JP5598875B2 - Decomposition method of catechol in waste water - Google Patents
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本発明は、カテコール分解酵素、および、本酵素を利用した排水中のカテコールの分解方法に関する。更には、本発明は、製鉄所のコークス炉から排出される安水中に含まれるカテコールを分解可能なカテコール分解酵素、および、本酵素を利用した安水中のカテコールの分解方法に関する。 The present invention relates to a catechol-degrading enzyme and a method for decomposing catechol in wastewater using the enzyme. Furthermore, the present invention relates to a catechol-degrading enzyme capable of decomposing catechol contained in the aqueduct discharged from a coke oven at a steel mill, and a method for decomposing the catechol in the aquatic water using the enzyme.
製鉄所においてコークス炉から発生する安水にはフェノール類、チオシアン、チオ硫酸など環境上好ましくない成分や、高濃度のアンモニアが含まれている。現在の安水処理システムでは、化学的酸素要求量（ＣＯＤ）成分となるフェノール類などの有機物や、チオシアン、チオ硫酸などの硫黄化合物が活性汚泥法で除去されている（例えば、非特許文献１参照）。 Aqueous water generated from a coke oven at an ironworks contains environmentally undesirable components such as phenols, thiocyanate and thiosulfuric acid, and a high concentration of ammonia. In the current water safety treatment system, organic substances such as phenols that are chemical oxygen demand (COD) components and sulfur compounds such as thiocyanate and thiosulfuric acid are removed by an activated sludge method (for example, Non-Patent Document 1). reference).
安水を処理する活性汚泥を構成する微生物には、フェノール類、チオシアン、チオ硫酸などを分解できる微生物が存在する（例えば、特許文献１，２参照）。これらのＣＯＤ成分を分解する微生物では、微生物が産生する酵素が直接分解に関わっている。しかし、どのような酵素が安水に含まれるフェノール類、チオシアン、チオ硫酸などの分解に関わるのかは解明されていない。 Among the microorganisms constituting the activated sludge that treats the low water, there are microorganisms that can decompose phenols, thiocyanate, thiosulfuric acid, and the like (see, for example, Patent Documents 1 and 2). In microorganisms that decompose these COD components, enzymes produced by the microorganisms are directly involved in the decomposition. However, it has not been clarified what enzymes are involved in the decomposition of phenols, thiocyanate, thiosulfate, etc. contained in the water.
コークス炉から排出される安水の中で最も高濃度に含まれるＣＯＤ成分はフェノールである。このフェノールの分解は、主として好気性微生物による酸化分解によるものと考えられており、フェノールは、先ず、水酸化酵素によって初発酸素添加を受け、中間反応生成物質であるカテコールに変換されることが知られている（例えば、非特許文献２参照）。 The COD component contained in the highest concentration in the safety water discharged from the coke oven is phenol. This degradation of phenol is thought to be mainly due to oxidative degradation by aerobic microorganisms, and phenol is first converted to catechol, which is an intermediate reaction product, after initial oxygenation by hydroxylase. (See, for example, Non-Patent Document 2).
また、カテコールの芳香環を開裂する反応は一般に進みにくい反応であると考えられ、フェノールの酸化分解反応においては、カテコールの芳香環の開裂反応が、反応律速になっていると考えられている。そして、カテコールを分解する酵素としては、例えば、３−メチルカテコール・ジオシキナーゼ（ＴｏｄＥ）等が知られている。 In addition, the reaction for cleaving the aromatic ring of catechol is generally considered to be a reaction that is difficult to proceed. In the oxidative degradation reaction of phenol, the cleavage reaction of the aromatic ring of catechol is considered to be rate-limiting. As an enzyme that degrades catechol, for example, 3-methylcatechol dioskinase (TodE) is known.
ところが、高濃度のアンモニアや硫黄化合物等を含む特殊な組成である安水の処理においては、安水処理を担う活性汚泥中の微生物が産生する、フェノールの分解に関わる酵素については、現在のところ全く判っておらず、安水中でこのカテコールの芳香環を開裂する反応を触媒するカテコール分解酵素についても、詳細が全くわかっていない。 However, in the treatment of safe water, which has a special composition containing high concentrations of ammonia, sulfur compounds, etc., enzymes currently involved in the degradation of phenol produced by microorganisms in activated sludge responsible for the safe water treatment are currently available. The details of the catechol-degrading enzyme that catalyzes the reaction of cleaving the aromatic ring of catechol in the water are not known at all.
