JP5667976B2 - Production method of organic acids - Google Patents

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Description

本発明はグルコースからＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩を製造する方法に関する。   The present invention relates to a method for producing L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof from glucose.

Ｌ−酒石酸及びその塩は、食品分野では酸味付け、ｐＨ調整剤として、工業分野では化粧品、染色、洗剤、メッキとして、医薬品分野では医薬品原料として用いられるなど、産業界で幅広く利用される有用な物質である。また、グルコースからＬ−酒石酸を製造する際にＬ−酒石酸と共に生産されるグリコール酸は、金属洗浄剤、メッキ添加剤、化粧品添加物、硬質系生分解性ポリマーの原料などとして利用される有用な物質である。   L-tartaric acid and its salts are useful in a wide range of industries such as acidification in the food field, pH adjusters, cosmetics, dyeing, detergents, plating in the industrial field, and pharmaceutical raw materials in the pharmaceutical field. It is a substance. Glycolic acid produced together with L-tartaric acid when producing L-tartaric acid from glucose is useful as a metal detergent, plating additive, cosmetic additive, hard biodegradable polymer raw material, etc. It is a substance.

Ｌ−酒石酸の製造方法として、様々な方法が知られているが、現在はワイン醸造の残渣および石油由来の中間体無水マレイン酸から作られている。また、グリコール酸は、石油化学の手法によって製造されている。一方、出発原料としてグルコースを用い、５−ケトグルコン酸を経て、酒石酸とグリコール酸を製造する方法は研究段階であり、様々な検討が過去に行われてきた。グルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸への変換方法としては、グルコノバクター属又はアセトバクター属に属する酢酸菌を用いて、グルコースからグルコン酸を経て５−ケト−Ｄ−グルコン酸を発酵生成する方法が報告されている。５−ケト−Ｄ−グルコン酸の実際の発酵生成においては、炭酸カルシウムを中和剤として利用したり、水酸化カルシウムを用いてｐＨ制御を行ったりして、５−ケト−Ｄ−グルコン酸を、水難溶性の５−ケト−Ｄ−グルコン酸のカルシウム塩として析出させ、その５−ケト−Ｄ−グルコン酸のカルシウム塩を発酵液から回収する方法が知られている。   Various methods are known as a method for producing L-tartaric acid, but it is currently made from winemaking residue and petroleum-derived intermediate maleic anhydride. In addition, glycolic acid is produced by a petrochemical technique. On the other hand, the method of producing tartaric acid and glycolic acid using glucose as a starting material and via 5-ketogluconic acid is in the research stage, and various studies have been conducted in the past. As a conversion method from glucose to 5-keto-D-gluconic acid, acetic acid bacteria belonging to the genus Gluconobacter or Acetobacter are used, and 5-keto-D-gluconic acid is produced by fermentation from glucose to gluconic acid. How to do it has been reported. In the actual fermentation production of 5-keto-D-gluconic acid, calcium carbonate is used as a neutralizing agent, or pH control is performed using calcium hydroxide, so that 5-keto-D-gluconic acid is obtained. A method is known in which a calcium salt of 5-keto-D-gluconic acid, which is sparingly soluble in water, is deposited and the calcium salt of 5-keto-D-gluconic acid is recovered from the fermentation broth.

また、グルコノバクター又はアセトバクターに属する多くの酢酸菌は、グルコースからグルコン酸を経て５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成するとともに、前述のグルコン酸から２−ケト−Ｄ−グルコン酸も同時に生成することが知られている。この２−ケト−Ｄ−グルコン酸はＬ−酒石酸やグリコール酸にはなり得ないため、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の収量の低下を招く。そこで、２−ケト−Ｄ−グルコン酸非生産株を誘導することによって、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の収率の向上が図られている(特許文献１参照)。しかしながら、多くの酢酸菌は、グルコースからグルコン酸を経て５−ケトグルコン酸を生成する酵素だけでなく、５−ケト−Ｄ−グルコン酸からグルコン酸へと変換する５−ケト−Ｄ−グルコン酸還元酵素を細胞質内に有している。還元されたグルコン酸はペントース・リン酸径路およびエントナー・ドウドロフ径路などの代謝径路により消費されてしまうため、Ｌ−酒石酸及びグリコール酸の原料となる５−ケト−Ｄ−グルコン酸の生成量が低下してしまうことも知られている（非特許文献１参照）。   In addition, many acetic acid bacteria belonging to Gluconobacter or Acetobacter produce 5-keto-D-gluconic acid from glucose via gluconic acid, and at the same time 2-keto-D-gluconic acid from gluconic acid described above. It is known to generate. Since this 2-keto-D-gluconic acid cannot become L-tartaric acid or glycolic acid, the yield of 5-keto-D-gluconic acid is reduced. Therefore, the yield of 5-keto-D-gluconic acid is improved by inducing a non-producing strain of 2-keto-D-gluconic acid (see Patent Document 1). However, many acetic acid bacteria are not only enzymes that produce 5-ketogluconic acid from glucose via gluconic acid, but also 5-keto-D-gluconic acid reduction that converts 5-keto-D-gluconic acid to gluconic acid. It has an enzyme in the cytoplasm. Reduced gluconic acid is consumed by metabolic pathways such as the pentose / phosphoric acid pathway and the Entner / Doudoroff pathway, resulting in a decrease in the amount of 5-keto-D-gluconic acid used as a raw material for L-tartaric acid and glycolic acid. It is also known that this occurs (see Non-Patent Document 1).

一方、５−ケト−Ｄ−グルコン酸から酒石酸の製造に関する報告がある。Isbellらは、水難溶性の５−ケト−Ｄ−グルコン酸カルシウム塩を出発原料として用い、それをまず炭酸ナトリウムと接触させて水溶性の５−ケト−Ｄ−グルコン酸ナトリウム塩に変換し、その後１モル水酸化ナトリウム溶液中で反応を行い、約１０％の収量で酒石酸が得られたと報告している（非特許文献２参照）。この製造法においては、水難溶性の炭酸カルシウムが副生するので、５−ケト−Ｄ−グルコン酸を酒石酸に変換する前に、反応液から炭酸カルシウムを取り除いておく必要がある。また、除去した炭酸カルシウムは、廃棄物として処理する必要があるため、本製造法のコスト高の要因となる。また、本製造法によれば、酒石酸の収量が約１０％と低いこと、及び、酒石酸以外に不要な有機酸が多量に副生するため、これらを分離する必要があるなどの問題点があり、工業的な酒石酸の製造には利用することは出来ない。   On the other hand, there is a report on the production of tartaric acid from 5-keto-D-gluconic acid. Isbell et al. Used poorly water-soluble 5-keto-D-gluconate calcium salt as a starting material, which was first contacted with sodium carbonate to convert it to water-soluble 5-keto-D-gluconate sodium salt, and then It has been reported that tartaric acid was obtained in a yield of about 10% after reacting in 1 molar sodium hydroxide solution (see Non-Patent Document 2). In this production method, since poorly water-soluble calcium carbonate is by-produced, it is necessary to remove calcium carbonate from the reaction solution before converting 5-keto-D-gluconic acid to tartaric acid. Further, since the removed calcium carbonate needs to be treated as waste, it becomes a factor of high cost of the present production method. In addition, according to this production method, there are problems such as that the yield of tartaric acid is as low as about 10%, and that unnecessary organic acids other than tartaric acid are produced as a by-product, so that they need to be separated. It cannot be used for industrial tartaric acid production.

酒石酸の収量をさらに改善する方法として、５−ケト−Ｄ−グルコン酸をアルカリ条件下、炭酸イオンあるいはリン酸イオンを含む緩衝液中で貴金属触媒に酸化的に接触させることにより、酒石酸を高収量で生産させる製造法が報告されている。さらにそのような条件下、触媒としてバナジン酸を用いればさらに高い収量で酒石酸が生産されることが報告されている(特許文献２参照)。しかしながら、これらの製造法には、製造材料として炭酸などの高価な緩衝剤を用いること、及び、ヒトに対し毒性を示すバナジン酸を触媒として用いるため多額の精製コストを必要とすることなどの欠点がある。   As a method for further improving the yield of tartaric acid, high yield of tartaric acid is obtained by contacting 5-keto-D-gluconic acid oxidatively with a noble metal catalyst in a buffer containing carbonate ion or phosphate ion under alkaline conditions. A production method for production in Japan has been reported. Furthermore, it has been reported that tartaric acid is produced in a higher yield when vanadic acid is used as a catalyst under such conditions (see Patent Document 2). However, these production methods use disadvantages such as the use of an expensive buffer such as carbonic acid as a production material and the use of vanadic acid, which is toxic to humans, as a catalyst, which requires a large amount of purification cost. There is.

さらに、その後、アルカリ条件下で、５−ケト−Ｄ−グルコン酸と、白金などの希少金属炭素触媒とを、水溶液、炭酸、リン酸、ピロリン酸、あるいは硫酸緩衝液中で接触させることによって、６１％の収量で酒石酸を生産させる製造法が報告されている（特許文献３参照）。しかしながら、この製造法でも、溶液として炭酸緩衝液を用いるため、酒石酸生産におけるコスト高の要因になっている。   Further, by contacting 5-keto-D-gluconic acid with a rare metal carbon catalyst such as platinum in an aqueous solution, carbonic acid, phosphoric acid, pyrophosphoric acid, or sulfuric acid buffer under alkaline conditions. A production method for producing tartaric acid with a yield of 61% has been reported (see Patent Document 3). However, even in this production method, a carbonate buffer solution is used as a solution, which is a cause of high cost in tartaric acid production.

以上述べた様に、従来の知見に基づいて、グルコースからの酒石酸の製造法を考えた場合、その製造法は、グルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸のカルシウム塩を微生物発酵によって生成し、５−ケト−Ｄ−グルコン酸カルシウム塩を分離する工程、得られた水難溶性の５−ケト−Ｄ−グルコン酸カルシウム塩を水溶性の塩に変換する工程、さらに水溶性の５−ケト−Ｄ−グルコン酸塩を化学的に酒石酸に変換する工程からなることとなる。しかし、この製造法には、工程が多く、また操作の手間がかかるという大きな欠点があり、そのため多額の製造コストを必要とする。故に、これまで上記工程からなる酒石酸の製造法が工業的に実現できなかったと考えられる。   As described above, when considering a method for producing tartaric acid from glucose based on conventional knowledge, the production method produces a calcium salt of 5-keto-D-gluconic acid from glucose by microbial fermentation, A step of separating 5-keto-D-gluconic acid calcium salt, a step of converting the obtained poorly water-soluble 5-keto-D-gluconic acid calcium salt into a water-soluble salt, and further water-soluble 5-keto-D -It consists of the step of chemically converting gluconate to tartaric acid. However, this manufacturing method has a great disadvantage that it involves many steps and takes time and effort, and therefore requires a large manufacturing cost. Therefore, it is thought that the manufacturing method of tartaric acid which consists of the said process was not industrially realizable until now.

上記の欠点を補う方法として、最初の工程の酢酸菌によるグルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸へ変換させる培地中に、次の反応工程（５−ケト−Ｄ−グルコン酸塩を酒石酸に変換する工程）に必要なバナジン酸触媒を添加した酒石酸の製造法が報告されている（特許文献４参照）。しかし、特許文献４によれば、この製造法では、１０００ｇのグルコースからわずか４３ｇ（取得収率５．２重量％）の酒石酸しか採取されない。このように、この製造法の収量は非常に低いため、この製造法は、工業的酒石酸の製造には利用されていない。   As a method to compensate for the above disadvantages, the following reaction step (converting 5-keto-D-gluconate to tartaric acid in a medium for converting glucose to 5-keto-D-gluconic acid by acetic acid bacteria in the first step) A method for producing tartaric acid to which a vanadic acid catalyst necessary for the step is added has been reported (see Patent Document 4). However, according to Patent Document 4, in this production method, only 43 g (acquisition yield: 5.2% by weight) of tartaric acid is collected from 1000 g of glucose. Thus, since the yield of this production method is very low, this production method has not been utilized for the production of industrial tartaric acid.

一方、化学反応により、５−ケト−Ｄ−グルコン酸からグリコール酸を製造する方法に関しては、これまで１つの報告しか知られていない（特許文献５参照）。特許文献５によれば、反応液中にグリコール酸以外に低分子の有機酸が多数副生してしまうため、７９６ｇ／Ｌの５−ケト−Ｄ−グルコン酸からわずか１１．６ｇ／Ｌのグリコール酸しか生産されない。このように、この製造法の収量は非常に低いため、この製造法は工業的なグリコール酸の製造には利用されていない。   On the other hand, only one report has been known so far regarding a method for producing glycolic acid from 5-keto-D-gluconic acid by a chemical reaction (see Patent Document 5). According to Patent Document 5, many low-molecular organic acids other than glycolic acid are by-produced in the reaction solution, so that only 11.6 g / L of glycol is generated from 796 g / L of 5-keto-D-gluconic acid. Only acid is produced. Thus, since the yield of this production method is very low, this production method has not been used for industrial production of glycolic acid.

デンマーク特許第102004010786号公報Danish Patent No. 102004010786 米国特許第5763656号公報U.S. Patent No. 5763656 ドイツ特許第2388368号公報German Patent No. 2388368 米国特許第3585109号公報U.S. Pat.No. 3,585,109 米国特許第5731467号公報U.S. Pat.No. 5,733,467

O. Adachi, ビタミン, 76, 65-77, 2003O. Adachi, Vitamins, 76, 65-77, 2003 H. Isbell and N. Hold, The Journal of Research of the Bureau of Standards, 35, 433-438, 1945H. Isbell and N. Hold, The Journal of Research of the Bureau of Standards, 35, 433-438, 1945

背景技術に記載したように、グルコースからＬ−酒石酸やグリコール酸を製造する従来の方法は、操作の効率性やコストの点で不十分であり、工業的な製造に利用することが事実上困難であった。本発明の課題は、グルコースからＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩を効率良く、かつ、低コストで製造し得る方法であって、工業的な製造に利用し得る実用性の高い方法を提供することにある。   As described in the background art, the conventional method for producing L-tartaric acid or glycolic acid from glucose is insufficient in terms of operational efficiency and cost, and is practically difficult to use for industrial production. Met. An object of the present invention is a method capable of producing L-tartaric acid or its salt and / or glycolic acid or its salt from glucose efficiently and at low cost, and can be used for industrial production. The purpose is to provide a highly reliable method.

