JP5522717B2 - Atopic dermatitis detection method and prophylactic / therapeutic agent screening method - Google Patents
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Description
本発明は、アトピー性皮膚炎の検出方法および予防・治療剤のスクリーニング方法などに関する。 The present invention relates to a method for detecting atopic dermatitis, a method for screening a preventive / therapeutic agent, and the like.
アトピー性皮膚炎は炎症を伴う皮疹を特徴とする皮膚科疾患であり、組織学的には表皮肥厚、角質増多、および線維化などを特徴とする。アトピー性皮膚炎の発生原因については明らかではないが、種々の化学物質による刺激や皮膚の擦過などの物理的刺激によりアトピー性皮膚炎が増悪することが知られている。日本において若年者のアトピー性皮膚炎の有病率は全人口の10数％に達する。 Atopic dermatitis is a dermatological disease characterized by rash with inflammation, and histologically characterized by thickening of the epidermis, hyperkeratosis, and fibrosis. Although the cause of the occurrence of atopic dermatitis is not clear, it is known that atopic dermatitis is exacerbated by physical stimulation such as irritation by various chemical substances and skin abrasion. In Japan, the prevalence of atopic dermatitis among young people reaches more than 10% of the total population.
アトピー性皮膚炎に対する予防・治療は、ステロイド剤および免疫抑制剤といった免疫機能調節薬、抗ヒスタミン薬および抗アレルギー薬といった抗掻痒薬、あるいは保湿剤などの使用が中心となっており、少なくとも現時点では、特定の分子を標的としてアトピー性皮膚炎の病態の改善を目指す治療剤は使用されていない。 The prevention and treatment of atopic dermatitis mainly involves the use of immune function regulators such as steroids and immunosuppressants, anti-pruritics such as antihistamines and antiallergic agents, or moisturizers, at least at the present time. No therapeutic agent that targets a specific molecule to improve the pathology of atopic dermatitis has been used.
アトピー性皮膚炎の表皮肥厚、角質増多、および線維化に関連する分子を特定することができれば、特定した分子を利用してアトピー性皮膚炎を検出することが可能となる。 If a molecule related to epidermis thickening, keratosis, and fibrosis of atopic dermatitis can be identified, it becomes possible to detect atopic dermatitis using the identified molecule.
また、アトピー性皮膚炎の病態の中で、表皮肥厚および角質増多は皮膚のバリアー破壊を引き起こすことでアトピー性皮膚炎の増悪につながるとともに、美容上の問題ともなる。このため、アトピー性皮膚炎の表皮肥厚、角質増多、または線維化に関連する分子を標的としてアトピー性皮膚炎の予防・治療剤を開発することができれば、アトピー性皮膚炎の患者にとって有用となる。 In the pathology of atopic dermatitis, thickening of the epidermis and hyperkeratosis cause skin barrier destruction, leading to exacerbation of atopic dermatitis and also a cosmetic problem. Therefore, it would be useful for patients with atopic dermatitis if a preventive / therapeutic agent for atopic dermatitis can be developed by targeting molecules related to epidermal thickening, hyperkeratosis, or fibrosis of atopic dermatitis. Become.
ここで、特許文献１には、ペリオスチン遺伝子の発現レベルを指標として、アレルギー性疾患を検査することが記載されている。 Here, Patent Document 1 describes testing for allergic diseases using the expression level of the periostin gene as an index.
また、非特許文献１には、ペリオスチン(骨芽細胞特異因子２)が、IL-4またはIL-13による刺激に応答して線維芽細胞で産生され、気管支喘息患者の肺線維症に関与する可能性があることが示されている。 In Non-Patent Document 1, periostin (osteoblast-specific factor 2) is produced in fibroblasts in response to stimulation with IL-4 or IL-13, and is involved in pulmonary fibrosis in patients with bronchial asthma. It has been shown that this is possible.
非特許文献２〜６には、ペリオスチンがインテグリンαVを介してシグナル伝達を行う可能性があることが示されている。 Non-Patent Document 2-6, it is shown that periostin might perform signaling through integrin alpha V.
このような状況の下、マーカーを利用したアトピー性皮膚炎の検出方法、およびアトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング方法などが求められていた。 Under such circumstances, a method for detecting atopic dermatitis using a marker and a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis have been demanded.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、アトピー性皮膚炎患者由来の生体試料においてペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が高いこと、ペリオスチンをマーカーとして利用することでアトピー性皮膚炎を検出できること、また、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニングできること等の知見に基づき本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that periostin gene expression levels or periostin protein levels are high in biological samples derived from patients with atopic dermatitis, and that periostin is used as a marker. The present invention has been completed on the basis of knowledge that atopic dermatitis can be detected and that a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis can be screened.
すなわち、本発明は、以下のアトピー性皮膚炎の検出方法または診断方法、およびアトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング方法などを提供する。
(1)生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定することを含む、アトピー性皮膚炎の検出方法。
(2)(i)被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と、(ii)正常細胞におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量との比較を行うことを含む、上記(1)に記載の方法。
(3)(i)被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が(ii)正常細胞におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量よりも高いときに、アトピー性皮膚炎である、またはアトピー性皮膚炎が疑われると判断することを含む、上記(2)に記載の方法。
(4)ペリオスチンを産生する能力を有する細胞を候補物質の存在下で培養した場合におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定することを含む、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング方法。
(5)(i)ペリオスチンを産生する能力を有する細胞を候補物質の存在下で培養した場合におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と、(ii)ペリオスチンを産生する能力を有する細胞を候補物質の非存在下で培養した場合におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量との比較を行うことを含む、上記(4)に記載の方法。
(6)(i)ペリオスチンを産生する能力を有する細胞を候補物質の存在下で培養した場合におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が(ii)ペリオスチンを産生する能力を有する細胞を候補物質の非存在下で培養した場合におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量よりも低いときに、候補物質を選択することを含む、上記(5)に記載の方法。
(7)測定が免疫測定法によるものである、上記(1)〜(6)のいずれか１項に記載の方法。
(8)生体試料が皮膚組織である、上記(1)〜(7)のいずれか１項に記載の方法。
(8a)ペリオスチンと候補物質を接触させて、ペリオスチンの活性の変化を検出することを含む、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング方法。
(9)インテグリンαV/β3とペリオスチンとを、候補物質の存在下で接触させた場合における、インテグリンαV/β3とペリオスチンとの結合量、thymic stromal lymphopoietin産生量または皮膚角化細胞の分化・増殖活性を測定することを含む、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング方法。
(10)(i)候補物質の存在下でインテグリンαV/β3とペリオスチンとを接触させた場合におけるインテグリンαV/β3とペリオスチンとの結合量またはthymic stromal lymphopoietin産生量と、(ii)候補物質の非存在下でインテグリンαV/β3とペリオスチンとを接触させた場合におけるインテグリンαV/β3とペリオスチンとの結合量またはthymic stromal lymphopoietin産生量との比較を行うことを含む、上記(9)に記載の方法。
(11)(i)被検物質の存在下でインテグリンαV/β3とペリオスチンとを接触させた場合におけるインテグリンαV/β3とペリオスチンとの結合量またはthymic stromal lymphopoietin産生量が、(ii)被検物質の非存在下でインテグリンαV/β3とペリオスチンとを接触させた場合におけるインテグリンαV/β3とペリオスチンとの結合量またはthymic stromal lymphopoietin産生量よりも低いときに、候補物質を選択することを含む、上記(10)に記載の方法。
(12)インテグリンαV/β3とペリオスチンとの接触がインテグリンαV/β3を発現する細胞とペリオスチンとの接触である、上記(9)〜(11)のいずれか１項に記載の方法。
(13)インテグリンαV/β3を発現する細胞が、インテグリンαV/β3を細胞表面に発現する細胞である、上記(12)に記載の方法。
(14)インテグリンαV/β3を発現する細胞が内因性インテグリンαV/β3発現細胞である、上記(12)または(13)に記載の方法。
(15)内因性インテグリンαV/β3発現細胞が皮膚角化細胞である、上記(14)に記載の方法。
(16)(i)候補物質の存在下でインテグリンαV/β3とペリオスチンとを接触させた場合における皮膚角化細胞の分化・増殖活性と、(ii)候補物質の非存在下でインテグリンαV/β3とペリオスチンとを接触させた場合における皮膚角化細胞の分化・増殖活性との比較を行うことを含む、上記(9)に記載の方法。
(17)(i)被検物質の存在下でインテグリンαV/β3とペリオスチンとを接触させた場合における皮膚角化細胞の分化・増殖活性が、(ii)被検物質の非存在下でインテグリンαV/β3とペリオスチンとを接触させた場合における皮膚角化細胞の分化・増殖活性よりも低いときに、候補物質を選択することを含む、上記(16)\に記載の方法。
(18)(i)ペリオスチンを認識する抗体、(ii) ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計された、連続する少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなるプライマー、および(iii)ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計された、連続する少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなるプローブからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、アトピー性皮膚炎の検出薬。
(18a)ペリオスチンを認識する抗体を含有する、アトピー性皮膚炎の検出薬。
(18b)ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計された、連続する少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなるプライマーを含む、アトピー性皮膚炎の検出薬。
(18c)ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計された、連続する少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなるプローブを含む、アトピー性皮膚炎の検出薬。
(19)(i)ペリオスチンを認識する抗体、(ii)ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計された、連続する少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなるプライマー、および(iii)ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計された、連続する少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなるプローブからなる群から選択される少なくとも１つを含有する、アトピー性皮膚炎の検出用キット。
(19a)ペリオスチンを認識する抗体を含有する、アトピー性皮膚炎の検出用キット。
(19b)ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計された、連続する少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなるプライマーを含む、アトピー性皮膚炎の検出用キット。
(19c)ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計された、連続する少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなるプローブを含む、アトピー性皮膚炎の検出用キット。
(20)(i)ペリオスチンを産生する能力を有する細胞、および／または(ii)インテグリンαV/β3を発現する細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング用キット。
(20a)ペリオスチンを産生する能力を有する細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング用キット。
(20b)インテグリンαV/β3を発現する細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング用キット。
(21)インテグリンαV/β3を発現する細胞が、インテグリンαV/β3を細胞表面に発現する細胞である、上記(20)または(20b)に記載のキット。
(22)インテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合を阻害する抗インテグリンαV抗体を含む、アトピー性皮膚炎の予防・治療用医薬組成物。
That is, the present invention provides the following methods for detecting or diagnosing atopic dermatitis, screening methods for prophylactic / therapeutic agents for atopic dermatitis, and the like.
(1) A method for detecting atopic dermatitis, comprising measuring the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in a biological sample.
(2) (i) comparing the expression level or periostin protein level of a periostin gene in a biological sample derived from a subject with (ii) the expression level or periostin protein level of a periostin gene in a normal cell (1) ) Method.
(3) (i) When the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in a biological sample derived from a subject is higher than the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in (ii) normal cells, atopic dermatitis. Alternatively, the method according to (2) above, comprising determining that atopic dermatitis is suspected.
(4) A screening method for a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis, comprising measuring the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein when cells having the ability to produce periostin are cultured in the presence of a candidate substance .
(5) (i) Periostin gene expression level or periostin protein amount when cells having the ability to produce periostin are cultured in the presence of the candidate substance, and (ii) cells having the ability to produce periostin are candidate substances The method according to (4), comprising comparing the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein when cultured in the absence of.
(6) (i) When the cell having the ability to produce periostin is cultured in the presence of the candidate substance, the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein is (ii) the cell having the ability to produce periostin is selected as the candidate substance. The method according to (5) above, comprising selecting a candidate substance when the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein is lower when cultured in the absence.
(7) The method according to any one of (1) to (6) above, wherein the measurement is performed by an immunoassay.
(8) The method according to any one of (1) to (7) above, wherein the biological sample is skin tissue.
(8a) A screening method for a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis, comprising contacting periostin with a candidate substance and detecting a change in the activity of periostin.
(9) When integrin α V / β 3 is contacted with periostin in the presence of a candidate substance, the amount of integrin α V / β 3 binding to periostin, the amount of thymic stromal lymphopoietin produced, or the amount of skin keratinocytes A screening method for a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis, comprising measuring differentiation / proliferation activity.
(10) (i) a coupling amount or thymic Stromal lymphopoietin production amount of integrin α V / β 3 and periostin In the case of contacting the integrin α V / β 3 and periostin in the presence of a candidate substance, (ii) comprises performing a comparison of the binding amount or thymic Stromal lymphopoietin production amount of integrin α V / β 3 and periostin in the case of contacting the integrin α V / β 3 and periostin in the absence of the candidate substance, the The method according to (9).
(11) (i) When the integrin α V / β 3 and periostin are contacted in the presence of the test substance, the binding amount of the integrin α V / β 3 and periostin or the amount of thymic stromal lymphopoietin produced is (ii) ) when less than the binding amount or thymic Stromal lymphopoietin production amount of integrin α V / β 3 and periostin in the case of contacting the integrin α V / β 3 in the absence of the test substance periostin, a candidate substance The method according to (10) above, comprising selecting
(12) Contact integrin α V / β 3 and periostin is contacting the cells with the periostin expressing integrin α V / β 3, The method according to any one of the above (9) to (11) .
(13) cells expressing the integrin α V / β 3 is a cell expressing integrin α V / β 3 on the cell surface, the method according to (12).
