JP5597543B2 - 糖衣の幅を決定する方法およびプログラム - Google Patents
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Description
より具体的には、本発明は、さらに、血管脆弱性と病因を検出する診断ツールを教示する。前記診断ツールは、好ましくは、血管病変に対する従来既知の診断手法よりも優れた1つまたは複数の利点、たとえば、より高速、高感度、特異および/または単純な検出、血管病変のより早期の検出、複数の関連パラメータの同時検出、より少ない出発原料からの検出、または低侵襲性もしくは非侵襲性技法によって得た出発原料からの検出を必要とする場合がある。
本明細書で使用されるとき、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈で明白に指定されない限り単数概念と複数概念の両方を含む。
要約の節で述べたように、本発明は、特に血管疾患および炎症で役立つ診断ツール、予防ツールおよび治療ツールならびに方法について述べる。詳細には、血管疾患および炎症は、さらに、糖衣(glycocalyx)の状態によって特徴付けることができる。
−グラム陰性菌敗血、内毒素誘導ショック、腐敗性ショック症候群、全身性炎症反応症候群(SIRS)、または多臓器機能不全症候群(MODS)
−予防接種
−移植片対宿主病変(たとえば、移植された異種または同種組織または臓器の移植片対宿主疾病(GVHD)または拒絶(たとえば、同種骨髄または臍帯血移植の拒絶))。
−急性および慢性伝染性ならびに寄生過程(好ましくは大脳マラリアまたは髄膜炎菌性髄膜炎を含む、ウィルス性、細菌性または菌性感染症、および原生動物または後生動物寄生体)。
−アレルギー性疾患(たとえば、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、喘息、湿疹、じんましん、接触性皮膚炎、全身性アレルギー反応(アナフィラキシー)またはアナフィラキシー・ショック)。より好ましくは、アレルギー性鼻炎と喘息から選択される。
−慢性炎症疾患(一般に、実証できる原因(たとえば、感染、組織傷害)のない状態で、先天または適応免疫の1つまたは複数の炎症過程および/または部分の慢性または回帰性局所または全身活性を通常含む混成群を包含する)、および/または自己免疫疾患(一般に、自己抗体反応または細胞媒介反応を含み、また臓器特異的および非臓器特異的な自己免疫症状を含む自己組織または組織成分に対する免疫反応、すなわち自己抗原を含む)。好ましくは、そのような症状は、急性散在性脳脊髄炎(ADEM)、アジソン病、アルツハイマー病(AD)、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群(APS)、再生不良性貧血、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性胃炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、腹腔疾病、皮膚筋炎、第I型糖尿病、第II型糖尿病、家族性地中海熱、家族性低温誘導性自己炎症性症候群、グッドバスチャー症候群、痛風、偽痛風、グレーブス病、ギャン-バレー症候群(GB)、ハシモト病、遺伝的間欠熱、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病と潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患(IBD)、虚血再潅流傷害、カワサキ病、混合結合組織疾患、マックル-ウェルズ症候群、多発性硬化症(MS)、重症筋無力症、眼球クローヌス症候群(OMS)、視神経炎、Ordの甲状腺炎、骨関節炎、パーキンソン病(PD)、天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、手術後または精神的炎症、原発性胆汁性肝硬変、初期粘液水腫、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、ライター症候群、硬皮症、Sjogren症候群、卒中乏血、全身性エリテマトーデス(SLE)、全身型若年性特発性関節炎、タカヤス動脈炎、側頭動脈炎、白斑、温式自己免疫性溶血性貧血、およびウェジナー肉芽腫症から選択されてもよい。
