JP5561636B2 - Improved method for producing hyaluronic acid - Google Patents
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Description
本発明は、植物によりヒアルロン酸を製造する方法、及びヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞又は形質転換植物体に関する。 The present invention relates to a method for producing hyaluronic acid by a plant, and a transformed plant cell or transformed plant having hyaluronic acid-producing ability.
ヒアルロン酸は、１９３４年にＭｅｙｅｒとＰａｌｍｅｒが、牛の眼球の硝子体から単離したグリコサミノグリカン（ムコ多糖）である（非特許文献１参照）。高分子のヒアルロン酸は、変形関節症の治療や眼科用手術補助剤、癒着防止や創傷治癒促進効果等に使用されている。また、低分子のヒアルロン酸は生理活性効果があることが報告されている。また、ヒアルロン酸は、保水力に優れていることから化粧品用途にも使用されている。さらに、ヒアルロン酸は、バイオマテリアル素材や、新たな医療用途への応用も期待されている。 Hyaluronic acid is a glycosaminoglycan (mucopolysaccharide) that Meyer and Palmer isolated in 1934 from the vitreous of a bovine eyeball (see Non-Patent Document 1). High molecular weight hyaluronic acid is used for the treatment of osteoarthritis, an ophthalmic surgical adjuvant, adhesion prevention, wound healing promotion effect and the like. In addition, low molecular weight hyaluronic acid has been reported to have a bioactive effect. Hyaluronic acid is also used for cosmetics because of its excellent water retention. Furthermore, hyaluronic acid is expected to be applied to biomaterials and new medical uses.
これまで、ヒアルロン酸の製造方法としては、動物組織からの抽出（特許文献１参照）または微生物発酵（特許文献２〜５参照）による製造方法が開発されてきた。しかしながら、動物組織からの抽出では、ウイルス等の混入の危険性が懸念されている。一方、微生物発酵では設備投資が必要であり、また、治療用物質を微生物で生産する場合、エンドトキシンの混入等を防ぐために精製コストが高くなる。 So far, as a method for producing hyaluronic acid, a production method by extraction from animal tissue (see Patent Document 1) or microbial fermentation (see Patent Documents 2 to 5) has been developed. However, there is concern about the risk of contamination with viruses and the like in extraction from animal tissues. On the other hand, microbial fermentation requires capital investment, and when a therapeutic substance is produced with microorganisms, the purification cost is increased to prevent endotoxin contamination.
一方、植物は、光合成を利用して水と二酸化炭素から糖を合成する、エネルギー負荷の低い理想的な糖質生産系である。特許文献６及び７に記載の発明では、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子を植物体または植物細胞に導入（形質転換）することによって、ヒアルロン酸の生産が可能なことが示されている。さらに、特許文献８及び９に記載の発明では、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子に加えて、ヒアルロン酸の合成原料の糖ヌクレオチドを合成する酵素の遺伝子であるグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ遺伝子及び／又はＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、植物体または植物細胞におけるヒアルロン酸の生産性が向上することが示されている。 Plants, on the other hand, are ideal carbohydrate production systems with low energy load that synthesize sugar from water and carbon dioxide using photosynthesis. The inventions described in Patent Documents 6 and 7 show that hyaluronic acid can be produced by introducing (transforming) a hyaluronic acid synthase gene into a plant or plant cell. Furthermore, in the inventions described in Patent Documents 8 and 9, in addition to the hyaluronic acid synthase gene, a glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase gene, which is an enzyme gene that synthesizes a sugar nucleotide as a raw material for synthesizing hyaluronic acid, It has been shown that introduction of a UDP-glucose dehydrogenase gene improves hyaluronic acid productivity in plants or plant cells.
本発明は、植物においてヒアルロン酸を製造する公知の方法を改良することによって、従来より更に効率良くヒアルロン酸を製造する方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for producing hyaluronic acid more efficiently than before by improving a known method for producing hyaluronic acid in a plant.
本発明者は、上記課題を解決するために形質転換に用いる発現用組換えベクター中の転写終結領域の転写効率を向上させることについて鋭意検討した結果、従来の特許文献８又は９等において転写終結領域として用いられているＮＯＳ（ノパリン合成酵素遺伝子）由来の転写終結領域を、シロイヌナズナの熱ショックタンパク質由来の転写終結領域に代えることにより、導入遺伝子の発現効率が増大し、ヒアルロン酸が効率良く生産されることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies on improving the transcription efficiency of the transcription termination region in the recombinant vector for expression used for transformation in order to solve the above-described problems, the present inventors have found that transcription termination is performed in conventional Patent Documents 8 and 9, etc. By replacing the transcription termination region derived from NOS (nopaline synthase gene) used as a region with the transcription termination region derived from Arabidopsis heat shock protein, the transgene expression efficiency is increased and hyaluronic acid is efficiently produced. As a result, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下に記載されるものを要旨とする。
１．（１）以下の（ｉ）並びに（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを構築し、このベクターを用いて、植物細胞又は植物体を形質転換して形質転換体を得る工程：
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；及び
（２）得られた形質転換体を培養し、該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程
を含むヒアルロン酸の製造方法において、転写終結領域の塩基配列が、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列であることを特徴とするヒアルロン酸の製造方法：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、ただし、前記ストリンジェントな条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０．２Ｍ ＮａＨ ２ ＰＯ ４ ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄する条件である。
２．以下の（ｉ）並びに（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて形質転換された、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織：
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
ただし、転写終結領域の塩基配列は、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列である：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、ただし、前記ストリンジェントな条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０．２Ｍ ＮａＨ ２ ＰＯ ４ ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄する条件である。
３．２．に記載の形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織から得られる植物抽出物。
４．１．に記載の方法によって得られる、分子量１００万以上のヒアルロン酸。
That is, the gist of the present invention is as described below.
1. (1) A recombinant expression vector comprising the following DNA (i) and (ii) or / and (iii) is constructed, and a plant cell or a plant body is transformed using this vector to transform the transformant. To obtain:
(I) DNA encoding a protein having hyaluronic acid synthase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region;
(Ii) DNA encoding a protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region;
(Iii) DNA encoding a protein having UDP-glucose dehydrogenase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region; and (2) culturing the obtained transformant, In the method for producing hyaluronic acid, comprising the step of separating the hyaluronic acid produced by the converter, the base sequence of the transcription termination region is the following base sequence (a) or (b): Manufacturing method:
(A) the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(B) a nucleotide sequence that hybridizes with a nucleotide sequence complementary to SEQ ID NO: 1 under stringent conditions , provided that the stringent conditions are 6 × SSC (0.9 M NaCl, 0.09 M citric acid Tris) or 6 × SSPE (3M NaCl, 0.2M NaH 2 PO 4 , 20 mM EDTA · 2Na, pH 7.4) at 42 ° C. and further equivalent to 0.1 × SSC and 0.1% SDS This is a condition of washing at 60 ° C. at a salt concentration .
2. A transformed plant cell or a transformed plant having the ability to produce hyaluronic acid, transformed with the following recombinant vector for expression containing the DNA of (i) and (ii) or / and (iii), or the same Progeny offspring or their organs or their tissues:
(I) DNA encoding a protein having hyaluronic acid synthase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region;
(Ii) DNA encoding a protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region;
(Iii) DNA encoding a protein having UDP-glucose dehydrogenase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region;
However, the base sequence of the transcription termination region is the following base sequence (a) or (b):
(A) the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(B) a nucleotide sequence that hybridizes with a nucleotide sequence complementary to SEQ ID NO: 1 under stringent conditions , provided that the stringent conditions are 6 × SSC (0.9 M NaCl, 0.09 M citric acid Tris) or 6 × SSPE (3M NaCl, 0.2M NaH 2 PO 4 , 20 mM EDTA · 2Na, pH 7.4) at 42 ° C. and further equivalent to 0.1 × SSC and 0.1% SDS This is a condition of washing at 60 ° C. at a salt concentration .