本発明者らは、グルコースからＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩を効率良く、かつ、低コストで製造し得る方法であって、工業的な製造に利用し得る実用性の高い方法を実現することを課題として鋭意研究を重ねた結果、以下のような工程Ａ〜Ｃを採用することによって、その課題を解決し得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
（Ａ）グルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生産する微生物を、５−ケト−Ｄ−グルコン酸を水溶性塩とし得るアルカリの存在下、グルコース含有培養液で培養することにより、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩を含む培養液を得る工程Ａ、
（Ｂ）工程Ａで得られた５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩を含む培養液のｐＨを７〜１２の範囲内に調整及び維持することにより、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩がＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩に変換した反応液を得る工程Ｂ、
（Ｃ）工程Ｂで得られた反応液から、Ｌ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩を採取する工程Ｃ。The present inventors are a method capable of producing L-tartaric acid or its salt and / or glycolic acid or its salt from glucose efficiently and at low cost, and can be used for industrial production. As a result of earnestly researching the realization of a highly efficient method, it was found that the problem could be solved by adopting the following steps A to C, and the present invention was completed. .
(A) By culturing a microorganism that produces 5-keto-D-gluconic acid from glucose in a glucose-containing culture solution in the presence of an alkali that can make 5-keto-D-gluconic acid a water-soluble salt, Step A for obtaining a culture solution containing a water-soluble salt of keto-D-gluconic acid,
(B) By adjusting and maintaining the pH of the culture solution containing the water-soluble salt of 5-keto-D-gluconic acid obtained in step A within the range of 7 to 12, 5-keto-D-gluconic acid Step B for obtaining a reaction solution in which a water-soluble salt of L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof is converted,
(C) Step C of collecting L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof from the reaction solution obtained in Step B.

すなわち、本発明は、（１）以下の工程Ａ〜Ｃを備え、グルコースからＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩を製造する方法；（Ａ）グルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生産する微生物を、水酸化カリウムの存在下、グルコース含有培養液で培養することにより、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩を含む培養液を得る工程Ａ；（Ｂ）工程Ａで得られた５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩を含む培養液のｐＨを水酸化カリウムを用い７〜１２の範囲内に調整及び維持することにより、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩がＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩に変換した反応液を得る工程Ｂ；（Ｃ）工程Ｂで得られた反応液から、Ｌ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩を採取する工程Ｃや、（２）上記工程Ｂにおける培養液に、遷移金属触媒をさらに含有させた培養液を用いることを特徴とする上記（１）に記載の方法や、（３）遷移金属触媒が、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、白金、マンガン、銅、コバルト、ニッケル、亜鉛、バナジウム及び鉄からなる群から選択される１種又は２種以上の遷移金属触媒であることを特徴とする上記（２）に記載の方法や、（４）遷移金属触媒の濃度が０．００００２〜２％の範囲内であることを特徴とする上記（２）又は（３）に記載の方法や、（５）遷移金属触媒の濃度が０．０００１〜１％の範囲内であることを特徴とする上記（２）〜（４）のいずれかに記載の方法や、（６）グルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生産する微生物が、グルコノバクター属又はアセトバクター属に属する微生物であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法や、（７）グルコノバクター属又はアセトバクター属に属する微生物が、グルコノバクター・オキシダンスＮＢＲＣ ３１７２およびＮＢＲＣ ３２５５、グルコノバクター・パストリアヌスＮＢＲＣ ３２２５、グルコノバクター・アルビダスＮＢＲＣ ３２５０、グルコノバクター・サブオキシダンスＮＢＲＣ ３２５４、グルコノバクター・インダストリアスＮＢＲＣ ３２６０、グルコノバクター・セレウスＮＢＲＣ ３２６７、グルコノバクター・ジオキシアセトニカスＮＢＲＣ ３２７３、グルコノバクター・モノオキシグルコニカスＮＢＲＣ ３２７６、グルコノバクター・グルコニカスＮＢＲＣ ３２８５、グルコノバクター・ロゼウスＮＢＲＣ ３９９０、グルコノバクター・フラトイリＮＢＲＣ ３２６５、アセトバクター・アセチＮＢＲＣ ３２５９、及び、それらの変異株であってグルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生産する株からなる群から選択されるいずれか１種又は２種以上の微生物であることを特徴とする上記（６）に記載の方法や、（８）グルコノバクター属又はアセトバクター属に属する微生物が、さらに２−ケト−Ｄ−グルコン酸低生産性及び／又は５−ケト−Ｄ−グルコン酸低消費性の株であることを特徴とする上記（７）に記載の方法や、（９）上記工程Ｂにおける培養液のｐＨを８〜１１の範囲内に調整及び維持することを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法や、（１０）上記工程Ｂにおける培養液のｐＨを９〜１０の範囲内に調整及び維持することを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法や、（１１）上記工程Ｂにおいて、培養液のｐＨを調整及び維持する際に、さらに、培養液の温度を０℃〜７０℃の範囲内に調整及び維持することを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法や、（１２）上記工程Ｂにおいて、培養液のｐＨを調整及び維持する際に、さらに、培養液の温度を２０℃〜６０℃の範囲内に調整及び維持することを特徴とする上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法や、（１３）上記工程Ｂにおいて、培養液のｐＨを調整及び維持する際に、さらに、培養液に対する空気供給量の割合を０．２〜５の範囲内に調整及び維持することを特徴とする上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法や、（１４）上記工程Ｂにおいて、培養液のｐＨを調整及び維持する際に、さらに、培養液に対する空気供給量の割合を０．５〜３の範囲内に調整及び維持することを特徴とする上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法や、（１５）工程Ｃにおいて採取されたＬ−酒石酸の塩が、Ｌ−酒石酸の１カリウム塩であることを特徴とする上記（１）〜（１４）のいずれかに記載の方法や、（１６）工程Ｃにおいて採取されたグリコール酸若しくはその塩が、グリコール酸のフリーな酸若しくはその塩であることを特徴とする上記（１）〜（１５）のいずれかに記載の方法に関する。 That is, the present invention comprises (1) the following steps A to C, and a method for producing L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof from glucose; (A) 5-keto from glucose Step A of obtaining a culture solution containing a water-soluble salt of 5-keto-D-gluconic acid by culturing a microorganism producing D-gluconic acid in a glucose-containing culture solution in the presence of potassium hydroxide ; ) By adjusting and maintaining the pH of the culture solution containing the water-soluble salt of 5-keto-D-gluconic acid obtained in step A within a range of 7 to 12 using potassium hydroxide , 5-keto-D -Step B for obtaining a reaction solution in which a water-soluble salt of gluconic acid is converted to L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof; (C) L-tartaric acid from the reaction solution obtained in Step B Or its salt, And / or step C for collecting glycolic acid or a salt thereof, and (2) the culture solution further containing a transition metal catalyst in the culture solution in step B above. And (3) one or more transition metal catalysts wherein the transition metal catalyst is selected from the group consisting of palladium, rhodium, ruthenium, platinum, manganese, copper, cobalt, nickel, zinc, vanadium and iron (2) or (3), wherein the method according to (2) above, or (4) the concentration of the transition metal catalyst is in the range of 0.00002 to 2% (5) The method according to any one of (2) to (4) above, wherein the concentration of the transition metal catalyst is in the range of 0.0001 to 1%, (6) ) Glucose to 5-keto-D-glu The method according to any one of (1) to (5) above, wherein the microorganism that produces acid is a microorganism belonging to the genus Gluconobacter or Acetobacter, or (7) The genus Gluconobacter Alternatively, microorganisms belonging to the genus Acetobacter are Gluconobacter oxydans NBRC 3172 and NBRC 3255, Gluconobacter pastorinus NBRC 3225, Gluconobacter albidas NBRC 3250, Gluconobacter suboxydans NBRC 3254, Gluconobacter Industrias NBRC 3260, Gluconobacter cereus NBRC 3267, Gluconobacter dioxyacetonicus NBRC 3273, Gluconobacter monooxygluconicus NBRC 3276, Gluconobacter gluconica NBRC 3285, Gluconobacter roseus NBRC 3990, Gluconobacter fragili NBRC 3265, Acetobacter aceti NBRC 3259, and mutants thereof that produce 5-keto-D-gluconic acid from glucose The method according to (6) above, wherein (8) the microorganism belonging to the genus Gluconobacter or Acetobacter is any one or more microorganisms selected from the group consisting of: Furthermore, the method according to (7) above, which is a strain with low productivity of 2-keto-D-gluconic acid and / or low consumption of 5-keto-D-gluconic acid, and (9) the above step The method according to any one of (1) to (8) above, wherein the pH of the culture solution in B is adjusted and maintained within the range of 8 to 11, ) Adjusting and maintaining the pH of the culture medium in the above step B within the range of 9 to 10, or (11) In the above step B, When adjusting and maintaining the pH of the culture solution, the temperature of the culture solution is further adjusted and maintained within the range of 0 ° C. to 70 ° C. Any one of the above (1) to (10) In the described method and (12) the step B, when adjusting and maintaining the pH of the culture solution, the temperature of the culture solution is further adjusted and maintained within a range of 20 ° C to 60 ° C. In the method according to any one of (1) to (11) above and (13) in step B, when adjusting and maintaining the pH of the culture solution, the ratio of the air supply amount to the culture solution is further set to 0. Adjust and maintain within the range of 2-5 above (1 In the method according to any one of (12) and (14), in step B, when adjusting and maintaining the pH of the culture solution, the ratio of the air supply amount to the culture solution is further set to 0.5 to 3. The method according to any one of (1) to (13) above, wherein (1) the salt of L-tartaric acid collected in step C is 1 of L-tartaric acid. The method according to any one of (1) to (14) above, which is a potassium salt, or (16) glycolic acid or a salt thereof collected in Step C is a free acid of glycolic acid or a salt thereof The method according to any one of (1) to (15) above, wherein the salt is a salt.

本発明によれば、グルコースからＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩を非常に効率良く、かつ、低コストで製造することができる。そのため、本発明の製造方法は、工業的な製造に利用することが可能であり、実用性もきわめて高い。   According to the present invention, L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof can be produced from glucose very efficiently and at low cost. Therefore, the production method of the present invention can be used for industrial production, and is extremely practical.

本発明の製造方法の一例の概略を示す図である。It is a figure which shows the outline of an example of the manufacturing method of this invention. 酢酸菌の代謝経路を示す図である。It is a figure which shows the metabolic pathway of acetic acid bacteria.

本発明の「グルコースからＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩を製造する方法」（以下、単に「本発明の製造方法」とも表示する。）としては、グルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生産する微生物を、５−ケト−Ｄ−グルコン酸を水溶性塩とし得るアルカリの存在下、グルコース含有培養液で培養することにより、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩を含有する培養液を得る工程Ａ；工程Ａで得られた５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩を含む培養液のｐＨを７〜１２の範囲内に調整及び維持することにより、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩がＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩に変換した反応液を得る工程Ｂ；及び、工程Ｂで得られた反応液から、Ｌ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩を採取する工程Ｃを備えている限り特に制限されない。これらの一連の工程Ａ〜Ｃを備えていることにより、グルコースからＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩（以下、「Ｌ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩」を単に「Ｌ−酒石酸等」とも表示する。）を非常に効率良く、かつ、低コストで製造することができる。特に、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩を含む培養液を得るものの（上記工程Ａ）、その培養液から５−ケト−Ｄ−グルコン酸を単離精製することなくそのまま上記Ｂのように、Ｌ−酒石酸等に変換することによって、Ｌ−酒石酸等の製造の効率が著しく向上し、また、それに伴ってＬ−酒石酸等の製造に要するコストが著しく低下する。なお、本発明の製造方法の一例の概略を図１に示す。   The “method for producing L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof from glucose” of the present invention (hereinafter, also simply referred to as “the production method of the present invention”) is a 5- By culturing a microorganism that produces keto-D-gluconic acid in a glucose-containing culture solution in the presence of an alkali that can make 5-keto-D-gluconic acid a water-soluble salt, Step A for obtaining a culture solution containing a water-soluble salt; adjusting and maintaining the pH of the culture solution containing the water-soluble salt of 5-keto-D-gluconic acid obtained in Step A within a range of 7 to 12 To obtain a reaction solution in which a water-soluble salt of 5-keto-D-gluconic acid is converted to L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof; and the reaction obtained in step B From the liquid, - tartaric acid or a salt thereof, and / or, not particularly limited as long as they include a step C of collecting glycolic acid or a salt thereof. By providing these series of steps A to C, L-tartaric acid or a salt thereof, and / or glycolic acid or a salt thereof (hereinafter referred to as “L-tartaric acid or a salt thereof, and / or glycolic acid) from glucose. Or, “the salt thereof” is also simply expressed as “L-tartaric acid or the like”.) Can be produced very efficiently and at low cost. In particular, although a culture solution containing a water-soluble salt of 5-keto-D-gluconic acid is obtained (step A above), the above-mentioned B as it is without isolating and purifying 5-keto-D-gluconic acid from the culture solution. Thus, by converting into L-tartaric acid etc., the efficiency of manufacture of L-tartaric acid etc. improves remarkably, and the cost required for manufacture of L-tartaric acid etc. falls remarkably in connection with it. In addition, the outline of an example of the manufacturing method of this invention is shown in FIG.

また、上記工程Ａにおける「グルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生産する微生物」（以下、「本発明における微生物」とも表示する。）とは、その微生物を、その微生物の生育に適した条件下、グルコース含有培養液で培養することにより、グルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生産する能力（以下、単に「５−ケト−Ｄ−グルコン酸生産能」とも表示する。）を有する微生物を意味する。かかる本発明における微生物としては、グルコノバクター属又はアセトバクター属に属する多くの酢酸菌を好適に例示することができ、中でも、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＢＲＣ）などの公的菌株保存機関で保管されているグルコノバクター属又はアセトバクターに属する菌株として、グルコノバクター・オキシダンスＮＢＲＣ ３１７２及びＮＢＲＣ ３２５５、グルコノバクター・パストリアヌスＮＢＲＣ ３２２５、グルコノバクター・アルビダスＮＢＲＣ ３２５０、グルコノバクター・サブオキシダンスＮＢＲＣ ３２５４、グルコノバクター・インダストリアスＮＢＲＣ ３２６０、グルコノバクター・セレウスＮＢＲＣ ３２６７、グルコノバクター・ジオキシアセトニカスＮＢＲＣ ３２７３、グルコノバクター・モノオキシグルコニカスＮＢＲＣ ３２７６、グルコノバクター・グルコニカスＮＢＲＣ ３２８５、グルコノバクター・ロゼウスＮＢＲＣ ３９９０、グルコノバクター・フラトイリＮＢＲＣ ３２６５、アセトバクター・アセチＮＢＲＣ ３２５９などをより好適に例示することができ、５−ケト−Ｄ−グルコン酸生産能に優れていることからグルコノバクター・オキシダンスＮＢＲＣ ３１７２株をさらに好適に例示することができる。また、本発明における微生物には、５−ケト−Ｄ−グルコン酸生産能を有している限り、新たに自然界から分離されるグルコノバクター属又はアセトバクター属に属する菌株を用いることもできる。   The “microorganism producing 5-keto-D-gluconic acid from glucose” in the above step A (hereinafter also referred to as “microorganism in the present invention”) is suitable for the growth of the microorganism. Under the conditions, it has the ability to produce 5-keto-D-gluconic acid from glucose by culturing in a glucose-containing culture solution (hereinafter also simply referred to as “5-keto-D-gluconic acid producing ability”). Means microorganism. As such microorganisms in the present invention, many acetic acid bacteria belonging to the genus Gluconobacter or Acetobacter can be preferably exemplified, and among them, public strain preservation such as the National Institute of Technology and Evaluation (NBRC) Gluconobacter oxydans NBRC 3172 and NBRC 3255, Gluconobacter pastorinus NBRC 3225, Gluconobacter albidas NBRC 3250, Gluconobacter Suboxydans NBRC 3254, Gluconobacter industry NBRC 3260, Gluconobacter cereus NBRC 3267, Gluconobacter dioxyacetonicus NBRC 3273, Gluconobacter model Nonoxygluconicus NBRC 3276, Gluconobacter gluconicus NBRC 3285, Gluconobacter roseus NBRC 3990, Gluconobacter fragilii NBRC 3265, Acetobacter aceti NBRC 3259 and the like can be more preferably exemplified. Gluconobacter oxydans NBRC 3172 strain can be more preferably exemplified because of its excellent ability to produce keto-D-gluconic acid. Moreover, as long as it has 5-keto-D-gluconic acid production ability, the strain which belongs to the gluconobacter genus or the acetobacter genus newly isolate | separated from nature can also be used for the microorganisms in this invention.