(14) cells expressing the integrin α V / β 3 is an endogenous integrin α V / β 3 expressing cells The method according to (12) or (13).
(15) The method according to (14) above, wherein the endogenous integrin α V / β 3 expressing cells are skin keratinocytes.
(16) (i) Differentiation / proliferation activity of skin keratinocytes when integrin α V / β 3 is contacted with periostin in the presence of a candidate substance, and (ii) integrin α in the absence of the candidate substance. comprises performing a comparison of the differentiation and proliferation activity of skin keratinocytes in the case of contacting the V / beta 3 and periostin method according to (9).
(17) (i) Differentiation / proliferation activity of skin keratinocytes when integrin α V / β 3 is contacted with periostin in the presence of the test substance, (ii) in the absence of the test substance The method according to (16) above, which comprises selecting a candidate substance when the differentiation / proliferation activity of skin keratinocytes when contacting integrin α V / β 3 with periostin is lowered.
(18) (i) an antibody recognizing periostin, (ii) a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides designed from the base sequence of a gene encoding periostin, and (iii) a gene encoding periostin A drug for detecting atopic dermatitis, comprising at least one selected from the group consisting of probes consisting of polynucleotides of at least 15 consecutive nucleotides designed from a nucleotide sequence.
(18a) A drug for detecting atopic dermatitis comprising an antibody recognizing periostin.
(18b) A drug for detecting atopic dermatitis, comprising a primer composed of a polynucleotide of at least 15 consecutive nucleotides designed from a nucleotide sequence of a gene encoding periostin.
(18c) A drug for detecting atopic dermatitis, comprising a probe comprising a polynucleotide consisting of at least 15 consecutive nucleotides designed from the nucleotide sequence of a gene encoding periostin.
(19) (i) an antibody recognizing periostin, (ii) a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides designed from the base sequence of a gene encoding periostin, and (iii) a gene encoding periostin A kit for detecting atopic dermatitis, comprising at least one selected from the group consisting of probes consisting of polynucleotides of at least 15 consecutive nucleotides designed from a nucleotide sequence.
(19a) A kit for detecting atopic dermatitis, comprising an antibody that recognizes periostin.
(19b) A kit for detecting atopic dermatitis, comprising a primer composed of a continuous polynucleotide of at least 15 bases designed from a base sequence of a gene encoding periostin.
(19c) A kit for detecting atopic dermatitis, comprising a probe comprising a polynucleotide consisting of at least 15 consecutive nucleotides designed from a nucleotide sequence of a gene encoding periostin.
(20) A kit for screening for a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis, comprising (i) cells having the ability to produce periostin and / or (ii) cells expressing integrin α V / β 3 .
(20a) A screening kit for a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis, comprising cells having the ability to produce periostin.
(20b) A screening kit for a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis, comprising cells expressing integrin α V / β 3 .
(21) cells expressing the integrin α V / β 3 is a cell expressing integrin α V / β 3 on the cell surface, the kit according to (20) or (20b).
(22) A pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of atopic dermatitis, comprising an anti-integrin α V antibody that inhibits the binding of integrin α V / β 3 and periostin.
本発明は、新規マーカーを利用したアトピー性皮膚炎の検出方法を提供する。本発明の好ましい態様によれば、検出結果を、アトピー性皮膚炎の確定診断の補助にできる等の利点がある。また。本発明は、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供する。 The present invention provides a method for detecting atopic dermatitis using a novel marker. According to a preferred aspect of the present invention, there is an advantage that the detection result can be used to assist a definite diagnosis of atopic dermatitis. Also. The present invention provides a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis.
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願2008-241295号(出願日：2008年9月19日)の特許請求の範囲、明細書、および図面の開示内容を包含する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
It should be noted that all publications cited in the present specification, for example, prior art documents, publications, patent publications and other patent documents are incorporated herein by reference. The disclosure contents of claims, specification, and drawings of Japanese Patent Application No. 2008-241295 (filing date: September 19, 2008), which is a Japanese patent application that forms the basis for claiming priority of the present application, are included.
１．本発明の概要
本発明は、生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定することを含む、アトピー性皮膚炎の検出方法または診断方法である。
本発明者らは、アトピー性皮膚炎の表皮肥厚、角質増多、または線維化に関連する分子を探索すべく鋭意検討を重ねた。その結果、アトピー性皮膚炎の患者は、皮膚組織などにおいてペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が高いことを見出した。
1. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is a method for detecting or diagnosing atopic dermatitis, comprising measuring the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in a biological sample.
The present inventors have intensively studied to search for molecules associated with epidermal thickening, hyperkeratosis, or fibrosis in atopic dermatitis. As a result, it was found that patients with atopic dermatitis have a high periostin gene expression level or periostin protein level in skin tissue and the like.
具体的には、アトピー性皮膚炎患者由来の皮膚組織を用いて組織染色法によりペリオスチンタンパク質量を測定した。その結果、20検体のアトピー性皮膚炎患者由来皮膚組織の全てにおいてペリオスチンタンパク質量が高かった（図１(b)）。一方、対照群として用いた5検体の正常皮膚組織ではペリオスチンタンパク質量がきわめて低かった(図１(a))。 Specifically, the amount of periostin protein was measured by a tissue staining method using skin tissue derived from an atopic dermatitis patient. As a result, the amount of periostin protein was high in all 20 skin tissues derived from atopic dermatitis patients (FIG. 1 (b)). On the other hand, the amount of periostin protein was extremely low in the normal skin tissues of 5 samples used as the control group (FIG. 1 (a)).
また、マウスの皮膚にダニアレルゲンを塗布してアトピー性皮膚炎を発症させたアトピー性皮膚炎モデルマウスを用いて実験を行った。その結果、野生型マウスにおいては、ダニアレルゲン塗布により表皮肥厚、線維化、および好酸球性炎症などのアトピー性皮膚炎に特徴的な組織学的変化が生じた（図２(a)）。一方、ペリオスチン欠損マウスにおいては、これらのアトピー性皮膚炎に特徴的な組織学的変化が著明に軽減していた(図２(b))。 In addition, experiments were conducted using atopic dermatitis model mice in which mite allergen was applied to the skin of mice to develop atopic dermatitis. As a result, in wild-type mice, application of mite allergen resulted in histological changes characteristic of atopic dermatitis such as epidermal thickening, fibrosis, and eosinophilic inflammation (FIG. 2 (a)). On the other hand, in the periostin-deficient mice, these histological changes characteristic of atopic dermatitis were significantly reduced (FIG. 2 (b)).
さらに、マウス線維芽細胞２をコラーゲンゲル３と混合し、その上でマウス皮膚角化細胞１を培養する実験を行った(図４)。その結果、野生型マウス由来の線維芽細胞上では角化細胞が増殖・分化した（図３(a)）。一方、ペリオスチン欠損マウス由来の線維芽細胞上では角化細胞の増殖・分化が阻害されていた（図３(b)）。 Further, an experiment was conducted in which mouse fibroblasts 2 were mixed with collagen gel 3 and mouse skin keratinocytes 1 were cultured thereon (FIG. 4). As a result, keratinocytes proliferated and differentiated on fibroblasts derived from wild-type mice (FIG. 3 (a)). On the other hand, on the fibroblasts derived from periostin-deficient mice, the proliferation and differentiation of keratinocytes were inhibited (FIG. 3 (b)).
以上のように、アトピー性皮膚炎由来の組織においては、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が高いことから、本発明者らは、ペリオスチンが、アトピー性皮膚炎を検出するためのマーカーとして有用であることを見出した。 As described above, in the tissue derived from atopic dermatitis, since the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein is high, the present inventors have found that periostin is useful as a marker for detecting atopic dermatitis. I found out.
また、本発明は、ペリオスチンを産生する能力を有する細胞を候補物質の存在下で培養した場合におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定することを含む、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング方法も提供する。 The present invention also relates to a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis, comprising measuring the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein when cells having the ability to produce periostin are cultured in the presence of a candidate substance. A screening method is also provided.
上記のようにペリオスチン遺伝子は、アトピー性皮膚炎の患者由来の組織で発現レベルが増加し、患者由来の組織中のペリオスチンタンパク質レベルが高いので、患者に投与することにより組織でのペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を減少させる化合物またはその塩、例えば、発現を阻害する化合物またはその塩（ペプチド、タンパク質、合成化合物、もしくは抗ペリオスチン抗体、またはそれらの塩など）は、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤として使用し得る。 As described above, the expression level of periostin gene is increased in tissues derived from patients with atopic dermatitis, and the level of periostin protein in the tissues derived from patients is high. Compounds that reduce levels or periostin protein amounts or salts thereof, eg, compounds that inhibit expression or salts thereof (such as peptides, proteins, synthetic compounds, or anti-periostin antibodies, or salts thereof) prevent atopic dermatitis Can be used as a therapeutic agent.
さらに、ペリオスチンタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩も、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤として使用し得る。よって、本発明は、ペリオスチンと候補物質を接触させて、ペリオスチンの活性の変化を検出することを含む、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供する。 Furthermore, a compound that inhibits the activity of periostin protein or a salt thereof can also be used as a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis. Therefore, the present invention provides a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis, which comprises contacting periostin with a candidate substance to detect a change in the activity of periostin.
２．ペリオスチン
ペリオスチン(periostin)は、骨芽細胞特異因子2とも呼ばれる、約90kDaのタンパク質である(OSF2；Horiuchi K，Amizuka N, Takeshita S，Takamatsu H, Katsuura M, Ozawa H, Toyama Y，Bonewald LF, Kudo A．;Identification and characterization of a novel protein, periostin, with restricted expression to periosteum and periodontal ligament and increased expression by transforming growth factor beta．J Bone Miner Res．1999 Jul;14(7):1239−49.)。ペリオスチンには、alternative splicingによるC末側の長さの違いで区別できるいくつかの転写物が存在することが知られている。ここで、配列番号１に、ヒトのペリオスチン遺伝子の全てのエクソンによる転写産物のDNA配列を示す（Accession No. D13666）。また、ヒトのペリオスチンのその他のsplicing variantのDNA配列の例を、配列番号3、5に示す（それぞれ、Accession Nos. AY918092、AY140646）。また、配列番号2、4、6に、それぞれ、配列番号1、3、5のポリヌクレオチドによってコードされるペリオスチンのアミノ酸配列を示す。
2. Periostin Periostin is a protein of about 90 kDa, also called osteoblast-specific factor 2 (OSF2; Horiuchi K, Amizuka N, Takeshita S, Takamatsu H, Katsuura M, Ozawa H, Toyama Y, Bonairald LF, Kudo A .; Identification and characterization of a novel protein, periostin, with restricted expression to periosteum and periodontal ligament and increased expression by transforming growth factor beta. J Bone Miner Res. 1999 Jul; 14 (7): 1239-49.). It is known that periostin has several transcripts that can be distinguished by alternative splicing length differences on the C-terminal side. Here, SEQ ID NO: 1 shows the DNA sequences of transcripts of all exons of the human periostin gene (Accession No. D13666). Examples of DNA sequences of other splicing variants of human periostin are shown in SEQ ID NOs: 3 and 5 (Accession Nos. AY918092 and AY140646, respectively). SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 show the amino acid sequences of periostin encoded by the polynucleotides of SEQ ID NOs: 1, 3, and 5, respectively.
本発明の好ましい態様では、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその配列から派生するvariant（例えば、配列番号２、４または６で表されるアミノ酸配列からなるペリオスチン）を含むペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定する。 In a preferred embodiment of the present invention, the expression level of a periostin gene comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a variant derived from the sequence (for example, periostin comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6) Alternatively, the amount of periostin protein is measured.
３．本発明のアトピー性皮膚炎の検出方法または診断方法
ペリオスチン遺伝子またはペリオスチンタンパク質量は、アトピー性皮膚炎の患者由来の組織で発現が増加しているので、被験者由来の生体試料におけるペリオスチンは、アトピー性皮膚炎を検出または診断するためのマーカーとして利用し得る。すなわち、本発明は、生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定することを含む、アトピー性皮膚炎の検出方法を提供する。
3. The detection method or diagnosis method of atopic dermatitis of the present invention The expression of periostin gene or periostin protein is increased in tissues derived from patients with atopic dermatitis, so periostin in a biological sample derived from a subject is atopic. It can be used as a marker for detecting or diagnosing dermatitis. That is, the present invention provides a method for detecting atopic dermatitis, which comprises measuring the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in a biological sample.
より具体的には、例えば、(i)被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と、(ii)正常細胞におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量との比較を行う。具体的には、ペリオスチンタンパク質量またはペリオスチンをコードするｍＲＮＡ量を測定して比較する。 More specifically, for example, (i) the periostin gene expression level or periostin protein level in a subject-derived biological sample is compared with (ii) the periostin gene expression level or periostin protein level in normal cells. Specifically, the amount of periostin protein or the amount of mRNA encoding periostin is measured and compared.
発現レベルまたはタンパク質量の測定に用いる生体試料としては、例えば、被験者由来の、皮膚組織、または血液等を用いることができる。好ましくは、被験者由来の皮膚組織を用いる。皮膚組織、または血液等を採取する方法は、公知である。正常細胞は、例えば、アトピー性皮膚炎を患っていない者由来の細胞である。 As a biological sample used for measurement of expression level or protein amount, for example, skin tissue or blood derived from a subject can be used. Preferably, skin tissue derived from a subject is used. Methods for collecting skin tissue or blood are well known. The normal cell is, for example, a cell derived from a person who does not suffer from atopic dermatitis.