そこで、本発明においては、コークス炉から排出される特殊な組成の安水中でもカテコールを分解可能なカテコール分解酵素を、安水活性汚泥から単離して利用できるようにし、更には、当該カテコール分解酵素を用いた排水処理方法を提供することを目的とする。 Therefore, in the present invention, a catechol-degrading enzyme capable of decomposing catechol even in low-pressure water having a special composition discharged from a coke oven can be isolated and used from the water-activated activated sludge, and further, the catechol-degrading enzyme An object is to provide a wastewater treatment method using a slag.
そこで本発明者らは、安水を処理する活性汚泥のメタゲノム解析を行い、安水処理でのフェノールの分解反応における共通の中間反応生成物質であるカテコールの分解に関わる酵素及び当該酵素をコードするＤＮＡの塩基配列について、鋭意検討した結果、安水活性汚泥中に安水の処理に使用可能な新規なカテコール分解酵素を複数発見し、これらを利用することに成功し、発明を完成した。 Therefore, the present inventors perform metagenomic analysis of activated sludge for treating aqueduct, and encode an enzyme involved in the degradation of catechol, which is a common intermediate reaction product in the degradation reaction of phenol in the aquatic treatment, and the enzyme. As a result of intensive studies on the DNA base sequence, the inventors have found a plurality of novel catechol-degrading enzymes that can be used for the treatment of aquatic water in the aquatic activated sludge, succeeded in using them, and completed the invention.
すなわち、本発明の特徴は以下の通りである。
（１）配列番号１２に示す塩基配列のＤＮＡを細胞の中に含む大腸菌を培養して、前記大腸菌に配列番号１２に示す塩基配列のＤＮＡでコードされるカテコール分解酵素を産生させ、前記培養されたカテコール分解酵素を有する大腸菌と前記カテコールを含む排水とを混合して、前記排水中のカテコールを分解することを特徴とする排水中のカテコールの分解方法。
（２）前記カテコールを含む排水がコークス炉から排出される安水であることを特徴とする（１）の排水中のカテコールの分解方法。
That is, the features of the present invention are as follows.
(1 ) culturing Escherichia coli containing a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 in a cell, producing the catechol-degrading enzyme encoded by the DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the E. coli , catechol degrading enzymes by mixing an effluent containing the catechol and E. coli having a decomposition method of catechol discharge water you which comprises decomposing the catechol in the drainage.
( 2 ) The method for decomposing catechol in wastewater according to ( 1 ), wherein the wastewater containing catechol is low-grade water discharged from a coke oven.
本発明により、従来知られていなかった新規な酵素を用いて、排水中に含まれるカテコールを酵素反応により分解促進することが可能となる。
特に、コークス炉から排出される安水には、高濃度のフェノールが含まれるが、本発明のカテコール分解酵素および当該酵素を使用した排水中のカテコールの分解方法を用いることで、特殊な組成を有する安水中においても、カテコールの分解を効率的に促進することができるようになる。
According to the present invention, it becomes possible to promote degradation of catechol contained in wastewater by an enzymatic reaction using a novel enzyme that has not been conventionally known.
In particular, the low water discharged from the coke oven contains a high concentration of phenol. By using the catechol-degrading enzyme of the present invention and the method for decomposing catechol in wastewater using the enzyme, a special composition is obtained. Even in the aquatic water, the decomposition of catechol can be promoted efficiently.
本発明者らは安水処理活性汚泥から環境ＤＮＡ（メタゲノム）を採取して、そこから新規なカテコール分解酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を解明することに成功した。さらに、この塩基配列のＤＮＡを用いて、新規なカテコール分解酵素を宿主微生物に産生させて、排水中のカテコールの分解をおこなうことにも成功した。 The present inventors have succeeded in elucidating the base sequence of DNA encoding a novel catechol-degrading enzyme from environmental DNA (metagenome) collected from activated water sludge treated with water. Furthermore, using the DNA of this base sequence, a novel catechol-degrading enzyme was produced by the host microorganism, and the catechol in the waste water was also successfully degraded.