また、本発明における微生物の中で特に好適な微生物として、５−ケト−Ｄ−グルコン酸生産能の他に、２−ケト−Ｄ−グルコン酸低生産性又は５−ケト−Ｄ−グルコン酸低消費性をさらに有している微生物（好ましくは、グルコノバクター属又はアセトバクター属に属する微生物）を例示することができ、より好適な微生物として、５−ケト−Ｄ−グルコン酸生産能の他に、２−ケト−Ｄ−グルコン酸低生産性及び５−ケト−Ｄ−グルコン酸低消費性をさらに有している微生物（好ましくは、グルコノバクター属又はアセトバクター属に属する微生物）を例示することができる。酢酸菌等の本発明の微生物は、グルコースからグルコン酸を経て、５−ケト−Ｄ−グルコン酸だけでなく、不必要な副生成物である２−ケト−Ｄ−グルコン酸をも生産するため（図２参照）、２−ケト−Ｄ−グルコン酸低生産性を有していると、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の収率が向上する点で好ましいからである。また、酢酸菌等の本発明の微生物は、生成した５−ケト−Ｄ−グルコン酸の一部を生育のために消費するため、さらに５−ケト−Ｄ−グルコン酸低消費性を有していると、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の収率が向上する点で好ましいからである。   In addition to the ability to produce 5-keto-D-gluconic acid, among the microorganisms of the present invention, 2-keto-D-gluconic acid low productivity or 5-keto-D-gluconic acid low Examples of the microorganism further having a consumable property (preferably, a microorganism belonging to the genus Gluconobacter or Acetobacter), and more preferable microorganisms include 5-keto-D-gluconic acid production ability. Examples of microorganisms having low 2-keto-D-gluconic acid low productivity and 5-keto-D-gluconic acid low consumption (preferably microorganisms belonging to the genus Gluconobacter or Acetobacter) can do. The microorganism of the present invention such as acetic acid bacteria produces not only 5-keto-D-gluconic acid but also 2-keto-D-gluconic acid, which is an unnecessary by-product, from glucose via gluconic acid. (See FIG. 2). It is preferable that 2-keto-D-gluconic acid has low productivity because the yield of 5-keto-D-gluconic acid is improved. In addition, since the microorganism of the present invention such as acetic acid bacteria consumes part of the produced 5-keto-D-gluconic acid for growth, it further has a low consumption of 5-keto-D-gluconic acid. It is because it is preferable at the point which the yield of 5-keto-D-gluconic acid improves.

本明細書における「２−ケト−Ｄ−グルコン酸低生産性を有している微生物」とは、２−ケト−Ｄ−グルコン酸の生産性が低い（特定量のグルコースからの２−ケト−Ｄ−グルコン酸の生産量が少ない、又は、特定量のグルコースから生産される５−ケト−Ｄ−グルコン酸量に対する２−ケト−Ｄ−グルコン酸量の割合が低い）微生物を意味し、例えば該微生物が酢酸菌の場合は、グルコノバクター・オキシダンスＮＢＲＣ ３１７２株と比較して、２−ケト−Ｄ−グルコン酸の生産性が低い酢酸菌を意味する。５−ケト−Ｄ−グルコン酸の収率をより向上する観点からは、２−ケト−Ｄ−グルコン酸低生産性の中でも、２−ケト−Ｄ−グルコン酸非生産性であることが好ましい。   In the present specification, “microorganism having low 2-keto-D-gluconic acid productivity” means that 2-keto-D-gluconic acid has low productivity (2-keto-from a specific amount of glucose). D-gluconic acid is produced in a small amount, or a microorganism having a low ratio of 2-keto-D-gluconic acid to 5-keto-D-gluconic acid produced from a specific amount of glucose. When the microorganism is an acetic acid bacterium, it means an acetic acid bacterium having a lower productivity of 2-keto-D-gluconic acid than the Gluconobacter oxydans NBRC 3172 strain. From the viewpoint of further improving the yield of 5-keto-D-gluconic acid, 2-keto-D-gluconic acid non-productive is preferable among the 2-keto-D-gluconic acid low productivity.

また、本明細書における「５−ケト−Ｄ−グルコン酸低消費性を有している微生物」とは、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の消費が少ない微生物を意味し、例えば該微生物が酢酸菌の場合は、グルコノバクター・オキシダンスＮＢＲＣ ３１７２株と比較して、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の消費が少ない酢酸菌を意味する。５−ケト−Ｄ−グルコン酸の収率をより向上する観点からは、５−ケト−Ｄ−グルコン酸低消費性の中でも、５−ケト−Ｄ−グルコン酸非消費性であることが好ましい。   The term “microbe having low consumption of 5-keto-D-gluconic acid” in the present specification means a microorganism that consumes less 5-keto-D-gluconic acid. In the case of fungi, it means acetic acid bacteria that consume less 5-keto-D-gluconic acid compared to Gluconobacter oxydans NBRC 3172 strain. From the viewpoint of further improving the yield of 5-keto-D-gluconic acid, 5-keto-D-gluconic acid non-consumable is preferable among the 5-keto-D-gluconic acid low-consumption properties.

上記の２−ケト−Ｄ−グルコン酸低生産性を有している微生物や、５−ケト−Ｄ−グルコン酸低消費性を有している微生物を、本発明における微生物（グルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生産する微生物）から作製する方法としては、特に制限されないが、本発明における微生物に対して、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ´−ニトロソグアニジン（以下、略して「ＮＴＧ」と表示する。）等の化学変異剤によって変異処理を施し、２−ケト−Ｄ−グルコン酸低生産性を有している微生物や、５−ケト−Ｄ−グルコン酸低消費性を有している微生物をスクリーニングする方法を好適に例示することができ、より具体的な方法として、後述の実施例１に記載のスクリーニング方法をより好適に例示することができる。ある微生物が、２−ケト−Ｄ−グルコン酸低生産性を有しているかどうかは、例えば該微生物の培養液の上澄をsilica gel TLC（Merck社製）にスポットし、ｎ−ブタノール−酢酸−水（３：２：１）で展開して、次いで風乾した後アルカリ性テトラゾリウムブルー（和光純薬工業社製）試薬を噴霧後１００℃加熱発色させ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸と５−ケト−Ｄ−グルコン酸の生成比を目視で判定する方法等により確認することができ、５−ケト−Ｄ−グルコン酸低消費性を有しているかどうかは、該微生物の培養液の上澄をウェルプレートに取り、５−ケト−Ｄ−グルコン酸に対して特異的にローズ色に呈色する１−メチル−１−フェニルヒドラジン溶液（和光純薬工業社製、終濃度＝２％（ｗ／ｖ））を加え、９５℃で６０分間加熱し呈色反応（M. Schramm, Anal. Chem., 28, 963-965, 1956）を行い、目視で５−ケト−Ｄ−グルコン酸の消費を調べる方法等により確認することができる。   The above-mentioned microorganisms having low productivity of 2-keto-D-gluconic acid and microorganisms having low consumption of 5-keto-D-gluconic acid are referred to as microorganisms in the present invention (from glucose to 5-keto). Although it does not restrict | limit especially as a method of producing from -D-gluconic acid producing microorganisms), N-methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidine (hereinafter abbreviated as "NTG" for the microorganisms in the present invention). ) And the like, and microorganisms having a low productivity of 2-keto-D-gluconic acid or having a low consumption of 5-keto-D-gluconic acid. The screening method described in Example 1 to be described later can be more preferably illustrated as a more specific method. Whether a certain microorganism has a low productivity of 2-keto-D-gluconic acid is determined by, for example, spotting the supernatant of the culture solution of the microorganism on silica gel TLC (Merck) and n-butanol-acetic acid. Development with water (3: 2: 1), followed by air drying, spraying with an alkaline tetrazolium blue (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) reagent, followed by heating at 100 ° C. to develop 2-keto-D-gluconic acid and 5- The production ratio of keto-D-gluconic acid can be confirmed by a method such as visual judgment, and whether or not it has low consumption of 5-keto-D-gluconic acid depends on the supernatant of the culture solution of the microorganism. 1-methyl-1-phenylhydrazine solution (Wako Pure Chemical Industries, final concentration = 2% (w / V)) and heat at 95 ° C. for 60 minutes for coloration A reaction (M. Schramm, Anal. Chem., 28, 963-965, 1956) is performed, and this can be confirmed by a method of examining the consumption of 5-keto-D-gluconic acid visually.

上記の２−ケト−Ｄ−グルコン酸低生産性を有している微生物の具体例としては、グルコノバクター・オキシダンスＴＡＢＴ−２００株を好適に例示することができる。このＴＡＢＴ−２００株は、本発明者らが、ＮＢＲＣ ３１７２株をＮＴＧ処理し、２−ケト−Ｄ−グルコン酸低生産性の株をスクリーニングすることによって作製した株である（後述の実施例１参照）。なお、このＴＡＢＴ−２００株は、２−ケト−Ｄ−グルコン酸をほとんど生産しない２−ケト−Ｄ−グルコン酸非生産性株である。また、２−ケト−Ｄ−グルコン酸低生産性及び５−ケト−Ｄ−グルコン酸低消費性を両方備えた微生物としては、グルコノバクター・オキシダンスＴＡＤＫ−２６７株を特に好適に例示することができる。このＴＡＤＫ−２６７株は、本発明者らが、ＴＡＢＴ−２００株をＮＴＧ処理し、５−ケト−Ｄ−グルコン酸低消費性の株をスクリーニングすることによって作製した株である（後述の実施例１参照）。なお、このＴＡＤＫ−２６７株は、２−ケト−Ｄ−グルコン酸非生産性株でもあり、また、５−ケト−Ｄ−グルコン酸を消費しない５−ケト−Ｄ−グルコン酸非消費性株でもある。   As a specific example of the microorganism having the low productivity of 2-keto-D-gluconic acid, Gluconobacter oxydans TABT-200 strain can be preferably exemplified. This TABT-200 strain is a strain prepared by the present inventors by subjecting the NBRC 3172 strain to NTG treatment and screening a 2-keto-D-gluconic acid low-productivity strain (Example 1 described later). reference). This TABT-200 strain is a 2-keto-D-gluconic acid non-producing strain that hardly produces 2-keto-D-gluconic acid. Further, as a microorganism having both 2-keto-D-gluconic acid low productivity and 5-keto-D-gluconic acid low consumption, the Gluconobacter oxydans TADK-267 strain is particularly preferably exemplified. Can do. This TADK-267 strain is a strain prepared by the present inventors by subjecting the TABT-200 strain to NTG treatment and screening a 5-keto-D-gluconic acid low-consumption strain (Examples described later). 1). In addition, this TADK-267 strain is also a 2-keto-D-gluconic acid non-producing strain and a 5-keto-D-gluconic acid non-consuming strain that does not consume 5-keto-D-gluconic acid. is there.

上記工程Ａにおける「５−ケト−Ｄ−グルコン酸を水溶性塩とし得るアルカリ」とは、溶液中で５−ケト−Ｄ−グルコン酸と接触したときに、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩を生成するアルカリである限り特に制限されず、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどを好適に例示することができる。また、上記工程Ａにおいて使用されるアルカリの量としては、本発明における微生物が生育可能である限り特に制限されないが、培養中の培養液のｐＨを好ましくは３〜９の範囲内、より好ましくは４〜７の範囲内、さらに好ましくは５〜６の範囲内に維持するために必要な量を用いることができる。   The “alkali capable of turning 5-keto-D-gluconic acid into a water-soluble salt” in the above step A means that when 5-keto-D-gluconic acid is brought into contact with 5-keto-D-gluconic acid in solution, The alkali is not particularly limited as long as it is an alkali that forms a water-soluble salt, and examples thereof include sodium hydroxide, potassium hydroxide, and ammonia. Further, the amount of alkali used in the above step A is not particularly limited as long as the microorganism in the present invention can grow, but the pH of the culture solution during culture is preferably within the range of 3 to 9, more preferably. An amount necessary for maintaining within the range of 4 to 7, more preferably within the range of 5 to 6 can be used.

上記工程Ａにおける「グルコース含有培養液」としては、グルコースを含有しており、かつ、上記工程Ａにおける微生物が生育可能な培養液である限り特に制限されないが、該微生物が同化可能な炭素源、消化可能な窒素源、無機金属塩類、及び、生育に必要なビタミン類あるいは消泡剤を含む培養液を例示することができる。なお、カルシウムは該微生物の生育にとって必須ではないが、グルコースからの５−ケトグルコン酸生成反応にとって必須な成分であるので、５−ケトグルコン酸カルシウム塩ができるだけ生成させない範囲で、微量のカルシウムを上記のグルコース含有培養液に添加する必要がある。添加するカルシウムの濃度の上限としては、培養液中のグルコース濃度（ｗ／ｗ（％））の２０分の１以下の濃度（ｗ／ｗ（％））であることが好ましく、４０分の１以下の濃度（ｗ／ｗ（％））であることがより好ましく、また、下限としては、培養液中のグルコース濃度の（ｗ／ｗ（％））の５００分の１以上の濃度（ｗ／ｗ（％））であることが好ましく、２００分の１以上の濃度（ｗ／ｗ（％））であることがより好ましい。さらに、工程Ａにおける培養より前の前培養における培養液の炭素源としては、グルコース、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、ソルボース、ラクトース、ガラクトース、スクロース、マルトースないしはグリセリンなどを用いてもよいが、工程Ａにおける培養液の炭素源としては、グルコースを用い、その濃度は１％〜２０％の範囲内、好ましくは５％〜１６％の範囲内とすることが好ましい。また、工程Ａにおける培養液には、グルコースの他に、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、ソルボース、ラクトース、ガラクトース、スクロース、マルトースないしはグリセリンなどを補助的に、具体的には０．１％ないし２．０％の範囲で培地に加えることが、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の収率をより向上させる観点から好ましい。   The “glucose-containing culture solution” in the above step A is not particularly limited as long as it contains glucose and is a culture solution in which the microorganism in the above step A can grow, but a carbon source that can be assimilated by the microorganism, A culture solution containing a digestible nitrogen source, inorganic metal salts, and vitamins or antifoaming agents necessary for growth can be exemplified. Although calcium is not essential for the growth of the microorganism, it is an essential component for the 5-ketogluconic acid production reaction from glucose. Therefore, a trace amount of calcium is added to the extent that 5-ketogluconic acid calcium salt is not generated as much as possible. It is necessary to add it to the culture medium containing glucose. The upper limit of the concentration of calcium to be added is preferably a concentration (w / w (%)) of 1/20 or less of the glucose concentration (w / w (%)) in the culture solution, and 1/40 The following concentration (w / w (%)) is more preferable, and as the lower limit, the concentration (w / w) of 1/500 or more of the glucose concentration (w / w (%)) in the culture solution w (%)) is preferable, and a concentration (w / w (%)) of 1/20 or more is more preferable. Furthermore, as the carbon source of the culture solution in the preculture prior to the culture in Step A, glucose, fructose, mannitol, sorbitol, sorbose, lactose, galactose, sucrose, maltose or glycerin may be used. As the carbon source of the culture solution, glucose is used, and its concentration is preferably in the range of 1% to 20%, preferably in the range of 5% to 16%. In addition to glucose, the culture solution in step A supplemented with fructose, mannitol, sorbitol, sorbose, lactose, galactose, sucrose, maltose or glycerin, specifically 0.1% to 2.0. % Is preferably added to the medium from the viewpoint of further improving the yield of 5-keto-D-gluconic acid.