生体試料が皮膚組織等である場合には、発現レベルまたはタンパク質量の測定に利用するために、例えば、そのライセートを調製すること、またはmRNAを抽出することが好ましい。ライセートの調製およびmRNAの抽出は、公知の方法で行うことができ、例えば市販のキットを使用して行う。また、生体試料が、血液等の液状のものである場合には、例えば、緩衝液等で希釈してペリオスチンをコードするｍＲＮＡ量の測定などに利用するのが好ましい。 When the biological sample is skin tissue or the like, it is preferable to prepare, for example, a lysate or extract mRNA in order to use it for the measurement of expression level or protein amount. Lysate preparation and mRNA extraction can be performed by a known method, for example, using a commercially available kit. Further, when the biological sample is a liquid such as blood, it is preferably used, for example, for measurement of the amount of mRNA encoding periostin after dilution with a buffer solution or the like.
ペリオスチンタンパク質量の測定は、例えば、免疫測定法などにより行うことができる。好ましくは、免疫測定法で行う。免疫測定法としては、放射免疫測定法(RIA)、免疫蛍光測定法(FIA)、免疫発光測定法、酵素免疫測定法(例えば、Enzyme Immunoassay(EIA)、Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA))、またはWestern blot法などが挙げられる。 The amount of periostin protein can be measured, for example, by immunoassay. Preferably, the immunoassay is performed. Examples of the immunoassay include radioimmunoassay (RIA), immunofluorescence assay (FIA), immunoluminescence assay, enzyme immunoassay (e.g., Enzyme Immunoassay (EIA), Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA)), Or Western blot method etc. are mentioned.
RIAで標識に用いる放射性物質としては、例えば、125I、131I、14C、3H、35S、または32Pを利用することができる。 As a radioactive substance used for labeling by RIA, for example, 125 I, 131 I, 14 C, 3 H, 35 S, or 32 P can be used.
FIAで標識に用いる蛍光物質としては、例えば、Eu（ユーロピウム）、FITC、TMRITC、Cy3、PE、またはTexas-Redなどの蛍光物質を利用することができる。 As a fluorescent substance used for labeling by FIA, for example, a fluorescent substance such as Eu (europium), FITC, TMRITC, Cy3, PE, or Texas-Red can be used.
免疫発光測定法で標識に用いる発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等を用いることができる。 As the luminescent substance used for labeling in the immunoluminescence measurement method, for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like can be used.
酵素免疫測定法で標識に用いる酵素としては、例えば西洋わさびペルオキシターゼ（HRP）、アルカリホファターゼ（ALP）、グルコースオキシターゼ（GO）等を用いることができる。 Examples of enzymes used for labeling in enzyme immunoassay include horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (ALP), glucose oxidase (GO), and the like.
さらに、抗体または抗原と、これらの標識物質との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。 Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for the binding between an antibody or an antigen and these labeling substances.
ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法、例えば、プローブとしてペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプローブを用いるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとしてペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプライマーを用いるＰＣＲ法を用いて行うことができる。「ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプローブ」および「ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプライマー」は、後述の「アトピー性皮膚炎の検出薬または診断薬」の項で説明するものと同様である。 The amount of mRNA can be measured by a known method, for example, Northern hybridization using a probe designed from the base sequence of a gene encoding periostin as a probe, or a primer designed from a base sequence of a gene encoding periostin as a primer. The PCR method used can be used. “Probes designed from the base sequence of the gene encoding periostin” and “Primers designed from the base sequence of the gene encoding periostin” are described in the section “Detecting or diagnosing atopic dermatitis” below. The same as described.
そして、例えば、前記(i)の場合のペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が、前記(ii)の場合のペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と比較して高い場合、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％以上高い場合にアトピー性皮膚炎である、あるいはアトピー性皮膚炎が疑われると判断できる。 For example, when the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein in the case of (i) is higher than the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein in the case of (ii), for example, about 20% More than about 30%, about 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 95% or more, or about 100% or more It can be determined that atopic dermatitis is suspected or atopic dermatitis is suspected.
また、免疫組織化学により、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定するようにしても良い。より具体的には、例えば、(i)被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と、(ii)正常細胞におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量との比較を行う。 Alternatively, the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein may be measured by immunohistochemistry. More specifically, for example, (i) the periostin gene expression level or periostin protein level in a subject-derived biological sample is compared with (ii) the periostin gene expression level or periostin protein level in normal cells.
具体的には、免疫組織化学によりペリオスチンまたはペリオスチンをコードするmRNAを可視化し、ペリオスチンタンパク質量またはｍＲＮＡ量を比較する。生体試料としては、皮膚組織などが挙げられる。免疫組織化学としては、具体的には、酵素標識抗体法、または蛍光抗体法などが挙げられる。酵素標識抗体法としては、例えば、直接法、間接法、アビジン・ビオチン化ペリオキシダーゼ複合体法（ABC法）、もしくはストレプトアビジン・ビオチン化抗体法（SAB）法などの標識抗体法、またはペルオキシダーゼ・抗ペルオキシダーゼ法（PAP法）などの非標識抗体法が挙げられる。 Specifically, periostin or mRNA encoding periostin is visualized by immunohistochemistry, and the amount of periostin protein or mRNA is compared. Examples of the biological sample include skin tissue. Specific examples of immunohistochemistry include enzyme-labeled antibody method or fluorescent antibody method. Examples of the enzyme-labeled antibody method include a direct antibody method, an indirect method, a labeled antibody method such as an avidin / biotinylated peroxidase complex method (ABC method), a streptavidin / biotinylated antibody method (SAB) method, or a peroxidase / Examples include an unlabeled antibody method such as an anti-peroxidase method (PAP method).
蛍光抗体法としては、直接法、または間接法が挙げられる。 Examples of the fluorescent antibody method include a direct method and an indirect method.
標識に用いる酵素または蛍光物質としては、前記と同様のものが挙げられる。 Examples of the enzyme or fluorescent substance used for labeling include those described above.
そして、例えば、(i)の場合のペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が、(ii)の場合のペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と比較して高い場合、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、または約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％以上高い場合にアトピー性皮膚炎である、あるいはアトピー性皮膚炎が疑われると判断できる。 And, for example, when the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in (i) is higher than the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in (ii), for example, about 20% or more, About 30% or more, about 40% or more, about 50% or more, or about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 95% or more, or about 100% or more It can be determined that atopic dermatitis or atopic dermatitis is suspected.
ここで、(i)被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と(ii)正常細胞におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の差は、アトピー性皮膚炎の検出または診断の臨界値となるものであり、例えば次のように設定しても良い。 Here, (i) the difference between periostin gene expression level or periostin protein level in a biological sample derived from a subject and (ii) periostin gene expression level or periostin protein level in a normal cell is the difference in detection or diagnosis of atopic dermatitis. For example, the threshold value may be set as follows.
先ず、２例以上のアトピー性皮膚炎患者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定し、その平均値（Ａ）を求める。このとき、対象となる患者の例数は２例以上であり、例えば、５例以上、１０例以上、５０例以上、または１００例以上である。一方、２例以上の健常者由来の細胞におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定し、その平均値（Ｂ）を求める。このとき、対象となる健常者の例数は２例以上であり、例えば、５例以上、１０例以上、５０例以上、または１００例以上である。そして、求めた平均値ＡおよびＢから[（Ａ−Ｂ）／Ｂ]×１００（％）を計算して、アトピー性皮膚炎由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の平均値が健常者由来の細胞におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の平均値と比較して何％高いかを求める。このようにして求めた値を、 (i)被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と(ii)正常細胞におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の差（臨界値）として設定する。すなわち、(i)の場合のペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が、(ii)の場合のペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と比較して求めた差以上に高い場合(例えば、統計的に有意に高い場合)に、アトピー性皮膚炎である、またはアトピー性皮膚炎が疑われると判断できる。 First, the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in biological samples derived from two or more patients with atopic dermatitis is measured, and the average value (A) is obtained. At this time, the number of target patients is 2 or more, for example, 5 or more, 10 or more, 50 or more, or 100 or more. On the other hand, the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in cells derived from two or more healthy subjects is measured, and the average value (B) is obtained. At this time, the number of healthy persons to be targeted is 2 or more, for example, 5 or more, 10 or more, 50 or more, or 100 or more. Then, [(A−B) / B] × 100 (%) is calculated from the obtained average values A and B, and the expression level of the periostin gene or the average value of the periostin protein amount in the biological sample derived from atopic dermatitis Is higher than the average value of periostin gene expression level or periostin protein amount in cells derived from healthy subjects. The value obtained in this way is (i) the difference (critical value) between the expression level or periostin protein level of periostin gene in a biological sample derived from the subject and (ii) the expression level or periostin protein level of periostin gene in normal cells. Set. That is, when the periostin gene expression level or periostin protein amount in (i) is higher than the difference obtained by comparison with the periostin gene expression level or periostin protein amount in (ii) (for example, statistical If it is significantly higher, it can be determined that atopic dermatitis is suspected or atopic dermatitis is suspected.
尚、本発明のアトピー性皮膚炎の検出方法または診断方法では、生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定するので、測定値を平均値（Ａ）および（Ｂ）に組み入れて、対象となる患者の例数および対象となる健常者の例数を増やすのが好ましい。例数を増やすことにより、アトピー性皮膚炎の検出または診断の精度を高めることができる。また、求めた健常者由来の細胞におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の平均値（Ｂ）を、「(ii)正常細胞におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量」としても良い。 In the method for detecting or diagnosing atopic dermatitis of the present invention, the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein in the biological sample is measured. Therefore, the measured value is incorporated into the average values (A) and (B), It is preferable to increase the number of target patients and the number of healthy subjects. By increasing the number of cases, the accuracy of detection or diagnosis of atopic dermatitis can be increased. The average value (B) of the periostin gene expression level or periostin protein amount in the cells derived from healthy subjects may be determined as “(ii) periostin gene expression level or periostin protein amount in normal cells”.
上記アトピー性皮膚炎の検出結果または診断結果は、例えばアトピー性皮膚炎の確定診断を行う場合の補助とすることができる。アトピー性皮膚炎の確定診断を行う場合には、上記検出結果に加えて、理学所見の結果、血清学的検査の結果、および組織学的検査などからなる群から選択される少なくとも１つと組み合わせて、総合的に判断するようにしても良い。 The detection result or diagnosis result of the atopic dermatitis can be used, for example, as an aid when performing a definitive diagnosis of atopic dermatitis. When performing a definitive diagnosis of atopic dermatitis, in addition to the above detection results, in combination with at least one selected from the group consisting of physical findings, serological results, histological results, etc. , You may make it judge comprehensively.
４．アトピー性皮膚炎の検出薬または診断薬
本発明はアトピー性皮膚炎の検出薬または診断薬（以下、検出薬等とする。）を提供する。本発明の検出薬等は、(i)ペリオスチンを認識する抗体、(ii) ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプライマー、および(iii)ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプローブからなる群から選択される少なくとも１つを含有する。
本発明のある態様のアトピー性皮膚炎の検出薬等は、ペリオスチンを認識する抗体を含有する。抗体は、好ましくは、ペリオスチンを特異的に認識する抗体である。ペリオスチンを認識する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。ペリオスチンを認識する抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Milstein C, et al., 1983, Nature 305(5934): 537-40）である。例えば、ペリオスチンに対するポリクローナル抗体は、抗原（ペリオスチンまたはその部分ペプチド）を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
4). TECHNICAL FIELD The present invention provides a detection agent or a diagnostic agent for atopic dermatitis (hereinafter referred to as a detection agent or the like). The detection agent of the present invention was designed from (i) an antibody recognizing periostin, (ii) a primer designed from the base sequence of a gene encoding periostin, and (iii) a base sequence of a gene encoding periostin. Containing at least one selected from the group consisting of probes.
A detection agent for atopic dermatitis according to an embodiment of the present invention contains an antibody that recognizes periostin. The antibody is preferably an antibody that specifically recognizes periostin. Antibodies that recognize periostin can be obtained using techniques well known to those skilled in the art. The antibody that recognizes periostin is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody (Milstein C, et al., 1983, Nature 305 (5934): 537-40). For example, in the case of a polyclonal antibody against periostin, blood of a mammal sensitized with an antigen (periostin or a partial peptide thereof) is taken out, and serum is separated from this blood by a known method. As the polyclonal antibody, serum containing the polyclonal antibody can be used. Alternatively, a fraction containing a polyclonal antibody can be further isolated from this serum as necessary. In order to obtain a monoclonal antibody, immune cells are removed from a mammal sensitized with the antigen and fused with myeloma cells or the like. The thus obtained hybridoma can be cloned, and the antibody can be recovered from the culture to obtain a monoclonal antibody.
