JP5583600B2 - ヒト体液中の微小胞を測定し、特徴付けるための新規な方法 - Google Patents

Description

本発明は一般に、ガン診断の分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒト体液中のエキソソームを定量および定性する方法に関する。

エキソソームは30〜120 nmのサイズの微小胞であり、通常は受容体放出および細胞間クロストークに使用されるエキソサイトーシス経路を介して能動的に分泌される。エキソソームは細胞培養物の上清および体液において、複数段階の超遠心分離の後に、検出することができる。主な組織適合性複合体タンパク質（ＭＨＣＩ、ＭＨＣ ＩＩ）および抗原提示に関与するタンパク質に加えて、エキソソームは多くの細胞機能に関与する膜および細胞質タンパク質を担持し得る。エキソソームは特定の生理的条件下で、樹状細胞（ＤＣ）、リンパ球、マスト細胞および上皮細胞のような多様な細胞タイプから分泌される。このプロセスは、多小胞体（ＭＶＢ）とも称されるこれらの複数の融合体由来の微小胞を含む、バスケット様細胞リザーバーの形成を導く。このプロセスは、特に正常細胞における、超微細構造の観察によって解明された。しかし、エキソソーム調製物の免疫電子顕微鏡観察およびウェスタンブロット分析によって、これらの微小胞は、初期エンドソーム（例えばＲａｂ５）、リソソーム（例えばＣＤ６３、ＣＤ８１、ＬＡＭＰ−１）および後期ファゴソーム（Ｒａｂ７）のような多様な細胞内液胞のマーカーに加えて、いくつかの他のより細胞特異的なタンパク質（例えばＭＨＣクラスＩＩＩ抗原）も共発現することが示されている。

腫瘍細胞からのエキソソームの放出は正常細胞からのものよりも劇的に高く、しばしば免疫抑制効果と関連している。腫瘍由来エキソソームは、いくつかの腫瘍マーカー、例えば結腸癌についてのＣＥＡ、黒色腫についてのＭＡＲＴ−１またはｇｐ−１００の発現を除き、多くの局面において正常細胞のエキソソームと同等である。さらに、腫瘍エキソソームの起源は、多くの局面において、正常なエキソソームのものとは異なっていると思われる。これはおそらく、悪性細胞は、細胞質から細胞外空間へ、そして細胞外空間から細胞質への、より動的な小胞の輸送を有するためである。

がん進行における腫瘍エキソソームの役割は、最近現れた研究領域である。初期のデータは、これらの小器官がＤＣ介在性Ｔ細胞クロスプライミングのための腫瘍抗原物質の担体として作用することを示唆している。かかる結果は、抗癌ワクチンとして腫瘍エキソソームを使用するという臨床的試みを支持する。これらの微小胞によって示される免疫系の多様な要素に対する抑制効果の膨大な数の証拠は、腫瘍エキソソームの疾患進行における関与を明らかに支持している。特に、多様な起源のヒト腫瘍細胞によって分泌されるエキソソームが、死亡リガンド（例えばＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ）の発現を介して、活性化されたＴ細胞においてアポトーシスを誘導し、ＮＫ機能を阻害し、そして正常な単球から骨髄由来サプレッサー細胞の産生を促進できることが、近年示されている。これらのデータは、適当な腫瘍起源のエキソソームががん患者の血漿および新生物性浸出液において豊富に見られるという再現性のある証拠と共に、腫瘍細胞増殖および進行を可能にする宿主微小環境を形作る腫瘍エキソソームの役割を支持している。

がん進行におけるエキソソームの役割の理解が増えつつあること、そして悪性腫瘍および腫瘍増殖の新たな治療法、改善された診断方法および追跡の必要性が増えつつあるという事実に鑑みて、ヒト体液中のエキソソームを検出し、測定する方法およびツールが必要とされている。しかし実際には、エキソソームを検出するために現在使用されている方法は定量的でないか（ＴＥＭ）、あるいはわずかにのみ定量的である（ＷＢ）。エキソソームを定量するためにフローサイトメトリーが使用されているが、この方法は、研究者が必要とする正確な測定ができない。実際に、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別装置）分析は、小さなサイズのものであっても、細胞を定量するための好適な方法であるが、かかる小胞（すなわち50〜100 nm）の量を定量するためには好適でない。さらに、合計平均蛍光のおおまかな測定によって、あるサンプル中にいくつの微小胞が存在するかを正確に定量することはできない。さらにまた、ＦＡＣＳ分析は異なるサンプルの同時分析ができない。したがって、少量の体液からエキソソームを検出し、定量する方法が必要とされている。さらに、がんの初期診断が疾患処置に必須であることに鑑みて、強力な腫瘍マーカーおよび予後因子が必要とされている。

エキソソームについての有用なインビボデータを得るための中心的な問題は、ヒト体液、特に血漿からエキソソームを定量し、特徴付けるための、エキソソームを得る現在利用可能な方法の効率が低レベルであることである。体液は腹水、脳液、骨髄、尿、糞便または気管支肺胞洗浄液であってもよい。これらの現在直面している課題の解決法を提供するために、本開示は、体液、特にヒト血漿からエキソソームを検出し、定量する単純で信頼のできる方法を提供する。本開示に従って、ＥＬＩＳＡベースの試験（ＥｘｏＴｅｓｔと称する）は、健常ドナーおよび腫瘍患者の両方のヒト血漿からエキソソームを定量し、特徴付けることができる。この試験によって、ヒト黒色腫または結腸癌を移植されたＳＣＩＤマウスおよび腫瘍患者の両方の血漿から、エキソソーム様微小胞の特徴付けが可能である。本開示は、エキソソームの血漿レベルが腫瘍サイズと直接関係しており、カベオリン−１が腫瘍患者の血漿から精製したエキソソームから排他的に検出可能であることを示している。本開示に従って、ヒト患者の血漿中の腫瘍エキソソームの検出は、ヒト悪性腫瘍の診断および追跡に有用である。