本明細書で使用されるとき、「糖衣」は、一般に、血管内皮細胞の管腔表面の多糖を多く含む細胞外基質を指す。糖衣は、主に、水と、とりわけ循環血液からの血漿タンパク質、脂質および酵素を含む多数の分子と、生体内で関連するプロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよび糖タンパク質(たとえば、セレクチン、接着分子など)からなる。
前述のように、本発明は、また、対象から取り出された試料中の、とりわけ前述のような1つまたは複数の糖衣関連マーカーを検出するように構成されたバイオセンサ素子、ならびにこの診断方法における前記バイオセンサの使用に関連する。
要約の節でさらに詳しく説明されたように、本発明は、また、たとえば前述のそれぞれの疾患のような血管および炎症性症状の治療、または糖衣成分により、もしくは糖衣異化酵素の阻害剤を使用することにより、炎症チャレンジに対するアテローム発生感受性を低下させる治療を意図する。
血管および/または炎症疾患の治療のために、本発明の活性物質(詳細には、糖衣成分および/または糖衣異化酵素の阻害剤)が調合薬として処方されると有利である。
本発明のさらに他の実施形態において、発明者は、糖衣の状態を評価する方法を決定した。糖衣の状態は、サイズ分布法を使用して評価することができ、個々の毛細血管の内皮糖衣寸法または糖衣幅(GW)が決定される。さらに、サイズ分布法は、血管内の赤血球幅(RBCW)、血管径(VD)、および毛細管容積余量(CVR)の測定値を提供することができる。
CVR=RBCWmax2/RBCW2
ここで、VDが単一RBCの最大幅と等しいかそれより大きい場合に、RBCWmaxはVDと等しい。
他のすべてのケースで、RBCWmaxは、単一RBCの最大幅と等しい。
(a)血管、好ましくは微細血管内の赤血球の幅(RBCW)を測定する段階と、
(b)赤血球幅測定値のサイズ分布から糖衣幅(GW)を決定し、それにより糖衣の状態を評価する段階とを含む方法に関する。
(a1)測定されたRBCWのサイズ分布を決定する段階と、
(b)測定されたRBCWのサイズ分布から糖衣幅(GW)を決定し、それにより糖衣の状態を評価する段階とを含む方法に関する。
CVR=RBCWmax2/RBCW2
ここで、VDが単一RBCのRBCW最大幅と等しいかそれより大きい場合にRBCWmaxはVDと等しい。
すべての他のケースで、RBCWmaxは、単一RBCの最大幅と等しい。
(a)血管、好ましくは微細血管内の少なくとも10個、好ましくは50、100、250、500、1000、2500または5000個を超える赤血球の幅を測定する段階と、
(b)段階(a)を、少なくとも10個、好ましくは50、100、250、500および1000個を超える血管、好ましくは微細血管に繰り返す段階と、
(c)赤血球幅測定値のサイズ分布から糖衣幅を評価し、それにより糖衣の状態を決定する段階とを含む方法に関する。
(a)血管、好ましくは微細血管内の少なくとも10個、好ましくは50、100、250、500、1000、2500または5000個を超える赤血球の幅を測定する段階と、
(b)段階(a)を、少なくとも10個、好ましくは50、100、250、500および1000個を超える血管、好ましくは微細血管に繰り返す段階と、
(b1)測定されたRBCWのサイズ分布を決定する段階と、
(c)サイズ分布から糖衣幅を決定し、それにより糖衣の状態を評価する段階とを含む方法に関する。
(d)赤血球幅測定値のサイズ分布から毛細管容積余量を決定する段階とを含む。
(a)第1の血管内、好ましくは微細血管内の少なくとも10個、好ましくは50、100、250、500、1000、2500または5000個を超える赤血球の幅を測定する段階と、
(b)段階(a)を、少なくとも10個、好ましくは50、100、250、500または1000個を超える血管、好ましくは微細血管に繰り返す段階と、
(c)RBCの最大幅値と中央幅値を決定する段階と、
(d)最大幅値と中央幅値との差を決定する段階とを含み、
前記差が、糖衣幅を決定し、糖衣の状態を評価する方法。
(a)前記化合物、心臓血管系危険因子または生活因子のある状態とない状態で、血管内の少なくとも10個、好ましくは50、100、250、500、1000、2500、5000個を超える赤血球の幅を測定する段階と、
