JP5716501B2 - Sample pretreatment method - Google Patents
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Description
本発明は、検体の前処理方法、前処理液、並びにこの検体前処理液を用いた糞便に含まれる成分測定用キット及び成分測定方法に関する。 The present invention relates to a sample pretreatment method, a pretreatment liquid, and a component measurement kit and component measurement method contained in feces using the sample pretreatment liquid.
生体試料を用い、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の成分を測定する方法が知られている。 A method of measuring various components contained in a biological sample using a biological sample and utilizing the specificity of immunological reaction and gene hybridization is known.
本発明者らは、上記方法により糞便検体を測定した場合、測定項目に関係なく異常値が高率で発生する現象があることを見出した。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、糞便検体を用い、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の成分を測定する際に、正確に測定を行うために必要な糞便検体前処理液、並びにこの検体前処理液を用いた糞便に含まれる成分測定用キット及び成分測定方法を提供することを目的としている。
The present inventors have found that when a stool specimen is measured by the above method, there is a phenomenon in which abnormal values occur at a high rate regardless of the measurement item.
The present invention has been made in view of such circumstances, and uses a stool specimen to measure various components contained in the biological sample by utilizing the specificity of immunological reaction and gene hybridization. It is an object of the present invention to provide a stool specimen pretreatment liquid necessary for accurate measurement, and a component measurement kit and a component measurement method contained in stool using this specimen pretreatment liquid.
本発明者らが測定データを解析した結果、異常値の発生は、検出を化学発光法で行った場合に多いことが明らかになった。次いで、本発明者らは、検出系に影響を与える要因に着目して異常値が発生する原因を検討したところ、原因は、糞便に含まれるアルカリホスファターゼによるものであることがわかった。 As a result of analysis of the measurement data by the present inventors, it has been clarified that the occurrence of abnormal values is often caused when the detection is performed by the chemiluminescence method. Next, the present inventors examined the cause of abnormal values by focusing on the factors affecting the detection system, and found that the cause was due to alkaline phosphatase contained in feces.
そこで、本発明者らは、該アルカリホスファターゼの影響を排除する方法について検討し、前処理においてｐＨを０．５〜２．９の間で処理することによりアルカリホスファターゼの影響をなくして、測定の正確性を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。 Therefore, the present inventors examined a method for eliminating the influence of the alkaline phosphatase, and eliminated the influence of the alkaline phosphatase by treating the pH between 0.5 and 2.9 in the pretreatment. The present inventors have found that accuracy can be improved and have completed the present invention.
すなわち本発明は以下の構成からなる。
［項１］
糞便に由来する検体の前処理方法であって、前記検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法。
［項２］
前記前処理方法が、免疫学的反応、または、遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法のために用いられる、項１に記載の前処理方法。
［項３］
前記の目的成分測定法が、検出系に化学発光反応を用いる方法である、項２に記載の検体前処理方法。
［項４］
前記の目的成分測定法が、酵素免疫測定法である、項２または３に記載の検体前処理方法。
［項５］
前記の目的成分が、Ｒｏｔａウイルスである、項２〜４のいずれかに記載の検体前処理方法。
［項６］
項１に記載の前処理方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法。
（１）前記検体を検体抽出液に懸濁し懸濁液とする工程
（２）前記懸濁液のｐＨを０．５〜２．９の間になるよう調整する工程
（３）（２）で処理した懸濁液のｐＨを６．０〜８．０の間になるよう調整する工程
［項７］
糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法であって、以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする目的成分測定法。
（１）糞便に由来する検体を、項１〜６のいずれかに記載の検体前処理方法で、処理する工程
（２）免疫学的反応、または、遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する工程
［項８］
前記の目的成分測定法が、検出系に化学発光反応を用いる方法である、項７に記載の目的成分測定法。
［項９］
前記の目的成分測定法が、酵素免疫測定法である、項７または８に記載の目的成分測定法。
［項１０］
前記の酵素免疫測定法が、以下の（Ａ）に記載された（ａ）から（ｅ）の工程、または、（Ｂ）に記載された（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法である、項９に記載の目的成分測定法。
（Ａ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）を含む溶液とを接触させて、試薬１と該目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタの表面に、上記目的成分に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体（試薬２）の溶液を滴下して、試薬２を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体と目的成分との複合体に結合させる工程。
（ｄ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｅ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
（Ｂ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分で該目的成分に結合する第二の抗体が酵素で標識された第二の抗体（試薬２）を接触させて、試薬１と試薬２と目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｄ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
［項１１］
項１〜６のいずれかに記載の糞便に由来する検体の前処理方法に用いるためのセットであって、ｐＨ２．９未満の酸性水溶液、または、ｐＨ０．５〜２．９の間の緩衝液を含むことを特徴とする検体前処理用セット。
［項１２］
項７〜１０のいずれかに記載の糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法に用いるためのキットであって、以下の（１）〜（３）の構成を含むことを特徴とするキット。
（１）項１１に記載の検体前処理用セット
（２）前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第一の抗体
（３）前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第二の抗体
（４）未結合の検体・抗体を除去するための洗浄液
（５）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、測定するための発光基質
That is, the present invention has the following configuration.
[Claim 1]
A pretreatment method for a specimen derived from feces, the method comprising the step of suspending the specimen in a state where the pH is maintained within a range of 0.5 to 2.9. .
[Section 2]
Item 1. The pretreatment method is used for a method of measuring a target component contained in a specimen derived from stool using an immunological reaction or specificity of an interaction in which a gene hybridizes. The pretreatment method described in 1.
[Section 3]
Item 3. The specimen pretreatment method according to Item 2, wherein the target component measurement method is a method using a chemiluminescence reaction in a detection system.
[Claim 4]
Item 4. The specimen pretreatment method according to Item 2 or 3, wherein the target component measurement method is an enzyme immunoassay.
[Section 5]
Item 5. The specimen pretreatment method according to any one of Items 2 to 4, wherein the target component is Rota virus.