まず、本発明のカテコール分解酵素を入手する方法について説明する。本発明のカテコール分解酵素をコードする配列番号１２に示す塩基配列のＤＮＡは製鉄所の安水活性汚泥から当該ＤＮＡをクローニングすることにより入手可能である。 First, a method for obtaining the catechol-degrading enzyme of the present invention will be described. The DNA of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 that encodes the catechol-degrading enzyme of the present invention can be obtained by cloning the DNA from the water-resistant activated sludge of the steelworks.
例えば、大腸菌などの微生物を宿主として、配列番号１２に示す塩基配列のＤＮＡを組み込んだプラスミドや、フォスミドを組み込んだファージ等を用いて宿主微生物を形質転換することにより、本発明のカテコール分解酵素を宿主微生物に産生させて、本発明のカテコール分解酵素を入手することができる。 For example, by using a microorganism such as Escherichia coli as a host and transforming the host microorganism using a plasmid incorporating a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 , a phage incorporating a fosmid, etc., the catechol-degrading enzyme of the present invention can be obtained. The catechol-degrading enzyme of the present invention can be obtained by producing it in a host microorganism.
本発明のカテコール分解酵素を産生する宿主微生物となりうるかどうかの判別、及び、形質転換した微生物がカテコール分解酵素を産生できているかどうかの確認は、以下のようにして行うことができる。 The determination of whether or not it can be a host microorganism producing the catechol-degrading enzyme of the present invention and the confirmation of whether or not the transformed microorganism can produce the catechol-degrading enzyme can be performed as follows.
先ず、形成転換し、培養した宿主微生物の細胞を破壊して得られる細胞抽出液に、基質となるカテコールを添加する。本発明のカテコール分解酵素を産生する宿主微生物の細胞抽出液では、カテコールの芳香環の開裂により、反応生成物として、２−ヒドロキシムコネート・セミアルデヒド（２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｕｃｏｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ）を形成して黄色を呈するため、３７５ｎｍの吸光度を測定することで、本発明のカテコール分解酵素を産生する宿主微生物かどうかを特定することが可能である。３７５ｎｍの吸光度が増加すれば、カテコールが分解されて２−ヒドロキシムコネート・セミアルデヒドが形成されることになるため、カテコールの分解酵素により、カテコールの分解が起こったことを判定できる。 First, a catechol as a substrate is added to a cell extract obtained by disrupting cells of a host microorganism that has undergone transformation and culture. In the cell extract of a host microorganism that produces the catechol-degrading enzyme of the present invention, 2-hydroxymuconate semialdehyde is formed as a reaction product by cleavage of the aromatic ring of catechol, resulting in a yellow color. Therefore, by measuring the absorbance at 375 nm, it is possible to specify whether the host microorganism produces the catechol-degrading enzyme of the present invention. If the absorbance at 375 nm increases, catechol is decomposed to form 2-hydroxymuconate semialdehyde, and therefore, it can be determined that catechol decomposition has occurred by the catechol-degrading enzyme.
次に、以上のようにして得られる、配列番号１２に示す塩基配列で特定されるカテコール分解酵素を用いて、排水中に含まれるカテコールを分解する方法について説明する。本発明のカテコール分解酵素の至適温度は、２０℃以上４０℃以下、至適ｐＨは５以上９以下である。排水中のカテコールを分解しようとする場合には、この温度とｐＨの条件を満足する条件で本発明のカテコール分解酵素を使用することが望ましい。 Next, a method for decomposing catechol contained in wastewater using the catechol-degrading enzyme specified by the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 obtained as described above will be described. The optimum temperature of the catechol-degrading enzyme of the present invention is 20 ° C. or more and 40 ° C. or less, and the optimum pH is 5 or more and 9 or less. When decomposing catechol in wastewater, it is desirable to use the catechol-degrading enzyme of the present invention under conditions that satisfy the conditions of temperature and pH.
また、本発明のカテコール分解酵素を用いて、排水中のカテコールを分解しようとする際のカテコール濃度について特に上限はない。製鉄所の安水はフェノールを高濃度に含むが、フェノールが分解される際の中間反応性生物としてカテコールが蓄積する可能性がある。安水であればカテコールを生成するもととなるフェノールが最大で１０００ｍｇ／Ｌ程度まで含まれることがあるが、これらフェノールが全て変換されてカテコール濃度が１０００ｍｇ／Ｌとなっても、本発明のカテコール分解酵素による処理は適用可能である。 In addition, there is no particular upper limit on the catechol concentration when attempting to degrade catechol in wastewater using the catechol-degrading enzyme of the present invention. Steelworks aqueducts contain high concentrations of phenol, but catechol may accumulate as an intermediate reactive organism when phenol is degraded. In the case of aqueous water, phenols that generate catechol may be contained up to about 1000 mg / L. However, even if all of these phenols are converted to a catechol concentration of 1000 mg / L, Treatment with catechol-degrading enzymes is applicable.