本発明の別の態様のアトピー性皮膚炎の検出薬等は、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプライマーを含有する。プライマーとして、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１，３，または５で表わされる塩基配列）から設計された、例えば、連続する少なくとも１５塩基（例えば、１５塩基以上、１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上、もしくは２０塩基以上）、および／または連続する１００塩基以下（例えば、１００塩基以下、７０塩基以下、６０塩基以下、もしくは５０塩基以下）、例えば、２０塩基以上５０塩基以下のポリヌクレオチドからなるプライマーを用いることができる。プライマーセットとして、フォワードプライマーとリバースプライマーの間の距離が、例えば、２５００塩基以下、１５００塩基以下、または５００塩基以下となるように設計することができる。プライマーは、例えば、RT-PCR法などでペリオスチン遺伝子の発現レベルが検出できるように設計する。プライマーの設計は、公知の手法を用いて行なうことができる。このように設計したプライマーは、例えば、配列番号１，３，もしくは５またはその一部（例えば、配列番号１，３，または５のうちの連続する少なくとも１５塩基）を含有するヌクレオチドである。必要に応じて、プライマーには、追加の配列を含めることも可能であり、例えば、タグ配列を付加することもできる。 The agent for detecting atopic dermatitis according to another aspect of the present invention contains a primer designed from the base sequence of the gene encoding periostin. The primer was designed from the base sequence of the gene encoding periostin (for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, or 5), for example, at least 15 consecutive bases (for example, 15 bases or more, 16 bases or more) 17 bases or more, 18 bases or more, 19 bases or more, or 20 bases or more), and / or 100 bases or less (for example, 100 bases or less, 70 bases or less, 60 bases or less, or 50 bases or less), for example, A primer comprising a polynucleotide of 20 bases or more and 50 bases or less can be used. The primer set can be designed such that the distance between the forward primer and the reverse primer is, for example, 2500 bases or less, 1500 bases or less, or 500 bases or less. The primer is designed so that the expression level of the periostin gene can be detected by, for example, RT-PCR. Primer design can be performed using a known method. The primer thus designed is, for example, a nucleotide containing SEQ ID NO: 1, 3, or 5 or a part thereof (for example, at least 15 consecutive bases of SEQ ID NO: 1, 3, or 5). If desired, the primer can include additional sequences, for example, tag sequences can be added.
本発明のさらに別の態様のアトピー性皮膚炎の検出薬等は、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプローブを含有する。プローブとして、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１，３，または５で表わされる塩基配列）から設計された、連続する少なくとも１５塩基（例えば、１５塩基以上、１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上、２０塩基以上、２１塩基以上、２２塩基以上、２３塩基以上、２４塩基以上、２５塩基以上、２６塩基以上、２７塩基以上、２８塩基以上、２９塩基以上、３０塩基以上、３５塩基以上、４０塩基以上、４５塩基以上、もしくは５０塩基以上）、および／または、連続する２５００塩基以下（例えば、２５００塩基以下、１０００塩基以下、５００塩基以下、もしくは１５０塩基以下）、例えば、塩基長５０〜１５０ｂｐのポリヌクレオチドからなるプローブを用いることができる。プローブは、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法などでペリオスチン遺伝子の発現レベルが検出できるように設計する。プローブの設計は、公知の手法を用いて行うことができる。このように設計したプローブは、例えば、配列番号１，３，もしくは５またはその一部（例えば、配列番号１，３，または５のうちの連続する少なくとも１５塩基）を含有するヌクレオチドである。また、プローブは、例えば、放射性標識として32Ｐなどで標識することができる。また、必要に応じ、プローブを蛍光標識、発光標識または酵素標識などで標識することもできる。当業者であれば、用いた標識物質に適切な検出方法で、ペリオスチン遺伝子の発現レベルを検出することができる。更に、プローブをビオチン化したものを用いることもでき、これをアビジン蛍光色素で処理し蛍光検出することも可能である。 The drug for detecting atopic dermatitis according to still another aspect of the present invention contains a probe designed from the base sequence of the gene encoding periostin. As a probe, at least 15 consecutive bases (for example, 15 bases or more, 16 bases or more, 17) designed from the base sequence of a gene encoding periostin (for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, or 5) More than base, more than 18 base, more than 19 base, more than 20 base, more than 21 base, more than 22 base, more than 23 base, more than 24 base, more than 25 base, more than 26 base, more than 27 base, more than 28 base, more than 29 base 30 bases or more, 35 bases or more, 40 bases or more, 45 bases or more, or 50 bases or more) and / or continuous 2500 bases or less (for example, 2500 bases or less, 1000 bases or less, 500 bases or less, or 150 bases) For example, a probe comprising a polynucleotide having a base length of 50 to 150 bp can be used. The probe is designed so that the expression level of the periostin gene can be detected by, for example, Northern hybridization. The design of the probe can be performed using a known method. The probe thus designed is, for example, a nucleotide containing SEQ ID NO: 1, 3, or 5 or a part thereof (for example, at least 15 consecutive bases of SEQ ID NO: 1, 3, or 5). The probe can be labeled with, for example, 32 P as a radioactive label. If necessary, the probe can be labeled with a fluorescent label, a luminescent label, an enzyme label, or the like. A person skilled in the art can detect the expression level of the periostin gene by a detection method suitable for the labeling substance used. Furthermore, a biotinylated probe can be used, and this can be treated with an avidin fluorescent dye to detect fluorescence.
本発明の検出薬等は、上記発明のアトピー性皮膚炎の検出方法または診断方法において使用することができる。 The detection agent or the like of the present invention can be used in the detection method or diagnosis method of atopic dermatitis of the above invention.
５．本発明のアトピー性皮膚炎の検出用キットまたは診断用キット
本発明は、前記アトピー性皮膚炎の検出方法または診断方法に使用することができるキットを提供する。
本発明のキットは、ペリオスチンを認識する抗体、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプライマー、およびペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプローブからなる群から選択される少なくとも１つを含有する。本発明のいくつかの態様のキットは、ペリオスチンを認識する抗体、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプライマー、またはペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプローブを含有する。「ペリオスチンを認識する抗体」、「ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプライマー」、および「ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプローブ」は、前記説明したのと同様である。
本発明のキットは、上記の他に、容器およびラベルを含んでいてもよい。容器上のまたは容器に伴うラベルには、キットがアトピー性皮膚炎の検出または診断に使用されることが示されていてもよい。また、他のアイテム、例えば、使用説明書等がさらに含まれていてもよい。
5. Detection Kit or Diagnosis Kit for Atopic Dermatitis of the Present Invention The present invention provides a kit that can be used for the detection method or diagnosis method for atopic dermatitis.
The kit of the present invention is at least one selected from the group consisting of an antibody recognizing periostin, a primer designed from the base sequence of the gene encoding periostin, and a probe designed from the base sequence of the gene encoding periostin. Containing. The kit of some embodiments of the present invention contains an antibody that recognizes periostin, a primer designed from the base sequence of a gene encoding periostin, or a probe designed from the base sequence of a gene encoding periostin. “An antibody recognizing periostin”, “a primer designed from the base sequence of a gene encoding periostin”, and “a probe designed from the base sequence of a gene encoding periostin” are the same as described above. .
In addition to the above, the kit of the present invention may contain a container and a label. The label on or associated with the container may indicate that the kit is used for detection or diagnosis of atopic dermatitis. In addition, other items such as instructions for use may be further included.
６．本発明のスクリーニング方法
ペリオスチン遺伝子は、アトピー性皮膚炎の患者由来の組織で発現が増加しているので、投与したときに患者の組織でペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を減少させる化合物またはその塩、例えば、発現を阻害する化合物またはその塩は、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤として使用し得る。すなわち、本発明は、ペリオスチンを産生する能力を有する細胞を候補物質の存在下で培養した場合におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定することを含む、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
6). Since the expression of periostin gene is increased in tissues derived from patients with atopic dermatitis, the compound that decreases the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in the patient tissues when administered is given A salt such as a compound that inhibits expression or a salt thereof can be used as a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis. That is, the present invention includes measuring the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein, comprising measuring the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein when cells having the ability to produce periostin are cultured in the presence of a candidate substance. A method of screening for a compound or a salt thereof that decreases the above is provided.
より具体的には、例えば、(i)ペリオスチンを産生する能力を有する細胞を候補物質の存在下で培養した場合と、(ii)ペリオスチンを産生する能力を有する細胞を候補物質の非存在下で培養した場合との間でペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の比較を行う。比較は、例えば、(i)と(ii)の場合における、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定して、比較する。 More specifically, for example, (i) when cells having the ability to produce periostin are cultured in the presence of a candidate substance, and (ii) cells having the ability to produce periostin are obtained in the absence of the candidate substance. The expression level of periostin gene or the amount of periostin protein is compared with the case of culturing. In the comparison, for example, in the cases (i) and (ii), the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein is measured and compared.
具体的には、(i)と(ii)の場合における、ペリオスチンタンパク質量またはペリオスチンをコードするｍＲＮＡ量を測定して比較する。ペリオスチンを産生する能力を有する細胞としては、例えば、アトピー性皮膚炎患者由来の線維芽細胞、ダニ抗原塗布したマウスの線維芽細胞、あるいはペリオスチンをコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された細胞などが挙げられる。 Specifically, the amount of periostin protein or the amount of mRNA encoding periostin in the cases (i) and (ii) is measured and compared. Examples of cells having the ability to produce periostin include, for example, fibroblasts derived from patients with atopic dermatitis, mouse fibroblasts coated with mite antigen, or cells transformed with a vector containing periostin-encoding DNA. Etc.
形質転換する細胞としては、例えば、CHO細胞、およびHEK293細胞などが挙げられる。形質転換された細胞の培養は、公知の方法で行うことができる。 Examples of cells to be transformed include CHO cells and HEK293 cells. Culture of the transformed cells can be performed by a known method.
候補物質としては、例えば、抗体、ペプチド、タンパク質、合成化合物、またはそれらの塩などが挙げられる。 Examples of candidate substances include antibodies, peptides, proteins, synthetic compounds, or salts thereof.
ペリオスチンタンパク質量の測定は、例えば、前記した免疫測定法またはプロテインチップ法により行うことができる。 The amount of periostin protein can be measured, for example, by the above-described immunoassay or protein chip method.
ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法、例えば、プローブとして配列番号１，３，もしくは５またはその一部を含有するヌクレオチドを用いるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとして配列番号１，３，もしくは５またはそれらの一部を含有するヌクレオチドを用いるＰＣＲ法を用いて行うことができる。 The amount of mRNA is measured by a known method, for example, Northern hybridization using nucleotides containing SEQ ID NO: 1, 3, or 5 or a part thereof as a probe, or SEQ ID NO: 1, 3, or 5 or a primer thereof. It can be performed using a PCR method using a nucleotide containing a part.
そして、例えば、(i)の場合のペリオスチンの発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を、(ii)の場合のペリオスチンの発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と比較して減少させる、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％以上減少させる候補物質を、ペリオスチン遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。 Then, for example, the periostin expression level or periostin protein amount in (i) is decreased as compared to the periostin expression level or periostin protein amount in (ii), for example, about 20% or more, about 30 %, About 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 95% or more, or about 100% or more It can be selected as a compound or a salt thereof that inhibits gene expression.
また、ペリオスチンタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩も、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤として使用し得る。よって、本発明は、ペリオスチンと候補物質を接触させて、ペリオスチンの活性の変化を検出することを含む、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供する。 Moreover, the compound or its salt which inhibits the activity of periostin protein can also be used as a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis. Therefore, the present invention provides a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis, which comprises contacting periostin with a candidate substance to detect a change in the activity of periostin.
候補物質としては、例えば、抗体（例えば、抗ペリオスチン抗体）、ペプチド、タンパク質、合成化合物、またはそれらの塩などが挙げられる。 Examples of candidate substances include antibodies (for example, anti-periostin antibodies), peptides, proteins, synthetic compounds, or salts thereof.
「接触」とは、例えば、ペリオスチン遺伝子を発現する細胞またはその細胞抽出液と候補物質とを同一の反応系または培養系に存在させること、精製したペリオスチンと候補物質とを同一の反応系に存在させることなどが挙げられる。さらに具体的には、細胞培養器に候補物質を添加すること、細胞と候補物質とを混合すること、細胞を候補物質の存在下で培養すること、細胞抽出液と候補物質とを混合すること、精製したペリオスチンと候補物質とを混合することなどが挙げられる。 “Contact” means, for example, that a cell expressing periostin gene or a cell extract thereof and a candidate substance are present in the same reaction system or culture system, or purified periostin and a candidate substance are present in the same reaction system. For example. More specifically, adding a candidate substance to the cell incubator, mixing the cell and the candidate substance, culturing the cell in the presence of the candidate substance, and mixing the cell extract and the candidate substance And a mixture of purified periostin and a candidate substance.
「ペリオスチンの活性」とは、例えば、細胞接着を阻害する活性、皮膚角化細胞を活性化する活性、線維芽細胞を活性化する活性、細胞外マトリックスタンパク質と結合する活性、細胞表面分子と結合する活性、細胞増殖因子と結合する活性、または細胞遊走活性などが挙げられる。ペリオスチンの活性は、公知の方法を用いて検出することができる。例えば、細胞外マトリックスタンパク質と結合する活性は、フィブロネクチン、テネシンＣ，コラーゲンをコートしてペリオスチンを混合することで評価できる（J Allergy Clin Immunol, vol.118, 98-104, 2006）。また、皮膚角化細胞または線維芽細胞を活性化する活性については、細胞とペリオスチンを混合して細胞内のAkt分子のリン酸化により評価できる（Cancer Cell, vol.5, 329-339, 2004）。 “Periostin activity” refers to, for example, activity that inhibits cell adhesion, activity that activates skin keratinocytes, activity that activates fibroblasts, activity that binds to extracellular matrix proteins, and binding to cell surface molecules Activity, binding activity to cell growth factor, cell migration activity and the like. The activity of periostin can be detected using a known method. For example, the activity of binding to extracellular matrix protein can be evaluated by coating fibronectin, tennessin C and collagen and mixing periostin (J Allergy Clin Immunol, vol. 118, 98-104, 2006). In addition, the activity to activate skin keratinocytes or fibroblasts can be evaluated by mixing cells with periostin and phosphorylating intracellular Akt molecules (Cancer Cell, vol.5, 329-339, 2004) .
