JP5680989B2 - Primer / probe set for detecting non-human animals - Google Patents
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Description
本発明は、核酸増幅反応において、非ヒト動物（ヒト以外の動物を指す）に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域を種に関係なく増幅するが、ヒトに由来するものは増幅しない、非ヒト動物を選択的に検出するためのプライマー・プローブセットに関する。 In the nucleic acid amplification reaction, the present invention amplifies the target region of genomic DNA encoding 28S ribosomal RNA derived from a non-human animal (refers to a non-human animal) regardless of species, but the one derived from human is amplified. The present invention relates to a primer / probe set for selectively detecting non-human animals.
本発明のプライマー・プローブセットは非ヒト動物DNA含有試料が核酸増幅反応のための鋳型として適した品質を有することを確認するために用いることができる。 The primer / probe set of the present invention can be used to confirm that a non-human animal DNA-containing sample has a quality suitable as a template for a nucleic acid amplification reaction.
本発明のプライマー・プローブセットはまた、得られた標的増幅産物の起源生物種を推定するために用いることができる。 The primer / probe set of the present invention can also be used to estimate the source species of the obtained target amplification product.
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction，以下「PCR」という）法を用いた検査法は、食品の検査に数多く取り入れられ、現在では食物アレルゲンの検査法（非特許文献１）、牛、豚、鶏等の検出法（非特許文献２）、植物片の異物検査法（特許文献１）、遺伝子組換え作物の検査法などが実用化されている（特許文献２）。これら検査法は、いずれも食品試料から抽出精製したDNAを鋳型として、PCRにより特定の生物種固有のDNA配列の増幅を試みるものである。判定は、特定の生物種のDNA配列に由来する増幅産物、すなわち目的の長さのDNA断片の有無を確認することによって行う。目的の長さのDNA断片が確認された場合には、特定のDNA配列を持つ生物種が食品に含まれている（陽性）と判定し、確認されなかった場合には、含まれていない（陰性）と判定する。 Numerous testing methods using the polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR”) method have been incorporated into food testing, and now food allergen testing methods (Non-patent Document 1), cows, pigs, chickens, etc. Detection methods (Non-patent Document 2), foreign matter inspection methods for plant fragments (Patent Document 1), inspection methods for genetically modified crops, etc. have been put into practical use (Patent Document 2). Each of these inspection methods attempts to amplify a DNA sequence specific to a specific species by PCR using DNA extracted and purified from a food sample as a template. The determination is performed by confirming the presence or absence of an amplification product derived from the DNA sequence of a specific species, that is, a DNA fragment of a desired length. If a DNA fragment of the desired length is confirmed, it is judged that a food species having a specific DNA sequence is contained in the food (positive). If not confirmed, it is not contained ( Negative).
検査において、PCRに用いるDNA試料液がPCR増幅に適した品質であることは重要である。品質の悪いDNA試料液を用いれば、特定のDNA配列が食品に含まれていたとしてもPCRで増幅されないため、偽陰性の判定となる可能性が生ずる。特に、食物アレルゲンの検査における偽陰性は、食物アレルギー患者の誤食被害に繋がる恐れがある。従って、検査を行う前に、食品試料から抽出精製したDNA試料液がPCRに適した品質かを確認する必要がある。確認するポイントは、DNA試料液に、PCR反応を阻害する食品由来の夾雑物の影響がないこと、十分量のDNAが抽出されていること、抽出DNAが酸、熱、圧力などによる加工やDNA抽出過程で極度に分解されていないことの3点である。 In testing, it is important that the DNA sample solution used for PCR is of a quality suitable for PCR amplification. If a poor-quality DNA sample solution is used, even if a specific DNA sequence is contained in food, it is not amplified by PCR, so that a false negative determination may occur. In particular, false negatives in food allergen testing can lead to accidental eating damage in food allergic patients. Therefore, it is necessary to check whether the DNA sample solution extracted and purified from the food sample is suitable for PCR before the inspection. The points to check are that the DNA sample solution is not affected by contaminants derived from foods that inhibit the PCR reaction, that a sufficient amount of DNA has been extracted, and that the extracted DNA is processed by acid, heat, pressure, etc. Three points are that they are not extremely decomposed during the extraction process.
食品試料から抽出精製したDNA試料液の品質を確認する方法としては、生物種に広く共通して存在するDNA配列を増幅するPCR法が幾つか報告されている。これらの方法により、食品試料から抽出精製したDNAを鋳型として目的の長さのDNA断片が増幅されれば、DNA試料液の品質が適切であると判断して、食物アレルゲン検査等のPCR検査を行なうこととなる。ここで注意が必要なことは、食品試料以外の環境中の生物にも広くDNAが存在しているということである。特に、ヒト、真菌、細菌DNAは飛沫、胞子、菌体などの形で室内を浮遊しているため、分析試料や試薬などへの混入リスクが高い。PCRは数コピーの鋳型DNAからの増幅が可能であることから、分析環境からこれらDNAが混入した場合、食品試料ではなく、環境中の生物由来DNAを鋳型とした増幅が起こり、誤った検査結果が得られる可能性がある。従って、分析環境から混入するDNA由来の増幅を防止することは、検査結果の正確性を高める上で重要であり、そのためには食品に用いられる植物、動物DNAを増幅するが、ヒト、真菌、細菌DNAを増幅しないPCR法をDNAの品質確認に用いることが重要となる。 As a method for confirming the quality of a DNA sample solution extracted and purified from a food sample, several PCR methods for amplifying a DNA sequence widely present in organism species have been reported. By these methods, if a DNA fragment of the desired length is amplified using DNA extracted and purified from food samples as a template, it is judged that the quality of the DNA sample solution is appropriate, and a PCR test such as a food allergen test is performed. Will be done. What should be noted here is that DNA is widely present in organisms in the environment other than food samples. In particular, humans, fungi, and bacterial DNA are floating in the room in the form of droplets, spores, fungus bodies, and the like, so there is a high risk of contamination into analysis samples and reagents. Since PCR can be amplified from several copies of template DNA, if these DNAs are mixed from the analytical environment, amplification occurs using DNA from living organisms in the environment as a template instead of food samples, resulting in incorrect test results. May be obtained. Therefore, preventing amplification derived from DNA mixed in from the analysis environment is important for improving the accuracy of the test results. To that end, plant and animal DNA used in foods are amplified, but humans, fungi, It is important to use a PCR method that does not amplify bacterial DNA for DNA quality confirmation.
これまで報告されている生物種に広く共通して存在するDNA配列を増幅するPCR法としては、まず、Allmannの真核生物DNAを検出するPCR法（非特許文献３）がある。しかし、この方法ではヒト、真菌DNAからも増幅産物が得られてしまう。この他、食物アレルゲン検査における品質確認に用いられる動物DNA検出PCR法（非特許文献１）もあるが、やはりヒトDNAからも増幅産物が得られてしまう。また、食品に用いる動物の一種であるクラゲのDNAなどからは増幅産物が得られず、動物種により得られた増幅産物の長さが大きく異なる。植物DNA検出PCR法（非特許文献１）は、ヒト、真菌、細菌DNAからは増幅産物が得られないものの、動物DNAを検出できない。 As a PCR method for amplifying a DNA sequence widely present in common with biological species reported so far, there is a PCR method (Non-patent Document 3) for detecting Allmann eukaryotic DNA. However, this method also yields amplification products from human and fungal DNA. In addition, there is an animal DNA detection PCR method (Non-patent Document 1) used for quality confirmation in food allergen tests, but amplification products are also obtained from human DNA. In addition, amplification products cannot be obtained from jellyfish DNA, which is a kind of animal used for food, and the lengths of amplification products obtained vary greatly depending on the animal species. The plant DNA detection PCR method (Non-Patent Document 1) cannot detect animal DNA, although an amplification product cannot be obtained from human, fungal or bacterial DNA.
本発明は、核酸増幅反応に供するための非ヒト動物DNA含有試料の品質確認を行うために、非ヒト動物DNAを核酸増幅反応により増幅する方法において、ヒト、真菌及び細菌のDNAを増幅することなく、非ヒト動物のDNAを、動物種に関係なく増幅することを可能にする手段を提供することを目的とする。 The present invention relates to a method for amplifying non-human animal DNA by a nucleic acid amplification reaction in order to confirm the quality of a non-human animal DNA-containing sample for use in a nucleic acid amplification reaction. It is another object of the present invention to provide means capable of amplifying non-human animal DNA regardless of animal species.