排水中のカテコールを分解する際は、本発明のカテコール分解酵素を産生する宿主微生物をそのままカテコール分解に利用することはもちろん可能である。例えば、宿主微生物が産生したカテコール分解酵素が細胞表層の細胞膜やペリプラズムに存在したり、細胞外に分泌される場合などは、カテコール分解酵素が細胞外部の水と接することができるため、宿主微生物をそのまま利用できる。また、宿主微生物により産生されたカテコール分解酵素が、宿主微生物の細胞内に蓄積される場合には、カテコール分解酵素が細胞外部の水と接することができないため、宿主微生物の細胞を破壊して、本発明のカテコール分解酵素を含む細胞抽出液などを利用することも可能である。 When decomposing catechol in wastewater, it is of course possible to use the host microorganism producing the catechol-degrading enzyme of the present invention as it is for degrading catechol. For example, when the catechol-degrading enzyme produced by the host microorganism is present in the cell membrane or periplasm of the cell surface or secreted outside the cell, the catechol-degrading enzyme can come into contact with water outside the cell. Can be used as is. In addition, when the catechol-degrading enzyme produced by the host microorganism is accumulated in the cells of the host microorganism, the catechol-degrading enzyme cannot contact the water outside the cell. A cell extract containing the catechol-degrading enzyme of the present invention can also be used.
また、本発明のカテコール分解酵素を用いて、排水中のカテコールを分解処理する際は、配列番号１２に示す塩基配列のＤＮＡでコードされるカテコール分解酵素を用いれば良いが、複数の酵素を一緒に用いて分解処理してももちろん構わない。単一の種類のカテコール分解酵素のみを使用する場合、排水のｐＨ変動や、温度変化、基質となるカテコールの濃度などによってカテコールの分解活性が影響を受ける可能性がある。したがって、異なる反応至適条件をもつ複数種類のカテコール分解酵素を使用することで、このような影響を受けにくくすることができると考えられ、より好ましい。尚、微生物に２種以上のカテコール分解酵素を産生させることも可能である。宿主微生物としては、プラスミドなどのベクターが利用できる大腸菌が最も利用しやすい。酵母など他の遺伝子組み換え可能な微生物も、宿主微生物として利用可能である。また、本発明のカテコール分解酵素は、酸素が存在する環境で生育する好気性微生物に由来するものであるから、宿主微生物を利用してカテコールを分解する際には、空気で曝気することが望ましい。
以下、本発明を実施例により説明する。
Further, when the catechol-degrading enzyme of the present invention is used to decompose catechol in wastewater, a catechol-degrading enzyme encoded by the DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 may be used. Of course, it does not matter if it is used for the decomposition treatment. When only a single type of catechol-degrading enzyme is used, there is a possibility that the catechol-degrading activity is affected by the pH variation of the wastewater, the temperature change, the concentration of the catechol as a substrate, and the like. Therefore, it is considered that the use of a plurality of types of catechol-degrading enzymes having different optimal reaction conditions is considered to be less susceptible to such effects, and is more preferable. It is also possible to cause the microorganism to produce two or more catechol-degrading enzymes . As the host microorganism, E. coli that can use a vector such as a plasmid is most easily used. Other genetically recombinable microorganisms such as yeast can also be used as host microorganisms. In addition, since the catechol-degrading enzyme of the present invention is derived from an aerobic microorganism that grows in an environment in which oxygen is present, it is desirable to aerate with air when degrading catechol using a host microorganism. .
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples.
