JP5618226B2

JP5618226B2 - Genetic risk detection method for cerebral infarction

Info

Publication number: JP5618226B2
Application number: JP2009011495A
Authority: JP
Inventors: 山田　芳司; 芳司山田; 俊男小島; 村上　和美; 和美村上
Original assignee: G&G SCIENCE CO., LTD.; Mie University NUC; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: G&G SCIENCE CO., LTD.; Mie University NUC; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2009-01-22
Filing date: 2009-01-22
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2029-01-22
Also published as: JP2010166844A

Description

本発明は、脳梗塞の遺伝的リスクを検出するための方法等に関するものである。 The present invention relates to a method for detecting a genetic risk of cerebral infarction.

脳卒中は多因子疾患であり、個人の遺伝因子と様々な環境要因との相互作用によって発症すると考えられている。脳卒中は、発症頻度が高く、重篤な疾患である。２００４年のアメリカ心臓学会の統計によれば、７８万人が新規または再発性の脳卒中に罹患し、１５万人が死亡している。米国での脳卒中の患者数は、約５８０万人である。脳卒中のうち、８７％が脳梗塞、１０％が脳出血、残りの３％がくも膜下出血である（非特許文献１）。厚生労働省の統計によれば、２００５年の日本における脳卒中の患者数は、約１４０万人（このうち、６１％が脳梗塞、２５％が脳出血、１１％がくも膜下出血、その他３％である）であり、１３万３千人が死亡している。近年の脳卒中の急性期に対する治療の発達にもかかわらず、脳卒中は、西洋及び日本において、重度障害を起こす最大の原因であり、心臓病とガンに次いで第３位の死因となっている（非特許文献２）。脳卒中のリスクを予測するためのバイオマーカを特定することは、将来の発症を回避するための危険予測および治療のために重要である。
遺伝疫学的研究によって、脳卒中のリスクファクターとして幾つかの遺伝子多型が報告されている（非特許文献３−６）が、脳卒中の遺伝因子については、ほとんどが未知のままである。 Stroke is a multifactorial disease that is thought to develop due to the interaction of individual genetic factors with various environmental factors. Stroke is a serious disease with a high incidence. According to 2004 American Heart Association statistics, 780,000 people suffer from new or recurrent strokes and 150,000 die. There are approximately 5.8 million stroke patients in the United States. Of the strokes, 87% are cerebral infarctions, 10% are cerebral hemorrhages, and the remaining 3% are subarachnoid hemorrhages (Non-patent Document 1). According to statistics from the Ministry of Health, Labor and Welfare, the number of stroke patients in Japan in 2005 is approximately 1.4 million (of which 61% are cerebral infarction, 25% are cerebral hemorrhage, 11% are subarachnoid hemorrhage, and 3% are others) 133,000 people have died. Despite recent developments in treatment for the acute phase of stroke, stroke is the leading cause of severe disability in the West and Japan, and the third leading cause of death after heart disease and cancer (non- Patent Document 2). Identifying biomarkers for predicting the risk of stroke is important for risk prediction and treatment to avoid future onset.
Although some genetic polymorphisms have been reported as a risk factor for stroke by genetic epidemiological studies (Non-patent Documents 3-6), most of the genetic factors for stroke remain unknown.

本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、脳梗塞に関連する遺伝的多型を同定し、脳梗塞の発症予測を行うための精度の高い資料を提供することである。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and its purpose is to identify genetic polymorphisms related to cerebral infarction and provide highly accurate data for predicting the onset of cerebral infarction. It is.

本発明者は、６３４１名の日本人集団において、約５２万個の遺伝子多型（single nucleotide polymorphism (SNP)）について、脳梗塞に関するゲノム全領域での関連解析（GWAS）を行ったところ、LLGL2のrs1671021、CELSR1のrs9615362、及びRUVBL2のrs753307の３個のSNPが脳梗塞に有意に関連した。
これらのSNPを含むエクソンとエクソン・イントロン境界の連鎖不平衡ブロックを検討したところ、４個のSNP、すなわち、３個のタグSNP（CELSR1のrs6007897、LLGL2のrs1671021、RUVBL2のrs1062708）と１個の非同義SNP（CELSR1のrs4044210）が脳梗塞に有意に関連した。CELSR1のrs6007897のバリアント型Ｇ（Ala）アレルとrs4044210のＧ（Val）アレルは脳梗塞の危険因子であり、LLGL2のrs1671021のバリアント型Ｃ（Leu）アレルとRUVBL2のrs1062708のＴアレルは防御因子であった。CELSR1のrs6007897とrs4044210は連鎖不平衡であり、これらを含むCELSR1の４個のSNPのハプロタイプ頻度は、C (rs9615362)−A (rs4044210)−A (rs6007897)−A (rs6008788)が0.8457であり、A−G−G−Gが0.1543であった。このうち、前者は脳梗塞の防御因子であり、後者は脳梗塞の危険因子であった。 The present inventor conducted an association analysis (GWAS) on the whole genome region for cerebral infarction for about 520,000 gene polymorphisms (SNP) in 6341 Japanese population. Three SNPs, rs1671021, rs9615362 of CELSR1, and rs753307 of RUVBL2, were significantly associated with cerebral infarction.
When we examined linkage disequilibrium blocks at the exon-exon-intron boundary containing these SNPs, we found four SNPs: three tag SNPs (CELSR1 rs6007897, LLGL2 rs1671021 and RUVBL2 rs1062708) and one A non-synonymous SNP (CELSR1 rs4044210) was significantly associated with cerebral infarction. CELSR1 rs6007897 variant G (Ala) allele and rs4044210 G (Val) allele are risk factors for cerebral infarction, LLGL2 rs1671021 variant C (Leu) allele and RUVBL2 rs1062708 T allele are protective factors there were. CELSR1 rs6007897 and rs4044210 are linkage disequilibrium, and the haplotype frequency of the four SELSR1 SNPs containing them is C (rs9615362) −A (rs4044210) −A (rs6007897) −A (rs6008788) is 0.8457, A-G-G-G was 0.1543. Of these, the former was a protective factor for cerebral infarction, and the latter was a risk factor for cerebral infarction.

こうして、本願発明に係る脳梗塞の遺伝的リスクを検出する方法は、LLGL2のrs1671021、CELSR1のrs9615362、RUVBL2のrs753307、CELSR1のrs6007897、CELSR1のrs4044210、RUVBL2のrs1062708のうちの少なくとも１個または２個以上のSNPを決定することを特徴とする。
上記方法において、LLGL2のrs1671021、CELSR1のrs6007897、CELSR1のrs4044210、RUVBL2のrs1062708のうちの少なくとも１個または２個以上のSNPを決定することが好ましい。このとき、CELSR1のrs6007897とrs4044210とは連鎖不平衡なので、いずれか一方を用いることが好ましい。さらに、このときCELSR1の４個のSNP（rs9615362、rs4044210、rs6007897、rs6008788）は連鎖不平衡であり、ハプロタイプ頻度が明らかとなったので、これら４個のSNPのうちのいずれか１個所のSNPの塩基に基づき、C (rs9615362)−A (rs4044210)−A (rs6007897)−A (rs6008788)、またはA−G−G−Gのいずれかを決定することが好ましい。 Thus, the method for detecting the genetic risk of cerebral infarction according to the present invention is at least one or two of LLGL2 rs1671021, CELSR1 rs9615362, RUVBL2 rs753307, CELSR1 rs6007897, CELSR1 rs4044210, and RUVBL2 rs1062708. The above SNP is determined.
In the above method, it is preferable to determine at least one or more SNPs among LLGL2 rs1671021, CELSR1 rs6007897, CELSR1 rs4044210, and RUVBL2 rs1062708. At this time, since rs6007897 and rs4044210 of CELSR1 are linkage disequilibrium, it is preferable to use one of them. Furthermore, at this time, the 4 SNPs of CELSR1 (rs9615362, rs4044210, rs6007897, rs6008788) are linkage disequilibrium, and the haplotype frequency has been clarified, so the SNP of any one of these 4 SNPs It is preferable to determine either C (rs9615362) -A (rs4044210) -A (rs6007897) -A (rs6008788) or A-G-G-G based on the base.