動物の核ゲノム上の28S rRNA遺伝子（ゲノムDNA）領域の中に、真菌とは相同性が低く、広く動物種に共通する塩基配列を見出して、動物共通プライマーペアを設計した。また、二つの動物共通プライマーに挟まれた配列上に、ヒトに特有の塩基配列を見出して、ヒト由来DNAの増幅を抑えるペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid。以下「PNA」という）プローブを設計した。そうして、これら動物共通プライマーペアとPNAプローブを用いてPCR等の核酸増幅反応を行うことで、広く非ヒト動物DNA全般から目的の長さの標的増幅産物が得られ、且つ、分析環境から混入するヒト由来DNAの増幅を抑えられることを見出し、本発明を完成させるに至った。 In the 28S rRNA gene (genomic DNA) region on the nuclear genome of animals, we found a base sequence that has low homology with fungi and is widely shared by animal species, and designed an animal common primer pair. In addition, a peptide nucleic acid (Peptide Nucleic Acid, hereinafter referred to as “PNA”) probe that suppresses the amplification of human-derived DNA was designed by finding a base sequence peculiar to humans on a sequence sandwiched between two animal common primers. By carrying out nucleic acid amplification reactions such as PCR using these animal common primer pairs and PNA probes, target amplification products of the desired length can be obtained from a wide range of non-human animal DNA, and from the analysis environment. The inventors have found that amplification of human-derived DNA mixed therein can be suppressed, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(I)
下記(1)及び(2)から選択されるプライマーペアと、下記(3)〜(6)から選択されるペプチド核酸(PNA)プローブとを含む、非ヒト動物に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域に相当するDNA断片を増幅するためのプライマー・プローブセット:
プライマーペア:
(1) 5’-gtttccctcaggatagctgg-3’ (配列番号1) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が20〜30塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドと、5’-cctctaatcattcgctttaccgg-3’ (配列番号2) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が23〜33塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーペア
(2) 配列番号1に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドとからなり、前記(1)のプライマーペアと同一の領域を増幅することができるプライマーペア
PNAプローブ:
(3) N-agacccgacgcacccccgc-C (配列番号3) に示す塩基配列 (NはPNAオリゴマー鎖のN末端側を、CはPNAオリゴマー鎖のC末端側を指す)を含む、全体が19〜29塩基の鎖長を有するPNAオリゴマーからなるプローブ
(4) 配列番号3に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるPNAオリゴマーからなり、前記(1)または(2)のプライマーペアを用いた核酸増幅反応において、ヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAが存在する場合に、該DNAとハイブリダイズして該DNAの増幅を阻止することができるプローブ
(5) 前記(3)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ
(6) 前記(4)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ。
(II)
検査対象から調製されたDNA試料を鋳型とし、(I)に記載のプライマー・プローブセットを用いてDNA断片の増幅を行う増幅工程と、増幅工程により標的増幅産物が得られているか否かを確認する確認工程とを含む、非ヒト動物DNAの検出方法。
(III)
確認工程において標的増幅産物が得られていることが確認された場合に、前記DNA試料が核酸増幅反応の試料として適した品質を有していると結論付ける工程を更に含む、(II)に記載の方法。
(IV)
増幅工程において、ヒトに由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの増幅が阻止される、(II)又は(III)に記載の方法。
(V)
(I)に記載のプライマー・プローブセットを含む、非ヒト動物DNA検出用キット。
(VI)
検査対象から調製されたDNA試料を鋳型とし、前記(I)記載の(1)及び(2)から選択されるプライマーペアと、前記(I)記載の(3)〜(6)から選択されるペプチド核酸(PNA)プローブとを含むプライマー・プローブセットを用いてDNA断片の増幅を行う増幅工程と、増幅工程により得られた標的増幅産物の塩基配列に基づいて該標的増幅産物の起源生物種を推定する推定工程とを含む、検査対象に含まれるDNAの起源生物種を推定する方法。
That is, the present invention includes the following inventions.
(I)
Encodes a 28S ribosomal RNA derived from a non-human animal, comprising a primer pair selected from the following (1) and (2) and a peptide nucleic acid (PNA) probe selected from the following (3) to (6) Primer / probe set for amplifying a DNA fragment corresponding to the target region of genomic DNA:
Primer pair:
(1) 5′-gtttccctcaggatagctgg-3 ′ (SEQ ID NO: 1) containing a nucleotide sequence at the 3 ′ end, an oligonucleotide having a chain length of 20 to 30 bases as a whole, and 5′-cctctaatcattcgctttaccgg-3 ′ ( Primer pair consisting of an oligonucleotide having a chain length of 23 to 33 bases as a whole, containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2) on the 3 ′ end side
(2) An oligonucleotide capable of hybridizing under stringent conditions to a DNA fragment comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 A primer pair that can amplify the same region as the primer pair of (1) above, comprising an oligonucleotide that can hybridize under stringent conditions to a DNA fragment comprising a basic nucleotide sequence
PNA probe:
(3) N-agacccgacgcacccccgc-C (SEQ ID NO: 3) The nucleotide sequence as a whole (N is the N-terminal side of the PNA oligomer chain, and C is the C-terminal side of the PNA oligomer chain) is a total of 19 to 29 bases Probe consisting of PNA oligomer with a chain length of
(4) comprising a PNA oligomer capable of hybridizing under stringent conditions to a DNA fragment comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and comprising the above (1) or (2) Probe that can hybridize with DNA to block amplification of human 28S ribosomal RNA when nucleic acid amplification reaction using primer pair is present
(5) A probe comprising a PNA oligomer comprising a base sequence complementary to the PNA oligomer constituting the probe of (3)
(6) A probe comprising a PNA oligomer having a base sequence complementary to the PNA oligomer constituting the probe of (4).
(II)
Using a DNA sample prepared from the test target as a template, amplifying the DNA fragment using the primer / probe set described in (I), and confirming whether the target amplification product is obtained by the amplification step A method for detecting non-human animal DNA.
(III)
The method according to (II), further comprising a step of concluding that the DNA sample has a quality suitable as a sample for a nucleic acid amplification reaction when it is confirmed that a target amplification product is obtained in the confirmation step. the method of.
(IV)
The method according to (II) or (III), wherein in the amplification step, amplification of genomic DNA encoding 28S ribosomal RNA derived from human is blocked.
(V)
A kit for detecting a non-human animal DNA comprising the primer / probe set according to (I).
(VI)
Using a DNA sample prepared from the test object as a template, selected from the primer pair selected from (1) and (2) described in (I) above, and from (3) to (6) described in (I) above An amplification step of amplifying a DNA fragment using a primer / probe set including a peptide nucleic acid (PNA) probe, and the source species of the target amplification product based on the base sequence of the target amplification product obtained by the amplification step A method for estimating a source species of DNA contained in a test object, comprising an estimation step for estimation.
本発明によれば、分析環境などから混入するヒトDNAの共存下においても、非ヒト動物を主原料とする食品から抽出精製されたDNA試料液の品質が核酸増幅反応による増幅に適したものであるかを確認するための、プライマー・プローブセットが提供される。 According to the present invention, the quality of a DNA sample solution extracted and purified from foods mainly made of non-human animals is suitable for amplification by a nucleic acid amplification reaction even in the presence of human DNA mixed from the analysis environment. A primer / probe set is provided for confirming the presence.
さらに、本発明のプライマー・プローブセットを用いた核酸増幅反応により目的の長さの増幅産物が得られた試料においては、その増幅産物の塩基配列を確認することによって、その増幅産物が由来する生物種を推定することができる。 Furthermore, in a sample in which an amplification product of a desired length is obtained by a nucleic acid amplification reaction using the primer / probe set of the present invention, the organism from which the amplification product is derived is confirmed by confirming the base sequence of the amplification product. Species can be estimated.
本発明のプライマー・プローブセットは、動物の核ゲノム上にある、28SリボソームRNA（28S rRNA）をコードするゲノムDNA中の、特定の種に限定されず動物が共通して有する塩基配列に基づいて設計した一対のオリゴヌクレオチドからなるプライマーペアと、該プライマーペアにより増幅される28S rRNA遺伝子の領域における、ヒト特異的な塩基配列に基づいて設計されたPNAオリゴマーとを含む。 The primer / probe set of the present invention is based on a base sequence that an animal has in common, not limited to a specific species, in genomic DNA encoding 28S ribosomal RNA (28S rRNA) on the nuclear genome of the animal. A primer pair composed of a pair of designed oligonucleotides, and a PNA oligomer designed based on a human-specific base sequence in the 28S rRNA gene region amplified by the primer pair.
本発明のプライマー・プローブセットは、非ヒト動物に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域をDNA断片として増幅するが、分析環境から混入するヒトに由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAでの対応領域を増幅しないプライマー・プローブセットである。 The primer / probe set of the present invention amplifies the target region of genomic DNA encoding 28S ribosomal RNA derived from a non-human animal as a DNA fragment, but the genome encoding human 28S ribosomal RNA mixed from the analysis environment This primer / probe set does not amplify the corresponding region in DNA.
本発明において「非ヒト動物に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域に相当するDNA断片」とは、非ヒト動物の28S rRNAをコードするゲノムDNAを鋳型として核酸増幅反応を行った場合に増幅されるDNA断片をいい、「非ヒト動物に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域に相当するDNA断片を増幅する」とは、非ヒト動物の28S rRNAをコードするゲノムDNAを鋳型として核酸増幅反応を行った場合に、目的とする増幅産物（配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基配列からなるプライマーとの組み合わせの場合、約60-83bpの増幅産物）が得られることをいう。 In the present invention, “a DNA fragment corresponding to a target region of genomic DNA encoding 28S ribosomal RNA derived from a non-human animal” refers to a nucleic acid amplification reaction using genomic DNA encoding 28S rRNA of a non-human animal as a template. Refers to a DNA fragment that is amplified in some cases, and "amplifies a DNA fragment corresponding to the target region of genomic DNA encoding 28S ribosomal RNA derived from non-human animals" refers to the genome encoding 28S rRNA of non-human animals When nucleic acid amplification reaction is performed using DNA as a template, the target amplification product (in the case of a combination of a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 is amplified by about 60-83 bp) Product).
「分析環境から混入するヒトDNA」とは、分析環境の室内を浮遊したり器具等に付着するヒト唾液の飛沫等を介して混入するヒトDNAをいい、「ヒトに由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAからの増幅が阻止される」とは、ヒトに由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAを鋳型として核酸増幅反応を行った場合に増幅が起こらないことをいう。 “Human DNA contaminated from the analysis environment” refers to human DNA that floats in the room of the analysis environment or enters through the droplets of human saliva adhering to instruments, etc. It encodes “28S ribosomal RNA derived from humans” “Amplification from genomic DNA is prevented” means that amplification does not occur when nucleic acid amplification reaction is performed using genomic DNA encoding 28S ribosomal RNA derived from human as a template.
本発明において、「非ヒト動物共通PCR」とは、食品材料や食品中に含まれる非ヒト動物DNAを鋳型としたPCR増幅をいう。 In the present invention, “non-human animal common PCR” refers to PCR amplification using food material or non-human animal DNA contained in food as a template.
