JP5609273B2 - 血小板解析方法及び血小板解析システム - Google Patents

Description

本発明は、血小板解析方法及び血小板解析システムに関し、特に、生体内イメージングによる血小板の解析に関する。

心筋梗塞や脳卒中等の脳・心血管疾患の多くは、血栓性疾患（アテローム血栓症）である。血栓の形成においては、血小板が重要な役割を果たしている。したがって、血栓症の治療薬や治療法を開発するためには、血小板の機能解析が欠かせない。

そこで、従来、例えば、非特許文献１及び非特許文献２に記載されているように、生きた動物の血管にレーザーを照射して内皮細胞を傷つけることにより人為的に血栓形成を誘発し、誘発された血栓の形成を共焦点レーザー顕微鏡により解析することが試みられていた。

具体的に、非特許文献１には、血栓形成を誘発するためのパルス窒素色素レーザーを照射する光源と、顕微鏡観察用の入射光としてアルゴン−クリプトンレーザーを照射する光源と、をそれぞれ準備し、まず、生きたマウスの血管にパルス窒素色素レーザーを照射して血栓形成を誘発し、その後、当該血管にアルゴン−クリプトンレーザーを照射して当該血栓形成を観察することが記載されている。

このような従来の血栓形成誘発法は、レーザー誘発血管壁傷害（ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｖｅｓｓｅｌ−ｗａｌｌ ｉｎｊｕｒｙ）又はレーザー誘発内皮傷害（ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｉｎｊｕｒｙ）と呼ばれ、顕微鏡観察用のレーザーとは異なる比較的強いレーザーを血管に照射することによって内皮細胞を破壊し、当該内皮細胞下の組織に含まれる細胞外マトリックスを血液中に露出させることで、血栓形成を強力に誘発していた。

一方、非特許文献３においては、生きた肥満マウスの脂肪組織における血液細胞の動態を高い時空間解像度の生体内イメージング（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ）で解析することが記載されている。ただし、この非特許文献３においては、人為的に血栓形成を誘発することについては何ら記載されていない。

Falati S, et al. Nat Med. 2002;8(10):1175-1181. Furie B, et al. J Thromb Haemost. 2007;5(Suppl 1):12-17. Nishimura S, et al. J Clin Invest. 2008;118(2):710-721.

上記従来の血栓形成誘発法によって強力に誘発される血栓形成は、血小板のみならず、内皮細胞の破壊及び細胞外マトリックスの露出に起因する様々な他の因子も関与し、血栓には白血球や赤血球も混入するといった、複雑な機構によるものであった。

しかしながら、例えば、血小板に特異的に作用する医薬品（例えば、抗血小板薬）を開発し、その薬効を判定する場合においては、シンプルな機構の血栓形成を誘発し、単一の血小板の挙動を解析することが有用である。この点、上記従来技術においては、上述のとおり、血小板に加えて多様な因子が関与する複雑な機構の血栓形成が誘発されるため、単一の血小板の挙動を解析することは困難であった。

本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、人為的に誘発した血栓形成における単一の血小板の解析を実現する血小板解析方法及び血小板解析システムを提供することをその目的の一つとする。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る血小板解析方法は、生きた動物の血管に対する入射光の照射に伴う前記血管からの出射光に基づき前記血管内の血小板を解析する方法であって、前記入射光の照射により活性酸素の生成を誘導するイニシエーター化合物が前記血管内に投与された前記生きた動物を準備し、前記イニシエーター化合物を含む血液が流通する前記生きた動物の前記血管に前記入射光を照射することによって、前記血管内における活性酸素の生成及び血栓形成の誘発と、前記血管からの前記出射光の検出と、を並行して行うことを特徴とする。本発明によれば、人為的に誘発した血栓形成における単一の血小板の解析を実現する、血小板解析方法を提供することができる。

また、前記血小板解析方法においては、前記入射光をマルチビームスキャンにより照射することとしてもよい。また、前記血小板解析方法においては、前記生きた動物の前記血管の少なくとも一部の径方向全域を含む観察視野を設定し、前記観察視野の全体に前記入射光を照射することとしてもよい。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る血小板解析システムは、生きた動物の血管に対する入射光の照射に伴う前記血管からの出射光に基づき前記血管内の血小板を解析するシステムであって、前記入射光の照射により活性酸素の生成を誘導するイニシエーター化合物が前記血管内に投与された前記生きた動物の前記血管を保持する保持部と、前記血管内における活性酸素の生成及び血栓形成の誘発と、前記血管からの前記出射光の検出と、を並行して行うために、前記イニシエーター化合物を含む血液が流通する前記生きた動物の前記血管に前記入射光を照射する照射部と、前記血管からの前記出射光を検出する検出部と、を備えたことを特徴とする。本発明によれば、人為的に誘発した血栓形成における単一の血小板の解析を実現する、血小板解析システムを提供することができる。

また、前記血小板解析システムは、前記入射光をマルチビームスキャンにより照射することとしてもよい。また、前記血小板解析システムは、前記生きた動物の前記血管の少なくとも一部の径方向全域を含むように設定された観察視野の全体に前記入射光を照射することとしてもよい。

本発明によれば、人為的に誘発した血栓形成における単一の血小板の解析を実現する血小板解析方法及び血小板解析システムを提供することができる。

本発明の一実施形態に係る血小板解析システムの一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る血小板解析における血栓形成誘発の一例を示す説明図である。 従来の血栓形成誘発を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る血小板解析において設定される観察視野の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において血小板を解析した結果の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において血管壁に接着する血小板を定量した結果の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において血栓の発達を定量した結果の一例を示す説明図である。