本明細書に開示した技術によって、腫瘍の診断、追跡およびスクリーニングに関する診療に有用な非侵襲的試験が可能となる。本開示による技術はまた、腫瘍の臨床研究に使用することもできる。さらに、あるウイルス（例えばＨＩＶおよびＨＣＶ）およびプリオンが細胞によって放出されるエキソソームまたは血漿内で検出できることが知られているので、本開示の技術は、ウイルス性疾患、伝染病および自己免疫疾患の特徴付けおよび研究に使用することもできる。さらにまた、本発明は、エキソソームで発現されるタンパク質（例えば腫瘍マーカー、ウイルス性タンパク質、プリオンタンパク質）に基づく既存の臨床検査を改善するためのツールを提供する。

本発明の根拠は、次の２つの重要な点に基づく：
１． 特に少量の、ヒト血漿サンプルにおいてしばしば入手可能なエキソソームの定量および特徴付けを可能とする方法についての先行技術は存在しない。
２． 多くのヒト疾患状態、特にがんにおいて、非侵襲的診断および／または予後検査の満たされていない要求が存在する。

したがって、本発明の目的は、特に少量の、エキソソームを定量し、特徴付ける方法を提供することである。
別の本発明の目的は、血漿サンプル中のエキソソームを定量し、特徴付ける方法を提供することである。
さらに別の本発明の目的は、2 ml未満の体液中のエキソソーム濃度を測定し、併せてエキソソームのタンパク質組成物のほぼ完全な特徴付けを行う方法を提供することである。

さらに、本発明の目的は、複数サンプル中のエキソソームを同時に定量する方法を提供することである。
さらにまた、本開示による試験は、血漿中のエキソソームの定量が腫瘍サイズと関連していることを示す。したがって、別の本発明の目的は、がん患者の予後を追跡し、得る方法を提供することである。
さらに、本発明の目的は、血漿エキソソームの細胞源を確立し、それらの中の感染物質（ＨＩＶ、ＨＣＶ）および／または伝染物質（例えばプリオンタンパク質）の存在を評価する試験を提供する。

ヒト黒色腫の細胞培養物上清から精製したエキソソームの検出。Ａ．エキソソーム検出および定量のためのＥｘｏＴｅｓｔ（ＥＬＩＳＡ）のスキーム図。Ｂ．ＥｘｏＴｅｓｔによる精製ＣＤ６３＋ エキソソームの用量漸増分析。Ｃ．ヒト黒色腫細胞（Ｍｅ５０１）の培養物上清から精製した異なる量のエキソソーム中のＣＤ６３、Ｒａｂ５ｂおよびＬａｍｐ−１発現のウェスタンブロット分析。Ｄ．上清Ｍｅ５０１細胞から精製し、ラテックスビーズにコーティングした黒色腫由来エキソソームでのＲａｂ５ｂおよびＣＤ６３発現のＦＡＣＳ分析。 ヒト黒色腫を移植したＳＣＩＤマウスの血漿エキソソームの検出。Ａ．ＥｘｏＴｅｓｔによるヒト黒色腫細胞を移植したＳＣＩＤマウスの血漿から精製した腫瘍エキソソームの用量漸増分析。Ｂ．ヒト黒色腫細胞（Ｍｅ５０１）を移植したＳＣＩＤマウスの血漿から精製したエキソソーム内のＲａｂ−５ｂおよびＣＤ６３発現のＦＡＣＳ分析。Ｃ．腫瘍増殖中の異なる時点で分析したＭｅ５０１移植ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍サイズと血漿エキソソーム濃度の相関関係。マウスのグループは、各時点で５匹の動物によって代表された。エキソソーム濃度はOD450×1000として表す。 エキソソームでのカベオリン−１（Ｃａｖ−１）発現の特徴付け。Ａ．細胞抽出物ならびにヒト黒色腫細胞およびマクロファージ由来エキソソーム中のＣａｖ−１のウェスタンブロット分析。Ｂ．Ｍｅ５０１細胞、Ｍｅ５０１移植ＳＣＩＤマウスおよび腫瘍ネガティブＳＣＩＤマウスの血漿から精製したエキソソーム中のＣＤ６４、Ｒａｂ−５ｂおよびＣａｖ−１のウェスタンブロット分析。Ｃ．Ｍｅ５０１移植ＳＣＩＤマウスの血漿から精製したエキソソームでのＣａｖ−１発現のＦＡＣＳ分析。Ｄ．黒色腫移植後５週目に屠殺した黒色腫担持ＳＣＩＤマウス由来のＣＤ６３＋およびＣａｖ１＋ エキソソームの血漿濃度。 黒色腫患者由来の血漿中のエキソソームの定量。健常ドナーおよび黒色腫患者の血漿から精製したエキソソームを、ＣＤ６３（Ａ）またはカベオリン−１（Ｂ）を検出抗原として用いてＥｘｏＴｅｓｔで定量した。データはボックスプロット代表として示す：各ボックスの水平および垂直の線は、それぞれ中央値と25〜75 パーセント値を示す。黒色の点は異常値を示す。エキソソーム濃度はOD450×10000として表す。グループ間の差はMann-Whitney検定によって評価した。 未分画サンプルでのＥｘｏＴｅｓｔ（Ｅｌｉｓａ）。Ａ．ヒトマクロファージ、黒色腫細胞および黒色腫患者由来の血漿から得た未分画培養物上清（50 ml）と比較して、精製エキソソーム（タンパク質50 μg）中で検出可能なエキソソームの量を測定した。データは平均±SDとして表す。Ｂ．患者（n=9、黒い菱形）および健常ドナー（n=4、白い菱形）の両方から得た精製または未分画血漿サンプルで測定した、ＣＤ６３＋ エキソソームの血漿濃度の回帰分析。エキソソーム濃度はOD450×1000として表す。 黒色腫患者由来の血漿中のエキソソームの定量。検出抗原としてＣＤ６３またはｇｐ１００およびＭＡＲＴ−１のような典型的な黒色腫タンパク質を用いて、ＥｘｏＴｅｓｔによって黒色腫患者（ＭＥＬ）および健常ドナー（ＨＤ）の血漿から精製したエキソソームを定量した。データは平均±SDとして表す。エキソソーム濃度はOD450×1000として表す。

