JP5596255B2 - 分子相互作用パラメータの決定のための方法およびシステム - Google Patents

Description

（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、分子相互作用のための反応速度論的パラメーターの決定に関し、より詳細には、固体支持体表面に固定化された分子と、溶液中の分子への結合パートナーとの間の相互作用のための反応速度論的パラメーターを決定するための方法に関する。本発明はまた、この方法を実行するための分析システム、コンピュータプログラム製品、およびコンピュータシステムに関する。

（関連技術の説明）
リアルタイムで生体分子などの分子間の相互作用をモニタリングし得る分析センサーシステムは、関心が高まりつつある。通常相互作用分析センサーシステムまたは生物特異的相互作用分析センサーシステムと呼ばれるこれらのセンサーシステムは、しばしば光学的生物センサーおよび親和性分析に基づき、かつ相互作用を行う分子を標識する必要とせずに、とりわけ平衡常数および速度定数をリアルタイムで決定するための迅速な方法を提供する。これらは、タンパク質、核酸、脂質、および炭水化物を含む種々の生体分子の研究において使用されてきた。これらのシステムにおいて、それに固定化された分子反応物の１つを有するセンサー表面は、センサー表面を通り過ぎる溶液の流れを与えることによって、またはキュベットなどの中においてのいずれかで他の反応物を含む溶液と接触され、そして表面における結合相互作用が検出される。

従来、例えば、２つの相互作用する分子の間の相互作用についての結合常数および解離定数（それぞれＫ_ａおよびＫ_ｄ）を決定するために、１つの分子（しばしばリガンドと呼ばれる）をセンサー表面に固定化し、かつ他の分子（しばしば分析物と呼ばれる）がいくつかの既知の濃度の溶液で供給される。次いで、各濃度の分析物またはサンプルが、センサー表面を通り過ぎた層流中で、またはキュベットなどの中でセンサー表面と接触され、センサー表面への分析物の結合を可能にする。サンプルがセンサー表面と接触させられるようになった後で、この表面は分析物を含まない溶液（通常は緩衝液）を接触されて、固定化リガンドからの分析物の解離を可能にする。これらの結合フェーズおよび解離フェーズの間、表面への分析物の結合の量が連続的に検出され、かつ結合データが収集される。新たな分析物濃度の試料とセンサー表面に接触される前に、リガンド表面は、リガンドを破壊しないようにしながら、結合した分析物のいかなるものをも除去することが可能な再生溶液で表面を処理することによって、回復または「再生」が行われる。このような方法において、すべての異なるサンプルは、リガンド密度に関係する限り、本質的に１つでありかつ同じであるリガンド表面に接触する。次いで、結合定数および解離定数が、異なる式の型における相互作用モデルの数学的記述にデータをフィットさせることによって、収集された結合データから得られ得る。通常、サンプルについての結合データすべてが同じフィットにおいて使用され、これはグローバルフィッティングと呼ばれる手順である。相互作用についての決定された結合速度定数および解離速度定数Ｋ_ａおよびＫ_ｄ、平衡定数Ｋ_Ｄ、および親和性定数Ｋ_Ａ（Ｋ_Ａ＝１／Ｋ_Ｄ）が次に計算され得る。代替的には、結合フェーズの間に相互作用が定常状態に達するという条件で、平衡定数は、フィッティングなしで結合データから直接的に得られ得る。

しかし、リガンドがセンサー表面に共有結合的に固定化され、かつ適切な再生条件を見出すことが困難である場合に問題が生じ得る。次いで、新たな各分析物濃度との接触の前に、固定化された捕捉剤を介する更新されたリガンドの結合が代替的であり得るが、決定のために大量のリガンドを消費する欠点を有する。

固定化リガンドの再生のための要件を必要としない滴定手順による平衡定数の決定は、Ｓｃｈｕｃｋ，Ｐ．ら（１９９８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６５，７９−９１によって記載されている。サンプルは、市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサーの２つのセンサースポットに対して密封したループ中で連続的に循環させる。センサースポットの１つは試料中の可溶性分析物のための固定化リガンドで官能基化され、他方のセンサースポットは参照表面として働く。相互作用分子のための結合等温線は、循環しているループへの分析物の段階的平衡滴定によって得られ、すなわち、センサースポットは、各濃度について平衡が得られるまで段階的な濃度増加の分析物を連続的に接触される。この平衡滴定は、高親和性システムにおける結合定数の決定のために特に有用であると言われている。なぜなら、これは、結合の反応速度論の解釈の必要性、およびそれによって物質移動制限から生じ得る問題を除外するからである。

同様の段階的な平衡滴定手順は、Ｈａｌｌ，Ｄ．Ｒ．およびＷｉｎｚｏｒ，Ｄ．Ｊ．（１９９７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４，１５２−１６０においてキュベットベースのバイオセンサー設計のために記載されている。

Ｍｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．ら（１９９８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６５，３２６−３３０は、表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサーを使用する高親和性相互作用の平衡分析を開示している。このアプローチにおいて、結合フェーズのデータを収集するために利用可能な時間は、ランニング緩衝液に分析物を直接的に配置することによって増加される。完全な平衡結合プロフィールは、分析物の濃度を変化させること、および表面反応が再平衡化することを可能にすることによって、再生なしで生成された。分析物濃度もまた、結合反応が完全に可逆的であることを実証するために減少させられた。このようにして、非常に高い親和性の相互作用についての平衡解離定数が決定され得る。

Ｓｈａｎｋ−Ｒｅｔｚｌａｆｆ，Ｍ．Ｌ．及びＳｌｉｇａｒ，Ｓ．Ｇ．（２０００）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２．４２１２−４２２０には、表面再生の必要性をなくした分析物勾配表面プラズモン共鳴ＳＰＲ（ＡＧ−ＳＰＲ）と呼ばれる技術によって反応速度論的速度及び平衡結合親和性を決定するための１段階方法が記載されている。分析物の勾配を、連続流条件下でセンサー表面に通すので、分析物の濃度は経時的に直線的に増加する。分析物がセンサー表面上の固定化リガンドに結合する速度は、分析物濃度が増加するにつれて表面プラズモン共鳴の変化をモニタリングすることによって確認される。反応速度論的速度は、分子的相互作用のための２コンパートメントモデルにデータをフィットさせることによって決定され、物質移動制限下のシステムに対しても使用できる。

結合能力および再生条件を決定するための滴定手順は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．ら、Ｂｉａｓｙｍｐｏｓｉｕｍ １９９８，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ ２−４ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９８，５ｔｈ Ｂｉａｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｉｎ Ｊａｐａｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ５−６，１９９８によって提案されている。

ＵＳ−Ａ１−２００３／０１４３５６５は、分析物と、センサー表面に固定されたリガンドとの間の速度定数を含む相互作用パラメーターを決定するための方法を開示し、ここで、測定は、連続して数回、例えばキュベット中で、各回の分析物濃度の段階的な修飾を伴って実行され得る。測定は、平衡まで完了される必要はないが、より初期に中断され得、かつ分析物の濃度はより高くまたはより低くされ得る。各分析物濃度に対応する曲線部分を結合するための別々のフィッティングは、それぞれの最初の結合速度を決定するために使用され、次いで、そこから相互作用の結合定数および解離定数が決定される。

このように、平衡結合親和性を決定するための、バイオセンサーおよび親和性分析を組み合わせた滴定手順は当該分野においてそれ自体公知であるが、反応速度論的速度定数を決定するための複数の滴定の使用は、上記に言及した刊行物、Ｓｈａｎｋ−Ｒｅｔｚｌａｆｆ，Ｍ．Ｌ．およびＳｌｉｇａｒ，Ｓ．Ｇ．（２０００）およびＵＳ−Ａ１−２００３／０１４３５６５においてのみ開示されているようである。Ｓｈａｎｋ−Ｒｅｔｚｌａｆｆ，Ｍ．Ｌ．およびＳｌｉｇａｒ，Ｓ．Ｇ．（２０００）に従う方法は、これが連続的な分析物の勾配の使用を必要とするという制限に遭遇しており、他方、最初の結合速度がしばしば輸送の制限に起因して反応速度論的結合速度よりも低く、これが反応速度論的分析において信頼性の低い最初の結合速度を生じるという点では不利である。さらに、この型の評価は、分析物濃度の注入の順番を制限する。