(b)段階(a)を、少なくとも10個、好ましくは50、100、250、500および1000個を超える血管に繰り返す段階と、
(c)本発明の方法により糖衣の状態を評価する段階とを含み、前記化合物、心臓血管系危険因子または生活因子のある状態とない状態での糖衣の状態の差が、糖衣の状態を調整するときの前記化合物、心臓血管系危険因子または生活因子を識別する。
(a)少なくとも1つの化合物がある状態で、血管、好ましくは微細血管内の少なくとも10個、好ましくは50、100、250、500、1000、2500、5000個を超える赤血球の幅を測定する段階と、
(b)段階(a)を、少なくとも10個、好ましくは50、100、250、500および1000個を超える血管、好ましくは微細血管に繰り返す段階と、
(c)段階(a)と(b)の測定を、少なくとも1つの他の化合物に繰り返す段階と、
(d)化合物がない状態で段階(a)と(b)の測定を繰り返し、それにより対照測定を確立する段階と、
(c)前記化合物のある状態とない状態で、糖衣の状態を評価し、GW、および必要に応じてRBCW、VD、およびCVRを決定する段階とを含み、糖衣の状態が、使用された化合物と対照測定に関して評価され、それにより前記化合物の糖衣の状態を調整する能力がスクリーニングされる。
a)前記化合物、心臓血管系危険因子、または生活因子がない状態で、少なくとも1つの血管内の赤血球(RBC)の平均幅値を定義する情報をコンピュータ・プログラムに導入する段階と、
b)前記化合物、心臓血管系危険因子または生活因子がある状態で、少なくとも1つの血管内でRBCの平均幅値と最大幅値を定義する情報をコンピュータ・プログラムに導入する段階と、
c)前記化合物、心臓血管系危険因子または生活因子がない状態のGWが、前記化合物、心臓血管系危険因子または生活因子がある状態のGWと異なるかどうかを評価する段階と、
d)c)で陽性評価された化合物、心臓血管系危険因子または生活因子を識別する段階とを含む。
(a)RBCW分布データを読み取り、
(b)本発明の方法により糖衣の状態を決定し、それによりGWを決定し、必要に応じてRBCW、VDおよびCVRを決定するように構成された、コンピュータ読取り可能媒体または類似の独立型コンピュータ装置上に記憶されたコンピュータ・プログラムに関する。
(i)本発明の方法段階を含むか、
(ii)GWを決定し、また必要に応じて、RBC幅分布データからRBCW、VDおよびCVRを決定するための方法段階を実行するように適応されたコード手段を含むコンピュータ・プログラムに関する。
(a)前記化合物がない状態で、少なくとも1つの血管内のRBCW値を定義する情報をコンピュータ・プログラムに導入する段階と、
(b)前記化合物がある状態で少なくとも1つの血管内のRBCW値を定義する情報をコンピュータ・プログラムに導入する段階と、
(c)本発明の方法にしたがって糖衣の状態を決定する段階と、
(d)前記化合物がある状態での糖衣の状態が、前記化合物がない状態での糖衣の状態と異なるかどうかを評価する段階と、
(e)(d)で陽性評価された化合物を識別する段階とを含む。
(i)本発明の方法段階を含むか、
(ii)方法段階が、RBCW分布データから赤血球幅、血管径、糖衣寸法および/または毛細管容積余量を決定する、データ処理システムを動作させる方法に関する。さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の方法段階を実行する手段および/またはRBC幅分布データから赤血球幅、血管径、糖衣寸法、および毛細管容積余量段階を決定する方法段階を実行する手段を含むデータ処理システムに関する。
例
例1
この例は、内毒素誘導炎症反応が、ヒトの糖衣量または寸法の減少をもたらし、またこのプロセスで腫瘍壊死因子α(TNFα)が効力を発することを実証する。詳細には、健康な男性ボランティアが、可溶性TNFα受容体エタネルセプト(Etanercept)の前処理のある場合(n=8)とない場合(n=13)で、少量の内毒素の投与を静脈に受けた。全身性および微小血管糖衣が、ベースライン時と内毒素チャレンジ後4時間で評価された。
調査設計