一般に多型は、集団（例えば、日本人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なることが知られている。このため、日本人以外の集団において、脳梗塞との関係が指摘されている多型であっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、国または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人における多型および脳梗塞との関連が裏付けられるわけではない。 In general, it is known that polymorphisms have different types and frequencies for different groups (for example, Japanese group, Western group, etc.). For this reason, even if the polymorphism has been pointed out to be related to cerebral infarction in a non-Japanese population, such a relationship is not necessarily recognized in the Japanese population. For this reason, conventional reports do not necessarily support the association between polymorphisms and cerebral infarction in Japanese when the country or disease is different.

本発明によれば、脳梗塞について、遺伝的リスクを予測するための検出法等が提供される。この発明を用いることにより、脳梗塞に対する予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・寝たきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the detection method etc. for predicting a genetic risk are provided about cerebral infarction. By using this invention, it becomes possible to prevent cerebral infarction, and can greatly contribute medically and socially, such as extending the healthy life of the elderly, improving QOL, preventing bedridden, and reducing medical costs in the future.

次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。 Next, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. However, the technical scope of the present invention is not limited by these embodiments, and various forms can be made without changing the gist of the invention. Can be implemented. Further, the technical scope of the present invention extends to an equivalent range.

＜試験方法＞
研究対象
研究対象は、３つの独立した母集団からなる６３４１名（９９２名の脳梗塞患者、５３４９名の対照者）であった。母集団Ａは、２６６名（１３１名の脳梗塞患者と１３５名の対照者）からなり、研究参加施設（岐阜県総合医療センター、岐阜県立多治見病院）に、２００２年１０月から２００４年３月までに、様々な症状の治療のため又は毎年の健康診断のために来院した者であった。母集団Ｂは、４２２５名（７９０名の脳梗塞患者、３４３５名の対照者）からなり、研究参加施設（岐阜県総合医療センター、岐阜県立多治見病院、横浜総合病院、弘前大学病院、黎明郷リハビリテーション病院、弘前脳卒中センター、東京都老人医療センター）に、２００２年１０月から２００８年３月までに、様々な症状の治療のため又は毎年の健康診断のために来院した者であった。母集団Ｃは、１８５０名の地域社会に暮らす一般住民（７１名の脳梗塞既往暦者と１７７９名の対照者）であり、群馬県と東京都における老化・老年病の疫学研究に参加した高齢者であった。脳梗塞の有無については、新規かつ突然の脳の局所的な神経学的異常が確認され、２４時間以上に渡って神経症状が継続した者であって、頭部のＣＴまたはＭＲＩによる診断（或いはその両者による診断）によって確定した。脳梗塞のタイプは、脳血管障害の分類III（非特許文献７）に従って決定した。心原性脳塞栓性、ラクナ梗塞のみ、一過性脳虚血発作、出血性脳血管障害または脳出血、脳血管奇形、モヤモヤ病、脳静脈洞血栓症、脳腫瘍、及び外傷性脳血管障害の患者は、今回の研究対象から除外した。心臓弁膜症の有無に拘わらず、心房細動を持つ患者についても同様に研究対象から除外した。 <Test method>
Study subjects The study subjects were 6341 (992 cerebral infarction patients, 5349 controls) consisting of 3 independent populations. Population A consisted of 266 people (131 cerebral infarction patients and 135 controls) and participated in the research participating facilities (Gifu Prefectural General Medical Center, Gifu Prefectural Tajimi Hospital) from October 2002 to March 2004. By the time, he had come to the hospital for treatment of various symptoms or for an annual health examination. Population B consists of 4225 people (790 cerebral infarction patients, 3435 controls), and participating research facilities (Gifu Prefectural General Medical Center, Gifu Prefectural Tajimi Hospital, Yokohama General Hospital, Hirosaki University Hospital, Reimeikyo Rehabilitation Hospital). , Hirosaki Stroke Center, Tokyo Metropolitan Geriatric Medical Center) from October 2002 to March 2008 for various symptoms or annual health examinations. Population C is a general population (71 people with a history of cerebral infarction and 1779 controls) who live in a community of 1850, and participated in an epidemiological study of aging and geriatric diseases in Gunma Prefecture and Tokyo. It was a person. Regarding the presence or absence of cerebral infarction, a new and sudden local neurological abnormality of the brain has been confirmed, and a neurological symptom has continued for 24 hours or more, and diagnosis by CT or MRI of the head (or Diagnosis by both). The type of cerebral infarction was determined according to the classification III of cerebrovascular disorder (Non-patent Document 7). Patients with cardiogenic cerebral embolism, lacunar infarct only, transient ischemic attack, hemorrhagic cerebrovascular disorder or cerebral hemorrhage, cerebrovascular malformation, moyamoya disease, cerebral sinus thrombosis, brain tumor, and traumatic cerebrovascular disorder Were excluded from this study. Patients with atrial fibrillation with or without valvular heart disease were also excluded from the study.

コントロール群は、様々な一般的疾患の治療のために外来患者として訪れた者、または前向きコホート研究に参加した地域の一般住民であった。対象者には、従来の脳梗塞の危険因子であるもの、つまり高血圧（収縮期血圧が140mmHg以上若しくは拡張期血圧が90mmHg以上または両条件を満たす者、または降圧薬を服用している者）、糖尿病（空腹時血糖値が6.93mmol/L以上若しくはヘモグロビンA1c（HbA1c）が6.5%以上、または抗糖尿病薬を服用している者）、または高コレステロール血症（血清総コレステロール値が5.72mmol/L以上、または脂質降下薬を服用している者）を有している者が含まれていた。対象者は、脳梗塞・脳出血・その他の脳疾患、冠動脈疾患・末梢動脈閉塞疾患・その他のアテローム硬化性疾患、その他の血栓性、塞栓性または出血性疾患の既往歴はなかった。
研究プロトコールはヘルシンキ宣言に従い、三重大学医学部、弘前大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、東京都老人総合研究、理化学研究所および参加病院の倫理委員会によって承認された。各参加者に対しては書面によるインフォームドコンセントを得た。 Control groups were those who visited as outpatients for the treatment of various common illnesses, or general residents of the community who participated in a prospective cohort study. Subjects are those who are traditional risk factors for cerebral infarction, namely high blood pressure (systolic blood pressure is 140mmHg or higher or diastolic blood pressure is 90mmHg or higher, or who is taking antihypertensive drugs), Diabetes (fasting blood glucose level of 6.93 mmol / L or higher, hemoglobin A1c (HbA1c) of 6.5% or higher, or taking antidiabetics), or hypercholesterolemia (serum total cholesterol level of 5.72 mmol / L) Those who have the above or those who are taking lipid-lowering drugs). The subject had no history of cerebral infarction / cerebral hemorrhage / other brain diseases, coronary artery disease / peripheral artery occlusion disease / other atherosclerotic diseases, or other thrombotic, embolic or hemorrhagic diseases.
The research protocol was approved by the Mie University School of Medicine, Hirosaki University School of Medicine, Gifu International Research Institute for Biotechnology, Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology, RIKEN, and participating hospital ethics committees in accordance with the Declaration of Helsinki. Written informed consent was obtained for each participant.