それゆえに、先行技術から、（ｉ）分析物の連続的勾配が使用されるものではない限り、または最初の結合速度が物質移動制限を含まないシステムにおいて決定されるのではない限り、バイオセンサーおよび親和性分析に基づくシステムを使用する分子相互作用についての反応速度論的速度を決定するために、センサー表面を異なる濃度の分析物と接触させる前に固定化リガンドを再生し、それによって各分析物濃度に対して本質的に１つでありかつ同じリガンド表面を提示することが必要となることが結論付けられ得る。

本発明の１つの目的は、段階的滴定によって、反応速度論的速度定数を含む化学的な相互作用パラメーターを決定するためのセンサーに基づく方法を提供することであり、その方法は、物質移動制限下での測定を可能にしながら、再生手順を取り除く。

（発明の要旨）
本発明に従って、上記その他の目的が化学的相互作用パラメーターを決定するための親和性センサーに基づく方法によって達成できるという予想外の知見が得られ、この方法は、１つの及び同じ実験的サイクルにおいて、センサー表面の途中での再生を行わずに、分析物濃度の段階的変化を実行する工程、及び物質移動制限を考慮した分子相互作用のための反応速度論的モデル（例えば、２コンパートメントモデルなど）に関して検出された結合データのセットすべての全体的分析を使用して相互作用パラメーターを決定する工程を包含する。従って、このようにして、反応速度論的データは分子の移動制限に関わらず得られ得、かつ異なる分析物濃度が任意の順番で使用され得る。

それゆえに、１つの態様では、本発明は、センサー表面に固定化されたリガンドと溶液中のリガンドに対する結合パートナー（分析物）との間の可逆的分子相互作用についての反応速度論的パラメーターを決定する方法を提供するが、この方法は、以下の工程：
ａ）上記固定化リガンドの途中での再生又は更新を行わずに、上記固体支持体表面に、 順次、種々の既知濃度の上記結合パートナーを含む複数の流体試料を流して、上記固定化リガンドに結合パートナーを結合させる工程と、
ｂ）上記固体支持体表面に、結合パートナーを含まない流体試料を流して、上記リガンドから結合パートナーを解離させる工程と、
ｃ）工程ａ）及びｂ）の際に、時間及び結合パートナーの溶液濃度に関連して、上記固体支持体表面に結合した上記結合パートナーの量を経時的にモニタリングし、もって結合データを収集する工程と、
ｄ）上記結合剤と固定化リガンドとの間の相互作用についての所定の反応速度論的モデルを、収集された結合データに、好ましくは全体的にフィットさせることによって反応速度論的パラメーターを決定する工程であって、このモデルが固体支持体表面での物質移動制限を考慮したものである、工程と
を含む。

改良方法において、異なる濃度の結合パートナーは、結合パートナーの勾配を生成する工程、および結合パートナーを含まない液体のセグメントと勾配のセグメントを交差させる工程によって得られる。

別の態様では、それゆえに本発明は、センサー表面に固定化されたリガンドと溶液中のリガンドに対する結合パートナー（分析物）との間の可逆的分子相互作用についての反応速度論的パラメーターを決定する方法を提供するが、この方法は、以下の工程：
ａ）上記固定化リガンドの途中での再生又は更新を行わずに、上記固体支持体表面に、 順次、種々の濃度の結合パートナーを含む複数の流体試料を流して、固定化リガンドに結合パートナーを結合させる工程であって、結合パートナーを含む流体試料が、結合パートナーを含まない液体のセグメントによって分離された結合パートナーの濃度勾配の不連続なセグメントである、工程と、
ｂ）工程ａ）の際に、時間及び結合パートナーの溶液濃度に関連して、上記固体支持体表面に結合した上記結合パートナーの量を経時的にモニタリングし、もって結合データを収集する工程と、
ｃ）各結合パートナーと固定化されたリガンドとの間の相互作用についての所定の反応速度論的モデルを、収集された結合データに対してフィットさせることによって反応速度論的パラメーターを決定する工程
を含む。

好ましくは、上記モデルは固体支持体表面での物質移動制限を考慮したものである。

すべての勾配セグメントの濃度が未知である場合、未知の濃度は見積もられ得る。これは、例えば、局所的フィッティングの濃度を含む工程ｄ）におけるフィッティングを有することによってなされ得る。

固体支持体表面は、好ましくはセンサー表面であり、すなわち、表面において結合相互作用に応答して検出可能なシグナルを産生するものである。

用語「モニタリングする」とは、本明細書中で使用される場合、検出が工程ａ）およびｂ）の間に複数回、好ましくは多数回実行されることを意味する。

別の局面において、本発明は、複数の結合パートナーを含有するサンプル中で結合パートナーの濃度を決定するための方法を提供する。

なお別の局面において、本発明は、複数の異なる結合パートナーについての反応速度論的パラメーターを決定するための方法を提供する。

別の局面において、本発明は、分子相互作用を研究するための分析システムを提供し、このシステムは、少なくとも１つの方法を実行するためのデータ処理手段を備える。

さらに別の局面において、本発明は、少なくとも本発明の１つの方法を実行するためのプログラムコード手段を備えるコンピュータプログラムを提供する。

なお別の局面において、本発明は、少なくとも１つの本発明の方法を実行するために、コンピュータ読み取り可能な媒体上に保存されるか、または電子的シグナルもしくは光学的シグナルで伝達されるプログラムコード手段を備えるコンピュータプログラム製品を提供する。

別の局面において、本発明は、少なくとも１つの本発明の方法を実行するために、プログラムコード手段を備えるコンピュータプログラムを備えるコンピュータシステムを提供する。

他の特徴、新たな特徴、および本発明の目的は、添付の図面と合わせて考慮される場合に、以下の発明の詳細な説明から明らかになる。

（発明の詳細な説明）
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。また、単数形（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、別段言及されない限り、複数形への言及を含むことを意味する。

上述のように、本発明は、好ましくは、分子相互作用を研究するため、および相互作用が進行するにつれて結果をリアルタイムで提示するためのセンサーに基づく技術を組み合わせた、新規な滴定型方法によって、固体支持体表面に固定化された分子と、溶液中の分子に対する結合パートナーとの間の相互作用についての反応速度論的定数を含む分子相互作用パラメーターの決定に関する。しかし、本発明をより詳細に記載する前に、本発明が使用される一般的背景が記載される。

化学センサー又はバイオセンサーは、代表的には、センサー表面の特性（例えば、質量、屈折率、又は固定化された層の厚さなど）の変化を検出する、標識を含まない技術に基づくが、ある種の標識化に依存するセンサーもまた存在する。代表的なセンサー検出技術には、質量検出方法（例えば、光学的、熱光学的、及び圧電性）又は音波（表面音波（ＳＡＷ）及び水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を含む）方法、電気化学的方法（例えば、電位測定法、導電率測定法、電流測定法、及び静電容量／インピーダンス法など）が含まれるがこれらに限定されない。光学的検出方法に関して、代表的な方法には以下のものが含まれる：物質表面濃度を検出するもの、例えば、反射−光学的方法（外部反射法と内部反射法の両方を含む）、角度、波長、偏光、又は分解されたフェーズを検出するもの、例えば、エバネセント波偏光解析法及びエバネセント波スペクトル分析法（ＥＷＳ、又 は内部反射スペクトル分析）、が含まれ、両方が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ角度屈折測定、臨界角度屈折測定、フラストレイテッド全反射（ＦＴＲ）、分散全内部反射（ＳＴＩＲ）、これは、分散増強レベル、光学的波動ガイドセンサー；外部反射画像解析、エバネセント波ベースの画像処理、例えば、臨界角度分解画像解析、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ角度分解画像解析、ＳＰＲ−角度分解画像解析などを含み得る。さらに、光度測定的方法及び画像処理／顕微鏡的方法が、「それ自体」、又は例えば、表面増強Ｒａｍａｎスペクトル測定（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴Ｒａｍａｎスペクトル測定（ＳＥＲＲＳ）、エバネセント波蛍光（ＴＩＲＦ）及びリン光に基づく反射方法と組み合わせて、導波管干渉計、導波管リーキングモードスペクトル測定、反射干渉スペクトル測定（ＲＩｆＳ）、透過干渉計、ホログラフィックスペクトル測定、及び原子間力顕微鏡（ＡＦＲ）と同様に言及され得る。

市販のバイオセンサーには、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎによって製造および市販されているＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システム機器が含まれ、これは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づき、かつ目的の結合リガンドと分析物との間でリアルタイムでの表面結合相互作用のモニタリングを可能にする。