本発明において、「非ヒト動物」とはヒト以外の動物であれば限定はされない。非ヒト動物の具体例としては、鉢虫綱、棘皮動物、甲殻類、軟体類、脊索動物などの、一般的な食品材料として用いられる非ヒト動物が挙げられる。ここで鉢虫綱としてはクラゲ等が挙げられる。棘皮動物としてはウニ、ナマコ等が挙げられる。甲殻類としてはエビ、カニ、シャコ、アミ等が挙げられる。軟体類としてはイカ、タコ、貝等が挙げられる。脊索動物としてはホヤ、ヤツメウナギ目、魚類、両生類、哺乳類（ヒトを除く）、爬虫類、鳥類等が挙げられる。 In the present invention, the “non-human animal” is not limited as long as it is an animal other than a human. Specific examples of the non-human animal include non-human animals used as general food materials such as scabbard, echinoderms, crustaceans, molluscs, and chordates. Here, jellyfish and the like can be mentioned as the potter class. Examples of echinoderms include sea urchins and sea cucumbers. Examples of crustaceans include shrimp, crab, giant clam, and mami. Examples of molluscs include squid, octopus and shellfish. Examples of chordates include squirts, lampreys, fishes, amphibians, mammals (excluding humans), reptiles, and birds.
プライマーペア及びPNAプローブ
本発明で用いられるプライマーペアは、好ましくは、(1) 配列番号1に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が20〜30塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が23〜33塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーペアである。
Primer pair and PNA probe The primer pair used in the present invention is preferably (1) an oligonucleotide having a chain length of 20 to 30 bases as a whole, comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the 3 ′ end side, A primer pair comprising an oligonucleotide having a chain length of 23 to 33 bases as a whole, containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the 3 ′ end side.
なお本発明において「オリゴヌクレオチド」とはDNA又はRNAを指し、典型的にはDNAを指す。 In the present invention, “oligonucleotide” refers to DNA or RNA, and typically refers to DNA.
配列番号1に示す塩基配列では3’末端の1塩基目、配列番号2に示す塩基配列は3’末端の1塩基目と2塩基目に真菌DNAとは異なる動物DNAに特異的な塩基が設定されていることを特徴とする。このため、上記(1)のプライマーペアは少なくとも3’末端側部分において動物の28S rRNA遺伝子領域における、それぞれの塩基配列に相補的な塩基配列にアニーリングすることができる。配列番号1に示す塩基配列を3’末端側に含む前記オリゴヌクレオチドはフォワードプライマーであり、配列番号2に示す塩基配列を3’末端側に含む前記オリゴヌクレオチドはリバースプライマーである。 In the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, a base specific to animal DNA different from fungal DNA is set at the first base at the 3 'end, and in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 at the first and second bases at the 3' end It is characterized by being. For this reason, the primer pair (1) can be annealed to a base sequence complementary to each base sequence in the 28S rRNA gene region of an animal at least at the 3 'terminal side. The oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the 3 'end side is a forward primer, and the oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the 3' end side is a reverse primer.
プライマーが鋳型DNAにアニーリングし、DNAポリメラーゼが作用する際には、3’末端側の領域が重要となるが、5’末端側の領域の重要性は低い。このため、配列番号1に示す塩基配列が3’末端側に含まれているオリゴヌクレオチドであれば、その5’末端側に任意の0〜10個、好ましくは0〜5個の塩基が付加された、全体が20〜30塩基、好ましくは20〜25塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドであっても、フォワードプライマーとしての機能に問題は生じない。同様に、配列番号2に示す塩基配列が3’末端側に含まれているオリゴヌクレオチドであれば、その5’末端側に任意の0〜10個、好ましくは0〜5個の塩基が付加された、全体が23〜33塩基、好ましくは23〜28塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドであっても、リバースプライマーとしての機能に問題は生じない。 When the primer anneals to the template DNA and the DNA polymerase acts, the region on the 3 'end side is important, but the region on the 5' end side is less important. For this reason, if the oligonucleotide contains the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 on the 3 ′ end side, any 0 to 10, preferably 0 to 5 bases are added to the 5 ′ end side. Even if the whole oligonucleotide has a chain length of 20 to 30 bases, preferably 20 to 25 bases, no problem occurs in the function as a forward primer. Similarly, in the case of an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 at the 3 ′ end, any 0 to 10, preferably 0 to 5 bases are added to the 5 ′ end. Even if the whole oligonucleotide has a chain length of 23 to 33 bases, preferably 23 to 28 bases, no problem occurs in the function as a reverse primer.
本発明で用いられるプライマーペアとしては更に、(2) 配列番号1に示す塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドとからなり、前記(1)のプライマーペアと同一の領域を増幅することができるプライマーペアを用いることができる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、例えば、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。より具体的には、例えば、0.5〜1.0 M 程度の NaClを含むハイブリダイゼーション溶液中、60℃〜68℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で0.1〜1×SSC中（1×SSC: 150mM NaCl, 15mMクエン酸ナトリウムからなる）で１時間洗浄する条件をいう。前記(2)のプライマーペアにおいてフォワードプライマーとして用いることができるハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとしては、配列番号1に示す塩基配列と60％以上、好ましくは80％以上、更に好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができ、特に好ましくは、少なくとも、3’末端の1塩基が、配列番号1に示す塩基配列の3’末端の1塩基と同一であるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。同様に、前記(2)のプライマーペアにおいてリバースプライマーとして用いることができるハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとしては、配列番号2に示す塩基配列と60％以上、好ましくは80％以上、更に好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができ、特に好ましくは、少なくとも、3’末端の1塩基が、配列番号2に示す塩基配列の3’末端の1塩基と同一であるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。前記(2)のプライマーペアにおけるフォワードプライマー塩基数は特に限定されないが、通常は17〜40塩基以下、好ましくは18〜30塩基以下、より好ましくは19〜25塩基以下である。前記(2)のプライマーペアにおけるリバースプライマー塩基数は特に限定されないが、通常は20〜43塩基以下、好ましくは21〜33塩基以下、より好ましくは22〜28塩基以下である。 The primer pair used in the present invention further includes (2) an oligo that can hybridize under stringent conditions to a DNA fragment consisting of a base sequence completely complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. The primer according to (1) above, comprising a nucleotide and an oligonucleotide capable of hybridizing under stringent conditions to a DNA fragment consisting of a base sequence completely complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. Primer pairs that can amplify the same region as the pair can be used. Here, “stringent conditions” refers to conditions under which, for example, a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. More specifically, for example, hybridization is performed at 60 ° C. to 68 ° C. in a hybridization solution containing about 0.5 to 1.0 M NaCl, and then in 0.1 to 1 × SSC (1 × SSC) at the same temperature as the hybridization. : 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate). The hybridizable oligonucleotide that can be used as a forward primer in the primer pair of (2) is 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 95% or more homologous to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. And particularly preferably an oligonucleotide having at least one base at the 3 ′ end identical to one base at the 3 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Can be mentioned. Similarly, the hybridizable oligonucleotide that can be used as a reverse primer in the primer pair of (2) above is 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 95%, with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. An oligonucleotide having a base sequence having the above homology can be mentioned, and particularly preferably, at least one base at the 3 ′ end is the same as one base at the 3 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. Mention may be made of oligonucleotides. Although the number of forward primer bases in the primer pair (2) is not particularly limited, it is usually 17 to 40 bases or less, preferably 18 to 30 bases or less, and more preferably 19 to 25 bases or less. The number of reverse primer bases in the primer pair (2) is not particularly limited, but is usually 20 to 43 bases or less, preferably 21 to 33 bases or less, more preferably 22 to 28 bases or less.
核酸増幅反応において標的以外の塩基配列が増幅されず、標的増幅産物を確認し易いことを期待する上での理想は、センス側、アンチセンス側のプライマーをそれぞれ1種類にすること、様々な動物DNAをほぼ同じ長さの標的増幅産物として検出できるようにすることである。本発明では、この要件を満たしつつ、100 bp程度の短めの増幅産物を形成することができるプライマーペアを選択することができた。 Ideal for expecting that the target amplification product is easy to confirm without amplification of the base sequence other than the target in the nucleic acid amplification reaction, one kind of primer for each of the sense side and the antisense side is used. The goal is to be able to detect DNA as a target amplification product of approximately the same length. In the present invention, a primer pair capable of forming a short amplification product of about 100 bp while satisfying this requirement could be selected.
本発明に用いられるPNAプローブは、好ましくは(3) 配列番号3に示す塩基配列を含む、全体が19〜29塩基の鎖長を有するPNAオリゴマーからなるプローブである。 The PNA probe used in the present invention is preferably a probe comprising a PNA oligomer having a chain length of 19 to 29 bases as a whole, including (3) the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
PNA（ペプチド核酸）とは、ニールセンにより開発された、ペプチド骨格に核酸塩基をもつ分子であり（「Science 254」、(1991年)、Nielsen, P. E.、Egholm, M.、Berg, R. H. and Buchardt, O.著、1497頁〜1500頁）、具体的にはN-(2-アミノエチル)グリシンを骨格単位とし、これにメチレンカルボニル基を介して核酸塩基を結合させた構造をもった化合物である（「ＰＮＡ−その性状と応用」、ダコ・ジャパン（株）発行）。PNAオリゴマーは、オリゴヌクレオチドの5炭糖-リン酸骨格が、N-(2-アミノエチル)グリシンがペプチド結合してなるポリアミド骨格に置換された構造を有するオリゴヌクレオチド類似体である。 PNA (peptide nucleic acid) is a molecule developed by Nielsen and having a nucleobase in the peptide backbone (“Science 254”, (1991), Nielsen, PE, Egholm, M., Berg, RH and Buchardt, O., pages 1497 to 1500), specifically, a compound having a structure in which N- (2-aminoethyl) glycine is a skeletal unit and a nucleobase is bound to this via a methylenecarbonyl group. ("PNA-its properties and applications", published by Dako Japan Co., Ltd.). A PNA oligomer is an oligonucleotide analogue having a structure in which the pentose-phosphate skeleton of an oligonucleotide is replaced with a polyamide skeleton formed by peptide bonding of N- (2-aminoethyl) glycine.