3.2. Or a plant extract obtained from the transformed plant cell or the transformed plant body described in 1) above, or the progeny having the same properties or their organs or tissues thereof.
4.1. Hyaluronic acid having a molecular weight of 1 million or more, obtained by the method described in 1.
本発明のヒアルロン酸の製造方法は、形質転換に用いる発現用組換えベクター中の転写終結領域として、従来一般的に用いられているＮＯＳ由来の転写終結領域の代わりに、シロイヌナズナの熱ショックタンパク質由来の転写終結領域を用いているので、植物中に導入された（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、並びに（ｉｉ）グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は／及び（ｉｉｉ）ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が植物内で効率良く発現され、植物内で高分子のヒアルロン酸が従来よりも多量に生産される。さらに、本発明によれば、ヒアルロン酸を効率良く生産可能な植物体または植物培養細胞を提供することができる。従って、本発明によれば、植物で生産された安全性の高い高分子のヒアルロン酸を低コストで提供することができる。 The method for producing hyaluronic acid of the present invention is derived from a heat shock protein of Arabidopsis thaliana instead of a transcription termination region derived from NOS that has been generally used as a transcription termination region in a recombinant expression vector used for transformation. (I) a gene encoding a protein having hyaluronic acid synthase activity introduced into a plant, and (ii) a protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity. And / or (iii) a gene encoding a protein having UDP-glucose dehydrogenase activity is efficiently expressed in a plant, and a higher amount of high-molecular hyaluronic acid is produced in the plant than in the past. Furthermore, according to this invention, the plant body or plant cultured cell which can produce hyaluronic acid efficiently can be provided. Therefore, according to the present invention, highly safe high molecular weight hyaluronic acid produced in plants can be provided at low cost.
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の方法の特徴は、転写終結領域としてシロイヌナズナの熱ショックタンパク質由来の転写終結領域を用いることにより、植物細胞又は植物体中で高分子のヒアルロン酸を効率良く製造することにある。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The method of the present invention is characterized in that a high molecular weight hyaluronic acid is efficiently produced in plant cells or plants by using a transcription termination region derived from Arabidopsis heat shock protein as the transcription termination region.
本発明のヒアルロン酸の製造方法では、まず、以下の（ｉ）並びに（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを構築し、このベクターを用いて、植物細胞又は植物体を形質転換して形質転換体を得る（工程（１））：
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
In the method for producing hyaluronic acid of the present invention, first, a recombinant vector for expression containing the following DNA (i) and (ii) or / and (iii) is constructed, and using this vector, a plant cell or plant The body is transformed to obtain a transformant (step (1)):
(I) DNA encoding a protein having hyaluronic acid synthase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region;
(Ii) DNA encoding a protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region;
(Iii) DNA encoding a protein having UDP-glucose dehydrogenase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region.
まず、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質について説明する。
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質は、ＵＤＰ−グルクロン酸とＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを基質としてグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンの繰り返し構造からなる直鎖状ポリマーのヒアルロン酸を合成するタンパク質である。
First, a protein having hyaluronic acid synthase activity will be described.
A protein having hyaluronic acid synthase activity is a protein that synthesizes a linear polymer hyaluronic acid having a repeating structure of glucuronic acid and N-acetylglucosamine using UDP-glucuronic acid and UDP-N-acetylglucosamine as substrates.
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質は、上記の性質を有していれば特に限定はされず、動物や、微生物やウイルス由来のヒアルロン酸合成酵素（以下、ＨＡＳと略すことがある）等であることができる。詳しくは、ヒト、マウス、ウサギ、ニワトリ、ウシ、アフリカツメガエル等の脊椎動物由来のヒアルロン酸合成酵素や、ストレプトコッカス属、パスチュレラ属等の微生物由来のヒアルロン酸合成酵素や、クロレラウイルス等のウイルス由来のヒアルロン酸合成酵素等であることができる。 The protein having hyaluronic acid synthase activity is not particularly limited as long as it has the above-mentioned properties, and is an animal, a hyaluronic acid synthase derived from a microorganism or a virus (hereinafter sometimes abbreviated as HAS), or the like. be able to. Specifically, hyaluronic acid synthase derived from vertebrates such as humans, mice, rabbits, chickens, cows, and Xenopus, hyaluronic acid synthase derived from microorganisms such as Streptococcus and Pasteurella, and viruses such as Chlorella virus It can be hyaluronic acid synthase or the like.
より具体的には、クロレラウイルス ＰＢＣＶ−１系統由来のＨＡＳ（Ａ９８Ｒ）、ヒト由来のヒアルロン酸合成酵素（ｈＨＡＳ）のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、マウス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｍＨＡＳ）のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、ニワトリ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｇＨＡＳ）のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、ラット由来のヒアルロン酸合成酵素（ｒＨＡＳ）のＨＡＳ２、ウシ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｂＨＡＳ）のＨＡＳ２、アフリカツメガエル由来のヒアルロン酸合成酵素（ｘＨＡＳ）のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、パスチュレラ ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｐｍＨＡＳ）、ストレプトコッカス ピオゲネス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｓｐＨＡＳ）、ストレプトコッカス エクイリシミリス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｓｅＨＡＳ）等が挙げられる。ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ）遺伝子には、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３等の各種タイプを有するものがあるが、タイプの種類は特に限定されない。 More specifically, HAS (A98R) derived from Chlorella virus PBCV-1 strain, HAS1, HAS2 and HAS3 derived from human-derived hyaluronic acid synthase (hHAS), HAS1, HAS2 derived from mouse-derived hyaluronic acid synthase (mHAS) And HAS3, chicken-derived hyaluronic acid synthase (gHAS) HAS1, HAS2 and HAS3, rat-derived hyaluronic acid synthase (rHAS) HAS2, bovine-derived hyaluronic acid synthase (bHAS) HAS2, Xenopus-derived HAS1, HAS2 and HAS3 of hyaluronic acid synthase (xHAS), hyaluronic acid synthase derived from Pasteurella multocida (pmHAS), hyaluronic acid synthase derived from Streptococcus pyogenes (spHAS), Streptococcus Kas Ekuirishimirisu derived hyaluronic acid synthase (seHAS), and the like. Some hyaluronic acid synthase (HAS) genes have various types such as HAS1, HAS2, and HAS3, but the type is not particularly limited.
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質は、上記記載のＨＡＳであれば使用できるが、より好ましくはクロレラウイルス由来のＨＡＳが良く、特に好ましくは、配列番号３または５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質によって示されるクロレラウイルス由来のＨＡＳが良い。 A protein having hyaluronic acid synthase activity can be used as long as it is the above-mentioned HAS, but a HAS derived from chlorella virus is more preferable, and a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5 is particularly preferable. HAS derived from the chlorella virus shown is good.
