JP5637846B2 - レシピエント宿主細胞におけるゲノム組込み方法 - Google Patents
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Description
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
[1]
第一の種からドナーゲノムを調製すること、
第二の種からレシピエント細胞を調製すること、ここで、第一の種および第二の種は、双方とも、同一の属からのものであり、そして
単離したドナーゲノムをレシピエント細胞に組込み、それによって、ドナーゲノムがレシピエント細胞を第一の種のそれ(表現型)に表現型的に形質転換すること
を含む種間ゲノム移植方法。
[2]
ドナーゲノムを第一の種の細胞から単離することを特徴とする[1]に記載の方法。
[3]
ドナーゲノムを合成的に調製することを特徴とする[1]に記載の方法。
[4]
ドナーゲノムが、選択マーカーを含むことを特徴とする[1]に記載の方法。
[5]
タンパク質は、組込みの前にドナーゲノムから取り除かれることを特徴とする[1]に記載の方法。
[6]
レシピエント細胞は、レシピエントゲノムを含むことを特徴とする[1]に記載の方法。
[7]
ドナーゲノムが、レシピエントゲノム内のシーケンスを認識するが、ドナーゲノム内のシーケンスは認識しない制限エンドヌクレアーゼをエンコードすることを特徴とする[6]に記載の方法。
[8]
ドナーゲノムをメチル化することを特徴とする[1]に記載の方法。
[9]
ドナーゲノムは、GATCがDamでメチル化されることを特徴とする[8]に記載の方法。
[10]
第一の種は、マイコプラズマ・ミコイデス ラージコロニー(LC)であることを特徴とする[1]に記載の方法。
[11]
第二の種は、マイコプラズマ・カプリコルムであることを特徴とする[1]に記載の方法。
[12]
第一の種からドナーゲノムを調製すること、
第二の種からレシピエントミニセルを調製すること、ここで、第一の種および第二の種は、双方とも、同一の属からのものであり、そして
レシピエントミニセルにドナーゲノムを組込み、それによって、ドナーゲノムが、レシピエント細胞を第一の種のそれ(表現型)に表現型的に形質転換すること
を含むミニセルにおけるゲノム組込み方法。
[13]
ドナーゲノムを、第一の種の細胞から単離することを特徴とする[12]に記載の方法。
[14]
ドナーゲノムを、合成的に調製することを特徴とする[12]に記載の方法。
[15]
ドナーゲノムが、選択マーカーを含むことを特徴とする[12]に記載の方法。
[16]
タンパク質は、組込みの前にドナーゲノムから取り除かれることを特徴とする[12]に記載の方法。
[17]
第一の種は、マイコプラズマ・ミコイデス ラージコロニー(LC)であることを特徴とする[12]に記載の方法。
[18]
第二の種は、マイコプラズマ・カプリコルムであることを特徴とする[12]に記載の方法。
ゲノムの化学合成が、近年記述(報告)されている。Gibson, et al.,「Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome」、Science(2008年2月29日)Vol. 319. no. 5867, pp. 1215〜1220、及び代理人事件整理番号(Attorney Docket No.)61687−3000800、61687−3000801、61687−3000802及び61687−3000803、これらの全ては引用によってそれらの全体において[本願明細書に]組み込まれる。この方法論は、細胞の生育に要求される遺伝子の最小セットに関する仮説を試験する手段としての使用、並びに、所望の代謝経路をエンコードするように選択された遺伝子を含有するカスタマイズ化された合成ゲノムを構築するための使用を含む、いくつかの使用に有用である。一度、合成ゲノムが構築されると、それは、エンコードしたゲノムの指示(instructions)を発現することができる細胞環境に導入されなければならない。本願明細書に開示の発明は、第一の種(ドナー)から単離されたゲノムを適切に調製された第二の種(レシピエント)の細胞に移植することができることを示す。ドナーの遺伝性物質(ないし遺伝子材料:genetic material)のレシピエント宿主細胞への導入は、供与される遺伝子材料の操作の結果として、効率的にレシピエント宿主細胞を、遺伝性物質のドナーの属及び種に属するものとして機能的に分類される(クラス分けされる)新たなる細胞に変える。
内因性宿主ゲノムの取り換え
アクロモソーマル宿主細胞
商業利用性