実施例１（参考例） 新規カテコール分解酵素によるカテコールの分解（１）
配列番号１２（配列表及び図１）の塩基配列をコードするＤＮＡ断片を精製して、平滑末端化した。次いで、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有するｐＣＣ１ＦＯＳフォスミドにライゲーションした。フォスミドへのライゲーションにはＴ４ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ）を使用した。このフォスミドへライゲーションしたものを、ＭａｘＰｌａｎｘ Ｌａｍｂｄａ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔｓを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇを行なった。宿主微生物として大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＰＩ−３００Ｔ１Ｒを使用した。そして、１２．５μｇ/ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ（ＬＢ/Ｃｍ）寒天プレートで、ラムダファージにより形質転換した大腸菌をクロラムフェニコール耐性により選択した。
Example 1 (Reference Example) Degradation of catechol by a novel catechol-degrading enzyme (1)
A DNA fragment encoding the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 (Sequence Listing and FIG. 1) was purified and blunt-ended. It was then ligated to pCC1FOS fosmid with the chloramphenicol resistance gene. T4 DNA ligase (Takara Bio) was used for ligation to fosmid. The one ligated to this fosmid was subjected to in vitro packaging using MaxPlanx Lambda Packing Extracts. E. coli as a host microorganism. EPI-300T1R was used. Then, Escherichia coli transformed with lambda phage was selected by chloramphenicol resistance on an LB (LB / Cm) agar plate containing 12.5 μg / mL chloramphenicol.
大腸菌のコロニーをとり、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む２ｘＹＴ培地（２ｘＹＴ／Ｃｍ）１ミリリットル中で、３７℃で１８時間培養した。ついで、このコロニーを採取した大腸菌の培養液のうち、２００マイクロリットルを、新しい８００マイクロリットルの２ｘＹＴ／Ｃｍ培地に移して混合し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で３０分間培養した後、１マイクロリットルのＣｏｐｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を添加した。こうすることにより、大腸菌の中にあるフォスミドのコピー数を増加させた。さらに大腸菌を３７℃で２時間、１２００ｒｐｍで激しく振とうしながら培養し、４℃で３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、大腸菌を沈殿させて回収した。回収した大腸菌を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。そして、１５０マイクロリットルのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｌｕｓ Ｂｅｎｚｏａｔｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加して、大腸菌の細胞を溶解させた。４℃で３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、大腸菌の溶解された残りの菌体部分を沈殿させて、上清を細胞抽出液として得た。 E. coli colonies were picked and cultured at 37 ° C. for 18 hours in 1 ml of 2 × YT medium (2 × YT / Cm) containing 12.5 μg / mL chloramphenicol. Next, 200 microliters of the E. coli culture solution from which the colonies were collected was transferred to a new 800 microliter 2 × YT / Cm medium, mixed, and cultured at 37 ° C. for 30 minutes while shaking at 250 rpm. Microliter of Copy Control Induction Solution (Epicentre) was added. This increased the fosmid copy number in E. coli. Further, E. coli was cultured at 37 ° C. for 2 hours with vigorous shaking at 1200 rpm, and centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. to precipitate and collect E. coli. The recovered E. coli was resuspended in 50 mM phosphate buffer (pH 7.5). Then 150 microliters of BugBuster Plus Benzoate Nuclease (Novagen) was added to lyse the E. coli cells. By centrifuging at 3000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., the remaining lysed bacterial cell portion was precipitated, and the supernatant was obtained as a cell extract.
次に、この細胞抽出液がカテコール分解酵素を含むことを、以下のように確認した。基質となるカテコール（ＳＩＧＭＡ製）を最終濃度が０．５ｍＭとなるように、５マイクロリットルずつ、１００マイクロリットルの細胞抽出液に添加して混合した。２５℃で２５０ｒｐｍでゆるやかに振とうしながら反応させた。反応時間は１時間および１６時間とした。カテコールの分解により、２−ヒドロキシムコネート・セミアルデヒドの形成により黄色を呈するようになるため、３７５ｎｍの吸光度を調べて、カテコール分解酵素の活性を調べた。 Next, it was confirmed as follows that this cell extract contains a catechol-degrading enzyme. Catechol (manufactured by SIGMA) serving as a substrate was added to and mixed with 100 microliters of cell extract at a rate of 5 microliters so that the final concentration was 0.5 mM. The reaction was conducted while gently shaking at 250 rpm at 25 ° C. The reaction time was 1 hour and 16 hours. Since the decomposition of catechol becomes yellow due to the formation of 2-hydroxymuconate semialdehyde, the absorbance at 375 nm was examined to examine the activity of the catechol-degrading enzyme.
