JP5499350B2 - Quinuclidinone reductase and method for producing optically active 3-quinuclidinol using the same - Google Patents
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Description
本発明は、有用且つ新規なキヌクリジノン還元酵素及びその遺伝子に関する。また、本発明は、当該キヌクリジノン還元酵素を製造するために使用されるベクター及び形質転換体に関する。さらに、本発明は当該キヌクリジノン還元酵素を用いた光学活性３−キヌクリジノール又はその塩を製造する方法に関する。 The present invention relates to a useful and novel quinuclidinone reductase and a gene thereof. The present invention also relates to a vector and a transformant used for producing the quinuclidinone reductase. Furthermore, the present invention relates to a method for producing optically active 3-quinuclidinol or a salt thereof using the quinuclidinone reductase.
３-キヌクリジノンの還元生成物である光学活性３-キヌクリジノールは、スクアレンシンターゼ阻害作用を有する動脈硬化の治療剤、またはムスカリン受容体拮抗作用を有する気管支拡張剤および胃腸運動抑制剤などの合成中間体として知られる化合物である。
当該光学活性３-キヌクリジノールの製造方法としては、化学合成法、エステル加水分解法、酵素還元法等が知られている。
Optically active 3-quinuclidinol, which is a reduction product of 3-quinuclidinone, is used as a synthetic intermediate such as a therapeutic agent for arteriosclerosis having a squalene synthase inhibitory action, or a bronchodilator and a gastrointestinal motility inhibitor having a muscarinic receptor antagonistic action. It is a known compound.
Known methods for producing the optically active 3-quinuclidinol include chemical synthesis, ester hydrolysis, enzyme reduction, and the like.
化学合成法としては、ロジウム錯化合物を触媒としてルイス酸付加物を不斉還元することにより、３-キヌクリジノンから光学活性３-キヌクリジノールを製造する方法が報告されている（特許文献１１）。しかしこの方法は光学純度が低く、工業的に有利な製造方法とは言い難い。また、光学活性酒石酸等を分割剤とする優先晶析法により光学活性３−キヌクリジノール誘導体に導く方法が報告されている（非特許文献１）。しかし、ラセミ体を出発原料とし、光学分割して目的の光学異性体を得る手法であるので、対掌体が残存するため、生産コストが高くなる傾向にある。 As a chemical synthesis method, a method of producing optically active 3-quinuclidinol from 3-quinuclidinone by asymmetric reduction of a Lewis acid adduct using a rhodium complex compound as a catalyst has been reported (Patent Document 11). However, this method has a low optical purity and is not an industrially advantageous production method. In addition, a method of leading to an optically active 3-quinuclidinol derivative by a preferential crystallization method using optically active tartaric acid or the like as a resolving agent has been reported (Non-Patent Document 1). However, since this is a method in which a racemate is used as a starting material and the desired optical isomer is obtained by optical resolution, the enantiomer remains, and thus the production cost tends to increase.
エステル加水分解法としては、３−キヌクリジノールの低級脂肪酸エステルを微生物由来の酵素により不斉加水分解して光学活性３−キヌクリジノールに分割する方法が知られている（特許文献８〜１０及び非特許文献２）。この方法もラセミ体を出発原料とし、光学分割して目的の光学異性体を得る手法であるので、対掌体が残存するため、生産コストが高くなる傾向にある。 As an ester hydrolysis method, a method is known in which a lower fatty acid ester of 3-quinuclidinol is asymmetrically hydrolyzed by an enzyme derived from a microorganism to split it into optically active 3-quinuclidinol (Patent Documents 8 to 10 and Non-Patent Documents). 2). This method is also a method in which a racemate is used as a starting material, and the target optical isomer is obtained by optical resolution, so that the enantiomer remains, so that the production cost tends to increase.
酵素還元法としては、微生物菌体を利用した酵素不斉還元による方法が知られている（特許文献１〜４）。しかし、特許文献１〜４に記載された菌体を用いた反応は、菌体由来の不純物又は菌体内の他の酵素による副反応等が生じることがあるため、さらに効率よく生成物を単離できる方法が望まれていた。また、ロドトルーラ属に属する微生物より産生された酵素を用いる方法も知られている（特許文献６）。しかし、この酵素は、高価なNADPH（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補酵素とするものであり、コストが高くなる。さらに、酵素を用いた不斉還元による光学活性３−キヌクリジノールの他の製造法として、トロピノンを還元する活性を持つ酵素とケトンを作用させる方法が提案されている（特許文献７）。しかし、トロピノンを還元する酵素は植物体由来のものが多く、植物体からの酵素製造は、コスト高となる。微生物を宿主として製造する場合には、酵素を高発現させることが困難な場合も多いなど工業的に酵素を製造することが困難である。
As an enzyme reduction method, a method by enzyme asymmetric reduction using microbial cells is known (
一方、本発明者も、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物より、３−キヌクリジノン又はその塩を還元し、Ｒ−３−キヌクリジノール又はその塩を生成する新規な酵素を見出している（特許文献５）。当該酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が約52,000であり、ゲル濾過で測定した場合の分子量は約220,000であり、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として必要とする。また、当該酵素は３−キヌクリジノン以外にも、トロピノン、N-メチル-4-ピペリジノン、6-ヒドロキシトロピノン、4-ピペリドン、テトラヒドロチオピラン-4-オン、4-メチルシクロヘキサノン、3-メチルシクロヘキサノン、2-メチルシクロヘキサノンなどにも作用して対応するアルコールを生成する。さらに種々のアルデヒド化合物に対しても高い活性を示す。このように広範な基質に対して高い活性を示す酵素は、原料に混在する３−キヌクリジノン以外の類似化合物を対応するアルコールへと変換させてしまうために、後工程での不純物分離に多大な労力を要し、工業的な生産には不利である。よって基質特異性の高い酵素の取得が強く求められていた。
本発明の目的は、新規なキヌクリジノン還元酵素及びその遺伝子を提供することである。また、本発明の目的は、当該酵素による不斉還元反応により、医農薬合成中間体として有用な光学活性３−キヌクリジノール又はその塩の工業的に有利な製造方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a novel quinuclidinone reductase and a gene thereof. Another object of the present invention is to provide an industrially advantageous method for producing optically active 3-quinuclidinol or a salt thereof useful as a pharmaceutical and agrochemical synthesis intermediate by an asymmetric reduction reaction with the enzyme.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物が新規なキヌクリジノン還元酵素を産生し、この酵素が低コストかつ工業的に使用可能であることを見いだし、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has produced a novel quinuclidinone reductase from a microorganism belonging to the genus Microbacterium, and this enzyme can be used at low cost and industrially. We found something and came to complete the present invention.