プローブが鋳型DNAに相補的に結合する際には、両末端の領域に付加される塩基配列の重要性は低い。このため、配列番号3に示す塩基配列が、連続した部分配列として任意の位置に含まれているPNAオリゴマーであれば、該配列の両末端の一方又は両方に、合計で0〜10個、好ましくは0〜5個の塩基が付加された、全体が19〜29塩基、好ましくは19〜24塩基の鎖長を有するPNAオリゴマーであっても、プローブとしての機能に問題は生じず、プローブとして使用可能である。 When the probe binds complementarily to the template DNA, the base sequence added to both end regions is less important. For this reason, if the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a PNA oligomer contained at any position as a continuous partial sequence, a total of 0 to 10, preferably one or both of both ends of the sequence Even if it is a PNA oligomer having a chain length of 19 to 29 bases, preferably 19 to 24 bases, to which 0 to 5 bases have been added, there is no problem in the function as a probe and it can be used as a probe Is possible.
本発明で用いられるPNAプローブは、前記(1)または(2)のプライマーペアを用いた核酸増幅反応の反応系中にヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAが存在する場合に、該DNAと特異的にハイブリダイズして該DNAの増幅を阻止することができる。一方、非ヒト動物の28SリボソームRNAをコードするDNAにはハイブリダイズせず、その増幅を妨げない。 The PNA probe used in the present invention is specific to a DNA encoding human 28S ribosomal RNA in the reaction system of a nucleic acid amplification reaction using the primer pair (1) or (2) above. Hybridize to prevent amplification of the DNA. On the other hand, it does not hybridize to DNA encoding 28S ribosomal RNA of non-human animals and does not prevent its amplification.
本発明で用いられるPNAプローブとしては更に、(4) 配列番号3に示す塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるPNAオリゴマーからなり、前記(1)または(2)のプライマーペアを用いた核酸増幅反応において、ヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAが存在する場合に、該DNAとハイブリダイズして該DNAの増幅を阻止することができるプローブを用いることができる。「ストリンジェントな条件」は上述の通りである。前記(4)のPNAプローブとしては、配列番号3に示す塩基配列と60％以上、好ましくは80％以上、更に好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列からなるPNAオリゴマーを挙げることができる。前記(4)のPNAプローブにおけるPNAオリゴマーの塩基数は特に限定されないが、通常は16〜39塩基、好ましくは17〜29塩基、特に好ましくは18〜24塩基である。ヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAの「増幅を阻止する」とは、該DNAの断片の増幅を検出限界以下にまで抑制することを指す。 The PNA probe used in the present invention further includes (4) a PNA capable of hybridizing under stringent conditions to a DNA fragment consisting of a base sequence completely complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. In the nucleic acid amplification reaction comprising the oligomer and using the primer pair of (1) or (2), when DNA encoding human 28S ribosomal RNA is present, it is hybridized with the DNA to amplify the DNA. Probes that can be blocked can be used. “Stringent conditions” are as described above. Examples of the PNA probe of (4) include a PNA oligomer comprising a base sequence having a homology of 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 95% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. . The number of bases of the PNA oligomer in the PNA probe (4) is not particularly limited, but is usually 16 to 39 bases, preferably 17 to 29 bases, and particularly preferably 18 to 24 bases. “Preventing amplification” of DNA encoding human 28S ribosomal RNA refers to inhibiting amplification of the DNA fragment to below the detection limit.
本発明で用いられるPNAプローブとしては更に、前記(3)又は(4)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して完全に相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブを用いることもできる。このようなプローブは、前記(3)又は(4)のプローブとハイブリダイズするヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAの相補的DNAとハイブリダイズし、前記(3)又は(4)のプローブと同様の機能を奏することができる。 As the PNA probe used in the present invention, a probe comprising a PNA oligomer having a base sequence completely complementary to the PNA oligomer constituting the probe of (3) or (4) can be used. Such a probe hybridizes with a complementary DNA of DNA encoding human 28S ribosomal RNA that hybridizes with the probe of (3) or (4), and is the same as the probe of (3) or (4). The function of can be performed.
上記のPNAプローブを構成するPNAオリゴマーのN末端のアミノ基は遊離の形態(-NH2)であることが好ましく、C末端のカルボキシル基はアミド化された形態(-C(=O)NH2)であることが好ましい。 The N-terminal amino group of the PNA oligomer constituting the PNA probe is preferably in a free form (-NH 2 ), and the C-terminal carboxyl group is in an amidated form (-C (= O) NH 2 ) Is preferable.
本発明が提供する配列番号1と2のプライマーおよび3のプローブは、論理的設計に加え、プライマー塩基配列、プローブ塩基配列を工夫した中で最良の形態と判断されたプライマー・プローブセットについて、PCR反応条件を鋭意検討し、最終的には実際の性能評価試験を行い、意図した特異性・感度を発揮していることを確認したものである。 The primers of SEQ ID NOS: 1 and 2 and the probe of 3 provided by the present invention are PCR-based on the primer / probe set determined to be the best form in devising the primer base sequence and probe base sequence in addition to the logical design. The reaction conditions were intensively studied, and finally an actual performance evaluation test was conducted to confirm that the intended specificity and sensitivity were exhibited.
理論上は首尾よく設計されたプライマー・プローブであっても、必要な感度と特異性を保有し得ない場合がある。例えば、後述する比較例1に示すように、配列番号1と同様に広く動物種全般の塩基配列に結合すると考えて設計した下記の配列番号4のフォワードプライマーを、配列番号1のフォワードプライマーの代わりに用いた場合の結果や、後述する比較例2に示すように、配列番号3のプローブと同様にヒトに特有の塩基配列に結合すると考えて設計した下記の配列番号5のプローブを、配列番号３のプローブの代わりに用いた場合の結果が挙げられる。そのため、単に論理的にプライマー、プローブを設計すれば、必要な特異性を確保できるとは限らない。本発明のプライマー及びプローブは、論理的設計に加え、更なる工夫を施し、意図した感度と特異性を確保していることを確認したものである。
In theory, even a well-designed primer / probe may not have the necessary sensitivity and specificity. For example, as shown in Comparative Example 1 described later, the forward primer of SEQ ID NO: 4 shown below, designed to bind to the base sequences of all animal species as widely as SEQ ID NO: 1, is used instead of the forward primer of SEQ ID NO: 1. As shown in Comparative Example 2 to be described later, the probe of SEQ ID NO: 5, which was designed to bind to a human-specific base sequence in the same manner as the probe of SEQ ID NO: 3, The results when used in place of the
プライマーとなるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法を利用したDNA自動合成装置を利用して合成することができる。 Oligonucleotides that serve as primers can be synthesized using an automatic DNA synthesizer using methods known in the art as oligonucleotide synthesis methods.
プローブとなるPNAオリゴマーは、特許文献3に記載された技術を利用して合成することが可能である。更に、当技術分野で公知の方法、例えば、t-Boc/ベンジルオキシカルボニル保護基戦略を使ったメリフィールド（Merrifield）固相合成により合成することができる（非特許文献4〜8及び特許文献4）。
A PNA oligomer serving as a probe can be synthesized using the technique described in
本発明で用いられるプライマー及びPNAプローブは、必要に応じて、適宜標識化等の修飾が施されたものであってもよい。標識化のための標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン(DIG)やビオチンなどの有機化合物等を使用することができる。 The primer and PNA probe used in the present invention may be appropriately modified such as labeling as necessary. The labeling substance for labeling is not particularly limited, and radioisotopes, fluorescent dyes, or organic compounds such as digoxigenin (DIG) and biotin can be used.
検査対象
本発明のプライマー・プローブセットを用いた核酸増幅反応は、食品、食品原料等の検査対象から抽出したDNA試料を鋳型とすることができる。本発明に係る、非ヒト動物DNAの増幅を確認する方法は、特に、核酸増幅反応によってアレルギーの原因となる特定の食品原料を検出する検査を行う際の、前検査あるいは同時検査のために使用することができる。すなわち、核酸増幅反応を用いた小麦、そば、落花生、エビ、カニ等の検出法（非特許文献１）や、牛、豚、鶏等の検出法（非特許文献２）を使用する際に、前検査あるいは同時検査として、検査対象となるDNA試料液に対して、本発明のプライマー・プローブセットを用いた核酸増幅を行うことが好ましい。
Object of Inspection The nucleic acid amplification reaction using the primer / probe set of the present invention can use a DNA sample extracted from an object of inspection such as a food or food material as a template. The method for confirming the amplification of non-human animal DNA according to the present invention is used for a pre-test or a simultaneous test, particularly when a test for detecting a specific food material causing allergy by a nucleic acid amplification reaction is performed. can do. That is, when using a detection method (Non-patent Document 1) of wheat, buckwheat, peanut, shrimp, crab, etc. using a nucleic acid amplification reaction, or a detection method (Non-Patent Document 2) of cows, pigs, chickens, etc. As a pre-inspection or simultaneous inspection, it is preferable to perform nucleic acid amplification using the primer / probe set of the present invention on a DNA sample solution to be inspected.
「検査対象」としては食品、食品原料等の、非ヒト動物の成分が含有されている可能性のあるものであれば特に限定されない。食品原料としては生又は加熱した食品材料等が挙げられる。食品としては加工食品、飲料等が挙げられる。 The “inspection object” is not particularly limited as long as it may contain a component of a non-human animal such as a food or a food material. Examples of food materials include raw or heated food materials. Examples of foods include processed foods and beverages.
本発明を用いて、PCR等の核酸増幅反応に供するDNA試料が該反応に適切な品質かを確認することで、核酸増幅反応を用いた検査の信頼性を高めることができる。 By using the present invention to confirm whether a DNA sample to be subjected to a nucleic acid amplification reaction such as PCR has an appropriate quality for the reaction, the reliability of the test using the nucleic acid amplification reaction can be enhanced.
