one and the dyeing object is cotton fiber, and 1.0 to when the dyeing object is human gray hair. It can be dyed black at about 1.5% by weight. When the number of times of staining is 2 times or more, a staining effect can be obtained at a lower concentration.
本発明の染料溶液のpHは、染色性能と保存性の観点からpH7〜9に調整することが好ましい。また、本発明の染料溶液には防腐剤として、エタノールを20重量%程度添加するのが好ましい。 The pH of the dye solution of the present invention is preferably adjusted to pH 7 to 9 from the viewpoint of dyeing performance and storage stability. In addition, it is preferable to add about 20% by weight of ethanol as a preservative to the dye solution of the present invention.
前述の染料溶液は、不活性ガス雰囲気下でステンレスタンク等の密閉可能な容器に封入し、常温で保管することができる。また、不活性ガスで加圧しておくと、使用時にコックを開くだけで必要量の染料溶液を取り出すことができて便利である。 The above dye solution can be sealed in a sealable container such as a stainless steel tank in an inert gas atmosphere and stored at room temperature. In addition, pressurizing with an inert gas is convenient because a necessary amount of the dye solution can be taken out simply by opening the cock at the time of use.
本染料溶液は茶褐色で、保管容器より空気中に取り出した時点より空気酸化を受け始め、急激に黒色に変化し、同時に染色が開始される。常温においては、通常1時間以内にメラニン前駆体が空気酸化により全量消費され、黒色のメラニン溶液に変換される。メラニン溶液に染色性能は認められない。 The dye solution is brown and begins to undergo air oxidation from the time it is taken out from the storage container into the air, and then suddenly changes to black, and at the same time, dyeing is started. At normal temperature, the entire amount of melanin precursor is usually consumed by air oxidation within 1 hour and converted to a black melanin solution. No staining performance is observed in the melanin solution.
本染料溶液は、それ自体で染色性能を有し、染料として使用可能であるが、さらに使用感を向上させるため、染色を意図した各種商品の原料として使用することもできる。例えば、染料成分として、界面活性剤、安定化剤、緩衝剤、香料、感触向上剤、キレート剤、可溶化剤、防腐剤等を含む染毛剤に配合することができる。 The dye solution itself has a dyeing performance and can be used as a dye. However, in order to further improve the feeling of use, it can also be used as a raw material for various products intended for dyeing. For example, it can mix | blend with the hair dye containing a surfactant, a stabilizer, a buffering agent, a fragrance | flavor, a touch improvement agent, a chelating agent, a solubilizer, an antiseptic | preservative, etc. as a dye component.
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例及び試験例を挙げる。しかし、本発明はこれら実験例等になんら限定されるものではない。 Examples and test examples will be given below to explain the present invention in more detail. However, the present invention is not limited to these experimental examples.