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）下記の理化学的性質を有する、キヌクリジノン還元酵素。
（i）分子量：
ゲルろ過法による測定値： 70,000〜73,000Da
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定値： 29,500〜31,500Da
（ii）至適pH：6.0〜8.0
（iii）補酵素としてＮＡＤＨ又はその誘導体を必要とする
（２）３−キヌクリジノンに特異的に作用し、３−キヌクリジノールを生成する触媒活性を有する、（１）に記載のキヌクリジノン還元酵素。
（３）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質を含むキヌクリジノン還元酵素。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と96%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質
（４）キヌクリジノン還元酵素が、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物由来のものである（１）〜（３）のいずれか１項に記載のキヌクリジノン還元酵素。
（５）ミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物が、Microbacterium luteolum JCM 9174 、Microbacterium esteraromaticum IFO 3751及びMicrobacterium arabinogalactanolyticum JCM9171からなる群から選ばれる少なくとも一種である、（４）に記載のキヌクリジノン還元酵素。
（６）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするキヌクリジノン還元酵素遺伝子。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と96%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質
（７）以下の（ｄ）又は（ｅ）に示すポリヌクレオチドを含むキヌクリジノン還元酵素遺伝子。
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（８）上記（６）又は（７）に記載のキヌクリジノン還元酵素遺伝子を含有する組換えベクター。
（９）上記（８）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１０）上記（９）に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からキヌクリジノン還元酵素を採取することを特徴とする、キヌクリジノン還元酵素の製造方法。
（１１）上記（１）〜（５）のいずれか1項に記載のキヌクリジノン還元酵素、該酵素を産生する微生物若しくは（９）に記載の形質転換体、又は前記微生物若しくは形質転換体の処理物を、3-キヌクリジノン又はその塩に作用させる工程を含む、Ｒ−３−キヌクリジノール又はその塩の製造方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) A quinuclidinone reductase having the following physicochemical properties:
(I) Molecular weight:
Measurement value by gel filtration method: 70,000-73,000 Da
Measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis: 29,500-31,500 Da
(Ii) Optimal pH: 6.0 to 8.0
(Iii) NADH or a derivative thereof as a coenzyme (2) The quinuclidinone reductase according to (1), which specifically acts on 3-quinuclidinone and has catalytic activity to produce 3-quinuclidinol.
(3) A quinuclidinone reductase containing the following protein (a), (b) or (c):
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence obtained by deleting, substituting or adding one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a quinuclidinone reductase Protein having activity (c) A protein having an amino acid sequence of 96% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having quinuclidinone reductase activity (4) Quinuclidinone reductase is a microbacterium (Microbacterium The quinuclidinone reductase according to any one of (1) to (3), which is derived from a microorganism belonging to the genus.
(5) Micro Agrobacterium (Microbacterium) microorganism belonging to the genus, Microbacterium luteolum JCM 9174, Microbacterium este r aromaticum IFO 3751 and is at least one selected from the group consisting of Microbacterium arabinogalactanolyticum JCM9171, quinuclidinone reductase according to (4) .
(6) A quinuclidinone reductase gene encoding the following protein (a), (b) or (c).
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence obtained by deleting, substituting or adding one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a quinuclidinone reductase Protein having activity (c) A protein comprising an amino acid sequence having a homology of 96% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having quinuclidinone reductase activity (7) (d) or (e) below A quinuclidinone reductase gene comprising the indicated polynucleotide.
(D) a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (e) hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and reducing quinuclidinone Polynucleotide encoding a protein having enzyme activity (8) A recombinant vector containing the quinuclidinone reductase gene according to (6) or (7) above.
(9) A transformant comprising the recombinant vector according to (8) above.
(10) A method for producing quinuclidinone reductase, comprising culturing the transformant according to (9) and collecting quinuclidinone reductase from the obtained culture.
(11) The quinuclidinone reductase according to any one of (1) to (5) above, the microorganism producing the enzyme, the transformant according to (9), or the processed product of the microorganism or transformant Is a method for producing R-3-quinuclidinol or a salt thereof, which comprises the step of acting on 3-quinuclidinone or a salt thereof.
本発明により、キヌクリジノンに特異的に作用し、医農薬合成中間体等として重要なＲ−３−キヌクリジノールを製造する触媒活性を有するキヌクリジノン還元酵素が得られ、また、当該酵素を利用してＲ−３−キヌクリジノールの効率的な生産が可能となる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a quinuclidinone reductase that specifically acts on quinuclidinone and has catalytic activity to produce R-3-quinuclidinol that is important as a pharmaceutical and agrochemical synthesis intermediate or the like can be obtained. Efficient production of 3-quinuclidinol becomes possible.
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明に係るキヌクリジノン還元酵素
本発明の酵素はキヌクリジノン還元酵素であり、例えばNADH（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として、３−キヌクリジノンあるいはその塩を還元し、Ｒ−３−キヌクリジノールを生成する触媒作用を有する。本発明の酵素の理化学的性質及び特徴を以下に示す。
（イ）分子量
本発明の酵素の分子量は、SDS-PAGEで測定した場合、29.5〜31.5kDa程度、好ましくは約31kDaである。また、ゲル濾過（高速液体クロマトグラフィー）で測定した場合の分子量は、約70〜73kDa、好ましくは、約71.8kDaである。
（ロ）至適pH
本発明のキヌクリジノン還元酵素は、至適ｐＨが6.0から8.0程度、特に、３−キヌクリジノンを基質とした場合の至適pHは6.0から8.0程度である。より好ましくは至適pHが6.5〜7.5程度である。
（ハ）基質特異性
本発明のキヌクリジノン還元酵素は、３−キヌクリジノンに特異的に作用し、３−キヌクリジノールを生成する触媒活性を有する。「３−キヌクリジノンに特異的に作用」するとは、３−キヌクリジノンには作用するが、ほかの化合物、例えば３−キヌクリジノンに類似した化合物には実質的には作用しないことをいう。
ここで、「３−キヌクリジノンに類似した化合物」とは、例えば、トロピノン、N-メチル-4-ピペリジノン、6-ヒドロキシトロピノン、4-ピペリドン、テトラヒドロチオピラン-4-オン、4-メチルシクロヘキサノン、3-メチルシクロヘキサノン、2-メチルシクロヘキサノンなどを例示することができる。これらの化合物は、トロピノン還元酵素の基質として作用する化合物として知られている（Phytochemistry 67., 327-337 (2006)参照）。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) Quinuclidinone reductase according to the present invention The enzyme of the present invention is a quinuclidinone reductase. For example, NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide) is used as a coenzyme to reduce 3-quinuclidinone or a salt thereof, and R-3 -It has a catalytic action to produce quinuclidinol. The physicochemical properties and characteristics of the enzyme of the present invention are shown below.
(A) Molecular weight The molecular weight of the enzyme of the present invention is about 29.5 to 31.5 kDa, preferably about 31 kDa, as measured by SDS-PAGE. Moreover, the molecular weight when measured by gel filtration (high performance liquid chromatography) is about 70 to 73 kDa, preferably about 71.8 kDa.