結果を表１に示す。配列番号のカテコール分解酵素は、そのアミノ酸配列の相同性からグループ分けされるサブファミリーについても表１に示した。カテコール分解酵素のサブファミリーは、非特許文献３，４，５の報告に基づいてグループ分けした。明確にグループ分けできないものについては、サブファミリーを記さなかった。また、配列番号のカテコール分解酵素について、アミノ酸配列の相同性が最も高い既知酵素名と、その相同性についても表１に記した。ＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）が０．５以上のものを＋＋、ＯＤが０より大きく０．５以下のものを＋、ＯＤが０のものを−で示した。なお、対照実験として形質転換しない大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＰＩ−３００Ｔ１Ｒの細胞抽出液についてもカテコール分解活性を調べた。 The results are shown in Table 1 . The catechol-degrading enzymes of SEQ ID NOs are also shown in Table 1 for subfamilies grouped according to their amino acid sequence homology. The subcategories of catechol-degrading enzymes were grouped based on the reports of Non-Patent Documents 3, 4 and 5. For those that could not be clearly grouped, no subfamily was given. Further , for the catechol-degrading enzyme of SEQ ID NO : Table 1, the known enzyme name having the highest amino acid sequence homology and the homology thereof are also shown in Table 1. An OD (Optical Density) of 0.5 or more was indicated by ++, an OD of greater than 0 and 0.5 or less was indicated by +, and an OD of 0 was indicated by-. In addition, E. coli E. coli not transformed as a control experiment. The catechol-degrading activity of the cell extract of E. coli EPI-300T1R was also examined.
以上の結果から、配列番号１２の塩基配列のＤＮＡでコードされた酵素が、カテコールの分解活性を有するカテコール分解酵素であることを確認できた。 From the above results, the enzyme encoded by the DNA of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12, was confirmed to be a catechol-degrading enzymes having a degrading activity of catechol.
実施例２（参考例） 新規カテコール分解酵素によるカテコールの分解（２）
配列番号１２（Ｉ．２．Ａサブファミリー）の塩基配列をコードする遺伝子を含むフォスミドＤＮＡを精製して、平滑末端化した。次いで、ｐＵＣ１１８プラスミドにライゲーションし、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ（ＬＢ／Ａｐ）寒天プレートで、大腸菌を選択した。続いて、大腸菌のコロニーをとり、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンと０．１ｍＭのｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地（２ｘＬＢ／Ａｐ／ＩＰＴＧ）１ミリリットル中で、３７℃で１８時間培養した。次に４℃で３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、大腸菌を沈殿させて回収した。回収した大腸菌を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。そして、１５０マイクロリットルのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｌｕｓ Ｂｅｎｚｏａｔｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加して、大腸菌の細胞を溶解させた。４℃で３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、大腸菌の溶解された残りの菌体部分を沈殿させて、上清を細胞抽出液として得た。
Example 2 (Reference Example) Degradation of catechol by a novel catechol-degrading enzyme (2)
The fosmid DNA containing the gene encoding the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 (I.2.A subfamily) was purified and blunt-ended. It was then ligated into pUC118 plasmid and E. coli E. coli. E. coli JM109 was transformed and E. coli was selected on LB (LB / Ap) agar plates containing 50 μg / mL ampicillin. Subsequently, colonies of E. coli were taken and cultured at 37 ° C. for 18 hours in 1 ml of LB medium (2 × LB / Ap / IPTG) containing 50 μg / mL ampicillin and 0.1 mM isopropyl β-D-thiogalactosidase (IPTG). did. Next, E. coli was precipitated and recovered by centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. The recovered E. coli was resuspended in 50 mM phosphate buffer (pH 7.5). 150 microliters of BugBuster Plus Benzoate Nuclease (Novagen) was added to lyse the E. coli cells. By centrifuging at 3000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., the remaining lysed bacterial cell portion was precipitated, and the supernatant was obtained as a cell extract.
次に、この細胞抽出液がカテコール分解酵素を含むことを、以下のように確認した。基質となるカテコールを最終濃度が０．５ｍＭとなるように、５マイクロリットルずつ、１００マイクロリットルの細胞抽出液に添加して混合した。２５℃で２５０ｒｐｍでゆるやかに振とうしながら反応させた。反応時間は１時間とした。 Next, it was confirmed as follows that this cell extract contains a catechol-degrading enzyme. The substrate catechol was added to and mixed with 100 microliters of the cell extract in 5 microliter increments so that the final concentration was 0.5 mM. The reaction was conducted while gently shaking at 250 rpm at 25 ° C. The reaction time was 1 hour.