また、前培養及び工程Ａにおける培養液のいずれも、窒素源としては、たとえばペプトン、大豆粉、コーンスティープパウダー、コーンスティープリカー、肉エキス、酵母エキス、アミノ酸類などの有機窒素源あるいは硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機窒素源をそれぞれ単独もしくは混合物として用いることができるが、工業的には、コーンスティープパウダー、コーンスティープリカーなどが安価であるため好ましい。無機金属塩として、例えばカルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、コバルト、及び鉄などの硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩若しくは燐酸塩を用いることが好ましい。また、必要に応じて少量の動物油、植物油、鉱油などを培養液に用いることが、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の収率をより向上させる観点から好ましい。なお、微生物が酢酸菌の場合の工程Ａにおける好ましい培養液として、より具体的には、６％グルコース、０．０９％塩化アンモニウム、０．０６％リン酸二水素カリウム、０．１８％コーンスティープパウダー（シグマ社製）、０．１％酵母エキス（ディフコ・ラボラトリー社製）、０．０１５％硫酸マグネシウム７水塩、０．００２９％硫酸マンガン５水塩、０．１２％塩化カルシウム２水塩、及び、０．１％アクトコール（武田化学工業社製）からなるＭＢ培地を特に好適に例示することができる。   In addition, as for the nitrogen source in any of the pre-culture and the culture solution in step A, for example, organic nitrogen sources such as peptone, soybean powder, corn steep powder, corn steep liquor, meat extract, yeast extract, amino acids, ammonium sulfate, ammonium nitrate Inorganic nitrogen sources such as urea can be used alone or as a mixture, but industrially preferred are corn steep powder and corn steep liquor because they are inexpensive. As the inorganic metal salt, for example, sulfates such as calcium, magnesium, zinc, manganese, cobalt, and iron, hydrochlorides, carbonates, or phosphates are preferably used. In addition, it is preferable to use a small amount of animal oil, vegetable oil, mineral oil or the like in the culture solution as necessary from the viewpoint of further improving the yield of 5-keto-D-gluconic acid. In addition, as a preferable culture solution in Step A when the microorganism is acetic acid bacteria, more specifically, 6% glucose, 0.09% ammonium chloride, 0.06% potassium dihydrogen phosphate, 0.18% corn steep Powder (manufactured by Sigma), 0.1% yeast extract (manufactured by Difco Laboratories), 0.015% magnesium sulfate heptahydrate, 0.0029% manganese sulfate pentahydrate, 0.12% calcium chloride dihydrate And MB medium composed of 0.1% Actol (manufactured by Takeda Chemical Industries) can be particularly preferably exemplified.

また、上記工程Ａにおける培養の条件としては、該工程における微生物が生育可能であり、かつ、該微生物が５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成し得る条件である限り特に制限はされないが、工程Ａではグルコン酸、５−ケト−Ｄ−グルコン酸などの強酸性有機酸が多量に生成して培養液のｐＨが著しく変化するため、酸溶液及びアルカリ溶液を培養液中に連続的に加えながら５−ケト−Ｄ−グルコン酸の生産に適したｐＨを維持することが好ましい。かかるｐＨとしては、３〜９の範囲内を好適に例示することができ、４〜７の範囲内をより好適に例示することができ、５〜６の範囲内をさらに好適に例示することができる。上記の酸溶液としては、塩酸、硫酸、硝酸などの酸水溶液を好適に例示することができ、上記のアルカリ水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどのアルカリ水溶液を好適に例示することができる。また、培養の温度条件としては、１０℃〜４０℃の範囲内の温度を好適に例示することができ、２５℃〜３５℃の範囲内の温度をより好適に例示することができる。さらに、培養の酸素条件としては、通気攪拌培養等の好気的条件が好ましく、より具体的には、１分間あたり培養液量に対する空気供給量の割合が０．２〜２．０の範囲内であることを好適に例示することができ、０．５〜１．５の範囲内であることをより好適に例示することができる。これらの好適な培養条件に維持するために、連続的に制御可能な攪拌式醗酵槽を好適に用いることができる。本発明における微生物を好適な培養条件で工程Ａにおける培養を行なえば、通常１日〜７日間、好ましくは１日〜４日間で工程Ａの培養は終了し、７０％〜９５％のモル収率で５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成することが可能となる。   In addition, the culture conditions in the step A are not particularly limited as long as the microorganisms in the step can grow and the microorganisms can produce 5-keto-D-gluconic acid. In A, strong acid organic acids such as gluconic acid and 5-keto-D-gluconic acid are produced in large quantities and the pH of the culture solution changes remarkably. Therefore, the acid solution and the alkaline solution are continuously added to the culture solution. It is preferable to maintain a pH suitable for the production of 5-keto-D-gluconic acid. As such pH, the range of 3-9 can be illustrated preferably, the range of 4-7 can be illustrated more suitably, and the range of 5-6 can be illustrated more suitably. it can. Examples of the acid solution include acid aqueous solutions such as hydrochloric acid, sulfuric acid, and nitric acid. Examples of the alkali aqueous solution preferably include aqueous alkali solutions such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, and ammonia. be able to. Moreover, as temperature conditions of culture | cultivation, the temperature within the range of 10 to 40 degreeC can be illustrated suitably, The temperature within the range of 25 to 35 degreeC can be illustrated more suitably. Further, as the oxygen condition for the culture, aerobic conditions such as aeration and agitation culture are preferable, and more specifically, the ratio of the air supply amount to the culture solution amount per minute is in the range of 0.2 to 2.0. It can be preferably exemplified, and it can be more suitably exemplified that it is in the range of 0.5 to 1.5. In order to maintain these suitable culture conditions, a continuously controllable stirred fermenter can be suitably used. When the microorganism in the present invention is cultured in the step A under suitable culture conditions, the culture in the step A is usually completed in 1 to 7 days, preferably 1 to 4 days, and a molar yield of 70% to 95%. In this way, 5-keto-D-gluconic acid can be produced.

工程Ａにおける培養を行なうと、培養液中に５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩が生産される。   When the culture in Step A is performed, a water-soluble salt of 5-keto-D-gluconic acid is produced in the culture solution.

上記工程Ｂにおいて、工程Ａで得られた５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩を含む培養液のｐＨを７〜１２の範囲内に調整及び維持する方法としては、特に制限されないが、工程Ａにおける培養を行なった培養槽（好ましくは、連続的に制御可能な攪拌式醗酵槽）中に、塩酸、硫酸、硝酸などの酸水溶液や、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどのアルカリ水溶液を、工程Ａで得られた培養液に添加する方法を好適に例示することができる。また、上記工程Ｂにおいて調整及び維持するｐＨとしては、Ｌ−酒石酸等への優れた変換効率を得る観点から、８〜１１の範囲内であることが好ましく、９〜１０の範囲内であることがさらに好ましい。また、ｐＨを調整及び維持する際には、Ｌ−酒石酸等の収率を向上させる観点から、温度も調整及び維持することが好ましく、かかる温度として、０℃〜７０℃の範囲内の温度を好適に例示することができ、２０℃〜６０℃の範囲内の温度をより好適に例示することができる。さらに、ｐＨを維持する際には、培養液を通気攪拌することが好ましく、その空気供給量としては、１分間あたり培養液量に対する空気供給量の割合が０．２〜５の範囲内であることを好適に例示することができ、０．５〜３の範囲内であることをより好適に例示することができる。好適な条件で工程Ｂにおける反応を行なえば、通常１日〜１４日間、好ましくは１日〜１０日間で反応は終了し、グルコースに対して１０〜３０％（好ましくは２０〜３０％）のモル収率で、Ｌ−酒石酸及びグリコール酸をそれぞれ得ることが可能となる。   In the above step B, the method for adjusting and maintaining the pH of the culture solution containing the water-soluble salt of 5-keto-D-gluconic acid obtained in step A within the range of 7 to 12 is not particularly limited. In the culture tank in which the culture in step A was performed (preferably, a continuously controllable stirring fermenter), an acid aqueous solution such as hydrochloric acid, sulfuric acid or nitric acid, or an alkali such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia A method of adding the aqueous solution to the culture medium obtained in step A can be suitably exemplified. Moreover, as pH adjusted and maintained in the said process B, it is preferable to exist in the range of 8-11 from a viewpoint of obtaining the conversion efficiency outstanding to L-tartaric acid etc., and it is in the range of 9-10. Is more preferable. Moreover, when adjusting and maintaining pH, it is preferable to also adjust and maintain temperature from a viewpoint of improving the yield of L-tartaric acid, etc., and as this temperature, the temperature within the range of 0 degreeC-70 degreeC is used. It can illustrate suitably, The temperature within the range of 20 to 60 degreeC can be illustrated more suitably. Furthermore, when maintaining the pH, it is preferable to aeration and agitate the culture solution, and the air supply amount is within the range of 0.2 to 5 in the ratio of the air supply amount to the culture solution amount per minute. This can be suitably exemplified, and it can be more suitably exemplified that it is in the range of 0.5 to 3. If the reaction in Step B is carried out under suitable conditions, the reaction is usually completed in 1 to 14 days, preferably 1 to 10 days, and a mole of 10 to 30% (preferably 20 to 30%) with respect to glucose. L-tartaric acid and glycolic acid can be obtained in a yield.

また、工程ＢでｐＨを調整又は維持する際には、培養液（反応液）にパラジウム、ロジウム、ルテニウム、白金、マンガン、銅、コバルト、ニッケル、亜鉛、バナジウムおよび鉄からなる群から選択される１種又は２種以上（好ましくは２種以上）の遷移金属触媒を添加することが、Ｌ−酒石酸等へのより優れた変換効率が得る観点から特に好ましい。前述の群から２種の遷移金属元素を選択して用いる場合の特に好ましい組み合わせとしては、パラジウムとバナジウムの組み合わせを例示することができ、中でもパラジウム炭素とバナジン酸塩の組み合わせをより好適に例示することができる。遷移金属触媒の添加量としては、培養液（反応液）に対して、０．００００２％（ｗ／ｖ）〜２％（ｗ／ｖ）の範囲内であることが好ましく、０．０００１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）の範囲内であることがより好ましい。遷移金属触媒を適量用いると、工程ＢにおけるＬ−酒石酸等への反応速度が速まるので、通常１日〜７日間、好ましくは１日〜４日間で反応（ｐＨの維持）を終了し、グルコースに対して４０〜７０％（好ましくは５０〜７０％、より好ましくは６０〜７０％）のモル収率で、Ｌ−酒石酸及びグリコール酸をそれぞれ得ることが可能となる。   Further, when adjusting or maintaining the pH in Step B, the culture solution (reaction solution) is selected from the group consisting of palladium, rhodium, ruthenium, platinum, manganese, copper, cobalt, nickel, zinc, vanadium and iron. It is particularly preferable to add one or more (preferably two or more) transition metal catalysts from the viewpoint of obtaining better conversion efficiency to L-tartaric acid or the like. As a particularly preferable combination in the case of selecting and using two kinds of transition metal elements from the aforementioned group, a combination of palladium and vanadium can be exemplified, and among them, a combination of palladium carbon and vanadate is more preferably exemplified. be able to. The addition amount of the transition metal catalyst is preferably within the range of 0.00002% (w / v) to 2% (w / v) with respect to the culture solution (reaction solution), and 0.0001% ( More preferably, it is in the range of w / v) to 1% (w / v). When an appropriate amount of a transition metal catalyst is used, the reaction rate to L-tartaric acid and the like in step B is increased, so the reaction (maintenance of pH) is usually completed in 1 to 7 days, preferably 1 to 4 days, and glucose is converted. On the other hand, L-tartaric acid and glycolic acid can be obtained in a molar yield of 40 to 70% (preferably 50 to 70%, more preferably 60 to 70%), respectively.

また、上記の遷移金属触媒は、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩などの水溶性金属塩でもよいが、例えば、酸化パラジウム、ロジウム酸化物、ルテニウム酸化物、白金酸化物、マンガン酸化物、銅酸化物、コバルト酸化物、ニッケル酸化物、亜鉛酸化物、バナジウム酸化物、鉄酸化物等の遷移金属酸化物；や、パラジウム炭素、ロジウム炭素、ルテニウム炭素、白金炭素、ニッケル炭素、パラジウムアルミナ、ロジウムアルミナ、ルテニウムアルミナ、白金アルミナ等の、遷移金属触媒を１種又は２種以上、水不溶性担体（炭素やアルミナ等）に吸着させた化合物；などの水不溶性金属化合物を用いると、遷移金属触媒を反応終了後の反応液を遠心分離することによって容易に回収することができ、回収したものを更に繰返し使用することにより、Ｌ−酒石酸等を非常に効率良く、かつ、低コストで製造することができるため、好ましい。上記の遷移金属触媒を水不溶性担体に吸着させる量としては、遷移金属触媒を水不溶性担体に０．１重量％〜３０重量％の含有率となるように吸着させることが好ましく、１重量％〜１５重量％の含有率となるように吸着させることがより好ましい。   The transition metal catalyst may be a water-soluble metal salt such as hydrochloride, sulfate, nitrate, acetate, etc., for example, palladium oxide, rhodium oxide, ruthenium oxide, platinum oxide, manganese oxide, Transition metal oxides such as copper oxide, cobalt oxide, nickel oxide, zinc oxide, vanadium oxide, iron oxide; and palladium carbon, rhodium carbon, ruthenium carbon, platinum carbon, nickel carbon, palladium alumina, When a water-insoluble metal compound such as rhodium alumina, ruthenium alumina, platinum alumina or the like, a compound in which one or more transition metal catalysts are adsorbed on a water-insoluble carrier (carbon, alumina, etc.); Can be easily recovered by centrifuging the reaction solution after completion of the reaction. Ri, very efficiently L- tartaric acid, and, because it can be manufactured at low cost, which is preferable. The amount of the transition metal catalyst adsorbed on the water-insoluble carrier is preferably such that the transition metal catalyst is adsorbed on the water-insoluble carrier so that the content is 0.1 wt% to 30 wt%. It is more preferable to adsorb so that it may become 15 weight% of content rate.

工程Ｂにおいて、工程Ａで得られた５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩を含む培養液のｐＨを７〜１２の範囲内に調整及び維持すると、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩がＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩に変換した反応液を得ることができる。なお、反応液中には、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩が残存していてもよい。   In step B, when the pH of the culture solution containing the water-soluble salt of 5-keto-D-gluconic acid obtained in step A is adjusted and maintained within the range of 7 to 12, A reaction solution in which the water-soluble salt is converted to L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof can be obtained. In the reaction solution, a water-soluble salt of 5-keto-D-gluconic acid may remain.