すなわち、本発明の特徴である広範囲の非ヒト動物のDNAを増幅可能なプライマーを利用した検査対象から調製されたDNA試料を鋳型とする核酸増幅反応において、目的の長さの増幅産物が確認できれば、DNA試料中の夾雑物が十分に除去されていること、検査対象中のDNAの分解が極端でないこと、DNAが核酸増幅反応に供するために十分な量存在することを確認することができるため、DNA試料が核酸増幅反応の鋳型として適切な品質であると判断できる。本発明の方法により適切な品質であると判断されたDNA試料を用いることで、任意の特定の配列の増幅を試みる核酸増幅法において「陽性」、「陰性」を正しく判定することができる。一方、本発明の方法によりDNA試料の品質が不適切だと判断された場合、該試料を鋳型とした核酸増幅反応による検査は不能であると判断することができる。 That is, in a nucleic acid amplification reaction using as a template a DNA sample prepared from a test object using primers capable of amplifying a wide range of non-human animal DNA, which is a feature of the present invention, an amplification product of a desired length can be confirmed. Because it is possible to confirm that the impurities in the DNA sample have been sufficiently removed, the degradation of the DNA in the test object is not extreme, and that there is a sufficient amount of DNA for the nucleic acid amplification reaction Therefore, it can be determined that the DNA sample has an appropriate quality as a template for the nucleic acid amplification reaction. By using a DNA sample determined to have an appropriate quality by the method of the present invention, it is possible to correctly determine “positive” and “negative” in a nucleic acid amplification method that attempts to amplify any specific sequence. On the other hand, when it is determined that the quality of the DNA sample is inappropriate by the method of the present invention, it can be determined that the inspection by the nucleic acid amplification reaction using the sample as a template is impossible.
また、食品原料、食品等の検査対象には異物等が検出される場合も想定されるが、当該異物がどのような由来であるかが不明な場合がある。そこで、本発明のプライマー・プローブセットを用いた核酸増幅反応を応用することで、異物がどのような動物由来のものであるかを推定することができる。例えば、水産系の加工品の異物として、動物の幼生が見つかる場合や、畜産系の加工品の異物として、骨などの動物組織の破片が見つかる場合もある。これらは形態観察だけでは動物種の推定が難しい場合もあるが、本発明のプライマー・プローブセットを用いた核酸増幅反応で得られた増幅産物であるDNA断片の塩基配列を解析し、その配列を公共あるいは個人が持つデータベースと照合すれば、当該異物の動物種を推定することが可能である。但し、被験DNA試料液中に、一種類の動物DNAが寡占的である場合にのみ、その推定が可能であり、複数の動物DNAが複雑に混じり合っている場合には、その推定は困難となる場合もありうる。 Moreover, although it is assumed that a foreign material or the like is detected in an inspection object such as a food raw material or food, it may be unclear what the foreign material is derived from. Therefore, by applying a nucleic acid amplification reaction using the primer / probe set of the present invention, it is possible to estimate what animal the foreign substance is derived from. For example, there are cases where animal larvae are found as foreign matters of fishery processed products, and fragments of animal tissues such as bones are found as foreign matters of livestock processed products. In some cases, it is difficult to estimate the animal species by morphological observation alone, but the nucleotide sequence of the DNA fragment that is the amplification product obtained by the nucleic acid amplification reaction using the primer / probe set of the present invention is analyzed, and the sequence is determined. It is possible to estimate the animal species of the foreign object by collating with a public or individual database. However, the estimation is possible only when one kind of animal DNA is oligopolistic in the test DNA sample solution, and when multiple animal DNAs are mixed in a complicated manner, the estimation is difficult. It may be.
このように、本発明のプライマー・プローブセットの適用性は広く、核酸増幅反応に供するDNA試料の品質確認や、異物分析等で利用が可能である。 Thus, the applicability of the primer / probe set of the present invention is wide, and can be used for quality confirmation of a DNA sample subjected to nucleic acid amplification reaction, foreign matter analysis, and the like.
検査対象からのDNAの調製
検査対象からのDNAの調製は、核酸抽出法として当業者に公知の任意の方法を用いて行うことができる。たとえば、フェノール／クロロホルム法、界面活性剤による細胞溶解やプロテアーゼ酵素による細胞溶解、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結溶融を繰り返す処理方法などにより行うことができる。抽出のための試薬としては、市販されている各種DNA抽出キットを用いてもよい。必要に応じて、メンブランフィルターによる濾過やホモジナイズを行い検査対象からDNAを抽出することができる。
Preparation of DNA from test subject DNA can be prepared from test subject using any method known to those skilled in the art as a nucleic acid extraction method. For example, it can be carried out by a phenol / chloroform method, cell lysis with a surfactant, cell lysis with a protease enzyme, a physical destruction method with glass beads, a treatment method in which freeze thawing is repeated. As a reagent for extraction, various commercially available DNA extraction kits may be used. If necessary, DNA can be extracted from the test object by filtration or homogenization with a membrane filter.
核酸増幅反応
核酸増幅反応としてはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)や、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)等を適用することができる。好ましくは核酸増幅反応としてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いる。
Nucleic acid amplification reaction As the nucleic acid amplification reaction, polymerase chain reaction (PCR), LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), or the like can be applied. The polymerase chain reaction (PCR) is preferably used as the nucleic acid amplification reaction.
核酸増幅反応は上記のプライマー・プローブセットを用いる以外は特に制限はなく、常法に従って行えばよい。具体的には、核酸増幅反応がPCRである場合、鋳型DNAの変性、プライマーの鋳型DNAへのアニーリング、および耐熱性酵素（TaqポリメラーゼやThermus themophilis由来のTth DNAポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ）を用いたプライマーの伸長反応を含むサイクルを繰り返すことにより、非ヒト動物の28S rRNAをコードするゲノムDNAの特定の塩基配列を含む断片を増幅させる。PCR反応液の組成、PCR条件（温度サイクル、サイクルの回数等）は、当業者であれば、前記のプライマーペアを用いたPCRにおいてPCR増幅産物が得られるように、予備実験等により適切に選択および設定することができる。また、PCR反応液中のPNAプローブ量については、当業者であれば、ヒトゲノムDNA 50ngを鋳型に用いた前記のPCRにおいてPCR増幅産物が得られないようなPNAプローブの量を、予備実験等により適切に選択および設定することができる。上記のアニーリングの条件としては、62℃で、1.5mM程度のMgCl2を含むPCR反応液中で1分行うことを例示することができるが、これは一例に過ぎず、アニーリング温度、PCR反応液の組成、アニーリング時間等は、プライマーとなるオリゴヌクレオチド配列の長さや塩基組成などに応じて適宜設定することができる。これらPCRの一連の操作は、市販のPCRキットやPCR装置を利用して、その操作説明書に従って行うことができる。PCR装置は、典型的にはGeneAmp PCR System 9700（アプライドバイオシステムズ社製）を用いることができるが、他のPCR装置も使用可能である。 The nucleic acid amplification reaction is not particularly limited except that the above primer / probe set is used, and may be performed according to a conventional method. Specifically, when the nucleic acid amplification reaction was PCR, denaturation of template DNA, annealing of primers to template DNA, and thermostable enzymes (DNA polymerases such as Taq polymerase and Tth DNA polymerase from Thermus themophilis) were used. By repeating a cycle including a primer extension reaction, a fragment containing a specific base sequence of genomic DNA encoding 28S rRNA of a non-human animal is amplified. The composition of the PCR reaction solution and the PCR conditions (temperature cycle, number of cycles, etc.) are appropriately selected by those skilled in the art through preliminary experiments so that PCR amplification products can be obtained in PCR using the above primer pairs. And can be set. As for the amount of PNA probe in the PCR reaction solution, those skilled in the art can determine the amount of PNA probe that does not yield a PCR amplification product in the PCR using 50 ng of human genomic DNA as a template by preliminary experiments or the like. Can be selected and set appropriately. The annealing conditions can be exemplified by performing in a PCR reaction solution containing about 1.5 mM MgCl 2 at 62 ° C. for 1 minute, but this is only an example, and the annealing temperature, PCR reaction solution The composition, annealing time, and the like can be appropriately set according to the length of the oligonucleotide sequence serving as a primer, the base composition, and the like. A series of these PCR operations can be performed using a commercially available PCR kit or PCR apparatus according to the operating instructions. Typically, GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) can be used as the PCR apparatus, but other PCR apparatuses can also be used.
標的増幅産物の確認
核酸増幅反応により標的増幅産物が得られたかどうかは、アガロースゲル電気泳動、DNAハイブリダイゼーションやリアルタイム PCR等の方法を用いて確認することができる。標的増幅産物の断片長は、増幅しようとする28S rRNA遺伝子領域の塩基配列において両プライマーに挟まれる領域の塩基数となる。本発明のプライマーペアを用いた場合は、標的増幅産物の断片長は約60-83bpである。このような標的増幅産物の長さであることは、DNAの断片化による影響が、非特許文献１で用いられるアレルギー検査法と極端に異ならない点で有効である。
Confirmation of Target Amplification Product Whether or not the target amplification product was obtained by the nucleic acid amplification reaction can be confirmed by using methods such as agarose gel electrophoresis, DNA hybridization and real-time PCR. The fragment length of the target amplification product is the number of bases in the region sandwiched between both primers in the base sequence of the 28S rRNA gene region to be amplified. When the primer pair of the present invention is used, the fragment length of the target amplification product is about 60-83 bp. Such a length of the target amplification product is effective in that the influence of DNA fragmentation is not extremely different from the allergy test method used in
上記の標的増幅産物の塩基配列、殊にプライマー配列部分を除いた塩基配列を、GenBank等に登録されている塩基配列と比較することによって、その増幅産物の起源生物種を推定することができ、検査結果の信頼性を高めることができる。 By comparing the base sequence of the target amplification product, particularly the base sequence excluding the primer sequence part, with the base sequence registered in GenBank etc., the source species of the amplification product can be estimated, The reliability of the inspection result can be increased.