カテコールの分解により、２−ヒドロキシムコネート・セミアルデヒドを形成して黄色を呈するようになるため、３７５ｎｍの吸光度（吸収係数ε＝３３０００Ｍ-1ｃｍ-1）が変化するので吸光度を測定した。吸光度変化と吸収係数からカテコール分解酵素の活性を算出した。カテコール分解活性の1単位は1分間で１マイクロモルのカテコール分解反応産物である２−ヒドロキシムコネート・セミアルデヒドを生成するカテコール分解酵素の活性を意味する。１ｇの蛋白質あたりの上記反応単位でカテコール分解活性を表示した。結果を表２に示す。 Since the decomposition of catechol causes 2-hydroxymuconate semialdehyde to form a yellow color, the absorbance at 375 nm (absorption coefficient ε = 33000 M −1 cm −1 ) changes, so the absorbance was measured. The activity of catechol-degrading enzyme was calculated from the change in absorbance and the absorption coefficient. One unit of catechol-degrading activity means the activity of a catechol-degrading enzyme that produces 2-hydroxymuconate semialdehyde, which is a product of catechol-decomposing reaction of 1 micromole per minute. Catechol degradation activity was expressed in the above reaction units per gram of protein. The results are shown in Table 2.
なお、対照実験として、上記各カテコール分解酵素とは異なるサブファミリーに属するカテコール分解酵素である、既知の３−メチルカテコール・ジオキシゲナーゼ（ＴｏｄＥ）（Ｉ．３．Ｂサブファミリー）の遺伝子を、同様の方法で大腸菌に産生させた場合の細胞抽出液でもカテコール分解活性を測定した。 As a control experiment, a known 3-methylcatechol dioxygenase (TodE) (I.3.B subfamily) gene, which is a catechol-degrading enzyme belonging to a different subfamily than the above-mentioned catechol-degrading enzymes, was similarly used. The catechol-degrading activity was also measured in the cell extract when produced in E. coli by the above method.
以上、既知のカテコール分解酵素である３−メチルカテコール・ジオキシゲナーゼ（ＴｏｄＥ）（Ｉ．３．Ｂサブファミリー）とは異なるサブファミリーに属する、本発明の配列番号１２（Ｉ．２．Ａサブファミリー）の塩基配列のＤＮＡにコードされている、カテコール分解酵素について、カテコール分解酵素活性があることを確認した。 Above, belong to different subfamilies and is a known catechol enzymes 3-methyl catechol dioxygenase (TodE) (I.3.B subfamily), SEQ ID NO: 12 (I.2.A subfamily of the present invention ) are DNA code of the base sequence, the catechol enzymes, it was confirmed that there is a catechol-degrading enzyme activity.
実施例３ 安水中のカテコールの分解
配列番号１２（Ｉ．２．Ａサブファミリー）の塩基配列をコードする遺伝子を含むフォスミドのＤＮＡを精製して、平滑末端化した。次いで、ｐＵＣ１１８プラスミドにライゲーションし、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、５０μｇ/ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ（ＬＢ／Ａｐ）寒天プレートで、大腸菌を選択した。続いて、大腸菌のコロニーをとり、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンと０．１ｍＭのｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地（２ｘＬＢ／Ａｐ／ＩＰＴＧ）１ミリリットル中で、３７℃で１８時間培養した。次に４℃で３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、大腸菌を沈殿させて回収した。
Example 3 Decomposition of Catechol in Aqueous Water
The fosmid DNA containing the gene encoding the base sequence of SEQ ID NO: 12 (I.2.A subfamily) was purified and blunt-ended. It was then ligated into pUC118 plasmid and E. coli E. coli. E. coli JM109 was transformed and E. coli was selected on LB (LB / Ap) agar plates containing 50 μg / mL ampicillin. Subsequently, colonies of E. coli were taken and cultured at 37 ° C. for 18 hours in 1 ml of LB medium (2 × LB / Ap / IPTG) containing 50 μg / mL ampicillin and 0.1 mM isopropyl β-D-thiogalactosidase (IPTG). did. Next, E. coli was precipitated and recovered by centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes at 4 ° C.