また、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質は、配列番号３または５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、ヒアルロン酸合成活性を失わない程度の変異がなされたタンパク質であっても良い。例えば、配列番号３または５で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号３または５で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号３または５で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいが、特にこれに限定されるものではない。このような変異は、自然界において生じるほかに、人為的な変異も含む。一例として、パスチュレラ ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素は、膜結合領域および膜貫通領域と推定される約２７０アミノ酸を欠失してもヒアルロン酸合成酵素活性を持つことが報告されている（Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０，８８３−８８９）。変異したアミノ酸の数は、ヒアルロン酸合成活性を失わない限り、その個数は制限されない。 In addition, the protein having hyaluronic acid synthase activity comprises hyaluronic acid synthesizing activity consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 5. It may be a protein that has been mutated to such an extent that it is not lost. For example, at least 1, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5 may be deleted, or SEQ ID NO: 3 or 5 At least 1, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5 amino acids may be added to the amino acid sequence represented, or at least one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 3 or 5, Preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids may be substituted with other amino acids, but there is no particular limitation thereto. Such mutations occur in nature as well as artificial mutations. As an example, it has been reported that a hyaluronic acid synthase derived from Pasteurella multocida has hyaluronic acid synthase activity even when approximately 270 amino acids deduced to be membrane-bound and transmembrane regions are deleted (Jing et al , 2000, Glycobiology, 10, 883-889). The number of mutated amino acids is not limited as long as hyaluronic acid synthesis activity is not lost.
ヒアルロン酸合成活性の測定は、次のように実施すればよい。試料と、１ｍＭジチオスレイトール、２０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラ酢酸、１５％グリセロール、０．５ｍＭウリジン−５’−ジホスホグルクロン酸（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＡと略する）、０．５ｍＭウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと略する）、０．１μＭ ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＡ、０．２４μＭ ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、グルクロン酸１２５μｇを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを３７℃で１時間インキュベーションすることにより反応させる。反応後、反応液を１０分間煮沸させることにより反応を停止させる。反応液を二分して、片方に０．５単位のストレプトコッカス ジスガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）由来ヒアルロニダーゼ（生化学工業製）を添加し、３０℃で４時間さらにインキュベーションする。反応後、１０分間煮沸させることによりヒアルロニダーゼを失活させる。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ１０／３０（アマシャムファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー（溶出液：０．２Ｍ酢酸アンモニウム）で、０．５ｍｌずつ分画し、各画分の放射活性を測定する。その結果、試料を用いた反応液から、ヒアルロニダーゼで低分子化される産物の量によりヒアルロン酸合成活性を測定すればよい。また、ヒアルロン酸結合タンパク質を利用した市販のヒアルロン酸測定用プレート（例えば、ＥＣＨＥＬＯＮ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社 Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ＥＬＩＳＡ）により、反応液中のヒアルロン酸濃度を測定することにより、ヒアルロン酸合成酵素活性の測定が可能である。 The measurement of hyaluronic acid synthesis activity may be performed as follows. Sample, 1 mM dithiothreitol, 20 mM magnesium chloride, 1 mM ethylene glycol bis (β-aminoethyl ether) -N, N, N, N-tetraacetic acid, 15% glycerol, 0.5 mM uridine-5′-diphosphoglucuron Acid (hereinafter abbreviated as UDP-GlcA), 0.5 mM uridine-5′-diphospho-N-acetylglucosamine (hereinafter abbreviated as UDP-GlcNAc), 0.1 μM UDP- [14C] GlcA, 0.24 μM The reaction is carried out by incubating 0.2 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing UDP- [3H] GlcNAc and 125 μg of glucuronic acid at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, the reaction is stopped by boiling the reaction solution for 10 minutes. The reaction solution is divided into two, and 0.5 unit of Streptococcus dysgalactiae-derived hyaluronidase (manufactured by Seikagaku Corporation) is added to one side and further incubated at 30 ° C. for 4 hours. After the reaction, the hyaluronidase is inactivated by boiling for 10 minutes. The reaction solution is fractionated by 0.5 ml each using Superdex Peptide HR 10/30 (Amersham Pharmacia) column chromatography (eluent: 0.2 M ammonium acetate), and the radioactivity of each fraction is measured. As a result, the hyaluronic acid synthesizing activity may be measured from the reaction solution using the sample by the amount of the product that is reduced in molecular weight by hyaluronidase. In addition, the hyaluronic acid synthase activity can be measured by measuring the hyaluronic acid concentration in the reaction solution with a commercially available hyaluronic acid measurement plate using a hyaluronic acid binding protein (for example, Hyaluronan ELISA from ECHELON BIOSCCIENCES). is there.
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、このタンパク質を生産する生物から、常法に従って容易に単離することができる。 DNA encoding a protein having hyaluronic acid synthase activity can be easily isolated from an organism producing this protein according to a conventional method.
次に、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質について説明する。
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質は、Ｌ−グルタミンとフルクトース−６−リン酸を基質として、グルコサミン−６−リン酸を合成するタンパク質である。
Next, a protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity will be described.
A protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity is a protein that synthesizes glucosamine-6-phosphate using L-glutamine and fructose-6-phosphate as substrates.
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質（以下、ＧＦＡＴと略すことがある）は上記の性質を有していれば特に限定はされず、真核生物由来、原核生物由来、ウイルス由来等のＧＦＡＴが挙げられる。真核生物由来としてはヒト、マウス、トウモロコシ、シロイヌナズナ、線虫、酵母等に由来するＧＦＡＴ、原核生物由来としては枯草菌、大腸菌に等由来するＧＦＡＴ、ウイルス由来としてはクロレラウイルスのＧＦＡＴを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。 The protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity (hereinafter sometimes abbreviated as GFAT) is not particularly limited as long as it has the above-mentioned properties, eukaryotic origin, prokaryotic origin, virus GFAT of origin etc. is mentioned. Examples of eukaryotic origin include GFAT derived from humans, mice, corn, Arabidopsis thaliana, nematodes, yeast, etc., prokaryotes derived from Bacillus subtilis, GFAT derived from Escherichia coli, etc., and viruses derived from chlorella virus GFAT However, it is not limited to these.
ＧＦＡＴは、上記記載のＧＦＡＴであれば使用できるが、より好ましくはクロレラウイルス由来のＧＦＡＴが良く、特に好ましくは、配列番号７または９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質によって示されるクロレラウイルス由来のＧＦＡＴが良い。 GFAT can be used as long as it is the GFAT described above, but GFAT derived from chlorella virus is more preferable, and GFAT derived from chlorella virus represented by a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9 is particularly preferable. Is good.
また、ＧＦＡＴは、配列番号７または９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を失わない程度の変異がなされたタンパク質であっても良い。例えば、配列番号７または９で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号７または９で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号７または９で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいが、特にこれに限定されるものではない。このような変異は、自然界において生じた変異のほかに、人為的な変異も含む。変異したアミノ酸の数は、ＧＦＡＴ活性を失わない限り、その個数は特に制限されない。天然の変異例として、配列番号７のクロレラウイルス弘前系統のＧＦＡＴと、公知のクロレラウイルスＰＢＣＶ−１系統、Ｋ２系統のＧＦＡＴとは、少なくともアミノ酸レベルで２％が変異している例がある。 Further, GFAT is a glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9. It may be a protein that has been mutated to such an extent that it is not lost. For example, at least 1, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9 may be deleted. At least 1, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5 amino acids may be added to the amino acid sequence represented, or at least one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 7 or 9, Preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids may be substituted with other amino acids, but there is no particular limitation thereto. Such mutations include artificial mutations in addition to mutations that occur in nature. The number of mutated amino acids is not particularly limited as long as GFAT activity is not lost. As a natural mutation example, there is an example in which at least 2% of GFAT of the chlorella virus Hirosaki strain of SEQ ID NO: 7 and the known chlorella virus PBCV-1 strain and GFAT of K2 strain are mutated at the amino acid level.