ゲノムワイド関連解析（GWAS）
脳梗塞のGWASは、母集団Ａについて、StyIとNspIチップから構成され、ゲノム全領域に分布する約５２万個のSNPsを含むジーンチップ・ヒューマン・マッピング・500Kアレイセット（Affymetrix）を用いて行った。解析可能であったデータ割合（コール・レート）が９３％以下であったチップのデータについては、解析に用いなかった。本研究におけるコール・レートの平均値は、９８％であった。各SNPのアレル頻度と脳梗塞との関連をカイ二乗検定にて評価し、Ｐ値が1.0 × 10⁻²⁰よりも小さな８９４個のSNPを抽出した。これらのSNPについて、ＮＣＢＩｄｂＳＮＰデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）を検索し、遺伝子注釈（gene annotation）が付された４９９個のSNPを決定した。次いで、各ハプロブロックのハプロタイプと脳梗塞との関連を調べ、Ｐ値が1.0 × 10⁻²⁰よりも小さな４５５個のハプロブロックを選択した。これらのハプロブロックについて、ｄｂＳＮＰデータベースを検索し、遺伝子注釈が付された２３８個のハプロブロックを得た。さらに４９９個のSNPのうち、これらのハプロブロックに含まれる１９４個のSNPを選択した。対照群について、これらのSNPの遺伝子型分布が、ハーディ・ワインバーグ平衡から逸脱していないことを確認した。最後に、ＳＮＰチップのハイブリダイゼーション・シグナルの分布が、正規分布から有意に（P ＜ 0.001）逸脱している９４個のSNPについては解析から外し、残った１００個のSNPについて脳梗塞との関連の再現性について別の集団で検討した。 Genome-wide association analysis (GWAS)
GWAS for cerebral infarction is performed on population A using Genechip Human Mapping 500K Array Set (Affymetrix), which is composed of StyI and NspI chips and contains about 520,000 SNPs distributed over the entire genome. It was. The chip data whose data rate (call rate) that could be analyzed was 93% or less was not used in the analysis. The average call rate in this study was 98%. The association between the allele frequency of each SNP and cerebral infarction was evaluated by chi-square test, and 894 SNPs having a P value smaller than 1.0 × 10 ⁻²⁰ were extracted. The NCBI dbSNP database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp) was searched for these SNPs, and 499 SNPs with gene annotations were determined. Next, the relationship between the haplotype of each haploblock and cerebral infarction was examined, and 455 ^haploblocks having a P value smaller than 1.0 × 10 ⁻²⁰ were selected. The dbSNP database was searched for these haploblocks to obtain 238 haploblocks with genetic annotations. Further, out of 499 SNPs, 194 SNPs contained in these haploblocks were selected. For the control group, it was confirmed that the genotype distribution of these SNPs did not deviate from Hardy-Weinberg equilibrium. Finally, 94 SNPs whose hybridization signal distribution on the SNP chip deviates significantly from the normal distribution (P <0.001) are excluded from the analysis, and the remaining 100 SNPs are related to cerebral infarction. The reproducibility of was studied in another group.

遺伝子多型の検出方法
７ｍＬの静脈血を５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ジナトリウム塩）を含むチューブに採取し、ゲノムＤＮＡをキット（ゲノミックス社製）によって分離した。多型の遺伝子型は、ＰＣＲと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブをサスペンジョン・アレイ・テクノロジー（ＳＡＴ：Ｌｕｍｉｎｅｘ１００）と組み合わせて使用する方法によって決定した（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社）。プライマー、プローブ、その他の条件は、表１に示した。表には左から順に、遺伝子（Gene）、一塩基多型(SNP(dbSNP)）、多型（Polymorphism）、センスプライマー（Sense primer）、アンチセンスプライマー（Antisense primer）、プローブ１（Probe 1）、プローブ２（Probe 2）を示した。また、アニーリング温度は６０℃、サイクル数は５０回とした。詳細な方法については、既報のもの（非特許文献８）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、脳梗塞との関連が認められなかった多型を検出するための条件については記載を省略した。 Detection method of gene polymorphism 7 mL of venous blood was collected in a tube containing 50 mmol / L EDTA (disodium salt), and genomic DNA was separated using a kit (Genomics). The polymorphic genotype was determined by a method using PCR and sequence-specific oligonucleotide probes in combination with Suspension Array Technology (SAT: Luminex 100) (G & G Science Inc.). The primer, probe, and other conditions are shown in Table 1. In the table from the left, gene (Gene), single nucleotide polymorphism (SNP (dbSNP)), polymorphism (Polymorphism), sense primer (Sense primer), antisense primer (Antisense primer), probe 1 (Probe 1) Probe 2 was shown. The annealing temperature was 60 ° C. and the number of cycles was 50. The detailed method was based on the previously reported one (Non-Patent Document 8), and the amplification conditions were appropriately changed. In addition, description was abbreviate | omitted about the conditions for detecting the polymorphism by which the relationship with cerebral infarction was not recognized.

ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の詳細については、非特許文献８に記載の通りである。以下には、この方法の概要について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面には、特異的な塩基配列を認識するプローブが結合されている。各ビーズには、一種類のプローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との割合を変化させることにより、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。複数種類のプローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類のプローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。 The details of the PCR-SSOP-Luminex method are as described in Non-Patent Document 8. Below, the outline | summary of this method is demonstrated.
FIG. 1 shows the microstructure and characteristics of microbeads detected by Luminex 100 flow cytometry. Microbeads (symbol (A) in the figure) have a diameter of about 5.5 μm and are made of polystyrene. A probe that recognizes a specific base sequence is bound to the bead surface. One type of probe is bound to each bead. By changing the ratio of the red dye and the infrared dye to this microbead, the identification of each bead can be performed in a state where a maximum of 100 kinds are mixed, as indicated by the symbol (B) in the figure. It can be done. Microbeads with multiple types of probes (however, only one type of probe for each microbead) were mixed at an appropriate ratio to prepare a bead mix of 100 beads / μL (reference in the figure). (C)).

図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示した。
１．増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
目的とするＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチンでラベルしたプライマーを用いた。１.５ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭｄＮＴＰｓ、及び０.１μＭ−１０μＭプライマーセットを混合し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）と５０ｎｇ−１００ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５°Cで１０分間処理の後、９４°Cで２０秒間の変性、６０°Cで３０秒間のアニーリング、及び７２°Cで３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。 In FIG. 2, the outline | summary of the procedure of PCR-SSOP-Luminex method was shown.
1. Amplification reaction
In the PCR reaction for amplifying the target DNA, a primer labeled with biotin at the 5 'end was used. A 1 × PCR solution containing 1.5 mM magnesium chloride (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3), 2% DMSO, 0.2 mM dNTPs, and 0.1 μM-10 μM primer set were mixed, and Taq DNA polymerase (50 U / mL) and 50 ng-100 ng of genomic DNA were added to make 25 μL. The PCR reaction was treated at 95 ° C for 10 minutes, followed by one cycle of denaturation at 94 ° C for 20 seconds, annealing at 60 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 30 seconds. Repeated. A GeneAmp9700 thermal cycler (Applied Biosystems) was used as the instrument.