以下の詳細な説明および実施例おいて、本発明は、ＳＰＲスペクトル測定の状況において、より詳細にはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）において例証されているが、本発明はこの検出手段に限定されるものではないことが理解されるべきである。むしろ、その上に固定されたリガンドへの分析物の結合を定量的に示すセンサー表面における変化が測定され得るという条件で、分析物がセンサー表面上に固定されたリガンドに結合するという親和性に基づく、任意の検出方法が利用され得る。

ＳＰＲの現象は周知であり、ＳＰＲは、光が特定の条件下で異なる反射指数の２つの媒体間の界面において反射するときに生じることを言うためには十分であり、そしてその界面は金属フィルム、代表的には銀または金によってコートされる。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器において、媒体はサンプルおよびセンサーチップのガラス（これは流体フロー系によってサンプルと接触される）である。金属フィルムは、チップ表面上の金の薄層である。ＳＰＲは特定の角度の反射における反射光の強度の減少を引き起こす。最小の反射光強度のこの角度は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムサンプル側において、反射光からの反対側の表面に近い屈折率に伴って変化する。

ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムの概略図は図１に示される。センサーチップ１はフローチャネル５を通して分析物４（例えば、抗原）を有するサンプルの流れにさらされる金フィルム２支持捕捉分子３（例えば、抗体）を有する。光源７（ＬＥＤ）からの単色性ｐ−偏光６はプリズム８によってガラス／金属界面９に連結され、ここで光が全体的に反射される。反射光ビーム１０の強度は光学的検出ユニット（光検出器アレイ）１１によって検出される。

ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器の技術的局面およびＳＰＲの現象の詳細な説明は、米国特許第５，３１３，２６４号において見出され得る。バイオセンサーセンサー表面についてのマトリックスコーティングについてのより詳細な説明は、例えば、米国特許第５，２４２，８２８号および同第５，４３６，１６１号において与えられる。さらに、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器と接続して使用されるバイオセンサーチップの技術的局面の詳細な説明は、米国特許第５，４９２，８４０号において見出され得る。上述の米国特許の完全な開示は、参照として本明細書に援用される。

サンプル中の分子がセンサーチップ表面上の捕捉分子に結合するときに、濃度、およびそれゆえに表面における屈折率が変化し、ＳＰＲ応答が検出される。相互作用の過程の間の時間に対する応答をプロットすることは、相互作用の進行の定量的な尺度を提供する。このようなプロットは通常センサグラムと呼ばれている。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムにおいては、ＳＰＲ応答値は共鳴単位（ＲＵ）として表現される。１Ｒｕは最小反射光強度の角度における０．０００１°の変化を表し、これは、大部分のタンパク質および他の生体分子については、センサー表面上の約１ｐｇ／ｍｍ^２の濃度変化に対応する。分析物を含むサンプルがセンサー表面に接触するにつれて、センサー表面に結合したリガンドが、「結合」と呼ばれる工程において分析物と相互作用する。この工程は、サンプルが最初にセンサー表面と接触されるので、ＲＵの増加によってセンサグラム上で示される。逆に、「解離」は、通常、サンプル流が、例えば、緩衝液流によって置き換えられるときに起こる。この工程は、分析物が表面結合リガンドから解離するにつれて時間に対するＲＵの低下によってセンサグラム上で示される。

センサーチップ表面における可逆的相互作用についての代表的なセンサグラム（結合曲線）は図２に提示され、センサー表面は固定化された捕捉分子、すなわちリガンド（例えば、抗体）を有し、サンプル中のそれについての結合パートナー、すなわち分析物と相互作用する（上述の他の検出原理に基づいてバイオセンサーシステムによって産生された検出曲線、またはセンサグラムは同様の外見を呈する）。ｙ軸は応答を示し（ここでは共鳴単位、ＲＵで）、およびｘ軸は時間を示す（ここでは秒で）。最初に、緩衝液がセンサー表面に対して通過され、これによりセンサグラムにおけるベースライン応答Ａが与えられる。サンプル注入の間、分析物の結合に起因するシグナルの増加が観察される。結合曲線のこのＢ部分は、通常「結合フェーズ」と呼ばれる。最終的に、定常状態条件に達し、ここでは、共鳴シグナルはＣにおいてプラトーに達する（しかし、この状態は常に達成されなくてもよい）。サンプル注入の最後には、サンプルは連続的な緩衝液の流れで置き換えられ、かつシグナルの減少は、表面からの分析物の解離または放出を反映する。結合曲線のＤ部分は、通常「解離フェーズ」と呼ばれる。分析は、再生工程によって終了され、ここでは、（理想的には）リガンドの活性を維持しながら、結合した分析物を表面から取り除くことが可能である溶液が、センサー表面に対して注入される。これは、センサグラムのＥ部分において示される。緩衝液の注入はベースラインＡを回復し、そして表面はここで新たな分析のために準備可能である。

結合および解離のフェーズＢおよびＤそれぞれより、結合および解離の反応速度論的関係に関する情報が得られ、そして共鳴シグナルの高さは表面濃度を表す（すなわち、相互作用から生じる応答は表面上の物質濃度の変化と関連する）。このことは、以下により詳細に説明される。

分析物Ａと表面結合（固定化）捕捉分子、すなわちＢとの間の可逆的反応を仮定し、これは、拡散または制限された物質移動ではなく、偽一次反応速度論に従う：

この相互作用モデル（通常、Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルと呼ばれる）は、分析物（Ａ）が一価でありかつ均質であることの両方であること、およびリガンド（Ｂ）が均質であること、およびすべての結合事象が独立であることを仮定しており、実際、非常に多くの場合において適用可能である。

分析物注入の間の分析物Ａの表面濃度の変化の速度（＝形成された複合体ＡＢの濃度の変化の速度）は、分析物Ａが進行する速度および進行しない速度の合計である：

ここで［Ａ］は分析物Ａの濃度であり、［Ｂ］はリガンドＢの濃度であり、［ＡＢ］は反応複合体ＡＢの濃度であり、ｋ_ａは結合速度定数であり、そしてｋ_ｄは解離速度定数である。

時間ｔの後、表面における未結合リガンドＢの濃度は［Ｂ_Ｔ］−［ＡＢ］であり、ここで［Ｂ_Ｔ］は全体または最大の、リガンドＢの濃度である。式（１）への挿入は以下を与える：

検出器応答単位によって（ＡＢが検出される）、これは以下のように表現される：

ここでＲは共鳴単位（ＲＵ）における時間ｔでの応答であり、Ｃは、溶液中における初期の、またはバルクの、遊離の分析物（Ａ）の濃度であり、Ｒｍａｘは、分析物（Ａ）が表面上のすべてのリガンド（Ｂ）に結合した場合に得られる応答（ＲＵで）である。式（３）の再配列は以下を与える：

ここでＲは共鳴単位（ＲＵ）における応答である。積分型において、式は以下である：

ここで、式（４）に従うと、ｄＲ／ｄｔが結合した分析物濃度Ｒに対してプロットされる場合、傾きはｋ_ａＣ＋ｋ_ｄであり、垂直方向の切片はｋ_ａＲ_ｍａｘＣとなる。バルク濃度Ｃが既知でありかつＲ_ｍａｘが決定されている場合（例えば、大幅に過剰となった分析物で表面を飽和することによって）、結合速度定数ｋ_ａおよび解離速度定数ｋ_ｄが計算され得る。しかし、より便利な方法は、積分関数（５）のフィッティング、または数値計算および微分方程式（４）のフィッティングであり、好ましくは以下に記載されるようなコンピュータプログラムによってである。

解離の速度は以下のように表現され得る：

および積分型：

ここで、Ｒ_０は解離フェーズの開始（表面の緩衝液洗浄を開始するとき）における応答である。

方程式（６）は線形化され得る：

そしてｌｎ［Ｒ／Ｒ_０］対ｔのプロットは傾き＝−ｋ_ｄを有する直線を生じる。しかし、より便利には、解離速度定数ｋ_ｄは指数関数的速度方程式（７）をフィッティングすることによって決定される。

親和性は結合定数Ｋ_Ａ＝ｋ_ａ／ｋ_ｄ、または解離定数（平衡定数とも呼ばれる）Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／ｋ_ａによって表現される。