(B) Optimum pH
The optimum pH of the quinuclidinone reductase of the present invention is about 6.0 to 8.0, and particularly when 3-quinuclidinone is used as a substrate, the optimum pH is about 6.0 to 8.0. More preferably, the optimum pH is about 6.5 to 7.5.
(C) Substrate specificity The quinuclidinone reductase of the present invention specifically acts on 3-quinuclidinone and has a catalytic activity to produce 3-quinuclidinol. “Specifically acting on 3-quinuclidinone” means that it acts on 3-quinuclidinone but does not substantially act on other compounds, for example, compounds similar to 3-quinuclidinone.
Here, the “compound similar to 3-quinuclidinone” includes, for example, tropinone, N-methyl-4-piperidinone, 6-hydroxytropinone, 4-piperidone, tetrahydrothiopyran-4-one, 4-methylcyclohexanone, Examples thereof include 3-methylcyclohexanone and 2-methylcyclohexanone. These compounds are known as compounds that act as substrates for tropinone reductase (see Phytochemistry 67., 327-337 (2006)).
（ニ）補酵素
本発明において、補酵素とは、酵素のタンパク質部分と可逆的に結合して酵素作用の発現に寄与する補欠分子族を意味し、本発明の酵素が特異的にＲ−３−キヌクリジノールを生成する触媒作用に寄与するものをいう。
補酵素としては、本発明に係る酵素が特異的にＲ−３−キヌクリジノールを生成することができれば特に限定されないが、例えば、NADH（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はその誘導体が好ましい。NADH以外の補酵素は、Ｒ−３−キヌクリジノールの生成能を発揮することができる限り特に限定されるものではないが、NADH依存性であることが望ましい。NADHの誘導体は、Ｒ−３−キヌクリジノールを特異的に生成することができれば特に限定されず、例えばＮＡＤＰＨなどが挙げられる。
補酵素は、本発明においてＲ−３−キヌクリジノールを生成させる酵素反応を行う際に、当業者が適宜選択することができる。
（ホ）アミノ酸配列
本発明のキヌクリジノン還元酵素は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質を含むものである。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と96%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質
上記のとおり、本発明のキヌクリジノン還元酵素には、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質も含まれる。
(D) Coenzyme In the present invention, the coenzyme means a prosthetic group that reversibly binds to the protein portion of the enzyme and contributes to the expression of the enzyme action, and the enzyme of the present invention is specifically R-3. -What contributes to the catalytic action to produce quinuclidinol.
The coenzyme is not particularly limited as long as the enzyme according to the present invention can specifically produce R-3-quinuclidinol. For example, NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide) or a derivative thereof is preferable. The coenzyme other than NADH is not particularly limited as long as it can exhibit the ability to produce R-3-quinuclidinol, but is preferably NADH-dependent. The NADH derivative is not particularly limited as long as it can specifically produce R-3-quinuclidinol, and examples thereof include NADPH.
The coenzyme can be appropriately selected by those skilled in the art when performing the enzyme reaction for producing R-3-quinuclidinol in the present invention.
(E) Amino acid sequence The quinuclidinone reductase of the present invention comprises the following protein (a), (b) or (c).
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence obtained by deleting, substituting or adding one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a quinuclidinone reductase Protein having activity (c) A protein having an amino acid sequence having 96% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having quinuclidinone reductase activity As described above, the quinuclidinone reductase of the present invention includes: A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are deleted, substituted or added, or mutated by a combination thereof, and having quinuclidinone reductase activity is also included. .
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
(i) 配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１〜９個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１〜９個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２で示されるアミノ酸配列に１〜９個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, as an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added, or mutated by a combination thereof, for example,
(i) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 lacks 1 to 9 amino acids (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 and even more preferably 1). Lost amino acid sequence,
(ii) 1 to 9 (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence substituted with an amino acid of
(iii) 1 to 9 (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) amino acid was added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Amino acid sequence,
(iv) Amino acid sequences mutated by the combination of (i) to (iii) above.
ここで、「キヌクリジノン還元酵素活性」とは、３−キヌクリジノンに特異的に作用し、３−キヌクリジノールを生成する触媒活性を意味する。当該酵素活性は、公知方法、例えば特許第４１２４４５３号に記載されたガスクロマトグラフィーによる活性測定法、分光光学法を用いた活性測定法により測定することができる。また、「キヌクリジノン還元酵素活性を有する」とは、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のキヌクリジノン還元酵素活性を100としたときと比較して、10%以上、20％以上、30%以上、好ましくは90%以上の活性を有することを意味する。 Here, “quinuclidinone reductase activity” means a catalytic activity that acts specifically on 3-quinuclidinone to produce 3-quinuclidinol. The enzyme activity can be measured by a known method, for example, an activity measurement method using gas chromatography described in Japanese Patent No. 4124453, or an activity measurement method using a spectroscopic method. In addition, “having quinuclidinone reductase activity” means 10% or more, 20% or more, 30% or more compared to when the quinuclidinone reductase activity of the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is 100 , Preferably means having an activity of 90% or more.
また、本発明のキヌクリジノン還元酵素には、配列番号2に示されるアミノ酸配列と約96％以上、好ましくは約97％以上、より好ましくは約98％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつキヌクリジノン還元酵素活性を有するもの（配列番号2に示されるアミノ酸配列と実質的に同等のアミノ酸配列）も含まれる。相同性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイト、例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST等の相同性検索を利用できる。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、BLASTを用いた検索を行うこともできる。 The quinuclidinone reductase of the present invention has an amino acid sequence having a homology of about 96% or more, preferably about 97% or more, more preferably about 98% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Those having quinuclidinone reductase activity (amino acid sequences substantially equivalent to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) are also included. For homology, homology search such as FASTA, BLAST, PSI-BLAST, etc. can be used on a homology search site using the Internet, for example, Japan DNA Data Bank (DDBJ). In addition, a search using BLAST can be performed in the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press（1989））、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons（1987-1997））、Kunkel（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kramer and Fritz（1987）Method. Enzymol. 154: 350-67、Kunkel（1988）Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。 Here, a polynucleotide encoding an amino acid sequence having a mutation such as deletion, substitution or addition in one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Press (1989)), "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997)), Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92, Kramer and Fritz (1987) Method. Enzymol. 154: 350-67, Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6, and the like.
上記の変異を有するタンパク質を調製するためにポリヌクレオチドに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。 In order to introduce a mutation into a polynucleotide in order to prepare a protein having the above mutation, a mutation introduction kit using a site-directed mutagenesis method such as Kunkel method or Gapped duplex method, for example, QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: Takara Bio) be able to.