[Claim 6]
Item 2. A pretreatment method according to Item 1, comprising the following steps (1) to (3):
(1) Step of suspending the specimen in a specimen extract to form a suspension (2) Step of adjusting the pH of the suspension to be between 0.5 and 2.9 (3) (2) Adjusting the pH of the treated suspension so as to be between 6.0 and 8.0 [Section 7]
A method for measuring a target component contained in a specimen derived from stool, comprising the following steps (1) and (2):
(1) A step of treating a sample derived from stool with the sample pretreatment method according to any one of Items 1 to 6 (2) Specificity of an immunological reaction or an interaction with which a gene hybridizes A step of measuring a target component contained in a sample derived from stool using [8]
Item 8. The target component measurement method according to Item 7, wherein the target component measurement method is a method using a chemiluminescence reaction in a detection system.
[Claim 9]
Item 9. The target component measurement method according to Item 7 or 8, wherein the target component measurement method is an enzyme immunoassay.
[Section 10]
The enzyme immunoassay is a method comprising the steps (a) to (e) described in the following (A) or the steps (a) to (d) described in (B). Item 10. The method for measuring the target component according to Item 9.
(A)
(A) A treated specimen containing a target component is brought into contact with a solution containing a conjugate (reagent 1) in which a ligand is bound to a first antibody that specifically binds to the target component, so that reagent 1 and the target Forming a complex with the component in solution.
(B) A step of dropping a solution containing the complex onto the surface of the porous filter to which the ligand capturing agent is bound to bind the ligand portion of the complex to the ligand capturing agent.
(C) A solution of a second antibody (reagent 2) labeled with an enzyme that specifically binds to the target component is dropped on the surface of the porous filter, and the reagent 2 is combined with a ligand-trapping agent and a ligand. Binding to the complex of the first antibody and target component bound to the porous filter via the portion.
(D) A step of removing the reagent not bound to the porous filter by washing the porous filter.
(E) The process of measuring the activity of the enzyme couple | bonded with the porous filter using a luminescent substrate.
(B)
(A) a treated specimen containing a target component, a conjugate (reagent 1) in which a ligand is bound to a first antibody that specifically binds to the target component, and a first that specifically binds to the target component A second antibody (reagent 2), which is an antibody different from the antibody, and in which the second antibody that binds to the target component at the same or different part as the first antibody is contacted with an enzyme, Forming a complex of 1, reagent 2 and a target component in a solution;
(B) A step of dropping a solution containing the complex onto the surface of the porous filter to which the ligand capturing agent is bound to bind the ligand portion of the complex to the ligand capturing agent.
(C) The process of removing the reagent which is not couple | bonded with the porous filter by wash | cleaning a porous filter.
(D) A step of measuring the activity of the enzyme bound to the porous filter using a luminescent substrate.
[Section 11]
Item 7. A set for use in the pretreatment method for a specimen derived from stool according to any one of Items 1 to 6, wherein the acidic aqueous solution has a pH of less than 2.9, or a buffer solution having a pH of 0.5 to 2.9. A specimen pretreatment set comprising:
[Claim 12]
A kit for use in a method for measuring a target component contained in a specimen derived from stool according to any one of Items 7 to 10, comprising the following configurations (1) to (3): Kit to do.
(1) The sample pretreatment set according to item 11 (2) A first antibody that specifically binds to a target component contained in the sample (3) A first antibody that specifically binds to a target component contained in the sample Second antibody (4) Washing solution for removing unbound specimen / antibody (5) Luminescent substrate for measuring the activity of the enzyme bound to the porous filter
糞便検体を用い、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の成分を測定する場合において、本発明の検体前処理液を用いて糞便検体を前処理することにより、正確性の高い測定が可能になる。
本発明の検体前処理方法によれば、ｐＨを０．５〜２．９の間で処理することにより、糞便検体に含まれるアルカリホスファターゼが不可逆的に活性を失い、発光測定系で用いている発光基質に非特異的に反応することを防ぐことができ、これにより、その測定における正確性を向上させることができる。
In the case where various components contained in the biological sample are measured using an immunological reaction or the specificity of hybridization of a gene using the stool sample, the stool sample is prepared using the sample pretreatment liquid of the present invention. Preprocessing makes it possible to measure with high accuracy.
According to the specimen pretreatment method of the present invention, alkaline phosphatase contained in a stool specimen loses its activity irreversibly by treating the pH between 0.5 and 2.9, and is used in a luminescence measurement system. Non-specific reaction with the luminescent substrate can be prevented, thereby improving accuracy in the measurement.
以下、本発明を詳述するが、これに限定されるものではない。 Hereinafter, although this invention is explained in full detail, it is not limited to this.
本発明の実施形態の一つは、糞便に由来する検体の前処理方法であって、前記検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程を含むことを特徴とする検体の前処理方法である。 One embodiment of the present invention is a method for pretreatment of a specimen derived from stool, comprising a step of suspending the specimen in a state where the pH is maintained within a range of 0.5 to 2.9. This is a sample pretreatment method.
本発明の前処理方法に適用される検体は、特に限定されない。糞便に由来するものとして、糞便そのものや、糞便を緩衝液などの水溶液で懸濁したもの、あるいは、それらを濾過などの手段で清澄化したものなどが例示される。また、生体から採取できるものに限らず、糞便を種々の方法で処理したものや、糞便由来の成分が含まれる可能性のあるものも糞便に由来する検体として、本発明の前処理方法を適用できる。
検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒、糞便採取器具などを用いて採取することができる。
The specimen applied to the pretreatment method of the present invention is not particularly limited. Examples of those derived from stool include stool itself, stool suspended in an aqueous solution such as a buffer solution, or clarified by means such as filtration. In addition, the pretreatment method of the present invention is applied not only to samples that can be collected from living organisms, but also to samples that have been treated with various methods of feces and those that may contain stool-derived components. it can.
The method for collecting the specimen is not particularly limited, and a known method can be adopted. Specifically, it can be collected using a cotton swab, a stool collection device or the like.
本発明の前処理方法における懸濁操作は特に限定されないが、例えば、検体採取に用いた綿棒を用いて懸濁液を攪拌することにより行うことが出来る。 The suspension operation in the pretreatment method of the present invention is not particularly limited, and can be performed, for example, by stirring the suspension using a cotton swab used for specimen collection.
