JP4269416B2 - Process for producing α-halo-α, β-saturated carbonyl compound - Google Patents

Description

（但し、式中Ｒ₁はハロゲン原子を表わし、Ｒ₂、Ｒ₃は独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１乃至６の直鎖状もしくは分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数１乃至６の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、置換されていてもよい芳香族基または含窒素、含酸素もしくは含硫黄複素環基を表わし、Ｒ₄はヒドロキシル基、炭素数１乃至３の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基または１級乃至３級アミノ基を表わす。）で示される化合物であり、α−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物が下記一般式（２）
【化４】

（但し、式中Ｒ₁乃至Ｒ₄は上記と同じ意味を表わす。）で示される化合物である［１］〜［６］のいずれかに記載のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の製造方法。
【００１３】
［８］ 一般式（１）で示される化合物が、α−ハロアクリル酸であり、一般式（２）で示される化合物が絶対配置Ｓのα−ハロプロピオン酸である［７］に記載のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の製造方法。
［９］ ハロゲン原子が臭素原子または塩素原子である［８］に記載の製造方法。
［１０］ 微生物の処理物が微生物培養物、微生物抽出物、微生物細胞懸濁液または微生物菌体固定物である［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］ 生成するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を分解しなくなるような変異を使用する微生物に生じさせ、生成物の蓄積量を高めることを特徴とする［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］ 反応系中にα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物と、使用する微生物が酸化できる化合物を共存させることによって反応継続時間を延長した［１］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］ 使用する微生物が酸化できる化合物が炭素数３乃至６の糖または炭素数２乃至４の有機酸である［１２］に記載の製造方法。
【００１４】
［１４］ α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有するシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株(Pseudomonas
sp.SD810)（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７６７）またはその変異株。
［１５］ α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有するシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株(Pseudomonas
sp.SD811)（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７６８）またはその変異株。
［１６］ α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有するシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株(Pseudomonas
sp.SD812)（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７６９）またはその変異株。
【００１５】
［１７］ α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有するバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株(Burkholderia
sp.SD816)（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７０）またはその変異株。
［１８］ ［１４］〜［１７］のいずれかに記載の微生物の処理物。
［１９］ 微生物培養物、微生物抽出物、微生物細胞懸濁液または微生物菌体固定物からなる［１８］に記載の微生物の処理物。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明において使用できる微生物は、アセトバクター(Acetobacter)属、アクチノマイセス(Actinomyces)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、エアロモナス(Aeromonas)属、アルカリジェネス(Alcaligenes)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、アゾトバクター(Azotobacter)属、バシラス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、バークホルデリア(Burkholderia)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、エッシェリッシア(Escherichia)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、グルコノバクター(Gluconobacter)属、ハロバクテリウム(Halobacterium)属、ハロコッカス(Halococcus)属、クレブシラ(Klebsiella)属、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ミクロポリスポラ(Micropolyspora)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ノカルディア(Nocardia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、セラチア(Serratia)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、キサントモナス(Xanthomonas)属のいずれかに属する微生物である。
【００１７】
好適にはシュードモナス属あるいはバークホルデリア属に属する微生物である。α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有する株ならば特に制限はないが、例えば、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株、またはバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株が好適に用いられる。中でもシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株またはバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株が特に好適に用いられる。シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株またはバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株は土壌中から単離されたものであり、各種のカルボニル化合物を分解資化する能力を有している。
【００１８】
また、上記微生物は、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物のα，β−炭素・炭素二重結合を還元する活性を有している限り、野生株、変異株、または細胞融合もしくは遺伝子操作により誘導される組み換え体などのいずれの菌株でも用いることができる。たとえば、生成物の分解活性が低下したり欠損した変異株、還元活性が向上した変異株や遺伝子組み換え体、高濃度の基質や生成物に対する耐性が向上した変異株などは、特に好適に用いることができる。
【００１９】
次にその分離・培養の例を示す。
すなわち、通常の細菌に用いられる無機塩培地（例えば、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ ２g/l、ＮａＨ₂ＰＯ₄ １g/l、Ｋ₂ＨＰＯ₄ １g/l、ＭｇＳＯ₄ ０．１g/l、酵母エキス０．５g/l）に、例えば、α−クロロアクリル酸のようなα位にハロゲン原子を置換基として持つα，β−不飽和カルボニル化合物を実質的に唯一の炭素源として２g/l添加した最少培地５mlを試験管に分注し滅菌後、土壌約０．１ｇを添加し、２８℃で振とう培養を行い、１日毎に植え継ぎを行う。本集積培養を６日間繰り返した後、上記最少培地に２０g/lの寒天を添加して平板化した上に塗布し、２８℃で３日間培養し、生成したコロニーを純粋分離すると、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株またはシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株を得ることができる。これらシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株およびシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株は、それぞれ生命研菌寄第BP-6767号(FERM BP-6767)［生命研菌寄第16746号(FERM-16746)から移管］、生命研菌寄第BP-6768号(FERM BP-6768)［生命研菌寄第16747号(FERM 16747)から移管］および生命研菌寄第BP-6769号(FERM BP−6769)［生命研菌寄第16748号(FERM 16748)から移管］として生命工業技術研究所に寄託されている。
【００２０】
また、比較的分離源中でのポピュレーションの低い株の分離・培養例を示す。
【００２１】
すなわち、土壌などを分離源とした馴化集積培養によりポピュレーションの低い微生物、資化能力が低い微生物、α−クロロアクリル酸のようなα位にハロゲン原子を置換基として持つα，β−不飽和カルボニル化合物（以降「含ハロゲン化合物」ともいう。）に対する耐性の低い微生物を分離することができる。酵母抽出物（０．５g/l）、硫酸アンモニウム（２g/l）、リン酸二水素ナトリウム（１g/l）、リン酸水素二カリウム（１g/l）、硫酸マグネシウム（０．１g/l）を含む基本培地（一部の高塩濃度を好んで生育する微生物の分離には、前記基本培地に、塩化ナトリウムを１０〜２０％濃度で加えたものを基本培地として用いる）に各種の含ハロゲン化合物０．０１％（本明細書中、特記しない限り「％」は「重量(g)／体積(100ml)ｘ100」を表わす。)を実質的に唯一の、あるいは同濃度のグルコースと共に炭素源として添加した培地１０mlに、採取した土壌１ｇを懸濁し３０℃で振とう培養する。２４時間後培養液上清５mlを取り、上記組成のうち含ハロゲン化合物濃度のみ０．０２％とした新しい培地５mlを加え３０℃で振とう培養する（植え継ぎ１回目）。２４時間後、培養液の上清５mlを取り、培地中の含ハロゲン化合物の濃度を０．０２％から０．１％に上げた培地５mlを加え３０℃で振とう培養する（植え継ぎ２回目）。この作業を２４時間毎にさらに３回繰り返す（植え継ぎ３〜５回目）。６回目の植え継ぎ時に、培養液に加える培地の含ハロゲン化合物の濃度を０．２％に上げ、上清５mlを取り、新しい培地５mlを加え３０℃で振とう培養する。この作業を２４時間毎に６回繰り返し（植え継ぎ６〜１２回目）、６回の各植え継ぎ時に、上記含ハロゲン化合物０．２％を含む培地に２％の寒天を加えて平板培地としたものに培養液上清の一部を塗布し、３０℃で培養し、生じたコロニーを純粋分離すると、たとえば、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株を得ることができる。バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株は、生命研菌寄第BP-6770号(FERM BP−6770)として生命工業技術研究所に寄託されている。
【００２２】
次に、これらの菌株の分類学的試験結果を示す。
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株
形態；
（１）細胞の形および大きさ 桿菌
０．６−１．０μm×１．２−３．０μm
（２）運動性 あり
（３）グラム染色性 陰性
（４）胞子の有無 なし
（５）３％ＫＯＨによる溶菌 陽性
生理学的活性；
（１）アミノペプチダーゼ 陽性
（２）オキシダーゼ 陽性
（３）カタラーゼ 陽性
（４）インドールの生成 陰性
（５）ＶＰテスト 陰性
（６）硝酸塩の還元 陰性
（７）脱窒反応 陰性
（８）クエン酸の利用（Simons） 陽性
（９）ウレアーゼ 陰性
（１０）フェニルアラニンデアミナーゼ 陰性
（１１）マロン酸の利用 陽性
（１２）シュクロースからのレバンの生成 陽性
（１３）レシチナーゼ 陰性
（１４）デンプンの加水分解 陰性
（１５）ゼラチンの加水分解 陰性
（１６）カゼインの加水分解 陰性
（１７）ＤＮＡの加水分解 陰性
【００２３】
（１８）Tween ８０の加水分解 陰性
（１９）エクスリンの加水分解 陰性
（２０）生育
酸素に対する挙動 絶対好気性
３７℃での生育 −
４１℃での生育 −
ｐH５．６での生育 ＋
Mac-Conkey-Agar培地での生育 −
SS-Agar培地での生育 −
Centrimid-Agarでの生育 −
（２１）色素の生成
非拡散性 陰性
拡散性 陰性
蛍光性 陰性
ピロシアニン 陰性
（２２）ＯＦテスト 糖を分解しない
（２３）酸の生成
グルコース 陰性
フラクトース 陽性
キシロース 陰性
（２４）ＯＮＰＧ（β−ガラクトシダーゼ） 陰性
（２５）アルギニンジヒドロラーゼ 陰性
（２６）グルコースからのガス生成 陰性
（２７）チロシン分解 陰性
（２８）生育因子要求性 なし
（２９）各種炭素化合物の利用性
酢酸 ＋
アジピン酸 −
【００２４】
カプリン酸 ＋
クエン酸 ＋
シトラコン酸 ＋
グリコール酸 ＋
レブリン酸 ＋
マレイン酸 ＋
マロン酸 ＋
メサコン酸 ＋
ムコン酸 ＋
フェニル酢酸 ＋
糖酸 ＋
セバシン酸 ＋
Ｄ−酒石酸 ＋
ｍ−酒石酸 ＋
Ｌ−アラビノース −
セロビオース −
フラクトース ＋
Ｄ−フコース −
グルコース −
マンノース −
マルトース −
リボース −
ラムノース −
キシロース −
マンニトール −
グルコン酸 −
２−ケトグルコン酸 ＋
Ｎ−アセチルグルコサミン −
【００２５】
トリプタミン −
エタノールアミン −
Ｄ−アラニン ＋
Ｌ−オルニチン −
Ｌ−セリン −
Ｌ−スレオニン −
グルタミン酸 ＋
安息香酸 ＋
ｍ−ヒドロキシ安息香酸 ＋
サリシン酸ナトリウム −
２，３−ブチレングリコール −
以上の結果をバージェイの細菌分類書(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(1986))に基づいて分類すると、本菌株はシュードモナス属に属するがこれらの性質が標準株と一致するものが見いだせなかった。そこで、本菌株はシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１０株(Pseudomonas sp.SD810)と呼ぶことにした。
【００２６】
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株
形態；
（１）細胞の形および大きさ 桿菌
０．７−０．９μm×１．５−３．０μm
（２）運動性 あり
（３）グラム染色性 陰性
（４）胞子の有無 なし
（５）３％ＫＯＨによる溶菌 陽性
生理学的活性；
（１）アミノペプチダーゼ 陽性
（２）オキシダーゼ 陽性
【００２７】
（３）カタラーゼ 陽性
（４）インドールの生成 陰性
（５）ＶＰテスト 陰性
（６）硝酸塩の還元 陰性
（７）脱窒反応 陰性
（８）クエン酸の利用（Simons） 陽性
（９）ウレアーゼ 陰性
（１０）フェニルアラニンデアミナーゼ 陰性
（１１）マロン酸の利用 陽性
（１２）シュクロースからのレバンの生成 陰性
（１３）レシチナーゼ 陰性
（１４）デンプンの加水分解 陰性
（１５）ゼラチンの加水分解 陰性
（１６）カゼインの加水分解 陰性
（１７）ＤＮＡの加水分解 陰性
（１８）Tween ８０の加水分解 陽性
（１９）エクスリンの加水分解 陰性
（２０）生育
酸素に対する挙動 絶対好気性
３７℃での生育 −
４１℃での生育 −
ｐＨ５．６での生育 ＋
Mac-Conkey-Agar培地での生育 −
SS-Agar培地での生育 −
Cetrimid-Agarでの生育 −
（２１）色素の生成
非拡散性 陰性
拡散性 陰性
【００２８】
蛍光性 陰性
ピロシアニン 陰性
（２２）ＯＦテスト 糖を分解しない
（２３）酸の生成
グルコース 陽性
フラクトース 陽性
キシロース 陽性
（２４）ＯＮＰＧ（β−ガラクトシダーゼ） 陰性
（２５）アルギニンジヒドロラーゼ 陰性
（２６）グルコースからのガス生成 陰性
（２７）チロシン分解 陰性
（２８）生育因子要求性 なし
（２９）各種炭素化合物の利用性
酢酸 ＋
アジピン酸 −
カプリン酸 −
クエン酸 −
シトラコン酸 ＋
グリコール酸 ＋
レブリン酸 −
マレイン酸 ＋
マロン酸 ＋
メサコン酸 −
ムコン酸 ＋
フェニル酢酸 ＋
糖酸 ＋
セバシン酸 −
Ｄ−酒石酸 ＋
【００２９】
ｍ−酒石酸 −
Ｌ−アラビノース ＋
セロビオース −
フラクトース ＋
Ｄ−フコース ＋
グルコース ＋
マンノース −
マルトース −
リボース ＋
ラムノース ＋
キシロース −
マンニトール ＋
グルコン酸 −
２−ケトグルコン酸 ＋
Ｎ−アセチルグルコサミン ＋
トリプタミン −
エタノールアミン −
Ｄ−アラニン −
Ｌ−オルニチン −
Ｌ−セリン −
Ｌ−スレオニン −
グルタミン酸 ＋
安息香酸 ＋
ｍ−ヒドロキシ安息香酸 ＋
サリシン酸ナトリウム −
２，３−ブチレングリコール −
以上の結果を同様にバージェイの細菌分類書に基づいて分類すると、本菌株はシュードモナス属に属するがこれらの性質が標準株と一致するものが見いだせなかった。そこで、本菌株はシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株(Pseudomonas sp.SD811)と呼ぶことにした。
【００３０】
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株
形態；
（１）細胞の形および大きさ 桿菌
０．５−０．８μm×１．５−３．０μm
（２）運動性 あり
（３）グラム染色性 陰性
（４）胞子の有無 なし
（５）３％ＫＯＨによる溶菌 陽性
生理学的活性；
（１）アミノペプチダーゼ 陽性
（２）オキシダーゼ 陽性
（３）カタラーゼ 陽性
（４）インドールの生成 陰性
（５）ＶＰテスト 陰性
（６）硝酸塩の還元 陰性
（７）脱窒反応 陰性
（８）クエン酸の利用（Simons） 陽性
（９）ウレアーゼ 陽性
（１０）フェニルアラニンデアミナーゼ 陰性
（１１）マロン酸の利用 陽性
（１２）シュクロースからのレバンの生成 陰性
（１３）レシチナーゼ 陰性
（１４）デンプンの加水分解 陰性
（１５）ゼラチンの加水分解 陰性
（１６）カゼインの加水分解 陰性
（１７）ＤＮＡの加水分解 陰性
【００３１】
（１８）Tween ８０の加水分解 陰性
（１９）エクスリンの加水分解 陰性
（２０）生育
酸素に対する挙動 絶対好気性
３７℃での生育 −
４１℃での生育 −
ｐＨ５．６での生育 ＋
Mac-Conkey-Agar培地での生育 −
SS-Agar培地での生育 −
Cetrimid-Agarでの生育 −
（２１）色素の生成
非拡散性 陽性
拡散性 陰性
蛍光性 陰性
ピロシアニン 陰性
（２２）ＯＦテスト 糖を分解しない
（２３）酸の生成
グルコース 陰性
フラクトース 陰性
キシロース 陰性
（２４）ＯＮＰＧ（β−ガラクトシダーゼ） 陰性
（２５）アルギニンジヒドロラーゼ 陰性
（２６）グルコースからのガス生成 陰性
（２７）チロシン分解 陽性
（２８）生育因子要求性 なし
（２９）各種炭素化合物の利用性
酢酸 ＋
アジピン酸 ＋
【００３２】
カプリン酸 −
クエン酸 ＋
シトラコン酸 −
グリコール酸 ＋
レブリン酸 −
マレイン酸 ＋
マロン酸 ＋
メサコン酸 ＋
ムコン酸 ＋
フェニル酢酸 ＋
糖酸 ＋
セバシン酸 ＋
Ｄ−酒石酸 −
ｍ−酒石酸 ＋
Ｌ−アラビノース −
セロビオース −
フラクトース −
Ｄ−フコース −
グルコース −
マンノース −
マルトース −
リボース −
ラムノース −
キシロース −
マンニトール −
グルコン酸 ＋
２−ケトグルコン酸 ＋
Ｎ−アセチルグルコサミン −
【００３３】
トリプタミン −
エタノールアミン −
Ｄ−アラニン ＋
Ｌ−オルニチン −
Ｌ−セリン −
Ｌ−スレオニン ＋
グルタミン酸 ＋
安息香酸 ＋
ｍ−ヒドロキシ安息香酸 ＋
サリシン酸ナトリウム −
２，３−ブチレングリコール −
以上の結果を同様にバージェイの細菌分類書に基づいて分類すると、本菌株はシュードモナス属に属するがこれらの性質が標準株と一致するものが見いだせなかった。そこで、本菌株はシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１２株(Pseudomonas sp.SD812)と呼ぶことにした。
【００３４】
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株
形態；
（１）細胞の形 桿菌
（２）運動性 あり
（３）グラム染色性 陰性
（４）胞子の有無 なし
（５）鞭毛 着生状態不明
生理学的活性；
（１）オキシダーゼ 陽性
（２）カタラーゼ 陽性
（３）プロトカテキン酸の開裂 ortho型
（４）硝酸塩の還元 陰性
【００３５】
（５）脱窒反応 陰性
（６）ＰＨＢの蓄積 陽性
（７）デンプンの加水分解 陰性
（８）ゼラチンの加水分解 陰性
（９）生育
酸素に対する挙動 絶対好気性
４０℃での生育 ＋
（１０）色素の生成
集落の色調 特徴的集落色素を生成せず
水溶性色素の生成 陰性
（１１）ＯＦテスト 糖を分解しない
（１２）アルギニンジヒドロラーゼ 陰性
（１３）各種炭素化合物の利用性
レブリン酸 −
メサコン酸 −
Ｄ−酒石酸 ＋
リボース ＋
ラムノース ＋