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼの活性は、フルクトース−６−リン酸（１５ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（１５ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）、ＫＨ２ＰＯ４（６０ｍＭ）を含む溶液（ｐＨ７．０）に酵素液を添加して、３７℃で数時間反応させ、生成物であるグルコサミン−６−リン酸またはグルタミン酸の量を測定することにより評価できる。具体的には、グルコサミン−６−リン酸を測定する方法としては、Ｍｏｒｇａｎ＆Ｅｌｓｏｎ法の改良法であるＲｅｉｓｓｉｇ法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９５５，２１７，９５９−９６６）、グルタミン酸を測定する方法としては、グルタミン酸脱水素酵素を利用した酵素法（Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４，５９，２０１−２０８）等が例示される。 The activity of glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase includes fructose-6-phosphate (15 mM), L-glutamine (15 mM), EDTA (1 mM), DTT (1 mM), KH 2 PO 4 (60 mM). It can be evaluated by adding an enzyme solution to a solution (pH 7.0), reacting at 37 ° C. for several hours, and measuring the amount of product glucosamine-6-phosphate or glutamic acid. Specifically, as a method for measuring glucosamine-6-phosphate, the Reissig method (J. Biol. Chem, 1955, 217, 959-966), which is an improved method of the Morgan & Elson method, and the method for measuring glutamic acid are as follows. And an enzyme method using glutamate dehydrogenase (J Biochem Biophys Methods, 2004, 59, 201-208) and the like.
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、このタンパク質を生産する生物から、常法に従って容易に単離することができる。 DNA encoding a protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity can be easily isolated from an organism producing this protein according to a conventional method.
次に、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質について説明する。
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質は、ＵＤＰ−グルコースを基質として、ＵＤＰ−グルクロン酸を合成するタンパク質である。
Next, a protein having UDP-glucose dehydrogenase activity will be described.
A protein having UDP-glucose dehydrogenase activity is a protein that synthesizes UDP-glucuronic acid using UDP-glucose as a substrate.
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（以下、ＵＧＤと略すことがある）は、上記の性質を有していれば特に限定はされず、真核生物由来、原核生物由来、ウイルス由来等のＵＧＤが挙げられる。真核生物由来としては、ヒト、ウシ、マウス、ポプラ、サトウキビやシロイヌナズナ由来等のＵＧＤ、原核生物由来としては、大腸菌、パスツレラ・ムルトシダや乳酸菌由来等のＵＧＤ、ウイルス由来としては、クロレラウイルス由来等のＵＧＤを挙げることができるが、これに限定されるものではない。 The protein having UDP-glucose dehydrogenase activity (hereinafter sometimes abbreviated as UGD) is not particularly limited as long as it has the above-mentioned properties, and UGDs derived from eukaryotes, prokaryotes, viruses, etc. Can be mentioned. From eukaryotes, UGD from humans, cows, mice, poplar, sugarcane and Arabidopsis, etc., from prokaryotes, UGD from Escherichia coli, Pasteurella multocida, lactic acid bacteria, etc., from virus, chlorella virus, etc. However, the present invention is not limited to this.
ＵＧＤは、上記記載のＵＧＤであれば使用できるが、より好ましくはクロレラウイルス由来またはシロイヌナズナ由来のＵＧＤが良く、特に好ましくは、配列番号１１または１３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質によって示されるクロレラウイルス由来のＵＧＤが良い。 UGD can be used as long as it is the above-mentioned UGD, more preferably UGD derived from chlorella virus or Arabidopsis thaliana, and particularly preferably a chlorella virus represented by a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or 13 Good origin UGD.
また、ＵＧＤは、配列番号１１または１３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を失わない程度の変異がなされたタンパク質であっても良い。例えば、配列番号１１または１３で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号１１または１３で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１１または１３で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいが、特にこれに限定されるものではない。このような変異は、自然界において生じるほかに、人為的な変異も含む。変異したアミノ酸の数は、ＵＧＤ活性を失わない限り、その個数は特に制限されない。 UGD is a mutation that does not lose UDP-glucose dehydrogenase activity consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 13. It may be a protein that has been made. For example, at least one, preferably about 1 to 10, and more preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or 13 may be deleted. At least one, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5 amino acids may be added to the amino acid sequence represented, or at least one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 11 or 13, Preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids may be substituted with other amino acids, but there is no particular limitation thereto. Such mutations occur in nature as well as artificial mutations. The number of mutated amino acids is not particularly limited as long as UGD activity is not lost.
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法は、ＵＤＰ−グルコース（４ｍＭ）、ＮＡＤ＋（１ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ）を含む溶液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加し、３７℃で反応を行い、生成物であるＵＤＰ−グルクロン酸またはＮＡＤＨの量を測定することにより評価できる。具体的には、ＮＡＤＨの測定法はＴｅｎｈａｋｅｎ ａｎｄ Ｔｈｕｌｋｅの報告（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６，１１２：１１２７−３４）に従い、Ａｂｓ３４０の増加を測定することで実施できる。 The measurement method of UDP-glucose dehydrogenase activity is performed by adding an enzyme solution to a solution (pH 8.0) containing UDP-glucose (4 mM), NAD + (1 mM), EDTA (1 mM), Tris-HCl (20 mM), Can be evaluated by measuring the amount of product UDP-glucuronic acid or NADH. Specifically, NADH can be measured by measuring an increase in Abs340 according to a report by Tenhaken and Thulke (Plant Physiol. 1996, 112: 1127-34).
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、このタンパク質を生産する生物から、常法に従って容易に単離することができる。 DNA encoding a protein having UDP-glucose dehydrogenase activity can be easily isolated from an organism producing this protein according to a conventional method.
本発明の方法では、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及びＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡはいずれも、植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にあることが必要である。 In the method of the present invention, DNA encoding a protein having hyaluronic acid synthase activity, DNA encoding a protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity, and a protein having UDP-glucose dehydrogenase activity are encoded. Any DNA needs to be under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region.
本発明の方法で用いるプロモーターは、植物中で機能し得る限り、いかなる従来公知のプロモーターであることもできるが、植物体を形質転換する場合は、器官特異的又は組織特異的プロモーターを用いることが好ましく、植物細胞を形質転換する場合は、構成的高発現プロモーターを用いることが好ましい。 The promoter used in the method of the present invention can be any conventionally known promoter as long as it can function in plants. However, when a plant body is transformed, an organ-specific or tissue-specific promoter may be used. Preferably, when transforming plant cells, it is preferable to use a constitutive high expression promoter.