21人の健康な白人男性ボランティアを調査した。調査は、アムステルダムのAcademic Medical Centreの施設内倫理委員会によって承認され、すべてのボランティアから書面のインフォームド・コンセントを得た。参加者たちには心疾患の履歴はなかった。対象は、喫煙をせず、薬剤を使用しておらず、その調査の前月に熱性疾患はなかった。病歴、理学的診断、通常臨床検査、心電図および胸部X線は、正常で比較可能であった。実験はすべて夜間絶食後に行われた。すべての対象の全身性糖衣量、微小血管糖衣厚さおよび生化学を含むベースライン測定を行った。5日後に、対象を、食塩水(n=13)またはエタネルセプト(n=8;Enbrel[登録商標]50mg、Wyeth Pharmaceuticals, Madison, NJ, USA)の筋肉注射に割り振った。48時間後に、すべての対象に、内毒素を静脈にボーラス注入した(体重で1ng/kg。United States Pharmacopeial Convention Inc, Rockville, MD, USA)。内毒素血症と関連した臨床症状の発生、時間および重大度を、従来発表のように記録した(Suffrediniら、1999. J Infect Dis 172: 1278-82)。内毒素注入後、血圧、心拍数および体温を含む生命徴候を一定間隔で測定した。全身性糖衣量と微小血管糖衣厚さを、内毒素注入約4時間後でかつベースライン測定と同じ時刻に測定した。
糖衣透過トレーサ・デクストラン40(前掲のNieuwdorp Mら、2006. Diabetes 55: 480-6; Suffrediniら、1999)の血管内分布量から循環血漿量を減算することによって、従来発表のように全身性糖衣量を評価した。循環血漿量は、従来発表の方法(Orthら.1998. Anesth Analg 87: 1234-8)で計算された。標識自己赤血球の脈管内分布量を使用して循環血液量を定量化した。血液を抜き取り、1,330rpmの遠心分離機に5分間かけた。次に、フルオレセインナトリウム(フルオレスセイン−ジ−Na 25%、250mg/ml、AZUA Pharmacy, Amsterdam, the Netherlands)を赤血球部分に5分間添加した。よく洗浄した後、標識赤血球を生理食塩水に初期体積(60ml)まで再懸濁し、再注入した。次に、注入後4、5、6および7分に血液を抜き取った。全赤血球プール内の標識赤血球の一部分を使用して循環赤血球量(VERY)を評価した。注入前の無標識赤血球は陰性対照の役割を果たした。FACScan分析装置(FACS Calibur[登録商標], Becton Dickinson, Mountain View, USA)を使用して、血液中の標識赤血球の一部分を測定した。少なくとも100、000個の細胞が計数された。データをCellquest(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)で分析した。10、000rpmのHettich−Haematokrit遠心分離機でヘパリン添加血液を5分間遠心分離した後、ヘマトクリット(Ht)値を測定した。循環血漿量の式([1−Ht]xVERY)/Ht)により、VERYと大血管Htから循環血漿量を計算した。
個々の毛細血管内の内皮糖衣の厚さを、従来発表(前掲のNieuwdorpら、2006; Nieuwdorpら、2006. Diabetes 55: 1127-32)のように、舌下微小循環系(Cytometrics, Philadelphia, PA, USA)の直交偏光スペクトル(OPS)によって測定した。要するに、毛細管を白血球が通過する前と通過直後に5本の個々の毛細管内に流れる赤血球の幅を測定した。健康な毛細管では、糖衣は、赤血球排除ゾーンとして知られる管腔内皮表面から赤血球を分離することによって毛細管血の充填を制限する。定常状態では、この赤血球排除ゾーンは、内皮糖衣の最大厚さの上限を表わす。白血球が一時的に毛細管内皮糖衣を圧縮するので、毛細管赤血球カラムの対応する一時的拡張を使用して毛細管糖衣寸法を評価することができる(Hanら、2006. Journal of Fluid Mechanics 554: 217-35)。倍率325xを提供する5x対物レンズで、728x576画素のサイズで記録された画像をフレーム・レート25/秒で収集した。参加者の臨床詳細を知らされていない1人の観測者が、lmage Pro Plus(Media Cybernetics, Silverspring, MD, USA)で画像分析を行った。自発的な毛細管白血球通過の前と後で、デジタル・カリパスを使用して、解剖学的毛細管直径と流動赤血球カラム幅を測定した。参加者1人当たり少なくとも5本の毛細管の糖衣寸法を決定した。これらの結果の平均は計算され、さらなる分析に使用された。さらに、毛細管密度の示度として、1視野当たりの毛細管数を数えた。