本発明の前処理方法において、糞便に由来する検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁するための手段は、特に限定されない。
例えば、糞便に由来する検体を懸濁することが出来る溶液であって、前記検体との混合時にそのような範囲のｐＨになるような溶液（本明細書ではこのような溶液を「前処理液」ともよぶ。）を用いればよい。例えば、ｐＨが０．５〜２．９の範囲で調整された前処理液で前記検体を懸濁させることにより行うことができる。
In the pretreatment method of the present invention, the means for suspending the specimen derived from stool while maintaining the pH within the range of 0.5 to 2.9 is not particularly limited.
For example, a solution capable of suspending a specimen derived from stool and having a pH in such a range upon mixing with the specimen (in this specification, such a solution is referred to as “pretreatment liquid”). ")"). For example, it can be carried out by suspending the specimen with a pretreatment liquid whose pH is adjusted in the range of 0.5 to 2.9.
また、上記工程は必要に応じて、ｐHが２．９を越える範囲で調整された溶液（本明細書ではこのような溶液を「検体抽出液」ともよぶ。）に糞便に由来する検体を懸濁する工程と、前記懸濁液のｐHを０．５〜２．９の範囲になるよう調整する工程とに分けても良い。
前記懸濁液のｐHを調整する手段としては、例えば、「ｐＨが０．５〜２．９の範囲で調整された前処理液」を添加すればよい。
工程を分ける場合、検体抽出液と前処理液とを混合するときの液量比は特に限定されないが、検体抽出液：前処理液＝３：２の割合が好ましい。
In addition, in the above steps, a sample derived from stool is suspended in a solution adjusted in a range where the pH exceeds 2.9 as necessary (this solution is also referred to as “specimen extract” in this specification). You may divide into the process which becomes cloudy, and the process which adjusts pH of the said suspension so that it may become the range of 0.5-2.9.
As a means for adjusting the pH of the suspension, for example, “a pretreatment liquid whose pH is adjusted in the range of 0.5 to 2.9” may be added.
When the steps are divided, the liquid volume ratio when the sample extract and the pretreatment liquid are mixed is not particularly limited, but a ratio of the sample extract: pretreatment liquid = 3: 2 is preferable.
前処理液としては、ｐＨが０．５〜２．９の範囲で調整されたものであれば特に限定されないが、種々の無機酸や有機酸などの酸類、または、酸性に調整された緩衝液が例示できる。
さらに具体的には、塩酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、リン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、セリン塩酸緩衝液、アラニン塩酸緩衝液が例示でき、中でもグリシン塩酸緩衝液、セリン塩酸緩衝液、アラニン塩酸緩衝液が好ましい。
酸類など実質的に緩衝能を持たない場合は、濃度は限定されないが０．５Mから２．０Mが好ましい。また、ｐＨは０．５〜２．９であれば特に限定されないが、２．０以下が好ましい。
酸性に調整された緩衝液の場合、濃度は限定されないが０．５Mから２．０Mが好ましい。また、ｐＨは０．５〜２．９であれば特に限定されないが、２．５以下が好ましい。
The pretreatment liquid is not particularly limited as long as the pH is adjusted in the range of 0.5 to 2.9, but various acids such as inorganic acids and organic acids, or buffer solutions adjusted to acidity. Can be illustrated.
More specifically, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, phosphate buffer, glycine hydrochloric acid buffer, serine hydrochloric acid buffer, alanine hydrochloric acid buffer can be exemplified, among which glycine hydrochloric acid buffer, serine hydrochloric acid buffer, Alanine hydrochloride buffer is preferred.
In the case of having substantially no buffer capacity such as acids, the concentration is not limited, but 0.5M to 2.0M is preferable. Moreover, although pH will not be specifically limited if it is 0.5-2.9, 2.0 or less is preferable.
In the case of a buffer adjusted to be acidic, the concentration is not limited, but is preferably 0.5M to 2.0M. Moreover, although pH will not be specifically limited if it is 0.5-2.9, 2.5 or less are preferable.
糞便に由来する検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程においては、前処理した検体の目的成分を測定する際における非特異的発光の防止効果を上げるために、また、当該測定において免疫学的反応を使用する場合は免疫反応の感度を上げるために、界面活性剤を含んでもよい。
界面活性剤としては、特に限定されるものではないが、非イオン性界面活性剤が好ましい。例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃなどが挙げられる。
界面活性剤の濃度は０．１０重量％から０．２５重量％が好ましい。中でも０．２５重量％が好ましい。
界面活性剤は、前処理液に添加されていても良いし、検体抽出液に添加されていてもよい。
In the step of suspending the specimen derived from stool while maintaining the pH within the range of 0.5 to 2.9, the effect of preventing nonspecific luminescence when measuring the target component of the pretreated specimen In order to increase the sensitivity, and when an immunological reaction is used in the measurement, a surfactant may be included to increase the sensitivity of the immune reaction.
Although it does not specifically limit as surfactant, A nonionic surfactant is preferable. For example, Triton X-100, Tween 20, Pluronic and the like can be mentioned.
The concentration of the surfactant is preferably 0.10% by weight to 0.25% by weight. Of these, 0.25% by weight is preferred.
The surfactant may be added to the pretreatment liquid or may be added to the specimen extract.
糞便に由来する検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程においては、前処理した検体の目的成分を測定する際において免疫学的反応を使用する場合は、前記検体を懸濁する際に、抗原が該懸濁液を入れる容器の表面へ吸着することを防止するために、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含んでも良い。また、防腐のためにアジ化ナトリウムなどの各種防腐剤を含んでも良い。
これらの試薬は、前処理液に添加されていても良いし、検体抽出液に添加されていてもよい。
In the step of suspending a specimen derived from stool while maintaining the pH within the range of 0.5 to 2.9, an immunological reaction is used in measuring the target component of the pretreated specimen. In this case, BSA (bovine serum albumin) may be included in order to prevent the antigen from adsorbing to the surface of the container in which the suspension is placed when the specimen is suspended. Further, various preservatives such as sodium azide may be included for preserving.
These reagents may be added to the pretreatment liquid, or may be added to the specimen extract.
上記工程の処理時間は特に限定されないが、３０秒から５分の間が好ましい。 Although the processing time of the said process is not specifically limited, Between 30 second and 5 minutes are preferable.