以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は、本実施形態に限られるものではない。

まず、本実施形態に係る血小板解析システム（以下、「本システム」という。）について説明する。図１は、本システムの一例を示す説明図である。図１に示す例において、本システム１００は、生きた動物１０の血管１１に対する入射光Ｌｉの照射に伴う当該血管１１からの出射光Ｌｏに基づき当該血管１１内の血小板を解析するシステムであって、当該入射光Ｌｉの照射により活性酸素の生成を誘導するイニシエーター化合物が当該血管１１内に投与された当該生きた動物１０の当該血管１１を保持する保持部１１０と、当該血管１１内における活性酸素の生成及び血栓形成の誘発と、当該血管１１からの当該出射光Ｌｏの検出と、を並行して行うために、当該イニシエーター化合物を含む血液が流通する当該生きた動物１０の当該血管１１に当該入射光Ｌｉを照射する照射部１２０と、当該血管１１からの当該出射光Ｌｏを検出する検出部１３０と、を備えている。

保持部１１０は、生きた動物１０の血管１１に対する入射光Ｌｉの照射及び当該血管１１からの出射光Ｌｏの出射が可能となるように当該動物１０の当該血管１１を保持する。保持部１１０は、例えば、顕微鏡の試料ステージとすることができ、好ましくは倒立顕微鏡の試料ステージとすることができる。

保持部１１０が倒立顕微鏡の試料ステージであり、動物１０がマウス等の小動物である場合には、当該試料ステージ上に血管１１が露出した当該動物１０を載せるだけで、当該血管１１を簡便に安定して保持しつつ、入射光Ｌｉの照射及び出射光Ｌｏの検出を行うことができる。

照射部１２０は、血管１１から検出用の出射光Ｌｏを得ることに加えて、後述するイニシエーター化合物による活性酸素の生成を誘導することをも目的とした入射光Ｌｉを照射する。照射部１２０は、例えば、顕微鏡観察用の入射光Ｌｉを照射する装置とすることができ、好ましくは共焦点レーザー顕微鏡等のレーザー顕微鏡による観察用の入射光Ｌｉとして用いられるレーザーを照射する装置とすることができる。

レーザーの種類及び出力は、血管１１から出射光Ｌｏを得ることができ、且つイニシエーター化合物による活性酸素の生成を誘導できる範囲であれば特に限られず、任意に選択することができる。すなわち、レーザーとしては、例えば、アルゴン−クリプトンレーザー、固体半導体レーザーを用いることができる。また、レーザーの出力は、例えば、生体適合性の観点から５〜５０ｍＷとすることが好ましい。

検出部１３０は、入射光Ｌｉの照射に対応して血管１１から出射される出射光Ｌｏ（例えば、蛍光又は反射光）を検出する。検出部１３０は、例えば、ＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）カメラ又はＣＭＯＳ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｍｅｔａｌ ｏｘｉｄｅ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）カメラとすることができ、好ましくはＣＣＤカメラとすることができる。

また、本システム１００は、入射光Ｌｉをマルチビームスキャンにより照射することもできる。すなわち、図１に示すように、本システム１００は、入射光Ｌｉをマルチビームスキャンにより照射するための光学系を備えている。

具体的に、本システム１００は、ピンホールアレイディスク（いわゆるニポウ（ｎｉｐｋｏｗ）ディスク）１４０を備えている。ピンホールアレイディスク１４０は、多数（例えば、数百個）のピンホール１４０ａが所定のパターン（図１に示す例では渦巻状）で形成され、回転可能に設けられた円板状の部材である。

マルチビームスキャンにおいては、照射部１２０から出力された入射光Ｌｉ（例えば、１本のレーザー）を複数（例えば、数百本）に分割して、分割により得られた複数の入射光Ｌｉ（例えば、分割前の１本のレーザーより強度が弱い複数本のレーザー）により血管１１の観察対象とする範囲をスキャンする。

また、図１に示す例において、本システム１００は、さらにマイクロレンズアレイディスク１４１を備えている。マイクロレンズアレイディスク１４１は、ピンホールアレイディスク１４０のピンホール１４０ａに対応する多数のマイクロレンズ１４１ａが、当該ピンホール１４０ａに対応するパターン（図１に示す例では同一のパターン（渦巻状））で形成され、回転可能に設けられた円板状の部材である。マイクロレンズアレイディスク１４１は、ピンホールアレイディスク１４０よりも入射光Ｌｉの下流側に配置される。

照射部１２０から出力された入射光Ｌｉは、マイクロレンズアレイディスク１４１の各マイクロレンズ１４１ａを通過して、ピンホールアレイディスク１４０の対応する各ピンホール１４０ａに集光される。

また、図１に示す例において、本システム１００は、さらに処理部１５０及び表示部１５１を備えている。処理部１５０は、検出部１３０が出射光Ｌｏの検出に基づき生成した電気信号を受け入れて、当該電気信号に基づき画像データを生成する。表示部１５１は、処理部１５０が生成した画像データに基づき形成された画像を表示する。

処理部１５０は、例えば、ＣＰＵ（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｕｎｉｔ）等の処理装置や、ＲＡＭ（ｒａｎｄｏｍ ａｃｃｅｓｓ ｍｅｍｏｒｙ）等の主記憶装置を備えたコンピュータとすることができる。表示部１５１は、例えば、液晶ディスプレイ等の表示装置とすることができる。

なお、処理部１５０は、例えば、保持部１１０（例えば、顕微鏡の試料ステージ）の移動や位置決定、照射部１２０による入射光Ｌｉの照射のオン／オフ、当該入射光Ｌｉの照射強度、ピンホールアレイディスク１４０やマイクロレンズアレイディスク１４１を含む光学系の条件設定等の処理を行うこととしてもよい。

ここで、図１を参照しながら、マルチビームスキャンを行うための共焦点光学系を備えた本システム１００の動作について説明する。まず、照射部１２０は、保持部１１０に保持された生きた動物１０の血管１１に向けて入射光Ｌｉを出力する。

入射光Ｌｉは、励起フィルター１４２、回転するマイクロレンズアレイディスク１４１、ダイクロイックミラー１４３、回転するピンホールアレイディスク１４０、及び対物レンズ１４４を順次通過して、動物１０の血管１１に照射される。