カテコールオキシダーゼ産生微生物(melB産生酵母)の調製
カテコールオキシダーゼとしてチロシナーゼ（melB）、微生物として酵母（Saccharomyces cerevisiae）を用いて、カテコールオキシダーゼ産生微生物を調製した。なお、チロシナーゼ（melB）は麹菌Aspergillus oryzaeから単離された酵素である（特許第3903125号公報）。そのアミノ酸配列、並びにそれをコードするmelB遺伝子のクローニング方法およびその塩基配列も、上記特許第3903125号公報に記載されている。
（1）チロシナーゼ遺伝子（melB遺伝子）のクローニング
特許第3903125号公報の記載に従って、麹菌Aspergillus oryzaeからmelB遺伝子をクローニングした。具体的には、麹菌Aspergillus oryzae OSI-1013株（受託番号FERM P-16528、平成9年11月20日に日本国茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター 中央第６に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所・特許微生物寄託センター）に寄託）を蒸米に接種し、製麹した麹を1.5g秤量し、液体窒素中で完全に破砕した。日本ジーン社製ISOGENを用いて、これから240μgの全RNAを抽出した。120μgの全RNAからタカラバイオ株式会社製Oligotex-dT30<Super>を用いて、１μgのmRNAを精製した。このmRNAを、Clontech社製SMART cDNA Library Construction KitによりcDNAライブラリーを作成し、PCRによりmelB cDNAのみを増幅した。得られたPCR産物はアガロースゲル電気泳動で、目的の約1.8Kbpのバンドのみが増幅されていることを確認した。また、塩基配列解析の結果、正常にイントロン配列が取り除かれていることも確認した。なお、特許第3903125号公報の配列番号２に記載されているmelB遺伝子の塩基配列のうち、1〜1436番目の塩基配列はプロモーター領域、3636〜4174番目の塩基配列はターミネーター領域に相当し、1437〜3635番目の塩基配列は、melB cDNAに相当するコーティング領域に相当する。
（2）酵母への組み込み
上記（1）で得られたmelB cDNAを、酵母Saccharomyces cerevisiae用発現ベクター（特開2003-265177号公報）に発現可能な状態で接続した。具体的には、特開2003-265177号公報の記載に準じて、SED1プロモーターとADH１ターミネーターを持つ上記発現ベクターのプロモーター直下のSmaI部位に、上記（a）で取得したmelB cDNAを挿入した。URA3マーカー内部に存在するStuI部位で切断することにより得られるmelB cDNAを含む断片を導入用カセットとして精製した。
これを定法に従って、酵母（Saccharomyces cerevisiae）に導入し、melB産生酵母を調製した。なお、酵母は、清酒の醸造に用いられる実用酵母・協会９号由来のウラシル要求性株については、日本醸造教会から入手できる清酒の醸造に用いられる実用酵母・協会９号の５−フルオロオロチジン酸耐性を利用した公知の陽性選択方法により取得することができる。
Preparation of catechol oxidase- producing microorganism (melB-producing yeast) A catechol oxidase-producing microorganism was prepared using tyrosinase (melB) as the catechol oxidase and yeast (Saccharomyces cerevisiae) as the microorganism. Tyrosinase (melB) is an enzyme isolated from Aspergillus oryzae (Japanese Patent No. 3903125). The amino acid sequence, the method for cloning the melB gene encoding it, and its base sequence are also described in the above-mentioned Japanese Patent No. 3903125.
(1) Cloning of tyrosinase gene (melB gene) The melB gene was cloned from Aspergillus oryzae as described in Japanese Patent No. 3903125. Specifically, Neisseria gonorrhoeae Aspergillus oryzae OSI-1013 strain (Accession number FERM P-16528, 1-1-1 Higashi Tsukuba City, Ibaraki, Japan on November 20, 1997 An independent administration with an address in the center of Tsukuba Center 6th Incorporated in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (formerly deposited at Biotechnology Institute of Biotechnology, Patent Microorganism Deposit Center), weighed 1.5g of koji made into liquid nitrogen, liquid nitrogen Completely crushed inside. 240 μg of total RNA was extracted from this using ISOGEN manufactured by Nippon Gene. 1 μg of mRNA was purified from 120 μg of total RNA using Oligotex-dT30 <Super> manufactured by Takara Bio Inc. From this mRNA, a cDNA library was prepared by SMART cDNA Library Construction Kit manufactured by Clontech, and only melB cDNA was amplified by PCR. The obtained PCR product was confirmed by agarose gel electrophoresis to amplify only the target band of about 1.8 Kbp. As a result of the base sequence analysis, it was also confirmed that the intron sequence was normally removed. Of the nucleotide sequence of the melB gene described in SEQ ID NO: 2 of Japanese Patent No. 3903125, the nucleotide sequence of 1 to 1436 corresponds to the promoter region, and the nucleotide sequence of 3636 to 4174 corresponds to the terminator region. The -3635th base sequence corresponds to the coating region corresponding to melB cDNA.