糞便に由来する検体をｐＨが０．５〜２．９の範囲内に保たれた状態で懸濁する工程の後には、必要に応じて、懸濁液のｐHを６．０から８．０の間に調整する工程を含んでも良い。
ｐＨを６．０〜８．０の間に調整する方法は、混合時にそのようなｐＨになるように溶液（本明細書ではこのような溶液を「中和液」ともよぶ。）を添加するのであれば、特に限定されない。例えば検体抽出液にｐＨが６．０を越える溶液を含有させることにより行うことができる。
After the step of suspending the specimen derived from stool while maintaining the pH within the range of 0.5 to 2.9, the pH of the suspension is changed from 6.0 to 8.0, if necessary. A step of adjusting during the period may be included.
The method of adjusting the pH between 6.0 and 8.0 is to add a solution (this solution is also referred to as “neutralizing solution” in this specification) so that such a pH is obtained during mixing. If it is, it will not specifically limit. For example, it can be carried out by adding a solution having a pH exceeding 6.0 to the specimen extract.
中和液としては、ｐＨが６．０を越える範囲で調整されたものであれば特に限定されない。アルカリ溶液類、または、アルカリ性に調整された緩衝液が例示できる。
さらに具体的には、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、グリシン‐ＮａＯＨ緩衝液、トリシン‐ＮａＯＨ緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液が例示でき、中でもトリシン‐ＮａＯＨ緩衝液が好ましい。
アルカリ溶液類など実質的に緩衝能を持たない場合は、濃度は限定されないが０．０５Mから２．０Mが好ましい。また、ｐＨは６．０以上であれば特に限定されないが、１２．０以上が好ましい。
アルカリ性に調整された緩衝液の場合、濃度は限定されないが０．５Mから２．０Mが好ましい。また、ｐＨは６．０以上であれば特に限定されないが、７．０〜９．０の塩基性の範囲の溶液が好ましく、７．０〜８．０が更に好ましい。
先の工程でｐHを０．５〜２．９の範囲になるよう調整した溶液と、上記ｐＨが６．０を越える溶液との液量比は特に限定されないが、２：１の割合が好ましい。
The neutralizing solution is not particularly limited as long as the pH is adjusted in a range exceeding 6.0. Alkaline solutions or buffers adjusted to be alkaline can be exemplified.
More specifically, an aqueous solution of sodium hydroxide, an aqueous solution of potassium hydroxide, an aqueous solution of sodium bicarbonate, an aqueous solution of sodium carbonate, a glycine-NaOH buffer solution, a tricine-NaOH buffer solution, a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, a Tris hydrochloride buffer Examples of the solution include tricine-NaOH buffer.
In the case where it does not substantially have a buffering capacity such as an alkaline solution, the concentration is not limited, but 0.05M to 2.0M is preferable. Moreover, if pH is 6.0 or more, it will not specifically limit, but 12.0 or more is preferable.
In the case of a buffer adjusted to be alkaline, the concentration is not limited, but is preferably 0.5M to 2.0M. Moreover, if pH is 6.0 or more, it will not specifically limit, However, The solution of the basic range of 7.0-9.0 is preferable, and 7.0-8.0 are still more preferable.
The liquid volume ratio of the solution adjusted to have a pH in the range of 0.5 to 2.9 in the previous step and the solution having a pH exceeding 6.0 is not particularly limited, but a ratio of 2: 1 is preferable. .
上記工程の処理時間は特に限定されないが、３０秒から５分の間が好ましい。 Although the processing time of the said process is not specifically limited, Between 30 second and 5 minutes are preferable.
本発明の前処理方法で処理された検体は、特に限定されることなく種々の測定方法に適用することができる。
例えば、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の目的成分を測定する方法が例示できる。
免疫学的方法としては、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、免疫比濁測定法、免疫凝集測定法などが例示できる。
遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用した方法としては、ＬＡＭＰ法、Ｑプローブ法などが例示できる。
本発明の検体前処理方法が適用される測定項目は、特に限定されるものではないが、例えば、糞便に含まれるＲｏｔａウイルスの検出に利用することができる。
The specimen processed by the pretreatment method of the present invention is not particularly limited and can be applied to various measurement methods.
For example, a method of measuring various target components contained in the biological sample by utilizing the specificity of the immunological reaction or the interaction with which the gene hybridizes can be exemplified.
Examples of the immunological method include enzyme immunoassay, radioimmunoassay, immunoturbidimetric assay, and immunoagglutination assay.
Examples of the method utilizing the specificity of the interaction in which the gene hybridizes include the LAMP method and the Q probe method.
The measurement items to which the sample pretreatment method of the present invention is applied are not particularly limited, and can be used for, for example, detection of Rota virus contained in stool.
本発明の前処理方法は、中でも、検出系に化学発光反応を用いる目的成分測定方法に好ましく適用できる。
化学発光反応を用いる検出系としては、特に限定されるものではないが、ウエスタンブロッティング法、免疫共沈降法、酵素免疫測定法などが挙げられる。
In particular, the pretreatment method of the present invention can be preferably applied to a target component measurement method using a chemiluminescence reaction in a detection system.
The detection system using a chemiluminescence reaction is not particularly limited, and examples include Western blotting, co-immunoprecipitation, and enzyme immunoassay.
本発明の実施形態の一つは、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法であって、以下の（１）および（２）の工程を含むことを特徴とする目的成分測定法である。
（１）糞便に由来する検体を、上述の検体前処理方法で、処理する工程
（２）免疫学的反応、または、遺伝子がハイブリダイズする相互作用の特異性を利用して、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する工程
One embodiment of the present invention is a method for measuring a target component contained in a sample derived from stool, and includes the following steps (1) and (2): It is.
(1) A step of processing a sample derived from stool by the above-described sample pretreatment method (2) Derived from stool using the specificity of an immunological reaction or an interaction in which a gene hybridizes The process of measuring the target component contained in the specimen
当該実施形態における検体前処理方法については、上記で詳しく説明したとおりである。
また、当該実施形態における目的成分測定方法としては、特に限定されないが、例えば、以下の（Ａ）に記載された（ａ）から（ｅ）の工程、または、（Ｂ）に記載された（ａ）から（ｄ）の工程を含む酵素免疫測定法が例示できる。この測定法は、特開２００１−２３５４７１号公報（特許文献１）などで公知である。
（Ａ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）を含む溶液とを接触させて、試薬１と該目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタの表面に、上記目的成分に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体（試薬２）の溶液を滴下して、試薬２を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体と目的成分との複合体に結合させる工程。
（ｄ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｅ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
（Ｂ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分で該目的成分に結合する第二の抗体が酵素で標識された第二の抗体（試薬２）を接触させて、試薬１と試薬２と目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｄ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
The specimen pretreatment method in this embodiment is as described in detail above.