入射光Ｌｉの照射によって血管１１から出射された出射光Ｌｏは、対物レンズ１４４、回転するピンホールアレイディスク１４０を順次通過し、ダイクロイックミラー１４３により反射され、エミッションフィルター１４５を通過して検出部１３０に到達する。

出射光Ｌｏを検出した検出部１３０は、当該出射光Ｌｏの検出結果に対応する電気信号を生成し、当該電気信号を処理部１５０に出力する。処理部１５０は、検出部１３０から受け入れた電気信号に基づいて画像形成用の画像データを生成する。表示部１５１は、処理部１５０から受け入れた画像データに基づいて、血管１１の画像を表示する。

本システム１００のユーザは、処理部１５０（例えば、画像解析用のソフトウェアがインストールされたコンピュータ）を操作することにより、表示部１５１に表示された血管１１の画像について、様々な解析を行うことができる。

次に、本実施形態に係る血小板解析方法（以下、「本方法」という。）について説明する。本方法は、上述した本システム１００を用いることにより好ましく実施することができる。

本方法は、生きた動物１０の血管１１に対する入射光Ｌｉの照射に伴う当該血管１１からの出射光Ｌｏに基づき当該血管１１内の血小板を解析する方法であって、当該入射光Ｌｉの照射により活性酸素の生成を誘導するイニシエーター化合物が当該血管１１内に投与された当該生きた動物１０を準備し、当該イニシエーター化合物を含む血液が流通する当該生きた動物１０の当該血管１１に当該入射光Ｌｉを照射することによって、当該血管１１内における活性酸素の生成及び血栓形成の誘発と、当該血管１１からの当該出射光Ｌｏの検出と、を並行して行う方法である。

本方法においては、まず、生きた動物１０を準備する。動物１０は、ヒト以外の動物であれば特に限られない。すなわち、動物１０としては、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類を用いることができ、哺乳類を好ましく用いることができる。

哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコを用いることができ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の小動物を好ましく用いることができる。図１に示す例では、動物１０としてマウスを用いている。また、動物１０としては、その種類にかかわらず、体重が１ｋｇ以下のものを好ましく用いることができる。

動物１０には麻酔をかける。麻酔の方法は、特に限られず、例えば、ウレタン、ペントバルビタール、イソフルラン等の麻酔剤を注射や吸入等の方法で動物１０に投与する。

次に、麻酔をかけた動物１０の血管１１を観察可能となるように露出させる。すなわち、例えば、動物１０の体内（例えば、腹腔内）の血管１１を解析する場合には、麻酔をかけた当該動物１０の体の一部（例えば、腹部）を切開して、当該血管１１を外部から観察できるように一部露出させる。

解析の対象とする血管１１としては、内部の血小板を観察できるものであれば特に限られず、動物１０の任意の臓器又は組織に含まれる任意の血管１１を解析の対象とすることができる。すなわち、血管１１としては、比較的細いものが好ましく、例えば、外径が１０μｍ以下のものが好ましい。具体的に、血管１１としては、例えば、毛細血管、細動脈、後毛細血管細静脈が好ましい。このような細い血管１１を含む組織としては、例えば、腸間膜、脂肪組織、骨格筋等が挙げられる。

次に、血管１１を露出した生きた動物１０を観察に適した位置に配置する。すなわち、図１に示すように、動物１０の血管１１を本システム１００の保持部１１０に保持する。図１に示す例では、保持部１１０として倒立顕微鏡の試料ステージを用いているため、血管１１が露出している切開部位を鉛直方向下方に向けて動物１０を当該保持部１１０に載せるだけで、当該動物１０の自重によって、当該血管１１を当該保持部１１に近接して安定に保持することができる。

血管１１を含む観察部位は、湿潤状態に保つことが好ましい。すなわち、例えば、生理食塩水等の水溶液を用いて観察部位を湿らせ、さらに当該観察部位を非透水性で且つ透明なフィルムで覆うことにより、当該観察部位を湿潤状態で観察可能に保つことができる。

動物１０の体温は、適切な範囲に維持することが好ましい。すなわち、例えば、ヒーティングプレート等の保温装置を用いて、動物１０の体温を正常時の範囲（例えば、３７℃）に維持する。

また、動物１０の血管１１内にイニシエーター化合物を投与する。イニシエーター化合物は、入射光Ｌｉの照射により活性酸素の生成を誘導する化合物であれば特に限られない。

すなわち、イニシエーター化合物としては、例えば、フォトダイナミックセラピー（ＰＤＴ）において活性酸素の生成のために用いられ得る光感受性化合物を用いることができる。具体的に、例えば、ヘマトポルフィリン又はその誘導体（例えば、フォトフリン（登録商標）、レザフィリン（登録商標）、ビスダイン（登録商標））を用いることができる。

また、イニシエーター化合物としては、例えば、光増感剤として用いられ得る色素化合物を用いることができる。具体的に、例えば、ローズベンガル、メチレンブルーを用いることができる。

なお、イニシエーター化合物の使用により生成される活性酸素は、血栓形成を誘発できるものであれば特に限られず、例えば、一重項酸素やスーパーオキシドアニオンラジカル等の酸素原子からなる活性酸素や、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素が挙げられ、特に当該酸素原子からなる活性酸素が好ましい。

また、動物１０の血管１１内に、血漿に溶解又は分散し且つ細胞を染色しない色素化合物を投与することもできる。この色素化合物としては、例えば、蛍光化合物を用いることができる。

蛍光化合物は、血漿に溶解又は分散し且つ細胞を染色せず、入射光Ｌｉの照射により蛍光を発する化合物であれば特に限られず、例えば、蛍光物質で標識された多糖類又はタンパク質を好ましく用いることができる。具体的に、例えば、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識されたデキストランを用いることができる。

このような色素化合物を血管１１内に投与することにより、血液のうち細胞以外の成分（すなわち、血漿）を選択的に染色し、当該血液中の細胞を非染色部分として簡便且つ明瞭に可視化することができる。