器官特異的プロモーターとしては、例えば、根特異的プロモーター、塊茎特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、種子特異的プロモーター、茎特異的プロモーター等がある。根特異的プロモーターとしては、ヒヨシアミン６ｂ−ヒドロキラーゼ遺伝子のＡ６Ｈ６Ｈプロモーター、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼのＰＭＴプロモーター等が挙げられる。種子特異的プロモーターとしては、リポキシゲナーゼ遺伝子のＬＯＸプロモーター、レクチン遺伝子のＰｓｌプロモーター、アミラーゼ遺伝子のＡｍｙｌＡプロモーター等が挙げられる。茎特異的プロモーターとしては、スクロースシンターゼのＳｕｓ４遺伝子プロモーター、グリコプロテインをコードするパタチン遺伝子プロモーター等が挙げられる。 Examples of the organ-specific promoter include a root-specific promoter, a tuber-specific promoter, a leaf-specific promoter, a seed-specific promoter, and a stem-specific promoter. Examples of the root-specific promoter include A6H6H promoter of hyoscyamine 6b-hydroxylase gene, PMT promoter of putrescine N-methyltransferase, and the like. Examples of the seed-specific promoter include LOX promoter of lipoxygenase gene, Psl promoter of lectin gene, AmylA promoter of amylase gene, and the like. Examples of stem-specific promoters include the Sus4 gene promoter for sucrose synthase and the patatin gene promoter encoding glycoprotein.
また、組織特異的プロモーターとしては、例えば、緑色組織特異的プロモーター等がある。緑色組織特異的プロモーターとしては、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットタンパク質をコードするｒｂｓ遺伝子のプロモーターやクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするＣＡＢ遺伝子のプロモーター、グルセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼＡサブユニットタンパク質をコードするＧａｐＡ遺伝子プロモーター等が挙げられる。 Examples of the tissue-specific promoter include a green tissue-specific promoter. Green tissue specific promoters include rbs gene promoter encoding ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase small subunit protein, CAB gene promoter encoding chlorophyll a / b binding protein, glyceraldehyde 3-phosphate Examples thereof include a GapA gene promoter encoding a dehydrogenase A subunit protein.
構成的高発現プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルスの３５ＳＲＮＡ遺伝子のプロモーターであるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター等が挙げられる。 Examples of the constitutive high expression promoter include CaMV35S promoter which is a promoter of 35S RNA gene of cauliflower mosaic virus.
次に、本発明の方法で用いる転写終結領域について説明する。
転写終結領域（以下ターミネーターと記すこともある）は、転写物の成熟化（ｐｒｅ−ｍＲＮＡの切断とポリアデニレーション）および転写の終結（ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡからの解離）に関わる領域であり、植物細胞で転写産物の安定化および核外輸送に必要なポリアデニレーション部位を含む領域である。
Next, the transcription termination region used in the method of the present invention will be described.
A transcription termination region (hereinafter also referred to as a terminator) is a region involved in transcript maturation (pre-mRNA cleavage and polyadenylation) and transcription termination (dissociation of RNA polymerase from DNA). It is a region containing polyadenylation sites necessary for transcriptional stabilization and nuclear export in cells.
本発明の方法では、転写終結領域として、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を用いることが必要である：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
In the method of the present invention, it is necessary to use the following base sequence (a) or (b) as a transcription termination region:
(A) the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(B) A base sequence that hybridizes with a base sequence complementary to SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.
（ａ）の配列番号１で示される塩基配列は、シロイヌナズナ由来の熱ショックタンパク質遺伝子の転写終結領域に相当する。この転写終結領域は、従来用いられているＮＯＳの転写終結領域と比較して導入遺伝子の発現効率が高い。そのため、この転写終結領域を用いると、ヒアルロン酸を効率良く生産することができる。 The base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in (a) corresponds to the transcription termination region of the heat shock protein gene derived from Arabidopsis thaliana. This transcription termination region has higher transgene expression efficiency than the conventionally used NOS transcription termination region. Therefore, when this transcription termination region is used, hyaluronic acid can be produced efficiently.
本発明の方法において用いられる転写終結領域は、（ａ）の配列番号１で示される塩基配列に限られず、（ｂ）の配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であることもできる。 The transcription termination region used in the method of the present invention is not limited to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in (a), but under stringent conditions with a base sequence complementary to SEQ ID NO: 1 in (b). It can also be a base sequence that hybridizes.
上記において、「ストリンジェントな条件」とは、配列番号１で示される塩基配列と同等の転写終結領域機能を有する塩基配列のみが配列番号１に対して相補的な塩基配列とハイブリッド（いわゆる特異的ハイブリッド）を形成し、同等の機能を有しない塩基配列は配列番号１に対して相補的な塩基配列とハイブリッド（いわゆる非特異的ハイブリッド）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ）・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。 In the above, “stringent conditions” means that only a base sequence having a transcription termination region function equivalent to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is hybridized with a base sequence complementary to SEQ ID NO: 1 (so-called specific conditions). A base sequence that forms a hybrid) and does not have an equivalent function means a condition that does not form a hybrid (so-called non-specific hybrid) with a base sequence complementary to SEQ ID NO: 1. Those skilled in the art can easily select such conditions by changing the temperature during the hybridization reaction and washing, the salt concentration of the hybridization reaction solution and the washing solution, and the like. Specifically, 42 in 6 × SSC (0.9 M NaCl, 0.09 M trisodium citrate) or 6 × SSPE (3 M NaCl, 0.2 M NaH 2 PO 4 , 20 mM EDTA) · 2Na, pH 7.4) Examples of the stringent conditions of the present invention include, but are not limited to, the conditions for hybridization at 0 ° C. and washing with 0.5 × SSC at 42 ° C.
該ストリンジェントな条件は、好ましくはハイストリンジェントな条件である。ハイストリンジェントな条件とは、例えば０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である。 The stringent conditions are preferably highly stringent conditions. High stringent conditions are conditions in which washing is performed at a salt concentration corresponding to, for example, 0.1 × SSC and 0.1% SDS at 60 ° C.
本発明の方法では、発現用組換えベクターの構築は、プラスミド「ｐＢＩ１２１」、「ｐＢＩ２２１」、「ｐＢＩ１０１」等の植物細胞又は植物体の形質転換に通常用いられているベクターを基にして常法に従って行うことができる。 In the method of the present invention, the recombinant vector for expression is constructed based on a vector usually used for transformation of plant cells or plants such as plasmids “pBI121”, “pBI221”, “pBI101”, etc. Can be done according to.
また、得られたベクターを用いた植物細胞又は植物体の形質転換も、常法に従って行うことができる。例えば、植物培養細胞を宿主として用いる場合、形質転換は、エレクトロポレーション法又はアグロバクテリウムのバイナリーベクター法もしくはパーティクルボンバードメント法により、行うことができる。発現ベクターを導入された植物細胞は、例えば、カナマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選択される。形質転換された植物細胞は、細胞培養、組織培養、器官培養に用いることができ、また、従来知られている植物組織培養法等を用いて、植物体を再生することもできる。 In addition, transformation of plant cells or plants using the obtained vector can also be performed according to a conventional method. For example, when plant cultured cells are used as a host, transformation can be performed by an electroporation method, an Agrobacterium binary vector method, or a particle bombardment method. Plant cells introduced with an expression vector are selected based on drug resistance such as kanamycin resistance, for example. The transformed plant cell can be used for cell culture, tissue culture, and organ culture, and the plant body can be regenerated using a conventionally known plant tissue culture method or the like.