キシロース ＋
トリプタミン −
２，３−ブチレングリコール −
（１４）キノン系 Ｑ−８
（１５）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（mol％） ６２
以上の結果をバージェイの細菌分類書(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(1986、1994))に基づいて分類すると、本菌株はバークホルデリア属に属するがこれらの性質が標準株と一致するものが見いだせなかった。そこで、本菌株はバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株(Burkholderia sp.SD816)と呼ぶことにした。
【００３６】
本発明において、好適に使用できるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物は、次の一般式（１）で表される。
【化５】

式中Ｒ₁ はハロゲン原子を表わし、好ましいＲ₁ としては塩素原子、臭素原子を挙げることができる。Ｒ₂ 、Ｒ₃ は独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１乃至６の直鎖状もしくは分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数１乃至６の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、置換されていてもよい芳香族基または飽和もしくは不飽和含窒素、含酸素もしくは含硫黄複素環基を表わし、好ましいＲ₂ 、Ｒ₃ としては水素原子を挙げることができる。Ｒ₄ はヒドロキシル基、炭素数１乃至４の直鎖状もしくは分岐状アルコキシ基、１級乃至３級アミノ基を表わし、好ましいＲ₄ としてはヒドロキシル基を挙げることができる。
【００３７】
具体的にはα−クロロアクリル酸、α−ブロモアクリル酸、２−クロロ−２−ブテン酸、２−ブロモ−２−ブテン酸、２−クロロ−２−ペンテン酸、２−ブロモ−２−ペンテン酸、それらのメチルエステル、エチルエステルなどが挙げられ、好ましくはα−クロロアクリル酸、α−ブロモアクリル酸である。
【００３８】
本発明の反応方法は、シュードモナス属あるいはバークホルデリア属等に属する微生物、具体例としてはシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株等の微生物をα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物に接触させて炭素・炭素二重結合を還元し、対応するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を得ることにより行われる。
【００３９】
本発明で行なうα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の炭素・炭素二重結合の還元反応は、前記微生物が持つ還元力が安定に発現する条件下であれば、該微生物の培養液中、前記方法により培養して得た菌体、または前記方法により培養して得た菌体を破砕して得られる無細胞抽出液等の微生物の処理物のいずれを用いても行うことができる。
【００４０】
すなわち培養して得た菌体を用いる場合は、基質となるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物を培養液に、０．１％〜１０％の濃度、好ましくは０．２％〜２％の濃度になるように連続的または回分的に添加し、培養温度１５℃〜３５℃、好ましくは２５℃〜３０℃で培養し、培養液中に相当するα−ハロ−α,β−飽和カルボニル化合物を生成させることができる。
【００４１】
あるいは、前記方法により培養して得た培養物から遠心分離などの方法で回収した菌体を、適当な溶液、例えば希薄なｐH緩衝溶液のごとき水溶液に懸濁した溶液に、基質となるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物を、例えば、０．１％〜１０％の濃度になるように連続的または回分的に添加し、反応温度１５℃〜３５℃、好ましくは、２５℃〜３０℃、反応ｐH６．０〜９．０、好ましくは、ｐH６．５〜７．３に調節して反応し、該菌体懸濁液中に相当するα−ハロα，β−飽和カルボニル化合物を生成させることができる。前記培養法による培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、基質となるα, β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物を、たとえば、０．１％〜１０％の濃度、好ましくは０．２％〜２％の濃度で含み、反応液のｐＨ維持に有効な成分、好ましくは、水性バッファ、たとえばリン酸カリウムもしくはトリス／ＨＣｌを１０mM〜１Mの範囲で含むような反応液に懸濁して、反応温度１５℃〜５０℃、好ましくは２８℃〜３５℃の範囲で反応させ、相当するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を生成させることができる。α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の添加時期と速度または回数は、反応が目的時間内で終了するような範囲で自由に選択できる。
【００４２】
微生物の処理物を用いる場合は、例えば、前記培養法による培養物を遠心分離に供して回収した菌体を、フレンチプレス等の方法により破壊して得た無細胞抽出液を、基質となるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の濃度が、０．１％〜１０％、好ましくは０．２％〜２％であり、反応液のｐＨ維持に有効な成分を１０mM〜１Mの範囲で含むような反応液に添加して、反応温度１５℃〜５０℃、好ましくは２８℃〜３５℃の範囲で反応させ、相当するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を生成させることができる。
【００４３】
さらに本発明においては、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の還元する活性の維持に有効な物質、たとえば使用する微生物が酸化することのできる糖や有機酸のごとき化合物、好ましくはグルコースやＬ−乳酸等を、単独で、あるいはα−クロロアクリル酸との混合溶液として反応中、０．１％〜１０％の濃度、好ましくは０．２％〜１％の濃度になるように連続的または回分的に添加しながら反応させることができる。α−クロロアクリル酸とこれら被酸化物質との添加割合は１：１〜２０：１の間で任意に選択できる。この糖や有機酸の添加により反応時間を延長することができる。このことにより、目的生成物であるα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の反応液中の濃度を高くすることができ、生成物を単離収得するのに好ましい。反応は培養中で無い場合は、好気的、嫌気的いずれの環境でも行うことができる。菌体または無細胞抽出液と基質であるα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の比率、あるいは基質の添加時期と速度または回数は、反応が目的時間内で終了するような範囲で自由に選択できる。
【００４４】
本発明においては、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の還元によって生成したα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物は、使用する微生物にとって代謝中間体であってさらに分解を受ける場合がある。例えば、α−クロロアクリル酸から生成されるα−クロロプロピオン酸は、微生物のいくつかでは比較的速やかに分解される。このような場合は、分解活性を失った変異株を用いるか、ｐＨ値の低下、菌体または無細胞抽出液の加熱処理、又は適切な分解酵素の阻害剤の添加により分解反応を停止させることができる。たとえば、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株は、通常α−クロロアクリル酸からα−クロロプロピオン酸を生成する最適な速度を与える条件では、培養液もしくは反応液中に生成したα−クロロプロピオン酸を速やかに分解するため、対α−クロロアクリル酸からα−クロロプロピオン酸への変換率が低下してしまうが、α−クロロアクリル酸からα−クロロプロピオン酸生成段階の至適反応のｐＨの範囲が、ｐＨ５．０〜７．０であり、α−クロロプロピオン酸の分解段階の至適反応ｐＨの範囲が、ｐＨ７．０〜７．３であり、α−クロロプロピオン酸の分解段階の至適反応ｐＨの範囲が高いので、ｐＨ５．０〜７．０の低いα−クロロプロピオン酸生成段階の至適反応のｐＨの範囲で反応を行うことによりα−クロロプロピオン酸の生成量を増すことができる。また、前記α−クロロプロピオン酸を分解する酵素の一種はヒドロキシルアミンによって効果的に阻害されることが知られているが（Soda K. et. al., J. Biol. Chem. 272,3363-3368,1997)、本発明においても、培養液あるいは反応液に適量のヒドロキシルアミンを添加することにより、分解反応を阻害することができる。
【００４５】
さらに、本発明で用いられる微生物の菌体あるいは無細胞抽出液は、慣用の方法、たとえば、吸着、包括、架橋などの方法により、種々の固定化担体に固定化して用いることができる。担体の種類は特に制限されず、たとえば、セルロースなどの多糖系材料、ポリマー系材料、コラーゲン等のタンパク質系材料などを用いることができる。
【００４６】
本発明で使用するα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物はα位についてプロキラルな分子であるが、炭素・炭素二重結合を還元することにより、α位について絶対配置Ｓ体の対応するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を製造することができる。
【００４７】
本発明に用いる微生物の培養方法は、一般好気性微生物が増殖し得る方法であれば特に制限されないが、培地の炭素源としては、上記微生物が利用可能なものであればいずれも使用でき、たとえば、糖類、酢酸、乳酸、およびこれらの混合物等が使用できる。窒素源としては、たとえば、硫酸アンモニウムやリン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキスなどの含窒素化合物、およびこれらの混合物を使用できる。
【００４８】
また、培地には、前記成分以外に通常の培養に用いられる栄養源、たとえば、無機塩、微量金属塩、ビタミン類などを適宜、混合して用いることができる。さらに、必要に応じて、微生物の増殖を促進する因子、培地のｐＨ維持に有効な成分等を添加できる。また、微生物の還元活性を高めるために有効な化合物、たとえば、α−クロロアクリル酸のようなα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物を、単独で炭素源として、または複数の炭素源と混合して用いることができる。
【００４９】
本発明に用いる微生物の培養は、ほとんどの好気性あるいは通性嫌気性細菌の培養に用いられる好気的条件下で行うことができる。たとえば、培地のｐＨ５．５〜８．０好ましくはｐＨ６．５〜７．０、培養温度１５℃〜３５℃、好ましくは２５℃〜３０℃の条件で行うことができる。培養時間は、たとえば、１〜１４４時間、好ましくは１２時間〜７２時間である。
【００５０】
本発明で生成したα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物は、常用の溶媒抽出、蒸留といった精製法を用いて、得ることができる。たとえば、α−クロロアクリル酸から生成したα−クロロプロピオン酸は、培養液や反応液から有機溶媒抽出、蒸留等に供することにより得ることができる。また、α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物はα位についてプロキラルな分子であるが、本発明の還元法によって生成するキラルなα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物の鏡像異性体の純度は、キラルカラム材料でのＧＣ、ＨＰＬＣあるいは旋光計で決定するのが有利である。
【００５１】
このように、本発明は、好気性あるいは通性嫌気性細菌を用いるため、経済性、操作性、プロセスの安全性に優れたα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の炭素・炭素二重結合を還元して対応する絶対配置Ｓ体のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を製造する方法を提供するものである。
【００５２】
【実施例】
以下の実施例において、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１
α，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の還元活性の検出
酵母抽出物（０．５g/l）、硫酸アンモニウム（２g/l）、リン酸二水素ナトリウム（１g/l）、リン酸水素二カリウム（１g/l）、硫酸マグネシウム（０．１g/l）を含む基本培地（一部の高塩濃度を好んで生育する微生物は、前記基本培地に、塩化ナトリウムを１０〜２０％濃度で加えたものを基本培地として用いた）に、炭素源としてα-クロロアクリル酸またはα−クロロ−α，β−ブテン酸を０．２％添加した培地を用いて、集積培養あるいは馴化集積培養により分離した微生物を３０℃で培養し、培養液中に対応する還元生成物であるα-クロロプロピオン酸、α-クロロ酪酸が出現するかどうかをガスクロマトグラフィーを用いて調べた。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、次の条件で分析を行った。
【００５４】
本体； GC-7A（島津製作所）
カラム； Thermon−3000／SHINCARBON A ２．６mm×２．１m
キャリアガス； 窒素 ５０ml／min．
検出； FID
カラム温度； ２００℃（一定）
インジェクション； ２〜１０マイクロリター、２６０℃
記録； クロマトコーダー１２（SIC）
上記検出により、複数の微生物の培養液中に、培養開始後速やかに、α−クロロアクリル酸またはα-クロロ-α，β-ブテン酸の消費に伴って、還元生成物であるα−クロロプロピオン酸またはα-クロロ酪酸の位置にピークが出現した。このピークをＧＣ−ＭＳにより分析したところ、標準物質のα−クロロプロピオン酸またはα-クロロ酪酸のマススペクトルと一致したことから、α−クロロプロピオン酸、α-クロロ酪酸であることが証明された。培養物中に還元生成物を生じた微生物の属を同定したところ様々な属の微生物にこの還元活性が認められることが判った。
【００５５】
活性が認められた微生物は、アセトバクター（Acetobacter）属、アクチノマイセス(Actinomyces)属、アシネトバクター（Acinetobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、エアロモナス（Aeromonas)属、アルカリジェネス(Alcaligenes)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、アゾトバクター（Azotobacter)属、バシラス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、バークホルデリア(Burkholderia)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、エッシェリッシア(Escherichia)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、グルコノバクター(Gluconobacter)属、ハロバクテリウム(Halobacterium)属、ハロコッカス(Halococcus)属、クレブシラ(Klebsiella)属、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、ミクロコッカス(micrococcus)属、ミクロポリスポラ(Micropolyspora)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ノカルディア(Nocardia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、セラチア(Serratia)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、キサントモナス(Xanthomonas)属に属する好気性あるいは通性嫌気性細菌であった。特に多くの株が認められたのはシュードモナス(Pseudomonas)属であり、還元生成物量が比較的多かったのは、シュードモナス(Pseudomonas)属およびバークホルデリア(Burkholderia)属に属する微生物であった。培養液中に認められた還元生成物はいずれの株でも微少量（０．０１％以下）であったため、以下優良株について生成物蓄積条件の最適化を行った。
【００５６】
実施例２
（１）シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の培養
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株を次の培地において培養した(量g/l)：α−クロロアクリル酸（２）、酵母抽出物（０．５）、硫酸アンモニウム（２）、リン酸二水素ナトリウム（１）、リン酸水素二カリウム（１）、硫酸マグネシウム（０．１）。培地の作成は以下のように行った。前記成分のうち、α−クロロアクリル酸および硫酸マグネシウムを除く全成分を９５０mlの水に溶解してｐＨ値を７．０に調整し、５ｌのフラスコに入れ、１２１℃で２０分間滅菌した。続いて、この培地の温度が７０℃程度まで下がった後、α−クロロアクリル酸および硫酸マグネシウムを５０mlの水に溶解してｐＨ値を７．０に調整した溶液を滅菌フィルターで滅菌した後混合した。さらに酸素を供給したり、ｐＨを調節することなく、この培地に５％予備培養物（ＯＤ６６０nm＝１．１０）を接種し３０℃で株を培養した。
【００５７】
（２）α−クロロアクリル酸培養液におけるα−クロロプロピオン酸の検出
上記のシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株のα−クロロアクリル酸を用いた培養において、特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、実施例１に示した条件で分析を行った。
【００５８】
上記検出により、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の培養液中には、培養開始後速やかに、α−クロロアクリル酸の消費に伴って、α−クロロプロピオン酸の位置にピークが出現し、その生産量は最大の時で培養液の約０．０２％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約１０％であった。
【００５９】
実施例３
（１）α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−１
上記のシュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株を、実施例２の方法の１／１０のスケールで培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収した。この菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、リン酸緩衝液１００ｍM（ｐＨ７．３）を含む溶液（ｐＨ７．３に調整）２０mlに懸濁し、２８℃で振とうして反応させた。
【００６０】
反応液から、特定の時点で０．５mlのサンプルを採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４ｍｌに、０．１mlの６ＮＨＣｌを混合した後、０．４mlの酢酸エチルにより生成物を抽出し、抽出サンプルを実施例１の方法により分析したところ、反応液中には、α−クロロアクリル酸の消費に伴って、α−クロロプロピオン酸の位置にピークが出現し、その生産量は最大の時で反応液の約０．０５％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約２５％であった。
【００６１】
（２）α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応からのα−クロロプロピオン酸の単離
前記シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株(Pseudomonas sp．SD811)を実施例１の方法の１／５スケールで培養して得た培養物を遠心分離に供して回収した菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、リン酸カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液１００mMを含む溶液（ｐＨ７．３に調整）１００mlに懸濁し、２８℃で攪拌して反応させた。反応中、α−クロロアクリル酸が無くなった時点で、さらに反応液の０．２％のα−クロロアクリル酸を添加して、反応を続行した。特定の時点でサンプル０．５mlを採取し、実施例３の方法で生成物を抽出分離し、実施例１の方法でα−クロロプロピオン酸の生産量をモニタリングした。約９時間後、反応液中のα−クロロアクリル酸が検出できなくなった時点で反応を終了し、その反応液の全量を遠心分離に供して菌体を除去した。得られた上清９５mlに２０mlの６ＮＨＣｌを添加し、９５mlの酢酸エチルで生成物を抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水１００mlで洗浄した後、エバポレーターで酢酸エチルを除去して濃縮した。濃縮サンプルを実施例１の方法で分析したところ、微量のα−クロロアクリル酸とα−クロロプロピオン酸が検出され、濃縮サンプルに含まれるα−クロロプロピオン酸は全量で約１００mg、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約２５％であった。
【００６２】
実施例４
（１）α−クロロプロピオン酸のメチル化