また、このような色素化合物として、血管１１の内皮細胞が破壊された場合に血液中から溢出するもの（例えば、分子量が比較的小さいＦＩＴＣ−デキストラン）を用いることにより、当該内皮細胞の破壊の有無を簡便且つ明瞭に可視化することができる。

また、動物１０の血管１１内に、特定の細胞を特異的に染色する色素化合物を投与することもできる。この色素化合物としては、例えば、蛍光化合物を用いることができる。

蛍光化合物は、特定の細胞に特異的に結合し、入射光Ｌｉの照射により蛍光を発する化合物であれば特に限られず、例えば、当該特定の細胞の表面に特異的に結合する、蛍光物質で標識された抗体や、核酸を特異的に染色する蛍光化合物を好ましく用いることができる。具体的に、例えば、血小板を染色するためにＦＩＴＣ又はＲ−フィコエリスリンで標識された抗ＣＤ４１抗体を用いることができ、白血球を染色するためにアクリジンオレンジを用いることができる。

このような色素化合物を血管１１内に投与することにより、血液中の特定の細胞を特異的に染色して簡便且つ明瞭に可視化することができる。

動物１０の血管１１内に、血漿に溶解又は分散し且つ血小板を染色しない色素化合物を投与し、且つ当該血小板を何ら染色しない場合には、染色による影響（例えば、抗体が細胞表面に結合することによる影響）を何ら受けない自然な単一の血小板を、当該血管１１内の非染色部分として簡便且つ明瞭に可視化することができる。動物１０の血管１１内にイニシエーター化合物や上述の色素化合物を投与する方法は特に限られず、例えば、静脈への注射による全身投与を好ましく用いることができる。

次に、本方法においては、イニシエーター化合物を含む血液が流通する血管１１に、入射光Ｌｉを照射する。すなわち、本システム１００の保持部１１０に保持された生きた動物１０の血管１１に対して、照射部１２０から入射光Ｌｉを照射する。

入射光Ｌｉは、血管１１から出射光Ｌｏを得ることができ、且つイニシエーター化合物による活性酸素の生成を誘導できる光であれば特に限られず、例えば、レーザーを好ましく用いることができる。

レーザーの種類及び強度は、本システム１００の照射部１２０について上述したのと同様、血管１１から出射光Ｌｏを得ることができ、且つイニシエーター化合物による活性酸素の生成を誘導できる範囲であれば特に限られず、任意に選択することができる。すなわち、レーザーとしては、例えば、アルゴン−クリプトンレーザー、固体半導体レーザーを用いることができる。また、レーザーの出力は、例えば、生体適合性の観点から５〜５０ｍＷとすることが好ましい。

ここで、本発明において特徴的な点の一つは、出射光Ｌｏを得るための観察用の入射光Ｌｉを、血管１１内における血栓形成の誘発に用いることである。

図２Ａは、本実施形態に係る血小板解析における血栓形成誘発の一例を示す説明図である。図２Ｂは、従来の血栓形成誘発を示す説明図である。図２Ａ及び図２Ｂには、解析の対象となる血管１１の一部を模式的に示している。

血管１１は、その内面を覆う内皮細胞１２と、当該内皮細胞１２下の組織（以下、「内皮下組織１３」という。）と、を有している。内皮下組織１３は、平滑筋細胞等の他の細胞及びコラーゲン等の細胞外マトリックスを含んでいる。血管１１内には、血液２０が流通している。血液２０は、血小板２１ａ，２１ｂ，２１ｃ、白血球２２、赤血球２３等の血液細胞と、当該血液細胞以外の液体成分である血漿と、を含んでいる。

従来の血栓形成誘発法においては、上述のとおり、顕微鏡観察用のレーザーとは別途独立に準備された、血栓形成誘発縫い特化した比較的強いレーザーを血管１１に照射していた。したがって、図２Ｂに示すように、強力なレーザーの照射によって血管１１の内皮細胞１２の一部が破壊され、その下の内皮下組織１３（特に、コラーゲン等の細胞外マトリックス）が露出して血液２０と接触することによって、血栓形成が強力に誘発されていた。

これら内皮細胞１２の破壊及び内皮下組織１３（特に、コラーゲン等の細胞外マトリックス）の露出という強力なトリガーにより誘発された血栓形成においては、露出した内皮下組織１３に血小板２１ｃが次々に接着し、積み上がっていく。

血管１１の内壁に接着した血小板２１ｃは、図２Ｂに示すように、血液２０中を流れる血小板２１ａのような円板状から、とげのあるいびつな形状に変形し、活性化される。また、こうして強力に誘発された血栓形成には、内皮細胞１２の破壊及び内皮下組織１３の露出に起因する様々な因子（例えば、コラーゲンや組織因子）が関与し、形成された血栓には、白血球２２や赤血球２３等の他の血液細胞が混入する。このように、従来の血栓形成誘発法においては、必然的に、複雑な機構による血栓形成が誘発されていた。

これに対し、本方法においては、観察用の比較的弱い入射光Ｌｉ（例えば、レーザー顕微鏡における観察用のレーザー）を、イニシエーター化合物が投与された血管１１に照射することにより、血栓形成を穏やかに誘発する。

すなわち、血管１１内を流通する血液２０に含まれるイニシエーター化合物に観察用の入射光Ｌｉを照射することにより、当該血管１１内において活性酸素を生成する。より具体的に、血管１１の解析対象とする範囲に入射光Ｌｉを継続的に照射することにより、当該範囲において、活性酸素を継続的に生成する。

このとき、照射される入射光Ｌｉは、観察用の出射光Ｌｏの取得に適した比較的弱いものであるため、図２Ａに示すように、血管１１の内皮細胞１２は、破壊されない。したがって、上記従来法とは異なり、内皮細胞１２の破壊及び内皮下組織１３の露出に起因する様々な因子の関与や、血小板２１ａ，２１ｂ以外の血液細胞の混入を効果的に低減又は回避することができる。