そして、ペリオスチンの活性を変化させる候補物質、例えば、ペリオスチンの活性を対照と比較して減少させる、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％以上減少させる候補物質を、ペリオスチンタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。ここで、対照は、例えば、候補物質の非存在下でのペリオスチンの活性である。 Then, a candidate substance that changes the activity of periostin, for example, the activity of periostin is decreased as compared to the control, for example, about 20% or more, about 30% or more, about 40% or more, about 50% or more, about 60% The candidate substance that decreases about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 95% or more, or about 100% or more can be selected as a compound that inhibits the activity of periostin protein or a salt thereof. . Here, the control is, for example, the activity of periostin in the absence of the candidate substance.
さらに、インテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合量、thymic stromal lymphopoietin産生量または皮膚角化細胞の分化・増殖活性を低下させる化合物またはその塩も、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤として使用し得る。よって、本発明は、インテグリンαV /β3とペリオスチンとを、候補物質の存在下で接触させた場合における、インテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合量、thymic stromal lymphopoietin産生量または皮膚角化細胞の分化・増殖活性を測定することを含む、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供する。 In addition, compounds that reduce the amount of integrin α V / β 3 binding to periostin, the amount of thymic stromal lymphopoietin produced, or the differentiation / proliferation activity of skin keratinocytes, or their salts are also used as prophylactic / therapeutic agents for atopic dermatitis Can do. Accordingly, the present invention provides a integrin α V / β 3 and periostin, when contacted in the presence of a candidate substance, the amount of binding between the integrin α V / β 3 and periostin, thymic Stromal lymphopoietin production amount or skin stratum Provided is a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis, which comprises measuring differentiation / proliferation activity of cells.
ここで、「インテグリンαV/β3」とは、インテグリンαVとインテグリンβ3との複合体を意味する。 Here, “integrin α V / β 3 ” means a complex of integrin α V and integrin β 3 .
本発明のいくつかの態様では、(i)候補物質の存在下でインテグリンαV /β3とペリオスチンとを接触させた場合におけるインテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合量またはthymic stromal lymphopoietin産生量と、(ii)候補物質の非存在下でインテグリンαV /β3とペリオスチンとを接触させた場合におけるインテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合量またはthymic stromal lymphopoietin産生量との比較を行う。ここで、「接触」とは、例えば、インテグリンαV /β3遺伝子を発現する細胞またはその細胞抽出液とペリオスチンとを同一の反応系または培養系に存在させること、精製したインテグリンαV /β3とペリオスチンとを同一の反応系に存在させることなどが挙げられる。さらに具体的には、細胞培養器にペリオスチンを添加すること、細胞とペリオスチンとを混合すること、細胞をペリオスチンの存在下で培養すること、細胞抽出液とペリオスチンとを混合すること、精製したインテグリンαV /β3とペリオスチンとを混合することなどが挙げられる。 In some embodiments of the present invention, (i) binding amount or thymic Stromal lymphopoietin production of integrin α V / β 3 and periostin In the case of contacting the integrin α V / β 3 and periostin in the presence of the candidate substance and amount, compared with the amount bound or thymic Stromal lymphopoietin production amount of integrin α V / β 3 and periostin in the case of contacting and (ii) a integrin α V / β 3 in the absence of the candidate substance and periostin Do. Here, “contact” means, for example, the presence of a cell expressing the integrin α V / β 3 gene or its cell extract and periostin in the same reaction system or culture system, or purified integrin α V / β 3 and periostin may be present in the same reaction system. More specifically, adding periostin to a cell culture vessel, mixing cells and periostin, culturing cells in the presence of periostin, mixing cell extract and periostin, purified integrin Examples thereof include mixing α V / β 3 and periostin.
好ましくは、インテグリンαV /β3とペリオスチンとの接触を、インテグリンαV /β3を発現する細胞、特には、インテグリンαV /β3を細胞表面に発現する細胞とペリオスチンとを接触することにより行う。すなわち、(i)候補物質の存在下でインテグリンαV /β3を発現する細胞とペリオスチンとを接触させた場合におけるインテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合量またはthymic stromal lymphopoietin産生量と、(ii)候補物質の非存在下でインテグリンαV /β3を発現する細胞とペリオスチンとを接触させた場合におけるインテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合量またはthymic stromal lymphopoietin産生量との比較を行う。 Preferably, contact between integrin α V / β 3 and periostin is performed by contacting periostin with a cell expressing integrin α V / β 3 , particularly a cell expressing integrin α V / β 3 on the cell surface. To do. That is, (i) the amount of integrin α V / β 3 binding to periostin or the amount of thymic stromal lymphopoietin produced when periostin is contacted with a cell expressing integrin α V / β 3 in the presence of a candidate substance, (ii) Comparison of the amount of integrin α V / β 3 binding to periostin or the amount of thymic stromal lymphopoietin produced when periostin is contacted with a cell expressing integrin α V / β 3 in the absence of a candidate substance I do.
インテグリンαV /β3を発現する細胞、特には、インテグリンαV /β3を細胞表面に発現する細胞としては、内因性インテグリンαV /β3発現細胞またはインテグリンαV /β3をコードするDNAを含有するベクターで形質転換された細胞などが挙げられる。 Cells that express integrin α V / β 3 , especially cells that express integrin α V / β 3 on the cell surface, encode endogenous integrin α V / β 3 expressing cells or integrin α V / β 3 Examples thereof include cells transformed with a vector containing DNA.
内因性インテグリンαV /β3発現細胞としては、例えば、皮膚角化細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、腸管平滑筋細胞、子宮平滑筋細胞または活性化マクロファージ、破骨細胞、ある種のがん細胞などを挙げることができる。内因性インテグリンαV /β3発現細胞は、好ましくは、皮膚角化細胞である。内因性インテグリンαV /β3発現細胞は、上記例示した細胞を不死化した細胞でもよい。不死化細胞は、公知の方法で得ることができ、例えば、上記例示した細胞に、ウイルス(例、SV40およびHPV)を感染させて細胞を不死化する遺伝子を導入することにより得ることができる。不死化細胞の培養は、公知の方法で行うことができる。 Endogenous integrin α V / β 3 expressing cells include, for example, skin keratinocytes, vascular endothelial cells, fibroblasts, intestinal smooth muscle cells, uterine smooth muscle cells or activated macrophages, osteoclasts, and certain types of cells. Can include cells. The endogenous integrin α V / β 3 expressing cells are preferably skin keratinocytes. The endogenous integrin α V / β 3 expressing cell may be a cell obtained by immortalizing the cell exemplified above. Immortalized cells can be obtained by a known method, for example, by infecting the cells exemplified above with a virus (eg, SV40 and HPV) and introducing a gene that immortalizes the cells. Culture of immortalized cells can be performed by a known method.
形質転換する細胞としては、微生物細胞または動物細胞（例、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞など）が好ましく、例えば、マウス初代培養線維芽細胞、SW480細胞、NIH3T3細胞、HerLa細胞、HaCat細胞、MRC5細胞、CHO細胞、HEK293細胞などが挙げられる。本発明のさらに好ましい態様では、形質転換する細胞は、形質転換後に、インテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合によりthymic stromal lymphopoietinを産生するような細胞であり、例えば、皮膚角化細胞、腸管上皮細胞（初代培養細胞、細胞株）などを挙げることができる。形質転換細胞の培養は、公知の方法で行うことができる。 The cells to be transformed are preferably microbial cells or animal cells (eg, human cells, mouse cells, rat cells, etc.). For example, mouse primary cultured fibroblasts, SW480 cells, NIH3T3 cells, HerLa cells, HaCat cells, MRC5 Examples include cells, CHO cells, HEK293 cells and the like. In a further preferred embodiment of the present invention, the cell to be transformed is a cell that produces thymic stromal lymphopoietin by the combination of integrin α V / β 3 and periostin after transformation, for example, skin keratinocytes, intestinal tract Examples include epithelial cells (primary cultured cells, cell lines). Culture of transformed cells can be performed by a known method.
ここで、配列番号８に、インテグリンαV遺伝子のDNA配列を示す(Accession No. BC136442.1)。また、配列番号１０に、インテグリンβ3遺伝子のDNA配列を示す(Accession No. BC127666.1)。配列番号９、１１は、それぞれ、配列番号８、１０によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す。 Here, SEQ ID NO: 8 shows the DNA sequence of the integrin alpha V gene (Accession No. BC136442.1). Further, in SEQ ID NO: 10 shows the DNA sequence of the integrin beta 3 gene (Accession No. BC127666.1). SEQ ID NOs: 9 and 11 show the amino acid sequences of the proteins encoded by SEQ ID NOs: 8 and 10, respectively.
本発明の別のいくつかの態様では、(i)候補物質の存在下でインテグリンαV /β3とペリオスチンとを接触させた場合における皮膚角化細胞の分化・増殖活性と、(ii)候補物質の非存在下でインテグリンαV /β3とペリオスチンとを接触させた場合における皮膚角化細胞の分化・増殖活性との比較を行う。ここで、「接触」とは、例えば、インテグリンαV /β3遺伝子を発現する細胞またはその細胞抽出液とペリオスチンとを同一の反応系または培養系に存在させることなどが挙げられる。さらに具体的には、細胞培養器にペリオスチンを添加すること、細胞とペリオスチンとを混合すること、細胞をペリオスチンの存在下で培養すること、細胞抽出液とペリオスチンとを混合することなどが挙げられる。 In some other embodiments of the present invention, (i) differentiation / proliferation activity of skin keratinocytes when integrin α V / β 3 is contacted with periostin in the presence of a candidate substance, and (ii) a candidate Comparison is made with the differentiation / proliferation activity of skin keratinocytes when integrin α V / β 3 is contacted with periostin in the absence of a substance. Here, “contact” includes, for example, causing cells expressing the integrin α V / β 3 gene or a cell extract thereof and periostin to exist in the same reaction system or culture system. More specifically, adding periostin to the cell culture vessel, mixing cells and periostin, culturing cells in the presence of periostin, mixing cell extract and periostin, etc. .
候補物質としては、例えば、抗体、ペプチド、タンパク質、合成化合物、またはそれらの塩などが挙げられる。 Examples of candidate substances include antibodies, peptides, proteins, synthetic compounds, or salts thereof.
インテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合量は、免疫沈降法、プルダウンアッセイ、BIAcoreを用いたアッセイ、ELISA(enzyme linked immune solvent assay)、ウエスタンブロットなどの免疫化学的方法により測定することができる。 The amount of integrin α V / β 3 binding to periostin can be measured by immunoprecipitation methods such as immunoprecipitation, pull-down assay, BIAcore assay, ELISA (enzyme linked immune solvent assay), and Western blot. .
thymic stromal lymphopoietin(TSLP)産生量は、例えば、免疫測定法などにより行うことができる。免疫測定法としては、放射免疫測定法(RIA)、免疫蛍光測定法(FIA)、免疫発光測定法、酵素免疫測定法(例えば、Enzyme Immunoassay(EIA)、Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA))、またはWestern blot法などが挙げられる。
あるいは、TSLPの産生量は、TSLPのｍRNA量を測定することにより行うこともできる。mRNAの測定は、公知の方法、例えば、プローブとしてインテグリンαVまたはインテグリンβ3をコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプローブをいるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとしてインテグリンαVまたはインテグリンβ3をコードする遺伝子の塩基配列から設計されたプライマーを用いるPCR法を用いて行うことができる。プローブおよびプライマーは公知の方法により設計できる。
The amount of thymic stromal lymphopoietin (TSLP) produced can be determined by, for example, immunoassay. Examples of the immunoassay include radioimmunoassay (RIA), immunofluorescence assay (FIA), immunoluminescence assay, enzyme immunoassay (e.g., Enzyme Immunoassay (EIA), Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA)), Or Western blot method etc. are mentioned.
Alternatively, the amount of TSLP produced can be determined by measuring the amount of TSLP mRNA. mRNA is measured by a known method, for example, Northern hybridization using a probe designed from the nucleotide sequence of the gene encoding integrin α V or integrin β 3 as a probe, or encoding integrin α V or integrin β 3 as a primer. PCR can be carried out using a primer designed from the base sequence of the gene. Probes and primers can be designed by known methods.