マイコプラズマ(モリキュート網のメンバー)は、合成細胞を構築するために選択された。この選択は、この細菌の分類単位に特異的な特徴の数に基づいた。マイコプラズマの本質的な特徴は、小さいゲノム、ほとんどの種によるトリプトファン(停止コドンではなく)をエンコードするUGAの使用、そして細胞壁の完全な欠如である。小さいゲノムは、合成し易く、取り扱い中に壊れにくい。遺伝子コードの変化は、マイコプラズマのタンパク質の発現を低減(ないし制限)するので、大腸菌におけるクローニングを促進する。細胞壁の欠如は、これらの細菌の外部表面を真核細胞の細胞膜と同様にし、確立された真核細胞への大きなDNA分子の挿入方法を我々が使用できるようにすることによって、レシピエント細胞内にゲノムを組み込む我々の作業を単純化することができる。
ドナーゲノムDNAの調製
レシピエント細胞調製及びゲノム移植反応条件
表1. コントロールを示す一連の実験の結果
* この実験の後、6回の実験を行ったが、移植クローンを全く生じなかったことを表1にはリストしなかった。
† これらの実験におけるより高いゲノム移植効率は、M・ミコイデスLCドナーゲノムを成長させることに使用したSP4培地におけるストレプトマイシンの含有に起因した。
推定上の移植(細胞)の解析
遺伝子型解析
表現型解析
ゲノム移植効率の最適化
表2 移植したM・ミコイデスLCゲノムDNAの量を関数とするゲノム移植
* 2つの異なるプレートで観察された移植コロニー
表3 ゲノム移植効率に対するPEGの入手元及び分子量の影響
表S4 M・カプリコルムにおける細胞融合
a 2つの親ストレインを、ゲノム移植実験に関して上記記載したように「レシピエント」細胞として同時に調製し、2xの融合バッファー[トリス 20mM、NaCl 500mM、MgCl2 20mM、ポリエチレングリコール8000(PEG)10%]の存在中で混合した。
b 細胞外プラスミドDNAの取り込みではなく、細胞融合に起因するコロニーを示すため、PEG−細胞混合物(液)中の10ユニットのDNase I(New England Biolabs(社))を添加。
c 2つの親ストレインを(a)に記載したように処理したが、2x融合バッファー[トリス 20mM、NaCl 500mM、MgCl2 20mM]は、PEGを全く含まなかった。
d 2つの親ストレインを(a)に記載したように処理したが、CaCl2処理は省略した。細胞は、洗浄バッファー[トリス 10mM、pH 6.5、NaCl 250mM]の中で、氷上で、30分間、プレインキュベートした。
Claims (11)
- ドナーゲノムをアガロース中に包埋し、ドナーゲノムを脱タンパク質化し、そしてドナーゲノムをアガロースから精製することにより、第一のマイコプラズマ種からドナーゲノムを調製すること、
第二のマイコプラズマ種からレシピエント細胞を調製すること、ここで、第一の種および第二の種は、双方とも、同一の属からのものであり、そして
単離したドナーゲノムをレシピエント細胞に組込み、それによって、第一の種が提供するドナーゲノムがレシピエント細胞に移植されること、を含み、
ここでレシピエント細胞は、成長・分裂して、生成された細胞を第一の種の表現型に表現型的に形質転換するドナーゲノムによって支配される細胞を生成することができること
を特徴とする種間ゲノム移植方法。 - ドナーゲノムを、第一の種の細胞から単離することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ドナーゲノムを、合成的に調製することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ドナーゲノムが、選択マーカーを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- タンパク質は、組込みの前にドナーゲノムから取り除かれることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- レシピエント細胞は、移植されたドナーゲノムによって置き換えられるレシピエントゲノムを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ドナーゲノムが、レシピエントゲノム内のシーケンスを認識するが、ドナーゲノム内のシーケンスは認識しない制限エンドヌクレアーゼをエンコードすることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- ドナーゲノムをメチル化することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ドナーゲノムは、GATCがDamでメチル化されることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 第一の種は、マイコプラズマ・ミコイデス ラージコロニー(LC)であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 第二の種は、マイコプラズマ・カプリコルムであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
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