２．ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、及び４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（３.７５ＭＴＭＡＣ、６２.５ｍＭＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭＥＤＴＡ、０.１２５％Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５°Cで２分間の変性、及び５２°Cで３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。 2. Hybridization
The amplified DNA was denatured and then hybridized with the bead mix. In each well of a 96-well plate, 5 μL of amplified PCR solution, 5 μL of bead mix, and 40 μL of hybridization buffer (3.75 M TMAC, 62.5 mM TB (pH 8.0), 0.5 mM) EDTA, 0.125% N-lauroylsarcosine) was added to a total volume of 50 μL. The 96-well plate to which this mixed solution had been added was subjected to denaturation at 95 ° C. for 2 minutes and hybridization at 52 ° C. for 30 minutes (using a GeneAmp 9700 thermal cycler).
FIG. 2 shows a state in which only beads (1) having a probe that recognizes amplified DNA bind to DNA.

３．ストレプトアビジン−フィコエリスリン反応（ＳＡ−ＰＥＲｅａｃｔｉｏｎ）
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリダイゼーション反応の後、各ウエルに１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２°Cで１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。 3. Streptavidin-phycoerythrin reaction (SA-PE Reaction)
Next, the bead mix-DNA was reacted with SA-PE. After the hybridization reaction, 100 μL of PBS-Tween (1 × PBS (pH 7.5), 0.01% Tween-20) was added to each well, centrifuged at 1000 × g for 5 minutes, and the supernatant was removed. The microbeads were washed. To each microbead remaining in each well, 70 μL of SA-PE solution (commercially available product (manufactured by G & G Science Co., Ltd.) diluted 100-fold with PBS-Tween) was added and mixed, and then 15 ° C. at 52 ° C. The reaction was performed for a minute (using a GeneAmp 9700 thermal cycler).
FIG. 2 shows that biotinylated DNA is bound only to the probe of the bead (1), and thus SA-PE is bound to the biotin.

４．測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを判定した。測定は２種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光は５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）−（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。 4). Measurement
Next, the sample after the reaction used Luminex 100 to identify the bead type and determine whether PE is bound to the bead. The measurement was performed using two types of lasers, the type of beads was identified by a 635 nm laser, and PE fluorescence was quantified using a 532 nm laser. For the DNA bound to the oligo beads, at least 50 beads were measured per measurement, and the quantified median fluorescence intensity (MFI) of PE was used.
In FIG. 2, since each bead (1)-(3) was identified and PE was measured only on the bead (1), the DNA recognized by the probe bound to the bead (1) was amplified. The situation is shown.

統計解析
臨床データは、脳梗塞患者群とコントロール群との間で、対応のないスチューデントt検定により比較した。質的（カテゴリー）データは、カイ二乗検定によって比較した。対立遺伝子頻度は遺伝子カウント法によって概算し、ハーディ・ワインベルク平衡にあてはまるかどうかを判断するためにカイ二乗検定を使った。遺伝子多型（SNPs）の対立遺伝子頻度は、脳梗塞患者群とコントロール群との間で、カイ二乗検定によって比較した。 Statistical analysis Clinical data were compared between the cerebral infarction patient group and the control group by unpaired Student t test. Qualitative (category) data were compared by chi-square test. Allele frequencies were estimated by the gene count method, and the chi-square test was used to determine if the Hardy-Weinberg equilibrium was met. The allele frequencies of genetic polymorphisms (SNPs) were compared between the cerebral infarction patient group and the control group by chi-square test.

脳梗塞と関連する多型を交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。交絡因子については、年齢（age）・性別(sex：女性＝０、男性＝１)・肥満指数(body mass index：BMI)・喫煙状態(smoking status：非喫煙者＝０、喫煙者＝１)・代謝変数（高血圧（hypertension）・糖尿病（diabetes mellitus）・または高コレステロール血症（hypercholesterolemia）の病歴なし＝０、それらの病歴あり＝１）および各SNPの遺伝子型を独立変数とし、脳梗塞を従属変数とした。各遺伝子型は、優性遺伝モデル（野生型ホモ接合体＝０，ヘテロ接合体とバリアント型ホモ接合体の結合群＝１）及び劣性遺伝モデル（野生型ホモ接合体とヘテロ接合体の結合群＝０，バリアント型ホモ接合体＝１）、並びにＰ値、オッズ比、及び９５％信頼区間を計算した。以下の記載において、特に示さない限り、危険率５％未満（Ｐ＜０.０５）を統計的に有意であると見なした。統計解析は、ＪＭＰゲノミクス・バージョン３.２ソフトウエア（ＳＡＳインスティテュート社製）及びＳＮＰＡｌｙｚｅバージョン６ソフトウエア（ダイナコム社製）によって実行した。 Polymorphisms associated with cerebral infarction were analyzed by multinomial logistic regression analysis with confounding factors. Confounding factors include age, sex (sex: female = 0, male = 1), body mass index (BMI), smoking status (smoking status: non-smoker = 0, smoker = 1)・ Metabolic variables (hypertension, diabetes (diabetes mellitus) or hypercholesterolemia) = 0, those with history = 1) and the genotype of each SNP as independent variables, and cerebral infarction Dependent variable. Each genotype consists of a dominant genetic model (wild-type homozygote = 0, heterozygous and variant homozygous binding group = 1) and a recessive genetic model (wild-type homozygous and heterozygous binding group = 0, variant homozygote = 1), and P value, odds ratio, and 95% confidence interval were calculated. In the following description, a risk factor of less than 5% (P <0.05) was considered statistically significant unless otherwise indicated. Statistical analysis was performed with JMP Genomics version 3.2 software (SAS Institute) and SNPAlize version 6 software (Dynacom).

＜試験結果＞
６３４１名の研究対象者に関するデータを表２に示した。表には、左欄より順に、特徴（Characteristic）、母集団Ａ（Subject panel A）について脳梗塞患者群（Ischemic stroke）とコントロール群（Controls）、母集団Ｂ（Subject panel B）について脳梗塞患者群（Ischemic stroke）とコントロール群（Controls）、母集団Ｃ（Subject panel C）について脳梗塞患者群（Ischemic stroke）とコントロール群（Controls）を示している。また特徴欄は、上より順に、症例数（No. of subjects）、年齢（Age(years)）、性別（男性／女性）（Sex(male /female)）、肥満指数（BMI）、現在または過去の喫煙率（Current or former smoker）、高血圧罹患率（Hypertension）、糖尿病罹患率（Diabetes mellitus）、高コレステロール血症罹患率（Hypercholesterolemia）を示している。 <Test results>
Data for 6341 subjects are shown in Table 2. In the table, in order from the left column, cerebral infarction patient group (Ischemic stroke) and control group (Controls) for characteristics (Characteristic), population A (Subject panel A), and cerebral infarction patients for population B (Subject panel B) A group (Ischemic stroke), a control group (Controls), and a population C (Subject panel C) show a cerebral infarction patient group (Ischemic stroke) and a control group (Controls). In addition, the number of cases (No. of subjects), age (Age (years)), sex (male / female) (Sex (male / female)), body mass index (BMI), current or past Smoking rate (Current or former smoker), hypertension prevalence (Hypertension), diabetes prevalence (Diabetes mellitus), hypercholesterolemia prevalence (Hypercholesterolemia).