光学分割ＧＣカラムによって光学分割を行う場合、未修飾のカルボン酸はカルボキシル基の影響でＧＣカラムでの分離性が悪いことが多いため、三フッ化硼素−メタノール錯塩法により生成物のメチルエステル化を行った。すなわち、α−クロロプロピオン酸３mgにメタノール４mlを添加して混合した後、さらに三フッ化硼素−メタノール錯体１４％メタノール溶液１mlを添加して、攪拌しながら８０℃のオイルバス上で１時間還流した。１時間後、水３０mlを反応液に加え、酢酸エチル１０mlで反応物を抽出した後、酢酸エチルをエバポレーターで留去してサンプル全量を約０．１mlに濃縮した。濃縮サンプルを実施例１の方法のうちカラム温度のみを１２０℃にした条件で分析したところ、α−クロロプロピオン酸メチルエステルの位置にメインピークが一つ見られた。このピークをＧＣ−ＭＳ分析し、α−クロロプロピオン酸メチルエステルであることを確認した。
（２）α−クロロプロピオン酸の光学分割ＧＣ分析
上記の方法によりメチル化したＳ体とＲ体のα−クロロプロピオン酸は、以下の分析条件により、良く分離できた。
【００６３】
本体 ； GC-１４A（島津製作所）
カラム； CP-Chirasil-DEX−DEX CB
０．３２mmI.D.×２５m ｄｆ＝０．２５mm
（ＧＬサイエンス株式会社）
キャリアガス； He、０．３８ kg/cm²
検出； FID ２７５℃
カラム温度； ７０℃（一定）
インジェクション； ０．１〜０．２マイクロリター
split 約１：１００、２５０℃
記録； クロマトパックC-R6A（島津製作所）
この条件で実施例３の反応液から得たα−クロロプロピオン酸メチルエステルを分析したところ、Ｓ体のα−クロロプロピオン酸メチルエステルの位置にのみピークが見られ、その光学純度は９９％以上であった。
【００６４】
実施例５
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−２
前記シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株を、実施例２の方法の１／１０のスケールで培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、リン酸緩衝液１００mM（ｐＨ５．７）を含む溶液（ｐＨ５．７に調整）２０mlに懸濁し、２８℃で振とうして反応させた。反応液から、特定の時点で０．５mlのサンプルを採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．１mlの６ＮＨＣｌを混合した後、０．４mlの酢酸エチルにより生成物を抽出し、抽出サンプルを実施例１の方法により分析したところ、反応液中には、α−クロロアクリル酸の消費に伴って、α−クロロプロピオン酸の位置にピークが出現し、その生産量は最大の時で反応液の約０．０８％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約４１％であった。
【００６５】
実施例６
α−クロロプロピオン酸非分解性変異株の作成
シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株およびバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株を実施例２の方法の１／２００のスケールで培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、それぞれ生理食塩水で洗浄した。この洗浄菌体を１０〜１００mMリン酸緩衝液（ｐＨ７）１mlに再懸濁した菌体懸濁液に、最終濃度が５０〜１００ppmとなるように、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を添加し、室温で２〜２０分間処理した。処理後の菌体懸濁液を遠心分離に供して菌体を回収し、滅菌生理食塩水で洗浄した後、全量をＬ培地（ポリペプトン１０g/l、酵母エキス５g/l、塩化ナトリウム５g/l、ｐＨ７）５mlに植菌して、２８℃で一昼夜振とう培養した。培養終了後の培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、２０％グリセリン溶液に懸濁した後、適当量ずつ等分して凍結し、それぞれ変異株の選択用グリセリン・ストックとした。
【００６６】
実施例７
α−クロロプロピオン酸非分解性変異株の選択
前記変異株の選択用グリセリン・ストックを実施例２の方法で用いた培地５mlに植菌し、２８℃で５時間培養した。濁度が数倍に上昇した時点で、培養液に終濃度１００〜１０００ppmとなる量のペニシリンＧを添加し、２８℃で培養を続行した。５〜１６時間培養後の培養液を遠心分離に供して菌体を回収し、滅菌生理食塩水で２回洗浄した後、全量をＬ−ブロス５mlに植菌して、２８℃で一昼夜振とう培養した。
【００６７】
実施例２で用いた培地のうち、炭素源であるα−クロロアクリル酸を、等量の乳酸に置き換えた培地に、２％の寒天を添加して平板化したものに、前記培養液を希釈して塗布し、２８℃で培養した。１〜２日後、平板上に形成されたコロニーを、実施例２で用いた培地に２％の寒天を添加して平板化したものにレプリカし、２８℃で１〜２日間培養した。乳酸平板上では生育し、α−クロロアクリル酸平板上では生育しなかった株を、α−クロロプロピオン酸非分解性変異株の候補として分離した。
【００６８】
分離した候補株を、実施例２で用いた培地に、生育可能な炭素源として乳酸を２g/l添加した培地５mlに一白金耳植菌し、２８℃で振とう培養した。この培養液について実施例１の方法によって分析を行ったところ、培養物中に生成したα−クロロプロピオン酸の生産最大量は、候補株によってバラツキがあったが、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の変異株では最大で培養液の約０．１７％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約８５％、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株の変異株では最大で培養液の約０．１５％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約７５％であった。これらの株をα−クロロプロピオン酸非分解性変異株として選択した。
【００６９】
実施例８
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−３
前記シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株およびバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、それぞれ実施例７で使用したのと同じ培地で培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、リン酸緩衝液１００mM（ｐＨ７．３）を含む溶液（ｐＨ７．３に調整）２０mlにそれぞれ懸濁し、２８℃で振とうして反応させた。
【００７０】
反応液から、特定の時点で０．５mlのサンプルを採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．１mlの６ＮＨＣｌを混合した後、０．４mlの酢酸エチルにより生成物を抽出し、抽出サンプルを実施例２の方法により分析したところ、反応液中には、α−クロロアクリル酸の消費に伴って、α−クロロプロピオン酸の位置にピークが出現した。その生産量は、α−クロロアクリル酸が反応液から消失した時点で、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の変異株では反応液の約０．１９％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９５％であり、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株の変異株ではそれぞれ約０．２％、約１００％であった。いずれの株でも生成したα−クロロプロピオン酸が時間の経過と共に減少することは無かった。このα−クロロプロピオン酸の光学活性を、実施例４の方法に従って分析した結果、共にＳ体であり、その光学純度は９９％以上であった。
【００７１】
実施例９
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−４
前記シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株およびバークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、それぞれ実施例２で使用した基本培地に、炭素源としてグルコース０．２％を添加した培地１００mlで培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、リン酸緩衝液１００mM（ｐＨ７．３）を含む溶液（ｐＨ７．３に調整）２０mlにそれぞれ懸濁し、２８℃で振とうして反応させた。
【００７２】
反応液から、特定の時点で０．５mlのサンプルを採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．１mlの６ＮＨＣｌを混合した後、０．４mlの酢酸エチルにより生成物を抽出し、抽出サンプルを実施例１の方法により分析したところ、反応液中には、反応開始初期の数時間のラグタイムののち、α−クロロアクリル酸の消費に伴って、α−クロロプロピオン酸の位置にピークが出現した。その生産量は、α−クロロアクリル酸が反応液から消失した時点で、シュードモナス・エスピー・ＳＤ８１１株の変異株では反応液の約０．１９％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９５％であり、バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株の変異株ではそれぞれ約０．２％、約１００％であった。
【００７３】
実施例１０
ジャーファーメンターによる培養
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例９で使用した培地を培地成分について５倍濃度とした培地（５×培地、ｐＨ７．０）１００mlで１６時間培養した培養液を、５Ｌのジャーファーメンターに張り込んだ５×培地２Ｌに接種し、２８℃、８００rpm、通気量１ml／分で培養した。培養開始後約１５〜２０時間経過時、初期投入分のグルコースが全て消費されるため、グルコース５〜２０％／硫酸アンモニウム５〜１５％／酵母エキス１〜５％溶液をそれぞれ単独あるいは混合液として、ペリスタック・ポンプにより連続的に追加添加した。この間のグルコース濃度は０．０２〜２％の間に保たれるように添加速度を調節した。培養液ｐＨは２０％アンモニア水溶液により６．３〜７．３の間に保たれるように調節した。この方法によって約３０〜４８時間培養した時のＯＤ６６０nmは約３０〜５０であった。
【００７４】
実施例１１
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−５
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例１０の方法に従い培養した。培養開始後４８〜７２時間グルコースなどの添加を停止して生育を止めた培養液に、終濃度が約０．２％になるようα−クロロアクリル酸を添加し、培養時と同条件で反応させた。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、次の条件で液中のα−クロロアクリル酸濃度の定量を行った。
【００７５】
本体； LC-９A（島津製作所）
カラム； ODSpak F-511／４．６mm×２５０mm（Shodex）
溶離液； アセトニトリル／水＝２／８＋０．１％トリフルオロ酢酸、１ml／分
検出； SPD-6AV UV-VIS Spectrophotometer（島津製作所）、 ２５６nm
カラム温度； ２５℃
インジェクション； Autosampler Model123（SIC）
２０マイクロリター・サンプルループ付
記録； クロマトコーダー１２（SIC）
この反応では、反応開始初期の３〜７時間のラグタイムののち、α−クロロアクリル酸が消費され始めた。α−クロロアクリル酸の濃度が約０．０２％になった時点で、α−クロロアクリル酸の濃度が約０．２％になるよう、α−クロロアクリル酸を追加添加した。この作業を実質的にα−クロロアクリル酸の消費が停止するまで繰り返した。反応が実質的に停止した３２時間後のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量は、反応液の約１．０〜１．２％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９７％であった。この蓄積したα−クロロプロピオン酸の光学活性を、実施例４の方法に従って分析した結果、Ｓ体であり、その光学純度は９９％以上であった。
【００７６】
実施例１２
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−６
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例１０の方法に従い４８〜７２時間培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、リン酸緩衝液６０mM（ｐＨ７．１）を含む溶液（ｐＨ７．１に調整）２ｌに懸濁し、２８℃、８００rpm、通気量１ml／分で反応させた。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、実施例１１に示した方法により液中のα−クロロアクリル酸濃度の定量を行った。
【００７７】
この反応では、反応開始初期の５〜１０時間のラグタイムののち、α−クロロアクリル酸が消費され始めた。α−クロロアクリル酸の濃度が約０．０２％になった時点で、α−クロロアクリル酸の濃度が０．２％になるよう、α−クロロアクリル酸を追加添加した。この作業を実質的にα−クロロアクリル酸の消費が停止するまで繰り返した。反応が実質的に停止した２８時間後のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量は、反応液の約０．８〜１．０％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９８％であった。
【００７８】
実施例１３
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−７
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例１０の方法に従い４８〜７２時間培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、リン酸緩衝液６０mM（ｐＨ７．１）を含む溶液（ｐＨ７．１に調整）２ｌに懸濁した。この菌体懸濁液に５〜１０％のα−クロロアクリル酸溶液をペリスタック・ポンプを用いて微量ずつ添加しながら、２８℃、８００rpm、通気量１ml／分で反応させた。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、実施例１１に示した方法により液中のα−クロロアクリル酸濃度の定量を行った。
【００７９】
この反応では、反応開始初期の５〜１０時間のラグタイムののち、α−クロロアクリル酸が消費され始めた。α−クロロアクリル酸の濃度が約０．０２〜０．２％の間に、好ましくは０．１％前後となるよう、消費スピードに合わせてα−クロロアクリル酸溶液の添加スピードを調節した。この作業を実質的にα−クロロアクリル酸の消費が停止するまで継続した。反応が実質的に停止した２４時間後のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量は、反応液の約０．８〜１．２％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９５％であった。
【００８０】
実施例１４
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−８
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例１０の方法に従い４８〜７２時間培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、リン酸緩衝液６０mM（ｐＨ７．１）を含む溶液（ｐＨ７．１に調整）２ｌに懸濁した。この菌体懸濁液に５〜１０％のα−クロロアクリル酸溶液をペリスタック・ポンプを用いて微量ずつ添加しながら、２８℃、８００rpm、通気量１ml／分で反応させた。同時に、５〜１０％のグルコース溶液あるいは５〜１０％の乳酸ナトリウム溶液を、単独で、あるいはα−クロロアクリル酸との混合溶液としてペリスタック・ポンプを用いて微量ずつ添加した。α−クロロアクリル酸とこれら被酸化物質との割合は１：１〜２０：１の範囲になるように調整した。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、実施例１１に示した方法により液中のα−クロロアクリル酸濃度の定量を行った。またグルコースを添加した場合はグルコース・アナライザーを用いて、乳酸を添加した場合は乳酸脱水素酵素を用いて濃度を定量した。反応系のｐＨは２０％アンモニア水および２ＮＨＣｌを用いて６．５〜７．３に調整した。
【００８１】
この反応では、反応開始初期の５〜１０時間のラグタイムののち、α−クロロアクリル酸が消費され始めた。被酸化物質は反応開始直後から速やかに消費された。α−クロロアクリル酸の濃度が約０．０２〜０．２％の間に、好ましくは０．１％前後となるよう、消費スピードに合わせてα−クロロアクリル酸溶液の添加スピードを調節し、同時に被酸化物質濃度が０．４％を越えない範囲で添加量を調節した。この作業を約６０時間まで継続した。本還元反応は被酸化物質の共存により顕著に持続され、約６０時間後も一定速度で進行した。６０時間後のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量は、反応液の約２．８〜３．２％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９９％以上であった。
【００８２】
実施例１５
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−９
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例１０の方法に従い４８〜７２時間培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、リン酸緩衝液６０mM（ｐＨ７．１）を含む溶液（ｐＨ７．１に調整）２ｌに懸濁した。この菌体懸濁液に１０％のα−クロロアクリル酸と１０％のグルコースの混合水溶液をペリスタック・ポンプを用いて微量ずつ添加しながら、２８℃、８００rpm、通気量１ml／分で反応させた。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、実施例１１に示した方法により液中のα−クロロアクリル酸濃度の定量を行った。グルコース濃度は遠心して得た反応上清を原液のままグルコースアナライザーに供して定量した。反応系のｐＨは２０％アンモニア水および２ＮＨＣｌを用いて６．５〜７．３に調整した。この反応では、反応開始初期の６〜１２時間のラグタイムの後、α−クロロアクリル酸が消費され始めた。グルコースは反応開始直後特に速やかに消費されたが、還元活性が安定してからは一定の速度で消費された。α−クロロアクリル酸の濃度が約０．０２〜０．２％の間に、好ましくは０．１％前後となるよう、同時にグルコース濃度が０．４％を超えないように留意しながら混合溶液の添加スピードを調節した。この作業を約６０時間まで継続した。本還元反応はグルコースの共存により顕著に持続され、約６０時間後も一定速度で進行した。６０時間後のα−クロロプロピオン酸に対しての変換率約９９％以上であった。
【００８３】
実施例１６
α−クロロアクリル酸を基質とする菌体懸濁反応−１０
バークホルデリア・エスピー・ＳＤ８１６株のα−クロロプロピオン酸非分解性変異株を、実施例１０の方法の１／２のスケールで４８〜７２時間培養して得た培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、この菌体を、α−クロロアクリル酸０．２％、グルコース０．２％、リン酸緩衝液６０mM（ｐＨ７．１）を含む溶液（ｐＨ７．１に調整）１ｌに懸濁し、２８℃、８００rpm、通気量１ml／分で反応させた。反応開始後５〜１０時間のラグタイムの終点で、通気を空気から窒素ガスに換え、その後は嫌気的な環境で反応を行った。特定の時点でサンプルを０．５ml採取し、遠心に供して菌体を除去した上清０．４mlに、０．４mlの２ＮＨＣｌを混合した後、実施例１１に示した方法により液中のα−クロロアクリル酸濃度の定量を行った。同時にグルコース濃度をグルコース・アナライザーで定量した。反応系のｐＨは２０％アンモニアおよび２ＮＨＣｌを用いて６．５〜７．３に調整した。
【００８４】
この反応では、反応開始初期の５〜１０時間のラグタイムののち、α−クロロアクリル酸が消費され始めた。α−クロロアクリル酸の濃度が約０．０２％になった時点で、α−クロロアクリル酸の濃度が０．２％になるよう、またグルコースの濃度が０．１％前後になるようα−クロロアクリル酸あるいはグルコースを追加添加した。この作業を約６０時間まで継続した。本還元反応は被酸化物質の共存により顕著に持続され、約６０時間後も一定速度で進行した。またグルコースの消費は反応系を好気的環境から嫌気的環境に移した直後から激減し、総消費量は好気的環境における反応の約１／１０以下となった。６０時間後のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量は、反応液の約２．５〜３．２％、基質α−クロロアクリル酸に対しての変換率約９９％以上であった。
【００８５】
【発明の効果】
本発明は、好気性細菌あるいは通性嫌気性細菌を用いるため、経済性、操作性、プロセスの安全性に優れたα，β−炭素・炭素二重結合を有するα−ハロカルボニル化合物の炭素・炭素二重結合を還元して、対応するα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を製造する方法を提供する。さらには、α，β−炭素・炭素二重結合を有するプロキラルなα−ハロカルボニル化合物の炭素・炭素二重結合を還元して、医農薬等のキラル構築ブロックとして有用な高純度の絶対配置Ｓ体のα−ハロ−α，β−飽和カルボニル化合物を製造する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】被酸化物質を添加しない場合と添加した場合のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量の例