以上のようにカテコール分解酵素を産生する大腸菌を、カテコールを１００ｍｇ／Ｌ含む人工安水（組成を表３に示す。）に、菌体濃度が５×１０5細胞／ｍＬとなるように入れて混合し、空気曝気しながら２５℃で２４時間処理した。対照実験として、形質転換せずカテコール分解酵素を産生しない大腸菌を同じ菌体濃度で同一条件で処理する試験（対照１）、及び本発明のカテコール分解酵素とはサブファミリーが異なるカテコール分解酵素である３−メチルカテコール・ジオキシゲナーゼ（ＴｏｄＥ）（Ｉ．３．Ｂサブファミリー）を産生する大腸菌についても同じ菌体濃度で同一条件で処理する試験（対照２）を行なった。 Escherichia coli producing catechol-degrading enzyme as described above is placed in artificial water-free solution (composition is shown in Table 3) containing 100 mg / L of catechol so that the cell concentration is 5 × 10 5 cells / mL. Mix and treat for 24 hours at 25 ° C. with air aeration. As a control experiment, a test in which E. coli that does not transform and does not produce a catechol-degrading enzyme is treated under the same conditions at the same cell concentration (control 1), and a catechol-degrading enzyme having a subfamily different from that of the present invention. An E. coli producing 3-methylcatechol dioxygenase (TodE) (I.3.B subfamily) was also subjected to a test (control 2) that was treated under the same conditions at the same cell concentration.
実施例１と同様に、カテコールの分解を、カテコールの芳香環が開裂することにより形成される２−ヒドロキシムコネート・セミアルデヒドを３７５ｎｍの吸光度の増加で測定した。結果を表４に示した。表では、ＯＤが０．５以上のものを＋＋、ＯＤが０より大きく０．５以下のものを＋、ＯＤが０のものを−で示した。 As in Example 1, the degradation of catechol was measured by increasing the absorbance at 375 nm for 2-hydroxymuconate semialdehyde formed by cleavage of the aromatic ring of catechol. The results are shown in Table 4. In the table, those having an OD of 0.5 or more are indicated by ++, those having an OD greater than 0 and 0.5 or less are indicated by +, and those having an OD of 0 are indicated by-.
表４より、配列番号１２のカテコール分解酵素を産生する大腸菌を入れた系では、安水中で良好にカテコールの分解がおこっている。対照１のカテコール分解酵素を産生しない大腸菌を入れた系では、カテコールの分解は進まなかった。また、対照２の既知のカテコール分解酵素であるＴｏｄＥを産生する大腸菌を入れた系では、本発明の配列番号１２のカテコール分解酵素を産生する大腸菌を入れた系と比較して、安水中でカテコール分解活性が低くなった。 From Table 4, in the system containing Escherichia coli that produces the catechol-degrading enzyme of SEQ ID NO: 12, catechol is satisfactorily degraded in the aquatic water. In the system containing E. coli that does not produce the catechol-degrading enzyme of Control 1, catechol degradation did not proceed. Further, in the system containing Escherichia coli producing TodE, which is a known catechol-degrading enzyme of Control 2, catechol was added in the aqueous solution compared to the system containing Escherichia coli producing the catechol-degrading enzyme of SEQ ID NO: 12 of the present invention. Degradation activity decreased.
以上、安水のような特殊な組成の排水中のカテコールであっても、本発明のカテコール分解酵素は、カテコール分解反応を促進できることを確認した。 As described above, it was confirmed that the catechol-degrading enzyme of the present invention can promote the catechol-decomposing reaction even in the catechol in the wastewater having a special composition such as an aqueous solution.
Claims (2)
前記培養されたカテコール分解酵素を有する大腸菌と前記カテコールを含む排水とを混合して、前記排水中のカテコールを分解することを特徴とする、排水中のカテコールの分解方法。 Culturing Escherichia coli containing the DNA of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 in a cell, causing the E. coli to produce a catechol-degrading enzyme encoded by the DNA of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 ;
By mixing the effluent containing the E. coli having a catechol degrading enzymes the cultured catechol, characterized by decomposing the catechol before SL in the waste water, the decomposition method of catechol discharge water.
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