解離定数Ｋ_Ａは、代替的には方程式（３）から決定され得、ここで平衡においてｄＲ／ｄｔ＝０であり以下を与える：

ここでＲ_ｅｑは平衡における検出器応答である。ｋ_ａ／ｋ_ｄ＝Ｋ_Ａであるので、方程式（９）における挿入および再配列は以下を与える：

結合反応が複数の濃度で実行される場合、データがフィットされ得るか、またはＲ_ｅｑ／ＣがＲ_ｅｑに対してプロットされ、これが傾き＝−Ｋ_Ａを与える。このような平衡分析は、結合および解離の速度が速すぎて正確に測定できない場合に実行され得る。

信頼性を有する反応速度論的定数を得るために、上記の分析は、通常、多数の異なる分析物濃度について、そして適切に、センサー表面における少なくとも１つの他のリガンド密度において反復される。

反応速度論的または他のバイオセンサーデータの分析のためのソフトウェアは市販されている。従って、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器によって生じた反応速度論的データの評価は、通常、専用のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、平方した残差の和を最小まで減少させる最も密接なフィットを与える変数についての値を見出すことによって、微分速度方程式および非線形回帰を計算して反応速度論的パラメーターをフィットさせるための数値積分を使用して実行される。残差は、各点において計算された曲線と実験的な曲線の間の違いであり、平方残差は、実験的曲線の上または下に偏差を等しく重み付けするために使用される。平方残差の和は方程式（１１）によって表現される：

ここでＳは平方残差の和であり、ｒ_ｆは所定の点においてフィットされた値であり、そしてｒ_ｘは同じ点における実験値である。

例えば、上記の分子相互作用については、このようなソフトウェア補助データ分析が、バックグラウンドノイズを減算後に、上記の式（５）および（７）によって表現されるような上述の単純１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルをフィットさせる試みを行うことによって実行される。

通常、結合モデルは、異なる分析物濃度Ｃを用いて（および／または異なるレベルの表面誘導体化Ｒ_ｍａｘを用いて）得られた複数の結合曲線に同時にフィットされる。これは、「グローバルフィッティング」と呼ばれ、センサグラムデータに基づき、このようなグローバルフィッティングは、単一のｋ_ａまたはｋ_ｄがすべてのデータに良好なフィットを提供するか否かを確立する。完了したフィットの結果は、操作者に画像として提示され、これは、もともとのセンサグラム上に重ね合わせ表示されたフィットされた曲線を示す。フィットの密接度はまた、標準的な統計学的尺度であるカイ二乗（χ^２）値によって提示される。良好なフィッティングのために、カイ２乗値は、ＲＵ^２におけるノイズと同じ規模である。選択的に、「残余プロット」がまた提供され、これは、いかにして実験データがフィットされた曲線から逸脱しているかのグラフ表示を与え、各曲線についての実験的データとフィットされたデータの間の違いを示す。次いで、操作者は、十分に良好であるか否かを決定する。十分でない場合、最も乏しいフィットを示すセンサグラム（１つまたは複数）が除外され、そしてフィッティング手順が、減少されたセットのセンサグラムを用いて再度実行される。この手順は、フィットが満足なものになるまで反復される。

場合により、上述の１：１結合反応モデルは有効ではなく、これは１つ以上の他の反応モデルを使用してデータセットが再分析されることが必要である。このような代替的なモデルには、例えば、物質移動（物質輸送）、２パラレル独立１対１反応、２競合反応、および２状態反応が含まれ得る。パラレル反応は、固定化リガンドが不均一である場合に起こり得るのに対して、不均一な分析物は競合反応を生じ得る。２状態反応は、リガンドと分析物の間のより安定な複合体に次第に導く高次構造の変化を示す。これらの代替的な反応モデルを反映する微分速度方程式については、これは、例えば、Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．およびＦａｌｔ，Ａ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００，１２１−１３３（この開示は参照として本明細書に援用される）に言及され得る。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムに関する曲線フィッティングのより包括的な記載については、これは、例えば、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（この開示は参照として本明細書に援用される）に言及され得る。

物質移動に関して、移動の効果は、反応速度が移動の速度と比較して速い場合に結合の反応速度論に影響を与える。分析物（Ａ）が固定化リガンド（Ｂ）に結合する反応について、物質移動制限を有する結合は以下の反応式で表すことができる：

それゆえに、結合相互作用を記載する微分方程式は、表面への分析物の物質移動についての用語を含む。フローセルについては、一連の対になった通常の微分方程式のセットからなり、かつ、とりわけＭｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．ら（１９９８）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７５，５８３−５９４、ならびにＳｈａｎｋ−Ｒｅｔｚｌａｆｆ，Ｍ．Ｌ．およびＳｌｉｇａｒ，Ｓ．Ｇ．（２０００）前出（これらの開示は参照として本明細書に援用される）において記載される「２コンパートメント」モデルが、データが物質移動によって影響される場合に、結合反応速度論の合理的な説明を与えるために考慮される。このモデルにおいて、フローセルは、２つのコンパートメントに分けられると仮定され、１つは分析物の濃度が一定であり、センサー表面の近傍の第２のものは、分析物濃度が物質移動速度、リガンドの表面密度、および反応速度定数に依存する。

固定化一価リガンド（Ｂ）と反応する一価分析物（Ａ）の相互作用については、このモデルは、以下の２つの微分方程式（１２）および（１３）によって表され得る：

ここでｋ_ｔはコンパートメント間の分析物の拡散的移動を説明する移動係数であり、Ｂ_Ｔは全体のリガンド濃度であり、Ａは遊離の分析物のバルク濃度であり、Ｃは注入（すなわち、最初の）分析物濃度である。ＡＢは複合体ＡＢの濃度であり（＝結合分析物の表面密度）、ｋ_ａおよびｋ_ｄは、それぞれ、結合速度定数および解離速度定数である。

反応速度論を全体的に分析するこの２コンパートメントモデルの使用は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）のような機器を用いて決定され得る反応速度の範囲を拡張すること、およびこれはまた、上述のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ分析ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから利用可能）において援用されていることが理解される。

異なる相互作用モデルについての理論的相互作用は、シミュレータ、例えば、上記のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ分析ソフトウェアに組み込まれているシミュレータを使用してシミュレーションされ得る。このようにして、種々の実験的パラメーターが利用され、それによって、どの相互作用条件が代替的な反応速度論モデル間を区別する際に決定的であり得るかを決定するために補助となり得る。

（本発明）
上述のように、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器を使用して反応速度論的パラメーターを決定することは、慣用的に、新たな反応物濃度を用いる各測定の前に、固定化リガンドの再生または更新を伴って、複数の異なる分析物濃度について、固定化リガンドとの分析物の相互作用をモニタリングする工程を包含する。次いで、相互作用についての反応速度論的モデルは、収集された結合データに対して全体的にフィットされ（通常はセンサグラムの形態）、反応速度論的パラメーターを与える。

本発明に従うと、反応速度論的パラメーターを決定するためのこのようなフローセルに基づく分析は実質的に改善され得、かつ滴定の型又は「配列注入」手順によってスピードアップが図られ、ここで、リガンド支持表面が、１つのかつ同じ分析的サイクルにおいて、異なる分析物濃度と連続的に接触されて、連続的なセンサグラムを産生する。次いで、物質移動制限を考慮した反応速度論的相互作用モデル（例えば、上述の２コンパートメントモデルなど）が、全体のセンサグラムに対して全体的にフィットされて、反応速度論的パラメーターを計算する。顕著に時間がかからないことに加えて、この滴定型の方法は、評価される実験データの量を減少し、固定化リガンドを破壊する再生条件のリスクを取り除く。

異なる分析物濃度を導入する順番は、本発明の手順の成功のためには重要ではない。むしろ、分析物濃度は、実際のところ、任意の順番で導入され得る。例えば、分析物濃度は連続的に増加されてもよく、連続的に減少されてもよく、または交互により高く、そしてより低くてもよい、などである。さらに、同じ濃度の分析物は、所望される場合、反復して導入され得る。

ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）または同様の機器のための分析物の注入（好ましくは短くあり得る）（例えば、３０〜６０秒間の規模）は、増加した反応物濃度が、増加した応答をかろうじてもたらすのみである場合には中断され得る。これは、いわゆる適合ソフトウェアを使用して有利にもたらされ得る。次いで、形成された複合体は、好ましくは、より長い時間の間、例えば、約５分間から約６０分間、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）または同様の機器の状況において、反応速度論的評価のための十分な解離データを加えるために、解離させた。このような解離時間は、選択的に、代替的に、または付加的に、サイクル中の任意の２つの分析物注入の間で実行され得る。