(2) Integration into yeast The melB cDNA obtained in (1) above was ligated into an expression vector for yeast Saccharomyces cerevisiae (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-265177) in a state where it can be expressed. Specifically, the melB cDNA obtained in (a) above was inserted into the SmaI site immediately below the promoter of the expression vector having the SED1 promoter and the ADH1 terminator according to the description in JP-A-2003-265177. A fragment containing melB cDNA obtained by cutting at the StuI site present inside the URA3 marker was purified as an introduction cassette.
This was introduced into yeast (Saccharomyces cerevisiae) according to a standard method to prepare melB-producing yeast. In addition, about the uracil requirement strain | stump | stock derived from the practical yeast and association No. 9 used for sake brewing, the yeast is the use of the yeast and the association No. 9 5-fluoroorotidine of the practical yeast used for sake brewing available from the Japan Brewing Church. It can be obtained by a known positive selection method using acid resistance.
微生物懸濁液の調製
上記で得られたmelB産生酵母（組換え酵母）を常法に従って培養し、遠心分離によって菌体を回収し、蒸留水で洗浄した。次いで、菌体（湿重量約100g）に0.1mMの硫酸銅を含む水溶液1Lを加え、40℃で20分間保持した。その後、遠心分離により菌体を回収し、これを50mMの酢酸緩衝液（NaOAc-HCl）（pH3.0）1Lに懸濁し、室温で10分間静置した。その後、遠心分離により菌体を回収し、過剰な銅イオンを除去するため、20mMのEDTA溶液（KOHを使用してpH5に調整）で洗浄し、遠心分離して菌体を回収した。斯くして活性化処理された菌体を水1Lに懸濁して、これを微生物懸濁液とした。
Preparation of Microbial Suspension The melB-producing yeast (recombinant yeast) obtained above was cultured according to a conventional method, and the cells were collected by centrifugation and washed with distilled water. Next, 1 L of an aqueous solution containing 0.1 mM copper sulfate was added to the cells (wet weight of about 100 g), and the mixture was kept at 40 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the cells were collected by centrifugation, suspended in 1 L of 50 mM acetate buffer (NaOAc-HCl) (pH 3.0), and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the cells were collected by centrifugation and washed with a 20 mM EDTA solution (adjusted to pH 5 using KOH) to remove excess copper ions, and the cells were collected by centrifugation. The cells thus activated were suspended in 1 L of water and used as a microorganism suspension.
微生物懸濁液の活性測定方法
酸化酵素又は微生物の活性は、酸化酵素又は微生物と0.8μmolのDOPAを含む溶液１mLを30℃で5分間反応させた場合の475nmにおける吸光度を光路長1 cmあたり１増加させる活性を１Uとして計算される。また微生物の酵素活性は、これを反応に用いた菌体の湿重量(mg)で除したもの(U/mg)とすることもできる。
Method for measuring the activity of microorganism suspension The activity of oxidase or microorganism is determined by measuring the absorbance at 475 nm per 1 cm of optical path length when 1 mL of a solution containing oxidase or microorganism and 0.8 μmol of DOPA is reacted at 30 ° C. for 5 minutes. The increasing activity is calculated as 1U. Further, the enzyme activity of the microorganism can be obtained by dividing this by the wet weight (mg) of the microbial cells used in the reaction (U / mg).