上記工程Ｃにおいて、工程Ｂで得られた反応液から、Ｌ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩を採取する方法としては、特に制限されず、例えばＬ−酒石酸又はその塩を採取する場合は、酒石酸1カリウムが水に対して難溶性質であることを利用する方法などの公知の精製方法を用いることによってＬ−酒石酸等を容易に単離精製することができる。例えば、工程Ｂで得られた反応液から、不溶性成分（工程Ａで用いた微生物の菌体残渣や、工程Ｂで、遷移金属触媒を水不溶性担体に吸着させた化合物を用いた場合はその化合物）を遠心分離により除去し、その遠心上澄に塩酸等の無機酸を添加してｐＨを下げて（好ましくは３．５〜４．０の範囲内に下げて）、Ｌ−酒石酸を１カリウム塩（酒石酸１カリウム）として沈殿させることができる。この沈殿物を含む溶液を遠心分離し、沈殿物を得ることができる。その沈殿物を少量の水に再度懸濁し、水酸化カリウム溶液（例えば５Ｍ水酸化カリウム溶液）を添加しながら溶解させた後、微量の微粉末触媒を取り除くために再度、遠心分離をすることができる。得られた遠心上澄に塩酸等の無機酸を添加して再びｐＨを下げて、低温（例えば５℃）条件下で一晩放置すると、酒石酸１カリウムの再結晶化を行うことができる。得られた酒石酸１カリウムの結晶を遠心分離により収集し、真空減圧下、一晩乾燥すると、高純度の酒石酸１カリウムを得ることができる。   In the above step C, the method for collecting L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof from the reaction solution obtained in step B is not particularly limited, and for example, L-tartaric acid or a salt thereof. In the case of collecting lactic acid, L-tartaric acid and the like can be easily isolated and purified by using a known purification method such as a method utilizing the fact that monopotassium tartrate is hardly soluble in water. For example, in the case where an insoluble component (a microbial cell residue used in Step A or a compound in which a transition metal catalyst is adsorbed on a water-insoluble carrier in Step B is used from the reaction solution obtained in Step B, the compound is used. ) By centrifugation, and an inorganic acid such as hydrochloric acid is added to the centrifugal supernatant to lower the pH (preferably within a range of 3.5 to 4.0), and L-tartaric acid is added to 1 potassium. It can be precipitated as a salt (monopotassium tartrate). The solution containing this precipitate can be centrifuged to obtain a precipitate. The precipitate is resuspended in a small amount of water, dissolved while adding potassium hydroxide solution (for example, 5M potassium hydroxide solution), and then centrifuged again to remove a trace amount of finely divided catalyst. it can. When an inorganic acid such as hydrochloric acid is added to the obtained centrifugal supernatant to lower the pH again and the mixture is allowed to stand overnight at a low temperature (for example, 5 ° C.), 1 potassium tartrate can be recrystallized. The obtained crystals of monopotassium tartrate can be collected by centrifugation and dried overnight under vacuum under reduced pressure to obtain highly pure monopotassium tartrate.

また、グリコール酸又はその塩を採取する方法としては、例えば、陰イオン交換樹脂を用いるイオン交換法あるいは電気透析法などの公知の精製方法を用いることができる。例えば、工程Ｂで得られた反応液、又は、その反応液からＬ−酒石酸を採取した後の反応液のｐＨを、水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液で７．０以上に調整し、調製後のその溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂（例えば蟻酸型）カラムに通して、ナトリウムイオン等の陽イオンを除去後、グリコール酸、蟻酸を含む非吸着画分をアンモニア水（例えば２Ｍアンモニア水）で中和することができる。次いで、その溶液について３５℃で減圧濃縮を行い、蟻酸アンモニウムを除去し、さらに真空減圧下、一晩乾燥すると、高純度のグリコール酸アンモニウムを得ることができる。   As a method for collecting glycolic acid or a salt thereof, for example, a known purification method such as an ion exchange method using an anion exchange resin or an electrodialysis method can be used. For example, the pH of the reaction solution obtained in Step B or the reaction solution after collecting L-tartaric acid from the reaction solution is adjusted to 7.0 or higher with an alkali solution such as sodium hydroxide, The solution is passed through a strongly basic anion exchange resin (eg, formic acid type) column to remove cations such as sodium ions, and the non-adsorbed fraction containing glycolic acid and formic acid is then added with aqueous ammonia (eg, 2M aqueous ammonia). Can be neutralized. Then, the solution is concentrated under reduced pressure at 35 ° C. to remove ammonium formate, and further dried overnight under vacuum under reduced pressure to obtain high purity ammonium glycolate.

なお、各工程における生成物が目的生成物（工程Ａの５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩； 工程ＢのＬ−酒石酸等； 工程ＣのＬ−酒石酸等）であるかどうかや、工程Ａにおける中間生成物（グルコン酸）であるかどうか等は、Herrmannらが報告した高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」と略す。）法（Herrmann, U., Merfort, M., Jeude, M., Bringer-Meyer, S., and Sahm, H., Appl. Microbiol. Biotechnol., 64, 86-90, 2004）を用いることもできるが、その方法を改良した方法により定量することが好ましい。この好ましい方法として具体的には以下の方法を挙げることができる。   In addition, whether the product in each step is a target product (water-soluble salt of 5-keto-D-gluconic acid in step A; L-tartaric acid in step B, etc .; L-tartaric acid in step C, etc.) Whether or not it is an intermediate product (gluconic acid) in Step A is determined by the high performance liquid chromatography (hereinafter abbreviated as “HPLC”) method reported by Herrmann et al. (Herrmann, U., Merfort, M., Jeude, M Bringer-Meyer, S., and Sahm, H., Appl. Microbiol. Biotechnol., 64, 86-90, 2004) can be used, but it is preferable to quantify the method by an improved method. Specific examples of the preferable method include the following methods.

本方法では、ＤＥ−６１３カラム（ショウデックス社製）を用い、移動相溶媒として過塩素酸溶液を流し、ＵＶ＝２１０ｎｍの紫外線検出器で検出し、記録計で記録することができる。グルコン酸、５−ケト−Ｄ−グルコン酸及び酒石酸を定量する場合は、１本のＤＥ−６１３カラムを用い、１０ｍＭ過塩素酸溶液を１分間あたり０．５ｍＬの流速で流してＨＰＬＣ分析を行うと、グルコン酸、５−ケト−Ｄ−グルコン酸及び酒石酸はそれぞれ６．２８分，７．３５分，９．００分の保持時間を示す。グリコール酸を定量する場合は、２本のＤＥ−６１３カラムを直列に接続して、２０ｍＭ過塩素酸溶液を１分間あたり０．７ｍＬの流速で流しＨＰＬＣ分析を行うと、グリコール酸は１１．７分の保持時間を示す。反応液中のグルコン酸、５−ケト−Ｄ−グルコン酸、酒石酸及びグリコール酸の濃度は、それぞれの物質のピーク面積を既知濃度のそれぞれの物質のピーク面積と比較することにより、それぞれの濃度を算出し、定量することができる。またグルコースはグルコーステストワコー（和光純薬工業社製）を用いて定量することができる。酒石酸の絶対配位及び純度検定は、Ｄ−酒石酸およびｍｅｓｏ−酒石酸には活性を示さず、Ｌ−酒石酸のみに活性を示すＤ−リンゴ酸脱水素酵素を用いたＬ−酒石酸の酵素学的検定法（T. Tsukatani, K. Matsumoto, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 1730-1735, 1999）により行うことができる。   In this method, a DE-613 column (manufactured by Shodex Co., Ltd.) is used, a perchloric acid solution is allowed to flow as a mobile phase solvent, detection is performed with a UV detector of UV = 210 nm, and recording can be performed with a recorder. When quantifying gluconic acid, 5-keto-D-gluconic acid and tartaric acid, HPLC analysis is performed using a single DE-613 column with a 10 mM perchloric acid solution flowing at a flow rate of 0.5 mL per minute. And gluconic acid, 5-keto-D-gluconic acid, and tartaric acid show the retention time of 6.28 minutes, 7.35 minutes, and 9.00 minutes, respectively. When quantifying glycolic acid, two DE-613 columns are connected in series, and 20 mM perchloric acid solution is allowed to flow at a flow rate of 0.7 mL per minute, and HPLC analysis is performed. Indicates the retention time in minutes. The concentration of gluconic acid, 5-keto-D-gluconic acid, tartaric acid and glycolic acid in the reaction solution is determined by comparing the peak area of each substance with the peak area of each substance having a known concentration. Can be calculated and quantified. Glucose can be quantified using Glucose Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The absolute coordination and purity assay of tartaric acid is an enzymatic assay for L-tartaric acid using D-malate dehydrogenase which is not active on D-tartaric acid and meso-tartaric acid but only on L-tartaric acid. (T. Tsukatani, K. Matsumoto, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 1730-1735, 1999).

なお、工程ＣにおけるＬ−酒石酸の塩の種類は、工程Ａや工程Ｂにおいて用いたアルカリの種類等に依存するため、特に制限されないが、例えば、工程Ａや工程Ｂにおいてアルカリとして水酸化カリウムを用いた場合は、工程ＣにおいてＬ−酒石酸の１カリウム塩が得られる。その他、工程ＣにおけるＬ−酒石酸の塩としては、Ｌ−酒石酸２カリウム塩、Ｌ−酒石酸ナトリウム塩、Ｌ−酒石酸ナトリウムカリウム塩、Ｌ−酒石酸アンモニウム塩を例示することができる。また、工程Ｃにおけるグリコール酸の塩の種類も、工程Ａや工程Ｂにおいて用いたアルカリの種類や、工程Ｃにおいて用いた酸の種類等に依存するため、特に制限されないが、工程Ｃにおいて塩酸を用いた場合は、グリコール酸のフリーな酸が得られる。その他、工程Ｃにおけるグリコール酸の塩としては、グリコール酸カリウム塩、グリコール酸ナトリウム塩、グリコール酸アンモニウム塩を例示することができる。以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。   The type of salt of L-tartaric acid in Step C is not particularly limited because it depends on the type of alkali used in Step A or Step B. For example, potassium hydroxide is used as the alkali in Step A or Step B. If used, the monopotassium salt of L-tartaric acid is obtained in Step C. In addition, examples of the salt of L-tartaric acid in Step C include L-tartaric acid dipotassium salt, L-tartaric acid sodium salt, L-tartaric acid sodium potassium salt, and L-tartaric acid ammonium salt. In addition, the type of glycolic acid salt in Step C is not particularly limited because it depends on the type of alkali used in Step A or Step B, the type of acid used in Step C, etc., but hydrochloric acid is used in Step C. When used, a glycolic acid free acid is obtained. Other examples of the salt of glycolic acid in Step C include potassium glycolate, sodium glycolate, and ammonium glycolate. EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited to the following.

［２-ケト−Ｄ−グルコン酸非生産菌および５−ケト−Ｄ−グルコン酸非消費変異株の取得］
グルコノバクター・オキシダンスＮＢＲＣ ３１７２株由来の２−ケト−Ｄ−グルコン酸非生産菌株を作製するために、ＮＢＲＣ ３１７２株についてＮＴＧ変異処理を行い、２−ケト−Ｄ−グルコン酸非生産菌のスクリーニングを試みた。具体的には、以下のような方法で行なった。[Acquisition of 2-keto-D-gluconic acid non-producing bacteria and 5-keto-D-gluconic acid non-consuming mutant strains]
In order to produce a 2-keto-D-gluconic acid non-producing strain derived from Gluconobacter oxydans NBRC 3172 strain, NBRC 3172 strain was subjected to NTG mutation treatment, and 2-keto-D-gluconic acid non-producing strain of Attempted screening. Specifically, the following method was used.

ＭＡ寒天培地［２．５％マンニトール、０．５％酵母エキス（ディフコ・ラボラトリー社製）、０．２％ペプトン（ディフコ・ラボラトリー社製）、１．５％寒天（ｐＨ無調整）］で生育したグルコノバクター・オキシダンスＮＢＲＣ ３１７２株を、１２１℃で２０分間、オートクレーブ殺菌した３０ｍＬのＭＡ培地入り３００ｍＬ容三角フラスコに１白金耳植菌した後、３０℃、１分間あたり２２０回転で１９時間振とう培養し、その培養液から遠心分離により無菌的に細胞を取得した。得られた細胞を０．８５％滅菌生理食塩水で１回洗浄した後、滅菌生理食塩水に懸濁した。滅菌した試験管に、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、終濃度＝５０ｍＭ）及び洗浄細胞懸濁液を順次分注した後、終濃度でそれぞれ０，５０，１００，２００，３００μｇ／ｍＬになるように２，０００μｇ／ｍＬ濃度のＮＴＧ溶液を加えて５ｍＬとした。これらの試験管を、３０℃、毎分２５０回転で３０分間往復振とうすることで変異処理を行なった。試験管中の反応液を滅菌生理食塩水で２回洗浄した後、再懸濁した。その懸濁液を段階的に１０７倍まで希釈し、それぞれの希釈液をＭＡ寒天培地に塗布し、３０℃の恒温機で３〜５日間、培養した。生育してきたコロニーから無作為に２，６００コロニーを同寒天培地に拾い、３０℃で１〜２日培養した菌体を用いてスクリーニングを行った。１００μＬの２％グルコン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝６．０）を分注した９６穴プレートに１白金耳の菌体を懸濁し、室温で１日振とうして休止菌体反応を行った。その反応上澄１μＬをsilica gel TLC（Merck社製）にスポットし、ｎ−ブタノール−酢酸−水（３：２：１）で展開して、次いで風乾した後アルカリ性テトラゾリウムブルー（和光純薬工業社製）試薬を噴霧後１００℃加熱発色させ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸と５−ケト−Ｄ−グルコン酸の生成比を目視で判定した。   Grows on MA agar medium [2.5% mannitol, 0.5% yeast extract (Difco Laboratories), 0.2% peptone (Difco Laboratories), 1.5% agar (pH unadjusted)] The gluconobacter oxydans NBRC 3172 strain was inoculated in a 300 mL Erlenmeyer flask containing 30 mL of MA medium that had been autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. After shaking culture, cells were aseptically obtained from the culture by centrifugation. The obtained cells were washed once with 0.85% sterilized physiological saline and then suspended in sterilized physiological saline. Tris-HCl buffer (pH = 8.0, final concentration = 50 mM) and washed cell suspension were sequentially dispensed into a sterilized test tube, and the final concentrations were 0, 50, 100, 200, and 300 μg / mL, respectively. The NTG solution at a concentration of 2,000 μg / mL was added to make 5 mL. These test tubes were subjected to mutation treatment by reciprocally shaking at 30 ° C. and 250 rpm for 30 minutes. The reaction solution in the test tube was washed twice with sterile physiological saline and then resuspended. The suspension was diluted stepwise to 107 times, and each diluted solution was applied to a MA agar medium and cultured in a thermostat at 30 ° C. for 3 to 5 days. Screening was performed using 2,600 colonies randomly picked from the grown colonies on the same agar medium and cultured at 30 ° C. for 1-2 days. One platinum loop cell is suspended in a 96-well plate dispensed with 50 mM potassium phosphate buffer (pH = 6.0) containing 100 μL of 2% sodium gluconate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at room temperature. The resting cell reaction was performed by shaking for 1 day. 1 μL of the reaction supernatant was spotted on silica gel TLC (Merck), developed with n-butanol-acetic acid-water (3: 2: 1), then air-dried and then alkali tetrazolium blue (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (Product made) After spraying the reagent, it was heated and colored at 100 ° C., and the production ratio of 2-keto-D-gluconic acid and 5-keto-D-gluconic acid was visually determined.