そして、継続的な活性酸素の生成をトリガーとして、血小板２１ｂは、血管１１の内面を覆っている内皮細胞１２の表面に接着し、積み上がっていく。このとき、血管１１の内壁に接着した血小板２１ｂは、図２Ａに示すように、血液２０中を流れる血小板２１ａと同様に、円板状の形状を維持している。すなわち、円板状の血小板２１ｂが内皮細胞１２上に積み上がることにより、実質的に当該血小板２１ｂのみからなる血栓が形成される。

したがって、本方法によれば、単一の血小板２１ｂの挙動を観察するのに適した、シンプルな機構による血栓形成を簡便に且つ確実に誘発することができる。なお、血小板２１ｂの形状が円板状に保たれたまま血栓形成が促進される機構の詳細は明らかでないが、例えば、従来法とは異なり、内皮細胞１２を破壊することなく、イニシエーター化合物を介して生成された活性酸素のみをトリガーとして用いることにより、血小板２１ｂが穏やかに活性化されることによるものと考えられる。

また、本発明において特徴的な点の他の一つは、血管１１内における活性酸素の生成及び血栓形成の誘発と、当該血管１１からの当該出射光Ｌｏの検出と、を並行して行うことである。

すなわち、本方法においては、上述のとおり、血栓形成の誘発に観察用の入射光Ｌｉを用いるため、当該血栓形成の誘発と同時に、血管１１から観察用の出射光Ｌｏを得ることができる。したがって、血管１１内における血栓形成の開始前又は開始時から、単一の血小板２１ｂの挙動を確実に観察することができる。

また、本方法においては、極めて短時間で血栓を形成することができる。すなわち、例えば、入射光Ｌｉの照射開始から５〜２０秒程度の間に、血小板２１ｂの血管壁への接着、積み上がり、凝集及び血管１１の閉塞といった、血栓形成の全過程を実現することができる。

したがって、血管１１内に投与された色素化合物の退色を効果的に低減しつつ、血栓形成の全過程における単一の血小板２１ｂの挙動を明瞭且つ確実に観察することができる。

また、本方法においては、入射光Ｌｉをマルチビームスキャンにより照射することもできる。この場合、図１に示すように、マルチビームスキャンを行うための光学系を備えた本システム１００を好ましく用いることができる。

マルチビームスキャンにおいては、上述のとおり、複数の比較的弱い入射光Ｌｉにより血管１１の所定範囲をスキャンするため、当該血管１１の各照射点における照射強度を低く抑えながら、当該血管１１の当該所定範囲に高速で入射光Ｌｉを照射することができる。

したがって、血管１１内に投与された色素化合物の退色を効果的に低減しつつ、上述の穏やかな血栓形成を短時間で効率よく誘発するとともに、当該血栓形成における単一の血小板２１ｂの挙動を明瞭且つ確実に観察することができる。

また、本方法においては、血管１１の少なくとも一部の径方向全域を含む観察視野を設定し、当該観察視野の全体に入射光Ｌｉを照射することもできる。図３は、本発実施形態に係る血小板解析において設定される観察視野の一例を示す説明図である。

図３に示す例において、生きた動物１０において露出させた血管１１は、第一の分岐部分１１ａと、第二の分岐部分１１ｂと、これら２つの分岐部分１１ａ，１１ｂが下流端で合流して形成された合流部分１１ｃと、を含んでいる。そして、この例においては、図３に示すように、第一の分岐部分１１ａ、第二の分岐部分１１ｂ及び合流部分１１ｃのそれぞれの径方向全域を含む観察視野３０（図３において破線で囲まれた矩形範囲）を設定し、当該観察視野３０の全体に入射光Ｌｉを照射する。

したがって、この観察視野３０に含まれる血管１１の各部分１１ａ，１１ｂ，１１ｃの径方向全域において、活性酸素を効率よく生成させて速やかに血栓形成を誘発するとともに、当該血栓形成における単一の血小板の挙動を確実に観察することができる。なお、図３に示すような血管１１について、例えば、合流部分１１ｃの径方向全域を含み、第一の分岐部分１１ａ及び第二の分岐部分１１ｂを含まない観察視野３０を設定することもできる。

また、このような観察視野３０の全体に、上述のマルチビームスキャンによって入射光Ｌｉを照射することにより、血管１１内に投与された色素化合物の退色を効果的に低減しつつ、血管１１の径方向全域において、血栓形成を短時間で効率よく誘発するとともに、当該血栓形成における単一の血小板２１ｂの挙動を明瞭且つ確実に観察することができる。

なお、図１に示すような本システム１００を用いて観察視野３０を設定する場合には、例えば、画像解析用ソフトウェアがインストールされたコンピュータを処理部１５０として用い、液晶ディスプレイ等の表示部１５１に表示された血管１１の画像の所望の範囲を座標値等に基づき当該観察視野３０として指定する。

そして、本方法においては、血管１１からの出射光Ｌｏを検出し、当該検出の結果に基づいて、生きた動物１０の血管１１内における単一の血小板２１ａ，２１ｂ（図２Ａ参照）を解析する。

すなわち、例えば、出射光Ｌｏの検出結果に基づき、血管１１内における単一の血小板２１ａ，２１ｂの経時的な挙動を示す画像を逐次的に取得する。具体的に、例えば、本システム１００においては、検出部１３０による出射光Ｌｏの検出結果に基づき、処理部１５０が所定の時間間隔で得られた当該検出結果に対応する複数の画像データを生成し、表示部１５１が当該複数の画像データに対応する画像を、当該所定の時間間隔で撮影された複数の画像（静止画又は動画）として表示する。