5,6-ジヒドロキシインドール量の測定方法
5,6-ジヒドロキシインドールの重量は、下記のHPLC分析方法で、5,6-ジヒドロキシインドール標準品はBIO SYNTH社製を用いて、絶対検量線法により定量した。
（１）試験液の処理
50 ml容メスフラスコに1%(w/v)のアスコルビン酸ナトリウムを含む0.1%(w/v)リン酸溶液を10 ml分注した。ここに試験液1.0 gを秤量して入れた後、0.1%(w/v)リン酸溶液で50 ml標線までメスアップした。
（２）HPLC分析
斯くして調製した試験液の遠心上清を下記条件のHPLCに供し、5,6-ジヒドロキシインドールのピーク面積を求めた。
HPLC装置：Waters社製HPLC Alliance2695-2996
カラム：Waters社製SunfireC18（4.6×150 mm）
移動相：A液−1.5%(w/v)リン酸溶液、Ｂ液−99.9%メタノール（Ｂ液が初発0%、5分後に50%となるようにグラジエントを設定）
試験液注入量：10μl
流速：1.0 ml/min
検出：極大吸収波長である280 nmにおける吸光度でモニター
Method for measuring the amount of 5,6-dihydroxyindole
The weight of 5,6-dihydroxyindole was determined by the following HPLC analysis method, and the 5,6-dihydroxyindole standard product was quantified by an absolute calibration curve method using BIO SYNTH.
(1) Test solution treatment
10 ml of a 0.1% (w / v) phosphoric acid solution containing 1% (w / v) sodium ascorbate was dispensed into a 50 ml volumetric flask. Here, 1.0 g of the test solution was weighed and added, and the volume was measured up to a 50 ml mark with a 0.1% (w / v) phosphoric acid solution.
(2) HPLC analysis The centrifugal supernatant of the test solution thus prepared was subjected to HPLC under the following conditions to determine the peak area of 5,6-dihydroxyindole.
HPLC apparatus: HPLC Alliance2695-2996 manufactured by Waters
Column: Sunfire C18 (4.6 x 150 mm) manufactured by Waters
Mobile phase: Solution A-1.5% (w / v) phosphoric acid solution, Solution B-99.9% methanol (Set the gradient so that solution B is 0% initially and 50% after 5 minutes)
Test solution injection volume: 10 μl
Flow rate: 1.0 ml / min
Detection: Monitored by absorbance at 280 nm, the maximum absorption wavelength
不揮発成分量の測定方法
不揮発成分の重量は、100 mLのメラニン前駆体溶液を窒素雰囲気下、-80℃において凍結し、凍結乾燥装置で48時間乾燥させた後に固形分重量を定量することにより測定した。
Method for measuring the amount of non-volatile components The weight of non-volatile components is measured by freezing a 100 mL melanin precursor solution at -80 ° C in a nitrogen atmosphere and drying it with a freeze-dryer for 48 hours, and then measuring the solid content weight. did.
5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸含有割合の測定条件
5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸含有割合は、5,6-ジヒドロキシインドール及び5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸のHPLC分析を「5,6-ジヒドロキシインドール量の測定方法」と同じ方法で行ってピーク面積を測定することにより求めた。
Conditions for measuring 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid content
The 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid content ratio is determined by HPLC analysis of 5,6-dihydroxyindole-2- and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid as "Method for measuring 5,6-dihydroxyindole amount". The peak area was obtained by the same method.
電気伝導度の測定方法
電気伝導度の測定は、微生物懸濁液を遠心分離し、得られた上清を電気伝導率計(堀場製作所製、B-173)により測定した。
Measuring method of electric conductivity The electric conductivity was measured by centrifuging the microorganism suspension and measuring the obtained supernatant with an electric conductivity meter (B-173, manufactured by Horiba, Ltd.).
実施例１．メラニン前駆体含有溶液の製造方法
下記A, B及びCを30L培養槽に仕込んだ（反応液量23.8L）。この時、DOPAが全量水に溶解することはなく、分散した状態(非溶解状態)で含まれていた。以後、これをDOPA非溶解液と呼ぶ。
A: イオン交換水 21.4 L
B: 微生物懸濁液 238 mL （活性8.6×106U、電気伝導度0.29 mS/cm）
C: DOPA 190 g
撹拌を開始後、酸素ガス通気を開始した。この操作により、酸化反応が開始する。この反応中、反応液のpHが5.5付近になるように6N NaOH又は1N 硫酸を自動添加した。具体的には、反応前半は6N NaOHを自動添加し、反応後半は1N 硫酸を自動添加した。40分で反応終了とし、通気を止めた。培養槽内を窒素雰囲気とし、弱アルカリ性条件(pH7〜9)で18時間弱く撹拌を続け、ドーパクロムから5,6-ジヒドロキシインドールを生成した。その後、反応液をUF膜を用いて除菌、除タンパク処理した。
Example 1. Method for Producing Melanin Precursor-Containing Solution The following A, B and C were charged into a 30 L culture tank (reaction solution volume 23.8 L). At this time, the entire amount of DOPA did not dissolve in water, and was contained in a dispersed state (insoluble state). Hereinafter, this is referred to as DOPA non-dissolved solution.