皮膚角化細胞の分化・増殖活性は、例えば、インテグリンαV /β3とペリオスチンとの接触に続き、放射ラベルしたチミジン（例えば、[3H]-TdR）を培養液中に添加し、さらに５〜２４時間、好ましくは８〜１６時間培養する。培養後のチミジンの取り込み量をシンチレーションカウンターで測定することにより、皮膚角化細胞の増殖活性を確認することができる。候補物質は、チミジンの添加前、添加時又は添加後に培養液に加えればよいが、チミジンの添加前、つまりインテグリンαV /β3とペリオスチンとの接触時に加えることが好ましい。 Skin keratinocyte differentiation / proliferation activity, for example, following contact of integrin α V / β 3 with periostin, radiolabeled thymidine (eg [ 3 H] -TdR) is added to the culture, Incubate for 5 to 24 hours, preferably 8 to 16 hours. The proliferation activity of skin keratinocytes can be confirmed by measuring the amount of thymidine incorporation after culture with a scintillation counter. The candidate substance may be added to the culture solution before, during, or after the addition of thymidine, but is preferably added before the addition of thymidine, that is, at the time of contact between integrin α V / β 3 and periostin.
そして、例えば、(i)の場合のインテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合量を、(ii)の場合のインテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合量と比較して減少させる、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％以上減少させる候補物質を、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤として選択することができる。 And, for example, the amount of binding between integrin α V / β 3 and periostin in the case of (i) is reduced compared to the amount of binding of integrin α V / β 3 and periostin in the case of (ii), for example About 20% or more, about 30% or more, about 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 95% or more, or about 100% Candidate substances to be reduced as described above can be selected as a preventive / therapeutic agent for atopic dermatitis.
あるいは、例えば、(i)の場合のTSLP産生量を、(ii)の場合のTSLP産生量と比較して減少させる、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％以上減少させる候補物質を、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤として選択することができる。 Alternatively, for example, the amount of TSLP produced in (i) is decreased compared to the amount of TSLP produced in (ii), for example, about 20% or more, about 30% or more, about 40% or more, about 50 % Or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 95% or more, or about 100% or more candidate substances are selected as prophylactic / therapeutic agents for atopic dermatitis can do.
あるいは、例えば、(i)の場合の皮膚角化細胞の分化・増殖活性を、(ii)の場合の皮膚角化細胞の分化・増殖活性と比較して減少させる、例えば、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％以上減少させる候補物質を、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤として選択することができる。 Alternatively, for example, the differentiation / proliferation activity of skin keratinocytes in the case of (i) is decreased as compared with the differentiation / proliferation activity of skin keratinocytes in the case of (ii), for example, about 20% or more, Candidate substances that reduce about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 95%, or about 100% or more It can be selected as a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis.
７．本発明のスクリーニング用キット
本発明は、上記アトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング方法に使用することができるキットを提供する。具体的には、前記キットは、ペリオスチンを産生する能力を有する細胞、および／またはインテグリンαV /β3を発現する細胞を含む。本発明のいつくかの態様のキットは、ペリオスチンを産生する能力を有する細胞、またはインテグリンαV /β3を発現する細胞を含む。「ペリオスチンを産生する能力を有する細胞」および「インテグリンαV /β3を発現する細胞」は、前記本発明のスクリーニング方法で説明した通りである。前記キットは、さらに、細胞培養用培地、培地に添加する抗生物質、血清（ウシ胎児血清等）などを含んでいても良い。
また、前記キットは、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定するための成分を含んでいても良い。そのような成分として、例えば、ペリオスチン遺伝子の塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、ペリオスチンタンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体などが挙げられる。これらのポリヌクレオチドおよび抗体は、前記と同様である。
あるいは、前記キットは、インテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合量、thymic stromal lymphopoietin産生量または皮膚角化細胞の分化・増殖活性を測定するための成分を含んでいても良い。
前記キットは、上記の他に、容器およびラベルを含んでいてもよい。容器上のまたは容器に伴うラベルには、キットがアトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニングに使用されることが示されていてもよい。また、他のアイテム、例えば、使用説明書等がさらに含まれていてもよい。
7). The screening kit of the present invention The present invention provides a kit that can be used in the screening method for the prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis. Specifically, the kit includes cells that have the ability to produce periostin and / or cells that express the integrin α V / β 3 . The kit of some embodiments of the present invention comprises cells that have the ability to produce periostin or cells that express the integrin α V / β 3 . “Cells having the ability to produce periostin” and “cells expressing integrin α V / β 3 ” are as described in the screening method of the present invention. The kit may further contain a cell culture medium, antibiotics added to the medium, serum (fetal bovine serum, etc.) and the like.
Further, the kit may contain a component for measuring the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein. Examples of such components include a polynucleotide containing the base sequence of the periostin gene or a part thereof, and an antibody that recognizes a peptide containing the amino acid sequence of periostin protein. These polynucleotides and antibodies are the same as described above.
Alternatively, the kit may contain components for measuring the amount of integrin α V / β 3 and periostin bound, the amount of thymic stromal lymphopoietin produced, or the differentiation / proliferation activity of skin keratinocytes.
In addition to the above, the kit may include a container and a label. The label on or accompanying the container may indicate that the kit is used for screening for a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis. In addition, other items such as instructions for use may be further included.
８．本発明の医薬組成物
本発明は、上記本発明のスクリーニング方法により得られた化合物またはその塩を含む、アトピー性皮膚炎の予防・治療用医薬組成物を提供する。本発明のいくつかの態様の医薬組成物は、インテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合を阻害する抗体を含む。好ましくは、インテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合を阻害する抗体は、抗インテグリンαV抗体である。
8). Pharmaceutical composition of the present invention The present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of atopic dermatitis, comprising the compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof. The pharmaceutical composition of some embodiments of the present invention comprises an antibody that inhibits the binding of integrin α V / β 3 to periostin. Preferably, the antibody that inhibits the binding between integrin α V / β 3 and periostin is an anti-integrin α V antibody.
インテグリンαV /β3とペリオスチンとの結合を阻害する抗体は、市販のものを用いても良いし、公知の方法で製造するようにしても良い。市販のものとしては、例えば、BioLegendから入手できる抗インテグリンαV抗体を挙げることができる。 As the antibody that inhibits the binding between integrin α V / β 3 and periostin, a commercially available antibody may be used, or a known method may be used. Commercially available ones include, for example, anti-integrin alpha V antibody available from BioLegend.
本発明の医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物またはその塩を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
本発明の医薬組成物の適用の対象となる疾患は、アトピー性皮膚炎である。
The pharmaceutical composition of the present invention is preferably provided in the form of a pharmaceutical composition comprising the compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof as an active ingredient and further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
The disease to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied is atopic dermatitis.
「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、１つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。 "Pharmaceutically acceptable carrier" refers to excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, colorants, sweeteners, thickeners, taste masking Agents, solubilizers or other additives. By using one or more of such carriers, pharmaceutical compositions in the form of injections, solutions, capsules, suspensions, emulsions or syrups can be prepared. These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally. Other forms for parenteral administration include injections that contain one or more active substances and are prescribed by conventional methods. In the case of an injection, it can be produced by dissolving or suspending it in a pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection.
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される活性成分である化合物またはその塩の種類などにより異なるが、例えば、活性成分が、抗インテグリンαV抗体である場合、通常成人一人当たり、一回につき１００μgから１０００mgの範囲で投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。 The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention depends on the patient's age, sex, weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the type of compound or salt thereof which is an active ingredient contained in the pharmaceutical composition. different, for example, the active ingredient, if an anti-integrin alpha V antibody, usually per adult can be administered in the range of 1000mg of 100μg per time, but is not limited to this range.
例えば抗インテグリンαV抗体を注射剤により投与する場合は、アトピー性皮膚炎に罹患しているヒト患者に対し、１回の投与において1kg体重あたり、１０μg〜１００mgの量を、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。 For example, when an anti-integrin α V antibody is administered by injection, a dose of 10 μg to 100 mg per kg body weight is administered once a day to a human patient suffering from atopic dermatitis. Can be administered several times. Examples of the administration form include intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, and intraperitoneal injection, and intravenous injection is preferred. In addition, injections can be prepared as non-aqueous diluents (eg, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol), suspensions, and emulsions. Such sterilization of the injection can be performed by filtration sterilization using a filter, blending of a bactericide, and the like. The injection can be produced as a form prepared at the time of use. That is, it can be used as a sterile solid composition by lyophilization, etc., and dissolved in sterile water for injection or other solvents before use.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
（１）ウサギポリクローナル抗ペリオスチン抗体の作製
ペリオスチン（ヌクレオチド配列：配列番号１、Accession No.D13666；アミノ酸配列：配列番号２、Accession No. BAA02837）にV5エピトープ／Hisタグを付加させたリコンビナントタンパク質を昆虫細胞であるS2細胞において発現させた上で精製した。
(1) Production of Rabbit Polyclonal Anti-Periostin Antibody Recombinant protein in which V5 epitope / His tag is added to periostin (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 1, Accession No. D13666; amino acid sequence: SEQ ID NO: 2, Accession No. BAA02837) is an insect The cells were expressed in S2 cells and purified.
具体的には、S2細胞の形質転換体は次のように作製した。pMT/Bip/V5-HisAプラスミド（Invitrogen,Carlsbad, CA）にペリオスチンの上記部分をコードするcDNAを挿入して、これをpMT/Bip/V5-HisA-periostinとした。S2細胞にpMT/Bip/V5-HisA-periostin及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるpCoHygro（Invitrogen）を公知の方法で共導入し、形質転換した。ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得た。 Specifically, S2 cell transformants were prepared as follows. A cDNA encoding the above-mentioned part of periostin was inserted into pMT / Bip / V5-HisA plasmid (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), and this was designated as pMT / Bip / V5-HisA-periostin. PCoHygro (Invitrogen), a plasmid expressing pMT / Bip / V5-HisA-periostin and a hygromycin resistance gene, was co-introduced and transformed into S2 cells by a known method. A transformant was selected with hygromycin to obtain a stable transformant.
そして、S2細胞の形質転換体では、V5エピトープ／Hisタグの結合したペリオスチンを発現させた。 And in the transformant of S2 cells, periostin to which a V5 epitope / His tag was bound was expressed.
リコンビナントタンパク質の精製は次のように行った。ペリオスチン遺伝子安定形質転換体S2細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、リコンビナントタンパク質の発現を誘導した。これにより、リコンビナントタンパク質は培養上清中に発現分泌された。この培養上清をPBSに透析した後、ニッケルレジン（Ni-NTA Agarose, Qiagen, Hilden, Germany）と混合して、リコンビナントタンパク質をレジンに結合させた。レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてリコンビナンタンパク質を溶出した。溶出されたリコンビナントタンパク質をPBSに透析し、これを動物の免疫原とした。 Recombinant protein was purified as follows. Recombinant protein expression was induced by adding copper sulfate to the medium of periostin gene stable transformant S2 cells. Thereby, the recombinant protein was expressed and secreted into the culture supernatant. The culture supernatant was dialyzed against PBS and then mixed with nickel resin (Ni-NTA Agarose, Qiagen, Hilden, Germany) to bind the recombinant protein to the resin. The resin was washed to remove impurities, and the recombinant protein was eluted with an imidazole-containing buffer. The eluted recombinant protein was dialyzed against PBS and used as an animal immunogen.
次に、これらのリコンビナントタンパク質をCFA（完全フロイントアジュバント）（Sigma社製のFreund's Adjuvant, Complete）と混合してラビットに免疫し、その後血清を採取した。 Next, these recombinant proteins were mixed with CFA (Complete Freund's Adjuvant) (Sigma's Freund's Adjuvant, Complete) to immunize rabbits, and then serum was collected.
具体的な手順は次の通りである。ラビットとして、New Zealand Whiteラビット, 雌、体重1.5-2 kg（ケービーティーオリエンタル、鳥栖）を用いた。 The specific procedure is as follows. As a rabbit, New Zealand White rabbit, female, body weight 1.5-2 kg (KB Tea Oriental, Tosu) was used.
これらのラビットは、免疫原であるリコンビナントペリオスチンとCFAの混合物をラビット背部皮下数カ所に注射することにより免疫した。 These rabbits were immunized by injecting a mixture of recombinant periostin, which is an immunogen, and CFA, into several subcutaneous sites on the back of the rabbit.
免疫の５〜７週後、免疫ラビットの耳静脈より注射針と注射器を用いて採血し、血清を得た。 Five to seven weeks after immunization, blood was collected from the ear vein of the immunized rabbit using a needle and a syringe to obtain serum.
最後に、血清からIgGを次のように精製した。すなわち、採取した血清に二倍量の50 mM酢酸ナトリウム（pH4.0）を加えた後、塩酸でpHを4.0に調整した。血清を攪拌しながら、血清の1/15量のカプリル酸を加え、30分攪拌した後、9200gで10分間遠心した。上清をPBSに透析して、精製IgGとした。 Finally, IgG was purified from the serum as follows. That is, a double amount of 50 mM sodium acetate (pH 4.0) was added to the collected serum, and then the pH was adjusted to 4.0 with hydrochloric acid. While stirring the serum, 1/15 volume of caprylic acid was added and stirred for 30 minutes, followed by centrifugation at 9200 g for 10 minutes. The supernatant was dialyzed against PBS to obtain purified IgG.
（２）ラットモノクローナル抗ペリオスチン抗体の作製
KLH（スカシガイヘモシアニン）結合ヒトペリオスチンペプチド（20-50 μg／ラット）またはS2リコンビナントペリオスチンタンパク（20-50 μg／ラット）をCFA（完全フロイントアジュバント）またはTiterMax Gold（化学合成アジュバント）と混合して一対の相互に結合したものを免疫原とした。
(2) Preparation of rat monoclonal anti-periostin antibody
Mix KLH (Skamus hemocyanin) -conjugated human periostin peptide (20-50 μg / rat) or S2 recombinant periostin protein (20-50 μg / rat) with CFA (complete Freund's adjuvant) or TiterMax Gold (chemical synthesis adjuvant) A pair of mutually bound ones was used as an immunogen.