また、こうして所定の時間間隔で得られた複数の画像に基づき、血栓形成における単一の血小板２１ｂを定性的又は定量的に解析することもできる。すなわち、例えば、上述のように誘発されたシンプルな血栓形成において、単一の血小板２１ｂが血管壁に接着し、積み上がり、血栓が発達し、安定化していく過程の全部又は一部における当該単一の血小板２１ｂの挙動を定性的又は定量的に解析する。

具体的に、例えば、血漿に溶解又は分散し且つ血小板２１ａ，２１ｂを染色しない色素化合物を血管１１に投与し、且つ当該血小板２１ａ，２１ｂを何ら染色しない場合には、単一の血小板２１ａ，２１ｂは、染色された血漿のバックグラウンド中で染色されていない粒子として、明瞭に可視化されるため、個々の血小板２１ｂの形状及び数を経時的に評価することができる。

なお、白血球２２や赤血球２３等の他の血液細胞を染色しない場合であっても、単一の血小板２１ａ，２１ｂは、細胞のサイズによって簡便に且つ確実に、当該他の血液細胞と区別することができる。

定性的又は定量的な解析は、例えば、図１に示すような本システム１００において、処理部１５０として、解析用のソフトウェアがインストールされたコンピュータを用いることにより行うことができる。

このように、本方法及び本システム１００によれば、シンプルな機構による血栓形成を誘発することができ、且つ当該血栓形成における単一の血小板２１ｂの挙動を簡便に且つ効率よく解析することができる。

すなわち、本方法及び本システム１００によれば、単一の血小板が血栓を形成する様子を手に取るように可視化できる、従来にない、生体内イメージング（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ）による単一血小板の機能評価システムを実現することができる。その結果、従来の「血小板凝集塊のイメージング」ではなく、「単一血小板のイメージング」が可能となった。

しかも、本方法で形成される血栓は、白血球や赤血球が混入しない、実質的に血小板のみからなる血栓である。この点、例えば、抗血小板薬の薬効判定においては、シンプルなモデルの方が薬効の差異を検出しやすい。

したがって、血小板のみからなるシンプルな血栓形成を人為的に実現する本方法及び本システム１００は、例えば、抗血小板薬等の血小板を標的とした新規医薬品の薬効判定の評価系として極めて有用である。

また、本方法及び本システム１００によれば、従来の止血時間の測定や、頸動脈の閉塞時間の測定等の評価とは異なり、単一血小板の動態を可視化することができる。すなわち、血小板が血管壁に付着し、積み上がり、血栓が発達し、安定化してく、血栓形成に関する全ての過程を定量的に解析することができる。具体的に、例えば、入射光Ｌｉの照射後に血栓形成に寄与した血小板の数を測定することにより、当該血小板の血栓形成能を定量することができる。

この定量結果は、従来の生きた動物の頸動脈に塩化鉄による傷害を起こすモデルにおける血栓による閉塞時間と強い相関を示しており、生体内の血小板機能を極めて鋭敏に示していると考えられる。しかも、上述のとおり、従来の止血時間の計測では分からなかった、血栓形成の素過程を可視化することができる。

したがって、本方法及び本システム１００は、例えば、遺伝子改変された動物において、当該遺伝子改変が血栓形成のどの過程に影響を及ぼしているかの評価系等、血小板機能の評価系としても極めて有用である。

次に、本実施例形態に係る具体的な実施例について説明する。

［解析システム］
図１に示すような本システム１００を用いた生体内イメージングにより、単一の血小板の挙動及び血栓形成の過程を可視化した。すなわち、倒立顕微鏡の試料ステージである保持部１１０と、アルゴン−クリプトンレーザー（励起波長λｍａｘが４８８ｎｍ又は５６８ｎｍ、出力３０ｍＷ）を照射するレーザー発振装置である照射部１２０と、ピンホールアレイディスク１４０及びマイクロレンズアレイディスク１４１を含む光学系と、を備えたニポウ式スピニングディスク共焦点顕微鏡（ＣＳＵ−Ｘ１、横河電機株式会社製）を用いた。この光学系は、対物レンズ１４４（１００倍油浸、開口数１．４０）、マルチダイクロイックミラー（ダイクロイックミラー１４３）及び適切なバンドパスフィルター（励起フィルター１４２、エミッションフィルター１４５）を含んでいた。

検出部１３０としては、ＥＭ−ＣＣＤ（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）カメラ（ｉＸｏｎ、Ａｎｄｏｒ社製)を用いた。処理部１５０としては、解析用ソフトウェア（ＩｐＬａｂ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．６、Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ.)がインストールされたコンピュータを用いた。表示部１５１としては、液晶ディスプレイを用いた。

これらの構成を備えた本システム１００は、高い時空間解像度（８０ｎｍ／ピクセル）を有しており、ピンホールアレイディスク１４０及びマイクロレンズアレイディスク１４１を５０００ｒｐｍで回転させることにより、１０００フレーム／秒までの高速で画像取得が可能であった。

また、本システム１００は、動物１０の臓器や組織の表面から１００μｍ程度の深さまでであれば、細胞や血流を明瞭に観察することが可能であった。なお、本システム１００の空間解像度は、光を用いた観察における解像度の理論的な最大値（回折限界）にほぼ達していた。

［血栓形成における単一血小板の可視化］
動物としては、オスのＣ５７ＢＬ/６マウスを使用した。尾静脈への注射により１．５ｇ／ｋｇ−ＢＷ（ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）のウレレタンを全身投与することでマウスを麻酔した。麻酔したマウスの腹部に、腸間膜を体外から観察できる程度の小さな切開を形成した（観察窓のサイズは５ｍｍ程度であった）。切開部分は、生理食塩水で湿らせるとともに非透水性で透明な樹脂フィルムで覆うことにより、湿潤状態に維持した。