その結果、親株のグルコノバクター・オキシダンスＮＢＲＣ ３１７２株が２−ケト−Ｄ−グルコン酸と５−ケト−Ｄ−グルコン酸をほぼ１：１の割合で生成するのに対して、おもに５−ケト−Ｄ−グルコン酸のみを生成し、２−ケト−Ｄ−グルコン酸をほとんど生成しない株（２−ケト−Ｄ−グルコン酸非生産性株）を７株得た。   As a result, the parent strain Gluconobacter oxydans NBRC 3172 strain produced 2-keto-D-gluconic acid and 5-keto-D-gluconic acid at a ratio of approximately 1: 1, whereas 5- Seven strains that produced only keto-D-gluconic acid and hardly produced 2-keto-D-gluconic acid (non-producing 2-keto-D-gluconic acid strain) were obtained.

さらに、得られた７株の２−ケト−Ｄ−グルコン酸非生産株の中の１株であるグルコノバクター・オキシダンスＴＡＢＴ−２００株について、上述と同様の方法でＮＴＧ変異処理を行ない、５−ケト−Ｄ−グルコン酸非消費変異株のスクリーニングを試みた。ＮＴＧ処理後に得られた１，６００コロニーを寒天培地に拾い、３０℃で生育した菌体を用いた。７５μＬの０．３％５−ケト−Ｄ−グルコン酸を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝６．０）を分注した９６穴プレートに、１白金耳の菌体を懸濁し、同様に菌体反応を行った。反応後、上澄１５μＬを平底の９６穴プレートに取り、５−ケト−Ｄ−グルコン酸に対して特異的にローズ色に呈色する１−メチル−１−フェニルヒドラジン溶液（和光純薬工業社製、終濃度＝２％（ｗ／ｖ））を加え、９５℃で６０分間加熱し呈色反応（M. Schramm, Anal. Chem., 28, 963-965, 1956）を行い、目視で５−ケト−Ｄ−グルコン酸の消費を調べた。その結果、２−ケト−Ｄ−グルコン酸非生産性であることに加えて、５−ケト−Ｄ−グルコン酸をまったく消費しなくなった変異株を３株得た。これらの変異株は、２−ケト−Ｄ−グルコン酸非生産性であり、かつ、５−ケト−Ｄ−グルコン酸非消費性であるため、グルコースからの５−ケト−Ｄ−グルコン酸生産性が向上していると考えられた。得られた３株の中の１株であるグルコノバクター・オキシダンスＴＡＤＫ−２６７株を以降の実験に使用した。   Furthermore, for the Gluconobacter oxydans TABT-200 strain that is one of the 7 non-keto-D-gluconic acid non-producing strains obtained, NTG mutation treatment was performed in the same manner as described above. An attempt was made to screen for 5-keto-D-gluconic acid non-consuming mutants. 1,600 colonies obtained after NTG treatment were picked up on an agar medium, and cells grown at 30 ° C. were used. 1 platinum ear cell was suspended in a 96-well plate into which 75 μL of 0.3% 5-keto-D-gluconic acid-containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH = 6.0) was dispensed. Bacterial cell reaction was performed. After the reaction, 15 μL of the supernatant is placed in a flat-bottomed 96-well plate, and a 1-methyl-1-phenylhydrazine solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) that specifically shows a rose color with respect to 5-keto-D-gluconic acid. Manufactured, final concentration = 2% (w / v)) and heated at 95 ° C. for 60 minutes to perform a color reaction (M. Schramm, Anal. Chem., 28, 963-965, 1956). -The consumption of keto-D-gluconic acid was investigated. As a result, in addition to being non-productive of 2-keto-D-gluconic acid, three mutant strains that no longer consumed 5-keto-D-gluconic acid were obtained. These mutants are non-productive of 2-keto-D-gluconic acid and non-consumable of 5-keto-D-gluconic acid, so that 5-keto-D-gluconic acid is produced from glucose. Was thought to have improved. Gluconobacter oxydans TADK-267 strain, which is one of the three obtained strains, was used in the subsequent experiments.

［グルコースから酒石酸及びグリコール酸の製造（遷移金属触媒無添加）］
上記実施例１で得られたグルコノバクター・オキシダンスＴＡＤＫ−２６７を、１２１℃、２０分間加熱殺菌した５ｍＬのＭＢ培地［２．５％マンニトール、０．５％酵母エキス（ディフコ・ラボラトリー社製）、０．３％ペプトン（ディフコ・ラボラトリー社製）］入り試験管３本に植菌し、２８℃、２５０回転で１７時間往復振とう培養した。これら３本の試験管中の培養液を合わせて種培養液とした。本培養は、１Ｌの醗酵槽（エイブル株式会社製）に、６％グルコース、０．０９％塩化アンモニウム、０．０６％リン酸二水素カリウム、０．１８％コーンスティープパウダー（シグマ社製）、０．１％酵母エキス（ディフコ・ラボラトリー社製）、０．０１５％硫酸マグネシウム７水塩、０．００２９％硫酸マンガン５水塩、０．１２％塩化カルシウム２水塩、及び、０．１％アクトコール（武田化学工業社製）からなる培地５００ｍＬを入れ、同様に加熱殺菌したところへ、前述の種培養液１０ｍＬを接種して開始した。６Ｍ水酸化カリウム溶液でｐＨ５．５以上に調整しながら、３０℃、１ｖｖｍ、８００回転で通気攪拌培養を行ない、培養液を１Ｍ塩酸溶液で５１倍希釈後、遠心上清のＨＰＬＣ分析を行って生成物を経時的に定量した。培養開始後５０時間目に培養液中のグルコースは完全に消費され、培養液中には、２．２ｇ／Ｌのグルコン酸が残るものの、７０．５ｇ／Ｌの５−ケト−Ｄ−グルコン酸が生成した。この培養液に６Ｍ水酸化カリウム溶液を添加して培養液のｐＨを９．６に上げた後、そのままその水酸化カリウム溶液を添加して培養液のｐＨを９．６以上に維持しつつ、１４４時間目まで通気攪拌を継続したところ、１２．１ｇ／Ｌの酒石酸及び６．０ｇ／Ｌのグリコール酸が生成した。蒸発及び水酸化カリウム溶液添加による液量変化、並びに、途中サンプリングによる液量減少分を考慮して計算すると、グルコースからの酒石酸のモル収率は２３．０％であり、グルコースからのグリコール酸のモル収率は２２．５％であった。[Production of tartaric acid and glycolic acid from glucose (no transition metal catalyst added)]
Gluconobacter oxydans TADK-267 obtained in Example 1 above was sterilized by heating at 121 ° C. for 20 minutes, 5 mL of MB medium [2.5% mannitol, 0.5% yeast extract (Difco Laboratories, Inc.) ), 0.3% peptone (manufactured by Difco Laboratories)] was inoculated into 3 test tubes and cultured with reciprocal shaking for 17 hours at 28 ° C. and 250 rpm. The culture media in these three test tubes were combined to make a seed culture solution. In the main culture, 1% fermenter (manufactured by Able Co., Ltd.), 6% glucose, 0.09% ammonium chloride, 0.06% potassium dihydrogen phosphate, 0.18% corn steep powder (manufactured by Sigma), 0.1% yeast extract (Difco Laboratories), 0.015% magnesium sulfate heptahydrate, 0.0029% manganese sulfate pentahydrate, 0.12% calcium chloride dihydrate, and 0.1% 500 mL of a medium consisting of Actol (manufactured by Takeda Chemical Industry Co., Ltd.) was added, and the mixture was sterilized by heating in the same manner. While adjusting the pH to 5.5 or more with 6M potassium hydroxide solution, culture with aeration and stirring at 30 ° C, 1vvm, 800 rpm, dilute the culture solution 51 times with 1M hydrochloric acid solution, and perform HPLC analysis of the centrifugal supernatant. The product was quantified over time. At 50 hours after the start of the culture, glucose in the culture was completely consumed, and 2.2 g / L of gluconic acid remained in the culture, but 70.5 g / L of 5-keto-D-gluconic acid. Generated. After adding a 6M potassium hydroxide solution to the culture solution to raise the pH of the culture solution to 9.6, the potassium hydroxide solution is added as it is to maintain the pH of the culture solution at 9.6 or higher. When aeration and stirring were continued until 144 hours, 12.1 g / L tartaric acid and 6.0 g / L glycolic acid were produced. When calculating in consideration of the change in liquid volume due to evaporation and addition of potassium hydroxide solution, and the decrease in liquid volume due to sampling in the middle, the molar yield of tartaric acid from glucose is 23.0%, and the glycolic acid from glucose is The molar yield was 22.5%.

［グルコースから酒石酸およびグリコール酸の製造(パラジウム炭素添加)］
上記実施例２と同様にグルコノバクター・オキシダンスＴＡＤＫ−２６７を、醗酵槽を用いて５０時間培養したところ、グルコースは完全に消費され、２．８ｇ／Ｌのグルコン酸が残るものの、６７．４ｇ／Ｌの５−ケト−Ｄ−グルコン酸が溶液中に生成した。この培養液に６Ｍ水酸化カリウム溶液を添加して培養液のｐＨを９．６に上げた後、１０ｇのパラジウム活性炭素（１０％、和光純薬工業社製）を添加し、以降は水酸化カリウム溶液を添加してｐＨ９．６以上に維持しつつ、１４４時間目まで通気攪拌を継続したところ、３１．９ｇ／Ｌの酒石酸及び１５．９ｇ／Ｌのグリコール酸を含む反応液を得た。蒸発及び水酸化カリウム溶液添加による液量変化、並びに、途中サンプリングによる液量減少分を考慮して計算すると、グルコースからの酒石酸のモル収率は６１％であり、グルコースからのグリコール酸のモル収率は６０％であった。[Production of tartaric acid and glycolic acid from glucose (addition of palladium on carbon)]
When Gluconobacter oxydans TADK-267 was cultured in a fermenter for 50 hours in the same manner as in Example 2 above, glucose was completely consumed and 2.8 g / L gluconic acid remained, but 67. 4 g / L of 5-keto-D-gluconic acid was formed in the solution. A 6M potassium hydroxide solution was added to the culture solution to raise the pH of the culture solution to 9.6, 10 g of palladium activated carbon (10%, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and thereafter hydroxylation was performed. Aeration and stirring were continued until 144 hours while adding a potassium solution to maintain the pH at 9.6 or higher. As a result, a reaction solution containing 31.9 g / L tartaric acid and 15.9 g / L glycolic acid was obtained. When calculating in consideration of the change in liquid volume due to evaporation and addition of potassium hydroxide solution, and the decrease in liquid volume due to sampling during the process, the molar yield of tartaric acid from glucose was 61%, and the molar yield of glycolic acid from glucose was The rate was 60%.

［酒石酸およびグリコール酸の採取］
上記実施例３で得られた反応液全量を醗酵槽の洗液と共に５，０００回転で遠心処理し、菌体残渣、パラジウム炭素などの不溶性画分を分離した後、約１００ｍＬの水で一度洗浄し、遠心上澄を合わせて６３５ｍＬの溶液から精製を行った。得られた溶液中には１３．１ｇの酒石酸と５．９ｇのグリコール酸が含まれていることをＨＰＬＣ分析で確認した。前述の得られたこの溶液に、濃塩酸を徐々に加えてｐＨを３．７に下げたところ、沈澱が生成したので、５℃で一晩放置してから遠心処理し沈殿と上澄とに分離した。沈殿には酒石酸が、上澄にはグリコール酸が含まれていた。[Collecting tartaric acid and glycolic acid]
The whole reaction solution obtained in Example 3 above was centrifuged at 5,000 rpm together with the washing solution of the fermenter to separate insoluble fractions such as cell residue and palladium carbon, and then washed once with about 100 mL of water. The centrifugal supernatants were combined and purified from a 635 mL solution. It was confirmed by HPLC analysis that the obtained solution contained 13.1 g of tartaric acid and 5.9 g of glycolic acid. Concentrated hydrochloric acid was gradually added to the obtained solution and the pH was lowered to 3.7. As a result, a precipitate was formed, which was allowed to stand overnight at 5 ° C. and then centrifuged to obtain a precipitate and a supernatant. separated. The precipitate contained tartaric acid and the supernatant contained glycolic acid.

沈澱は微細なパラジウム炭素を含みやや灰色であったが、ＨＰＬＣ分析で酒石酸のピークエリア値が総エリア値の９４％を占めていることを確認した。この沈殿を水に懸濁し、水酸化カリウム溶液を徐々に加えて溶解した後１Ｍ塩酸でゆっくりとｐＨを３．７まで下げて再結晶を行い、白色の粉末として酒石酸１カリウム１４．１ｇを得た。そして、採取した酒石酸について、以下に述べる酵素学的方法により検定を行った。標準物質としてＬ−酒石酸（シグマ・アルドリッチ社製）、Ｄ−酒石酸（シグマ・アルドリッチ社製）、およびｍｅｓｏ−酒石酸（シグマ・アルドリッチ社製）をそれぞれ正確に秤量して０、２．５、５、７．５ｍＭ溶液を調製した。サンプル側にセットしたミクロキュベットには、２０ｍＭ塩化マンガン、２ｍＭジチオトレイトール（和光純薬工業社製）、１５ｍＭ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋、オリエンタル酵母社製）、５ユニットのＤ−リンゴ酸脱水素酵素（ＥＣ １．１．１．８３、メガザイム社製）、６０ｍＭグリシルグリシン緩衝液（水酸化カリウムでｐＨ９．０に調整）及び上記作製した各濃度のＬ−酒石酸、Ｄ−酒石酸、又はｍｅｓｏ−酒石酸を含む混合液（総量１５０μＬ）を加え、またレファレンス側にセットしたミクロキュベットには１５０μＬの水を入れ、ＵＶ２２００分光光度計（島津製作所社製）を用いて３４０ｎｍの波長で５０分間の吸光度の増加を測定した。その結果、Ｌ−酒石酸では７．５ｍＭの濃度で３．７５の吸光度の増加を示し、０、２．５、５、７．５ｍＭ溶液のそれぞれの吸光度の増加を縦軸に、Ｌ−酒石酸の濃度を横軸にプロットしたところ、すべてのＬ−酒石酸標準溶液で原点を通る直線上にプロットされた。それに対してＤ−酒石酸ではすべての濃度で吸光度の増加はまったく認められず、また高濃度のｍｅｓｏ−酒石酸で吸光度の若干の増加が見られたが、Ｌ−酒石酸の吸光度の増加に比べると無視できる程度の増加であった。そこで採取された酒石酸は、酒石酸１カリウムであると考え、正確に秤量して５ｍＭの溶液を調整し上記と同じ方法で吸光度の増加を測定した。その結果、吸光度の増加は２．４５を示し、Ｌ−酒石酸の標準曲線から、得られた酒石酸は純度９９．７％のＬ−酒石酸であることが判明した。   The precipitate was slightly gray with fine palladium on carbon, but HPLC analysis confirmed that the peak area value of tartaric acid accounted for 94% of the total area value. This precipitate was suspended in water, dissolved by gradually adding potassium hydroxide solution, and then recrystallized by slowly lowering the pH to 3.7 with 1M hydrochloric acid to obtain 14.1 g of monopotassium tartrate as a white powder. It was. The collected tartaric acid was assayed by the enzymological method described below. As reference materials, L-tartaric acid (manufactured by Sigma-Aldrich), D-tartaric acid (manufactured by Sigma-Aldrich) and meso-tartaric acid (manufactured by Sigma-Aldrich) were weighed exactly 0, 2.5, 5 respectively. A 7.5 mM solution was prepared. The micro cuvette set on the sample side includes 20 mM manganese chloride, 2 mM dithiothreitol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 15 mM oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +, manufactured by Oriental Yeast), and 5 units of D-apple. Acid dehydrogenase (EC 1.1.1.183, manufactured by Megazyme), 60 mM glycylglycine buffer (adjusted to pH 9.0 with potassium hydroxide), and L-tartaric acid and D-tartaric acid at each concentration prepared above. , Or a mixture containing meso-tartaric acid (total amount 150 μL), and a micro cuvette set on the reference side is filled with 150 μL of water, and a UV2200 spectrophotometer (manufactured by Shimadzu Corporation) is used at a wavelength of 340 nm. The increase in absorbance per minute was measured. As a result, L-tartaric acid showed an increase in absorbance of 3.75 at a concentration of 7.5 mM. The increase in absorbance of each of the 0, 2.5, 5, and 7.5 mM solutions was plotted on the vertical axis. When the concentration was plotted on the horizontal axis, all L-tartaric acid standard solutions were plotted on a straight line passing through the origin. In contrast, D-tartaric acid showed no increase in absorbance at all concentrations, and a slight increase in absorbance was observed at high concentrations of meso-tartaric acid, but negligible compared to the increase in absorbance of L-tartaric acid. It was an increase that was possible. The tartaric acid collected there was considered to be monopotassium tartrate, and was accurately weighed to prepare a 5 mM solution, and the increase in absorbance was measured by the same method as described above. As a result, the increase in absorbance was 2.45, and it was found from the standard curve of L-tartaric acid that the obtained tartaric acid was L-tartaric acid having a purity of 99.7%.