エキソソームは30〜120 nmのサイズの微小胞であり、正常および腫瘍細胞によって細胞外環境に能動的に分泌される。がん進行におけるエキソソームの役割の理解が増えつつあること、そして悪性腫瘍および腫瘍増殖の新たな治療法、改善された診断方法および追跡の必要性が増えつつあるという事実に鑑みて、ヒト体液中のエキソソームを検出し、測定する方法およびツールが必要とされている。腫瘍微小環境に対する一連の有害な効果を通じて疾患進行を促進することにエキソソームが関与している可能性があるため、感受性が高く、特異的であり、そして実行可能なアッセイによって、ヒト血漿または血清中のエキソソームを定量する可能性は、極めて重要な問題となりつつある。かかるアッセイが利用可能であれば、がん予後におけるこれらの微小胞の潜在的な役割を評価し、そして腫瘍疾患を検出またはモニターするための新たな予後因子またはマーカーとしての、基礎的なツールとなり得る。しかし、現在使用されている方法、例えばＴＥＭおよびＷＢは定量的でないか、わずかにのみ定量的であり、したがってヒト体液中のエキソソームを定量的に検出し、測定する方法が明らかに必要とされている。したがって、本開示の目的は、がん患者の診断および追跡試験のための新たなツールを腫瘍専門医に提供することである。さらにまた、本開示の目的は、ウイルス性疾患またはプリオン病のような、粒子が微小胞に感染する他のヒト疾患を診断するために使用する新たな方法を提供する。

本明細書に開示する新規な定量試験は、エキソソームのＥＬＩＳＡ介在検出に基づいており、エキソソームを定量する初めての簡単な、感受性の高い、信頼できる試験である。この方法によって検出されるタンパク質は、エキソソームに特異的でなく、エンドソームおよびリソソームのような、膜が細胞膜構造に再利用されない細胞質小器官で排他的に共有されている。この特徴は、壊死腫瘍細胞由来のデブリ上のこれらのタンパク質またはそれらの可溶形態を検出する可能性を排除する。

本開示のアッセイは好ましくは、腫瘍分泌エキソソームを優先的に検出することができる普遍的な腫瘍マーカー（カベオリン−１）を含む。下記実施例に記載の異なる比較方法（ウェスタンブロッティングとフローサイトメトリー）および異なる実験条件によって実施した一連の総合的研究は、本開示の新たな試験の信頼性を証明する。

我々がＥｘｏＴｅｓｔと呼ぶ本開示の新たな方法は、ハウスキーピングタンパク質（ＣＤ６３およびＲａｂ−５）および腫瘍関連マーカーのカベオリン−１の発現に基づいて血漿エキソソームを捕捉し、定量するサンドイッチＥＬＩＳＡ試験に基づく。ＥｘｏＴｅｓｔは、精製エキソソーム調製物中に存在するエキソソームを捕捉するために抗Ｒａｂ５抗体を用いる。抗体を検出するため、ＥｘｏＴｅｓｔではエキソソーム抗原（ＣＤ６３）またはエキソソームの細胞源によって発現される他の抗原、例えば腫瘍の転移動態に関連するタンパク質であるカベオリン−１を認識する抗体を使用する。実験の最初のセットでは、我々はヒト腫瘍細胞系の培養培地由来のエキソソーム調製物を用いて、ウェスタンブロットおよびＦＡＣＳによって得られた結果をＥｘｏＴｅｓｔの結果と比較した。結果は、３つの方法全てでエキソソーム調製物中の典型的なエキソソーム抗原が検出可能であったことを示した。しかし、ＦＡＣＳまたはＷＢ分析と比較して、ＥｘｏＴｅｓｔはエキソソームおよびより少量の出発物質を含む同じ調製物中のより広いタンパク質群の定量分析が可能であった。この技術的特徴は、分析が血漿サンプルで実施されるとき、最も重要である。実際、ヒト黒色腫または結腸癌細胞を移植したＳＣＩＤマウスの血漿プールの分析は、ＷＢを用いたとき、しばしば再現性がないか、あるいは少なくともとても難しいが、ＥｘｏＴｅｓｔはヒト腫瘍ＳＣＩＤマウスの血漿中エキソソーム濃度の定量的分析が可能であった。新たな重要な発見は、ＥｘｏＴｅｓｔの結果に基づいて、血漿中エキソソーム濃度が腫瘍サイズと有意に関連づけられること、そして移植後の時間に伴って上昇することである。