ベースライン測定時、ならびに内毒素注入後のt=0、1/2、1、3、4および24時間後に、対象から血液試料を抜き取った。遠心分離後、アリコットを液体窒素中で瞬間冷凍し−80℃で貯蔵した。標準化されたフローサイトメトリー分析で、EDTA血漿中の白血球血漿濃度とサブトラクションを決定した。血漿CRPレベルは、市販の分析物(Roche, Switzerland)で測定された。有効エタネルセプト投与のマーカーとして、血漿可溶性TNFα受容体タイプ2(sTNFR2)レベルが、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)(R&D Systems Inc, Minneapolis, MN, USA)を使用して測定された。血漿IL−6レベル(TNFα活性により生じたサイトカイニン)が、Cytometric Bead Array技術(R & D systems, Minneapolis, MN, USA)を使用して測定された。トロンビン生成を評価するために、プロトロンビン活性化フラグメントF1+2(Dade Behring, Marburg, Germany)をELISAによって測定した。自動化された定量的ラテックス粒子免疫測定(Biomerieux, Durham, NC, USA)により、フェブリン形成とその後の内因性フェブリン溶解の反映としてDダイマー・レベルを測定した。ELISA(Echelon Biosciences, Salt Lake City, UT, USA)によって、全量(低分子量と高分子量を含む)ヒアルロン酸を評価する定量的血漿ヒアルロン酸を測定した。ELISA(Seikagaku Corporation, Tokyo, Japan)によって、アクチナーゼE(Sigma, St. Louis, MO, USA)による血清前処理後にヘパラン硫酸を測定した。少し修正を加えた従来発表の分析により、総血漿ヒアルロニダーゼ活性を決定した(24)。要するに、コバリンク・プレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)をビオチン化ヒアルロン酸(0.2 mg/mL, HyluMed[登録商標] Sterile IUO Sodium hyaluronate, Genzyme Corp, Cambridge, MA, USA)で被覆した。血漿試料を800倍に希釈し、pH3.7、37℃で2.5時間プレートに添加した。標準曲線にはウシのヒアルロニダーゼ(Sigma, St. Louis, MO, USA)を使用した。アビジン-ビオチン複合体(Vectastain, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)の結合により残量のヒアルロン酸を決定し、その後、o−フェニレンジアミン(OPD)と30%のH2O2を加えた。読取り装置においてOD492nmでプレートを測定した。
全血試料をパイロジェンを含まないリチウム・ヘパリン管内で収集し、次に9ボリュームの氷冷赤血球溶解緩衝液で10分間保温し、4℃で10分間遠心分離した。残りの細胞を氷冷PBSで2回洗浄した。フローサイトメトリー分析用に、抗体と混合したFACS緩衝液中で0.5×106個の細胞を保温した。すべての試薬を滴定して、製造業者によって推奨されたような最適な結果を得た。フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)標識マウス抗ヒトCD14(lgG2a)、抗ヒト・アロフィコシアニン(APC)標識CD18(IgG1)およびフィコエリトリン(PE)標識抗ヒトCD11b(IgG1)とCD62L(IgG1)(R&D Systems, San Jose, CA, USA)によって細胞表面の染色を行った。適切なイソタイプ対照抗体を使用して非特異性抗体結合を修正した。染色後、細胞を洗浄して4%パラホルムアルデヒド中に固定し、FACS Calibur血球計算器フローサイトメトリーによって分析した。CellQuestソフトウェア(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)によってデータを分析した。