【図２】グルコースを添加しない場合と添加した場合のα−クロロプロピオン酸の蓄積生産量の比較の例[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to microorganisms belonging to a specific genus such as Acetobacter, particularly microorganisms belonging to the genus Pseudomonas or Burkholderia, more particularly Pseudomonas sp. SD810 strain (Pseudomonas sp. SD810), Pseudomonas sp. Using specific strains such as SP SD811 strain (Pseudomonas sp. SD811), Pseudomonas sp. SD812 strain (Pseudomonas sp. SD812), Burkholderia sp. SD816 strain (Burkholderia sp. SD816), or treatments thereof The α, β-carbon / carbon double bond of the α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond is hydrogenated to give the corresponding α-halo-α, β-saturated carbonyl compound. It relates to a method of manufacturing. Furthermore, novel microorganisms belonging to the genus Pseudomonas or Burkholderia, particularly Pseudomonas sp. SD810 strain (Pseudomonas sp. SD810), Pseudomonas sp. SD811 strain (Pseudomonas sp. SD811), Pseudomonas sp. SD812 strain ( Pseudomonas sp. SD812) and Burkholderia sp. SD816 strain (Burkholderia sp. SD816).
[0002]
In the present invention, an α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond is a prochiral molecule at the α-position. The present invention relates to a method for producing an S-form α-halo-α, β-saturated carbonyl compound with respect to the position. This novel method can be utilized in the field of producing optically active carbonyl compounds such as various optically active (α-position absolute configuration S-form) saturated carboxylic acids and amides. Optically active carbonyl compounds are valuable chiral building blocks that are difficult to prepare by classical chemical processes, and are a group of substances that are particularly useful as raw materials for pharmaceuticals and agrochemicals.
[0003]
[Prior art]
In recent years, various compounds, particularly methods for producing optically active substances by reducing carbon / carbon double bonds of microorganisms have attracted attention, and have various α, β-carbon / carbon double bonds and substituents at the α-position. A method for producing an α, β-saturated carbonyl compound having a substituent at the corresponding α-position by microbial reduction of the carbon-carbon double bond of a carbonyl compound having a hydrogen atom has been reported (H. Simon.et. al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 362, 33 (1981), H. Giesel. et.al., Arch. Microbiol. 135, 51 (1983), HGWLeuenberger. et.al., Helv. Chim Acta., 62, 455 (1979), R. Matuno., Et. Al., J. Ferm. Bioeng., 84, 195 (1997)). However, in the method using bacteria as microorganisms, anaerobic bacteria such as Clostridium kluyveri (DSM-555) and Clostridium sp. La-1 (Clostridium sp. La-1 (DSM-1460)) are used. Since it is used, the growth rate of microorganisms is slow, and it is difficult to increase the cell concentration, so that the reaction rate is not sufficient, and there are problems in economy and operability.
[0004]
Further, the method using Clostridium thermosaccharolyticum disclosed in JP-A-63-003794 is intended to solve the above problem by using thermophilic bacteria, Since anaerobic bacteria are still used, the growth rate and reaction rate are not sufficient, and the problems of economics and safety such as the use of hydrogen in the process have not been solved. In addition, the α, β-saturated carbonyl compound having a substituent at the α-position produced by reduction of a carbonyl compound having a α, β-carbon / carbon double bond and having a substituent at the α-position by this microorganism is It is an absolute configuration R body, and S body cannot be manufactured.
[0005]
The method of reducing α, β-carbon / carbon double bonds using baker's yeast as a microorganism is versatile because it has a wide range of compounds that can be reduced, and is an aerobic microorganism, so it is produced with good operability. Both the optically active form, S form, and R form are known and most reported, but yeast grows slower than bacteria, and reduction reactions aimed at optically active products are optical. In many cases, selectivity is not sufficient, and a reduction reaction of an α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond is not known.
[0006]
As described above, the corresponding α-halo-α, β-saturated carbonyl compound is obtained by reducing the carbon-carbon double bond of the α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond using a microorganism. In the manufacturing method, a method that satisfies all the conditions such as operability, economy, safety, and reaction characteristics has not been known.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, the present invention provides a corresponding α-halo-α, β-saturated carbonyl obtained by reducing the carbon-carbon double bond of an α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond using a microorganism. In the method for producing a compound, it is an object to provide a production method in which all the conditions such as operability, economy, safety and reaction characteristics are satisfied and the optical selectivity is excellent.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The inventors reduce the carbon-carbon double bond of an α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond to produce the corresponding α-halo-α, β-saturated carbonyl compound. A thorough screening from the soil has found that microorganisms are surprisingly distributed over a relatively large number of aerobic or facultative anaerobic bacteria. In particular, there are many strains having this activity in microorganisms belonging to the genus Pseudomonas or Burkholderia, and among these strains, α-β having an α, β-carbon / carbon double bond is present. The inventors have found that there is a substance capable of reducing the halocarbonyl compound to produce an α-halo-α, β-saturated carbonyl compound having an absolute configuration S-form with extremely high purity at the α-position, thereby completing the present invention. It was.
[0009]
That is, the present invention relates to the following matters.
[1] An α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond is converted into an Acetobacter genus, Actinomyces genus, Acinetobacter genus, Agrobacterium genus, Aeromonas genus, Alcaligenes genus, Arthrobacter genus, Azotobacter genus, Bacillus genus, Brevibacterium genus, Burkholderia genus, Cellulomonas genus Cellulomonas genus, Corynebacterium genus, Enterobacter genus, Enterococcus genus, Escherichia genus, Flavobacterium genus, Gluconobacter genus, Halobacteria Genus Halobacterium, genus Halococcus, genus Klebsiella, lactobacilli Lactobacillus genus, Microbacterium genus, Micrococcus genus, Micropolyspora genus, Mycobacterium genus, Nocardia genus, Pseudomonas genus, Pseudonocardia genus, Rhodococcus genus, Rhodobacter genus, Serratia genus, Staphylococcus genus, Streptococcus genus, Streptomyces genus Xanthomonas) Using a microorganism belonging to any of the genus Xanthomonas) or a processed product thereof, the α, β-carbon / carbon double bond is reduced.To produce S-form compounds with chiral α-positionAnd a process for producing an α-halo-α, β-saturated carbonyl compound.
[0010]
[2] An α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond is reduced using a microorganism belonging to the genus Pseudomonas or a processed product thereof, and the α, β-carbon / carbon double bond is reduced. The method for producing an α-halo-α, β-saturated carbonyl compound according to [1].
[3] Using an α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond, a microorganism belonging to the genus Burkholderia or a processed product thereof, and using the α, β-carbon / carbon double bond, The method for producing an α-halo-α, β-saturated carbonyl compound according to [1], wherein the reduction is performed.
[0011]
[4] The microorganism belonging to the genus Pseudomonas is Pseudomonas sp. SD810 strain (Pseudomonas sp. SD810)(FERM BP-6767)Pseudomonas sp. SD811 strain (Pseudomonas
sp.SD811)(FERM BP-6768)Or Pseudomonas sp. SD812 strain (Pseudomonas sp. SD812)(FERM BP-6769)The production method according to [2].
[5] A microorganism belonging to the genus Burkholderia is Burkholderia sp. SD816 strain (Burkholderia sp. SD816)(FERM BP-6770)The production method according to [3].
[6] A microorganism belonging to the genus Burkholderia is Burkholderia sp. SD816 strain (Burkholderia sp. SD816)(FERM BP-6770)The production method according to [3], which is a non-degradable mutant of α-chloropropionic acid.
[0012]
[7An α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond is represented by the following general formula (1):
[Chemical 3]

(However, R in the formula₁Represents a halogen atom, R₂, R_ThreeIs independently a hydrogen atom, a halogen atom, a linear or branched aliphatic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a hydroxyl group, a carboxyl group, or a substituted group. Represents an aromatic group or a nitrogen-containing, oxygen-containing or sulfur-containing heterocyclic group, and R_FourRepresents a hydroxyl group, a linear or branched alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, or a primary to tertiary amino group. The α-halo-α, β-saturated carbonyl compound is represented by the following general formula (2):
[Formula 4]

(However, R in the formula₁To R_FourRepresents the same meaning as above. [1] to [1] which are compounds represented by6] The manufacturing method of the alpha-halo-alpha, beta-saturated carbonyl compound in any one of.
[0013]
[8The compound represented by the general formula (1) is α-haloacrylic acid, and the compound represented by the general formula (2) is α-halopropionic acid having an absolute configuration S [7] The manufacturing method of the alpha-halo-alpha, beta-saturated carbonyl compound of description.
[9] Halogen atom is bromine atomOr chlorine atom[8] The manufacturing method of description.
[10[1] to [1] to [1] to [1], wherein the processed microorganism is a microorganism culture, microorganism extract, microorganism cell suspension or microorganism cell fixed substance9] The manufacturing method in any one of.
[11[1] to [1], wherein the produced α-halo-α, β-saturated carbonyl compound is caused in a microorganism using a mutation that does not decompose, and the accumulated amount of the product is increased.10] The manufacturing method in any one of.