さらに、循環エキソソームは、典型的なタンパク質と共に、マウスにおけるヒト腫瘍増殖によって発現される腫瘍マーカーを提示した（示さず）。したがって、検出抗原としてＣＤ６３を用いるＥｘｏＴｅｓｔは、黒色腫を有する患者および健常対象の血漿中のエキソソームを定量できた。腫瘍細胞は大量のエキソソームを分泌するため、黒色腫患者と健常対照人の血漿中のＣＤ６３ポジティブエキソソーム濃度に差がないことに、我々は本当に驚いた。可能性のある腫瘍特異的エキソソームを同定するために、我々は、検出抗原としてカベオリン−１を用いたＥｘｏＴｅｓｔを実施した。最近の刊行物に循環カベオリン−１の血漿濃度が転移性前立腺腺癌と有意に相関していることが報告されている。興味深いことに、カベオリン−１は癌化細胞形質転換、腫瘍形成および転移の病因に関与している。まず、我々はＦＡＣＳおよびＷＢによって、腫瘍移植ＳＣＩＤマウスおよび腫瘍患者の血漿から精製した、腫瘍由来エキソソームにカベオリン−１が存在することを示した。次いで、ＥｘｏＴｅｓｔを用いて、健常個体の血漿と比較して腫瘍患者におけるカベオリン−１ポジティブエキソソームの血漿濃度の顕著な上昇を我々は観察でき、これはカベオリン−１が特異的腫瘍マーカーを示し、ＥｘｏＴｅｓｔがかかる上昇を定量するためのうまくいく試験であることを示唆している。

つまるところ、本結果は、エキソソーム検出ＥｘｏＴｅｓｔはヒトにおける循環エキソソームの検出および定量に実用的であり、有用であることを示す。さらに、該試験は、血漿エキソソーム調製物中の異なるタンパク質を検出する可能性を提供し、特定のタイプの腫瘍患者に適用できる可能性がある。本開示はまた、血漿エキソソームの定量および特徴付けに基づく腫瘍患者の新規な予後／診断ツールを提供する。感受性の高い、信頼できる血清マーカーがなおも限定されており、ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）濃度が疾患コースおよび予後の評価のための唯一の予後血清因子であり続けるため、これは特に、黒色腫患者に関連する。

本発明を以下に詳細に記載する。実施例および実験の詳細は、当業者の理解を改善し、手助けするために提供する。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって決定される。

１．エキソソーム源
Ａ．細胞培養物上清
我々は２つのタイプのヒト腫瘍細胞系、すなわち黒色腫および結腸癌を用いた。Ｍｅｌ ５０１およびＭｅｌ ＢＳは、患者の黒色腫病変から外科手術によって切除して得た２つの転移性黒色腫細胞系である（Istituto Nazionale dei Tumori, Milan, Italy）。我々はまた、２つの結直腸癌細胞系、Ｃｏｌｏ２０６（結直腸癌患者の肝臓転移から作成）および１８６９ ｃｏｌ（Istituto Superiore di SanitaのDr. Maccalliから提供）も用いた。全ての細胞系は、１００ IU/mlのペニシリン、100 μg/mlのストレプトマイシン（Gibco）、2 mMのグルタミンＩ（Gibco）および10％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）（Invitrogen, Milan, Italy）を補ったＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）は培養物中でＣＤ１４電磁ビーズ（Milteny Biotec, Germany）およびＧＭ−ＣＳＦ（500 U/ml）を５日間使用して、健常血液ドナーの軟膜から得た。

Ｂ．ヒト腫瘍ＳＣＩＤマウス血漿
ＣＢ．１７ ＳＣＩＤ／ＳＣＩＤメスマウス（Harlan, S. Pietro al Natisone, Italy）を４〜５週齢で用いて、特定病原体を含まない条件下で維持した。動物に対する全ての手順はＵＫＣＣＲガイドラインに従って実施した。ＳＣＩＤマウスはマイクロアイソレーターケージ中で飼育し、食餌、水および寝具は全て、使用前にオートクレーブ処理した。マウスの右側腹部に2.5×10⁶細胞／マウスのヒト黒色腫または結腸癌細胞を皮下注射した。ノギスで腫瘍増殖を測定し、既報のとおり以下の式に従って腫瘍重量を推定した：腫瘍重量（mg）＝長さ（mm）×幅^２（mm）／２（Luciani L et al., J. Natl. Cancer Inst., 2004）。移植した腫瘍を重量500 mgまで増殖させて、腫瘍増殖の間の異なる時点で屠殺したそれぞれの動物から、腫瘍移植マウス由来の血漿500 μlを採取した。

Ｃ．ヒトドナーおよび腫瘍患者の血漿
ヒト血漿サンプルは、原発性または転移性黒色腫を有する患者ならびに年齢と性別がマッチした健常ドナー由来のＥＤＴＡ処理した全血から採取した。サンプルは分析まで−70℃で保存した。