すべての値は、平均±SEMとして提供される。個別試料のt検定によって、内毒素生理食塩水と内毒素エタネルセプト群間のベースライン特性の差を分析した。処置群内の変化を一元配置分散分析によって分析した。処置群間の変化を二元配置分散分析(相互作用処理と時間)によって分析した。全身性糖衣量と他のパラメータ間の相関関係をSpearmanの順位相関係数試験(両側)によって計算した。P<0.05は、統計的に意味する差を表わすと考えられた。
エタネルセプト前処理のある場合またはない場合の内毒素注入に対する臨床応答
内毒素注入前、臨床特徴に生理食塩水とエタネルセプト群間の差は見られなかった。内毒素注入と全身性糖衣量測定は十分に許容され、重大な悪影響には遭遇しなかった。内毒素注入によって、寒気、頭痛、筋肉痛、吐き気などの特有の臨床症状が生じた。これらの症状は、両群で一時的であったが、エタネルセプト群より生理食塩水群の方がより頻繁でより集中的であった(データは示されず)。エタネルセプト前処理後にsTNFR2レベルが著しく増大し(1.8±0.2〜520±34ng/mL、p<0.0001)、エタネルセプトが有効に投与されたことが示された。エタネルセプト群では、内毒素注入後4時間血漿レベルが上昇し続け(646±83ng/mL)、それに対して、生理食塩水群では、sTNFR2血漿レベルがわずかしか影響を受けなかった(内毒素注入後4時間で2.1±0.3から5.2±0.5ng/mL,p<0.01)。生理食塩水群では、内毒素注入4時間後に血圧、心拍数および体温が著しく変化した(収縮期血圧:127±11から119±5mmHg、ns;拡張期血圧:67±8から51±9mmHg、p<0.01:心拍数:59±6から82±5、p<0.01;および体温:36.6±0.5から38.3±0.4℃、p<0.01。すべてのパラメータに関してベースライン特性と比較)。エタネルセプトはこれらの変化を弱めた(収縮期血圧:125±7から123±10mmHg、ns;拡張期血圧:69±6から67±6mmHg、ns、心拍数:62±4から69±3、ns;および体温:36.6±0.5から37.3±0.5℃。すべてのパラメータに関してベースライン特性と比較)。
2群間でベースラインの全身性糖衣量が比較可能であった(生理食塩水群:1.6±0.6に対してエタネルセプト群:1.7±0.5リットル、ns)。全身性糖衣量は、主にデクストラン40分布量の減少(4.7±0.6から4.1±0.9リットル、p<0.O5。図1aと図1bを参照)により、生理食塩水群での内毒素注入後に大幅に減少した(0.8±0.4リットル,p<0.01)。循環血漿量が増大し(3.1±0.4から3.3±0.7リットル,p<0.05)、それに伴ってヘマトクリット値がわずかに低下した(0.44±0.03〜0.41±0.03%、p<0.01)。さらに、内毒素によって、デクストラン40の全身性クリアランス率(τ-1)が2倍になった(0.008±0.005から0.015±0.008分-1、p<0.01)。エタネルセプトは、循環血漿量(2.9±0.5から2.8±0.6リットル、ns)、ヘマトクリット値(0.43±0.02から0.42±0.02%、ns)、または全身性デクストラン40クリアランス率(0.009±0.002から0.009±0.001分-1、ns)に影響を及ぼすことなく、デクストラン40分布量の減少(4.6±0.6から3.9±0.5リットル、p<0.05)により内毒素誘導糖衣量損失を減少させた(1.1±0.2リットルに、p<0;01)。
血漿ヒアルロン酸レベル(糖衣シェディングのマーカー)は、生理食塩水群での内毒素注入後の最初の1時間以内に大幅に上昇し(62±18から85±24ng/mL、p<0.05)、一方、エタネルセプトでは、内毒素誘導シェディングが減少した(58±13から46±10ng/mL、p<0.05)(図2a)。血漿ヒアルロニダーゼ活性は、生理食塩水群において内毒素注入4時間後に大幅に減少し(ベースラインと比較して−56±20%、p<0.01)、一方、エタネルセプト群では、ヒアルロニダーゼ活性は影響を受けなかった(ベースラインと比較して−8±14%、ns;図2b)。特に、ヘパラン硫酸血漿レベルは、前処理を有するどちらの場合も、内毒素チャレンジ後4時間にあまり変化しなかった(生理食塩水群:5.3±1.1から5.5±1.2μg/mlに対してエタネルセプト群:5.4±1.3から5.1±1.0μg/ml、ns。ベースラインと比較して)。しかしながら、内毒素注入24時間後、生理食塩水群では血漿パラン硫酸レベルがさらに上昇した(エタネルセプト群7.4±1.5μg/mlに対して11.2±2.1μg/mL、p<0.01)。