[12The reaction duration was extended by coexisting an α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond and a compound that can be oxidized by the microorganism used in the reaction system [1] to [11] The manufacturing method in any one of.
[13] The compound that can be oxidized by the microorganism used is a sugar having 3 to 6 carbon atoms.Or an organic acid having 2 to 4 carbon atoms[12] The manufacturing method of description.
[0014]
[14] Pseudomonas sp. Strain SD810 having activity of reducing α, β-carbon / carbon double bond of α-halocarbonyl compound having α, β-carbon / carbon double bond (Pseudomonas
sp.SD810)(FERM BP-6767)Or its mutants.
[15] Pseudomonas strain SD811 (Pseudomonas strain having activity of reducing α, β-carbon / carbon double bond of α-halocarbonyl compound having α, β-carbon / carbon double bond
sp.SD811)(FERM BP-6768)Or its mutants.
[16] Pseudomonas sp. SD812 strain (Pseudomonas strain having activity of reducing α, β-carbon / carbon double bond of α-halocarbonyl compound having α, β-carbon / carbon double bond
sp.SD812)(FERM BP-6769)Or its mutants.
[0015]
[17] Burkholderia sp. SD816 strain (Burkholderia strain having activity of reducing α, β-carbon / carbon double bond of α-halocarbonyl compound having α, β-carbon / carbon double bond)
sp.SD816)(FERM BP-6770)Or its mutants.
[18] A processed product of the microorganism according to any one of [14] to [17].
[19] The processed microorganism product according to [18], which comprises a microbial culture, a microbial extract, a microbial cell suspension, or a microbial cell fixed product.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Microorganisms that can be used in the present invention include the genus Acetobacter, the genus Actinomyces, the genus Acinetobacter, the genus Agrobacterium, the genus Aeromonas, the genus Alcaligenes, Arthrobacter genus, Azotobacter genus, Bacillus genus, Brevibacterium genus, Burkholderia genus, Cellulomonas genus, Corynebacterium genus, Corynebacterium genus, Enterobacter genus, Enterococcus genus, Escherichia genus, Flavobacterium genus, Gluconobacter genus, Halobacterium genus, Halococcus genus, Klebsiola (Klebsiella), Lactobacillus, microbacteria Microbacterium genus, Micrococcus genus, Micropolyspora genus, Mycobacterium genus, Nocardia genus, Pseudomonas genus, Pseudonocardia genus, Any of the genus Rhodococcus, Rhodobacter, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Xanthomonas It is a microorganism.
[0017]
A microorganism belonging to the genus Pseudomonas or Burkholderia is preferred. The strain is not particularly limited as long as it has an activity of reducing the α, β-carbon / carbon double bond of the α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond. For example, Pseudomonas sp. SD810 Strain, Pseudomonas sp. SD811 strain, Pseudomonas sp. SD 812 strain, or Burkholderia sp. SD 816 strain is preferably used. Among them, Pseudomonas sp. SD811 strain or Burkholderia sp. SD816 strain is particularly preferably used. Pseudomonas sp. SD810 strain, Pseudomonas sp. SD811 strain, Pseudomonas sp. SD812 strain or Burkholderia sp. SD816 strain is isolated from soil and decomposes and assimilates various carbonyl compounds. Has the ability.
[0018]
In addition, as long as the microorganism has an activity of reducing the α, β-carbon / carbon double bond of the α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond, it is a wild strain or a mutant strain. Alternatively, any strain such as a recombinant derived by cell fusion or genetic manipulation can be used. For example, mutant strains with reduced or deficient product degradation activity, mutant strains or genetic recombinants with improved reduction activity, mutant strains with improved resistance to high concentrations of substrates and products, etc. should be used particularly preferably. Can do.
[0019]
Next, an example of the separation and culture is shown.
That is, an inorganic salt medium (for example, (NH_Four)₂SO_Four 2g / l, NaH₂PO_Four 1g / l, K₂HPO_Four 1g / l, MgSO_Four 0.1 g / l, yeast extract 0.5 g / l), for example, α, β-unsaturated carbonyl compounds having a halogen atom as a substituent at the α-position, such as α-chloroacrylic acid. Dispense 5 ml of a minimum medium supplemented with 2 g / l as a carbon source into a test tube, sterilize, add about 0.1 g of soil, perform shaking culture at 28 ° C., and transplant every day. After this enrichment culture was repeated for 6 days, 20 g / l agar was added to the above-mentioned minimal medium, and the mixture was applied on a plate, cultured at 28 ° C. for 3 days, and the resulting colonies were isolated purely, Pseudomonas sp. -SD810 strain, Pseudomonas sp. SD811 strain or Pseudomonas sp. SD812 strain can be obtained. These Pseudomonas sp. SD810 strain, Pseudomonas sp. SD811 strain and Pseudomonas sp. SD812 strain are respectively referred to as Life Research Bacteria BP-6767 (FERM BP-6767) [Life Research Bacteria Yoko No. 16746 (FERM- 16746)], life research fungus BP-6768 (FERM BP-6768) [transfer from life research fungi 16747 (FERM 16747)] and life research fungi BP-6769 (FERM BP- 6769) [Transferred from Life Kenkyu No. 16748 (FERM 16748)].
[0020]
Moreover, the example of isolation | separation and culture | cultivation of the strain with a comparatively low population in a isolation | separation source is shown.
[0021]
In other words, microorganisms with low population, microorganisms with low assimilation ability, and α, β-unsaturation having a halogen atom as a substituent at the α-position, such as α-chloroacrylic acid, by acclimation accumulation culture using soil as a separation source Microorganisms with low resistance to carbonyl compounds (hereinafter also referred to as “halogen-containing compounds”) can be isolated. Yeast extract (0.5 g / l), ammonium sulfate (2 g / l), sodium dihydrogen phosphate (1 g / l), dipotassium hydrogen phosphate (1 g / l), magnesium sulfate (0.1 g / l) Various halogen-containing compounds in a basic medium containing (for separation of microorganisms that prefer to grow some high salt concentrations, the basic medium is added with sodium chloride at a concentration of 10 to 20% as the basic medium) 0.01% (in this specification, “%” means “weight (g) / volume (100 ml) × 100” unless otherwise specified) is added as a carbon source with substantially the same or the same concentration of glucose) 1 g of the collected soil is suspended in 10 ml of the prepared medium and cultured with shaking at 30 ° C. 24 hours later, 5 ml of the culture supernatant is taken, 5 ml of a new medium containing only 0.02% of the halogen-containing compound in the above composition is added, and the mixture is cultured with shaking at 30 ° C. (first planting). 24 hours later, 5 ml of the supernatant of the culture solution is taken, 5 ml of the medium in which the concentration of the halogen-containing compound in the medium is increased from 0.02% to 0.1% is added, and the mixture is cultured with shaking at 30 ° C. ). This operation is repeated three more times every 24 hours (3-5 planting joints). At the time of the 6th inoculation, the concentration of the halogen-containing compound in the medium added to the culture solution is increased to 0.2%, 5 ml of the supernatant is taken, 5 ml of fresh medium is added, and the mixture is cultured with shaking at 30 ° C. This operation was repeated 6 times every 24 hours (the 6th to 12th planting), and at each of the 6 plantings, 2% agar was added to the medium containing 0.2% of the halogen-containing compound to obtain a plate medium. When a part of the culture supernatant is applied to the culture medium and cultured at 30 ° C., and the resulting colonies are isolated purely, for example, Burkholderia sp. SD816 strain can be obtained. The Burkholderia sp. SD816 strain has been deposited with the Biotechnology Research Institute as FERM BP-6770.
[0022]
Next, taxonomic test results of these strains are shown.
Pseudomonas sp. SD810 shares
Form;
(1) Shape and size of cells
0.6-1.0μm × 1.2-3.0μm
(2) There is mobility
(3) Gram staining negative
(4) Presence or absence of spores None
(5) Lysis positive by 3% KOH
Physiological activity;
(1) Aminopeptidase positive
(2) Oxidase positive
(3) Catalase positive
(4) Indole production Negative
(5) Negative VP test
(6) Nitrate reduction Negative
(7) Negative denitrification reaction
(8) Use of citric acid (Simons) Positive
(9) Urease negative
(10) Phenylalanine deaminase negative
(11) Use of malonic acid Positive
(12) Production of levan from sucrose
(13) Lecithinase negative
(14) Starch hydrolysis negative
(15) Gelatin hydrolysis Negative
(16) Casein hydrolysis negative
(17) DNA hydrolysis negative
[0023]
(18) Tween 80 hydrolysis negative
(19) Exrin hydrolysis negative
(20) Growth
Behavior to oxygen Absolute aerobic
Growth at 37 ° C-
Growth at 41 ° C-
Growth at pH 5.6 +
Growth on Mac-Conkey-Agar medium −
Growth on SS-Agar medium −
Growth in Centrimid-Agar −
(21) Production of pigment
Non-diffusive negative
Diffusive negative
Fluorescence negative
Pyrocyanine negative
(22) OF test Does not decompose sugar
(23) Acid generation
Glucose negative
Fructose positive
Xylose negative
(24) ONPG (β-galactosidase) negative
(25) Arginine dihydrolase negative
(26) Gas production from glucose Negative
(27) tyrosine degradation negative
(28) Growth factor requirement None
(29) Usability of various carbon compounds
Acetic acid +
Adipic acid −
[0024]
Capric acid +
Citric acid +
Citraconic acid +
Glycolic acid +
Levulinic acid +
Maleic acid +
Malonic acid +
Mesaconic acid +
Muconic acid +
Phenylacetic acid +
Sugar acid +
Sebacic acid +
D-tartaric acid +
m-tartaric acid +
L-arabinose-
Cellobiose −
Fructose +
D-Fucose-
Glucose −
Mannose −
Maltose −
Ribose −
Rhamnose −
Xylose −
Mannitol −
Gluconic acid −
2-ketogluconic acid +
N-acetylglucosamine −
[0025]
Tryptamine −
Ethanolamine −
D-alanine +
L-ornithine-
L-serine-
L-threonine-
Glutamic acid +
Benzoic acid +
m-Hydroxybenzoic acid +
Sodium salicylate −
2,3-butylene glycol −
When these results were classified based on Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1986), it was not found that this strain belongs to the genus Pseudomonas, but these properties are consistent with the standard strain. Therefore, this strain was called Pseudomonas sp. SD810 strain (Pseudomonas sp. SD810).
[0026]
Pseudomonas sp. SD811 strain
Form;
(1) Shape and size of cells
0.7-0.9μm × 1.5-3.0μm
(2) There is mobility
(3) Gram staining negative
(4) Presence or absence of spores None
(5) Lysis positive by 3% KOH
Physiological activity;
(1) Aminopeptidase positive
(2) Oxidase positive
[0027]
(3) Catalase positive
(4) Indole production Negative
(5) Negative VP test
(6) Nitrate reduction Negative
(7) Negative denitrification reaction
(8) Use of citric acid (Simons) Positive
(9) Urease negative
(10) Phenylalanine deaminase negative
(11) Use of malonic acid Positive
(12) Production of levan from sucrose
(13) Lecithinase negative
(14) Starch hydrolysis negative
(15) Gelatin hydrolysis Negative
(16) Casein hydrolysis negative
(17) DNA hydrolysis negative
(18) Tween 80 hydrolysis positive
(19) Exrin hydrolysis negative
(20) Growth
Behavior to oxygen Absolute aerobic
Growth at 37 ° C-
Growth at 41 ° C-
Growth at pH 5.6 +
Growth on Mac-Conkey-Agar medium −
Growth on SS-Agar medium −
Growth on Cetrimid-Agar −
(21) Production of pigment
Non-diffusive negative
Diffusive negative
[0028]
Fluorescence negative
Pyrocyanine negative
(22) OF test Does not decompose sugar
(23) Acid generation
Glucose positive
Fructose positive
Xylose positive
(24) ONPG (β-galactosidase) negative
(25) Arginine dihydrolase negative
(26) Gas production from glucose Negative
(27) tyrosine degradation negative
(28) Growth factor requirement None
(29) Usability of various carbon compounds
Acetic acid +
Adipic acid −
Capric acid −
Citric acid −
Citraconic acid +
Glycolic acid +
Levulinic acid −
Maleic acid +
Malonic acid +
Mesaconic acid −
Muconic acid +
Phenylacetic acid +
Sugar acid +
Sebacic acid-
D-tartaric acid +
[0029]
m-tartaric acid-
L-arabinose +
Cellobiose −
Fructose +
D-Fucose +
Glucose +
Mannose −
Maltose −
Ribose +
Rhamnose +
Xylose −
Mannitol +
Gluconic acid −
2-ketogluconic acid +
N-acetylglucosamine +
Tryptamine −
Ethanolamine −
D-alanine-
L-ornithine-
L-serine-
L-threonine-
Glutamic acid +
Benzoic acid +
m-Hydroxybenzoic acid +
Sodium salicylate −
2,3-butylene glycol −
When the above results were similarly classified based on Burjay's bacterial classification, this strain belonged to the genus Pseudomonas, but it was not found that these properties were consistent with the standard strain. Therefore, this strain was called Pseudomonas sp. SD811 strain (Pseudomonas sp. SD811).
[0030]
Pseudomonas sp. SD812 stock
Form;
(1) Shape and size of cells
0.5-0.8μm × 1.5-3.0μm
(2) There is mobility
(3) Gram staining negative
(4) Presence or absence of spores None
(5) Lysis positive by 3% KOH
Physiological activity;
(1) Aminopeptidase positive
(2) Oxidase positive
(3) Catalase positive
(4) Indole production Negative
(5) Negative VP test
(6) Nitrate reduction Negative
(7) Negative denitrification reaction
(8) Use of citric acid (Simons) Positive
(9) Urease positive
(10) Phenylalanine deaminase negative
(11) Use of malonic acid Positive
(12) Production of levan from sucrose
(13) Lecithinase negative
(14) Starch hydrolysis negative
(15) Gelatin hydrolysis Negative
(16) Casein hydrolysis negative
(17) DNA hydrolysis negative
[0031]
(18) Tween 80 hydrolysis negative
(19) Exrin hydrolysis negative
(20) Growth
Behavior to oxygen Absolute aerobic
Growth at 37 ° C-
Growth at 41 ° C-
Growth at pH 5.6 +
Growth on Mac-Conkey-Agar medium −
Growth on SS-Agar medium −
Growth on Cetrimid-Agar −
(21) Production of pigment
Nondiffusive positive
Diffusive negative
Fluorescence negative
Pyrocyanine negative
(22) OF test Does not decompose sugar
(23) Acid generation
Glucose negative
Fructose negative
Xylose negative
(24) ONPG (β-galactosidase) negative
(25) Arginine dihydrolase negative
(26) Gas production from glucose Negative
(27) Tyrosine degradation positive
(28) Growth factor requirement None
(29) Usability of various carbon compounds
Acetic acid +
Adipic acid +
[0032]
Capric acid −
Citric acid +
Citraconic acid-
Glycolic acid +
Levulinic acid −
Maleic acid +
Malonic acid +
Mesaconic acid +
Muconic acid +
Phenylacetic acid +
Sugar acid +
Sebacic acid +
D-tartaric acid-
m-tartaric acid +
L-arabinose-
Cellobiose −
Fructose −
D-Fucose-
Glucose −
Mannose −
Maltose −
Ribose −
Rhamnose −
Xylose −
Mannitol −
Gluconic acid +
2-ketogluconic acid +
N-acetylglucosamine −
[0033]
Tryptamine −
Ethanolamine −
D-alanine +
L-ornithine-
L-serine-
L-threonine +
Glutamic acid +
Benzoic acid +
m-Hydroxybenzoic acid +
Sodium salicylate −
2,3-butylene glycol −
When the above results were similarly classified based on Burjay's bacterial classification, this strain belonged to the genus Pseudomonas, but it was not found that these properties were consistent with the standard strain. Therefore, this strain was designated as Pseudomonas sp. SD812 (Pseudomonas sp. SD812).