２．インビトロおよびインビボエキソソーム調製物
T-175フラスコ中で72時間コンフルエントな細胞培養物からヒト黒色腫および結腸癌細胞系由来の調製物を採取し、わずかに修正したが既報のとおりに微小胞を単離した（Andreola et al., J. Exp. Med. 2002）。簡潔には、300×gで10分間遠心分離して細胞をペレットにした後、上清を1,200×gで20分間、次いで10,000×gで30分間遠心分離した。0.22 μmのフィルター（Stericup(商標), Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA）を用いて上清を濾過し、次いでBeckman超遠心分離器（Beckman Coulter）で100,000 gで１時間遠心分離して、エキソソームをペレットにした。大量のリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、エキソソームを少量のＰＢＳまたは適切な溶解バッファー中に再懸濁し、さらなる実験分析まで−80℃で保存した。

血漿サンプルからエキソソームを得るために、ヒト腫瘍を移植したＳＣＩＤマウスまたは腫瘍患者および健常ドナー由来のヘパリン化血液を400×gで20分間遠心分離した。次いで血漿を採取し、アリコートに分け、分析まで−70℃で保存した。血漿サンプルを上記と同じ遠心分離手順に供して、少量の遠心分離のためにBeckman TL100を用いて、エキソソームを単離した。

３．エキソソームのフローサイトメトリー分析
エキソソームでの抗原発現の決定を、ラテックスビーズに結合した精製エキソソームでのフローサイトメトリー分析によって実施した。エキソソーム調製物（5〜10 μg）を5 μlの直径4 μmアルデヒド／硫酸ラテックスビーズ（Interfacial Dynamics, Portland, OR）と共にインキュベートし、2％ＦＣＳを含む400 μlのＰＢＳ中に再懸濁した。エキソソームで被覆したビーズ（20 μl）を4℃で、以下の抗体：抗Ｒａｂ５（Santa Cruz）、抗ＣＤ６３−ＦＩＴＣ（Pharmigen）、抗ＣＤ８１−ＰＥ（Pharmingen）、抗カベロリン−１（clone N-20, Santa Cruz）と共に30分間インキュベートして、次いで必要であれば、ＰＥ−またはＦＩＴＣ−結合二次抗体と共にインキュベートして、FACSCaliburフローサイトメトリー（BD Biosciences）で分析した。

４．エキソソームのウェスタンブロット分析
1％のTriton X-100、0.1％のＳＤＳ、0.1 MのＴｒｉｓ ＨＣｌ（pH 7）およびプロテアーゼ阻害剤（10 μg/mlのアプロチニン、10 μg/mlのロイペプチンおよび2 mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド）（Sigma）を含む溶解バッファー中に精製エキソソームを溶解した。エキソソームタンパク質濃度はBradfordマイクロアッセイ法（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）で測定した。ＳＤＳサンプルバッファーに合計50 μgのタンパク質を再懸濁し、5分間煮沸し、10％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース（Protran BA85, Schleicher and Schuell）に電気ブロットした。ＣＤ６３（1:50に希釈）およびＲａｂ−５ｂ（1:50に希釈）に対する抗体で膜をブロットし、適切なＨＲＰ結合二次抗体（Amersham Pharmacia）と共にインキュベートして、高感度化学発光（ECL, Pierce）で可視化した。

５．エキソソームについてのＥＬＩＳＡ試験の開発（ＥｘｏＴｅｓｔ）
本開示に従う新規なＥＬＩＳＡ試験（ＥｘｏＴｅｓｔ）は、エキソソーム中の特定のタンパク質の存在に基づく。これらのタンパク質はエンドソームおよびリソソームのような細胞質小器官で共有されており（それぞれＲａｂ−５およびＣＤ６３）、それらの膜は細胞膜構造として放出または再利用されず、したがって膜破壊に由来する構造の存在の可能性を除外する。

96ウェルプレート（Nunc, Milan, Italy）を体積100 μl/ウェルのカルボネートバッファーpH 9.6中のポリクローナル抗Ｒａｂ−５ｂ抗体（clone A-20 Santa Cruz）、最終濃度4 μg/mlでコーティングし、4℃で一夜インキュベートした。ＰＢＳで3回洗浄後、100 μl/ウェルのブロッキング溶液（0.5％のＢＳＡを含むＰＢＳ）を加え、室温で1時間静置した。ＰＢＳで3回洗浄した後、50 μgの精製エキソソーム（最終体積100 μl/ウェル）を加え、37℃で一夜インキュベートした。ＰＢＳで3回洗浄後、適切な検出抗体（抗ＣＤ６３ Ｍａｂ(clone H5C6 Pharmingen)または抗カベオリン−１Ｍａｂ(clone 2297, Pharmingen)）をブロッキング溶液中4 μg/mlで希釈し、100 μl/ウェルを37℃で1時間インキュベートした。ＰＢＳで3回洗浄後、ブロッキング溶液中1:50,000に希釈した100μlのＨＲＰ結合抗マウスペルオキシダーゼ二次抗体（Pierce, Milan, Italy）と共にプレートを室温で1時間インキュベートした。ＰＢＳで3回最終洗浄後、反応物をＰＯＤ（Roche Applied Science, Milan, Italy）で展開し、1 NのＨ_２ＳＯ_４でブロックし、450 nmフィルター（Biorad）を用いてＥＬＩＳＡリーダーで光学密度を記録した。