具体的な手順は次の通りである。Sigma社に依頼してFmoc法で作製したペリオスチンペプチド（CPVRKLQANKKVQGSRRRLR：配列番号７）にmaleimide基を持ったKLHを混合して結合させることによりKLH結合ヒトペリオスチンペプチドを作製した。 The specific procedure is as follows. A KLH-binding human periostin peptide was prepared by mixing KLH having a maleimide group and binding to a periostin peptide (CPVRKLQANKKVQGSRRRLR: SEQ ID NO: 7) prepared by Fmoc method upon request from Sigma.
次に、S2リコンビナントペリオスチンタンパクは、次のように作製した。先ず、ペリオスチン遺伝子安定形質転換体S2細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導した。これにより、リコンビナントペリオスチンは培養上清中に発現分泌された。この培養上清をPBSに透析した後、ニッケルレジン（Ni-NTA Agarose, Qiagen, Hilden, Germany）と混合して、リコンビナントペリオスチンをレジンに結合させた。レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてS2リコンビナントペリオスチンタンパクを溶出した。 Next, S2 recombinant periostin protein was produced as follows. First, expression of recombinant periostin protein was induced by adding copper sulfate to the medium of periostin gene stable transformant S2 cells. Thereby, recombinant periostin was expressed and secreted in the culture supernatant. The culture supernatant was dialyzed against PBS and then mixed with nickel resin (Ni-NTA Agarose, Qiagen, Hilden, Germany) to bind recombinant periostin to the resin. The resin was washed to remove impurities, and S2 recombinant periostin protein was eluted with an imidazole-containing buffer.
CFAは、Sigma社製のFreund's Adjuvant, Completeを用いた。TiterMax Goldは、Funakoshi Co., Ltd.から購入した。そして、KLH結合ヒトペリオスチンペプチド溶液またはS2リコンビナントペリオスチンタンパク溶液1容に対して、CFAまたはTiterMax Goldを1容の割合で混合した。 As CFA, Freund's Adjuvant, Complete manufactured by Sigma was used. TiterMax Gold was purchased from Funakoshi Co., Ltd. Then, 1 volume of CFA or TiterMax Gold was mixed with 1 volume of KLH-conjugated human periostin peptide solution or S2 recombinant periostin protein solution.
次に、雌ラットの足蹠に免疫原として20-50μｇのKLH結合ヒトペリオスチンペプチド溶液またはS2リコンビナントペリオスチンタンパク溶液とCFAまたはTiterMax Goldとの混合物を皮下注射し、10日〜2週間後、再度ラットの足蹠に免疫原として20-50μｇのKLH結合ヒトペリオスチンペプチド溶液またはS2リコンビナントペリオスチンタンパク溶液とCFAまたはTiterMax Goldとの混合物を皮下注射した。ここで、ラットは、Wisterラット、雌、6-8週齢（日本チャールズリバー、横浜）を用いた。 Next, 20-50 μg of a KLH-conjugated human periostin peptide solution or S2 recombinant periostin protein solution and a mixture of CFA or TiterMax Gold as an immunogen is injected subcutaneously into the footpad of a female rat. 20-50 μg of a KLH-conjugated human periostin peptide solution or S2 recombinant periostin protein solution and a mixture of CFA or TiterMax Gold was injected subcutaneously into the toe of the foot. Here, Wister rats, females, 6-8 weeks old (Nippon Charles River, Yokohama) were used as the rats.
最終免疫より3-4日後、免疫したラットの膝窩・鼠径・腸骨リンパ節内の細胞と、ミエローマ細胞を1対1から10対1の割合で混合し、一般的な方法でポリエチレングリコールを加えて細胞融合させ、ハイブリドーマコロニーを選別した。 3-4 days after the final immunization, cells in the popliteal, inguinal, and iliac lymph nodes of the immunized rat and myeloma cells are mixed in a ratio of 1: 1 to 10: 1, and polyethylene glycol is added by a general method. In addition, cell fusion was performed, and hybridoma colonies were selected.
具体的には、細胞融合は次のように行った。混合したリンパ節細胞とミエローマ細胞を遠心して上清を除き、室温でポリエチレングリコール（PEG1500、Roche、Switzerland）1 mlに1分間かけて懸濁した後、37度で1分間攪拌した。血清不含培地1 mlを1分間かけて加え、その後血清不含培地10 mlを1分間かけて加えた。細胞を数回洗浄した後、96穴プレートに分注して37度5%CO2存在下で培養した。 Specifically, cell fusion was performed as follows. The mixed lymph node cells and myeloma cells were centrifuged to remove the supernatant, suspended in 1 ml of polyethylene glycol (PEG1500, Roche, Switzerland) at room temperature for 1 minute, and then stirred at 37 degrees for 1 minute. 1 ml of serum-free medium was added over 1 minute, and then 10 ml of serum-free medium was added over 1 minute. The cells were washed several times and then dispensed into 96-well plates and cultured in the presence of 37 ° C. and 5% CO 2 .
選別の方法としては、細胞融合から7-14日後、抗原に使用したペプチドまたはタンパクを固相化し、融合細胞培養上清を一次抗体としたELISAの系にて行った。ELISAは具体的には、次のように行った。1μg/mlのペプチドまたはタンパクを96穴プレートに分注し、数時間固相化させた。固相化溶液を洗浄した後、融合細胞培養上清を各ウェルに加え、1時間室温に静置した。融合細胞培養上清を洗浄して、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットIgG抗体（GE Healthcare、Little Chalfont、UK）を加え1時間室温に静置した。二次抗体を洗浄後、ABTSペルオキシダーゼ基質（KPL、Gaithersburg、Maryland）を加えて発色させ、405 nmの吸光度を測定した。 As a selection method, 7-14 days after cell fusion, the peptide or protein used as the antigen was immobilized, and the ELISA was performed using the fused cell culture supernatant as a primary antibody. Specifically, ELISA was performed as follows. 1 μg / ml peptide or protein was dispensed into a 96-well plate and allowed to immobilize for several hours. After washing the solid phase solution, the fusion cell culture supernatant was added to each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. The supernatant of the fused cell culture was washed, and a peroxidase-labeled goat anti-rat IgG antibody (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) was added as a secondary antibody and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After washing the secondary antibody, ABTS peroxidase substrate (KPL, Gaithersburg, Maryland) was added for color development, and the absorbance at 405 nm was measured.
そして、選別したハイブリドーマ細胞からIgGを次のように精製した。ハイブリドーマ細胞をICR-SCIDマウス、雌、6-8週齢（日本クレア、東京）の腹腔内に注射し、7-10日後に貯留した腹水を採取した。採取した腹水に二倍量の50 mM酢酸ナトリウム（pH4.0）を加えた後、塩酸でpHを4.0に調整した。血清を攪拌しながら、血清の1/15量のカプリル酸を加え、30分攪拌した後、9200gで10分間遠心した。上清をPBSに透析して、精製IgGとした。 Then, IgG was purified from the selected hybridoma cells as follows. Hybridoma cells were injected into the abdominal cavity of ICR-SCID mice, females, 6-8 weeks old (Claire, Tokyo, Japan), and ascites collected 7-10 days later was collected. A double amount of 50 mM sodium acetate (pH 4.0) was added to the collected ascites, and the pH was adjusted to 4.0 with hydrochloric acid. While stirring the serum, 1/15 volume of caprylic acid was added and stirred for 30 minutes, followed by centrifugation at 9200 g for 10 minutes. The supernatant was dialyzed against PBS to obtain purified IgG.
（３）ペリオスチンの組織免疫染色
染色は、一般的なABC法と呼ばれる組織免疫染色法により行った。
生体試料としてパラフィン包埋皮膚組織を用いた。パラフィン包埋皮膚組織は、20人のアトピー性皮膚炎患者、および5人の正常者から、それぞれ採取し、作製しておいたものである。これに、脱パラフィン、内因性ペルオキシダーゼ活性の阻害、ブロッキングといった処理を施した。具体的には、これらの操作は次のように行った。組織をメタノール＋3%H2O2で15-30分間処理した後、Protein Block Serum-Free（DAKO、Glostrup、Denmark）で5-10分間処理した。
(3) Tissue immunostaining of periostin Staining was performed by a tissue immunostaining method called a general ABC method.
Paraffin-embedded skin tissue was used as a biological sample. Paraffin-embedded skin tissue was collected and prepared from 20 patients with atopic dermatitis and 5 normal subjects. This was subjected to treatments such as deparaffinization, inhibition of endogenous peroxidase activity, and blocking. Specifically, these operations were performed as follows. The tissue was treated with methanol + 3% H 2 O 2 for 15-30 minutes and then treated with Protein Block Serum-Free (DAKO, Glostrup, Denmark) for 5-10 minutes.
上記作成したラビットポリクローナル抗ペリオスチン抗血清、あるいはラットモノクローナル抗ペリオスチン抗体を、それぞれ1000倍希釈あるいは10μg/mlの濃度で一次抗体として加えた。その後、HRP標識された一次抗体に対する抗体（Envision、DAKO社から購入）を二次抗体として加え、DAB（diaminobenzidine）（Sigma社）にて発色させた。 The rabbit polyclonal anti-periostin antiserum prepared above or a rat monoclonal anti-periostin antibody was added as a primary antibody at a 1000-fold dilution or a concentration of 10 μg / ml, respectively. Thereafter, an antibody against the HRP-labeled primary antibody (Envision, purchased from DAKO) was added as a secondary antibody and developed with DAB (diaminobenzidine) (Sigma).
さらに、核染色、脱水、封入などの操作を行った。具体的には、これらの操作は次のように行った。100μlの一次抗体を組織上にのせ、室温で60分間静置した。一次抗体を洗浄した後、100μlの二次抗体を組織上にのせ、室温で60分間静置した。二次抗体を洗浄した後、DAB基質溶液中に組織スライドを浸して、1-20分間発色させた。ヘマトキシリンで核染色した後、公知の方法で脱水、封入した。 Furthermore, operations such as nuclear staining, dehydration, and encapsulation were performed. Specifically, these operations were performed as follows. 100 μl of the primary antibody was placed on the tissue and allowed to stand at room temperature for 60 minutes. After washing the primary antibody, 100 μl of the secondary antibody was placed on the tissue and allowed to stand at room temperature for 60 minutes. After washing the secondary antibody, the tissue slide was immersed in DAB substrate solution and allowed to develop for 1-20 minutes. After nuclear staining with hematoxylin, it was dehydrated and encapsulated by a known method.
上記組織免疫染色により、ペリオスチンの発現部位が茶色に染まる。染色の結果、20人のアトピー性皮膚炎患者由来の皮膚組織全てにおいてペリオスチン遺伝子の発現レベルが高かった。例えば図１(b)の写真を見ると、アトピー性皮膚炎患者の真皮部分ではペリオスチンが強く発現していることが分かる。 The tissue immunostaining stains the periostin expression site in brown. As a result of staining, the expression level of the periostin gene was high in all the skin tissues derived from 20 atopic dermatitis patients. For example, from the photograph in FIG. 1 (b), it can be seen that periostin is strongly expressed in the dermis of atopic dermatitis patients.
一方、対照群として用いた5人の正常皮膚組織においてはいずれもペリオスチン遺伝子の発現レベルはきわめて低かった。例えば図１(a)の染色写真を見ると、正常者の皮膚組織ではほとんどペリオスチンの発現が見られないことが分かる。 On the other hand, the expression level of the periostin gene was extremely low in the five normal skin tissues used as the control group. For example, from the stained photograph of FIG. 1 (a), it can be seen that the expression of periostin is hardly observed in the skin tissue of a normal person.
（４）アトピー性皮膚炎モデルマウス
マウスの皮膚にダニアレルゲンを塗布してアトピー性皮膚炎を発症させるアトピー性皮膚炎モデルマウス実験を以下のように行った。
(4) Atopic dermatitis model mouse An atopic dermatitis model mouse experiment in which mite allergen was applied to the mouse skin to develop atopic dermatitis was performed as follows.