[0034]
Burkholderia SP SD816
Form;
(1) Cell shape Neisseria gonorrhoeae
(2) There is mobility
(3) Gram staining negative
(4) Presence or absence of spores None
(5) Flagella The state of growth unknown
Physiological activity;
(1) Oxidase positive
(2) Catalase positive
(3) Cleavage of protocatechinic acid ortho type
(4) Nitrate reduction Negative
[0035]
(5) Denitrification reaction negative
(6) PHB accumulation positive
(7) Starch hydrolysis negative
(8) Gelatin hydrolysis Negative
(9) Growth
Behavior to oxygen Absolute aerobic
Growth at 40 ° C +
(10) Production of pigment
Settlement color tone Does not produce characteristic settlement pigments
Formation of water-soluble dyes Negative
(11) OF test Does not decompose sugar
(12) Arginine dihydrolase negative
(13) Usability of various carbon compounds
Levulinic acid −
Mesaconic acid −
D-tartaric acid +
Ribose +
Rhamnose +
Xylose +
Tryptamine −
2,3-butylene glycol −
(14) Quinone Q-8
(15) GC content (mol%) of intracellular DNA 62
When the above results are classified based on the Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1986, 1994), this strain belongs to the genus Burkholderia, but it cannot be found that these properties match those of the standard strain. It was. Therefore, this strain was called Burkholderia sp. SD816 (Burkholderia sp. SD816).
[0036]
In the present invention, an α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond that can be suitably used is represented by the following general formula (1).
[Chemical formula 5]

Where R₁ Represents a halogen atom, preferably R₁ Examples thereof include a chlorine atom and a bromine atom. R₂ , R_Three Is independently a hydrogen atom, a halogen atom, a linear or branched aliphatic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a hydroxyl group, a carboxyl group, or a substituted group. Represents an aromatic group which may be substituted or a saturated or unsaturated nitrogen-containing, oxygen-containing or sulfur-containing heterocyclic group, and preferred R₂ , R_Three As an example, a hydrogen atom can be mentioned. R_Four Represents a hydroxyl group, a linear or branched alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, and a primary to tertiary amino group, and is preferably R_Four Examples thereof include a hydroxyl group.
[0037]
Specifically, α-chloroacrylic acid, α-bromoacrylic acid, 2-chloro-2-butenoic acid, 2-bromo-2-butenoic acid, 2-chloro-2-pentenoic acid, 2-bromo-2-pentene Examples thereof include acids, methyl esters and ethyl esters thereof, and α-chloroacrylic acid and α-bromoacrylic acid are preferable.
[0038]
The reaction method of the present invention comprises microorganisms belonging to the genus Pseudomonas or Burkholderia, and specific examples include microorganisms such as Pseudomonas sp. SD811 strain, Burkholderia sp. SD 816 strain, and the like. It is carried out by contacting a α-halocarbonyl compound having a heavy bond to reduce the carbon-carbon double bond to obtain a corresponding α-halo-α, β-saturated carbonyl compound.
[0039]
The reduction reaction of the carbon / carbon double bond of the α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond performed in the present invention is performed under the condition that the reducing power of the microorganism is stably expressed. Using any of the microorganisms obtained by culturing by the above-mentioned method in the culture solution of the microorganisms, or a processed product of microorganisms such as a cell-free extract obtained by crushing the cells obtained by the above-described method Can also be done.
[0040]
That is, when using the cells obtained by culturing, the α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond as a substrate is added to the culture solution at a concentration of 0.1% to 10%, preferably It is added continuously or batchwise to a concentration of 0.2% to 2%, cultured at a culture temperature of 15 ° C to 35 ° C, preferably 25 ° C to 30 ° C, and the corresponding α-halo in the culture solution. -Α, β-saturated carbonyl compounds can be produced.
[0041]
Alternatively, the cells collected by centrifuging from the culture obtained by culturing according to the above-described method are suspended in an appropriate solution, for example, a solution suspended in an aqueous solution such as a dilute pH buffer solution. The α-halocarbonyl compound having a β-carbon / carbon double bond is added continuously or batchwise to a concentration of, for example, 0.1% to 10%, and the reaction temperature is 15 ° C. to 35 ° C., preferably Is reacted at 25 to 30 ° C., reaction pH 6.0 to 9.0, preferably pH 6.5 to 7.3, and corresponding α-halo α, β in the cell suspension. -Saturated carbonyl compounds can be produced. The culture by the above-mentioned culture method is centrifuged to collect the cells, and α-halocarbonyl compound having α, β-carbon / carbon double bond as a substrate is, for example, 0.1% to 10% Concentration, preferably 0.2% to 2%, and contains an effective component for maintaining the pH of the reaction solution, preferably an aqueous buffer such as potassium phosphate or Tris / HCl in the range of 10 mM to 1 M. It can be suspended in the reaction solution and reacted at a reaction temperature of 15 ° C. to 50 ° C., preferably 28 ° C. to 35 ° C., to produce the corresponding α-halo-α, β-saturated carbonyl compound. The addition timing and rate or number of times of the α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond can be freely selected within a range in which the reaction is completed within the target time.
[0042]
In the case of using a processed product of microorganism, for example, a cell-free extract obtained by disrupting the cells collected by centrifuging the culture by the above-mentioned culture method by a method such as a French press is used as the substrate α , Β-carbon / carbon double bond-containing α-halocarbonyl compound has a concentration of 0.1% to 10%, preferably 0.2% to 2%, and is an effective component for maintaining the pH of the reaction solution. The reaction mixture is added to a reaction solution containing 10 mM to 1 M and reacted at a reaction temperature of 15 ° C. to 50 ° C., preferably 28 ° C. to 35 ° C., and the corresponding α-halo-α, β-saturated carbonyl compound Can be generated.
[0043]
Furthermore, in the present invention, a substance effective for maintaining the reducing activity of an α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond, such as a sugar or an organic acid that can be oxidized by the microorganism used. During the reaction of a compound, preferably glucose or L-lactic acid, alone or as a mixed solution with α-chloroacrylic acid, a concentration of 0.1% to 10%, preferably a concentration of 0.2% to 1% It can be made to react, adding continuously or batchwise. The addition ratio of α-chloroacrylic acid and these oxidizable substances can be arbitrarily selected between 1: 1 to 20: 1. The reaction time can be extended by the addition of this sugar or organic acid. This makes it possible to increase the concentration of the target product α-halo-α, β-saturated carbonyl compound in the reaction solution, which is preferable for isolating and obtaining the product. If the reaction is not in culture, the reaction can be carried out in either an aerobic or anaerobic environment. The ratio of the microbial cells or cell-free extract to the substrate α-β-carbon / carbon double bond α-halocarbonyl compound, or the timing, rate, or number of additions of the substrate is completed within the target time. It can be freely selected in such a range.
[0044]
In the present invention, an α-halo-α, β-saturated carbonyl compound produced by reduction of an α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond is a metabolic intermediate for the microorganism used. Further degradation may occur. For example, α-chloropropionic acid produced from α-chloroacrylic acid is degraded relatively quickly in some microorganisms. In such cases, use a mutant strain that has lost its degradation activity, or stop the degradation reaction by lowering the pH value, heating the cells or cell-free extract, or adding an appropriate degrading enzyme inhibitor. Can do. For example, Pseudomonas sp. SD811 strains rapidly produce α-chloropropionic acid produced in a culture solution or reaction solution under conditions that usually give an optimum rate of producing α-chloropropionic acid from α-chloroacrylic acid. Since the decomposition rate, the conversion rate from α-chloroacrylic acid to α-chloropropionic acid decreases, but the pH range of the optimal reaction in the α-chloropropionic acid production stage from α-chloroacrylic acid is pH 5.0-7.0, the optimum reaction pH range for the decomposition stage of α-chloropropionic acid is pH 7.0-7.3, and the optimum reaction pH for the decomposition stage of α-chloropropionic acid. The range of pH is high, so that α-chloropropionic acid is produced by carrying out the reaction in the pH range of the optimum reaction in the low α-chloropropionic acid production stage of pH 5.0 to 7.0. The amount can be increased. In addition, it is known that one of the enzymes that degrade α-chloropropionic acid is effectively inhibited by hydroxylamine (Soda K. et. Al., J. Biol. Chem. 272,3363- 3368, 1997), also in the present invention, the decomposition reaction can be inhibited by adding an appropriate amount of hydroxylamine to the culture solution or reaction solution.
[0045]
Furthermore, the microbial cells or cell-free extract used in the present invention can be used by being immobilized on various immobilization carriers by a conventional method such as adsorption, entrapment, and crosslinking. The type of carrier is not particularly limited, and for example, polysaccharide materials such as cellulose, polymer materials, protein materials such as collagen, and the like can be used.
[0046]
The α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond used in the present invention is a prochiral molecule with respect to the α-position, but by reducing the carbon / carbon double bond, the absolute configuration at the α-position is obtained. The corresponding α-halo-α, β-saturated carbonyl compound in the S form can be prepared.
[0047]
The method for culturing microorganisms used in the present invention is not particularly limited as long as general aerobic microorganisms can grow, and any carbon source can be used as long as the above microorganisms can be used. , Saccharides, acetic acid, lactic acid, and mixtures thereof. As the nitrogen source, for example, ammonium salts such as ammonium sulfate and ammonium phosphate, nitrogen-containing compounds such as meat extract and yeast extract, and mixtures thereof can be used.
[0048]
In addition to the above-mentioned components, nutrient media used for normal culture, for example, inorganic salts, trace metal salts, vitamins, and the like can be appropriately mixed and used for the medium. Furthermore, factors that promote the growth of microorganisms, components that are effective for maintaining the pH of the medium, and the like can be added as necessary. In addition, an effective compound for increasing the reducing activity of a microorganism, for example, an α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond such as α-chloroacrylic acid, alone or as a carbon source, It can be used by mixing with a plurality of carbon sources.
[0049]
The microorganisms used in the present invention can be cultured under aerobic conditions used for culturing most aerobic or facultative anaerobic bacteria. For example, the culture can be performed under conditions of pH 5.5 to 8.0, preferably pH 6.5 to 7.0, culture temperature 15 ° C. to 35 ° C., preferably 25 ° C. to 30 ° C. The culture time is, for example, 1 to 144 hours, preferably 12 hours to 72 hours.
[0050]
The α-halo-α, β-saturated carbonyl compound produced in the present invention can be obtained using a conventional purification method such as solvent extraction or distillation. For example, α-chloropropionic acid produced from α-chloroacrylic acid can be obtained by subjecting it to an organic solvent extraction, distillation or the like from a culture solution or a reaction solution. An α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond is a prochiral molecule at the α-position, but the chiral α-halo-α, β-saturated carbonyl produced by the reduction method of the present invention. The purity of the enantiomers of the compounds is advantageously determined by GC, HPLC or polarimeter on chiral column materials.
[0051]
As described above, since the present invention uses an aerobic or facultative anaerobic bacterium, the α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond excellent in economic efficiency, operability, and process safety. The carbon-carbon double bond is reduced and the corresponding absolute configuration S-form α-halo-α, β-saturated carbonyl compound is produced.
[0052]
【Example】
In the following examples, the present invention will be described in more detail, but the present invention is not limited to these examples.
[0053]
Example 1
Detection of reduction activity of α-halocarbonyl compounds with α, β-carbon / carbon double bonds
Yeast extract (0.5 g / l), ammonium sulfate (2 g / l), sodium dihydrogen phosphate (1 g / l), dipotassium hydrogen phosphate (1 g / l), magnesium sulfate (0.1 g / l) A basic medium (some microorganisms that prefer high salt concentration grow with the basic medium added with sodium chloride at a concentration of 10 to 20% as a basic medium) and α-chloro as a carbon source. Using a medium supplemented with 0.2% of acrylic acid or α-chloro-α, β-butenoic acid, the microorganisms isolated by enrichment culture or acclimatization enrichment culture are cultured at 30 ° C., and corresponding reduction production in the culture solution The presence of α-chloropropionic acid and α-chlorobutyric acid, which are the products, was examined using gas chromatography. At a specific time point, 0.5 ml of a sample was collected, and 0.4 ml of 2N HCl was mixed with 0.4 ml of supernatant obtained by centrifuging to remove bacterial cells, and then analyzed under the following conditions.
[0054]
Main body; GC-7A (Shimadzu Corporation)
Column; Thermon-3000 / SHINCARBON A 2.6mm x 2.1m
Carrier gas; nitrogen 50 ml / min.
Detection; FID
Column temperature: 200 ° C (constant)
Injection; 2-10 microliter, 260 ° C
Record; Chromatocoder 12 (SIC)
As a result of the detection, α-chloropropion, which is a reduction product, is consumed in the culture solution of a plurality of microorganisms immediately after the start of the culture, with the consumption of α-chloroacrylic acid or α-chloro-α, β-butenoic acid. A peak appeared at the position of acid or α-chlorobutyric acid. When this peak was analyzed by GC-MS, it coincided with the mass spectrum of α-chloropropionic acid or α-chlorobutyric acid as a standard substance, which proved that it was α-chloropropionic acid and α-chlorobutyric acid. . Identification of the genus of microorganisms that produced reduction products in the culture revealed that microorganisms of various genera have this reduction activity.
[0055]
Microorganisms recognized as active are Acetobacter genus, Actinomyces genus, Acinetobacter genus, Agrobacterium genus, Aeromonas genus, Alcaligenes genus, Alcaligenes genus, Arthrobacter genus, Azotobacter genus, Bacillus genus, Brevibacterium genus, Burkholderia genus, Cellulomonas genus, Corynebacterium genus, Corynebacterium genus, Enterobacter genus, Enterococcus genus, Escherichia genus, Flavobacterium genus, Gluconobacter genus, Halobacterium genus, Halococcus genus, Klebsil (Klebsiella), Lactobacillus, microbacteria Microbacterium genus, Micrococcus genus, Micropolyspora genus, Mycobacterium genus, Nocardia genus, Pseudomonas genus, Pseudonocardia genus, Rhodococcus genus, Rhodobacter genus, Serratia genus, Staphylococcus genus, Streptococcus genus, Streptomyces genus, Xanthomonas genus or aerobic genus It was a facultative anaerobic bacterium. In particular, many strains were observed in the genus Pseudomonas, and the amount of reduction products was relatively large in microorganisms belonging to the genus Pseudomonas and Burkholderia. Since the reduction products found in the culture broth were very small (0.01% or less) in any of the strains, the product accumulation conditions were optimized for the superior strains.