上述のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器の設計は、例えば、各分析物の注入にランニング緩衝液の注入が続き、次の濃度の分析物が注入される前に結合した分析物の部分的解離を可能にすることが注目されるべきである。例えば、約１分の間隔でのこのような交互の分析物を含まない量が、上述の（好ましくはより長い）解離期間によって得られるものに対して解離データを加えることが理解される。十分な解離データがこれらの分析物を含まない液体の交互の注入によって得られるならば、より長い解離期間でさえもがなしで済まされ得る。途中での緩衝液注入はまた、たとえセンサー機器の設計自体によって、注入間の緩衝液注入なしで連続的な分析物の注入が可能であったとしても、当然、使用できる。

少なくともある適用のために、流れは、全体の実験的サイクルの間に実質的に一定であることが好ましい。

連続的注入手順は、選択的に、少なくとも１回、同じかまたは別の分析物濃度の配列を用いて反復され得、次いで、収集されたすべての結合データが、反応速度論的モデルに同時にフィットされ得る。

必要に応じて、異なる反応物濃度を含む流体体積は、分析物の濃度勾配の異なる量のセグメントであり得る。減少する（または増加する）分析物勾配のセグメントの連続的注入のための方法は、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」という表題の本発明者らの同時係属ＰＣＴ出願（この開示は参照として本明細書に援用される）において記載されている。

この「パルス注入」法において、各注入は、分析物含有サンプル、および別の液体（例えば、緩衝液）の交互の流れによって生じる一連の短いサンプルパルス、適切には、４または５から４０パルスまで、好ましくは１５〜３０パルス、より好ましくは約２０パルスからなる。各パルスは、好ましくは、１〜４０μｌ、好ましくは１０〜４０μｌ、より好ましくは１５〜２５μｌ、適切には約２０μｌの量を有する。パルスの持続時間、すなわち、溶液の各セグメントは、８〜２０秒長、好ましくは約１０〜１５秒長、適切には１２秒長であり得、フローセルを通してのサンプル液体の流速は、５０〜２００μｌ／分、好ましくは８０〜１２０μｌ／分、適切には１００μｌ／分であり得る。

このようにして、いくつかの濃度レベルからの情報は、各注入のパルスが原理的には１つの濃度を構成するという点で、単回注入を通して生成される。選択的に、注入の間のいくつかのパルスは破棄され得、それによって破棄されたパルスはセンサーを通して通過されない。代替的には、いくつかの液体のアリコートは、分離したセグメントを作製するために、交互の緩衝液注入を実行する前でさえ破棄され得る。

濃度勾配がどのように調製されるかに依存して、すべてのセグメントは既知であってもよく、または既知でなくてもよい。すべての濃度が既知である場合、反応速度論的パラメーターは、上記のグローバルフィッティングによって決定され得る。他方、例えば、エッジセグメントの濃度のみが既知である場合、例えば、「分散勾配」の場合において、フィッティングは分析物濃度の局所的フィッティングを含まなければならないことがある。

所望により、上記のように実行される１つ以上の連続的実験からの結合データは、１つ以上の従来型の単一濃度実験からの結合データを合わせてもよく、次いで、その合わせたデータは反応速度論的相互作用モデルにフィットされる。従って、一般的に、反応速度論的相互作用モデルに全体的にフィットされる全体のデータセットは、１つ以上の「連続的」結合曲線および１つ以上の単一濃度結合曲線を含む、結合曲線の任意の組み合わせを含み得る。

本発明の理解を容易にするために、ここで図３を参照した場合、固定化リガンド（Ｂ）と反応し、複合体（ＡＢ）（これが検出されるＳＰＲ応答を生じる）を形成する分析物（Ａ）の連続的に増加する濃度を用いる滴定のための例示的なセンサグラムを示す（上述のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器を用いて得られるようなもの）。この滴定は、以下の実施例１においてより詳細に記載される。このセンサグラムを参照すると、分析物濃度８０ｎＭは４０４〜４６４秒の間に注入され、２４０ｎＭは５２３〜５８３秒の間、７３０ｎＭが６４２〜７０２秒の間、および２２００ｎＭが７６０〜８２０秒の間に注入された。

結合曲線を分析する前に、分析物の各注入のための開始時間及び終了時間が示され、ベースラインがゼロレベルに調整される。次いで、一般的に、結合曲線は、時間依存的な分析物濃度に基づく相互作用モデルを使用して、物質移動制限を考慮して分析できる（例えば、上述の２コンパートメントモデル）。必要である場合、このモデルは、他の相互作用メカニズム、例えば、高次構造変化

競合反応

パラレル反応

または二価分析物

などに適合され得る。このようなモデルは、例えば、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋにおいてより詳細に記載されている。

例えば、１：１結合を仮定すると、以下の微分方程式が、固定されたリガンドＢに結合可能な分析物Ａの時間依存性濃度を表し得る。

ここでＡは遊離の分析物Ａの表面濃度であり、ｋ_ｔは移動係数であり、Ｃ_１からＣ_ｎは異なるバルク濃度の分析物であり、Ｂは固定化リガンドの濃度（リガンド密度）であり、ＡＢは形成した複合体の濃度（＝結合した分析物）であり、そしてｋ_ａおよびｋ_ｄはそれぞれ結合速度定数および解離速度定数である。

実験の開始において、表面における分析物濃度Ａが０であると仮定され、リガンドの濃度ＢはＲ_ｍａｘであると仮定され、かつ形成された複合体ＡＢの濃度が０であると仮定される場合、上述のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアと適合可能な形態でここで書かれている以下の関数が、相互作用システムを説明している。

上述のモデルにおいて、サイン関数＄１から＄４（１または０である）は、特定の分析物濃度が注入されるときを示す（ｔＯｎ１は、分析物濃度１が注入される時間であり、ｔＯｆｆ１は分析物濃度１が停止する時間、などである）。関数＄５および＄６は、ともに時間に対する分析物の表面濃度の変化を説明し、＄６は、リガンド密度および複合体が時間とともにどのように変化するかを説明している。最初の行の関数は、各注入の間に存在する、結合しているＡＢおよびバルク効果からのシグナルの全体の変化に対応する。これらの方程式の数値積分および図３における全体のセンサグラムのすべてのデータ点に対するグローバルフィッティングによって、例えば、本発明に適合されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、反応速度論的速度定数ｋ_ａおよびｋ_ｂが得られ得る。他の相互作用メカニズムについての数学的モデルは、当業者によって容易に考案され得る。

フィットの結果が図４において示され、ここで、実線の「波状でない線」は８０から２２００ｎＭの濃度範囲についての最良のフィットのための適合した曲線を示し、ｋａおよびｋｄは、以下の実施例１に記載されるように単一の値、それぞれ１．０^＊１０^５Ｍ^−１ｓ^−１および６．６^＊１０^−４ｓ^−１に制約される。

上記のモデルを用いて、反応速度論的データおよび親和性データは、移動制限にも関わらず、このように得られ得る。上述のように、本発明は分析物の注入順序に感受性ではないので、比較的低濃度の分析物濃度の分析は、結合が飽和に近づいているか、または平衡応答よりも上である場合に実行され、それによって、移動効果が小さい場合に、センサグラム中の反応速度論的情報を最小化する。

２つ以上の異なるリガンド密度における結合分析からのデータは、有利に同時にフィットされ得る。

反応速度論的速度定数と同時の濃度の測定は、移動係数ｋ_ｔが既知でありかつ一定に保たれるという条件下で、上記の滴定手順およびデータフィッティングを使用して実行され得る。好ましくは、少なくとも２つからの結合データ、および好ましくは、次いでより多くの密度が使用される。

上記のものと類似の滴定型アプローチもまた、同じリガンド（同じかまたは異なる既知の濃度）に結合する複数の異なる分析物についての反応速度論的速度定数を決定する（少なくとも概算する）ために使用され得る。この場合において、異なる分析物は、異なる分析物濃度ではなく、センサー表面に対して連続的に通過される。結合データの評価は、得られる全体の結合曲線に対する異なる速度定数のフィッティングを可能にするように修飾される。このような手順は、例えば、最良の結合剤、例えば、レセプターなどの薬物標的に結合する薬物候補を迅速に見出すためにリガンドに対する異なる結合パートナーをスクリーニングするために使用され得る。選択的に、このアプローチは、異なる分析物の使用と組み合わされ得る。

上述のように、分析物注入は「パルス注入」アプローチによって実行され得る。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に基づくこのようなパルス注入を実行するための例示的なシステムは、図５において模式的に図示されている。