8〜12週齢の野生型BALB/ｃマウス（日本クレア社）11匹と、8〜12週齢のペリオスチン欠損BALB/ｃマウス（米国インデイアナ大学コンウエイ博士より供与、Periostin null mice exhibit dwarfism, incisor enamel defects, and an early-onset periodontal disease-like phenotypes, Mol Cell Biol, vol.25, 11131-11144, 2005）10匹を実験に用いた。先ず、マウスの耳にセロハンテープを貼って剥がす作業を左右の耳の表裏で各3回ずつ繰り返し、左右の耳の表裏からセロハンテープ（共和社製のパイロンセロハン粘着テープ）で優しく角層を剥がした（tape stripping）。角層を剥がした左右の耳の表裏に、ダニ抗原10mg/mlを25μmlずつ塗布した。ダニ抗原は次のように調製して用いた。すなわち、ダニ虫体を脱脂乾燥後、1gに対し10mlの50%グリセリン5%NaCl液を加え、4℃にて48時間振盪して抽出し、さらに遠心分離した後、濾過することでダニ抗原を調製した。左右の耳の表裏にダニ抗原を塗布する作業を1週間おきに行い、8回目の24時間後にマウスを解析した。すなわち、回収したマウスの皮膚組織をホルマリン固定した後、パラフィンで包埋し、スライドを作製した。スライドを脱パラフィン後、HE染色、マッソン・トリクローム染色、および組織免疫染色を行った。そして、染色したマウス皮膚組織を顕微鏡で観察した。 11 8-12 weeks old wild type BALB / c mice (CLEA Japan) and 8-12 weeks old periostin-deficient BALB / c mice (provided by Dr. Conway, Indiana University, USA) Periostin null mice exhibit dwarfism, incisor enamel defects, and an early-onset periodontal disease-like phenotypes, Mol Cell Biol, vol. 25, 11131-11144, 2005). First, repeat the process of attaching and removing the cellophane tape to the ears of the mouse three times each on the front and back of the left and right ears, and then gently peeling off the stratum corneum with cellophane tape (pylon cellophane adhesive tape made by Kyowa) from the front and back of the left and right ears. (Tape stripping). On the front and back of the left and right ears from which the stratum corneum had been peeled, 25 mg of mite antigen 10 mg / ml was applied. The mite antigen was prepared and used as follows. That is, after defatting and drying mite bodies, 10 ml of 50% glycerin 5% NaCl solution is added to 1 g, extracted by shaking at 4 ° C. for 48 hours, further centrifuged, and filtered to filter the mite antigen. Prepared. The work of applying mite antigens to the front and back of the left and right ears was performed every other week, and the mice were analyzed 24 hours after the 8th time. That is, the collected mouse skin tissue was fixed in formalin and then embedded in paraffin to prepare a slide. After deparaffinization of the slide, HE staining, Masson trichrome staining, and tissue immunostaining were performed. The stained mouse skin tissue was observed with a microscope.
この結果、野生型マウスにおいては、ダニアレルゲン塗布により表皮肥厚、線維化、および好酸球性炎症などのアトピー性皮膚炎に特徴的な組織学的変化が生じた（図２(a)）。一方、ペリオスチン欠損マウスにおいては、これらのアトピー性皮膚炎に特徴的な組織学的変化が著明に軽減していた(図２(b))。 As a result, in wild-type mice, application of mite allergen resulted in histological changes characteristic of atopic dermatitis such as epidermal thickening, fibrosis, and eosinophilic inflammation (FIG. 2 (a)). On the other hand, in the periostin-deficient mice, these histological changes characteristic of atopic dermatitis were significantly reduced (FIG. 2 (b)).
（５）マウス皮膚角化細胞培養系
マウス線維芽細胞をコラーゲンゲルと混合し、その上でマウス皮膚角化細胞を培養する実験を以下のように行った。
(5) Mouse skin keratinocyte culture system An experiment in which mouse fibroblasts were mixed with collagen gel and mouse skin keratinocytes were cultured thereon was performed as follows.
タイプＩコラーゲンゲル３（新田ゼラチン株式会社製のCellmatrix）2mlにマウス線維芽細胞（MEF）２ (periostin WT or KO) 2×106cellsを混和し、inner dish（Millicell）に入れて、37℃で30分培養し、ゲルを固めた。ゲルを固めたものの上に、生後２日の新生児の野生型BALB/cマウス（日本クレア社）、または生後２日のペリオスチン欠損BALB/cマウス（米国インデイアナ大学コンウエイ博士より供与、Periostin null mice exhibit dwarfism, incisor enamel defects, and an early-onset periodontal disease-like phenotypes, Mol Cell Biol, vol.25, 11131-11144, 2005）から採取したマウス皮膚角化細胞（mouse primary keratinocyte）１を2×106cellsまいた。DMEMにてperiostin 10μg/ml（コントロールとしてPBS）とした培養液４を、outer dishに1ml入れ、outer dishの中に、inner dishを入れて37℃で培養した（図４参照）。培養液は3、5日目に交換した。5日目、7日目に、inner dishを回収し、ホルマリン固定し、スライドを作製した。スライドを脱パラフィン後、HE染色、マッソン・トリクローム染色、および組織免疫染色を行い、顕微鏡観察を行った。
ここで、periostinは、次のようにして得た。pMT/Bip/V5-HisAプラスミドにペリオスチンcDNAを挿入し、ショウジョウバエS2細胞にpCoHygroプラスミドとともに形質転換させた。400 mg/mlのハイグロマイシン(Sigma-Aldrich)存在下で培養し、ペリオスチン安定細胞株を樹立した。ペリオスチン安定細胞株の培養上清を集め、Ni-NTAアガロース（Qiagen）に添加してペリオスチンを精製した。
Mouse fibroblasts (MEF) 2 (periostin WT or KO) 2 × 10 6 cells are mixed in 2 ml of type I collagen gel 3 (Cellmatrix made by Nitta Gelatin Co., Ltd.), and placed in an inner dish (Millicell). The gel was hardened by culturing at 30 ° C. for 30 minutes. Two-day-old newborn wild-type BALB / c mice (CLEA Japan), or two-day-old periostin-deficient BALB / c mice (provided by Dr. Conway, Indiana University, Periostin null mice exhibit) 2 × 10 6 mouse primary keratinocytes collected from dwarfism, incisor enamel defects, and an early-onset periodontal disease-like phenotypes, Mol Cell Biol, vol.25, 11131-11144, 2005) I had cells. 1 ml of periostin 10 μg / ml (PBS as a control) in DMEM was placed in the outer dish, and the inner dish was placed in the outer dish and cultured at 37 ° C. (see FIG. 4). The culture medium was changed on the 3rd and 5th days. On the 5th and 7th days, the inner dish was collected and fixed in formalin to prepare slides. The slide was deparaffinized, followed by HE staining, Masson's trichrome staining, and tissue immunostaining and microscopic observation.
Here, periostin was obtained as follows. Periostin cDNA was inserted into the pMT / Bip / V5-HisA plasmid, and Drosophila S2 cells were transformed with the pCoHygro plasmid. A periostin stable cell line was established by culturing in the presence of 400 mg / ml hygromycin (Sigma-Aldrich). The culture supernatant of the periostin stable cell line was collected and added to Ni-NTA agarose (Qiagen) to purify periostin.
この結果、野生型マウス由来の線維芽細胞上では角化細胞が正常に増殖・分化した（図３(a)）。一方、ペリオスチン欠損マウス由来の線維芽細胞上では角化細胞の増殖・分化が阻害されていた（図３(b)）。 As a result, keratinocytes normally proliferated and differentiated on wild type mouse-derived fibroblasts (FIG. 3 (a)). On the other hand, on the fibroblasts derived from periostin-deficient mice, the proliferation and differentiation of keratinocytes were inhibited (FIG. 3 (b)).
以上、実施例に示した通り、ペリオスチン遺伝子は、アトピー性皮膚炎の患者由来の組織で発現が増加しているので、被験者由来の生体試料におけるペリオスチンは、アトピー性皮膚炎を検出または診断するためのマーカーとして利用し得る。 As described above, since the expression of periostin gene is increased in tissues derived from patients with atopic dermatitis, as shown in the examples, periostin in a biological sample derived from a subject is used to detect or diagnose atopic dermatitis. It can be used as a marker.
また、ペリオスチン遺伝子は、アトピー性皮膚炎の患者由来の組織で発現が増加しているので、ペリオスチン遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、アトピー性皮膚炎の予防・治療剤として使用し得る。 In addition, since the expression of periostin gene is increased in tissues derived from patients with atopic dermatitis, a compound that inhibits expression of periostin gene or a salt thereof can be used as a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis. .
さらに、これらのことから、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を指標として、アトピー性皮膚炎の予防・治療薬をスクリーニングできることも分かる。 Furthermore, these facts also indicate that a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis can be screened using the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein as an index.
タイプＩコラーゲンゲル3（新田ゼラチン株式会社のCellmatrix）2mlをperiostin 10μg/mlとともに
inner dish (Millicell)に入れて、37℃で培養し、ゲルを固めた。ゲルを固めたものの上に、生後2日の新生児野生型BALB/cマウス（日本クレア社）から採取したマウス皮膚角化細胞を2×106 cellsまいた。DMEMにIL-13（Peprotech社） 10ng/ml、抗インテグリンαV抗体（BioLegend）10μg/ml、periostin（実施例１と同様の方法にて入手。） 10μg/mlを加えて培養液とし、この培養液をouter dishに1ml入れて37℃でマウス皮膚角化細胞を培養した。培養液は3、5日目に交換した。5日目の培養液中のthymic stromal lymphopoietin（TSLP）をELISA（R＆D SystemsのQuantikine）にて測定した。7日目にinner dishを回収し、培養細胞をホルマリン固定し培養細胞のスライドを作成した。
並行してIL-13、抗インテグリンαV抗体及び／又はperiostinが存在しない系についても実験した。
Type I collagen gel 3 (Cellmatrix from Nitta Gelatin Co., Ltd.) 2ml with periostin 10μg / ml
It was put into an inner dish (Millicell) and cultured at 37 ° C. to solidify the gel. On the solidified gel, 2 × 10 6 cells of mouse skin keratinocytes collected from 2 days old newborn wild type BALB / c mice (CLEA Japan) were spread. DMEM to IL-13 (Peprotech Co.) 10 ng / ml, anti-integrin alpha V antibody (BioLegend) 10μg / ml, periostin ( obtained in the same manner as in Example 1.) Was added to 10 [mu] g / ml and the culture solution, the 1 ml of the culture solution was placed in an outer dish, and mouse skin keratinocytes were cultured at 37 ° C. The culture medium was changed on the 3rd and 5th days. The thymic stromal lymphopoietin (TSLP) in the culture solution on the fifth day was measured by ELISA (Quantikine of R & D Systems). On the seventh day, the inner dish was collected, and the cultured cells were fixed in formalin to prepare a slide of the cultured cells.
In parallel IL-13, and experiments for anti-integrin alpha V antibody and / or periostin absence system.
結果を図５と図６に示す。
図５は、培養液中のTSLPのELISAでの測定結果を示すものである。図５から、IL-13 又はperiostinの存在により、TSLPの産生が高まり、両者が同時に存在することによりTSLPの産生は著しく高まるが、インテグリンとperiostinの結合を阻害する抗インテグリンαV抗体の添加により、TSLPの産生は著しく低下することが分かる。
図６はスライドの培養細胞をHE染色した結果を示す組織像写真である。図６(a)〜(e)は、それぞれ、図５の一番左の棒グラフ〜一番右の棒グラフに対応する。ペリオスチンとIL-13を加えると、皮膚角化細胞が増殖、分化していることがわかり（図６(d)）、これに抗インテグリンαV抗体を加えると、その増殖、分化が抑制されることが分かる（図６(e)）。
The results are shown in FIGS.
FIG. 5 shows the measurement results of TSLP in the culture medium by ELISA. From Figure 5, the presence of IL-13 or Periostin, increased production of TSLP, although both production of TSLP is significantly enhanced by the simultaneous presence, by the addition of anti-integrin alpha V antibody to inhibit the binding of integrins and Periostin It can be seen that TSLP production is significantly reduced.
FIG. 6 is a histological photograph showing the result of HE staining of cultured cells on a slide. 6A to 6E correspond to the leftmost bar graph to the rightmost bar graph in FIG. 5, respectively. The addition of periostin and IL-13, cutaneous keratinocytes proliferation, can see that the differentiation (FIG. 6 (d)), the addition of anti-integrin alpha V antibody thereto, the proliferation, differentiation is inhibited (Fig. 6 (e)).
以上、実施例に示した通り、インテグリンαV/β3とペリオスチン結合量の低下、又はTSLP産生量の低下は、皮膚角化細胞の増殖・分化の抑制につながるので、インテグリンαV/β3とペリオスチン結合量又はTSLP産生量を低下させる化合物またはその塩は、アトピー性皮膚炎の予防・治療薬として使用し得る。特に、インテグリンαV/β3とペリオスチン結合を阻害する抗インテグリンαV抗体は、アトピー性皮膚炎の予防・治療薬として使用し得る。 Above, as shown in the examples, decrease of the integrin α V / β 3 and periostin bond amount, or reduction of TSLP production amount, so leading to inhibition of proliferation and differentiation of skin keratinocytes, integrin α V / β 3 And a compound or a salt thereof that reduces periostin binding amount or TSLP production amount can be used as a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis. In particular, an integrin α V / β 3 and an anti-integrin α V antibody that inhibits periostin binding can be used as a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis.
また、これらのことから、インテグリンαV/β3とペリオスチン結合量、TSLP産生量の低下または皮膚角化細胞の増殖・分化を指標として、アトピー性皮膚炎の予防・治療薬をスクリーニングできることも分かる。 In addition, these findings indicate that prophylactic and therapeutic drugs for atopic dermatitis can be screened using integrin α V / β 3 binding to periostin, decreased TSLP production, or skin keratinocyte proliferation / differentiation as indicators. .
１…皮膚角化細胞、２…繊維芽細胞、３…コラーゲンゲル、４…培養液。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Skin keratinocyte, 2 ... Fibroblast, 3 ... Collagen gel, 4 ... Culture solution.
配列番号７：合成構築物 SEQ ID NO: 7: synthetic construct
Claims (22)
A pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis, comprising an anti-integrin α V antibody that inhibits the binding of integrin α V / β 3 and periostin.
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