さらに、本発明のキヌクリジノン還元酵素には、他のペプチド配列により付加された融合タンパク質が含まれる。上記配列番号２に示すアミノ酸配列またはその変異体のアミノ酸配列に付加するペプチド配列としては、インフルエンザ凝集素（HA）、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、多重ヒスチジンタグ（6×His、10×His等）、FLAG等が挙げられ、これらのペプチド配列は、タンパク質の識別や採取を容易にするものであり、配列等は適宜選択することができる。 Furthermore, the quinuclidinone reductase of the present invention includes fusion proteins added by other peptide sequences. Examples of the peptide sequence added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a variant thereof include influenza agglutinin (HA), glutathione S transferase (GST), multiple histidine tags (6 × His, 10 × His, etc.) , FLAG and the like, and these peptide sequences facilitate the identification and collection of proteins, and the sequences and the like can be appropriately selected.
また、本発明のキヌクリジノン還元酵素には、配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質であって、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質も含まれる。 The quinuclidinone reductase of the present invention is a protein encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, Proteins having quinuclidinone reductase activity are also included.
このようなポリヌクレオチドは、上記部位特異的突然変異誘発法を利用して得ることができ、あるいは、配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法によりcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることもできる。ライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press（1989））等を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。 Such a polynucleotide can be obtained by using the above-mentioned site-directed mutagenesis method, or a colony hybridization, plaque using the polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof as a probe. It can also be obtained from a cDNA library and a genomic library by a known hybridization method such as hybridization and Southern blot. For the method for preparing the library, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold Spring Harbor Press (1989)) and the like can be referred to. Commercially available cDNA libraries and genomic libraries may also be used.
「ストリンジェントな条件」は、BergerとKimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press, San Diego, CA, USA, 1987)に教示されるように、複合体又はプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。 “Stringent conditions” refers to binding of a complex or probe as taught by Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego, CA, USA, 1987). It can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid.
ハイブリダイゼーションは、公知の方法によって行うことができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons（1987-1997））等を参照することができる。 Hybridization can be performed by a known method. Hybridization methods include, for example, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons (1987-1997)), etc. You can refer to it.
（２）酵素の取得
本発明におけるキヌクリジノン還元酵素の供給源は、３−キヌクリジノン又はその塩に特異的に作用してＲ−３−キヌクリジノール又はその塩を生成する酵素が得られる限り、特に限定されるものではない。
(2) Acquisition of enzyme The source of quinuclidinone reductase in the present invention is particularly limited as long as an enzyme that specifically acts on 3-quinuclidinone or a salt thereof to produce R-3-quinuclidinol or a salt thereof is obtained. It is not something.
当該供給源としては、本発明に係る酵素を産生することができる微生物が挙げられる。このような微生物としては、Microbacterium属に属する微生物が好ましい。Microbacterium属に属する微生物としては、好ましいものとしてMicrobacterium esteraromaticum（JCM9172）、Microbacterium arabinogalactanolyticum（JCM9171）、Microbacterium luteolum （JCM 9174）が挙げられる。特に好ましくはMicrobacterium luteolum JCM 9174である。なお、JCM番号が付された菌株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから容易に入手することができる。
Examples of the supply source include microorganisms capable of producing the enzyme according to the present invention. As such a microorganism, a microorganism belonging to the genus Microbacterium is preferable. Examples of the microorganisms belonging to Microbacterium genus, Microbacterium este r aromaticum as preferred (JCM9172), Microbacterium arabinogalactanolyticum (JCM9171 ), Microbacterium luteolum (JCM 9174) can be mentioned. Particularly preferred is Microbacterium luteolum JCM 9174. In addition, the strain with JCM number can be easily obtained from RIKEN BioResource Center.
本発明の酵素の単離精製方法は、蛋白質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーなどのほか、キレート、色素又は抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜組み合わせることにより精製することができる。たとえば、菌体を破砕後、硫安沈澱、Blue-Sepharose カラム、DEAT-Toyopearl 、Hiload Superdex 200 pg FPLC カラム、HAP-C-BEADA hydroxyapatite FPLC カラム、Pros HQ/M FPLC カラム、BioAssistQ FPLCカラムクロマトグラフィー等を行うことにより、ほぼ単一バンド（ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)）にまで精製することができる。
また、このような微生物以外にも、遺伝子工学的手法により当該酵素を産生することが可能となった形質転換微生物（後述）を使用することができる。
The enzyme isolation and purification method of the present invention includes fractionation based on protein solubility (precipitation with organic solvents, salting out with ammonium sulfate, etc.), cation exchange, anion exchange, gel filtration, hydrophobic chromatography, etc. Purification can be carried out by appropriately combining known methods such as affinity chromatography using chelates, dyes or antibodies. For example, after disrupting cells, ammonium sulfate precipitation, Blue-Sepharose column, DEAT-Toyopearl, Hiload Superdex 200 pg FPLC column, HAP-C-BEADA hydroxyapatite FPLC column, Pros HQ / M FPLC column, BioAssistQ FPLC column chromatography, etc. By performing, it is possible to purify to almost a single band (polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)).
In addition to such microorganisms, transformed microorganisms (described later) that are capable of producing the enzyme by genetic engineering techniques can be used.
（３）キヌクリジノン還元酵素遺伝子
本発明はまた、上記キヌクリジノン還元酵素の遺伝子を提供する。なお、ここでいう遺伝子には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡならびにＲＮＡが含まれる。
(3) Quinuclidinone reductase gene The present invention also provides a gene for the above quinuclidinone reductase. The gene referred to here includes genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, and RNA.
当該遺伝子は、前述するアルコール脱水素（タンパク質）をコードする塩基配列を有するものであればよい。具体的には、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ、並びにそのホモログを挙げることができる。ここでホモログとしては、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質（キヌクリジノン還元酵素）と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。
「機能的に同等」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（アルコール脱水素）と同様に、好ましくはpHが約６．０〜８．０の範囲、より好ましくはpHが約６．５〜７．５の範囲でキヌクリジノン還元酵素活性を有することを意味する。
The said gene should just have a base sequence which codes alcohol dehydrogenation (protein) mentioned above. Specific examples include DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and homologs thereof. Here, examples of the homolog include a gene encoding a protein functionally equivalent to a protein (quinuclidinone reductase) encoded by a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
“Functionally equivalent” means that the pH is preferably in the range of about 6.0 to 8.0, more preferably about pH, like the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (alcohol dehydrogenation). It means having quinuclidinone reductase activity in the range of 6.5 to 7.5.
本発明において、ホモログとしては、上記（１）において説明した酵素の性質の（イ）〜（ホ）の少なくとも１つの性質又は特徴を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。かかるホモログとして、具体的には、配列番号１で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド(例えばＤＮＡ）とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。 In the present invention, examples of the homolog can include a polynucleotide encoding a protein having at least one of the properties (i) to (e) of the enzyme described in (1) above. Specific examples of such a homolog include a gene having a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide (eg, DNA) comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Can do.