実施例２．ＥｘｏＴｅｓｔは細胞培養調製物中に存在するエキソソームの定量を提供し、ウェスタンブロット分析よりも高いエキソソームタンパク質検出の感受性を有する。
黒色腫および結腸癌細胞系の培養物上清を標準的な方法に従って処理して、上記のとおり精製エキソソームを得た。エキソソームを検出するために設定されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（ＥｘｏＴｅｓｔ、図１Ａ参照）を細胞培養物上清から得たエキソソーム上清に対して、差動的遠心分離によって実施した。ＥｘｏＴｅｓｔは細胞培養物上清中に存在するエキソソームの定量を提供することができ、ＣＤ６３＋ エキソソームが用量依存的に検出可能であった（図１Ｂ）。10 000 g遠心分離後に得たペレットに由来する分画によって代表されるネガティブコントロールにおいて、細胞培養培地のみおよび二次抗体のみから精製したエキソソームは、かろうじて測定可能な吸光度であった（OD＝0.07 +/- 0.01)。試験内および試験間変動は、３つの異なるプレートで実施した同じ調製物の６回再現で計算し、それぞれ30％ および35％であった。

同じ精製エキソソーム調製物のウェスタンブロットおよびＦＡＣＳ分析によって、ＥｘｏＴｅｓｔで得た定量データを確認した。実際、両方のエキソソーム溶解物におけるＷＢによってＲａｂ−５ｂ、Ｌａｍｐ−１および低い程度のＣＤ６３タンパク質が多様なエキソソーム調製物において検出され（図１Ｄ）、Ｒａｂ−５ｂとＣＤ６３は両方ともラテックスビーズに結合したエキソソームについてのＦＡＣＳで検出された（図１Ｄ）。しかし、ＥｘｏＴｅｓｔによるエキソソーム検出および定量は、ＷＢ分析に対してＣＤ６３タンパク質の検出についてのより高い感受性を示した（図１Ｃ）。実際に、ＷＢによってＣＤ６３またはＲａｂ−５ｂを適切に検出するためには少なくとも12.5 μgのエキソソームタンパク質が必要であったが、ＥｘｏＴｅｓｔは最少量の3 μgの精製エキソソーム調製物から開始して明確にエキソソームを検出できた。

実施例３．ＦＡＣＳ、ＷＢおよびＥｘｏＴｅｓｔによるヒト腫瘍を移植したＳＣＩＤマウスのインビボエキソソーム調製物の定性および定量結果の比較
ＥｘｏＴｅｓｔを用いてインビボでヒト腫瘍由来エキソソームを検出できるかを検証するため、我々はまず、ヒト黒色腫（Ｍｅ５０１）および結腸癌細胞系をＳＣＩＤマウスに皮下注射する実験を実施した。最初の実験では、移植腫瘍（100〜500 mg）を担持するＳＣＩＤマウスから屠殺時に得た血漿サンプルを、エキソソーム精製手順に供した。細胞培養物上清から精製したエキソソームとして、マウス血漿から精製したエキソソームもＥｘｏＴｅｓｔ（図２Ａ）およびＦＡＣＳ（図２Ｂ）によって明確かつ特異的に検出可能であった。対照ＳＣＩＤマウス（ヒト腫瘍を移植されていない）の血漿から得たエキソソーム調製物はブランクサンプルと同等のバックグラウンド光学密度をもたらし（OD＝0.08±0.03）、したがって易感染性動物にエキソソームが存在しないことまたはマウスエキソソームがヒトＣＤ６３およびＲａｂ−５ｂと交叉反応しないことを示唆している。繰り返すが、ＷＢ分析を用いた結果と同等の結果を得るために必要なエキソソーム調製物の量は、ＥｘｏＴｅｓｔでは顕著に少なかった。

ＥｘｏＴｅｓｔによってヒトエキソソームが回収でき、検出できることを示した後、我々はヒト腫瘍ＳＣＩＤマウスにおける血漿エキソソームの量と腫瘍負荷が相関しているかを評価する目的で、時間経過実験を実施した。これらの実験では、黒色腫腫瘍を移植後5週間まで増殖させて、エキソソームを精製し、移植後14日目から開始してその3週間後までの間、個々の動物の血漿から定量した。結果はＥｘｏＴｅｓｔによって検出されたヒトエキソソームの量が時間と共に、腫瘍サイズの増加と平行して増加したことを示しており（図２Ｃ）；これは血漿エキソソームの定量が腫瘍増殖をモニターするための有用な方法であることを示唆している。同様の結果がＭｅＢＳ細胞でも得られた（示さず）。