遠心分離して得られたグリコール酸を含む上澄約６３０ｍＬを５Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した後、１，０００ｍＬのアンバーライトＣＧ４００陰イオン交換樹脂（蟻酸型、ローム・アンド・ハース社製）のカラムに通した。そのカラムを１，０００ｍＬの２０ｍＭ蟻酸ナトリウム溶液で洗浄後、２００ｍＭ蟻酸ナトリウム溶液を流し、その溶出液を１０ｍＬずつ分画した。分画した画分はＨＰＬＣ分析を行い、グリコール酸標準液と同一保持時間を示すピークを持つ分画番号５４〜２０５の溶出画分を集めた。その溶出液からナトリウムイオンなどの陽イオンを除去するため、２，０００ｍＬのダウエックス５０Ｗ×８陽イオン交換樹脂（ＯＨ−型）のカラムを通したのち、さらに５００ｍＬの脱イオン水で洗浄した。その非吸着画分および洗液を一緒に集め、２Ｍアンモニア溶液でｐＨを７．０に調整後、その中和溶液を３５℃で減圧濃縮して蟻酸アンモニウムを除去した。さらに一晩、真空減圧下で乾燥し、４．７ｇのグリコール酸アンモニウムの白色粉末を得た。その粉末の一部を水に溶解させ、ＬＣＭＳ−２０１０Ａ液体クロマトグラフ質量分析計（島津製作所社製）にディスカバリー ＨＳ Ｆ５， ２５ｃｍ×４．６ｍｍカラム（スペルコ社製）を接続し、０．１％蟻酸含有アセトニトリル／０．１％蟻酸水溶液の溶媒系で０．１％蟻酸含有アセトニトリルを０％から５０％まで直線的に増加さて１分間当たり０．３ｍＬの流速で２８分間流し、２１０ｎｍの波長での液体クロマトグラム、検出されたピークの紫外線吸収スペクトル及び陰イオンマススペクトル、マスクロマトグラム測定を行った。その結果、採取した物質中には液体クロマトグラムで１０．２分にピークが検出され、そのピークは標準品のグリコール酸の保持時間、紫外線吸収スペクトル、ｍ／ｚ＝７５．０５，１２１．０５を特徴とする陰イオンマススペクトル、及びそれらの陰イオンのマスクロマトグラムと一致した。その結果、採取した物質をグリコール酸と同定した。   About 630 mL of the supernatant containing glycolic acid obtained by centrifugation was adjusted to pH 7.0 with 5 M sodium hydroxide, and then 1,000 mL of Amberlite CG400 anion exchange resin (formic acid type, Rohm and Haas) ). The column was washed with 1,000 mL of 20 mM sodium formate solution, followed by flowing 200 mM sodium formate solution, and the eluate was fractionated by 10 mL. Fractionated fractions were subjected to HPLC analysis, and elution fractions with fraction numbers 54 to 205 having peaks showing the same retention time as the glycolic acid standard solution were collected. In order to remove cations such as sodium ions from the eluate, it was passed through a column of 2,000 mL of Dowex 50W × 8 cation exchange resin (OH-type) and further washed with 500 mL of deionized water. The non-adsorbed fraction and the washing solution were collected together and adjusted to pH 7.0 with 2M ammonia solution, and then the neutralized solution was concentrated under reduced pressure at 35 ° C. to remove ammonium formate. Further, it was dried overnight under vacuum under reduced pressure to obtain 4.7 g of a white powder of ammonium glycolate. A part of the powder was dissolved in water, and a Discovery HS F5, 25 cm × 4.6 mm column (manufactured by Spelco) was connected to an LCMS-2010A liquid chromatograph mass spectrometer (manufactured by Shimadzu Corporation), and 0.1% In a solvent system of formic acid-containing acetonitrile / 0.1% formic acid aqueous solution, 0.1% formic acid-containing acetonitrile was linearly increased from 0% to 50% and flowed at a flow rate of 0.3 mL per minute for 28 minutes at a wavelength of 210 nm. The liquid chromatogram, UV absorption spectrum and anion mass spectrum of the detected peak, and mass chromatogram measurement were performed. As a result, in the collected substance, a peak was detected at 10.2 minutes in the liquid chromatogram, and the peak was the retention time of the glycolic acid standard, ultraviolet absorption spectrum, m / z = 75.05, 121.05. The anion mass spectrum was characterized and the mass chromatogram of those anions coincided. As a result, the collected substance was identified as glycolic acid.

［パラジウム炭素の再利用］
１％の５−ケト−Ｄ−グルコン酸カリウム塩を含む５ｍＬの０．４５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５５）に４０ｍｇのパラジウム炭素を添加し、９日間振とうした。その結果４ｇ／ＬのＬ−酒石酸と１ｇ／Ｌのグリコール酸が生成し、０．７ｇ／Ｌの５−ケト−Ｄ−グルコン酸が残存した。この３．５ｍＬの反応液を遠心してパラジウム炭素を回収し、０．５Ｍの同緩衝液３．１５ｍＬと０．１０％の５−ケト−Ｄ−グルコン酸カリウム３５ｍＬを加えて７日間振とうしたところ、５ｇ／ＬのＬ−酒石酸と１．２ｇ／Ｌのグリコール酸が生成し、２．１ｇ／Ｌの５−ケト−Ｄ−グルコン酸が残存した。[Reuse of palladium carbon]
To 5 mL of 0.45 M sodium carbonate buffer (pH 9.55) containing 1% 5-keto-D-gluconic acid potassium salt, 40 mg of palladium carbon was added and shaken for 9 days. As a result, 4 g / L L-tartaric acid and 1 g / L glycolic acid were produced, and 0.7 g / L 5-keto-D-gluconic acid remained. This 3.5 mL reaction solution was centrifuged to recover palladium carbon, and 3.15 mL of the same 0.5 M buffer solution and 35 mL of 0.10% potassium 5-keto-D-gluconate were added and shaken for 7 days. However, 5 g / L L-tartaric acid and 1.2 g / L glycolic acid were produced, and 2.1 g / L 5-keto-D-gluconic acid remained.

［５−ケト−Ｄ−グルコン酸からＬ−酒石酸及びグリコール酸生成に及ぼすｐＨの影響］
１％の５−ケト−Ｄ−グルコン酸を含むｐＨ６、７、８若しくは９の４５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、又は、ｐＨ ９、１０、１１若しくは１１．５の炭酸ナトリウム緩衝液に、パラジウム炭素（１０％）添加又は無添加の条件で、酒石酸及びグリコール酸の生成を検討した。反応はシリコセンをした１０ｍＬ容試験管に１．５ｍＬの液量で行い、２日間２８℃、２５０ｒｐｍで往復振とうした後にｐＨを測定し、生成した酒石酸とグリコール酸を定量した。結果を以下の表１に示すが反応中のｐＨが維持されにくかったことから、酒石酸及びグリコール酸の生成にはｐＨ８から１１が適していると考えられた。特にｐＨ９から１０で顕著な生産が認められた。また、いずれのｐＨでも、パラジウム炭素を添加すると、酒石酸及びグリコール酸の生産性が著しく向上することが分かる。[Effect of pH on L-tartaric acid and glycolic acid production from 5-keto-D-gluconic acid]
To 450 mM potassium phosphate buffer at pH 6, 7, 8 or 9 containing 1% 5-keto-D-gluconic acid or sodium carbonate buffer at pH 9, 10, 11 or 11.5, palladium on carbon ( 10%) The production of tartaric acid and glycolic acid was examined under the condition of addition or no addition. The reaction was carried out in a 10 mL test tube containing silicosene in a volume of 1.5 mL, and after reciprocating shaking at 28 ° C. and 250 rpm for 2 days, the pH was measured, and the produced tartaric acid and glycolic acid were quantified. Although the results are shown in Table 1 below, it was difficult to maintain the pH during the reaction, and thus pH 8 to 11 was considered suitable for the production of tartaric acid and glycolic acid. In particular, remarkable production was observed at pH 9 to 10. Moreover, it turns out that productivity of tartaric acid and glycolic acid improves remarkably when palladium carbon is added in any pH.

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［５−ケト−Ｄ−グルコン酸からＬ−酒石酸およびグリコール酸生成に及ぼす温度の影響］
１％の５−ケト−Ｄ−グルコン酸を含む４５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５５）に、パラジウム炭素（１０％）添加又は無添加の条件で、３０℃、４０℃、５０℃又は６０℃での酒石酸、及び、グリコール酸の生成を検討した。反応はシリコセンをした３０ｍＬフラスコに３ｍＬの液量にて、各温度で２日間、８０回転の往復振とうして行った。得られた反応液を分析した結果を以下の表２に示すが、３０℃から６０℃、特に３０℃から４０℃で酒石酸およびグリコール酸の良好な生産が認められた。また、いずれの温度でも、パラジウム炭素を添加すると、酒石酸及びグリコール酸の生産性が著しく向上することが分かる。[Effect of temperature on L-tartaric acid and glycolic acid production from 5-keto-D-gluconic acid]
30 ° C., 40 ° C., 50 ° C. or 60 ° C. in a 450 mM sodium carbonate buffer solution (pH 9.55) containing 1% 5-keto-D-gluconic acid, with or without the addition of palladium carbon (10%). The production of tartaric acid and glycolic acid was studied. The reaction was carried out in a 30 mL flask containing silicosene in a volume of 3 mL with a reciprocal shake of 80 revolutions at each temperature for 2 days. The results of analyzing the obtained reaction solution are shown in Table 2 below, and good production of tartaric acid and glycolic acid was observed at 30 to 60 ° C., particularly 30 to 40 ° C. Moreover, it turns out that productivity of tartaric acid and glycolic acid improves remarkably when palladium carbon is added at any temperature.

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［５−ケト−Ｄ−グルコン酸からＬ−酒石酸及びグリコール酸生成に使用可能な触媒の検討］
１％の５−ケト−Ｄ−グルコン酸を含む４５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５５）に後述の表３記載の触媒を加えて酒石酸及びグリコール酸の生成を検討した。反応はシリコセンをした３０ｍＬフラスコに５ｍＬの液量にて、２４℃で２日間、往復振とうして行なった。得られた反応液を分析した結果を以下の表３に示す。検討したいずれの触媒も、酒石酸及びグリコール酸の生産性の向上に有効であったが、特に、パラジウム、ロジウム及びマンガンが優れていた。[Investigation of catalysts that can be used to produce L-tartaric acid and glycolic acid from 5-keto-D-gluconic acid]
Catalysts described in Table 3 below were added to 450 mM sodium carbonate buffer (pH 9.55) containing 1% 5-keto-D-gluconic acid to examine the production of tartaric acid and glycolic acid. The reaction was carried out by reciprocating shaking at 24 ° C. for 2 days in a 5 mL liquid volume in a 30 mL flask containing silicosene. The results of analyzing the obtained reaction solution are shown in Table 3 below. All of the catalysts studied were effective in improving the productivity of tartaric acid and glycolic acid, but palladium, rhodium and manganese were particularly excellent.

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［５−ケト−Ｄ−グルコン酸からＬ−酒石酸及びグリコール酸生成で触媒効果を示す遷移金属の検討］
１０％の５−ケト−Ｄ−グルコン酸を含む５００ｍＭ炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）に、後述の表４記載の遷移金属触媒をそれぞれ加えて酒石酸及びグリコール酸の生成を検討した。反応はウレタン栓をした２ｍＬの反応液を含む大試験管（直径２１ｍｍ ´ 長さ２００ｍｍ）を２８℃、２５０回転/分で往復振とうを行なった。１９時間目に３Ｍ炭酸カリウム溶液を０．５ｍＬ添加し、反応液のｐＨを９．５付近に維持した。反応開始から３日目の反応液を分析した結果を以下の表４に示す。検討したいずれの触媒も、酒石酸及びグリコール酸の生産性の向上に有効であった。用いた触媒の中でも、硫酸銅（II）５水和物や、バナジン酸アンモニウムが特に優れていた。[Examination of transition metals showing catalytic effects in the production of L-tartaric acid and glycolic acid from 5-keto-D-gluconic acid]
Transition metal catalysts described in Table 4 described below were added to a 500 mM potassium carbonate buffer (pH 10.0) containing 10% 5-keto-D-gluconic acid to examine the production of tartaric acid and glycolic acid. In the reaction, a large test tube (diameter 21 mm ′ length 200 mm) containing 2 mL of the reaction solution with a urethane stopper was shaken back and forth at 28 ° C. and 250 rpm. At 19 hours, 0.5 mL of 3M potassium carbonate solution was added, and the pH of the reaction solution was maintained at around 9.5. The results of analyzing the reaction solution on the third day from the start of the reaction are shown in Table 4 below. Any of the catalysts studied was effective in improving the productivity of tartaric acid and glycolic acid. Among the catalysts used, copper (II) sulfate pentahydrate and ammonium vanadate were particularly excellent.