生理食塩水群の炎症マーカーは、内毒素チャレンジ後に上昇した(IL−6:4.2±6.3から678±427pg/ml、CRP:0.5±0.4から26.7±7.6mg/L、p<0.01。ベースラインと比較。図3aと図3bを参照)。エタネルセプトは、この増加を大幅に減少させた(IL−6:4.6±3.1から127±98pg/ml、p<0.05。ベースラインと比較。CRP:0.6±0.4から16.0±3.4mg/L、p<0.01。ベースラインと比較。図3aと図3b)。平行して、内毒素4時間後に、両方処理群で、循環白血球の数が、ベースラインと比較して2倍になった。
これらのデータは、TNFαによって部分的に引き起こされた炎症活性が、内皮糖衣を動揺させることが実証する。このメカニズムにより、炎症によって生じる血管脆弱性が増大する。このデータにしたがって、本発明は、糖衣健康の検出と調節を含む炎症および血管疾患に対する診断および治療法を提供する。
この例は、本発明の方法と2つの先行技術の方法との比較例を提供する。本発明の方法は、(1)RBC幅の白血球誘導過渡的拡張を使用する先行技術の方法、および(2)(図4の)トレーサを使用して糖衣の状態を評価する先行技術の方法と比較される。
RBC幅(図4B)の白血球誘導過渡的拡張に基づく先行技術の方法は、すべての視覚化された血管に、測定1回当たり約2個の白血球を測定し、したがって糖衣の状態を決定するのに十分なデータが収集されるまでに少なくとも10分の視覚化時間を必要とする。さらに、この種の測定は、白血球(4)の(希な)通過を許容する血管上でのみ実行できることに注意されたい。微細血管などの小さい血管では、きわめて長い視覚化時間が必要である。
先行技術の糖衣状態の測定は、血流へのトレーサの追加を使用して実行される。この方法は、患者から血液を採り、患者の外で血液をマークし、マークした血液を患者に注入することを必要とする。数時間後(通常は4時間後)に、血液を患者から抜き取り抽出し分析する。この分析は、糖衣の状態に関する情報を提供する。
(1)この先行技術の方法は、きわめて労働集約的で長時間かかる。(2)この先行技術の方法は、患者にとってきわめて不快である。実際には、患者によっては、トレーサに対するアレルギー反応を起こし、患者の寿命を危険にさらすことがある。(3)さらに、より小さな血管は、赤血球の貫流が制限されるので、この先行技術の方法は、糖衣の状態の1回の測定しか提供せず、その測定が正確でない場合がある。
この例は、本発明の方法により糖衣の状態を確立することによって、糖衣の状態を素早く検出できることを実証する。
サイズ分布測定を実行することによって個々の毛細血管内の内皮糖衣の状態を測定し、それにより、赤血球幅(RBCW)、血管径(VD)、毛細管容積余量および糖衣幅(GW)を決定した。MicroScan Video Microscope System (MicroVision Medical, The Netherlands)を使用して臨床舌下ビデオ顕微鏡画像を取得した。このシステムは、5x倍率を備えたLED照明付き携帯型ビデオ顕微鏡である。赤血球速度の評価を改善するために、ストロボスコープ照明が導入される。このシステムは、ADキャプチャ装置に接続されて画像をコンピュータ・ハードドライブに直接記録されるデジタル信号に変換する標準ビデオ出力(PALまたはNTSC)を有する。
舌下噴霧ニトログリセリンで処理された対象と処理されてない対照対象間で糖衣の状態の測定値を比較した。ニトログリセリンが糖衣を破損させることが知られているので、舌下噴霧ニトログリセリンは、制御された刺激を提供する。図5aと図5bに示されたように、処理した対象内の糖衣の状態と未処理の対象内の糖衣の状態に明確な相違が見られる。この例で実行されたような糖衣の状態の動的変化の検出は、ほぼ数分で検出することができた。糖衣の状態は、RBCWに直接関連した(図5aと図5b)。この結果から、わずか100個のRBCの分析で類似の結果が得られたことが分かった。