実施例４．腫瘍エキソソームはカベオリン−１を発現する
エキソソームは細胞間コミュニケーションの重要かつ特異的な経路を代表することが知られているので、我々は、生理的条件下で腫瘍由来エキソソームが循環エキソソームと異なり得ると考えた。最近では、前立腺癌ＰＣ−３細胞系から単離されたプロスタソーム（前立腺癌細胞によって分泌される膜ベシクル）が、カベオラの主成分であるカベオリン−１タンパク質を含むことが報告されている。また、健常対象と比較して前立腺癌患者において、カベオリン−１の血清濃度が高いことも知られている（Tahir, 2003 #21）。しかし、このタンパク質と血中の膜ベシクルの関連を示唆する先行技術は存在しない。したがって、我々は黒色腫腫瘍を移植したＳＣＩＤマウスの血漿から得たエキソソームでのカベオリン−１の存在を評価した。図３Ａの結果が示すとおり、Ｃａｖ１はインビトロでヒト黒色腫によって分泌されたエキソソームにおいて強く発現されているが、例えば原発性単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）のような正常ヒト細胞由来の細胞抽出物およびエキソソームの両方では検出されない。これらの結果は、エキソソーム包埋形態で分泌されるＣａ１が黒色腫細胞の特異的な特徴であり得て、したがって腫瘍由来エキソソームのエクスビボ分析のための潜在的なマーカーであり得ることを示唆している。したがって、我々は黒色腫腫瘍を移植したＳＣＩＤマウスの血漿から得たエキソソームでのＣａｖ１の存在を試験した。Ｃａｖ１はウェスタンブロット（図３Ｂ）、フローサイトメトリー（図３Ｃ）およびＥｘｏＴｅｓｔ（図３Ｄ）によって黒色腫腫瘍を移植したＳＣＩＤマウスの血漿に由来するエキソソーム調製物中で検出されたが、対照動物の血漿由来エキソソームではＣａｖ１は検出されなかった（図３Ｂ、３Ｄ）。黒色腫おおび結腸癌（ＣＲＣ）患者からの結果と一致して、黒色腫についてのMelanA/Mart-1およびＣＲＣについてのＣＥＡのような他の腫瘍マーカーが、Ｃａｖ１で得られた結果と同等の結果で、腫瘍を有するＳＣＩＤマウスの腫瘍エキソソームのインビボ放出をＥｘｏＴｅｓｔによる検出に使用できた。しかし、黒色腫は異種または少量のMelanA/MART-1を、とりわけ転移レベルで発現し得て、ＣＥＡはほとんどがＣＲＣ患者の血清中に溶解形態で存在するため、Ｃａｖ１がより信頼でき、再現性のある腫瘍マーカーである。したがって、ＥｘｏＴｅｓｔを抗Ｃａｖ１特異的抗体の封入体でさらに開発する。

実施例５．ＥｘｏＴｅｓｔによる腫瘍患者の血漿のインビボエキソソーム調製物の定量：予後のためのツールとしての血漿中エキソソーム量
ヒト腫瘍ＳＣＩＤマウスで得られたデータによって、我々はＥｘｏＴｅｓｔがヒト血漿から精製したエキソソームの検出および特徴付けが同様に可能かを調査することを促された。定量が可能であれば、我々は腫瘍患者が健常ドナーの血漿中に存在するのとは異なる量および／または質で循環血漿エキソソームを有し得るかを検証することを目的とした。エキソソームを腫瘍患者（n＝62）および健常ドナー（n＝37）の血漿から精製して、Ｒａｂ５およびＣＤ６３の存在についてＥｘｏＴｅｓｔおよびウェスタンブロット分析に供した。ＥｘｏＴｅｓｔによるＣＤ６３およびＣａｖ１に基づくエキソソームの定量は、表１に示す。

表１．試験集団における血漿エキソソームおよびＬＤＨレベル。CD63+およびCav1+ exoは、血漿エキソソームであり、OD450×1000として表す。血漿ＬＤＨ値はIU/Lとして表す。データは平均として示す（95％ C.I.）

ＥｘｏＴｅｓｔは黒色腫患者と健常ドナー両方由来の血漿精製エキソソーム中のエキソソームタンパク質を、健常ドナーと比較して４倍の黒色腫患者の血漿中エキソソーム濃度として、検出できた（図４Ａ）（p＜0.001）。２種のエキソソームタンパク質マーカーの検出に基づくＥｘｏＴｅｓｔの感受性および特異性を決定するために、我々はＣＤ６３およびＣａｖ１発現血漿エキソソームの両方についてカットオフ（健常ドナーのサンプル中の平均 +/- 2SD）を計算し、それぞれ526および411（OD450×1000)であった。ＣＤ６３＋ エキソソームを検出するＥｘｏＴｅｓｔは低い感受性（36％）および良好な特異性（97.3％）を示したが、Ｃａｖ＋ エキソソームについてのＥｘｏＴｅｓｔはより高い感受性（63％）および同様の特異性（97.3％）を有した。この観察と一致して、Ｃａｖ１＋ エキソソームの血漿レベルは黒色腫患者におけるＣＤ６３＋ エキソソームの濃度よりも有意に高かった（P＝0.04）。これらの結果は以下のことを示唆している：
i) 黒色腫患者において循環Ｃａｖ１はエキソソームと関連し得る、および
ii) Ｃａ１を有する血漿エキソソームの定量は、有用な腫瘍マーカーと考え得る。

さらに、我々は血漿ＬＤＨはＣＤ６３＋またはＣａｖ１＋ 血漿エキソソームと関連していないが、ＣＤ６３＋とＣａ１＋ 血漿エキソソーム間で有意な相関が観察される（スピアマンの係数 0.25、P＝0.04）ことを見出した（図４Ｃ）。さらに、ＥｘｏＴｅｓｔはがんまたは黒色腫患者の血漿中のＭＡＲＴ−１またはＣＥＡのような腫瘍抗原の存在を示した（図６）。