形質転換の対象となる植物細胞の例としては、例えば、タバコ由来ＢＹ−２細胞やＴ−１３細胞、ニンジン由来ｋｕｒｏｄａｇｏｓｕｎ細胞、ブドウ由来ＶＲ細胞やＶＷ細胞、ヨウシュヤマゴボウ由来ＰＡＲ細胞やＰＡＰ細胞やＰＡＷ細胞、シロイヌナズナ由来Ｔ８７細胞、アスパラガス由来Ａｓｐ−８６細胞やＡ．ｐｅｒ細胞やＡ．ｐａｓ細胞やＡ．ｐｌｏ細胞、スイカ由来Ｃｂａ−１細胞、トマト由来Ｓｌｙ−１細胞、ハッカ由来１−Ｍａｒ細胞、ニチニチソウ由来ＣＲＡ細胞やＶ２０８細胞や、ホウレンソウ由来Ｓｐｉ−ＷＴ細胞やＳｐｉ−Ｉ−１細胞やＳｐｉ−１２Ｆ細胞、ヘチマ由来Ｌｃｙ−１細胞やＬｃｙＤ６細胞やＬｃｙＤ７細胞や、イネ由来ＯＳ−１細胞、ツルニチニチソウ由来Ｖｍａ−１細胞、ゴマ由来ＰＳＢ細胞やＰＳＷ細胞やＰＳＧ細胞、ヒャクニチソウ由来ＺＥ３細胞等が挙げられる。 Examples of plant cells to be transformed include, for example, tobacco-derived BY-2 cells and T-13 cells, carrot-derived kurodagosun cells, grape-derived VR cells and VW cells, pokeweed-derived PAR cells and PAP cells, PAW cells, Arabidopsis thaliana-derived T87 cells, Asparagus-derived Asp-86 cells and A. per cell and A. pas cells and A. plo cells, watermelon-derived Cba-1 cells, tomato-derived Sly-1 cells, mint-derived 1-Mar cells, periwinkle-derived CRA cells and V208 cells, spinach-derived Spi-WT cells, Spi-I-1 cells and Spi-12F Examples include cells, loofah-derived Lcy-1 cells, LcyD6 cells, and LcyD7 cells, rice-derived OS-1 cells, periwinkle-derived Vma-1 cells, sesame-derived PSB cells, PSW cells, PSG cells, and zinnia-derived ZE3 cells.
植物体、植物器官又は植物組織を宿主として用いる場合、形質転換は、採取した植物切片に、アグロバクテリウムのバイナリーベクター法又はパーティクルボンバードメント法によって、あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法によって発現用組換えベクターを導入し、形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根等を分離することにより行われる。 When a plant body, plant organ or plant tissue is used as a host, transformation is performed on the collected plant section by recombinant Agrobacterium binary vector method or particle bombardment method, or protoplast by electroporation method. It is carried out by introducing a vector and separating tumor tissue, shoots, hairy roots and the like obtained as a result of transformation.
こうして得られる腫瘍組織やシュート、毛状根等は、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能である。また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモンの投与等により植物体に再生させることができる。 The tumor tissue, shoots, hairy roots and the like thus obtained can be used as they are for cell culture, tissue culture or organ culture. Further, it can be regenerated into a plant body by administration of an appropriate concentration of a plant hormone using a conventionally known plant tissue culture method.
形質転換された植物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地等に培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再生（再分化）の方法は植物細胞の種類により異なるが、従来知られている植物組織培養法を適宜用いることができる。 In order to regenerate plants from transformed plant cells, such plant cells may be cultured in a regeneration medium, a hormone-free MS medium, or the like. The rooted young plant body can be made into a plant body by transplanting and cultivating it in soil. Although the method of regeneration (redifferentiation) varies depending on the type of plant cell, a conventionally known plant tissue culture method can be appropriately used.
形質転換の対象となる植物体には、遺伝子導入の可能ないずれの植物も包含され、具体的には、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科、フトモト科、ヒルガオ科の植物等が挙げられる。 Plants to be transformed include any plant into which gene transfer is possible. Specifically, eggplants, gramineous, cruciferous, rose, leguminous, cucurbitaceae, perilla, lily And plants of the family, red crustaceae, antaceae, ftomotaceae, convolvulaceae.
これらの方法により作製された形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体、またはそれと同じ性質を有するその子孫（繁殖媒体、例えば種子、塊茎、切穂等から得た植物体）も本発明の対象である。 Transformed plant cells or transformed plants produced by these methods, or their progeny having the same properties (plants obtained from propagation media such as seeds, tubers, cut ears, etc.) are also objects of the present invention. .
次に、以上のようにして得られた形質転換体を培養し、該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する（工程（２））。 Next, the transformant obtained as described above is cultured, and hyaluronic acid produced by the transformant is separated (step (2)).
ヒアルロン酸の分離は、常法に従って行えばよい。例えば、形質転換体が植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織等である場合は、これらを収穫して、乾燥させた後に粉砕して、適当な有機溶媒によりヒアルロン酸を含む植物抽出液を抽出する。次に、そのヒアルロン酸を含む植物抽出液を濾過し、植物細胞を含まないヒアルロン酸の濾過溶液を得る。次に、この溶液をダイアフィルトレーションによって精製し、低分子量の不純物を除去する。次に、溶解したヒアルロン酸を含む濾過溶液を純水でダイアフィルトレーションし、濾液を連続して捨てることによりヒアルロン酸を分離することができる。 The separation of hyaluronic acid may be performed according to a conventional method. For example, when the transformant is a plant or a progeny having the same properties or their organs or tissues thereof, these are harvested, dried, pulverized, and hyaluronic acid with a suitable organic solvent. Extract a plant extract containing Next, the plant extract containing hyaluronic acid is filtered to obtain a filtered solution of hyaluronic acid that does not contain plant cells. The solution is then purified by diafiltration to remove low molecular weight impurities. Next, the hyaluronic acid can be separated by diafiltration of the filtered solution containing the dissolved hyaluronic acid with pure water and continuously discarding the filtrate.
形質転換体が植物細胞である場合は、植物細胞の培養液中に蓄積されたヒアルロン酸を、公知の分離法を用いて精製することによりヒアルロン酸を分離することができる。 When the transformant is a plant cell, hyaluronic acid can be separated by purifying hyaluronic acid accumulated in the culture solution of the plant cell using a known separation method.
本発明の方法によって得られるヒアルロン酸は、１００万以上の分子量を有し、化粧品及び医薬品の成分、又はバイオマテリアル素材等の用途に有用に利用できる。具体的には、化粧品の保湿成分、又は、関節炎や慢性リウマチ、火傷や切り傷の治療薬や目薬の成分等として、有用に利用できる。また、皮膚の老化を防止及び／又は改善する上で有用な機能性食品としても利用できる。 The hyaluronic acid obtained by the method of the present invention has a molecular weight of 1 million or more, and can be usefully used for cosmetics and pharmaceutical ingredients, biomaterials, and the like. Specifically, it can be usefully used as a moisturizing ingredient in cosmetics, a therapeutic agent for arthritis, chronic rheumatism, burns or cuts, an eye drop ingredient, or the like. It can also be used as a functional food useful for preventing and / or improving skin aging.