[0056]
Example 2
(1) Culture of Pseudomonas sp. SD811 strain
Pseudomonas sp. SD811 strain was cultured in the following medium (amount g / l): α-chloroacrylic acid (2), yeast extract (0.5), ammonium sulfate (2), sodium dihydrogen phosphate (1 ), Dipotassium hydrogen phosphate (1), magnesium sulfate (0.1). The medium was prepared as follows. Among the above components, all components except α-chloroacrylic acid and magnesium sulfate were dissolved in 950 ml of water to adjust the pH value to 7.0, placed in a 5 l flask, and sterilized at 121 ° C. for 20 minutes. Subsequently, after the temperature of the medium is lowered to about 70 ° C., a solution prepared by dissolving α-chloroacrylic acid and magnesium sulfate in 50 ml of water and adjusting the pH value to 7.0 is sterilized with a sterilizing filter and then mixed. did. Without further supplying oxygen or adjusting the pH, this medium was inoculated with a 5% preculture (OD660 nm = 1.10) and the strain was cultured at 30 ° C.
[0057]
(2) Detection of α-chloropropionic acid in α-chloroacrylic acid culture solution
In culture using the above-mentioned Pseudomonas sp. SD811 strain α-chloroacrylic acid, 0.5 ml of a sample was collected at a specific time point, and centrifuged to 0.4 ml of the supernatant after removing the cells. After mixing 4 ml of 2N HCl, analysis was performed under the conditions indicated in Example 1.
[0058]
As a result of the above detection, a peak appears at the position of α-chloropropionic acid in the culture solution of Pseudomonas sp. Was about 0.02% of the culture solution and about 10% conversion to the substrate α-chloroacrylic acid at the maximum.
[0059]
Example 3
(1) Cell suspension reaction-1 using α-chloroacrylic acid as a substrate
A culture obtained by culturing the above-mentioned Pseudomonas sp. SD811 strain at a scale of 1/10 of the method of Example 2 was subjected to centrifugation, and the cells were collected. This cell was suspended in 20 ml of a solution containing 0.2% α-chloroacrylic acid and 100 mM phosphate buffer (pH 7.3) (adjusted to pH 7.3) and reacted by shaking at 28 ° C. .
[0060]
A 0.5 ml sample was collected from the reaction solution at a specific time, and 0.4 ml of the supernatant obtained by centrifuging to remove the cells was mixed with 0.1 ml of 6N HCl, and then with 0.4 ml of ethyl acetate. When the product was extracted and the extracted sample was analyzed by the method of Example 1, a peak appeared at the position of α-chloropropionic acid with the consumption of α-chloroacrylic acid in the reaction solution. The maximum production amount was about 0.05% of the reaction solution, and the conversion rate to the substrate α-chloroacrylic acid was about 25%.
[0061]
(2) Isolation of α-chloropropionic acid from cell suspension reaction using α-chloroacrylic acid as a substrate
The cells obtained by culturing the Pseudomonas sp. SD811 strain (Pseudomonas sp. SD811) on the 1/5 scale of the method of Example 1 by centrifugation were collected. Suspended in 100 ml of a solution containing 2% potassium phosphate-sodium hydroxide buffer 100 mM (adjusted to pH 7.3) and stirred at 28 ° C. for reaction. When α-chloroacrylic acid disappeared during the reaction, 0.2% α-chloroacrylic acid in the reaction solution was further added to continue the reaction. At a specific time point, a 0.5 ml sample was taken, the product was extracted and separated by the method of Example 3, and the production amount of α-chloropropionic acid was monitored by the method of Example 1. About 9 hours later, when α-chloroacrylic acid in the reaction solution could not be detected, the reaction was terminated, and the whole amount of the reaction solution was subjected to centrifugation to remove the cells. To 95 ml of the resulting supernatant, 20 ml of 6N HCl was added, and the product was extracted with 95 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with 100 ml of saturated brine, and then concentrated by removing the ethyl acetate with an evaporator. When the concentrated sample was analyzed by the method of Example 1, trace amounts of α-chloroacrylic acid and α-chloropropionic acid were detected, and the total amount of α-chloropropionic acid contained in the concentrated sample was about 100 mg, and the substrate α-chloro The conversion rate with respect to acrylic acid was about 25%.
[0062]
Example 4
(1) Methylation of α-chloropropionic acid
When optical resolution is performed using an optical resolution GC column, the unmodified carboxylic acid often has poor separability on the GC column due to the influence of the carboxyl group, so that the product is methyl esterified by the boron trifluoride-methanol complex method. Went. That is, after adding 4 ml of methanol to 3 mg of α-chloropropionic acid, further adding 1 ml of 14% methanol solution of boron trifluoride-methanol complex and refluxing on an oil bath at 80 ° C. for 1 hour with stirring. did. After 1 hour, 30 ml of water was added to the reaction solution, and the reaction product was extracted with 10 ml of ethyl acetate, and then the ethyl acetate was distilled off with an evaporator to concentrate the total amount of the sample to about 0.1 ml. When the concentrated sample was analyzed in the method of Example 1 under the condition where only the column temperature was 120 ° C., one main peak was observed at the position of α-chloropropionic acid methyl ester. This peak was analyzed by GC-MS and confirmed to be α-chloropropionic acid methyl ester.
(2) Optical resolution GC analysis of α-chloropropionic acid
The S-form and R-form α-chloropropionic acid methylated by the above method could be well separated under the following analysis conditions.
[0063]
Body: GC-14A (Shimadzu Corporation)
Column; CP-Chirasil-DEX-DEX CB
0.32 mm ID x 25 m df = 0.25 mm
(GL Science Co., Ltd.)
Carrier gas; He, 0.38 kg / cm²
Detection; FID 275 ° C
Column temperature: 70 ° C (constant)
Injection; 0.1-0.2 microliter
split about 1: 100, 250 ℃
Record; Chromatopack C-R6A (Shimadzu Corporation)
When α-chloropropionic acid methyl ester obtained from the reaction solution of Example 3 was analyzed under these conditions, a peak was found only at the position of S-form α-chloropropionic acid methyl ester, and its optical purity was 99% or more. Met.
[0064]
Example 5
Cell suspension reaction -2 using α-chloroacrylic acid as substrate
The culture obtained by culturing the Pseudomonas sp. SD811 strain at a scale of 1/10 of the method of Example 2 was subjected to centrifugation to recover the cells, and the cells were recovered from α-chloroacrylic acid. The suspension was suspended in 20 ml of a solution containing 0.2% phosphate buffer 100 mM (pH 5.7) (adjusted to pH 5.7) and reacted by shaking at 28 ° C. A 0.5 ml sample was collected from the reaction solution at a specific time point, and 0.4 ml of the supernatant obtained by centrifuging to remove the cells was mixed with 0.1 ml of 6N HCl, and then with 0.4 ml of ethyl acetate. When the product was extracted and the extracted sample was analyzed by the method of Example 1, a peak appeared at the position of α-chloropropionic acid with the consumption of α-chloroacrylic acid in the reaction solution. The maximum production amount was about 0.08% of the reaction solution, and the conversion rate to the substrate α-chloroacrylic acid was about 41%.
[0065]
Example 6
Creation of non-degradable mutants of α-chloropropionic acid
Cultures obtained by culturing Pseudomonas sp. SD811 strain and Burkholderia sp. SD 816 strain at a scale of 1/200 of the method of Example 2 were subjected to centrifugation, and the cells were collected, respectively. Washed with water. N-methyl-N'-nitro-N- is added to a cell suspension obtained by resuspending the washed cells in 1 ml of 10 to 100 mM phosphate buffer (pH 7) so that the final concentration is 50 to 100 ppm. Nitrosoguanidine (NTG) was added and treated at room temperature for 2-20 minutes. The treated cell suspension is centrifuged to collect the cells, washed with sterilized physiological saline, and the whole amount is L medium (polypeptone 10 g / l, yeast extract 5 g / l, sodium chloride 5 g / l). PH 7) Inoculated into 5 ml and cultured with shaking at 28 ° C. all day and night. After completion of the culture, the culture was centrifuged to collect the cells, suspended in a 20% glycerin solution, then aliquoted into appropriate amounts and frozen to obtain glycerin stocks for selection of mutants.
[0066]
Example 7
Selection of non-degradable mutants of α-chloropropionic acid
The glycerin stock for selection of the mutant strain was inoculated into 5 ml of the medium used in the method of Example 2 and cultured at 28 ° C. for 5 hours. When the turbidity increased several times, penicillin G was added to the culture solution to a final concentration of 100 to 1000 ppm, and the culture was continued at 28 ° C. The culture solution after culturing for 5 to 16 hours is centrifuged to collect the cells, washed twice with sterilized physiological saline, inoculated into 5 ml of L-broth, and shaken at 28 ° C. all day and night. Cultured.
[0067]
Of the medium used in Example 2, the culture solution was diluted to a medium obtained by adding 2% agar to a medium in which α-chloroacrylic acid as a carbon source was replaced with an equal amount of lactic acid. Then, it was applied and cultured at 28 ° C. One to two days later, colonies formed on the plate were replicated in a plate obtained by adding 2% agar to the medium used in Example 2, and cultured at 28 ° C. for 1-2 days. Strains that grew on the lactic acid plate and did not grow on the α-chloroacrylic acid plate were isolated as candidates for non-degradable mutants of α-chloropropionic acid.
[0068]
The isolated candidate strain was inoculated into 5 ml of medium containing 2 g / l of lactic acid as a viable carbon source in the medium used in Example 2, and cultured with shaking at 28 ° C. When the culture broth was analyzed by the method of Example 1, the maximum production amount of α-chloropropionic acid produced in the culture varied depending on the candidate strain, but the Pseudomonas sp. SD811 strain was varied. The maximum strain is about 0.17% of the culture solution, the conversion rate to the substrate α-chloroacrylic acid is about 85%, and the Burkholderia sp. SD816 strain is about 0.15% of the culture solution. %, And the conversion rate with respect to the substrate α-chloroacrylic acid was about 75%. These strains were selected as α-chloropropionic acid non-degradable mutants.
[0069]
Example 8
Cell suspension reaction using α-chloroacrylic acid as substrate-3
The α-chloropropionic acid non-degradable mutant strain of Pseudomonas sp. SD811 and the α-chloropropionic acid non-degradable mutant strain of Burkholderia sp. SD816 strain were the same as those used in Example 7, respectively. A culture obtained by culturing in a medium is subjected to centrifugation to collect microbial cells, and these microbial cells are mixed with a solution containing 0.2% α-chloroacrylic acid and 100 mM phosphate buffer (pH 7.3) ( (Adjusted to pH 7.3) Each was suspended in 20 ml and reacted by shaking at 28 ° C.
[0070]
A 0.5 ml sample was collected from the reaction solution at a specific time point, and 0.4 ml of the supernatant obtained by centrifuging to remove the cells was mixed with 0.1 ml of 6N HCl, and then with 0.4 ml of ethyl acetate. When the product was extracted and the extracted sample was analyzed by the method of Example 2, a peak appeared at the position of α-chloropropionic acid in the reaction solution with the consumption of α-chloroacrylic acid. When α-chloroacrylic acid disappears from the reaction solution, the production amount is about 0.19% of the reaction solution of Pseudomonas sp. SD811 strain, and the conversion rate to the substrate α-chloroacrylic acid. It was about 95%, and about 0.2% and about 100% in the mutant strain of Burkholderia sp. SD816, respectively. None of the strains produced α-chloropropionic acid decreased with time. As a result of analyzing the optical activity of this α-chloropropionic acid according to the method of Example 4, both were S-forms and the optical purity was 99% or more.
[0071]
Example 9
Cell suspension reaction using α-chloroacrylic acid as substrate-4
The α-chloropropionic acid non-degradable mutant strain of Pseudomonas sp. SD811 and the α-chloropropionic acid non-degradable mutant strain of Burkholderia sp. SD816 strain were used as the basic media used in Example 2, respectively. The culture obtained by culturing in 100 ml of a medium supplemented with 0.2% glucose as a carbon source is subjected to centrifugation to recover the cells, and the cells are mixed with 0.2% α-chloroacrylic acid, phosphorus Each suspension was suspended in 20 ml of a solution containing 100 mM of acid buffer (pH 7.3) (adjusted to pH 7.3) and reacted by shaking at 28 ° C.
[0072]
A 0.5 ml sample was collected from the reaction solution at a specific time point, and 0.4 ml of the supernatant obtained by centrifuging to remove the cells was mixed with 0.1 ml of 6N HCl, and then with 0.4 ml of ethyl acetate. The product was extracted and the extracted sample was analyzed by the method of Example 1. As a result, after the lag time of several hours at the beginning of the reaction, the α-chloroacrylic acid was consumed in the reaction solution. A peak appeared at the position of chloropropionic acid. When α-chloroacrylic acid disappears from the reaction solution, the production amount is about 0.19% of the reaction solution of Pseudomonas sp. SD811 strain, and the conversion rate to the substrate α-chloroacrylic acid. It was about 95%, and about 0.2% and about 100% in the mutant strain of Burkholderia sp. SD816, respectively.
[0073]
Example 10
Culture with jar fermenter
An α-chloropropionic acid non-degradable mutant of Burkholderia sp. SD816 strain was prepared in 100 ml of a medium (5 × medium, pH 7.0) in which the medium used in Example 9 was 5 times the concentration of the medium components. The culture broth that had been cultured for a period of time was inoculated into 2 L of 5 × medium spread on a 5 L jar fermenter, and cultured at 28 ° C., 800 rpm, and aeration rate of 1 ml / min. When about 15 to 20 hours have elapsed after the start of the culture, all of the initial input glucose is consumed. Therefore, the glucose 5-20% / ammonium sulfate 5-15% / yeast extract 1-5% solution is used alone or as a mixture, Additional additions were made continuously with a peristalk pump. During this time, the addition rate was adjusted so that the glucose concentration was kept between 0.02 and 2%. The culture solution pH was adjusted to be maintained between 6.3 and 7.3 with a 20% aqueous ammonia solution. The OD660nm when cultured by this method for about 30 to 48 hours was about 30 to 50.
[0074]
Example 11
Cell suspension reaction using α-chloroacrylic acid as substrate-5
The α-chloropropionic acid non-degradable mutant strain of Burkholderia sp. SD816 strain was cultured according to the method of Example 10. 48-72 hours after the start of culture, the addition of α-chloroacrylic acid is added to the culture solution that has stopped growing by stopping the addition of glucose and the like so that the final concentration is about 0.2%, and the reaction is performed under the same conditions as in the culture. I let you. 0.5 ml of a sample is collected at a specific time point, and 0.4 ml of 2N HCl is mixed with 0.4 ml of supernatant obtained by centrifuging to remove cells, and then α-chloroacrylic acid in the solution is subjected to the following conditions. The concentration was quantified.
[0075]
Main body; LC-9A (Shimadzu Corporation)
Column; ODSpak F-511 / 4.6mm x 250mm (Shodex)
Eluent: acetonitrile / water = 2/8 + 0.1% trifluoroacetic acid, 1 ml / min
Detection; SPD-6AV UV-VIS Spectrophotometer (Shimadzu Corporation), 256nm
Column temperature; 25 ° C
Injection; Autosampler Model123 (SIC)
20 microliter sample loop included
Record; Chromatocoder 12 (SIC)
In this reaction, α-chloroacrylic acid began to be consumed after a lag time of 3 to 7 hours at the beginning of the reaction. When the concentration of α-chloroacrylic acid was about 0.02%, α-chloroacrylic acid was further added so that the concentration of α-chloroacrylic acid was about 0.2%. This operation was repeated until the consumption of α-chloroacrylic acid substantially stopped. The accumulated production amount of α-chloropropionic acid 32 hours after the reaction was substantially stopped was about 1.0 to 1.2% of the reaction solution, and the conversion rate to the substrate α-chloroacrylic acid was about 97%. Met. The optical activity of the accumulated α-chloropropionic acid was analyzed according to the method of Example 4. As a result, it was S form, and its optical purity was 99% or more.