In addition, the target component measurement method in the embodiment is not particularly limited. For example, the steps (a) to (e) described in the following (A) or (a) described in (B) (a) The enzyme immunoassay method including the steps (d) to (d) can be exemplified. This measuring method is known in Japanese Patent Laid-Open No. 2001-235471 (Patent Document 1) and the like.
(A)
(A) A treated specimen containing a target component is brought into contact with a solution containing a conjugate (reagent 1) in which a ligand is bound to a first antibody that specifically binds to the target component, so that reagent 1 and the target Forming a complex with the component in solution.
(B) A step of dropping a solution containing the complex onto the surface of the porous filter to which the ligand capturing agent is bound to bind the ligand portion of the complex to the ligand capturing agent.
(C) A solution of a second antibody (reagent 2) labeled with an enzyme that specifically binds to the target component is dropped on the surface of the porous filter, and the reagent 2 is combined with a ligand-trapping agent and a ligand. Binding to the complex of the first antibody and target component bound to the porous filter via the portion.
(D) A step of removing the reagent not bound to the porous filter by washing the porous filter.
(E) The process of measuring the activity of the enzyme couple | bonded with the porous filter using a luminescent substrate.
(B)
(A) a treated specimen containing a target component, a conjugate (reagent 1) in which a ligand is bound to a first antibody that specifically binds to the target component, and a first that specifically binds to the target component A second antibody (reagent 2), which is an antibody different from the antibody, and in which the second antibody that binds to the target component at the same or different part as the first antibody is contacted with an enzyme, Forming a complex of 1, reagent 2 and a target component in a solution;
(B) A step of dropping a solution containing the complex onto the surface of the porous filter to which the ligand capturing agent is bound to bind the ligand portion of the complex to the ligand capturing agent.
(C) The process of removing the reagent which is not couple | bonded with the porous filter by wash | cleaning a porous filter.
(D) A step of measuring the activity of the enzyme bound to the porous filter using a luminescent substrate.
本発明の実施形態の一つは、上記で説明した糞便に由来する検体の前処理方法に用いるためのセットであって、ｐＨ２．９未満の酸性水溶液、もしくは、ｐＨ０．５〜２．９の間の酸性緩衝液を含むことを特徴とする検体前処理用セットである。 One of the embodiments of the present invention is a set for use in the pretreatment method of the specimen derived from stool described above, an acidic aqueous solution having a pH of less than 2.9, or a pH of 0.5 to 2.9. A sample pretreatment set comprising an acidic buffer solution in between.
セットの各構成については、本発明の前処理方法の項で説明したとおりである。 Each configuration of the set is as described in the section of the preprocessing method of the present invention.
本発明の実施形態の一つは、糞便に由来する検体に含まれる目的成分を測定する方法に用いるためのキットであって、上記で説明した検体前処理用のセットに加え、さらに、目的成分を測定するために必要な試薬構成を含むものである。
検体に含まれる目的成分を測定するために必要な試薬構成部分については、特に限定されない。例えば、下記の全てを含む一式が例示される。
・前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第一の抗体、
・前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第二の抗体、
・未結合の検体・抗体を除去するための洗浄液、および、
・多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定するための発光基質
One embodiment of the present invention is a kit for use in a method for measuring a target component contained in a sample derived from stool, and in addition to the sample pretreatment set described above, the target component The reagent configuration necessary for measuring
There are no particular limitations on the reagent components necessary for measuring the target component contained in the specimen. For example, a set including all of the following is exemplified.
A first antibody that specifically binds to a target component contained in the specimen,
A second antibody that specifically binds to a target component contained in the specimen,
A washing solution for removing unbound specimens and antibodies, and
・ Luminescent substrates for measuring the activity of enzymes bound to porous filters
（実施例）
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
(Example)
The following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited thereto.
（実験１）ビオチン標識抗ロタウイルス抗体の調製
抗ロタウイルスマウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）１ ｍｇとビオチンアミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを２５℃で４時間反応させ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（ミリポア社製）を用いて分画し、第１抗体液を調製した。
（実験２）ＡＬＰ標識抗ロタウイルス抗体の調製
抗ロタウイルスマウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）０．１ ｍｇをＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ - ＳＨ（同人化学社製）を用いて、第２抗体液を調製した。
（実験３）ロタウイルス抗原測定の実施
症状から明らかにロタウイルス感染症でない人より糞便を採取し、そのうちイムノクロマト法を原理とする市販のロタウイルス検出キット（日本ベクトン・ディッキンソン社 商品名ＢＤ Ｒｏｔａ／Ａｄｅｎｏ エグザマンＴＭ スティック）でロタウイルス感染症陰性であることを確認できた糞便を使用し（５４例）、ロタウイルス抗原を測定した。
検体抽出液としては、０．１５重量％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク社製）、０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０（ナカライテスク社製）、１重量％ ＢＳＡを含む溶液を用い、糞便を前記検体抽出液に懸濁したものを検体とした。
検体７５μｌに第１抗体液２０μｌを添加し、混合後、４０℃でインキュベーションした（検体・第１抗体液混合液）。１０秒後に、検体・第１抗体液混合液７０μｌをあらかじめ５０μｌの蒸留水を添加したＰＯＣｕｂｅ（東洋紡績社製）専用反応容器（第１抗体に結合したリガンドを特異的に認識するリガンド捕捉剤が結合された多孔性フィルタ（抗ビオチン抗体を結合させたガラスフィルター固相）を含む容器。）に添加し、さらに、第２抗体液を２０μｌ添加し、４０℃でインキュベーションした。１５０秒後に、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む蒸留水を８０μｌずつ２回添加し、さらに発色基質としてＬｕｍｉｇｅｎＴＭ ＡＰＳ−５（Ｌｕｍｉｇｅｎ社製）を３０μｌ添加し、発光強度を測定した。発光強度で１００００以上を示す検体をロタウイルス感染症陽性と判定した。
その結果、５４例中、すべての検体で非特異的な発光が検出され、擬陽性を示した。
(Experiment 1) Preparation of biotin-labeled anti-rotavirus antibody 1 mg of anti-rotavirus mouse monoclonal antibody (Fitzgerald) was reacted with biotinamidocaproic acid-N-hydroxysuccinimide ester at 25 ° C. for 4 hours to give Amicon Ultra-4 (Millipore). And the first antibody solution was prepared.