A: Ion exchange water 21.4 L
B: Microbial suspension 238 mL (activity 8.6 × 10 6 U, electric conductivity 0.29 mS / cm)
C: DOPA 190 g
After starting stirring, oxygen gas aeration was started. By this operation, the oxidation reaction starts. During this reaction, 6N NaOH or 1N sulfuric acid was automatically added so that the pH of the reaction solution was around 5.5. Specifically, 6N NaOH was automatically added in the first half of the reaction, and 1N sulfuric acid was automatically added in the second half of the reaction. The reaction was completed in 40 minutes, and aeration was stopped. The inside of the culture tank was put into a nitrogen atmosphere, and stirring was continued for 18 hours under mildly alkaline conditions (pH 7 to 9) to produce 5,6-dihydroxyindole from dopachrome. Thereafter, the reaction solution was sterilized and protein-removed using a UF membrane.
以上の操作により、除菌、除タンパク済みのメラニン前駆体溶液28.95 kgを得た。得られたメラニン前駆体溶液は、ステンレス製の加圧対応型タンクに入れ、窒素ガスで気相部を置換した上で、約0.1MPaに加圧して、常温で保管した。 By the above operation, 28.95 kg of melanin precursor solution having been sterilized and deproteinized was obtained. The obtained melanin precursor solution was put into a pressurization-compatible tank made of stainless steel, and after replacing the gas phase portion with nitrogen gas, it was pressurized to about 0.1 MPa and stored at room temperature.
得られたメラニン前駆体含有溶液に含まれていた成分：
・5,6-ジヒドロキシインドール濃度：17 mM（0.26重量%）
・不揮発成分重量に占める5,6-ジヒドロキシインドール以外の成分の重量：62重量%
・5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸含有割合：6 %
Components contained in the obtained melanin precursor-containing solution:
・ 5,6-dihydroxyindole concentration: 17 mM (0.26 wt%)
-Weight of components other than 5,6-dihydroxyindole in non-volatile component weight: 62% by weight
-5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid content: 6%
比較例１．メラニン前駆体含有溶液の製造方法
下記A, B及びCを10L培養槽に仕込んだ（反応液量7L）。この時、DOPAは酸性条件下で水に溶解した(DOPA濃度20 mM）。以後、これをDOPA溶解液とする。
A: イオン交換水 6.3 L
B: DOPA 28 g
C: 62.5% 硫酸 14 mL
酸素を通気し、撹拌を開始した。6N NaOHを添加し、pH5.5付近に調整した。反応液に緩衝作用がないため、pHの微調整はできない。直ちに、微生物懸濁液を0.7L添加した(活性4.0×106U、電気伝導度0.88 mS/cm）。これによって、酸化反応が始まる。この反応中、反応液のpHが5.5付近になるように6N NaOH又は1N 硫酸を自動添加した。具体的には、反応前半は6N NaOHを自動添加し、反応後半は1N 硫酸を自動添加した。40分で反応終了とした。培養槽内を窒素雰囲気とし、弱アルカリ性条件(pH7〜9)で一晩弱く撹拌を続け、ドーパクロムから5,6-ジヒドロキシインドールを生成した。その後、反応液をUF膜を用いて除菌、除タンパク処理した。
Comparative Example 1 Method for Producing Melanin Precursor-Containing Solution The following A, B and C were charged into a 10 L culture tank (reaction solution volume 7 L). At this time, DOPA was dissolved in water under acidic conditions (DOPA concentration 20 mM). This is hereinafter referred to as DOPA solution.