[0076]
Example 12
Cell suspension reaction using α-chloroacrylic acid as substrate-6
The culture obtained by culturing the α-chloropropionic acid non-degradable mutant strain of Burkholderia sp. SD816 strain according to the method of Example 10 for 48 to 72 hours was subjected to centrifugation to recover the cells. This cell is suspended in 2 l of a solution (adjusted to pH 7.1) containing 0.2% α-chloroacrylic acid and 60 mM phosphate buffer (pH 7.1), 28 ° C., 800 rpm, aeration rate 1 ml / min. It was made to react with. At a specific time point, 0.5 ml of a sample is collected, and 0.4 ml of 2N HCl is mixed with 0.4 ml of the supernatant obtained by centrifuging to remove the bacterial cells, and then α in the liquid is mixed by the method described in Example 11. -The chloroacrylic acid concentration was quantified.
[0077]
In this reaction, α-chloroacrylic acid began to be consumed after a lag time of 5 to 10 hours at the beginning of the reaction. When the concentration of α-chloroacrylic acid reached about 0.02%, α-chloroacrylic acid was additionally added so that the concentration of α-chloroacrylic acid was 0.2%. This operation was repeated until the consumption of α-chloroacrylic acid substantially stopped. The accumulated production amount of α-chloropropionic acid after 28 hours after the reaction was substantially stopped was about 0.8 to 1.0% of the reaction solution, and the conversion rate to the substrate α-chloroacrylic acid was about 98%. Met.
[0078]
Example 13
Cell suspension reaction using α-chloroacrylic acid as substrate-7
The culture obtained by culturing the α-chloropropionic acid non-degradable mutant strain of Burkholderia sp. SD816 strain according to the method of Example 10 for 48 to 72 hours was subjected to centrifugation to recover the cells. The cells were suspended in 2 l of a solution (adjusted to pH 7.1) containing 60 mM phosphate buffer (pH 7.1). To this cell suspension, a 5 to 10% α-chloroacrylic acid solution was added little by little using a peristalk pump, and reacted at 28 ° C., 800 rpm, and aeration rate of 1 ml / min. At a specific time point, 0.5 ml of a sample is collected, and 0.4 ml of 2N HCl is mixed with 0.4 ml of the supernatant obtained by centrifuging to remove the bacterial cells, and then α in the liquid is mixed by the method described in Example 11. -The chloroacrylic acid concentration was quantified.
[0079]
In this reaction, α-chloroacrylic acid began to be consumed after a lag time of 5 to 10 hours at the beginning of the reaction. The addition speed of the α-chloroacrylic acid solution was adjusted according to the consumption speed so that the concentration of α-chloroacrylic acid was between about 0.02 and 0.2%, preferably around 0.1%. This operation was continued until the consumption of α-chloroacrylic acid substantially stopped. The accumulated production amount of α-chloropropionic acid 24 hours after the reaction was substantially stopped was about 0.8 to 1.2% of the reaction solution, and the conversion rate to the substrate α-chloroacrylic acid was about 95%. Met.
[0080]
Example 14
Cell suspension reaction using α-chloroacrylic acid as substrate-8
The culture obtained by culturing the α-chloropropionic acid non-degradable mutant strain of Burkholderia sp. SD816 strain according to the method of Example 10 for 48 to 72 hours was subjected to centrifugation to recover the cells. The cells were suspended in 2 l of a solution (adjusted to pH 7.1) containing 60 mM phosphate buffer (pH 7.1). To this cell suspension, a 5 to 10% α-chloroacrylic acid solution was added little by little using a peristalk pump, and reacted at 28 ° C., 800 rpm, and aeration rate of 1 ml / min. At the same time, a 5 to 10% glucose solution or a 5 to 10% sodium lactate solution was added in small amounts by itself or as a mixed solution with α-chloroacrylic acid using a peristack pump. The ratio of α-chloroacrylic acid to these oxidizable substances was adjusted to be in the range of 1: 1 to 20: 1. At a specific time point, 0.5 ml of a sample is collected, and 0.4 ml of 2N HCl is mixed with 0.4 ml of the supernatant obtained by centrifuging to remove the bacterial cells, and then α in the liquid is mixed by the method described in Example 11. -The chloroacrylic acid concentration was quantified. When glucose was added, the glucose analyzer was used, and when lactic acid was added, the concentration was quantified using lactate dehydrogenase. The pH of the reaction system was adjusted to 6.5 to 7.3 using 20% aqueous ammonia and 2N HCl.
[0081]
In this reaction, α-chloroacrylic acid began to be consumed after a lag time of 5 to 10 hours at the beginning of the reaction. The oxidizable substance was consumed quickly immediately after the start of the reaction. The addition speed of the α-chloroacrylic acid solution is adjusted according to the consumption speed so that the concentration of α-chloroacrylic acid is about 0.02 to 0.2%, preferably around 0.1%, At the same time, the addition amount was adjusted so that the concentration of the oxidizable substance did not exceed 0.4%. This operation was continued for about 60 hours. This reduction reaction was remarkably sustained by the coexistence of oxidizable substances, and proceeded at a constant rate even after about 60 hours. The accumulated production amount of α-chloropropionic acid after 60 hours was about 2.8 to 3.2% of the reaction solution, and the conversion rate to the substrate α-chloroacrylic acid was about 99% or more.
[0082]
Example 15
Cell suspension reaction using α-chloroacrylic acid as substrate-9
The culture obtained by culturing the α-chloropropionic acid non-degradable mutant strain of Burkholderia sp. SD816 strain according to the method of Example 10 for 48 to 72 hours was subjected to centrifugation to recover the cells. The cells were suspended in 2 l of a solution (adjusted to pH 7.1) containing 60 mM phosphate buffer (pH 7.1). To this cell suspension, a mixed aqueous solution of 10% α-chloroacrylic acid and 10% glucose was added little by little using a peristalk pump, and reacted at 28 ° C., 800 rpm, and aeration rate of 1 ml / min. It was. At a specific time point, 0.5 ml of a sample is collected, and 0.4 ml of 2N HCl is mixed with 0.4 ml of supernatant obtained by centrifuging to remove bacterial cells. -The chloroacrylic acid concentration was quantified. The glucose concentration was quantified by subjecting the reaction supernatant obtained by centrifugation to a glucose analyzer as the stock solution. The pH of the reaction system was adjusted to 6.5 to 7.3 using 20% aqueous ammonia and 2N HCl. In this reaction, α-chloroacrylic acid began to be consumed after a lag time of 6 to 12 hours at the beginning of the reaction. Glucose was consumed particularly quickly immediately after the start of the reaction, but was consumed at a constant rate after the reduction activity was stabilized. The mixed solution while taking care not to exceed the glucose concentration of 0.4% at the same time so that the concentration of α-chloroacrylic acid is between about 0.02 and 0.2%, preferably around 0.1% The addition speed of was adjusted. This operation was continued for about 60 hours. This reduction reaction was remarkably sustained by the coexistence of glucose and proceeded at a constant rate even after about 60 hours. The conversion rate with respect to α-chloropropionic acid after 60 hours was about 99% or more.
[0083]
Example 16
Cell suspension reaction using α-chloroacrylic acid as substrate-10
A culture obtained by culturing an α-chloropropionic acid non-degradable mutant strain of Burkholderia sp. SD816 strain at a half scale of the method of Example 10 for 48 to 72 hours was subjected to centrifugation. The cells were collected, and the cells were suspended in 1 l of a solution containing 0.2% α-chloroacrylic acid, 0.2% glucose and 60 mM phosphate buffer (pH 7.1) (adjusted to pH 7.1). It became cloudy and reacted at 28 ° C., 800 rpm, and aeration rate of 1 ml / min. At the end of the lag time of 5 to 10 hours after the start of the reaction, the aeration was changed from air to nitrogen gas, and then the reaction was performed in an anaerobic environment. At a specific time point, 0.5 ml of a sample is collected, and 0.4 ml of 2N HCl is mixed with 0.4 ml of the supernatant obtained by centrifuging to remove the bacterial cells, and then α in the liquid is mixed by the method described in Example 11. -The chloroacrylic acid concentration was quantified. At the same time, the glucose concentration was quantified with a glucose analyzer. The pH of the reaction system was adjusted to 6.5 to 7.3 using 20% ammonia and 2N HCl.
[0084]
In this reaction, α-chloroacrylic acid began to be consumed after a lag time of 5 to 10 hours at the beginning of the reaction. When the concentration of α-chloroacrylic acid reaches about 0.02%, α-chloroacrylic acid has a concentration of 0.2% and glucose has a concentration of about 0.1%. Additional chloroacrylic acid or glucose was added. This operation was continued for about 60 hours. This reduction reaction was remarkably sustained by the coexistence of oxidizable substances, and proceeded at a constant rate even after about 60 hours. In addition, glucose consumption decreased sharply immediately after the reaction system was moved from an aerobic environment to an anaerobic environment, and the total consumption was about 1/10 or less of the reaction in an aerobic environment. The accumulated production amount of α-chloropropionic acid after 60 hours was about 2.5 to 3.2% of the reaction solution, and the conversion rate with respect to the substrate α-chloroacrylic acid was about 99% or more.
[0085]
【The invention's effect】
Since the present invention uses an aerobic bacterium or facultative anaerobic bacterium, the carbon of the α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond excellent in economic efficiency, operability and process safety. Provided is a method for reducing a carbon double bond to produce the corresponding α-halo-α, β-saturated carbonyl compound. Furthermore, by reducing the carbon / carbon double bond of a prochiral α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond, the high-purity absolute configuration S useful as a chiral building block for medical and agricultural chemicals. A method for producing a body α-halo-α, β-saturated carbonyl compound is provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an example of accumulated production of α-chloropropionic acid with and without the addition of an oxidizable substance.
FIG. 2 shows an example of comparison of accumulated production amount of α-chloropropionic acid when glucose is not added and when glucose is added.

Claims (19)

The α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond is categorized into an Acetobacter genus, Actinomyces genus, Acinetobacter genus, Agrobacterium genus, Aeromonas genus ), Alcaligenes genus, Arthrobacter genus, Azotobacter genus, Bacillus genus, Brevibacterium genus, Burkholderia genus, Cellulomonas Genus, Corynebacterium, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Flavobacterium, Gluconobacter, Halobacterium ), Halococcus, Klebsiella, Lacto bacillus genus, Microbacterium genus, micrococcus genus, Micropolyspora genus, Mycobacterium genus, Nocardia genus, Pseudomonas genus, Pseudomonas genus, Pseudomonas genus Pseudonocardia, Rhodococcus, Rhodobacter, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces (X), Xanthomonas (X) An α-halo-α characterized by producing an S-form compound having a chiral α-position by reducing the α, β-carbon / carbon double bond using a microorganism belonging to any genus or a processed product thereof , Β-saturated carbonyl compound production method. An α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond is reduced using a microorganism belonging to the genus Pseudomonas or a processed product thereof, and the α, β-carbon / carbon double bond is reduced. The method for producing an α-halo-α, β-saturated carbonyl compound according to claim 1. Reduction of an α, β-carbon / carbon double bond using an α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond using a microorganism belonging to the genus Burkholderia or a processed product thereof The method for producing an α-halo-α, β-saturated carbonyl compound according to claim 1. The microorganisms belonging to the genus Pseudomonas are Pseudomonas sp. SD810 strain (Pseudomonas sp. SD810) (FERM BP-6767) , Pseudomonas sp. SD811 strain (Pseudomonas
sp.SD811) (FERM BP-6768) , or Pseudomonas sp. SD812 strain (Pseudomonas sp. SD812) (FERM BP-6769) . The production method according to claim 3, wherein the microorganism belonging to the genus Burkholderia is Burkholderia sp. SD816 (FERM BP-6770) . The method according to claim 3, wherein the microorganism belonging to the genus Burkholderia is an α-chloropropionic acid non-degradable mutant strain of Burkholderia sp. SD816 (FERM BP-6770). . An α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond is represented by the following general formula (1):

(In the formula, R ₁ represents a halogen atom, R ₂ and R ₃ are independently a hydrogen atom, a halogen atom, a linear or branched aliphatic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, or 1 to 6 carbon atoms. A linear or branched alkoxy group, a hydroxyl group, a carboxyl group, an optionally substituted aromatic group or a nitrogen-containing, oxygen-containing or sulfur-containing heterocyclic group, and R ₄ is a hydroxyl group having 1 to 3 represents a linear or branched alkoxy group or a primary to tertiary amino group), and an α-halo-α, β-saturated carbonyl compound is represented by the following general formula (2):

(Wherein R _{1 to} R ₄ represent the same meaning as described above), and the method for producing an α-halo-α, β-saturated carbonyl compound according to any one of claims 1 to 6. . Compound represented by the general formula (1) is, alpha-halo acrylic acid, the general formula (2) compound represented by the according to claim 7, which is alpha-halopropionyl absolute configuration S alpha-halo - A method for producing an α, β-saturated carbonyl compound. The production method according to claim 8 , wherein the halogen atom is a bromine atom or a chlorine atom. The process according to any one of claims 1 to 9 , wherein the processed microorganism is a microorganism culture, a microorganism extract, a microorganism cell suspension, or a microorganism fixed body. 11. The product according to claim 1, wherein the amount of accumulated product is increased by causing a microorganism using a mutation that does not decompose the α-halo-α, β-saturated carbonyl compound to be generated. Manufacturing method. The reaction duration time is extended by coexisting an α-halocarbonyl compound having an α, β-carbon / carbon double bond and a compound that can be oxidized by the microorganism used in the reaction system. The manufacturing method as described. The production method according to claim 12, wherein the compound that can be oxidized by the microorganism to be used is a saccharide having 3 to 6 carbon atoms or an organic acid having 2 to 4 carbon atoms. Pseudomonas strain SD810 having activity of reducing α, β-carbon / carbon double bond of α-halocarbonyl compound having α, β-carbon / carbon double bond (Pseudomonas
sp.SD810) (FERM BP-6767) or a mutant thereof. Pseudomonas strain SD811 having activity of reducing α, β-carbon / carbon double bond of α-halocarbonyl compound having α, β-carbon / carbon double bond (Pseudomonas
sp.SD811) (FERM BP-6768) or a mutant thereof. Pseudomonas strain SD812 having activity of reducing α, β-carbon / carbon double bond of α-halocarbonyl compound having α, β-carbon / carbon double bond (Pseudomonas
sp.SD812) (FERM BP-6769) or a mutant thereof. Burkholderia sp. SD816 strain (Burkholderia strain having activity of reducing α, β-carbon / carbon double bond of α-halocarbonyl compound having α, β-carbon / carbon double bond)
sp.SD816) (FERM BP-6770) or a mutant thereof. The processed product of the microorganism according to any one of claims 14 to 17. The processed product of microorganisms according to claim 18, comprising a microorganism culture, a microorganism extract, a microorganism cell suspension, or a microorganism fixed body.

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