(Experiment 2) Preparation of ALP-labeled anti-rotavirus antibody A second antibody solution was prepared using Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH (manufactured by Doujin Chemical) 0.1 mg of anti-rotavirus mouse monoclonal antibody (Fitzgerald). .
(Experiment 3) Implementation of rotavirus antigen measurement Feces collected from a person who is clearly not rotavirus-infected from the symptoms, of which a commercially available rotavirus detection kit based on the immunochromatography method (Nippon Becton Dickinson's trade name BD Rota / Feces that were confirmed to be negative for rotavirus infection with Adeno Examan ™ Stick) (54 cases) were used to measure rotavirus antigen.
As the sample extract, a solution containing 0.15% by weight Triton X-100 (manufactured by Nacalai Tesque), 0.1% by weight Tween 20 (manufactured by Nacalai Tesque), and 1% by weight BSA was used, and feces were extracted from the sample. A sample suspended in the liquid was used as a specimen.
20 μl of the first antibody solution was added to 75 μl of the sample, mixed, and incubated at 40 ° C. (sample / first antibody solution mixed solution). After 10 seconds, 70 μl of the sample / first antibody liquid mixture was added to a reaction vessel dedicated to POCube (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) to which 50 μl of distilled water had been added in advance (a ligand capture agent that specifically recognizes the ligand bound to the first antibody) 20 μl of the second antibody solution was further added and incubated at 40 ° C .. The vessel was added to a bound porous filter (a container containing a glass filter solid phase to which an anti-biotin antibody was bound). After 150 seconds, 80 μl of distilled water containing 0.05% Tween 20 was added twice, 30 μl of Lumigen ™ APS-5 (manufactured by Lumigen) was added as a chromogenic substrate, and the luminescence intensity was measured. A specimen showing a luminescence intensity of 10,000 or more was determined to be positive for rotavirus infection.
As a result, non-specific luminescence was detected in all specimens in 54 cases, indicating false positives.
実験３に用いた発光基質であるＬｕｍｉｇｅｎＴＭ ＡＰＳ−５はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）依存的であり、非特異的な発光は糞便に含まれるＡＬＰであると推測される。そこで実験３で用いた糞便のうち３例を用いてＡＬＰ活性を調べた。また、ネガティブコントロールとして検体抽出液も測定した。
（実験４）ＡＬＰ測定試薬の調製
９．６６ｍｌのジエタノールアミン（ナカライテスク社製）を蒸留水６０ｍｌで希釈後、０．１Ｍ 塩化マグネシウム水溶液 ０．２５ｍｌを添加した。さらに、２．０Ｍ ＨＣｌでｐＨを１０．１に調整し、最終液量を１００ｍｌとして、試薬Ａとした。また、３７１ｍｇのｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（ナカライテスク社製）を１０ｍｌの試薬Ａに溶解して、試薬Ｂとした。
（実験５）ＡＬＰ活性測定の実施
試薬Ａ ２．６ｍｌと試薬Ｂ ０．３ｍｌとを混合し、３７℃で５分間予備加温した。続いて（実験３）で用いた検体０．１ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、水を対象に、３７℃に制御された分光光度計で４０５ｎｍの吸光度変化を３から４分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化量を測定した。得られた結果を（実験３）で得られた発光強度のデータと合わせて表１に示す。
Lumigen ™ APS-5, which is a luminescent substrate used in Experiment 3, is dependent on alkaline phosphatase (ALP), and nonspecific luminescence is presumed to be ALP contained in feces. Therefore, ALP activity was examined using 3 cases of feces used in Experiment 3. Moreover, the sample extract was also measured as a negative control.
(Experiment 4) Preparation of ALP measuring reagent 9.66 ml of diethanolamine (manufactured by Nacalai Tesque) was diluted with 60 ml of distilled water, and then 0.25 ml of 0.1 M magnesium chloride aqueous solution was added. Furthermore, the pH was adjusted to 10.1 with 2.0 M HCl, the final solution volume was 100 ml, and reagent A was obtained. Also, 371 mg of p-nitrophenyl phosphate disodium salt (manufactured by Nacalai Tesque) was dissolved in 10 ml of reagent A to obtain reagent B.
(Experiment 5) Implementation of ALP activity measurement Reagent A 2.6 ml and reagent B 0.3 ml were mixed and pre-warmed at 37 ° C. for 5 minutes. Subsequently, 0.1 ml of the sample used in (Experiment 3) was added, mixed gently, and the absorbance change at 405 nm was recorded for 3 to 4 minutes using a spectrophotometer controlled at 37 ° C. for water. The amount of change in absorbance per minute was measured from the initial linear portion. The obtained results are shown in Table 1 together with the emission intensity data obtained in (Experiment 3).
表１の結果から、糞便では、ＡＬＰ活性を示す吸光度変化量がネガティブコントロールである検体抽出液に比べて有意に高いことが確認できた。このことから、糞便が高い発光強度を示す原因は糞便中のＡＬＰの影響であると言える。 From the results in Table 1, it was confirmed that the change in absorbance indicating ALP activity was significantly higher in stool than in the sample extract as a negative control. From this, it can be said that the cause of stool showing high luminescence intensity is the influence of ALP in stool.
ＡＬＰはアルカリ性条件下で有意に働く酵素であり、強酸性にすることで失活させることができると考え、前処理液として数種の酸性溶液を用いて、糞便中のＡＬＰを失活させようと考えた。
（実験６）酸処理後の糞便中のＡＬＰ活性測定の実施
７種類の酸性溶液を用いてロタウイルス感染症陰性である糞便中のＡＬＰ活性測定を測定した。糞便を（実験３）で用いた検体抽出液に懸濁し、そのうち３０μｌに前処理液として酸性溶液２０μｌを加えて４０℃、１分間処理後、中和液として、１．０Ｍ，ｐＨ８．０のＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液 ５０μｌでｐＨ７に中和した。酸処理後、中和した検体を用いて、（実験５）と同様の方法でＡＬＰ活性測定を実施した。得られた結果を酸処理後のｐＨのデータと合わせて表２に示す。
ALP is an enzyme that works significantly under alkaline conditions, and can be inactivated by making it strongly acidic, so let's inactivate ALP in feces using several types of acidic solutions as pretreatment liquid I thought.