「ストリンジェントな条件」は前記した条件と同様であり、BergerとKimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press, San Diego, CA, USA, 1987)に教示されるように、複合体又はプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。 “Stringent conditions” are similar to those described above, as taught by Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego, CA, USA, 1987). , Based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid binding the complex or probe.
また、配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１で示される塩基配列において１個又は数個の核酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じた塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。 In addition, the polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, one or several in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. And a polynucleotide containing a base sequence in which mutation such as deletion, substitution or addition has occurred.
ここで、配列番号１で示される塩基配列において１個又は数個の核酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じた塩基配列としては、例えば、
(a) 配列番号１で示される塩基配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）の核酸が欠失した塩基配列、
(b) 配列番号１で示される塩基配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）の核酸が他の核酸で置換された塩基配列、
(c) 配列番号１で示される塩基配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）の核酸が付加した塩基配列、
(d)上記(a)〜(c)の組合せにより変異された塩基配列
などが挙げられる。
Here, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, as a base sequence having a mutation such as deletion, substitution or addition in one or several nucleic acids, for example,
(a) 1 to 10 (eg, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) nucleic acid in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is missing. Lost base sequence,
(b) 1 to 10 (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) nucleic acid in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 A base sequence substituted with the nucleic acid of
(c) 1 to 10 (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) nucleic acid was added to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Base sequence,
(d) Examples include base sequences mutated by the combinations (a) to (c) above.
本酵素遺伝子の単離方法は、精製した酵素のN末端アミノ酸配列や内部ペプチドのアミノ酸配列や特定の機能を持つ酵素は、比較的類似したアミノ酸配列を有することなどを利用して縮重プライマーを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、特定の遺伝子部分配列を増幅することにより取得することができる。 This enzyme gene isolation method uses a degenerate primer utilizing the N-terminal amino acid sequence of the purified enzyme, the amino acid sequence of the internal peptide, and the enzyme having a specific function having a relatively similar amino acid sequence. It can be obtained by designing and amplifying a specific gene partial sequence by polymerase chain reaction (PCR).
たとえば、キヌクリジノン還元酵素の1種であるトロピノン還元酵素遺伝子類で保存されているアミノ酸配列などを比較してプライマー又はプローブを設計し、PCR法により、あるいはコロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法によりcDNAライブラリー、ゲノムライブラリーなどの核酸から得ることができる。ライブラリーの作製方法は、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press（1989））を参照することができる。この際、プライマーには、適当な制限酵素配列やタグ配列等を付加させてもよい。 For example, primers or probes are designed by comparing amino acid sequences conserved in the tropinone reductase gene, which is a kind of quinuclidinone reductase, and PCR or colony hybridization, plaque hybridization, Southern blot It can obtain from nucleic acids, such as a cDNA library and a genomic library, by well-known hybridization methods. For the method for preparing the library, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold Spring Harbor Press (1989)) can be referred to. At this time, an appropriate restriction enzyme sequence or tag sequence may be added to the primer.
ここで、公知の酵素の保存領域を参照して作製されたプライマー等を利用して遺伝子を取得する場合、一般には、比較した酵素と性質の似た酵素遺伝子が得られるはずである。
しかしながら、本発明の酵素は、従来知られていた酵素とは全く性質の異なる酵素であり、本発明によって意外にもこのような酵素をコードする遺伝子が得られたことは、当業者が予測し得るものではないといえる。
Here, when a gene is obtained using a primer or the like prepared by referring to a known enzyme storage region, an enzyme gene having properties similar to those of the compared enzyme should generally be obtained.
However, the enzyme of the present invention is an enzyme having completely different properties from conventionally known enzymes, and it is predicted by a person skilled in the art that a gene encoding such an enzyme was unexpectedly obtained by the present invention. It can be said that it is not what you get.
さらに、本発明のキヌクリジノン還元酵素は、本発明で開示するアミノ酸配列に基づいてPCR法等の化学的または遺伝子工学的手法によって製造することができる。遺伝子工学的手法による本発明の酵素の製造方法の詳細については、後述する。また、アミノ酸配列における改変は、当業界において既に公知な方法、例えば部位特異的変異導入法[Current Protocols I molecular Biology, edit. Ausubel et al., John Wily & Sons, Section 8. 1-8.5 (1987)]等を用いて、改変しようとするアミノ酸配列に、適宜、置換、欠失、挿入、付加、逆位などの変異を導入することによって行うことができる。 Furthermore, the quinuclidinone reductase of the present invention can be produced by a chemical or genetic engineering technique such as PCR based on the amino acid sequence disclosed in the present invention. Details of the method for producing the enzyme of the present invention by genetic engineering techniques will be described later. Further, the amino acid sequence can be modified by a method already known in the art, for example, site-directed mutagenesis [Current Protocols I molecular Biology, edit. Ausubel et al., John Wily & Sons, Section 8.1-8.5 (1987 )], Etc., can be used by appropriately introducing mutations such as substitution, deletion, insertion, addition and inversion into the amino acid sequence to be modified.
ストリンジェントな条件としては、前述のものを同様に挙げることができる。具体的なホモログとしては、配列番号３で示される塩基配列を有する遺伝子（当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列：配列番号４）を挙げることができる。 Examples of the stringent conditions include those described above. Specific examples of the homologue include a gene having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (amino acid sequence of the protein encoded by the gene: SEQ ID NO: 4).
本発明において、塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができ、例えば、適当なDNAシークエンサーを利用して配列が解析される。
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が決定されると、その後は、当該塩基配列情報に基づき、PCR法により、あるいは他の化学的な合成法によって本発明の遺伝子を調製することができる。
In the present invention, the nucleotide sequence can be confirmed by sequencing by a conventional method. For example, the sequence is analyzed using an appropriate DNA sequencer.
Once the base sequence of the gene of the present invention is determined, the gene of the present invention can then be prepared by PCR or other chemical synthesis methods based on the base sequence information.
（４）組み換えベクター
本発明は、上記キヌクリジノン還元酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクターを提供する。当該組み換えベクターは、上記キヌクリジノン還元酵素をコードする遺伝子を、所望の宿主細胞内で発現可能な状態で含んでおり、当該宿主細胞を形質転換するために使用される。
(4) Recombinant Vector The present invention provides a recombinant vector containing a gene encoding the above quinuclidinone reductase. The recombinant vector contains the gene encoding the quinuclidinone reductase in a state that can be expressed in a desired host cell, and is used to transform the host cell.
したがって、本発明の組換えベクターは、宿主細胞の形質転換が達成できる形態を有するものであればよく、例えばプラスミド、バクテリオファージ、レトロトランスポゾンの形態を有するものであってもよい。 Accordingly, the recombinant vector of the present invention may be any vector as long as it has a form capable of achieving transformation of a host cell, and may have a form such as a plasmid, bacteriophage, or retrotransposon.