母集団Ａでは、脳梗塞群の方が対照群に比べ、男性の割合、高血圧罹患率、及び高コレステロール血症罹患率が高い一方、年齢は低かった。母集団Ｂでは、脳梗塞群の方が対照群に比べ、年齢、男性の割合、喫煙率、高血圧罹患率、及び糖尿病罹患率は高い一方、肥満指数は小さかった。母集団Ｃでは、脳梗塞群の方が対照群に比べ、高血圧罹患率が高かった。
母集団ＡについてＳＮＰチップを用いてＧＷＡＳの解析から選択された１００個のSNPと、脳梗塞との関連について、母集団Ｂ中の４１３１名（脳梗塞患者７０５名、対照者３４２６名）においてカイ二乗検定で解析した。結果を表３〜表６に示した。表は、左欄から順に、座位（Locus）、遺伝子名（Gene）、簡易記載（Symbol）、一塩基多型（SNP）、多型データベース登録番号（dbSNP）、遺伝子型の確率（P(genotype)）、アレルの確率（P(allele)）を示している。 In population A, the cerebral infarction group had a higher proportion of males, prevalence of hypertension, and prevalence of hypercholesterolemia, but was younger than the control group. In population B, the cerebral infarction group had higher age, percentage of men, smoking rate, hypertension prevalence, and diabetes prevalence, but smaller body mass index than the control group. In population C, the incidence of hypertension was higher in the cerebral infarction group than in the control group.
Regarding the relationship between 100 SNPs selected from the GWAS analysis using the SNP chip for the population A and cerebral infarction, 4131 in the population B (705 patients with cerebral infarction, 3426 controls) Analysis was performed with a square test. The results are shown in Tables 3 to 6. The table shows the locus (Locus), gene name (Gene), simple description (Symbol), single nucleotide polymorphism (SNP), polymorphism database registration number (dbSNP), genotype probability (P (genotype) )) And the allele probability (P (allele)).

対象集団において、３個のSNP、すなわちLLGL2のrs1671021（遺伝子型分布及びアレル頻度について、それぞれP = 0.0196及び0.0052）、CELSR1のrs9615362（遺伝子型分布及びアレル頻度について、それぞれP = 0.0058及び0.0060）、及びRUVBL2のrs753307（遺伝子型分布及びアレル頻度について、それぞれP = 0.0277 and 0.0239）が、遺伝子型分布及びアレル頻度の両者について、有意に（P ＜ 0.05）脳梗塞と関連した。次いで我々は、脳梗塞患者群から選んだ９６例のＤＮＡサンプルについて、図３−図５（Supplementary Figure 1A-1C）に示すSNPを含む連鎖不平衡（linkage disequilibrium (LD)）ブロックのエクソンとエクソン・イントロン境界について検討した（標準連鎖不平衡係数（ｒ^２）を０.３以上とした）。連鎖不平衡ブロックについてのデータは、国際HapMap計画データベース（http://www.hapmap.org/index.html.ja）から入手した。 In the target population, three SNPs, namely LL1672 rs1671021 (P = 0.0196 and 0.0052 for genotype distribution and allele frequency, respectively), CELSR1 rs9615362 (P = 0.0058 and 0.0060 for genotype distribution and allele frequency, respectively), And RSVBL2 rs753307 (P = 0.0277 and 0.0239 for genotype distribution and allele frequency, respectively) were significantly (P <0.05) associated with cerebral infarction for both genotype distribution and allele frequency. Next, we analyzed exon and exon of linkage disequilibrium (linkage disequilibrium (LD)) block including SNP shown in Fig.3-5 (Supplementary Figure 1A-1C) for 96 DNA samples selected from cerebral infarction patients group -The intron boundary was examined (standard linkage disequilibrium coefficient (r ² ) was set to 0.3 or more). Data on linkage disequilibrium blocks were obtained from the International HapMap Project Database (http://www.hapmap.org/index.html.ja).

rs1671021多型（T→C, Phe479Leu）は、LLGL2のエクソン12に位置している。この多型を含む連鎖不平衡ブロックに関するデータが無いため、我々はLLGL2のエクソン12と、このエクソンとイントロンの境界部分について塩基配列の決定を行った（図３（Supplementary Figure 1A）。エクソン12についてはrs1671021以外の多型は認められなかったが、イントロン13にrs2305526（A→T）多型とC→T多型（dbSNPにはrs番号が検索されなかった）が検出された。これら３個の多型は、連鎖不平衡にあった（rs1671021対rs2305526は、r² =0.1624、P = 3.28 × 10⁻⁸であり、rs1671021対C→T多型は、r² = 0.1739、P = 9.01 × 10⁻⁹であり、rs2305526対C→T多型は、r² = 0.026、P = 0.0272であった）。ハプロタイプ頻度は、T (rs1671021)−A (rs2305526)−C (C→T)が0.4143、T−T−Cが0.3357、C−A−Cが0.1957、C−A−Tが0.0543であった。エクソン12のrs1671021 (T→C, Phe479Leu)と、エクソン13のrs2305526 (A→T)は、いずれもタグSNPであった。 The rs1671021 polymorphism (T → C, Phe479Leu) is located in exon 12 of LLGL2. Since there is no data on linkage disequilibrium blocks containing this polymorphism, we determined the base sequence of exon 12 of LLGL2 and the boundary between this exon and intron (Fig. 3 (Supplementary Figure 1A)). No polymorphisms other than rs1671021 were found, but rs2305526 (A → T) polymorphism and C → T polymorphism (no rs number was found in dbSNP) were detected in intron 13. These three Was in linkage disequilibrium (rs1671021 vs. rs2305526, r ² = 0.1624, P = 3.28 × 10 ⁻⁸ , and the rs1671021 vs. C → T polymorphism was r ² = 0.1739, P = 9.01 × 10 ⁻⁹ , and the rs2305526 vs. C → T polymorphism was r ² = 0.026, P = 0.0272.) The haplotype frequency was 0.4143 for T (rs1671021) −A (rs2305526) −C (C → T). T-T-C was 0.3357, C-A-C was 0.1957, and C-A-T was 0.0543. Exon 12 rs1671021 (T → C, Phe479Leu) and exon 13 rs2305526 (A → T ) Were tag SNPs.

rs9615362 (A→C)多型は、CELSR1のイントロン10に位置している。この多型を含む連鎖不平衡ブロックはエクソン１０−２０を含んでいるので、我々はCELSR1について、これらのエクソンと該当するエクソン・イントロン境界領域の塩基配列を決定した（図４（Supplementary Figure 1B）。rs9615362に加えて、エクソン17のrs4044210（A→G, Ile2107Val）多型、エクソン20のrs6007897（A→G, Thr2268Ala）、及びイントロン19のrs6008788（A→G）を検出した。これら４個の多型は、連鎖不平衡にあった（rs9615362対rs4044210は、r² = 0.9221、P = 2.05 × 10⁻⁴⁰であり、rs9615362対rs6007897は、r² = 0.8712、P = 2.11 × 10⁻³⁶であり、rs9615362対rs6008788は、r² = 0.9582、P = 1.18 × 10⁻⁴⁰であり、rs4044210対rs6007897は、r² = 0.9568、P = 9.25 × 10⁻⁴⁰であり、rs4044210対rs6008788は、r² = 0.9582、P = 1.18 × 10⁻⁴⁰であり、rs6007897対rs6008788は、r² = 0.9111、P = 3.79 × 10⁻³⁷であった）。ハプロタイプ頻度は、C (rs9615362)−A (rs4044210)−A (rs6007897)−A (rs6008788)が0.8457であり、A−G−G−Gが0.1543であった。エクソン20のrs6007897 (A→G, Thr2268Ala)と、エクソン19のrs6008788 (A→G)は、タグSNPであった。 The rs9615362 (A → C) polymorphism is located in intron 10 of CELSR1. Since the linkage disequilibrium block containing this polymorphism contains exons 10-20, we determined the base sequences of these exons and the corresponding exon-intron boundary region for CELSR1 (Fig. 4 (Supplementary Figure 1B)). In addition to rs9615362, exon 17 rs4044210 (A → G, Ile2107Val) polymorphism, exon 20 rs6007897 (A → G, Thr2268Ala), and intron 19 rs6008788 (A → G) were detected. The polymorphisms were in linkage disequilibrium (rs9615362 vs rs4044210, r ² = 0.9221, P = 2.05 × 10 ⁻⁴⁰ , rs9615362 vs rs6007897, r ² = 0.8712, P = 2.11 × 10 ⁻³⁶ Rs9615362 vs rs6008788 is r ² = 0.9582, P = 1.18 × 10 ⁻⁴⁰ , rs4044210 vs rs6007897 is r ² = 0.9568, P = 9.25 × 10 ⁻⁴⁰ , and rs4044210 vs rs6008788 is r ² = 0.9582 a P = 1.18 × 10 ^-40, rs6007897 pair rs6008788 is, r ² = 0.9111, was P = 3.79 × 10 ^-37). c The rotypic frequency was 0.8457 for C (rs9615362) −A (rs4044210) −A (rs6007897) −A (rs6008788) and 0.1543 for A−G−G−G.rs6007897 (A → G, for Exon 20) Thr2268Ala) and rs6008788 (A → G) of exon 19 were tag SNPs.