(Experiment 6) Measurement of ALP activity in stool after acid treatment The measurement of ALP activity in stool negative for rotavirus infection was measured using seven types of acidic solutions. Feces were suspended in the sample extract used in (Experiment 3), 20 μl of an acidic solution was added to 30 μl as a pretreatment solution, treated at 40 ° C. for 1 minute, and then 1.0 M, pH 8.0 as a neutralization solution. Neutralized to pH 7 with 50 μl of Tricine buffer. After the acid treatment, ALP activity was measured in the same manner as in (Experiment 5) using the neutralized specimen. The obtained results are shown in Table 2 together with pH data after acid treatment.
表２の結果から、酢酸以外の酸では有意にＡＬＰ活性を低減させる効果があることが確認できた。 From the results shown in Table 2, it was confirmed that acids other than acetic acid have a significant effect of reducing ALP activity.
（実験７）ロタウイルス抗原測定の実施
（実験６）で用いた７種類の酸性溶液で処理し、中和した陰性検体を用いてロタウイルス抗原量測定を行った。測定方法は（実験３）と同様の方法で行った。得られた結果を酸処理後のｐＨのデータと合わせて表３に示す。
(Experiment 7) Implementation of rotavirus antigen measurement The amount of rotavirus antigen was measured using negative samples that were treated with the seven acidic solutions used in (Experiment 6) and neutralized. The measurement method was the same as in (Experiment 3). The obtained results are shown in Table 3 together with pH data after acid treatment.
（実験８）処理に用いる酸のｐＨと、ＡＬＰ活性、ＰＯＣｕｂｅ測定値の関係の検証
（実験６）で用いた酸のうち、Ｇｌｙ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、ｐＨ ０．５から４．０に調整した１５種類の溶液を準備し、それぞれの溶液を用いて陰性検体に対して酸処理を行い、ＡＬＰ活性測定とＰＯＣｕｂｅ測定値との関係を調べた。得られた結果を表４に示す。また、ＡＬＰ活性とＰＯＣｕｂｅ測定値との相関を図１に示す。
(Experiment 8) Verification of relationship between pH of acid used for treatment, ALP activity, and POCube measurement value Among acids used in (Experiment 6), pH 0.5 to 4.0 using Gly-HCl buffer. 15 types of solutions prepared in the above were prepared, and each sample was subjected to acid treatment on a negative sample, and the relationship between the ALP activity measurement and the POCube measurement value was examined. Table 4 shows the obtained results. Moreover, the correlation between ALP activity and the measured value of POCube is shown in FIG.
表４、図１の結果から、ＡＬＰ活性とＰＯＣｕｂｅ測定値とは良好な相関を示した。また、ＰＯＣｕｂｅ測定では、１００００ＲＬＵ（ＲＬＵは、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ（相対発光量）の略。）を上回ると陽性判定となることから、処理に用いる酸性溶液はｐＨ０．５から２．９までの間であれば、偽陽性判定を防ぐことができることがわかった。 From the results of Table 4 and FIG. 1, ALP activity and the measured value of POCube showed a good correlation. In addition, in the POCube measurement, a positive determination is made when exceeding 10,000 RLU (RLU is an abbreviation of Relative Light Unit (relative light emission amount)), so the acidic solution used for the treatment is between pH 0.5 and 2.9. If it exists, it turned out that a false positive determination can be prevented.
（実験９）ロタウイルス抗原測定の実施
（実験７）の方法と同様にして、効果が確認できなかった酢酸を除く６種類の酸性溶液を用いて、ロタウイルス抗原測定を行った。糞便は（実験３）で用いた５４例のうち２０例を用いた。得られた結果を表５に示す。
(Experiment 9) Implementation of rotavirus antigen measurement In the same manner as in (Experiment 7), rotavirus antigen measurement was performed using six types of acidic solutions excluding acetic acid whose effect could not be confirmed. Feces used 20 cases out of 54 cases used in (Experiment 3). The results obtained are shown in Table 5.
表５の結果から、６種類の酸性溶液いずれも市販のロタウイルス検出キットとの一致率は１００％であった。
以上の結果から、糞便中のロタウイルス抗原検出の際に、ｐＨが２．９以下になるように酸性溶液で処理することで、擬陽性判定を防ぐことができると確認できた。本発明の糞便処理方法は、化学発光法を測定原理とした免疫測定法において十分利用可能であると言える。
From the results in Table 5, the agreement rate with the commercially available rotavirus detection kit was 100% for all six types of acidic solutions.
From the above results, when detecting rotavirus antigen in stool, it was confirmed that false positive determination could be prevented by treating with an acidic solution so that the pH was 2.9 or less. It can be said that the fecal treatment method of the present invention can be sufficiently used in an immunoassay based on the chemiluminescence method.
本発明によれば、糞便検体を用い、免疫学的反応や遺伝子がハイブリダイズする特異性を利用して、該生体試料に含まれる種々の成分を測定する場合において、本発明の検体前処理液を用いて糞便検体を前処理することにより、正確性の高い測定が可能になる。種々の診断システムに適用できる。 According to the present invention, the sample pretreatment solution of the present invention is used in the case where various components contained in the biological sample are measured using the fecal sample and utilizing the specificity of the immunological reaction and gene hybridization. Pretreatment of a stool specimen with the can enables highly accurate measurement. It can be applied to various diagnostic systems.
Claims (7)
（Ａ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）を含む溶液とを接触させて、試薬１と該目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタの表面に、上記目的成分に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体（試薬２）の溶液を滴下して、試薬２を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体と目的成分との複合体に結合させる工程。
（ｄ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｅ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
（Ｂ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分で該目的成分に結合する第二の抗体が酵素で標識された第二の抗体（試薬２）を接触させて、試薬１と試薬２と目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｄ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。 A target component contained in a specimen derived from stool including the steps (a) to (e) described in (A) below or the steps (a) to (d) described in (B) A method for pretreatment of a specimen derived from stool used for a method for measuring , wherein the specimen is treated with HCl, NaNO 3 , H 2 SO 4 , Gly-HCl buffer, Ala-HCl buffer, and Ser-HCl. A step of suspending in a state where the pH is maintained within a range of 0.5 to 2.9 by adding a solution containing at least one of the group consisting of buffer solutions. Sample pretreatment method.