標的増幅産物の塩基配列解析による生物種の推定
本発明では、得られた標的増幅産物の起源生物種、特に動物種を、標的増幅産物の塩基配列を指標として確認する工程を行うこともできる。具体的には、標的増幅産物をアガロース電気泳動等により精製し、バンドを切り出してDNAを抽出し、得られたDNA断片をダイレクトシーケンス法に供して塩基配列を決定するか、または、適当なベクターに挿入後、大腸菌等にクローニングして培養した後に、得られたDNA断片の塩基配列を確認する。配列の確認はサンガー法やマキサム−ギルバート法等の一般的な方法によって行えばよい。確認された塩基配列のうち、プライマー配列を除いた塩基配列を公共あるいは個人が持つデータベースと照合することで、当該異物の生物種を推定することが可能である。本願発明によって得られる増幅領域は、GenBank等において比較的広範囲なデータが開示されているため、生物種の推定に有効である。
Estimation of biological species by base sequence analysis of target amplification product In the present invention, a step of confirming the source biological species of the obtained target amplification product, particularly an animal species, using the base sequence of the target amplification product as an index can be performed. Specifically, the target amplification product is purified by agarose electrophoresis or the like, the band is cut out and DNA is extracted, and the obtained DNA fragment is subjected to the direct sequencing method to determine the base sequence, or an appropriate vector After being inserted into, and cloned and cultured in E. coli or the like, the base sequence of the obtained DNA fragment is confirmed. The sequence can be confirmed by a general method such as the Sanger method or the Maxam-Gilbert method. Of the confirmed base sequences, it is possible to estimate the species of the foreign substance by comparing the base sequence excluding the primer sequence with a public or individual database. The amplification region obtained by the present invention is effective for estimating species because a relatively wide range of data is disclosed in GenBank and the like.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
実施例１：動物共通PCRプライマー・PNAプローブセットの、食品に用いられる動物、植物に対する特異性評価
(1) 試料の調製
DNAの取得
サバフグ、マカレイ、ブリ、アジ、サバ、カツオ、マグロ、シマホッケ、サンマ、ボラ、マダラ、アンコウ、アオメエソ（メヒカリ）、サケ、カラフトシシャモ、ドジョウ、マイワシ、ウナギ、エイ、マボヤ、マダコ、コウイカ、ヤリイカ、スルメイカ、アワビ、サザエ、ツブガイ、ホンミル、マテガイ、シジミ、トリガイ、アサリ、ハマグリ、ホッキガイ、バカガイ（アオヤギ）、ホタテ、マガキ、ムラサキイガイ（ムール貝）、アカガイ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ウシエビ（ブラックタイガー）、アキアミ、ホッコクアカエビ（アマエビ）、イセエビ、タラバガニ、ズワイガニ、ナンキョクオキアミ、イサザアミ、シャコ、マナマコ、エゾバフンウニ、クラゲ、コメ、とうもろこし、小麦、大豆、落花生、そば、ばれいしょ、トマト、人参、玉ねぎ、白菜、ホウレンソウ、きゅうり、アロエベラ、パイナップル、パパイヤ、オレンジ、メロン、柿、いちじく、マンゴー、バナナ、アボカド、ブルーベリー、ブドウ、キウイ、リンゴは市場から購入した。
Example 1: Evaluation of specificity of animal common PCR primer / PNA probe set for animals and plants used in food
(1) Sample preparation
Acquiring DNA Mackerel, Macaque, Yellowtail, Horse mackerel, Skipjack, Tuna, Shimahokke, Sanma, Bora, Madara, Anglerfish, Aomeso (Mexicali), Salmon, Caraft's Shamo, Loach, Sardine, Eel, Ray, Maboya, Madako, Cucumber , Squid, squid, abalone, sazae, horn mill, mate, rainbow trout, Triggery, clams, clams, scallops, snails, scallops, oysters, mussels (mussel), red oysters, cows, pigs, sheep, horses, chickens , Bovine shrimp (black tiger), kaki shrimp, pink tiger shrimp (shrimp), lobster, king crab, snow crab, antarctic krill, isaami, shrimp, manamako, echobafun sea urchin, jellyfish, rice, corn, wheat, soy, peanut, buckwheat, Potato, tomato, carrot, onion, Chinese cabbage, spinach, cucumber, aloe vera, pineapple, papaya, orange, melon, strawberries, figs, mango, banana, avocado, blueberry, grape, kiwi and apple were purchased from the market.
DNA試料液は、Genomic-tip 20/Gを用い、非特許文献１に記載された方法、または、Genomic-tip 100/Gを用い、Genomic DNA Handbook (QIAGEN) のTissueに記載された方法に従って抽出し取得した。
DNA sample solution is extracted using Genomic-
取得したDNAは、PCRに供するために、分光光度計で波長260nmにおける吸光度を測定した結果から濃度を測定した。動物試料から得たDNAは200 pg/μLに、植物試料から得たDNAは20 ng/μLに滅菌超純水で希釈した。タラから得たDNAについては、2 ng/μL、20 ng/μLにそれぞれ滅菌超純水で希釈したDNA試料液も作製した。 In order to use the obtained DNA for PCR, the concentration was measured from the result of measuring the absorbance at a wavelength of 260 nm with a spectrophotometer. DNA obtained from animal samples was diluted to 200 pg / μL, and DNA obtained from plant samples was diluted to 20 ng / μL with sterile ultrapure water. For DNA obtained from cod, DNA sample solutions diluted to 2 ng / μL and 20 ng / μL with sterile ultrapure water were also prepared.
植物試料から得たDNA試料液は、植物DNA検出PCR法（非特許文献１）で標的増幅産物の出現を確認したものを用いた。動物試料から得たDNA試料液は、クラゲ以外は動物DNA検出PCR法（非特許文献１）で増幅産物の出現を確認したものを用いた。クラゲから得たDNA試料液は、動物DNA検出PCR法で増幅産物が確認できなかったため、そのまま用いた。 As the DNA sample solution obtained from the plant sample, the one in which the appearance of the target amplification product was confirmed by the plant DNA detection PCR method (Non-patent Document 1) was used. As a DNA sample solution obtained from an animal sample, a product in which the appearance of an amplification product was confirmed by an animal DNA detection PCR method (Non-Patent Document 1) except for jellyfish. The DNA sample solution obtained from jellyfish was used as it was because no amplification product could be confirmed by the animal DNA detection PCR method.
(2) PCR
上記のようにして調製した各DNA試料液を用いてPCRを行った。PCRは、下記表１に示す反応液組成と、表２に示す温度条件で、フォワードプライマーに配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、リバースプライマーに配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマー、PNAプローブに配列番号３に示す塩基配列からなるPNAプローブを用い、0.2 mlチューブより、PCR装置にABI PRISM 9700（アプライドバイオシステムズ社製）を使用して行った。
(2) PCR
PCR was performed using each DNA sample solution prepared as described above. PCR is performed using the reaction solution composition shown in Table 1 below and the temperature conditions shown in Table 2 below. The forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 as the forward primer, and the reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 as the reverse primer. The PNA probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 was used as the PNA probe, and ABI PRISM 9700 (Applied Biosystems) was used as the PCR device from the 0.2 ml tube.
(3) PCR増幅産物の有無および断片長の確認
PCR後の反応液7.5 μLをそれぞれエチジウムブロマイド含有の3.5％アガロースゲル電気泳動に供した。同時に分子量マーカーとして20 bp DNA Ladder（タカラバイオ株式会社）を0.5 μL供し、UV照射で視覚化することで、PCR増幅産物の有無および断片長の確認を行った。
(3) Confirmation of presence of PCR amplification products and fragment length
Each 7.5 μL of the reaction solution after PCR was subjected to 3.5% agarose gel electrophoresis containing ethidium bromide. At the same time, 0.5 μL of 20 bp DNA Ladder (Takara Bio Inc.) was used as a molecular weight marker and visualized by UV irradiation to confirm the presence of PCR amplification products and the fragment length.
結果、調べた56種類の動物DNA全てにおいて標的増幅産物が得られ、目的の断片長以外の増幅産物は得られないことを確認した。図１には、マダラ（No.11）を除く動物55種で、DNA 500pgから目的の断片長と同じ長さ（60-83bp）の標的増幅産物が得られた結果を示す。なお、マダラは、DNA 500pgでは標的増幅産物が得られなかったが、DNA 5ngで標的増幅産物が得られた（図１右下）。 As a result, it was confirmed that target amplification products were obtained in all of the 56 types of animal DNA examined, and amplification products other than the desired fragment length were not obtained. FIG. 1 shows the results of obtaining target amplification products of the same length (60-83 bp) as the target fragment length from 500 pg of DNA in 55 animals except for spotted fish (No. 11). As for Madara, no target amplification product was obtained with 500 pg of DNA, but a target amplification product was obtained with 5 ng of DNA (lower right of FIG. 1).
植物については27試料中18試料で増幅産物が標的増幅産物の範囲付近に得られ、9試料からは増幅産物は得られなかった（図２）。得られた増幅産物は、パイナップルで2本、その他の17種では1本だった。 As for plants, amplification products were obtained in the vicinity of the target amplification product in 18 of 27 samples, and no amplification product was obtained from 9 samples (FIG. 2). The resulting amplification products were 2 for pineapples and 1 for the other 17 species.
これらの結果から、配列番号１と２と３のプライマー・プローブセットを用いたPCRは、食品に用いられる動物種の配列から、それぞれ予想された長さの増幅産物が得られることが示された。また、一部の食品に用いられる植物でも標的増幅産物と同じ位置に増幅産物が得られることが示された。 From these results, it was shown that PCR using the primer / probe sets of SEQ ID NOS: 1, 2 and 3 can obtain amplification products of the expected length from the sequences of animal species used in foods. . Moreover, it was shown that the amplification product can be obtained at the same position as the target amplification product even in plants used for some foods.