これらのデータから、本発明の方法を使用して糖衣の状態を実行できることが実証された。さらに、本発明の方法が、糖衣の状態の動的変化を素早く検出する正確な方法を提供することが分かる。
この例は、例2で述べたような方法を用いて糖衣の状態を定義することによって、本発明が、癌対照と健常対照のケースで糖衣の状態を区別できることを実証する。また、治療効果も評価することができる。
糖衣の状態の測定値を、癌と診断された対象と健常対照対象間で比較した。図6aと図6bに示されたように、健常対照と癌対象間で糖衣の状態の明確な差異を確認することができる。この例で実行されたような糖衣の状態の動的変化の検出は、ほんの数分で検出することができた。診断対象をVEGF受容体阻害化合物で処理した後、図7aと図7bに示されたように、この治療の効果を視覚化することができる。
これらのデータは、糖衣の状態を使用して、糖衣の破損、この例では癌によって引き起こされた破損を診断することができることを実証する。さらに、特定化合物による癌の治療の効果を評価することができる。
この例は、例2で述べたような方法を使用して、糖衣の状態を定義することによって、本発明が、糖尿病と健常対照のケースで糖衣の状態を区別できることを実証する。また、治療の効果も評価することができる。
糖尿病(ミクロアルブミン尿症のない)と診断された対象と健常対照対象間で、糖衣の状態の測定値が比較された。図8aと図8bに示されたように、健常対象と糖尿病対象の糖衣の状態に明確な差異を確認することができる。この例で実行されたような糖衣の状態の動的変化の検出は、ほんの数分で検出することができる。診断対象を擬糖化合物で処置した後で、図9aと図9bに示されたように、この治療の効果を視覚化することができる。
これらのデータは、糖衣の状態を使用して、糖衣の破損、この例では糖尿病によって引き起こされた損傷を診断することができることを実証する。さらに、特定化合物による糖尿病の治療の効果を評価することができる。
Claims (5)
- 糖衣の幅を決定する非侵襲性の方法であって、
(a)微細血管内の少なくとも10個の赤血球の幅を測定する段階と、
(b)段階(a)を、少なくとも10個の微細血管に繰り返す段階と、
(c)赤血球細胞のカラム幅測定のサイズ分布から最大赤血球幅(赤血球幅の分布のp99値;またはRBCWmax)と中央赤血球幅(赤血球幅の分布のp50値;またはRBCWmedian)とを得て、最大赤血球幅と中央赤血球幅との間の相違の半分を糖衣の幅として決定する段階とを含むことを特徴とする方法。 - (d)前記赤血球幅測定値の前記サイズ分布から毛細管容積余量を決定する段階をさらに含み、ここで前記毛細管容積余量は、(最大赤血球幅の2乗)/(平均赤血球幅の2乗)であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- コンピュータ読取り可能媒体または類似の独立型コンピュータ装置に記憶され、
(a)RBCW分布データを読み取り、
(b)請求項1または2の方法によって糖衣の幅を決定するように構成されたコンピュータ・プログラム。 - コンピュータ読取り可能媒体または類似の独立型コンピュータ装置に記憶され、
(i)RBCW分布データを読み取り、
(ii)糖衣の状態を評価する方法であって、(a)微細血管内の少なくとも10個の赤血球の幅を測定する段階と、(b)段階(a)を、少なくとも10個の微細血管に繰り返す段階と、(c)赤血球細胞のカラム幅測定のサイズ分布から糖衣の幅の評価を得て、ここで前記糖衣の幅は、最大赤血球幅(赤血球幅の分布のp99値;またはRBCWmax)と中央赤血球幅(赤血球幅の分布のp50値;またはRBCWmedian)との間の相違の半分に等しいものであり、それにより前記糖衣の前記状態を決定する段階とを含む方法によって前記糖衣の前記状態を決定するように構成されたコンピュータ・プログラム。 - 前記糖衣の状態を評価する方法は、(d)前記赤血球幅測定値の前記サイズ分布から毛細管容積余量を決定する段階をさらに含み、
前記毛細管容積余量は、(最大赤血球幅の2乗)/(平均赤血球幅の2乗)であることを特徴とする請求項4に記載のコンピュータ・プログラム。
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