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
（１）発現用組換えベクターの構築
クロレラウイルス由来ヒアルロン酸合成酵素（ｃｖＨＡＳ、配列番号３）をコードするＤＮＡ（配列番号２）、クロレラウイルス由来ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ｃｖＵＧＤ、配列番号１１）をコードするＤＮＡ（配列番号１０）およびクロレラウイルス由来グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ｃｖＧＦＡＴ、配列番号７）をコードするＤＮＡ（配列番号６）は、既報（ＷＯ ０５／０１２５２９、ＷＯ ０６／０３２５３８）に従い単離した。プロモーターとして用いたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、およびコントロールの転写終結領域として用いたＮＯＳターミネーターは、ｐＢＩ１２１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から単離した。本発明例の転写終結領域として用いた配列番号１で示される塩基配列（以下、ＨＳＰターミネーターと称する）は、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡから公知の方法で単離した。これらを用いて、図１のＡ及びＢに示した、転写終結領域の異なる２種類の発現用組換えベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ及びｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳを公知の方法（特開平０６−３１９５８０号公報）に従い、構築した。図１において、ＨＳＰターミネーターはＨＳＰ−Ｔ、ＮＯＳターミネーターはＮＯＳ−Ｔと記した。これらのベクターは、植物中で機能し得るプロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを上流に、転写終結領域としてＨＳＰターミネーター（図１のＡ）またはＮＯＳターミネーター（図１のＢ）を下流に連結したｃｖＨＡＳ遺伝子のＤＮＡカセット、同様の構成のｃｖＵＧＤ遺伝子のＤＮＡカセットおよび同様の構成のＧＦＡＴ遺伝子のＤＮＡカセットから成る多重遺伝子を含むベクターである。また、図１のＣに示す構造の発現用組換えベクターｐＢＩ１２１−ｃｖＨＡＳを同様にして構築した。このベクターは、植物中で機能し得るプロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを上流に、転写終結領域としてＮＯＳターミネーターを下流に連結したｃｖＨＡＳ遺伝子のＤＮＡカセットを含む公知（ＷＯ ０５／０１２５２９）のベクターである。
(1) Construction of recombinant vector for expression DNA (SEQ ID NO: 2) encoding chlorella virus-derived hyaluronic acid synthase (cvHAS, SEQ ID NO: 3), chlorella virus-derived UDP-glucose dehydrogenase (cvUGD, SEQ ID NO: 11) DNA (SEQ ID NO: 10) and chlorella virus-derived glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase (cvGFAT, SEQ ID NO: 7) encoding DNA (SEQ ID NO: 6) have been reported (WO 05/012529, WO 06/032538). ). The CaMV35S promoter used as the promoter and the NOS terminator used as the control transcription termination region were isolated from the pBI121 vector (Clontech). The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as HSP terminator) used as the transcription termination region of the present invention example was isolated from the genomic DNA of Arabidopsis thaliana by a known method. Using these, two types of expression recombinant vectors pBI101-HUG-HSP and pBI101-HUG-NOS having different transcription termination regions shown in FIGS. 1A and 1B are disclosed in a known method (Japanese Patent Laid-Open No. 06-319580). It was constructed according to the publication. In FIG. 1, the HSP terminator is indicated as HSP-T, and the NOS terminator is indicated as NOS-T. These vectors are a cvHAS gene DNA cassette in which a CaMV35S promoter is linked upstream as a promoter that can function in plants, and an HSP terminator (A in FIG. 1) or NOS terminator (B in FIG. 1) is linked downstream as a transcription termination region. , A vector comprising a multigene comprising a DNA cassette of cvUGD gene having a similar structure and a DNA cassette of GFAT gene having a similar structure. Further, a recombinant expression vector pBI121-cvHAS having the structure shown in FIG. 1C was constructed in the same manner. This vector is a known vector (WO 05/012529) containing a DNA cassette of the cvHAS gene in which a CaMV35S promoter is linked upstream as a promoter that can function in plants and a NOS terminator is linked downstream as a transcription termination region.
（２）タバコＢＹ−２培養細胞の形質転換
上記（１）で構築した３種類の発現用組換えベクターをそれぞれアグロバクテリム ツメファシエンス ＬＢＡ４４０４のエレクトロポレーションコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入した。既知の方法（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８５ ７９：５６８−５７０）に従い、得られた形質転換アグロバクテリムを用い、タバコＢＹ−２培養細胞を形質転換した。この操作によって、図１ＡのベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰを導入した２１個の形質転換カルス（系統Ｎｏ．ＨＳＰ−１〜ＨＳＰ−２１）、図１ＢのベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳを導入した２１個の形質転換カルス（系統Ｎｏ．ＮＯＳ−１〜ＮＯＳ−２１）、及び図１ＣのベクターｐＢＩ１２１−ｃｖＨＡＳを導入した５個の形質転換カルス（系統Ｎｏ．ｃＨＡＳ−１〜ｃＨＡＳ−５）を得た。
(2) Transformation of tobacco BY-2 cultured cells The three types of recombinant expression vectors constructed in (1) above were introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 electroporation competent cells (Invitrogen). According to a known method (Plant Physiol. 1985 79: 568-570), tobacco BY-2 cultured cells were transformed with the obtained transformed Agrobacterium. By this operation, 21 transformed calli (line Nos. HSP-1 to HSP-21) into which the vector pBI101-HUG-HSP in FIG. 1A was introduced and 21 vectors into which the vector pBI101-HUG-NOS in FIG. 1B was introduced. Transformed calli (lines No. NOS-1 to NOS-21) and five transformed calli (lines No. cHAS-1 to cHAS-5) into which the vector pBI121-cvHAS of FIG. 1C was introduced were obtained.
（３）ヒアルロン酸高生産性タバコＢＹ−２培養細胞形質転換体の選抜
上記（２）で得られた形質転換カルスを、スクロース（３０ｇ／Ｌ）、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびカルベニシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含む改変ＬＳ液体培地（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９８１ １８４：１６１−１６５）で液体培養した。１ヶ月間の液体培養で馴化し生育した細胞の培地を回収し、市販のヒアルロン酸測定キット（ＥＣＨＥＬＯＮ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社 Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ＥＬＩＳＡ）を用い、ヒアルロン酸濃度を測定し、各形質転換体のヒアルロン酸生産性を調査した。この調査結果に基づき、高いヒアルロン酸生産性を示したクローンを液体培地でさらに２ヶ月間継代培養し、正常に生育したクローンを選抜し、培養開始６日後のヒアルロン酸生産性を比較した。その結果を図２に示す。また、これらのクローンのヒアルロン酸生産性を細胞湿重量当たりのヒアルロン酸生産量に換算した値を表１に示す。図２及び表１から明らかな通り、図１ＡのベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰを導入したクローンは、図１ＢのベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳを導入したクローンよりも明らかに高い生産性を維持し、安定な形質転換体である。
(3) Selection of hyaluronic acid high-producing tobacco BY-2 cultured cell transformant The transformed callus obtained in (2) above was transformed into sucrose (30 g / L), kanamycin (100 mg / L) and carbenicillin (100 mg / L). L) and a modified LS liquid medium (Mol. Gen. Genet. 1981 184: 161-165). The culture medium of cells grown after acclimation in a liquid culture for 1 month was collected, and the hyaluronic acid concentration of each transformant was measured using a commercially available hyaluronic acid measurement kit (ECHELON BIOSCENCECES Hyaluran ELISA). investigated. Based on the results of this investigation, clones showing high hyaluronic acid productivity were subcultured in a liquid medium for another 2 months, and normally grown clones were selected, and the hyaluronic acid productivity 6 days after the start of culture was compared. The result is shown in FIG. Table 1 shows values obtained by converting the hyaluronic acid productivity of these clones into hyaluronic acid production per cell wet weight. As is clear from FIG. 2 and Table 1, the clone introduced with the vector pBI101-HUG-HSP in FIG. 1A maintained a clearly higher productivity and stable than the clone introduced with the vector pBI101-HUG-NOS in FIG. 1B. Transformant.