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［銅あるいはバナジウム触媒による５−ケト−Ｄ−グルコン酸からＬ−酒石酸及びグリコール酸の生成における、それらの触媒の最適濃度の検討］
１０％の５−ケト−Ｄ−グルコン酸を含む５００ｍＭ炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）に、後述の表５記載の濃度の硫酸銅（II）６水和物あるいはバナジン酸アンモニウムを加えて酒石酸及びグリコール酸の生成を検討した。遷移金属塩なしを対照区とした。反応はウレタン栓をした５ｍＬの反応液を含む１００ｍＬフラスコを２８℃で１分間あたり２５０回転にて回転振とうを行なった。反応開始から１９時間目に３Ｍ炭酸カリウム溶液を０．５ｍＬ加え、反応液のｐＨを９．５付近に維持した。得られた反応液を分析した結果を以下の表５に示す。０．０７５ｇ／Ｌの濃度の硫酸銅（ＩＩ）６水和物で、また０．２ｇ／Ｌの濃度のバナジン酸アンモニウムで、酒石酸、グリコール酸の生成量は最大に達し、いずれの触媒も、それ以上の濃度では酒石やグリコール酸のほぼ同じ生成量であった。[Investigation of optimum concentration of L-tartaric acid and glycolic acid from 5-keto-D-gluconic acid by copper or vanadium catalyst]
To a 500 mM potassium carbonate buffer solution (pH 10.0) containing 10% 5-keto-D-gluconic acid, copper sulfate (II) hexahydrate or ammonium vanadate having a concentration shown in Table 5 described below is added, and tartaric acid is added. And the production of glycolic acid was investigated. The control group was without transition metal salt. In the reaction, a 100 mL flask containing a 5 mL reaction solution with a urethane stopper was subjected to rotary shaking at 28 ° C. and 250 rotations per minute. At 19 hours from the start of the reaction, 0.5 mL of 3M potassium carbonate solution was added, and the pH of the reaction solution was maintained around 9.5. The results of analyzing the obtained reaction solution are shown in Table 5 below. With copper (II) sulfate hexahydrate at a concentration of 0.075 g / L and ammonium vanadate at a concentration of 0.2 g / L, the production of tartaric acid and glycolic acid reached a maximum, At higher concentrations, tartar and glycolic acid were produced almost the same amount.

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［５−ケト−Ｄ−グルコン酸からＬ−酒石酸及びグリコール酸の生成でパラジウム炭素とバナジン酸の併用による触媒効果の検討］
１０％の５−ケト−Ｄ−グルコン酸を含む５００ｍＭ炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）に、後述の表６記載の濃度の１０％パラジウム炭素とバナジン酸アンモニウムを加えて酒石酸及びグリコール酸の生成を検討した。パラジウム炭素単独あるいは各濃度のバナジン酸アンモニウム単独を対照区とした。反応はウレタン栓をした５ｍＬの反応液を含む１００ｍＬフラスコを２８℃で１分間あたり２５０回転で回転振とうを行なった。反応開始から１９時間目に３Ｍ炭酸カリウム溶液を０．５ｍＬ加え、反応液のｐＨを９．５付近に維持した。３日目の反応液を分析した結果を以下の表６に示す。０．２g／Ｌの１０％パラジウム炭素と０．２、０．４あるいは０．８g／Ｌのバナジン酸アンモニウムを混合触媒として用いた反応液は、０．２g／Ｌの１０％パラジウム炭素単独あるいは０．２、０．４あるいは０．８g／Ｌのバナジン酸アンモニウム単独の反応液に比べてＬ−酒石酸、グリコール酸の生成量が著しく増加し、それらの生産性が著しく向上した。[Examination of catalytic effect by combined use of palladium carbon and vanadic acid on the formation of L-tartaric acid and glycolic acid from 5-keto-D-gluconic acid]
Generation of tartaric acid and glycolic acid by adding 10% palladium carbon and ammonium vanadate at concentrations shown in Table 6 below to 500 mM potassium carbonate buffer (pH 10.0) containing 10% 5-keto-D-gluconic acid It was investigated. Palladium carbon alone or ammonium vanadate at various concentrations was used as a control group. In the reaction, a 100 mL flask containing a 5 mL reaction solution with a urethane stopper was subjected to rotary shaking at 28 ° C. and 250 revolutions per minute. At 19 hours from the start of the reaction, 0.5 mL of 3M potassium carbonate solution was added, and the pH of the reaction solution was maintained around 9.5. The results of analyzing the reaction solution on the third day are shown in Table 6 below. A reaction solution using 0.2 g / L of 10% palladium carbon and 0.2, 0.4, or 0.8 g / L ammonium vanadate as a mixed catalyst was 0.2 g / L of 10% palladium carbon alone or Compared to the reaction solution of 0.2, 0.4 or 0.8 g / L ammonium vanadate alone, the production amounts of L-tartaric acid and glycolic acid were remarkably increased, and their productivity was remarkably improved.

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［比較例１］
［グルコースから酒石酸およびグリコール酸の製造方法（５−ケト−Ｄ−グルコン酸から１Ｍ 水酸化カリウム存在下で反応］
実施例２と同様にグルコノバクター・オキシダンスＴＡＤＫ−２６７を用いて得られた６７．３ｇ／Ｌの５−ケト−Ｄ−グルコン酸を含む培養液約４３０ｍＬに、２４ｇの水酸化カリウムを約３０ｍＬの水溶液として加え、溶液の水酸化カリウム終濃度を１Ｍとした。この時のｐＨは１３．７であった。その後通気攪拌を継続したところ５５時間目に３．１ｇ／Ｌの酒石酸及び１．５ｇ／Ｌのグリコール酸が生成し、微量の５−ケト−Ｄ−グルコン酸が残存していた。また、１４４時間目まで反応させたが酒石酸は３．６ｇ／Ｌ、グリコール酸は１．７ｇ／Ｌで、蒸発及び途中サンプリングによる減少分を考慮して計算すると、グルコースからの酒石酸のモル収率は６．６％であり、グルコースからのグリコール酸のモル収率は６．２％であった。すなわち、ｐＨが１２以上の場合は、酒石酸及びグリコール酸の収率が著しく低かった。[Comparative Example 1]
[Production method of tartaric acid and glycolic acid from glucose (reaction from 5-keto-D-gluconic acid in the presence of 1M potassium hydroxide]
About 430 mL of a culture solution containing 67.3 g / L of 5-keto-D-gluconic acid obtained by using Gluconobacter oxydans TADK-267 as in Example 2, about 24 g of potassium hydroxide was added. As a 30 mL aqueous solution, the final potassium hydroxide concentration of the solution was 1M. The pH at this time was 13.7. Thereafter, when aeration and stirring were continued, 3.1 g / L tartaric acid and 1.5 g / L glycolic acid were formed at 55 hours, and a trace amount of 5-keto-D-gluconic acid remained. The reaction was continued until the 144th hour, but tartaric acid was 3.6 g / L, glycolic acid was 1.7 g / L, and the molar yield of tartaric acid from glucose was calculated by taking into account the decrease due to evaporation and sampling in the middle. Was 6.6% and the molar yield of glycolic acid from glucose was 6.2%. That is, when the pH was 12 or more, the yields of tartaric acid and glycolic acid were extremely low.

本発明によれば、グルコースからＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩を非常に効率良く、かつ、低コストで製造することができる。そのため、本発明の製造方法は、工業的な製造に利用することが可能であり、実用性もきわめて高い。したがって、Ｌ−酒石酸やグリコール酸等を使用する産業分野、例えば、食品分野、工業分野、医薬品分野において、特に有用となる。   According to the present invention, L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof can be produced from glucose very efficiently and at low cost. Therefore, the production method of the present invention can be used for industrial production, and is extremely practical. Therefore, it is particularly useful in industrial fields using L-tartaric acid, glycolic acid and the like, for example, in the food field, industrial field, and pharmaceutical field.

Claims (16)

以下の工程Ａ〜Ｃを備え、グルコースからＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩を製造する方法。
（Ａ）グルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生産する微生物を、水酸化カリウムの存在下、グルコース含有培養液で培養することにより、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩を含む培養液を得る工程Ａ、
（Ｂ）工程Ａで得られた５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩を含む培養液のｐＨを水酸化カリウムを用い７〜１２の範囲内に調整及び維持することにより、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の水溶性塩がＬ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩に変換した反応液を得る工程Ｂ、
（Ｃ）工程Ｂで得られた反応液から、Ｌ−酒石酸若しくはその塩、及び／又は、グリコール酸若しくはその塩を採取する工程Ｃ。 A method for producing L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof from glucose, comprising the following steps A to C.
(A) A microorganism producing 5-keto-D-gluconic acid from glucose is cultured in a glucose-containing culture solution in the presence of potassium hydroxide, thereby containing a water-soluble salt of 5-keto-D-gluconic acid. Step A for obtaining a culture solution,
(B) By adjusting and maintaining the pH of the culture solution containing the water-soluble salt of 5-keto-D-gluconic acid obtained in step A within the range of 7 to 12 using potassium hydroxide , 5-keto A step B of obtaining a reaction solution in which a water-soluble salt of D-gluconic acid is converted to L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof;
(C) Step C of collecting L-tartaric acid or a salt thereof and / or glycolic acid or a salt thereof from the reaction solution obtained in Step B. 上記工程Ｂにおける培養液に、遷移金属触媒をさらに含有させた培養液を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein a culture solution further containing a transition metal catalyst is used as the culture solution in the step B. 遷移金属触媒が、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、白金、マンガン、銅、コバルト、ニッケル、亜鉛、バナジウム及び鉄からなる群から選択される１種又は２種以上の遷移金属触媒であることを特徴とする請求項２に記載の方法。 The transition metal catalyst is one or more transition metal catalysts selected from the group consisting of palladium, rhodium, ruthenium, platinum, manganese, copper, cobalt, nickel, zinc, vanadium and iron. The method of claim 2. 遷移金属触媒の濃度が０．００００２〜２％の範囲内であることを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。 The process according to claim 2 or 3, wherein the concentration of the transition metal catalyst is in the range of 0.00002 to 2%. 遷移金属触媒の濃度が０．０００１〜１％の範囲内であることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 2 to 4, wherein the concentration of the transition metal catalyst is in the range of 0.0001 to 1%. グルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生産する微生物が、グルコノバクター属又はアセトバクター属に属する微生物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the microorganism that produces 5-keto-D-gluconic acid from glucose is a microorganism belonging to the genus Gluconobacter or Acetobacter. グルコノバクター属又はアセトバクター属に属する微生物が、グルコノバクター・オキシダンスＮＢＲＣ ３１７２およびＮＢＲＣ ３２５５、グルコノバクター・パストリアヌスＮＢＲＣ ３２２５、グルコノバクター・アルビダスＮＢＲＣ ３２５０、グルコノバクター・サブオキシダンスＮＢＲＣ ３２５４、グルコノバクター・インダストリアスＮＢＲＣ ３２６０、グルコノバクター・セレウスＮＢＲＣ ３２６７、グルコノバクター・ジオキシアセトニカスＮＢＲＣ ３２７３、グルコノバクター・モノオキシグルコニカスＮＢＲＣ ３２７６、グルコノバクター・グルコニカスＮＢＲＣ ３２８５、グルコノバクター・ロゼウスＮＢＲＣ ３９９０、グルコノバクター・フラトイリＮＢＲＣ ３２６５、アセトバクター・アセチＮＢＲＣ ３２５９、及び、それらの変異株であってグルコースから５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生産する株からなる群から選択されるいずれか１種又は２種以上の微生物であることを特徴とする請求項６に記載の方法。 Microorganisms belonging to the genus Gluconobacter or Acetobacter are Gluconobacter oxydans NBRC 3172 and NBRC 3255, Gluconobacter pastorianus NBRC 3225, Gluconobacter albidas NBRC 3250, Gluconobacter suboxydans NBRC 3254 , Gluconobacter industrias NBRC 3260, Gluconobacter cereus NBRC 3267, Gluconobacter dioxyacetonicus NBRC 3273, Gluconobacter monooxygluconicus NBRC 3276, Gluconobacter gluconicus NBRC 3285, Glucono Bacter Roseus NBRC 3990, Gluconobacter Fratoli NBRC 3265, Acetobacter aceti NBR 3259 and mutants thereof, any one or more microorganisms selected from the group consisting of strains that produce 5-keto-D-gluconic acid from glucose, Item 7. The method according to Item 6. グルコノバクター属又はアセトバクター属に属する微生物が、さらに２−ケト−Ｄ−グルコン酸低生産性及び／又は５−ケト−Ｄ−グルコン酸低消費性の株であることを特徴とする請求項７に記載の方法。 The microorganism belonging to the genus Gluconobacter or Acetobacter is a strain having low 2-keto-D-gluconic acid low productivity and / or 5-keto-D-gluconic acid low consumption. 8. The method according to 7. 上記工程Ｂにおける培養液のｐＨを８〜１１の範囲内に調整及び維持することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the pH of the culture solution in the step B is adjusted and maintained within a range of 8 to 11. 上記工程Ｂにおける培養液のｐＨを９〜１０の範囲内に調整及び維持することを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the pH of the culture solution in the step B is adjusted and maintained within a range of 9 to 10. 上記工程Ｂにおいて、培養液のｐＨを調整及び維持する際に、さらに、培養液の温度を０℃〜７０℃の範囲内に調整及び維持することを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。 In the said process B, when adjusting and maintaining the pH of a culture solution, the temperature of a culture solution is further adjusted and maintained in the range of 0 degreeC-70 degreeC, The any one of Claims 1-10 characterized by the above-mentioned. The method described in 1. 上記工程Ｂにおいて、培養液のｐＨを調整及び維持する際に、さらに、培養液の温度を２０℃〜６０℃の範囲内に調整及び維持することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。 In said process B, when adjusting and maintaining the pH of a culture solution, the temperature of a culture solution is further adjusted and maintained in the range of 20 to 60 degreeC. The method described in 1. 上記工程Ｂにおいて、培養液のｐＨを調整及び維持する際に、さらに、培養液に対する空気供給量の割合を０．２〜５の範囲内に調整及び維持することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。 In the step B, when adjusting and maintaining the pH of the culture solution, the ratio of the air supply amount to the culture solution is further adjusted and maintained within a range of 0.2 to 5. 13. The method according to any one of 12. 上記工程Ｂにおいて、培養液のｐＨを調整及び維持する際に、さらに、培養液に対する空気供給量の割合を０．５〜３の範囲内に調整及び維持することを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。 In the step B, when adjusting and maintaining the pH of the culture solution, the ratio of the air supply amount to the culture solution is further adjusted and maintained within a range of 0.5 to 3. 14. The method according to any one of 13. 工程Ｃにおいて採取されたＬ−酒石酸の塩が、Ｌ−酒石酸の１カリウム塩であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the salt of L-tartaric acid collected in Step C is a monopotassium salt of L-tartaric acid. 工程Ｃにおいて採取されたグリコール酸若しくはその塩が、グリコール酸のフリーな酸若しくはその塩であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
The method according to any one of claims 1 to 15, wherein the glycolic acid or salt thereof collected in step C is a glycolic acid free acid or salt thereof.
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