rs753307 (C→T)多型は、RUVBL2のイントロン13に位置している。この多型を含む連鎖不平衡ブロックはRUVBL2のエクソン７−１５とLHBのエクソン3を含んでいるので、我々はこれらのエクソンと該当するエクソン・イントロン境界領域の塩基配列を決定した（図５（Supplementary Figure 1C）。rs753307に加えて、RUVBL2のエクソン8のrs1062708(C→T, Leu205Leu)とイントロン8のrs2287760 (C→G)を検出した。これら３個の多型は、連鎖不平衡にあった（rs753307対rs1062708はr² = 0.2789、P = 1.13 × 10⁻¹²であり、rs753307対rs2287760はr² = 0.1078、P = 4.99 × 10⁻⁶であり、rs1062708対rs2287760はr² = 0.0977、P = 2.57 × 10⁻⁵であった）。ハプロタイプ頻度は、T (rs753307)−T (rs1062708)−G (rs2287760)が0.472、C−C−Cが0.1323、T−C−Gが0.1284、C−C−Gが0.0957、T−T−Cが0.0805、C−T−Gが0.0805、T−C−Cが0.0106、C−T−Cが1.31 × 10⁻¹⁰であった。イントロン8のrs1062708 (C→T, Leu205Leu)多型とrs2287760 (C→G)多型は、いずれもタグSNPであった。 The rs753307 (C → T) polymorphism is located in intron 13 of RUVBL2. Since the linkage disequilibrium block containing this polymorphism contains exon 7-15 of RUVBL2 and exon 3 of LHB, we determined the base sequence of these exons and the corresponding exon-intron boundary region (Fig. 5 ( Supplementary Figure 1C) In addition to rs753307, we detected rs1062708 (C → T, Leu205Leu) of exon 8 of RUVBL2 and rs2287760 (C → G) of intron 8. These three polymorphisms were in linkage disequilibrium. (Rs753307 vs rs1062708 is r ² = 0.2789, P = 1.13 × 10 ⁻¹² , rs753307 vs rs2287760 is r ² = 0.1078, P = 4.99 × 10 ⁻⁶ , rs1062708 vs rs2287760 is r ² = 0.0977, P = 2.57 × 10 ⁻⁵ ) The haplotype frequencies are 0.472 for T (rs753307) −T (rs1062708) −G (rs2287760), 0.1323 for C−C−C, 0.1284 for T−C−G, C− C-G was 0.0957, T-T-C was 0.0805, C-T-G was 0.0805, T-C-C was 0.0106, and C-T-C was 1.31 × 10 ⁻¹⁰ rs1062708 ( C → T, Leu205Le u) Polymorphism and rs2287760 (C → G) polymorphism were both tag SNPs.

次に、集団Ｂと集団Ｃにおいて、脳梗塞とエクソン中の３個のタグSNP（LLGL2のrs1671021 (T→C, Phe479Leu)、CELSR1のrs6007897 (A→G, Thr2268Ala)、及びRUVBL2のrs1062708 (C→T, Leu205Leu)多型）と、非同義SNP（CELSR1のrs4044210 (A→G, Ile2107Val)）との関連を検討した。カイ二乗検定によって、集団Ｂでは遺伝子型分布とアレル頻度の両者で、CELSR1のrs6007897 (A→G, Thr2268Ala)とCELSR1のrs4044210 (A→G, Ile2107Val)とLLGL2のrs1671021 (T→C, Phe479Leu)とが有意に（P ＜ 0.05）脳梗塞に関連した（表７）。カイ二乗検定によって、集団Ｃでは遺伝子型分布とアレル頻度の両者で、CELSR1のrs6007897とrs4044210が脳梗塞に有意に（P ＜ 0.05）関連した（表８）。 Next, in group B and group C, three tag SNPs in cerebral infarction and exon (LLGL2 rs1671021 (T → C, Phe479Leu), CELSR1 rs6007897 (A → G, Thr2268Ala), and RUVBL2 rs1062708 (C → T, Leu205Leu) polymorphism) and non-synonymous SNPs (CELSR1 rs4044210 (A → G, Ile2107Val)) were examined. By Chi-square test, CELSR1 rs6007897 (A → G, Thr2268Ala), CELSR1 rs4044210 (A → G, Ile2107Val) and LLGL2 rs1671021 (T → C, Phe479Leu) And were significantly (P <0.05) related to cerebral infarction (Table 7). By Chi-square test, CELSR1 rs6007897 and rs4044210 were significantly (P <0.05) related to cerebral infarction in both population genotype distribution and allele frequency (Table 8).

これら３個のタグSNPと１個の非同義置換多型と脳梗塞の関連について、集団Ａ−集団Ｃを組み合わせた全集団において検討した。カイ二乗検定により遺伝子型分布とアレル頻度を評価したところ、これら４個の多型は脳梗塞と有意に（P ＜ 0.05）関連した（表９）。 The association between these three tag SNPs, one non-synonymous substitution polymorphism, and cerebral infarction was examined in all populations in which population A to population C were combined. When genotype distribution and allele frequency were evaluated by chi-square test, these four polymorphisms were significantly (P <0.05) associated with cerebral infarction (Table 9).