A: Ion exchange water 6.3 L
B: DOPA 28 g
C: 62.5% sulfuric acid 14 mL
Oxygen was bubbled and stirring was started. 6N NaOH was added to adjust the pH to around 5.5. Since the reaction solution has no buffering action, the pH cannot be finely adjusted. Immediately 0.7 L of microbial suspension was added (activity 4.0 × 10 6 U, electrical conductivity 0.88 mS / cm). This initiates the oxidation reaction. During this reaction, 6N NaOH or 1N sulfuric acid was automatically added so that the pH of the reaction solution was around 5.5. Specifically, 6N NaOH was automatically added in the first half of the reaction, and 1N sulfuric acid was automatically added in the second half of the reaction. The reaction was completed in 40 minutes. The inside of the culture tank was put into a nitrogen atmosphere, and the stirring was continued overnight under mild alkaline conditions (pH 7-9) to produce 5,6-dihydroxyindole from dopachrome. Thereafter, the reaction solution was sterilized and protein-removed using a UF membrane.
以上の操作により、除菌、除タンパク済みのメラニン前駆体溶液8.4 kgを得た。得られたメラニン前駆体溶液は、ステンレス製の加圧対応型タンクに入れ、窒素ガスで気相部を置換した上で、約0.1MPaに加圧して、常温で保管した。 By the above operation, 8.4 kg of a melanin precursor solution which had been sterilized and deproteinized was obtained. The obtained melanin precursor solution was put into a pressurization-compatible tank made of stainless steel, and after replacing the gas phase portion with nitrogen gas, it was pressurized to about 0.1 MPa and stored at room temperature.
得られたメラニン前駆体含有溶液に含まれていた成分：
・5,6-ジヒドロキシインドール濃度：6.5 mM（0.10重量%）
・不揮発成分重量に占める5,6-ジヒドロキシインドール以外の成分の重量：80重量%
・5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸含有割合：11 %
Components contained in the obtained melanin precursor-containing solution:
・ 5,6-dihydroxyindole concentration: 6.5 mM (0.10% by weight)
-Weight of components other than 5,6-dihydroxyindole in non-volatile component weight: 80% by weight
-5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid content: 11%
上記結果から、実施例１は比較例１と比較して不揮発成分重量に占める5,6-ジヒドロキシインドール以外の成分の重量が減少しており、夾雑物の少ないメラニン前駆体含有溶液が調製できていることが確認された。これは、実施例１では、比較例１と異なりDOPAを溶解するための硫酸を使用しておらず、その結果、中和処理による塩の発生がないと考えられる。また、基質DOPAの物質量に対する生成物5,6-ジヒドロキシインドールの収率を求めると、実施例1は44％、比較例1は33％であり、実施例1の方が高収率である。このことから、DOPA非溶解液の反応は副生成物であるメラニンオリゴマーやメラニンの生成を抑える効果があるものと考えられる。 From the above results, in Example 1, the weight of components other than 5,6-dihydroxyindole occupying the nonvolatile component weight is reduced as compared with Comparative Example 1, and a melanin precursor-containing solution with less impurities can be prepared. It was confirmed that This is considered that Example 1 does not use sulfuric acid for dissolving DOPA unlike Comparative Example 1, and as a result, there is no generation of salt due to neutralization treatment. Further, when the yield of the product 5,6-dihydroxyindole with respect to the amount of the substrate DOPA was determined, Example 1 was 44%, Comparative Example 1 was 33%, and Example 1 had a higher yield. . From this, it is considered that the reaction of the DOPA non-dissolved solution has an effect of suppressing the production of melanin oligomers and melanin which are by-products.