細胞をネガティブイメージで可視化するため、尾静脈への注射により２０ｍｇ／ｋｇ−ＢＷのＦＩＴＣ−デキストラン（分子量１４００００）をマウスに全身投与した。腹部の切開部分が試料ステージに近接するように、マウスをうつぶせにして当該試料ステージに載せた。また、ヒーティングプレートを用いて、試料ステージ上のマウスの体温を３７℃に維持した。また、レーザー照射により活性酸素（ＲＯＳ：ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）を生成するため、尾静脈への注射により、１．８ｍｇ／ｋｇ−ＢＷのヘマトポルフィリンを、マウスに全身投与した。解析の対象とした毛細血管の直径は２〜１０μｍであった。コンピュータ上で、毛細血管の一部の径方向全域を含む観察視野を設定した。

そして、マルチビームスキャンにより、この観察視野全体に、アルゴン−クリプトンレーザー（励起波長４８８ｎｍ、出力３０ｍＷ）を２０秒間照射した。このレーザー照射によって、観察視野内の毛細血管の径方向全域において、活性酸素の生成を介した血栓形成の誘発及び進行と、当該毛細血管内における血小板の挙動を示す逐次的な画像の取得と、を並行して行った。画像は、３０フレーム／秒で取得した。また、各画像を得るためのレーザー照射時間は１０ミリ秒であった。

図４は、本実施例において血小板を解析した結果の一例を示す説明図である。図４には、レーザー照射の開始後、２秒（２ｓ）、４秒（４ｓ）、８秒（８ｓ）、１２秒（１２ｓ）及び１６秒（１６ｓ）が経過した時点において得られた画像を示している。右列の画像は、対応する左列の画像の一部（左列最上の画像において四角の枠で囲まれた部分及び左列他の画像における対応する部分）を拡大した部分画像である。なお、毛細血管内において血液は、左列最上の画像に示す矢印の指す方向に流れていた。

図４に示すように、毛細血管内は血液に含まれるＦＩＴＣの蛍光により染色され、血小板を含む血液細胞は、当該蛍光のバックグラウンド中において染色されていない黒い粒子として可視化された。個々の血小板は、そのサイズに基づいて他の血液細胞から区別され、染色されていない円板状の黒い粒子として明瞭に可視化された。

図４に示すように、腸間膜の毛細血管に対するレーザー照射を開始してから少なくとも４秒後には、当該毛細血管内において、血小板が円板状のまま血管壁に接着し始めた。すなわち、レーザー照射開始後数秒以内に起こる、血栓形成の極めて初期の段階を観察することができた。

その後、血液中を流れる血小板がさらに急激に積み重なった（ｐｉｌｅ−ｕｐ）。積み重なった血小板は、図２Ａにも示したように、円板状の形状を保っていた。さらに、形成された血栓により、毛細血管の内径が低減され、血液の流速も低減された。そして、レーザー照射開始から１６秒後には、円板状の血小板が凝集して形成された血栓により、毛細血管はほぼ閉塞された。

本実施例に係る生体内イメージングによれば、図４に示すように、血管壁に接着する単一の血小板及び血栓を形成する単一の血小板を明瞭に可視化できるため、積み重なった血小板の数（血栓形成の間に血管壁に接着した血小板の数）、及び血小板により形成される血栓の発達は、得られた画像に基づき定量的に評価することができた。すなわち、得られた画像中に示されている、毛細血管と相互作用して内皮細胞の表面に接着する血小板の数を数えることにより、血小板の血管壁への接着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）を定量評価した。また、画像中に示されている、血栓を構成する血小板の数を数えることにより、血栓の発達を定量評価した。なお、解析の対象が血小板であることを確認するために、血管内に抗ＧＰＩｂα抗体（ＧＰＩｂα中和抗体）を投与した場合と、投与しない場合と、で定量評価を行った。

図５には、血小板の血管壁への接着を定量評価した結果を示す。図６には、血栓の発達を定量評価した結果を示す。図５及び図６の横軸において、抗ＧＰＩｂα抗体「あり」は当該抗ＧＰＩｂα抗体を投与した場合の結果であることを示し、「なし」は当該抗ＧＰＩｂα抗体を投与しなかった（厳密には、当該抗ＧＰＩｂα抗体に代えて、血小板に結合しないＩｇＧを対照として投与した）場合の結果であることを示す。図５の縦軸は、毛細血管の単位長さ（１μｍ）あたり、且つ単位ミリ秒（１ｍｓ）あたりに血管壁に接着した血小板の数（ｐｌａｔｅｌｅｔｓ／μｍ／ｍｓ）を示している。図６の縦軸は、毛細血管の単位長さ（１μｍ）あたりに形成された血栓に含まれる血小板の数（ｐｌａｔｅｌｅｔｓ／μｍ）を示している。また、図６には、レーザー照射を開始した直後、すなわち０秒後（０ｓ）と、当該レーザー照射を開始してから１０秒後（１０ｓ）及び２０秒後（２０ｓ）の定量結果を示す。図６に示す複数の点は、毛細血管の複数の場所における定量結果を示す。

図５に示すように、血管壁に付着した血小板の数を数えることにより、血小板の接着を定量的に評価することができた。すなわち、レーザー照射による血栓形成の誘発により、毛細血管１μｍあたり且つ１ミリ秒あたり約３０個の血小板が血管壁に接着した。これに対し、抗ＧＰＩｂα抗体を投与した場合には、レーザー照射を行っても、血小板はほとんど血管壁に接着しなかった（すなわち、抗ＧＰＩｂα抗体によって血管壁への血小板の接着が抑制された）。このように、様々な血液細胞のうち、レーザー照射によって血管壁に接着し始める単一の血小板を特異的に定量評価することができた。

また、図６に示すように、血栓に含まれる血小板の数の経時的な変化を評価することにより、血栓の発達を定量的に評価することができた。すなわち、図６に示すように、レーザー照射を開始してから２０秒間という短時間で、血栓を構成する血小板の数が急激に増加した（すなわち、血小板により形成される血栓が急激に発達した）。これに対し、抗ＧＰＩｂα抗体を投与した場合には、血栓を形成する血小板はほとんど見られなかった（すなわち、抗ＧＰＩｂα抗体によって血栓形成が抑制された）。このように、血小板により形成される血栓の発達を特異的に定量評価することができた。