本発明の組換えベクター（発現ベクター）は、宿主として大腸菌（E. coli）や枯草菌（B. subtilis）などの細菌を使用する場合、一般に、少なくともプロモーター−オペレーター領域（プロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合領域（SD領域）を含む）、開始コドン、本発明のキヌクリジノン還元酵素遺伝子、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を有する。 The recombinant vector of the invention (expression vectors), when using a bacterium such as E. coli as a host (E. coli) and Bacillus subtilis (B subtilis.), In general, at least a promoter - operator region (promoter, operator and ribosome binding Region (including SD region), a start codon, a quinuclidinone reductase gene of the present invention, a stop codon, a terminator region, and a replicable unit.
また、酵母等の真菌細胞または動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、一般に、少なくともプロモーター、開始コドン、シグナルペプチド及び本発明のキヌクリジノン還元酵素遺伝子、及び終止コドンを有する。 When a fungal cell such as yeast or an animal cell is used as a host cell, it generally has at least a promoter, an initiation codon, a signal peptide and the quinuclidinone reductase gene of the present invention, and a stop codon.
また、本発明の組み換えベクター（発現ベクター）は、必要に応じて、エンハンサーなどのシスエレメント、本発明のキヌクリジノン還元酵素遺伝子の5'側または3'側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、複製可能単位、相同領域、選択マーカーを含むことができる。これらのエレメントは、本発明のキヌクリジノン還元酵素遺伝子の発現に用いられる宿主に対応したものであれば、特に制限されず、当分野の技術常識に基づいて選択することができる。 In addition, the recombinant vector (expression vector) of the present invention may contain, as necessary, a cis element such as an enhancer, a 5 ′ or 3 ′ untranslated region of the quinuclidinone reductase gene of the present invention, a splicing junction, Site, replicable unit, homologous region, selectable marker. These elements are not particularly limited as long as they correspond to the host used for the expression of the quinuclidinone reductase gene of the present invention, and can be selected based on the common general technical knowledge in this field.
なお、選択マーカーとしては、特に制限されず、例えば遺伝子発現に使用される宿主が細菌の場合は、薬剤抵抗性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、シクロヘキシミド耐性遺伝子、テトラマイシン耐性遺伝子など）、宿主が細菌以外の例えば酵母などの場合は、栄養要求性遺伝子（例えば、ＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ４など）などを始めとする公知の各種選択マーカーを利用することができる。 The selection marker is not particularly limited. For example, when the host used for gene expression is a bacterium, a drug resistance gene (for example, ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene, cycloheximide resistance gene, tetramycin resistance gene, etc.) ) When the host is other than bacteria, such as yeast, various known selection markers including auxotrophic genes (for example, HIS4, URA3, LEU2, ARG4, etc.) can be used.
本発明の組換えベクター（発現ベクター）は、簡便には、上記本発明のキヌクリジノン還元酵素遺伝子を、公知の発現用ベクターに、目的のキヌクリジノン還元酵素が発現可能な状態で導入することによって、具体的にはプロモーターの下流に導入することによって作製することができる。かかる導入は、ＤＮＡ組換えの一般的な方法、例えばMolecular Cloning. (1989). (Cold Spring Harbor Lab.)に記載される方法に従って行うことができる。 The recombinant vector (expression vector) of the present invention can be conveniently prepared by introducing the quinuclidinone reductase gene of the present invention into a known expression vector in a state where the target quinuclidinone reductase can be expressed. Specifically, it can be prepared by introducing it downstream of the promoter. Such introduction can be performed according to a general method of DNA recombination, for example, a method described in Molecular Cloning. (1989). (Cold Spring Harbor Lab.).
発現用ベクターに用いるプラスミドベクターとして、例えばpRS413、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112またはpAUR123などのYCp型大腸菌（E. coli）-酵母シャトルベクター；pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101またはpAUR135などのYIp型大腸菌（E.coli）-酵母シャトルベクター；大腸菌（E. coli）由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396またはpTrc99AなどのColE系プラスミド；pACYC177またはpACYC184などのp1A系プラスミド；pMW118、pMW119、pMW218またはpMW219などのpSC101系プラスミドなど）；枯草菌（B.subtilis）由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5など）；pHSP64などの大腸菌（E. coli）-枯草菌（B. subtilis）シャトルベクターを挙げることができる。 Examples of plasmid vectors used for expression vectors include YCp-type E. coli- yeast shuttle vectors such as pRS413, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 or pAUR123; YIp such as pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pAUR101 or pAUR135. Type E. coli- yeast shuttle vector; plasmids derived from E. coli (for example, pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHSG298, pHSG396, or pTrc99A); p1A-based plasmids such as pACYC177 or pACYC184; pSC101-based plasmids such as pMW118, pMW119, pMW218 or pMW219; plasmids derived from B. subtilis (eg pUB110, pTP5 etc.); E. coli such as pHSP64 ( E. coli) ) - can be exemplified Bacillus subtilis (B subtilis) shuttle vector..
またファージベクターとして、λファージ（Charon 4A, Charon21A, EMBL4, λgt100, gt11, zap）、ψX174、M13mp18、M13mp19などを挙げることができる。レトロトランスポゾンとしてはTy因子などを挙げることができる。また、融合タンパク質として発現する発現ベクター、例えばpGEXシリーズ（ファルマシア製）、pMALシリーズ（Biolabs社製）を使用することもできる。 Examples of phage vectors include λ phage (Charon 4A, Charon21A, EMBL4, λgt100, gt11, zap), ψX174, M13mp18, and M13mp19. Examples of retrotransposons include Ty factor. In addition, expression vectors that are expressed as fusion proteins, such as pGEX series (Pharmacia) and pMAL series (Biolabs) can also be used.
（５）形質転換体
以下、より詳細に形質転換（導入）体（以下、単に「形質転換体」と称す）の作製方法について説明する。
形質転換体を作製するための発現ベクターは、宿主細胞中にてプラスミドが増殖するために必要なＤＮＡ配列、プロモーター、リボソーム結合配列、転写終結配列、更に好ましくは形質転換体の選択マーカーとなる遺伝子を含む。
(5) Transformant Hereinafter, a method for producing a transformed (introduced) body (hereinafter simply referred to as “transformant”) will be described in more detail.
An expression vector for producing a transformant is a DNA sequence, a promoter, a ribosome binding sequence, a transcription termination sequence, and more preferably a gene that serves as a selectable marker for the transformant. including.
プロモーター配列としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーターなどが挙げられる。また、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等を挙げることができる。さらに、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター等の独自に改変及び設計された配列も利用できる。 Examples of the promoter sequence include trp promoter of tryptophan operon derived from E. coli, lac promoter of lactose operon, PL promoter and PR promoter derived from lambda phage, and the like. Moreover, Bacillus subtilis-derived gluconic acid synthase promoter (gnt), alkaline protease promoter (apr), neutral protease promoter (npr), α-amylase promoter (amy) and the like can be mentioned. Furthermore, uniquely modified and designed sequences such as tac promoter and trc promoter can also be used.