年齢、性別、BMI、喫煙率、高血圧罹患率、糖尿病罹患率、及び高コレステロール血症罹患率を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、CRLSR1のrs6007897とrs4044210、LLGL2（優性モデル）のrs1671021、及びRUVBL2（劣性モデル）のrs1062708が有意に（P ＜ 0.05）脳梗塞と関連した。CELSR1のrs6007897のバリアント型Ｇ（Ala）アレルとrs4044210のＧ（Val）アレルは脳梗塞の危険因子であり、LLGL2のrs1671021のバリアント型Ｃ（Leu）アレルとRUVBL2のrs1062708のＴアレルは防御因子であった。これら４個の多型の遺伝子型分布は、脳梗塞患者群及び対照者群のいずれについても、ハーディ・ワインバーグ平衡にあった。
CELSR1のrs6007897とrs4044210は連鎖不平衡にあるため、これらの多型についてハプロタイプ解析を行った。この解析により、メジャーなハプロタイプは、A (rs6007897)−A (rs4044210)であり、これは脳梗塞の防御因子であった。一方、マイナーなハプロタイプは、G−Gであり、これは危険因子であった（表１０）。 Multinomial logistic regression analysis corrected for age, sex, BMI, smoking rate, hypertension prevalence, diabetes prevalence, and hypercholesterolemia prevalence, CRLSR1 rs6007897 and rs4044210, LLGL2 (dominant model) rs1671021, and RUVBL2 (Recessive model) rs1062708 was significantly (P <0.05) associated with cerebral infarction. CELSR1 rs6007897 variant G (Ala) allele and rs4044210 G (Val) allele are risk factors for cerebral infarction, LLGL2 rs1671021 variant C (Leu) allele and RUVBL2 rs1062708 T allele are protective factors there were. The genotype distribution of these four polymorphisms was in Hardy-Weinberg equilibrium for both the cerebral infarction patient group and the control group.
Since rs6007897 and rs4044210 of CELSR1 are in linkage disequilibrium, haplotype analysis was performed on these polymorphisms. According to this analysis, the major haplotype was A (rs6007897) -A (rs4044210), which was a protective factor for cerebral infarction. On the other hand, the minor haplotype was GG, which was a risk factor (Table 10).

最後に、これら３個のタグSNPと１個の非同義置換多型が、高血圧、２型糖尿病、高コレステロール血症、及び肥満に関連するか否かを検討した（表１１）。日本人と他のアジア人集団では、BMIが25 kg/m²以上を肥満と定義している（非特許文献９）ので、これに従って「肥満」を定義した。カイ二乗検定によって、全例において各疾患群と対照群との間で、これら４個の多型について遺伝子型分布及びアレル頻度を比較したところ、CELSR1のrs6007897とrs4044210、及びRUVBL2のrs1062708が、２型糖尿病に有意に（P ＜ 0.05）関連した。 Finally, we examined whether these three tag SNPs and one non-synonymous substitution polymorphism are associated with hypertension, type 2 diabetes, hypercholesterolemia, and obesity (Table 11). In Japanese and other Asian populations, BMI of 25 kg / m ² or more is defined as obesity (Non-patent Document 9), and “obesity” is defined accordingly. When the genotype distribution and allele frequency of these four polymorphisms were compared between each disease group and the control group by chi-square test in all cases, it was found that rs6007897 and rs4044210 of CELSR1 and rs1062708 of RUVBL2 were 2 Significantly (P <0.05) associated with type 2 diabetes.

＜考察＞
脳梗塞の主たる原因はアテローム血栓症であり、これに治療可能な危険因子として高血圧、糖尿病、及び高コレステロール血症が含まれる（非特許文献１０）。これら従来の危険因子に加えて、脳梗塞の発症には遺伝因子が重要である（非特許文献１１）。遺伝因子に基づいて脳梗塞の危険を予測することができれば、治療によって改善できる危険因子をどの程度まで積極的に治療するかどうかを決定するために有効となる。本研究によって、日本人集団においては、CELSR1のrs6007897 (A→G, Thr2268Ala)とrs4044210 (A→G, Ile2107Val)が、脳梗塞の発症に有意に関連し、バリアント型Ｇ(Ala)アレルとＧ（Val）アレルが危険因子であることが明らかとなった。 <Discussion>
The main cause of cerebral infarction is atherothrombosis, which includes hypertension, diabetes, and hypercholesterolemia as risk factors that can be treated (Non-patent Document 10). In addition to these conventional risk factors, genetic factors are important for the development of cerebral infarction (Non-patent Document 11). If the risk of cerebral infarction can be predicted based on genetic factors, it will be effective to determine how aggressively the risk factors that can be improved by treatment are treated. In this study, CELSR1 rs6007897 (A → G, Thr2268Ala) and rs4044210 (A → G, Ile2107Val) were significantly associated with the onset of cerebral infarction in the Japanese population, and variant G (Ala) allele and G The (Val) allele was found to be a risk factor.

CELSR1（７回膜貫通型カドヘリン（cadherin, epidermal growth factor (EGF) laminin A G-type repeats (LAG) seven-pass G-type receptor 1））は、カドヘリンタンパク質のフラミンゴ・サブファミリーに属している。フラミンゴ・サブファミリーは、カテニンとの相互作用を有しない特殊なカドヘリンから構成される。フラミンゴ・カドヘリンは、原形質膜に局在しており、細胞外ドメインには、９個のカドヘリンドメイン、７個のＥＧＦ様繰り返し、及び２個のＬＡＧ繰り返しを含んでいる。また、このサブファミリーに特異的な性質として、７回膜貫通ドメインを有している。これらのタンパク質は、カドヘリンドメインが同種結合作用を示し、ＥＧＦ様ドメインが細胞接着と受容体・リガンド相互作用を示すことにより、接触を介した情報伝達を行うリセプターとしての機能を持つと考えられている（Entrez Gene, NCBI：非特許文献１２−１４）。 CELSR1 (cadherin, epidermal growth factor (EGF) laminin A G-type repeats (LAG) seven-pass G-type receptor 1) belongs to the flamingo subfamily of cadherin proteins. The flamingo subfamily consists of special cadherins that do not interact with catenin. Flamingo cadherin is localized in the plasma membrane, and the extracellular domain contains 9 cadherin domains, 7 EGF-like repeats, and 2 LAG repeats. In addition, as a property specific to this subfamily, it has a seven-transmembrane domain. These proteins are thought to have a function as a receptor for signal transduction through contact, with the cadherin domain showing homogenous binding action and the EGF-like domain showing cell adhesion and receptor-ligand interaction. (Entrez Gene, NCBI: Non-Patent Documents 12-14).

in situ ハイブリダイゼーション及び逆転写酵素ＰＣＲ解析によれば、１１.５日目のマウス胚では、神経管、脳、肺上皮及び発生期の眼瞼においてCelsr1が発現していることが示されている。成熟マウスでは、Celsr1の発現は、脊髄、眼、及び脳に認められ、主に側脳室・第３脳室・及び第４脳室の上衣細胞に検出された（非特許文献１２）。Celsr1は、発生学的に調節された神経特異的遺伝子であり、初期胚形成に役割を有する（Entrez Gene, NCBI：非特許文献１２）。CELSR1のエクソン１７のrs4044210 (A→G, Ile2107Val)多型は、ホルモン受容体ドメインをコードする遺伝子領域に位置している。細胞外ドメインは、４個の遺伝的に保護されたシステイン残基を含んでおり、これらがジスルフィド結合を形成するらしい。このドメインは多くのホルモン受容体に存在することから、リガンド結合ドメインとして機能しているらしい（Entrez Gene, NCBI）。rs6007897とrs4044210の両多型がタンパク質の構造及び機能に対して与える影響については、明らかではない。CELSR1の遺伝子多型がヒトの疾患と関連したという報告は無い。 In situ hybridization and reverse transcriptase PCR analysis indicate that Celsr1 is expressed in the neural tube, brain, lung epithelium and nascent eyelids in the 11.5 day mouse embryo. In mature mice, the expression of Celsr1 was observed in the spinal cord, eyes, and brain, and was detected mainly in the ependymocytes of the lateral ventricle, the third ventricle, and the fourth ventricle (Non-patent Document 12). Celsr1 is a developmentally regulated nerve-specific gene and has a role in early embryogenesis (Entrez Gene, NCBI: Non-Patent Document 12). The rs4044210 (A → G, Ile2107Val) polymorphism of exon 17 of CELSR1 is located in the gene region encoding the hormone receptor domain. The extracellular domain contains four genetically protected cysteine residues that appear to form disulfide bonds. Since this domain exists in many hormone receptors, it appears to function as a ligand binding domain (Entrez Gene, NCBI). The effects of both rs6007897 and rs4044210 polymorphisms on protein structure and function are not clear. There is no report that CELSR1 gene polymorphism was associated with human disease.