図５において見られ得るように、サンプル（２０）および緩衝液（２１）をそれぞれ含む２つの容器（例えば、試験管）２０および２１が提供される。試験管から液体を吸引するための手段２２もまた提供され、下方に試験管まで伸びている垂直線を用いて示される。この手段２２は、適切には針であり得、同じ針が両方の液体のために使用されるので、サンプル管２０において示される針は破線で示される。この針は、これによって、液体の吸引のために連続して試験管の間を物理的に移動される。当然、吸引手段を考案する他の可能性が存在し、示されたものは例示に過ぎない。

システム緩衝液サプライもまた提供される。最初に全体のシステムが緩衝液で満たされ、すなわち、すべてのチューブがこの緩衝液を含む。チューブ２３のそれぞれのセグメント（それぞれ試料及びシステム緩衝液）がマイクロ流体デバイス２４に接続され（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ−ＩＦＣと呼ばれるＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器中で）、これは１つ以上のフローセル（図示された場合においては４つのフローセル、２５ａ〜２５ｄ）への制御された液体送達を可能にする。各フローセルはセンサー表面を有し、１つ以上の適切な標的がそこに固定化される。それぞれの液体の流れを制御するためのマイクロ流体デバイス２４における多数のバルブｖ１〜ｖ４もまた提供される。バルブｖ２及びｖ３はフローセルへの液体の供給を制御するのに対して、バルブｖ１及びｖ４は各々廃棄に接続されている。バルブｖ１〜ｖ４は制御ユニット２６によって制御されている。代替的には、種々のライン中での流れは正確なポンプによって制御され得、それによって、実際の流速が単調に制御され得、０の流れから必要とされる最大の流速までの範囲にわたり、又はそれらの組み合わせである所望の流速を供給する。

この手順における第１の工程は、針２２に少量の緩衝液を吸引することであり、すなわち、緩衝液試験管２１に針を浸漬すること、および針に適切な量を吸引することである。しかし、吸引によって針に緩衝液を満たすことは厳密に必要となるわけではない。確かに、針は、一方の末端からの緩衝液で、すなわち、システム緩衝液サプライから、全体のシステムを緩衝液で満たすことによって充填され得る。次いで、針は、サンプル試験管に移動し、適切な量として約５００μｌのサンプルが吸引される。しかし、実際の容量は、適用およびサンプルの種類に依存し得、広範な限界内で変化し得、例えば、１μｌと４ｍｌの間である。

試料の吸引は、試料と緩衝液の分散による混合をもたらし、チューブ内に勾配を生じる。この場合、勾配は、チューブ内を流れる減少勾配（針から見て）である。増加勾配が必要とされる場合、試料を吸引した後で緩衝液を吸引しなければならず、かつ針内に既に存在している液体から試料を保護するために気泡を最初に吸引しておき、２番目に試料、３番目に緩衝液セグメントを吸引することによって非分散状態の試料トレイリングエッジが得られるように担保する。吸引手順は常に、マイクロ流体デバイス２４に既に存在している液体から勾配を保護するため、１又は数個の気泡の吸引で終わる。

第１の工程の前に、連続的な空気およびサンプルのセグメントを提供し、かつマイクロ流体デバイス２４にそれらを注入するために、空気およびサンプルの数回の交互の吸引を実行することが好ましい。このようにして、サンプルは、マイクロ流体デバイス中でランニング緩衝液との望ましくない分散から保護され、すなわち、吸引されたサンプル液のリーディングフロントが名目上の（最大の）濃度を示す。

勾配が確立されたら、勾配はマイクロ流体デバイスに針を介して注入され、試料及び緩衝液流ライン中のバルブｖ１及びｖ２をプログラムされた手順に従って開閉して、試料（チューブの長軸方向の勾配を呈する）と緩衝液のパルスを交互にフローセルに供給できるようにし、その結果、試料液流が少なくとも１回、好ましくは複数回、別の液体（この場合はシステム緩衝液で代表される）によって交差される。この交差は、液体の少なくとも２つの別々のセグメントを生じる。しかし、システム緩衝液以外のさらに別の液体、例えば、純粋な溶媒、他の目的の化学種を含む溶液なども当然に可能である。

こうして、減少するサンプル勾配流のリーディングエッジは、最初の濃度を表す。最も頻繁には、リーディングエッジにおける濃度は名目上と非常に密接であり、既知の濃度を表すと見なされ得る。しかし、サンプル流の主要な部分は勾配を示し、従って、作製されるこのセグメントの大部分は、サンプルに関して異なる濃度を有する。

サンプル勾配流の所定の量がフローセルに流された後で、バルブｖ２は閉じられかつバルブｖ３は開かれて、それによってサンプル流の後ろのラインに緩衝液を注入する。その上に固定化された標的を有するセンサー表面に対する分析物含有サンプルの通過の間、分析物は標的と結合する。サンプルの量は、好ましくは、平衡に達することを可能にするのに十分であるべきである。しかし、平衡に達したが、平衡レベルが対応する結合曲線グラフ（応答対時間）から計算され得ることが必ずしも必要であるわけではない。関係する時間のフレームは、サンプル特異的結合および移動の特性、流速、温度、フローセルの寸法などに依存する。

試料が十分に長時間注入されたとき、緩衝液は、バルブｖ３を開くこと、およびバルブｖ２を閉じることによって注入される。表面に対する緩衝液の通過の間、分析物は解離する。このプロセスは、吸引したサンプルが注入されるまで反復される。

フローセルに完全な勾配を注入することは必ずしも必要ではない。緩衝液注入の間（ｖ３開く、ｖ２閉じる）、バルブ１は勾配の小セグメントを廃棄するために開かれ得る。これは、産生されるパルスの数を減少し、かつ完全な注入のために必要とされる時間を減少する。

バルブのないシステムが使用される代替的な実施形態において、結合フェーズの間、すなわち、サンプルがセンサーセルを通して通過する時間の間、緩衝液流は非常に低い値、規則的な流の５％未満、例えば、約１％に設定される。これは厳密に必要なわけではないが、緩衝液ラインへの漏れからサンプル溶液を保護する。次いで、特定の、所定の量のサンプルが、特定の速度でマイクロ流体デバイスに注入される。次いで、緩衝液流は、規則的な速度に再設定される。セルを通しての緩衝液の通過の間、センサー表面上の標的に結合したサンプル化合物は、適切な時間の期間の間、解離されることが可能である。

図６に、図５のマイクロ流体デバイスを用いた勾配の代替的な形成方法を示す。これは、既知の濃度の試料セグメントを吸引すること、またそれを、接続ｃ１及びチューブセグメントｍ１を使用して、マイクロ流体デバイス中で緩衝液で希釈することによってなされる。これによって、緩衝液と試料が、フローセルと接触する前に均質な混合物を形成することができる。パルスは、以前に記載されたように、すなわち、例えば、交互のポンプ又はバルブｖ２及びｖ３を使用することによって生成される。接続ｃ１は単純なＴ接続とすることができ、その結果、勾配中の試料の濃度は、［流速（緩衝液）］と［流速（試料）］との比率が経時的にどの程度変化するかによって制御される。別の可能性は、２方向バルブを接続ｃ１とすることである。試料の濃度は、ｍ１への入口を緩衝液と試料との間で切り換え、２方向バルブを、試料に対して開いている時以外は緩衝液に対して開くようにすることによって制御される。チューブセグメントｍ１において、別個に接続された試料及び緩衝液のセグメントは、分散によって均質な混合物を形成する。この方法は、すべての時点で既知の濃度の試料を有する勾配を産生することを可能にし、これは最初の少ないパルスのみが既知の化合物濃度を有する分散濃度勾配と対照的である。この後者の場合において、反応速度論的パラメーターをフィットさせることと同時に、局所的に濃度をフィットさせることが必要である。これは、以下に、より詳細に記載される。

いわゆる標識を含まない検出方法（ＳＰＲなどの上記に言及されたものを含む）を使用することが現在好ましいが、すでに上記に言及した他の検出技術（例えば、標識、例えば、放射性標識、蛍光団（表面蛍光を含む）、発色団、化学発光団、散乱光についてのマーカー、電気化学的活性マーカー、熱活性マーカーなど）もまた、当然意図され得る。