(A)
(A) A treated specimen containing a target component is brought into contact with a solution containing a conjugate (reagent 1) in which a ligand is bound to a first antibody that specifically binds to the target component, so that reagent 1 and the target Forming a complex with the component in solution.
(B) A step of dropping a solution containing the complex onto the surface of the porous filter to which the ligand capturing agent is bound to bind the ligand portion of the complex to the ligand capturing agent.
(C) A solution of a second antibody (reagent 2) labeled with an enzyme that specifically binds to the target component is dropped on the surface of the porous filter, and the reagent 2 is combined with a ligand-trapping agent and a ligand. Binding to the complex of the first antibody and target component bound to the porous filter via the portion.
(D) A step of removing the reagent not bound to the porous filter by washing the porous filter.
(E) The process of measuring the activity of the enzyme couple | bonded with the porous filter using a luminescent substrate.
(B)
(A) a treated specimen containing a target component, a conjugate (reagent 1) in which a ligand is bound to a first antibody that specifically binds to the target component, and a first that specifically binds to the target component A second antibody (reagent 2), which is an antibody different from the antibody, and in which the second antibody that binds to the target component at the same or different part as the first antibody is contacted with an enzyme, Forming a complex of 1, reagent 2 and a target component in a solution;
(B) A step of dropping a solution containing the complex onto the surface of the porous filter to which the ligand capturing agent is bound to bind the ligand portion of the complex to the ligand capturing agent.
(C) The process of removing the reagent which is not couple | bonded with the porous filter by wash | cleaning a porous filter.
(D) A step of measuring the activity of the enzyme bound to the porous filter using a luminescent substrate.
（１）前記検体を検体抽出液に懸濁し懸濁液とする工程
（２）前記懸濁液のｐＨを０．５〜２．９の間になるよう調整する工程
（３）（２）で処理した懸濁液のｐＨを６．０〜８．０の間になるよう調整する工程 The pretreatment method according to claim 1 or 2 , comprising the following steps (1) to (3):
(1) Step of suspending the specimen in a specimen extract to form a suspension (2) Step of adjusting the pH of the suspension to be between 0.5 and 2.9 (3) (2) Adjusting the pH of the treated suspension to be between 6.0 and 8.0
（１）糞便に由来する検体を、請求項１〜３のいずれかに記載の検体前処理方法で、処理する工程
（２）以下の（Ａ）に記載された（ａ）から（ｅ）の工程、または、（Ｂ）に記載された（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法により、目的成分を測定する工程
（Ａ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）を含む溶液とを接触させて、試薬１と該目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタの表面に、上記目的成分に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体（試薬２）の溶液を滴下して、試薬２を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体と目的成分との複合体に結合させる工程。
（ｄ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｅ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
（Ｂ）
（ａ）目的成分を含む処理検体と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体にリガンドが結合された結合体（試薬１）と、該目的成分に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分で該目的成分に結合する第二の抗体が酵素で標識された第二の抗体（試薬２）を接触させて、試薬１と試薬２と目的成分との複合体を溶液中にて形成する工程。
（ｂ）該複合体を含む溶液を、上記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、該複合体のリガンド部分を、該リガンド補捉剤に結合させる工程。
（ｃ）多孔性フィルタを洗浄することにより、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
（ｄ）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。 A method for measuring a target component contained in a specimen derived from stool, comprising the following steps (1) and (2):
(1) A step of treating a sample derived from stool with the sample pretreatment method according to any one of claims 1 to 3 (2) (a) to (e) described in (A) below A step of measuring a target component by a step or a method comprising steps (a) to (d) described in (B)
(A)
(A) A treated specimen containing a target component is brought into contact with a solution containing a conjugate (reagent 1) in which a ligand is bound to a first antibody that specifically binds to the target component, so that reagent 1 and the target Forming a complex with the component in solution.
(B) A step of dropping a solution containing the complex onto the surface of the porous filter to which the ligand capturing agent is bound to bind the ligand portion of the complex to the ligand capturing agent.
(C) A solution of a second antibody (reagent 2) labeled with an enzyme that specifically binds to the target component is dropped on the surface of the porous filter, and the reagent 2 is combined with a ligand-trapping agent and a ligand. Binding to the complex of the first antibody and target component bound to the porous filter via the portion.
(D) A step of removing the reagent not bound to the porous filter by washing the porous filter.
(E) The process of measuring the activity of the enzyme couple | bonded with the porous filter using a luminescent substrate.
(B)
(A) a treated specimen containing a target component, a conjugate (reagent 1) in which a ligand is bound to a first antibody that specifically binds to the target component, and a first that specifically binds to the target component A second antibody (reagent 2), which is an antibody different from the antibody, and in which the second antibody that binds to the target component at the same or different part as the first antibody is contacted with an enzyme, Forming a complex of 1, reagent 2 and a target component in a solution;
(B) A step of dropping a solution containing the complex onto the surface of the porous filter to which the ligand capturing agent is bound to bind the ligand portion of the complex to the ligand capturing agent.
(C) The process of removing the reagent which is not couple | bonded with the porous filter by wash | cleaning a porous filter.
(D) A step of measuring the activity of the enzyme bound to the porous filter using a luminescent substrate.
（１）請求項６に記載の検体前処理用セット
（２）前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第一の抗体
（３）前記検体に含まれる目的成分に特異的に結合する第二の抗体
（４）未結合の検体・抗体を除去するための洗浄液
（５）多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、測定するための発光基質 A kit for use in a method for measuring a target component contained in a specimen derived from stool according to claim 4 or 5 , comprising the following (1) to (5) : .
(1) The sample pretreatment set according to claim 6 (2) A first antibody that specifically binds to a target component contained in the sample (3) Specifically binds to a target component contained in the sample Second antibody (4) Washing solution for removing unbound specimen / antibody (5) Luminescent substrate for measuring activity of enzyme bound to porous filter
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