試験例１.微生物懸濁液の電気伝導度の影響検討結果
品質を安定化させるため、微生物懸濁液の電気伝導度管理を行った。これにより微生物懸濁液からの持込不純物を管理する効果が見込まれる。
Test Example 1. Effect of examination of electric conductivity of microorganism suspension In order to stabilize the quality, the electric conductivity of the microorganism suspension was controlled. Thereby, the effect which manages the carrying-in impurity from microbial suspension is anticipated.
微生物を洗浄することにより電気伝導度が種々異なる微生物懸濁液を使用した以外は、実施例１と同様の製造方法でメラニン前駆体含有溶液を製造した。以下の表に、微生物懸濁液の電気伝導度と5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸含有割合の関係を示す。
（製造番号３は、実施例１と同一）
A melanin precursor-containing solution was produced by the same production method as in Example 1 except that microbial suspensions having different electrical conductivities were used by washing the microorganisms. The following table shows the relationship between the electrical conductivity of the microbial suspension and the content of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid.
(Production number 3 is the same as in Example 1)
上記表から、製造番号３と４では5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸含有割合を好ましいレベルである10%以下に抑えられている。また、微生物懸濁液の電気伝導度が0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05の場合にも5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸含有割合を10%以下に抑えられた。 この結果より、微生物懸濁液又は酸化酵素溶液の電気伝導度を概ね0.8 mS/cm以下にコントロールすることにより5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸含有割合を10%以下にできることが分かる。そのため、安全上のリスクを低減することができる。 From the above table, in the production numbers 3 and 4, the 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid content is suppressed to a preferred level of 10% or less. In addition, even when the electrical conductivity of the microbial suspension is 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, the content ratio of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid is 10% or less. It was suppressed. From this result, it is understood that the 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid content can be reduced to 10% or less by controlling the electrical conductivity of the microbial suspension or the oxidase solution to approximately 0.8 mS / cm or less. As a result, safety risks can be reduced.
配合例１．染料溶液
以下、本発明のメラニン前駆体含有溶液を用いた染料溶液の配合例を示す。
Formulation Example 1 Dye solution are shown below formulation examples of the dye solution using a melanin precursor-containing solution of the present invention.
実施例1と比較例1のメラニン前駆体溶液について、それぞれ下記の手順で表２に記載の組成の染料溶液を調製した。 For the melanin precursor solutions of Example 1 and Comparative Example 1, dye solutions having the compositions shown in Table 2 were prepared by the following procedure.
5,6-ジヒドロキシインドール濃度が1.25%に達するまで、遠心式薄膜濃縮装置（大川原製作所製「エバポールラボ」）を用いて濃縮した。 そこへ脱気エタノールを20%重量になる量を加えた。 Concentration was performed using a centrifugal thin film concentrator (“Evapole Lab” manufactured by Okawara Seisakusho) until the 5,6-dihydroxyindole concentration reached 1.25%. Thereto was added deaerated ethanol in an amount of 20% by weight.
この配合操作によって、それぞれの不揮発成分重量に占める5,6-ジヒドロキシインドール以外の成分の重量と、5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸含有割合は変化しなかった。 This blending operation did not change the weight of components other than 5,6-dihydroxyindole and the content of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid in the weight of each nonvolatile component.
実施例1のメラニン前駆体溶液から調製した染料溶液を（イ）、比較例1のメラニン前駆体溶液から調製した染料溶液を（ロ）として、染料溶液の品質を評価した。 The dye solution prepared from the melanin precursor solution of Example 1 was (a) and the dye solution prepared from the melanin precursor solution of Comparative Example 1 was (b), and the quality of the dye solution was evaluated.