滴定（すなわち、連続的分析物注入）および時間依存性の分析物濃度を用いる評価を含む本発明の方法は、すでに上記で言及したように、手順の異なる工程を実行するコンピュータシステム実行ソフトウェアの形態で、実施されることが適切に低減される。好ましくは、滴定は、上記に言及されたように適合可能である。本発明はまた、コンピュータプログラム、特に、本発明の滴定手順を実施させるために適合された、キャリア上またはキャリアのコンピュータプログラムに拡張される。キャリアは、プログラムを伝送することが可能な任意の実体またはデバイスであり得る。例えば、キャリアは、ＲＯＭ、ＣＤ ＲＯＭ、もしくは半導体ＲＯＭ、または磁気記録媒体、例えば、フロッピー（登録商標）ディスクもしくはハードディスクなどの保存媒体を含み得る、キャリアはまた、例えば、電気的もしくは光学的なケーブルを介して、または無線通信もしくは他の手段によって伝達され得る、電気的または光学的シグナルなどの伝導性キャリアであり得る。代替的には、キャリアは、プログラムが埋め込まれた集積回路であり得る。

上記に概略を述べたソフトウェアはまた、従来からの単一の注入分析手順について上記でさらに記載されたのと同様に、異なる相互作用モデルのための理論的相互作用曲線を生成するために使用され得る。複合体モデル（例えば、高次構造変化モデル）についてのデータを生成することによって、注入時間および分析物濃度などのパラメーターを変化させること、次いで、このデータを１：１結合モデルおよび高次構造変化モデルの量にフィットさせることによって、残差が反応速度論的実験の最適な設計のための条件を同定し得る。

以下の実施例において、本発明の種々の局面が開示され、より詳細には例示目的であって限定的な目的ではない。

（機器）
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を以下の実施例１から４において使用した。この機器はＹ型フローセルを有し、これは、センサーチップ表面の上で二重の液体の流れを可能にし、これはいわゆる流体力学アドレッシングであり、例えば、ＥＰ−Ｂ１−１０２１７０３（この開示は参照として本明細書に援用される）において記載されている。この機器は、センサーチップ上で３つのパラレル検出スポットを使用する。

ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を以下の実施例５において使用した。この機器においては、マイクロ流体システムが、４つの個別に検出されるフローセル（１つずつまたはシリーズで）を通してサンプルおよびランニング緩衝液を通過させる。

センサーチップとして、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。これは、金コートされた表面を有し、共有結合されたカルボキシメチル修飾デキストランポリマーハイドロゲルを有する。

機器制御ソフトウェアを介する機器からのアウトプットは、「センサグラム」であり、これは、時間の関数としての検出器応答（「共鳴単位」で測定される）のプロットである。１０００ＲＵの増加は、約１ｎｇ／ｍｍ^２のセンサー表面上の物質の増加に対応する。実施例１から４において、評価は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン３．１（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して実行され、上記のような反応速度論的モデルに適合した。実施例５において、評価は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン３．１（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｍａｔｌａｂバージョン５．３（Ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）およびＥｘｃｅｌ ９７（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して実行した。

（実施例１）
（固定化キナーゼへのキナーゼインヒビターの結合）
抗ヒスチジン抗体（Ｑｉａｇｅｎ ３４６６０；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を１０ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ ５．０中で２０μｇ／ｍｌまで希釈し、１３０００ＲＵの抗体を、製造業者の指示書に従ってアミンカップリングを使用して（Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ−Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５に固定化した。流速は１０μｌ／分であった。次いで、３分間、１０ｍＭ ＰＢＳ中の３０μｇ／ｍｌのキナーゼ、次いで表面上のキナーゼを安定化するために、２．５分間のＥＤＣ／ＮＨＳおよびエタノールアミンを注入することによって、ヒスチジンタグ化キナーゼ（独自製品）を捕捉しかつセンサーチップ表面に架橋した。この手順を用いて、４０００ＲＵのキナーゼが固定化された。

キナーゼインヒビター、スタウロスポリンを、３０μｌ／分の流速で８０、２４０、７３０、および２２００ｎＭの濃度で注入した。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および３％ＤＭＳＯであった。注入手順についての観察されたデータおよびフィットされたデータの重ね合わせ表示プロットを図３（観察）および図４（観察プラスフィット）に実証している。結合速度定数は、１，０＊１０^５Ｍ^−１ｓ^−１と計算され、解離速度定数ｋ_ｄは６，６＊１０^−４ｓ^−１と計算された。

（実施例２）
（固定化カルボニックアンヒドラーゼへの一連のカルボニックアンヒドラーゼインヒビターの結合）
カルボニックアンヒドラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃ３６４０）、１０ｍＭ 酢酸緩衝液ｐＨ５．０中２０μｇ／ｍｌを、製造業者の指示書に従ってアミンカップリングを使用して（流速１０μｌ／分）Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５に固定化し、約２０００ＲＵおよび７００ＲＵの固定化されたカルボニックアンヒドラーゼを有するセンサー表面をそれぞれ得た。反応速度論的分析を、０．００５％ Ｐ２０および５％ ＤＭＳＯを有する１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液中のインヒビターを３０μｌ／分の流速で注入することによって実行した。インヒビターは、アセタゾラミド（Ｓｉｇｍａ Ａ６０１１）、アゾスルファミド（Ｓｉｇｍａ Ａ２７５９）、およびベンゼンスルホンアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ １０，８１４−６）であった。２つのリガンド密度についての観察されたデータおよびフィットされたデータを実証する重ね合わせプロットを図７（アセタゾラミド）、図８（アゾスルファミド）、および図９（ベンゼンスルホンアミド）において提示する。図７において、データは、各リガンド密度に対する２つの反復を表し、ｋ_ａは１，８＊１０^６Ｍ^−１ｓ^−１と計算され、ｋ_ｄは４，０＊１０^−２ｓ^−１と計算された。図８において、ｋ_ａは２，９＊１０^４Ｍ^−１ｓ^−１と計算され、ｋ_ｄは８．１＊１０^−３ｓ^−１と計算され、そして図９において、ｋ_ａは１，６＊１０^５Ｍ^−１ｓ^−１と計算され、ｋ_ｄは１．４＊１０^−１ｓ^−１と計算された。

（実施例３）
（固定化トロンビンへの高親和性インヒビターの結合）
トロンビン（Ｓｉｇｍａ Ｔ１０６３）、１０ｍＭ 酢酸緩衝液ｐＨ５．０中２０μｇ／ｍｌを、製造業者の指示書に従ってアミンカップリングを使用して（流速１０μｌ／分）Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５に固定化し、約２３００ＲＵおよび６００ＲＵの固定化されたカルボニックアンヒドラーゼを有するセンサー表面をそれぞれ得た。反応速度論的分析を、０．００５％ Ｐ２０、５％ ＤＭＳＯおよび３．４ｍＭ ＥＤＴＡを有する１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液中の高親和性トロンビンインヒビター、メラガトラン（Ｊｏｈａｎｎａ Ｄｅｉｎｕｍ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，Ｍｏｌｎｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）を注入することによって実行した。観察されたデータおよびフィットされたデータを実証する重ね合わせプロットを図１０において提示する。計算されたｋ_ａは２，０＊１０^７Ｍ^−１ｓ^−１であり、ｋ_ｄは１．８＊１０^−２ｓ^−１であった。

上記の実施例１から３は、広範な速度定数が連続的注入手順を用いて実証され得ることを実証する。これらの実施例において、ｋ_ａ値は２，９＊１０^４から２，０＊１０^７Ｍ^−１ｓ^−１の範囲であり、かつｋ_ｄ値は０．１４から６．６＊１０^−４Ｍ^−１ｓ^−１の範囲である。これらの実施例はまた、反応速度論的データが１つまたは２つのリガンド密度を使用して得られ得ること、および注入の順番が混合され得、かつ低濃度から高濃度までの順番のみではないことを例証する。

（実施例４）
（連続的および単回の注入の組み合わせ）
図１１において、連続的注入および単回注入を表すシミュレートしたデータは、評価において合わされて、ここですべての結合曲線が相似にフィットされる。左の３つの曲線は、５１２００ｎＭにおける単回注入でのセンサグラムを表すが、種々の注入時間、１０ｓ、３０ｓ、および５００ｓを伴うのに対して、右の曲線は、８００〜１２８００ｎＭの分析物の連続的注入を表す。これは、種々の数の注入および注入時間を伴うセンサグラムが分析され得ることを例証する。