（４）タバコＢＹ−２培養細胞形質転換体の生産したヒアルロン酸の分子量
上記（３）で高いヒアルロン酸生産性を示したｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ導入クローンの生産するヒアルロン酸の分子量を、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳ導入クローンおよびｐＢＩ１２１−ｃｖＨＡＳ導入クローンの分子量と比較した。具体的には、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ導入クローンから系統Ｎｏ．ＨＳＰ−１９、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳ導入クローンから系統Ｎｏ．ＮＯＳ−３およびｐＢＩ１２１−ｃｖＨＡＳ導入クローンから系統Ｎｏ．ｃｖＨＡＳ−５を選択し、これらの系統の培地を公知の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９ ２７４：２５０８５−２５０９２）に従い、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＰＶＤＦメンブレンにブロッティングし、ビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質および化学発光法を用いることにより、培地中のヒアルロン酸の分子量を調査した。対照として、タバコＢＹ−２培養細胞の非形質転換体（ＷＴ）の培地を用いた。その結果を図３に示す。図３から明らかなように、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ導入クローンは、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳ導入クローンおよびｃｖＨＡＳ導入クローンよりも高い分子量のヒアルロン酸を生産した。具体的には、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ導入クローン（ＨＳＰ−１９）の生産するヒアルロン酸の分子量は１００万以上であり、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳ導入クローン（ＮＯＳ−３）の生産するヒアルロン酸の分子量は１００万未満であり、ｃｖＨＡＳ導入クローン（ｃｖＨＡＳ−５）の生産するヒアルロン酸の分子量は５０万未満であった。
(4) Molecular weight of hyaluronic acid produced by tobacco BY-2 cultured cell transformant The molecular weight of hyaluronic acid produced by the pBI101-HUG-HSP-introduced clone showing high hyaluronic acid productivity in (3) above was determined as pBI101- The molecular weights of HUG-NOS-introduced clone and pBI121-cvHAS-introduced clone were compared. Specifically, from the pBI101-HUG-HSP-introduced clone, the strain No. From the HSP-19, pBI101-HUG-NOS-introduced clone, the strain No. From the NOS-3 and pBI121-cvHAS-introduced clones, strain no. cvHAS-5 was selected and the medium of these strains was subjected to agarose gel electrophoresis according to a known method (J. Biol. Chem. 1999 274: 25085-25092), then blotted on a PVDF membrane, and biotin-labeled hyaluron The molecular weight of hyaluronic acid in the culture medium was investigated by using acid binding protein and chemiluminescence method. As a control, a medium of non-transformant (WT) of tobacco BY-2 cultured cells was used. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 3, the pBI101-HUG-HSP-introduced clone produced higher molecular weight hyaluronic acid than the pBI101-HUG-NOS-introduced clone and the cvHAS-introduced clone. Specifically, the molecular weight of hyaluronic acid produced by the pBI101-HUG-HSP introduced clone (HSP-19) is 1 million or more, and the molecular weight of hyaluronic acid produced by the pBI101-HUG-NOS introduced clone (NOS-3) The molecular weight of hyaluronic acid produced by the cvHAS-introduced clone (cvHAS-5) was less than 500,000.
本発明の方法によれば、植物で生産された安全なヒアルロン酸を低コストで提供することができる。従って、本発明の方法は、化粧品や医薬品、バイオマテリアル素材等の分野で広く利用することができ、産業界に大きく寄与することが期待される。 According to the method of the present invention, safe hyaluronic acid produced in plants can be provided at low cost. Therefore, the method of the present invention can be widely used in the fields of cosmetics, pharmaceuticals, biomaterials, and the like, and is expected to greatly contribute to the industry.
Claims (10)
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；及び
（２）得られた形質転換体を培養し、該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程
を含むヒアルロン酸の製造方法において、転写終結領域の塩基配列が、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列であることを特徴とするヒアルロン酸の製造方法：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、ただし、前記ストリンジェントな条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄する条件である。 (1) A recombinant expression vector comprising the following DNA (i) and (ii) or / and (iii) is constructed, and a plant cell or a plant body is transformed using this vector to transform the transformant. To obtain:
(I) DNA encoding a protein having hyaluronic acid synthase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region;
(Ii) DNA encoding a protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region;
(Iii) DNA encoding a protein having UDP-glucose dehydrogenase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region; and (2) culturing the obtained transformant, In the method for producing hyaluronic acid, comprising the step of separating the hyaluronic acid produced by the converter, the base sequence of the transcription termination region is the following base sequence (a) or (b): Manufacturing method:
(A) the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(B) a nucleotide sequence that hybridizes with a nucleotide sequence complementary to SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, provided that the stringent conditions are 6 × SSC (0.9 M NaCl, 0.09 M citric acid Tris) or 6 × SSPE (3M NaCl, 0.2M NaH 2 PO 4 , 20 mM EDTA · 2Na, pH 7.4) at 42 ° C. and further equivalent to 0.1 × SSC and 0.1% SDS This is a condition of washing at 60 ° C. at a salt concentration .
（ａ）配列番号３又は５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質。 The method for producing hyaluronic acid according to claim 1, wherein the protein having hyaluronic acid synthase activity is the following protein (a) or (b):
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5;
(B) A protein having an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) and having hyaluronic acid synthase activity.
（ａ）配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。 The method for producing hyaluronic acid according to claim 1 or 2, wherein the protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity is the following protein (a) or (b):
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9;
(B) A protein having an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) and having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity.
（ａ）配列番号１１又は１３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 The method for producing hyaluronic acid according to any one of claims 1 to 3, wherein the protein having UDP-glucose dehydrogenase activity is the following protein (a) or (b):
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or 13;
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) and having UDP-glucose dehydrogenase activity.
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
ただし、転写終結領域の塩基配列は、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列である：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、ただし、前記ストリンジェントな条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄する条件である。 A transformed plant cell or a transformed plant having the ability to produce hyaluronic acid, transformed with the following recombinant vector for expression containing the DNA of (i) and (ii) or / and (iii), or the same Progeny offspring or their organs or their tissues:
(I) DNA encoding a protein having hyaluronic acid synthase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region;
(Ii) DNA encoding a protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region;
(Iii) DNA encoding a protein having UDP-glucose dehydrogenase activity under the control of a promoter capable of functioning in plants and a transcription termination region;
However, the base sequence of the transcription termination region is the following base sequence (a) or (b):
(A) the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(B) a nucleotide sequence that hybridizes with a nucleotide sequence complementary to SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, provided that the stringent conditions are 6 × SSC (0.9 M NaCl, 0.09 M citric acid Tris) or 6 × SSPE (3M NaCl, 0.2M NaH 2 PO 4 , 20 mM EDTA · 2Na, pH 7.4) at 42 ° C. and further equivalent to 0.1 × SSC and 0.1% SDS This is a condition of washing at 60 ° C. at a salt concentration .
（ａ）配列番号３又は５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質。 The transformed plant cell or transformed plant body according to claim 6, wherein the protein having hyaluronic acid synthase activity is the following protein (a) or (b), or a progeny having the same property: Or their organs or their tissues:
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5;
(B) A protein having an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) and having hyaluronic acid synthase activity.
（ａ）配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。 The transformed plant cell or transformed plant according to claim 6 or 7, wherein the protein having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity is the following protein (a) or (b): Body or offspring with the same properties or their organs or their tissues:
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9;
(B) A protein having an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) and having glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase activity.
（ａ）配列番号１１又は１３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 The protein having UDP-glucose dehydrogenase activity is the following protein (a) or (b), or the transformed plant cell or transformed plant body according to any one of claims 6 to 8, Offspring with the same properties or their organs or their tissues:
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or 13;
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) and having UDP-glucose dehydrogenase activity.
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