評価方法： 空気中にてシャーレに長さ3 cm程度に切断した表３に記載の被染色物を数本入れ、そこへ保管容器から出した染料溶液約5 mLを加える。直後に染料溶液の外観を観察する。10分後に再度染料溶液の外観を観察し、同時に被染色物をシャーレから引き上げ、空気中に10分間放置する。その後、被染色物に付着した染料溶液を水でよく洗い流し、乾燥させた後、黒色に染色されたかどうか目視にて確認した。結果を以下の表３に示す。尚、表３中の+は黒色に染色されたことを示す。 Evaluation method: In a petri dish, put several dyed articles shown in Table 3 cut in a petri dish into a length of about 3 cm, and add about 5 mL of the dye solution removed from the storage container. Immediately afterwards, the appearance of the dye solution is observed. After 10 minutes, the appearance of the dye solution is observed again, and at the same time, the object to be dyed is pulled up from the petri dish and left in the air for 10 minutes. Thereafter, the dye solution adhering to the object to be dyed was thoroughly washed with water, dried, and then visually confirmed whether it was dyed black. The results are shown in Table 3 below. In addition, + in Table 3 shows that it dye | stained black.
この結果より、染料溶液（イ）は、空気中で急速に色が変化する様子が目視でわかり、染色されていく様子を使用者が実感することができる。染色性能に関して、両者に差は認められなかった。また、安全上のリスクは、含有する5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸が少ない（イ）の方が低い。 From this result, it can be visually recognized that the dye solution (I) changes its color rapidly in the air, and the user can feel how it is dyed. There was no difference between the two in terms of dyeing performance. In addition, the safety risk is lower when (a) contains less 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid.
Claims (7)
(1)HPLC分析における5,6-ジヒドロキシインドール-2-カルボン酸のピーク面積が、5,6-ジヒドロキシインドールのピーク面積の10%以下、
(2)不揮発成分重量に占める5,6-ジヒドロキシインドール以外の成分の重量が70重量%未満。 In an undissolved state, at least one substrate compound selected from the group consisting of water, microorganisms capable of producing oxidase or oxidase, and DOPA (3- (3,4-dihydroxyphenyl) alanine) and analogs of DOPA A method for producing a melanin precursor-containing solution having the following characteristics (1) and (2), wherein a melanin precursor is produced by reacting a mixture containing oxygen in the presence of oxygen :
(1) The peak area of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid in HPLC analysis is 10% or less of the peak area of 5,6-dihydroxyindole,
(2) The weight of components other than 5,6-dihydroxyindole in the non-volatile component weight is less than 70% by weight .
当該混合物中に基質化合物が非溶解状態になるように調製することを特徴とする、メラニン前駆体含有溶液中の5,6-ジヒドロキシインドール以外の不揮発成分を低減させる方法。 A mixture of at least one substrate compound selected from the group consisting of water, microorganisms capable of producing oxidase or oxidase, and DOPA and DOPA analogs is reacted in the presence of oxygen to produce a melanin precursor. In the production of the melanin precursor-containing solution,
A method for reducing non-volatile components other than 5,6-dihydroxyindole in a melanin precursor-containing solution, wherein the mixture is prepared so that the substrate compound is in an insoluble state in the mixture.
当該混合物が水、酸化酵素を産生し得る微生物懸濁液又は酸化酵素溶液、並びに基質化合物を混合して調製される、基質化合物を非溶解状態で含むものであり、微生物懸濁液又は酸化酵素溶液の電気伝導度を0.8 mS/cm以下に調整することを特徴とする方法。 A mixture of at least one substrate compound selected from the group consisting of water, microorganisms capable of producing oxidase or oxidase, and DOPA and DOPA analogs is reacted in the presence of oxygen to produce a melanin precursor. A method for reducing the amount of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid relative to 5,6-dihydroxyindole contained in the melanin precursor-containing solution,
The mixture is prepared by mixing water, a microbial suspension or oxidase solution capable of producing oxidase, and the substrate compound, and contains the substrate compound in an undissolved state. Adjusting the electrical conductivity of the solution to 0.8 mS / cm or less.
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