（実施例５）
（相互作用速度定数の見積もり）
リゾチームに結合するラクダ由来の重鎖３重変異体単鎖ドメイン抗体（ｃＡｂ−Ｌｙｓ３：ｓ ＳＧＳ）（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手）の反応速度論を、上記の「パルス注入法」を用いて研究した。すべての実験を３０℃で実行した。１９０ＲＵ（チップ１）および２８０ＲＵ（チップ２）のリゾチームを、標準的なアミンカップリング法を使用して固定化した。２分間の活性化に際して、リゾチーム（１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ｐＨ７．０中８μｇ／ｍｌ）を、３分間（チップ１）および４分３０秒（チップ２）の間、注入した。１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ｐＨ７．０（流速５μｌ／分）を、固定化の間のランニング緩衝液として使用した。ＳＧＳを、異なる初期濃度で注入した（ＨＢＳ−ＥＰ中、０．５、１．０、および２．０μＭ）。結果を図１２に示す。

サンプル溶液中のバルクエラーを、参照フローセルシグナルの減算によって補正した。個々のパルスをＭＡＴＬＡＢを用いて分離および整列させ、その結果、各パルスは１つの結合曲線に対応した。ＢＩＡソフトウェアを使用して曲線を重ね合わせた。１５パルスをすべてのフィットにおいて使用した。最初の２つのパルスを初期濃度と仮定した。ｋ_ａ、ｋ_ｄおよびＲ_ｍａｘのグローバル開始値は第２のパルス（パルス番号１はその不規則な形状のために除外した）にフィットした。なぜなら、その濃度が既知であったからである。次いで、これらの値を使用して、すべてのパルスの濃度にフィットさせた。ｋ_ａ、ｋ_ｄおよびＲ_ｍａｘの見積もりを、新規な濃度の情報を使用して純化させた。プロセスを、すべてのパラメーターが集中するまで反復した。各パルス注入を別々に評価した。濃度のフィッティングは、部分的に線状の濃度勾配を示した。パルス注入法を用いて得られた反応速度論的データは、以下の表１において平均値および標準偏差ともに提示している。

（表１：ラクダ抗体ＳＧＳおよびリゾチームを用いるパルス注入アッセイからの結果）

＊Ｃ_０は名目上のＳＧＳの濃度である。
＊＊χ^２はフィットの質の統計学的尺度である。

本発明は、上記の本発明の特定の実施形態に限定されないが、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって確立されることが理解されるべきである。

図１は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくバイオセンサーシステムの模式側面図である。 図２は、結合フェーズおよび解離フェーズを有する結合曲線を伴う代表的なセンサグラムである。 図３は、本発明の方法に従う、固定化キナーゼを有する表面に対するキナーゼインヒビター（スタウロスポリン）の連続的注入によって得られる代表的なセンサグラムである。 図４は、グローバルフィッティングから得られる、その上に重ね合わせ表示された結合曲線を有する図３のセンサグラムである。 図５は、パルス濃度勾配についてのシステムの概略図である。 図６は、パルス濃度勾配を作製するための代替的なシステムの概略図である。 図７は、固定化カルボニックアンヒドラーゼを有する表面に対するカルボニックアンヒドラーゼインヒビター（アセタゾレミド）の連続的注入についての観察されたデータおよびフィットされた結合データの重ね合わせ表示プロットである。 図８は、別のカルボニックアンヒドラーゼインヒビター（アゾスルファミド）の連続的注入についての図７と図８のそれと同様の重ね合わせ表示である。 図９は、さらに別のカルボニックアンヒドラーゼインヒビター（ベンゼンスルホンアミド）の連続的注入についての図７のそれと同様の重ね合わせ表示である。 図１０は、固定化トロンビンを有する表面に対するトロンビンインヒビター（メラガトラン）の連続的注入についての観察されたデータおよびフィットされた結合データの重ね合わせ表示のプロットである。 図１１は、４つの結合曲線およびフィットされた重ね合わせ表示プロットであり、３つの曲線（左側）は分析物の単回注入でのセンサグラムを表し、そして１つの曲線（右側）は分析物の連続注入についてのセンサグラムを表す。 図１２は、固定化リゾチームを有する表面に対して、ラクダ抗体（ＳＧＳ）のパルス注入によって得られたセンサグラムである。

Claims (23)

1. 固体支持体表面に固定化されたリガンドと溶液中のリガンドに対する結合パートナーとの間の可逆的分子相互作用についての反応速度論的パラメーターを決定する方法であって、当該方法が、
   ａ）上記固定化されたリガンドの途中での再生又は更新を行わずに、上記固体支持体表面に、順次、種々の既知濃度の上記結合パートナーを含有する複数の流体試料を流して、上記固定化されたリガンドに結合パートナーを結合させる工程と、
   ｂ）上記固体支持体表面に、結合パートナーを含まない流体試料を流して、上記リガンドから結合パートナーを解離させる工程と、
   ｃ）工程ａ）及びｂ）の際に、時間及び結合パートナーの溶液濃度に関して、上記固体支持体表面に結合した上記結合パートナーの量を経時的にモニタリングし、もって結合データを収集する工程と、
   ｄ）上記結合パートナーと上記固定化されたリガンドとの間の相互作用についての所定の反応速度論的モデルを、収集された結合データに全体的にフィットさせることによって反応速度論的パラメーターを決定する工程であって、上記モデルが固体支持体表面での物質移動制限を考慮したものである、工程と
   を含む方法。
2. 工程ａ）に関して同じ又は別の順序の結合パートナー濃度を用いて工程ａ）〜ｃ）を少なくとも１回繰返し、収集した結合データを全て工程ｄ）で前記反応速度論的モデルに同時にフィットさせる、請求項１記載の方法。
3. 請求項１における工程ｃ）で得られた順次的な結合データを単一濃度の結合パートナーについての少なくとも１セットの結合データと組み合わせ、組み合わせた結合データを工程ｄ）で前記反応速度論的モデルにフィットさせる、請求項１又は請求項２記載の方法。
4. 請求項１における工程ｂ）が、結合パートナーを含む最後の流体試料を前記表面に流した後で実行される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
5. 請求項１における工程ｂ）が、結合パートナーを含む２つの流体試料の間で実行される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
6. 結合パートナーを含む各流体試料の後に、結合パートナーを含まない流体試料が続く、請求項４又は請求項５記載の方法。
7. 結合パートナーを含まない流体試料の１つが、結合パートナーを含まない他の流体試料よりも長時間にわたり、前記固体支持体表面に流される、請求項６記載の方法。
8. 結合パートナーを含む複数の流体試料が同じ濃度の結合パートナーを有する流体試料を含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
9. 結合パートナーを含む流体試料が、結合パートナーの段階的に増加する濃度を含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
10. 結合パートナーの濃度の増加がセンサー表面に結合した結合パートナーの量の所定の増加を生じたときに、請求項１の工程ａ）を止める、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
11. 前記反応速度論的モデルが２コンパートメントモデルである、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
12. 前記反応速度論的モデルが１：１結合、併発反応、競合反応、高次構造変化及び二価分析物から選択される相互作用機構に適合している、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
13. 請求項１の工程ａ）が前記固体支持体表面において少なくとも１つの他のリガンド密度にて実行される、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
14. 前記固体支持体表面に対する流れが一定に維持される、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
15. 前記固体支持体表面がセンサー表面である、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
16. 前記固体支持体表面における検出がエバネセント波検知に基づく、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
17. 前記固体支持体表面における検出が標識の検出に基づく、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
18. 請求項１における工程ｄ）がコンピュータによって実行される、請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
19. 請求項１における工程ａ）からｄ）がコンピュータによって実行される、請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法。
20. 分子結合相互作用を検出するための分析システムであって、
    （ｉ）少なくとも１つのセンサー表面、上記少なくとも１つのセンサー表面における分子相互作用を検出するための検出手段及び上記相互作用の経時的な進行を提示する検出データを生じるための手段を備える、センサーデバイス、並びに
    （ｉｉ）請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法を実行するためのデータ処理手段、
    を備える、分析システム。
21. コンピュータプログラムであって、上記プログラムがコンピュータ上で実行されるときに請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法を実行するためのプログラムコード手段を備える、コンピュータプログラム。
22. コンピュータプログラム製品であって、上記プログラムがコンピュータ上で実行されるときに請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法を実行するための、コンピュータで読み取り可能な媒体上に保存されるか、又は電子的シグナルもしくは光学的シグナルで伝達されるプログラムコード手段を備える、コンピュータプログラム製品。
23. 請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法を実行するための手段を備えるコンピュータシステム。
    

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