リボソーム結合配列としては、ＳＤ配列やKozak配列が知られており、これらの配列を変異遺伝子の上流に挿入することができる。原核生物を宿主に用いるときにはＳＤ配列を、真核細胞を宿主に用いるときにはＫｏｚａｋ配列をＰＣＲ法等により付加してもよい。ＳＤ配列としては、大腸菌由来、ロドコッカス 属細菌または枯草菌由来の配列等を挙げることができるが、所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。例えば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作製してこれを利用してもよい。
転写終結配列は発現ベクターの構築には必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。
選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。
宿主としては、上記の酵素遺伝子が発現するものであれば良い。例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌、枯草菌、酵母、カビ、植物等を挙げることができる。好ましくは、大腸菌及びロドコッカス 属細菌である。
大腸菌宿主としては、例えば大腸菌Ｋ１２株やＢ株、あるいはそれら野生株由来の派生株であるJM109株、XL1-Blue株、C600株、W3110株等を挙げることができる。その他、これら菌株の変異体、組換え体および遺伝子工学的手法による誘導体等も用いられ得る。
SD sequences and Kozak sequences are known as ribosome binding sequences, and these sequences can be inserted upstream of the mutated gene. An SD sequence may be added by PCR or the like when a prokaryotic organism is used as a host, and a Kozak sequence may be added when a eukaryotic cell is used as a host. Examples of the SD sequence include E. coli-derived, Rhodococcus genus bacteria, and Bacillus subtilis-derived sequences, but are not particularly limited as long as the sequence functions in a desired host. For example, a consensus sequence in which a sequence complementary to the 3 ′ terminal region of 16S ribosomal RNA is continuous by 4 bases or more may be prepared by DNA synthesis and used.
A transcription termination sequence is not necessarily required for the construction of an expression vector, but a p-factor-independent one such as a lipoprotein terminator, a trp operon terminator, etc. can be used.
Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a kanamycin resistance gene, and the like.
Any host that expresses the above-described enzyme gene may be used. For example, mammalian cells, insect cells, E. coli, Bacillus subtilis, yeasts, molds, plants and the like can be mentioned. Preferred are Escherichia coli and Rhodococcus bacteria.
Examples of the E. coli host include E. coli K12 strain and B strain, or JM109 strain, XL1-Blue strain, C600 strain, W3110 strain and the like derived from these wild strains. In addition, mutants of these strains, recombinants, derivatives by genetic engineering techniques, and the like can also be used.
ロドコッカス 属細菌としては、例えばロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC 12674株やロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J-1株(FERM BP-1478)等を挙げることができる。
大腸菌を宿主に用いる場合には、特に有用なベクターとしては、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２３３−２、ｐＦＹ５２９、ｐＥＴ−１２、ｐＥＴ−２６ｂ等が例示される。これらベクターに本発明のキヌクリジノン還元酵素遺伝子又はその断片を組み込むには、これらを含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、必要であれば適当なリンカ−を付加した後、適当な制限酵素で切断したベクターと結合させることにより行うことができる。
このようにして得られた発現ベクターを宿主細胞に導入すれば、本発明のキヌクリジノン還元酵素を高発現する形質転換体が得られる。そして、当該形質転換体を培養することにより、これらの酵素を発現・蓄積させることができる。
Examples of bacteria belonging to the genus Rhodococcus include Rhodococcus rhodochrous ATCC 12674 strain, Rhodococcus rhodochrous J-1 strain (FERM BP-1478), and the like.
When Escherichia coli is used as a host, particularly useful vectors include pTrc99A, pKK233-2, pFY529, pET-12, pET-26b and the like. In order to incorporate the quinuclidinone reductase gene of the present invention or a fragment thereof into these vectors, the DNA containing them is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and if necessary, an appropriate linker is added and then cleaved with an appropriate restriction enzyme. This can be carried out by ligation with the prepared vector.
When the expression vector thus obtained is introduced into a host cell, a transformant that highly expresses the quinuclidinone reductase of the present invention can be obtained. These enzymes can be expressed and accumulated by culturing the transformant.
発現ベクターの宿主への導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等を用いることができる。酵母への発現プラスミドの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。 The method for introducing the expression vector into the host is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA. For example, a method using calcium ions, an electroporation method, and the like can be given. When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe , Pichia pastoris, etc. can be used. The method for introducing an expression plasmid into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast, and examples thereof include an electroporation method, a spheroplast method, and a lithium acetate method.
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、CHO細胞、マウスＬ細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。 When animal cells are used as hosts, monkey cells COS-7, Vero, CHO cells, mouse L cells, rat GH3, human FL cells and the like are used. Examples of methods for introducing a recombinant vector into animal cells include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a lipofection method.
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が用いられる。 When insect cells are used as hosts, Sf9 cells, Sf21 cells and the like are used. As a method for introducing a recombinant vector into insect cells, for example, calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method and the like are used.
植物細胞を宿主とする場合は、タバコBY-2細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法、エレクトロポレーション法等が用いられる。 When plant cells are used as hosts, tobacco BY-2 cells and the like can be mentioned, but are not limited thereto. As a method for introducing a recombinant vector into a plant cell, for example, an Agrobacterium method, a particle gun method, a PEG method, an electroporation method, or the like is used.
（６）キヌクリジノン還元酵素の製造
このようにして得られた形質転換体は、宿主に応じて適切な培地中で培養されることによって、本発明の新規キヌクリジノン還元酵素を産生することができる。本発明は、かかる形質転換体を利用した新規キヌクリジノン還元酵素の製造方法を提供するものである。当該方法は、具体的には、上記の形質転換体を培地で培養し、得られた培養物から、キヌクリジノン還元酵素を採取することによって実施することができる。
(6) Production of quinuclidinone reductase The transformant thus obtained can be cultured in an appropriate medium according to the host, whereby the novel quinuclidinone reductase of the present invention can be produced. The present invention provides a method for producing a novel quinuclidinone reductase using such a transformant. Specifically, the method can be carried out by culturing the above transformant in a medium and collecting quinuclidinone reductase from the obtained culture.
本発明において、「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。 In the present invention, the “culture” means any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells. The method for culturing the transformant of the present invention is carried out according to a usual method used for culturing a host.