実施例２：標的増幅産物の塩基配列解析による生物種の推定
実施例1に示したPCRで得られたウシDNA由来の標的増幅産物の塩基配列を、ダイレクトシーケンス法により確認した。
Example 2: Estimation of biological species by base sequence analysis of target amplification product The base sequence of the target amplification product derived from bovine DNA obtained by PCR shown in Example 1 was confirmed by the direct sequencing method.
ダイレクトシーケンスした塩基配列データをGenBank nucleotide sequence databaseとBLAST searchによって比較解析し、その塩基配列の類似性に基づいて、増幅されたDNA断片の生物種を推定した。 The directly sequenced base sequence data were compared and analyzed by GenBank nucleotide sequence database and BLAST search, and the species of the amplified DNA fragment was estimated based on the similarity of the base sequences.
その結果、得られた塩基配列はウシの28S rRNA遺伝子領域の塩基配列（Accession No. AY639443）における配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとに挟まれる領域と一致した。このことから、本発明のプライマーを用いたPCRで得られた目的の長さの増幅産物の塩基配列を解析することで、その生物種を推定できることが示された。 As a result, the obtained base sequence was converted into a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the base sequence of the bovine 28S rRNA gene region (Accession No. AY639443). It coincided with the sandwiched area. From this, it was shown that the biological species can be estimated by analyzing the base sequence of the amplification product of the target length obtained by PCR using the primer of the present invention.
実施例３：動物共通PCRプライマー・PNAプローブセットの、分析環境から混入するDNA、ヒトDNAに対する特異性評価
(1) 試料の調製、PCRと標的増幅産物の確認
ヒトDNAは、試薬メーカー3社（Novagen、Biochain、GenScript）からそれぞれ1種類ずつ精製済みのDNA溶液を購入した。これらのDNA溶液を用い、それぞれ滅菌水を用いて20 ng/μLから10倍ずつ20 pg/μL（103倍）まで段階希釈したDNA試料液を作製した。
Example 3: Evaluation of specificity of animal common PCR primer / PNA probe set for DNA and human DNA mixed from analysis environment
(1) Preparation of sample, confirmation of PCR and target amplification product For human DNA, purified DNA solutions were purchased from three reagent manufacturers (Novagen, Biochain, GenScript). Using each of these DNA solutions, a DNA sample solution was prepared by serial dilution from 20 ng / μL to 20 pg / μL (10 3 times) in 10-fold increments using sterilized water.
また、ヒト唾液を、滅菌超純水を用いて10倍ずつ106倍まで段階希釈した液を作製した。 Moreover, the human saliva, to produce a solution prepared by serial dilution to 10 6 fold by 10-fold with sterilized ultrapure water.
これらのDNA試料液、または滅菌超純水 2.5 μLについて、それぞれ実施例１に記載の、本発明によるPCR（PNAプローブを含むPCR）、または、実施例１に記載した反応液組成のうちPNAプローブの代わりに滅菌超純水を用いたPCR（PNAプローブを含まないPCR）を行った。PCR後の反応液について、実施例１と同様にしてPCR増幅産物の有無および断片長の確認を行った。 For these DNA sample solutions or 2.5 μL of sterilized ultrapure water, the PCR according to the present invention (PCR including the PNA probe) described in Example 1 or the PNA probe of the reaction solution composition described in Example 1, respectively. Instead of PCR, PCR using sterile ultrapure water (PCR without PNA probe) was performed. For the reaction solution after PCR, the presence or absence of the PCR amplification product and the fragment length were confirmed in the same manner as in Example 1.
(2) 分析環境から混入するDNAに対する排他性の評価結果
DNA溶液の代わりに滅菌超純水を添加した、PNAプローブを含むPCR反応液を、蓋を開けたまま1時間分析環境に放置後、PCRを行う実験を20反応液×3回行ったが、計60反応液のいずれからも何の増幅産物も得られなかった（データ省略）。
(2) Exclusion evaluation results for DNA mixed in from the analysis environment
The PCR reaction solution containing PNA probe with sterilized ultrapure water added instead of the DNA solution was left in the analysis environment for 1 hour with the lid open, and then the experiment for PCR was performed 3
(3) ヒトDNAに対する排他性の評価結果
試薬メーカー3社から購入した3種類のヒトDNAをそれぞれ鋳型として、PNAプローブを含むPCRを行った結果、Novagen、GenScriptから購入したヒトDNAで50 ngからの増幅を完全に阻害した（図３）。Biochainから購入したヒトDNAで5 ng、50 ngからそれぞれごく薄い標的増幅産物が得られたものの、この増幅産物はGenBankデータベース中のラット配列（Accession No. AY739179）と一致したことから、原因はラット由来DNAの微量の混入だと推測した。
(3) Results of evaluation of exclusivity for human DNA As a result of performing PCR including PNA probes using three types of human DNA purchased from three reagent manufacturers as templates, human DNA purchased from Novagen and GenScript Amplification was completely inhibited (Figure 3). Although human amplification purchased from Biochain produced very thin target amplification products from 5 ng and 50 ng, respectively, this amplification product was consistent with the rat sequence (Accession No. AY739179) in the GenBank database. I guessed it was a very small amount of DNA.
ヒト唾液の段階希釈液をDNA試料液に用い、PNAプローブを含まないPCRを行った結果、希釈無し、10倍、102倍、103倍希釈液でそれぞれ標的増幅産物が得られた。一方、PNAプローブを含むPCRを行った結果、いずれの希釈液からも増幅産物は得られなかった。 Using serial dilutions of human saliva DNA sample solution, as a result of the PCR containing no PNA probes, without dilution, 10 times, 10 twice, each target amplification product in 10 3-fold dilutions were obtained. On the other hand, as a result of PCR containing the PNA probe, no amplification product was obtained from any of the dilutions.
これらの結果から、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのプライマーペアを用いたPCRに、配列番号３に示す塩基配列からなるPNAプローブを添加することによって、ヒトDNAを増幅しないことが示された。 From these results, a PCR using a primer pair consisting of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 was applied to a PNA probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. It was shown that human DNA was not amplified by the addition.
実施例４：動物共通PCRプライマー・PNAプローブセットの、市販動物含有加工食品中の動物由来DNAのPCR増幅
(1) 試料の調製、PCRと標的増幅産物の確認
ランチョンミート、ウインナーソーセージ、牛肉味付、やきとり（たれ味）、白湯スープの素、アンチョビーソース、いか味付、いわし油漬、さんま塩焼、スパゲッティ用調味料、とりささみ水煮、貝柱水煮、乾燥スープ（コンソメ）、中華だし、風味調味料（かつお）、風味かまぼこ（タラ100％と表示）、コンビーフ（牛肉）、まぐろ水煮、ずわいがにほぐしみ、あさり水煮、オイスターソース、ナンプラーは市場から購入した。DNA試料液は、Genomic-tip 20/Gを用い、非特許文献１に記載された方法、または、Genomic-tip 100/Gを用い、Genomic DNA Handbook (QIAGEN) のTissueに記載された方法に従って抽出し取得した。
Example 4: PCR amplification of animal-derived DNA in a commercial animal-containing processed food using an animal common PCR primer / PNA probe set
(1) Preparation of sample, confirmation of PCR and target amplification product Luncheon meat, Wiener sausage, Beef seasoning, Yakitori (boiled sauce), Shirayu soup base, Anchovy sauce, Squid seasoning, Sardine oil soup, Sanma salt grilled, Spaghetti Seasoning, Boiled Tori Sasami, Boiled Scallop, Dried Soup (Consomme), Chinese Dashi, Flavor Seasoning (Katsuo), Flavored Kamaboko (labeled 100% Cod), Corned Beef, Boiled Tuna Boiled Fish , Boiled clams, oyster sauce and nampula were purchased from the market. DNA sample solution is extracted using Genomic-
取得したDNAは、PCRに供するために、分光光度計で波長260nmにおける吸光度を測定した結果から濃度を測定し、20ng/μLに滅菌超純水で希釈した。 In order to use the obtained DNA for PCR, the concentration was measured from the result of measuring the absorbance at a wavelength of 260 nm with a spectrophotometer, and diluted with sterilized ultrapure water to 20 ng / μL.
これらのDNA試料液2.5 μLについて、それぞれ実施例1に記載のPCRを行った。PCR後の反応液について、実施例1と同様にしてPCR増幅産物の有無および断片長の確認を行った。 PCR described in Example 1 was performed on 2.5 μL of each of these DNA sample solutions. For the reaction solution after PCR, the presence or absence of the PCR amplification product and the fragment length were confirmed in the same manner as in Example 1.
DNA試料液中のPCRを阻害する夾雑物の有無の判定は、上記のようにして調製した各DNA試料液2.5 μLについて、それぞれ大豆DNA 5 pgを添加した植物DNA検出法（非特許文献１）で標的増幅産物を確認できたかによって行った。 The determination of the presence or absence of contaminants that inhibit PCR in the DNA sample solution was performed by a plant DNA detection method in which 2.5 pg of each DNA sample solution prepared as described above was added with 5 pg of soybean DNA (Non-patent Document 1). The target amplification product was confirmed by whether or not.
動物のうち、畜肉、魚、軟体類、甲殻類をそれぞれ含む市販品を用いて増幅の有無の評価を行った。 Among animals, the presence or absence of amplification was evaluated using commercially available products including meat, fish, molluscs, and crustaceans.
図４に示すように、動物を含む市販品のうち、PCR阻害が見られた4品（図４中、下線で示すアンチョビーソース、中華だし、オイスターソース、ナンプラー）以外は全て標的増幅産物が見られた。タラ100％と表示された風味かまぼこも標的増幅産物が見られた。従って、動物を含む市販品でPCR増幅可能と考えた。 As shown in FIG. 4, the target amplification products are all except commercial products including animals, except for 4 products that showed PCR inhibition (anchovy sauce, Chinese soup, oyster sauce, and sampler shown in underline in FIG. 4). It was seen. Targeted amplification products were also found in the flavored kamaboko labeled 100% cod. Therefore, it was considered that PCR amplification was possible with commercial products including animals.