分析に含まれるほとんどの患者（57/62）は、進行した疾患に罹患していた（ステージIII〜IV）。全ての疾患段階において血漿エキソソーム濃度の広い分布がＥｘｏＴｅｓｔによって検出され、これは異なる患者の末梢循環中に存在するエキソソームの量のばらつきが多様なレベルの腫瘍悪性度を反映し得て、したがって黒色腫の新たな独立した予後因子となり得ることを示唆している。American Joint Committee on Cancer（ＡＪＣＣ）によって示された他の予後因子、例えば原発性黒色腫の厚みおよび潰瘍形成、転移性リンパ節の数、ならびに離れた転移の位置および数も、本開示の結果によって示唆されるように、エキソソーム血清含有量と相関し得る。

実施例６．エキソソーム定量のために全血漿を用いることができる
臨床目的でのＥｘｏＴｅｓｔの潜在的な適用によって、我々は、ＥｘｏＴｅｓｔが未分画生物学的液体におけるエキソソーム検出に用いることができるかを検証することを促された。超遠心分離の工程を避けることで容易な、再現性のよい分析が可能となる。したがって、我々は未分画サンプル（ヒトマクロファージおよび黒色腫細胞由来の細胞培養物上清、ならびにヒト血漿）と同じサンプルから精製したエキソソームからの、ＣＤ６３＋ エキソソームの検出および定量を比較した。試験の感受性を増強するために、これらの特定の実験について、ＨＲＰ結合Ｍａｂを15分でなく30分間インキュベートした。図５Ａに示すとおり、未分画マクロファージおよび黒色腫培養物上清と９人の黒色腫患者由来の血漿から、エキソソームの存在がＥｘｏＴｅｓｔによって検出された。さらに、我々は４人の健常ドナー由来の血漿の同じ分析を実施した。分析したサンプルの総数（９人の患者と４人の健常ドナー）での回帰分析は２つのタイプの測定間で有意な相関を示した（図５Ｂ）。これらの結果は、全血漿を用いて、エキソソーム精製の複雑な、時間のかかる手順を回避した臨床設定においてＥｘｏＴｅｓｔの潜在的な適用が示唆される。

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Claims (14)

1. ヒト細胞由来サンプルまたは体液中のエキソソームを定量し、定性する方法であって、
   以下の段階：
   ａ）ヒト細胞由来サンプルまたは体液のエキソソームを一次抗体抗Ｒａｂ−５で捕捉する段階；
   ｂ）結合したエキソソームを、エキソソーム抗原またはエキソソームの細胞源によって発現される抗原を認識する検出抗体で検出する段階；
   ｃ）酵素結合二次抗体を前記検出抗体と反応させる段階；
   ｄ）基質を加える段階；そして
   ｅ）反応を検出する段階
   を含む方法。
2. 検出抗体が抗ＣＤ６３または抗カベオリン−１である、請求項１の方法。
3. ヒト細胞由来サンプルまたは体液からエキソソーム調製物を精製する段階を含み、段階ａ）が精製したエキソソームで実施される、請求項１または２の方法。
4. 体液がヒト血漿サンプル、腹水、脳液、骨髄、尿、糞便または気管支肺胞洗浄液である、請求項１または２の方法。
5. 使用する体液の体積が２ｍｌ未満である、請求項４の方法。
6. 体液または細胞サンプルが血漿サンプルであって、健常人および腫瘍を有する疑いのある患者から採取され、患者サンプル中のエキソソームの検出量を健常人サンプル中のエキソソームの検出量と比較して、増加した量を腫瘍の指標として用いる、請求項２の方法。
7. 腫瘍増殖を非侵襲的にモニターする方法であって、以下の段階：
   ａ）定期的に患者の血漿サンプルを分析する段階；
   ｂ）血漿サンプルのエキソソームを一次抗体抗Ｒａｂ−５で捕捉する段階；
   ｃ）結合したエキソソームを検出抗体抗ＣＤ６３または抗カベオリン−１で検出する段階；
   ｄ）酵素結合二次抗体を前記検出抗体と反応させる段階；
   ｅ）基質を加える段階；
   ｆ）反応を検出する段階；そして
   ｇ）検出したエキソソームの量と腫瘍サイズとの相関を導く段階
   を含む方法。
8. 血漿サンプルからエキソソーム調製物を精製する段階を含み、段階ｃ）が精製したエキソソーム調製物で実施される、請求項７の方法。
9. 腫瘍が黒色腫である、請求項７の方法。
10. ヒト細胞由来サンプルまたは体液が血漿サンプルである、請求項１の方法を用いてカベオリン−１を有するエキソソームを検出する、腫瘍を診断するための組成物であって、抗カベオリン−１である検出抗体を含む、組成物。
11. 腫瘍が黒色腫である、請求項１０の組成物。
12. ヒト細胞由来サンプルまたは体液中のエキソソームを定量し、定性するための試験キットであって、以下のもの：
    ａ）細胞由来サンプルまたは体液のエキソソームを捕捉するための一次抗体抗Ｒａｂ−５調製物；
    ｂ）結合したエキソソームを検出するための検出抗体調製物；
    ｃ）検出抗体と反応するための酵素結合二次抗体調製物；および
    ｄ）酵素の基質
    を含むキット。
13. 検出抗体が抗ＣＤ６３または抗カベオリン−１である、請求項１２の試験キット。
14. ヒト細胞由来サンプルまたは体液からエキソソーム調製物を精製するための指示書を含み、ａ）のエキソソームが精製したエキソソーム調製物である、請求項１２または１３の試験キット。

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