今回の研究によれば、日本人集団においてLLGL2（lethal giant larvae homolog 2 gene）は脳梗塞に関連する候補遺伝子の一つであるが、集団Ｃにおいては、rs1671021(T→C, Phe479Leu)多型と脳梗塞との関連は認められなかった。この遺伝子は、ショウジョウバエの致死的巨大幼虫タンパク質（lethal (2) giant larvae protein）に類似するタンパク質をコードしている。このタンパク質は、非対称的な細胞分裂、上皮細胞極性の形成、及び細胞遊走に関係している（非特許文献１５，１６）。細胞の運命決定を行わせるショウジョウバエタンパク質の能力は、特殊なタンパク質キナーゼＣによって調節されている（非特許文献１６）。ヒトLLGL2タンパク質は、特殊なタンパク質キナーゼＣを含む複合体タンパク質と相互作用し、有糸分裂細胞の皮質に局在している（非特許文献１６）。LLGL2転写物の選択的スプライシングによって、タンパク質アイソフォームをコードする複数のｍＲＮＡ変異体が形成される（Entrez Gene, NCBI：非特許文献１５，１６）。このタンパク質の構造及び機能に対して、rs1671021がどのように影響するのかについては、不明である。LLGL2の遺伝子多型についてもヒトの疾患と関連したという報告は無い。 According to this study, LLGL2 (lethal giant larvae homolog 2 gene) is one of the candidate genes related to cerebral infarction in the Japanese population. There was no association between stroke and cerebral infarction. This gene encodes a protein similar to the Drosophila lethal (2) giant larvae protein. This protein is involved in asymmetric cell division, formation of epithelial cell polarity, and cell migration (Non-patent Documents 15 and 16). The ability of Drosophila proteins to make cell fate decisions is regulated by a special protein kinase C (Non-patent Document 16). Human LLGL2 protein interacts with a complex protein containing a special protein kinase C and is localized in the cortex of mitotic cells (Non-patent Document 16). By alternative splicing of LLGL2 transcripts, multiple mRNA variants encoding protein isoforms are formed (Entrez Gene, NCBI: Non-Patent Documents 15 and 16). It is unclear how rs1671021 affects the structure and function of this protein. There is no report that the LLGL2 gene polymorphism is associated with human diseases.

＜結論＞
脳梗塞に関連するとして特定された多型がタンパク質の構造や機能に対して如何なる影響を与えるかについては不明であるが、我々の研究の結果、日本人集団において脳梗塞に関連する遺伝子としてCELSR1が特定された。この遺伝子型を検討することによって、日本人集団における脳梗塞の遺伝的リスクを評価するための有用な情報が得られる。この結果に基づき、遺伝子多型を調べることにより、脳梗塞の危険性を知ることができる。
このように本実施形態によれば、脳梗塞について、遺伝的リスクを予測するための検出法を提供することができる。この実施形態を用いることにより、脳梗塞の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。 <Conclusion>
Although it is unclear how the polymorphism identified as related to cerebral infarction affects the structure and function of the protein, as a result of our study, CELSR1 is a gene related to cerebral infarction in the Japanese population. Was identified. Examining this genotype provides useful information for assessing the genetic risk of cerebral infarction in the Japanese population. Based on this result, the risk of cerebral infarction can be known by examining the gene polymorphism.
Thus, according to this embodiment, a detection method for predicting a genetic risk can be provided for cerebral infarction. By using this embodiment, it becomes possible to prevent cerebral infarction, and can greatly contribute medically and socially, such as extending the healthy life of the elderly, improving QOL, preventing stickiness and reducing medical costs in the future.

Rosamond W, Flegal K, Furie K, Go A, Greenlund K, Haase N, Hailpern SM, Ho M, Howard V, Kissela B, Kittner S, Lloyd-Jones D, McDermott M, Meigs J, Moy C, Nichol G, O’Donnell C, Roger V, Sorlie P, Steinberger J, Thom T, Wilson M, Hong Y; American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Heart disease and stroke statistics−2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 2008;117:e25−e146.Rosamond W, Flegal K, Furie K, Go A, Greenlund K, Haase N, Hailpern SM, Ho M, Howard V, Kissela B, Kittner S, Lloyd-Jones D, McDermott M, Meigs J, Moy C, Nichol G, O'Donnell C, Roger V, Sorlie P, Steinberger J, Thom T, Wilson M, Hong Y; American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.Heart disease and stroke statistics−2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. 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Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。It is a figure which shows the fine structure and characteristic of a microbead detected with Luminex100. ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。It is a figure which shows the outline | summary of the procedure of PCR-SSOP-Luminex method. rs1671021多型を含むLLGL2の連鎖不平衡ブロックを示す図である。It is a figure which shows the linkage disequilibrium block of LLGL2 containing rs1671021 polymorphism. rs9615362多型を含むCELSR1の連鎖不平衡ブロックを示す図である。FIG. 4 shows a linkage disequilibrium block of CELSR1 containing the rs9615362 polymorphism. rs753307多型を含むRUVBL2の連鎖不平衡ブロックを示す図である。FIG. 4 shows a linkage disequilibrium block of RUVBL2 containing the rs753307 polymorphism.

Claims

Polymorphism at the 12th nucleotide in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 3 (rs1671021 of LLGL2), (rs9615362 of CELSR1) polymorphism at the 13th nucleotide in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 7, as SEQ ID NO: 11 A polymorphism at the 17th base in the nucleotide sequence described ( RS753307 of RUVBL2 ) , a polymorphism at the 14th nucleotide in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 15 ( rs6007897 of CELSR1 ) , and a base described in SEQ ID NO: 19 Japan characterized by determining all SNPs of the polymorphism at the 15th base in the sequence ( rs4044210 of CELSR1 ) and the polymorphism at the 11th base ( rs1062708 of RUVBL2 ) in the base sequence described in SEQ ID NO: 23 Methods for detecting genetic risk of cerebral infarction in humans.

Polymorphism at the 12th nucleotide in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 3 (rs1671021 of LLGL2), (rs6007897 of CELSR1) polymorphism at 14 th base of the base sequence described in SEQ ID NO: 15, in SEQ ID NO: 19 To determine all SNPs of the polymorphism at the 15th base ( rs4044210 of CELSR1 ) in the base sequence described and the polymorphism at the 11th base ( rs1062708 of RUVBL2 ) of the base sequence described in SEQ ID NO: 23 Characteristic method for detecting genetic risk of cerebral infarction in Japanese .

3 SNPs of CELSR1 (polymorphism at the 13th base in the base sequence described in SEQ ID NO: 7 ( rs9615362 ) , polymorphism at the 15th base in the base sequence described in SEQ ID NO: 19 ( rs4044210 ) , sequence For the polymorphism at the 14th base in the base sequence described in number 15 ( rs6007897 ) ), C (rs9615362) -A (rs4044210) -A (rs6007897) or A- based on the base of any one SNP The method for detecting a genetic risk of cerebral infarction in Japanese according to claim 1 or 2 , wherein any one of GG is determined.