また、レーザー照射による血栓誘発後の毛細血管内面のイソレクチンＩＢ４（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ ＩＢ４ ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ：血管内皮細胞のマーカー）を染色した結果、当該毛細血管の内皮細胞は損傷を受けていないことが確認された。

また、低分子量のＦＩＴＣ−デキストラン（分子量４０００）を毛細血管内に投与して同様の解析を行ったところ、レーザー照射による血栓形成誘発後において、蛍光色素の溢出は観察されず、当該レーザー照射によって毛細血管の透過性は影響を受けなかった（すなわち、内皮細胞は破壊されていなかった）ことも確認された。

［Ｌｎｋアダプタータンパク質に関する解析］
また、Ｌｎｋ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓｈ２b３としても知られている。）というアダプタータンパク質に関する検討も行った。Ｌｎｋは、血球系幹細胞の維持に重要なタンパク質であるが、巨核球及び血小板にも発現している。興味深いことに、Ｌｎｋの欠損した遺伝子改変動物では、流血中の末梢血小板数が野生型の５倍になるにもかかわらず血栓が形成されず、止血時間はむしろ延長しており、Ｌｎｋの欠損が血小板機能に影響をもたらしていると考えられた。

そこで、骨髄移植を行うことにより作製したＬｎｋキメラマウスを用い、上述したのと同様の生体内イメージングにより血栓形成過程を観察した。すなわち、まず、麻酔したＬｎｋキメラマウスにＦＩＴＣ−デキストラン及びヘマトポルフィリンを静脈投与した。

次いで、上述した共焦点レーザー顕微鏡及びＣＣＤカメラを備えた本システム１００を用いて、当該キメラマウスの腸間膜の毛細血管にアルゴン−クリプトンレーザーを照射して、当該毛細血管内の血小板の挙動を可視化した。また、比較として、ワイルドタイプのマウスについても同様の解析を行った。

その結果、ワイルドタイプのマウスでは、図４に示す上述の例と同様、レーザー照射によって、円板状の血小板が血管内皮細胞に接着し、積み重なって安定な血栓を形成することが確認された。

これに対し、Ｌｎｋキメラマウスでは、レーザー照射によって、円板状の血小板は血管内皮細胞に接着するものの、血小板の積み重なり及び血栓の安定化は起こらず、血管壁に接着した血小板は血流に押し流され、血小板血栓の発達が阻害されていることが確認された。

すなわち、Ｌｎｋは、血栓の安定化に寄与していることが示された。なお、分子生物学的機序については、リン酸化したＬｎｋが、インテグリンのシグナリングにＣ−Ｓｒｃ、Ｆｙｎ等と協同して関与していた。

このように、本方法及び本システム１００は、人為的に誘発された血栓形成に関連する単一の血小板の機能を簡便に且つ効率よく評価することのできる、従来にない手法を提供するものであった。

１０ 動物、１１ 血管、１１ａ 第一の分岐部分、１１ｂ 第二の分岐部分、１１ｃ 合流部分、１２ 内皮細胞、１３ 内皮下組織、２０ 血液、２１ａ，２１ｂ，２１ｃ 血小板、２２ 白血球、２３ 赤血球、３０ 観察視野、１００ 血小板解析システム、１１０ 保持部、１２０ 照射部、１３０ 検出部、１４０ ピンホールアレイディスク、１４０ａ ピンホール、１４１ マイクロレンズアレイディスク、１４１ａ マイクロレンズ、１４２ 励起フィルター、１４３ ダイクロイックミラー、１４４ 対物レンズ、１４５ エミッションフィルター、１５０ 処理部、１５１ 表示部。

Claims (4)

1. 生きた動物の血管に対する入射光の照射に伴う前記血管からの出射光に基づき前記血管内の血小板を解析する方法であって、
   前記入射光の照射により活性酸素の生成を誘導するイニシエーター化合物と、血漿に溶解又は分散し且つ細胞を染色しない色素化合物とが前記血管内に投与された前記生きた動物を準備し、
   前記生きた動物の前記血管の少なくとも一部の径方向全域を含む観察視野を設定し、
   前記イニシエーター化合物と前記色素化合物とを含む血液が流通する前記生きた動物の前記血管の前記観察視野の全体に、前記血管の内皮細胞を破壊しない前記入射光を照射することによって、前記内皮細胞を破壊することなく、前記血管内における前記イニシエーター化合物による活性酸素の生成及び血栓形成の誘発と、前記色素化合物により前記血漿が染色された前記血管からの前記出射光の検出と、を並行して行う
   ことを特徴とする血小板の解析方法。
2. 前記入射光をマルチビームスキャンにより照射する
   ことを特徴とする請求項１に記載された血小板の解析方法。
3. 生きた動物の血管に対する入射光の照射に伴う前記血管からの出射光に基づき前記血管内の血小板を解析するシステムであって、
   前記入射光の照射により活性酸素の生成を誘導するイニシエーター化合物と、血漿に溶解又は分散し且つ細胞を染色しない色素化合物とが前記血管内に投与された前記生きた動物の前記血管を保持する保持部と、
   前記血管の内皮細胞を破壊することなく、前記血管内における前記イニシエーター化合物による活性酸素の生成及び血栓形成の誘発と、前記色素化合物により前記血漿が染色された前記血管からの前記出射光の検出と、を並行して行うために、前記イニシエーター化合物と前記色素化合物とを含む血液が流通する前記生きた動物の前記血管の少なくとも一部の径方向全域を含むように設定された観察視野の全体に、前記内皮細胞を破壊しない前記入射光を照射する照射部と、
   前記血管からの前記出射光を検出する検出部と、
   を備えた
   ことを特徴とする血小板の解析システム。
4. 前記入射光をマルチビームスキャンにより照射する
   ことを特徴とする請求項３に記載された血小板の解析システム。