比較例１
配列番号１の５’末端側の６塩基上流に設計した配列番号４に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号３に示す塩基配列からなるプローブとのセットを用いて、実施例３と同様にヒトDNAを鋳型としてPCRを行った結果、ヒトDNAからの増幅産物が得られた。したがって、本研究の目的とする動物共通PCRプライマー・PNAプローブセットとして配列番号４、２、３のセットは不適当と考えた。
配列番号4: 5’-ccatctagtagctggttccct-3’
Comparative Example 1
It consists of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 designed upstream 6 bases on the 5 ′ end side of SEQ ID NO: 1, a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a base sequence shown in SEQ ID NO: 3. As a result of PCR using a set with a probe and human DNA as a template in the same manner as in Example 3, an amplification product from human DNA was obtained. Therefore, the sets of SEQ ID NOs: 4, 2, and 3 were considered inappropriate as the common animal PCR primer / PNA probe set for this study.
SEQ ID NO: 5: 5'-ccatctagtagctggttccct-3 '
比較例２
配列番号３に示す塩基配列のN末端側の４塩基を欠いた配列番号５に示す塩基配列からなるプローブと、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマー・プローブセットを用いて、実施例３と同様にヒトDNAを鋳型としてPCRを行った結果、ヒトDNAからの増幅産物が得られた。したがって、本研究の目的とする動物共通PCRプライマー・PNAプローブセットとして配列番号１、２、５のセットは不適当と考えた。
配列番号5: H2N-ccgacgcacccccgc-CONH2
Comparative Example 2
From the probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 lacking the 4 bases on the N-terminal side of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, the forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 As a result of PCR using a primer / probe set consisting of a reverse primer and human DNA as a template in the same manner as in Example 3, an amplification product from human DNA was obtained. Therefore, the set of SEQ ID NOs: 1, 2, and 5 was considered inappropriate as the animal common PCR primer / PNA probe set for the purpose of this study.
SEQ ID NO: 5: H 2 N-ccgacgcacccccgc-CONH 2
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：人工的に合成されたペプチド核酸(PNA)プローブ
配列番号４：プライマー
配列番号５：人工的に合成されたペプチド核酸(PNA)プローブ
SEQ ID NO: 1: Primer SEQ ID NO: 2: Primer SEQ ID NO: 3: Artificially synthesized peptide nucleic acid (PNA) probe SEQ ID NO: 4: Primer SEQ ID NO: 5: Artificially synthesized peptide nucleic acid (PNA) probe
Claims (6)
プライマーペア:
(1) 5’-gtttccctcaggatagctgg-3’ (配列番号1) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が20〜25塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドと、5’-cctctaatcattcgctttaccgg-3’ (配列番号2) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が23〜28塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーペア
(2) 配列番号1に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号1に示す塩基配列と95％以上の相同性を有する塩基配列からなり、少なくとも3’末端の1塩基が、配列番号1に示す塩基配列の3’末端の1塩基と同一であるオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号2に示す塩基配列と95％以上の相同性を有する塩基配列からなり、少なくとも3’末端の1塩基が、配列番号2に示す塩基配列の3’末端の1塩基と同一であるオリゴヌクレオチドとからなり、前記(1)のプライマーペアと同一の領域を増幅することができるプライマーペア
PNAプローブ:
(3) N-agacccgacgcacccccgc-C (配列番号3) に示す塩基配列 (NはPNAオリゴマー鎖のN末端側を、CはPNAオリゴマー鎖のC末端側を指す)を含む、全体が19〜24塩基の鎖長を有するPNAオリゴマーからなるプローブ
(4) 配列番号3に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号3に示す塩基配列と95％以上の相同性を有する塩基配列からなるPNAオリゴマーからなり、前記(1)または(2)のプライマーペアを用いた核酸増幅反応において、ヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAが存在する場合に、該DNAとハイブリダイズして該DNAの増幅を阻止することができるプローブ
(5) 前記(3)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ
(6) 前記(4)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ。 Encodes a 28S ribosomal RNA derived from a non-human animal, comprising a primer pair selected from the following (1) and (2) and a peptide nucleic acid (PNA) probe selected from the following (3) to (6) Primer / probe set for amplifying a DNA fragment corresponding to the target region of genomic DNA:
Primer pair:
(1) 5′-gtttccctcaggatagctgg-3 ′ (SEQ ID NO: 1) containing a nucleotide sequence at the 3 ′ end, an oligonucleotide having a chain length of 20 to 25 bases as a whole, 5′-cctctaatcattcgctttaccgg-3 ′ ( A primer pair comprising an oligonucleotide having a chain length of 23 to 28 bases as a whole, comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2) on the 3 ′ end side
(2) It can hybridize under stringent conditions to a DNA fragment consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and has a homology of 95% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and an oligonucleotide having at least one base at the 3 'end identical to the 3' end of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 Consisting of a base sequence having a homology of 95% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and capable of hybridizing under stringent conditions to a DNA fragment comprising a simple base sequence , at least at the 3 ′ end 1 A primer pair consisting of an oligonucleotide having the same base as the 1 'base at the 3' end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and capable of amplifying the same region as the primer pair of (1) above
PNA probe:
(3) N-agacccgacgcacccccgc-C (SEQ ID NO: 3) The nucleotide sequence as a whole (N is the N-terminal side of the PNA oligomer chain and C is the C-terminal side of the PNA oligomer chain) is a total of 19 to 24 bases Probe consisting of PNA oligomer with a chain length of
(4) It can hybridize under stringent conditions to a DNA fragment consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and has a homology of 95% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. When a DNA encoding human 28S ribosomal RNA is present in a nucleic acid amplification reaction using the primer pair of (1) or (2) above, comprising a PNA oligomer comprising a base sequence having the property Probe capable of preventing amplification of the DNA by soybean
(5) A probe comprising a PNA oligomer comprising a base sequence complementary to the PNA oligomer constituting the probe of (3)
(6) A probe comprising a PNA oligomer having a base sequence complementary to the PNA oligomer constituting the probe of (4).
プライマーペア：
(1) 5’-gtttccctcaggatagctgg-3’ (配列番号1) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が20〜25塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドと、5’-cctctaatcattcgctttaccgg-3’ (配列番号2) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が23〜28塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーペア
(2) 配列番号1に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号1に示す塩基配列と95％以上の相同性を有する塩基配列からなり、少なくとも3’末端の1塩基が、配列番号1に示す塩基配列の3’末端の1塩基と同一であるオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号2に示す塩基配列と95％以上の相同性を有する塩基配列からなり、少なくとも3’末端の1塩基が、配列番号2に示す塩基配列の3’末端の1塩基と同一であるオリゴヌクレオチドとからなり、前記(1)のプライマーペアと同一の領域を増幅することができるプライマーペア
PNAプローブ:
(3) N-agacccgacgcacccccgc-C (配列番号3) に示す塩基配列 (NはPNAオリゴマー鎖のN末端側を、CはPNAオリゴマー鎖のC末端側を指す)を含む、全体が19〜24塩基の鎖長を有するPNAオリゴマーからなるプローブ
(4) 配列番号3に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号3に示す塩基配列と95％以上の相同性を有する塩基配列からなるPNAオリゴマーからなり、前記(1)または(2)のプライマーペアを用いた核酸増幅反応において、ヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAが存在する場合に、該DNAとハイブリダイズして該DNAの増幅を阻止することができるプローブ
(5) 前記(3)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ
(6) 前記(4)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ。 A primer comprising a DNA sample prepared from a test target as a template, a primer pair selected from the following (1) and (2), and a peptide nucleic acid (PNA) probe selected from the following (3) to (6) A test object comprising an amplification step of amplifying a DNA fragment using a probe set, and an estimation step of estimating the source species of the target amplification product based on the base sequence of the target amplification product obtained by the amplification step Method to estimate the origin species of DNA contained in:
Primer pair:
(1) 5′-gtttccctcaggatagctgg-3 ′ (SEQ ID NO: 1) containing a nucleotide sequence at the 3 ′ end, an oligonucleotide having a chain length of 20 to 25 bases as a whole, 5′-cctctaatcattcgctttaccgg-3 ′ ( A primer pair comprising an oligonucleotide having a chain length of 23 to 28 bases as a whole, comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2) on the 3 ′ end side
(2) It can hybridize under stringent conditions to a DNA fragment consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and has a homology of 95% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and an oligonucleotide having at least one base at the 3 'end identical to the 3' end of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 Consisting of a base sequence having a homology of 95% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and capable of hybridizing under stringent conditions to a DNA fragment comprising a simple base sequence , at least at the 3 ′ end 1 A primer pair consisting of an oligonucleotide having the same base as the 1 'base at the 3' end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and capable of amplifying the same region as the primer pair of (1) above
PNA probe:
(3) N-agacccgacgcacccccgc-C (SEQ ID NO: 3) The nucleotide sequence as a whole (N is the N-terminal side of the PNA oligomer chain and C is the C-terminal side of the PNA oligomer chain) is a total of 19 to 24 bases Probe consisting of PNA oligomer with a chain length of
(4) It can hybridize under stringent conditions to a DNA fragment consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and has a homology of 95% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. When a DNA encoding human 28S ribosomal RNA is present in a nucleic acid amplification reaction using the primer pair of (1) or (2) above, comprising a PNA oligomer comprising a base sequence having the property Probe capable of preventing amplification of the DNA by soybean
(5) A probe comprising a PNA oligomer comprising a base sequence complementary to the PNA oligomer constituting the probe of (3)
(6) A probe comprising a PNA oligomer having a base sequence complementary to the PNA oligomer constituting the probe of (4).
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