培地には、上記形質転換体の生育に必須な炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、薬剤などが含有される。炭素源としてはマンナン成分、アラビノース、セロビオース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、グリセロール、イノシトール、ラクトース、マンニトール、マンノース、ラフィノース、ラムノース、スクロース、トレハロース、キシロースが；窒素源としては硫酸アンモニウムや塩化アンモニウムなどの無機窒素、並びにカゼイン分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン及びビーフ抽出物などの有機窒素源；無機塩としては例えば二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等；ビタミンとしてはビタミンＢ１を始めとする各種のビタミン；薬剤としてはアンピシリン、ネオマイシン、シクロヘキシミド、テトラマイシンなどの各種抗生物質を挙げることができる。なお、これらは一例であり、これらに制限はされない。 The medium contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, a vitamin, a drug and the like essential for the growth of the transformant. Carbon sources include mannan components, arabinose, cellobiose, fructose, galactose, glucose, glycerol, inositol, lactose, mannitol, mannose, raffinose, rhamnose, sucrose, trehalose and xylose; nitrogen sources include inorganic nitrogen such as ammonium sulfate and ammonium chloride And organic nitrogen sources such as casein degradation product, yeast extract, polypeptone, bactotryptone and beef extract; inorganic salts such as sodium diphosphate or potassium diphosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium chloride, sulfuric acid Magnesium, calcium chloride, etc .; various vitamins such as vitamin B1 as vitamins; various drugs such as ampicillin, neomycin, cycloheximide, tetramycin Mention may be made of the raw material. These are merely examples, and are not limited thereto.
培地の一例としては、宿主が大腸菌などのグラム陰性菌、または枯草菌などのグラム陽性菌といった細菌の場合は、ＬＢ培地（日水製薬）、Ｍ９培地（J. Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, p.431, 1972）などが；また宿主が酵母の場合、ＹＰＤ培地（１％ Bacto yeast extract, ２％ Bacto peptone, ２％ glycerol）、ＹＰＧ培地（１％ Bacto yeast extract, ２％ Bacto peptone, ２％ glycerol）、ＹＰ培地（１％ Bacto yeast extract, ２％ Bacto peptone、ＹＰＤ培地（１％ Bacto yeast extract, ２％ Bacto peptone, ２％ glucose）、０．７％ Yeast Nitrogen Base (Difco社)、ＹＰ培地〔１％ Bacto yeast extract (Difco社) , ２％ Polypeptone S (日本製薬)〕、などが例示される。 As an example of the medium, when the host is a gram-negative bacterium such as Escherichia coli or a gram-positive bacterium such as Bacillus subtilis, LB medium (Nissui Pharmaceutical), M9 medium (J. Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, p.431, 1972); and when the host is yeast, YPD medium (1% Bacto yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% glycerol), YPG medium (1% Bacto yeast extract) , 2% Bacto peptone, 2% glycerol), YP medium (1% Bacto yeast extract, 2% Bacto peptone, YPD medium (1% Bacto yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% glucose), 0.7% Yeast Nitrogen Examples include Base (Difco), YP medium [1% Bacto yeast extract (Difco), 2% Polypeptone S (Nippon Pharmaceutical)], and the like.
培養は、通常10〜40℃の温度範囲で数〜80時間程度実施され、必要に応じて通気、攪拌を加えることもできる。培養温度は、宿主に応じて設定できるため、特に制限されないが、好ましくは18〜42℃、より好ましくは25〜38℃の範囲で実施することができる。 The culture is usually carried out in the temperature range of 10 to 40 ° C. for about several to 80 hours, and aeration and agitation can be added as necessary. The culture temperature can be set according to the host and is not particularly limited. However, the culture temperature is preferably 18 to 42 ° C, more preferably 25 to 38 ° C.
本発明のキヌクリジノン還元酵素の製造方法は、さらに、このようにして得られる培養物から目的のキヌクリジノン還元酵素を採取することによって実施される。目的タンパク質の採取は、培養後、培養上清中または形質転換体（菌体）中に蓄積された、目的のタンパク質を公知の方法で抽出し、また必要に応じて精製することによって行うことができる。 The method for producing a quinuclidinone reductase of the present invention is further carried out by collecting the target quinuclidinone reductase from the culture thus obtained. The target protein can be collected by extracting the target protein accumulated in the culture supernatant or in the transformant (bacteria) by a known method after culture, and purifying as necessary. it can.
本発明の酵素の単離精製方法は、蛋白質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。 The method for isolating and purifying the enzyme of the present invention includes fractionation based on protein solubility (precipitation with organic solvent, salting out with ammonium sulfate, etc.), cation exchange, anion exchange, gel filtration, hydrophobic chromatography, chelation, Purification can be performed by appropriately combining known methods such as affinity chromatography using dyes, antibodies, and the like.
たとえば、菌体を破砕後、硫安沈澱、Blue-Sepharose カラム、DEAT-Toyopearl 、Hiload Superdex 200pg FPLC カラム、HAP-C-BEADA hydroxyapatiteFPLC カラム、Pros HQ/M FPLC カラム、BioAssistQ FPLCカラムクロマトグラフィー等を行うことによりポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一バンドにまで精製することができる。 For example, after disrupting cells, perform ammonium sulfate precipitation, Blue-Sepharose column, DEAT-Toyopearl, Hiload Superdex 200pg FPLC column, HAP-C-BEADA hydroxyapatiteFPLC column, Pros HQ / M FPLC column, BioAssistQ FPLC column chromatography, etc. Can be purified to almost single band by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
また、本発明においては、上記キヌクリジノン還元酵素遺伝子又は上記ベクターから無細胞タンパク質合成系を採用して、キヌクリジノン還元酵素を産生することが可能である。 In the present invention, it is possible to produce a quinuclidinone reductase by employing a cell-free protein synthesis system from the quinuclidinone reductase gene or the vector.
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。 The cell-free protein synthesis system is a system that synthesizes a protein in an artificial container such as a test tube using a cell extract. The cell-free protein synthesis system used in the present invention includes a cell-free transcription system that synthesizes RNA using DNA as a template.
上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスL-細胞、HeLa細胞、CHO細胞、出芽酵母、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されないものであってもよい。細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿等によって得ることができる。 The cell extract is an eukaryotic or prokaryotic cell-derived extract such as wheat germ, rabbit reticulocyte, mouse L-cell, HeLa cell, CHO cell, budding yeast, or Escherichia coli. Can do. Note that these cell extracts may be concentrated or not concentrated. The cell extract can be obtained, for example, by ultrafiltration, dialysis, polyethylene glycol (PEG) precipitation or the like.
さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTM System（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。 Furthermore, in the present invention, cell-free protein synthesis can also be performed using a commercially available kit. Examples of such kits include reagent kits PROTEIOS ™ (Toyobo), TNT ™ System (Promega), synthesizer PG-Mate ™ (Toyobo), RTS (Roche Diagnostics) and the like.
上記のように細胞タンパク質合成によって得られるキヌクリジノン還元酵素は、前述のように適宜クロマトグラフィー等を選択して、精製することができる。 The quinuclidinone reductase obtained by cell protein synthesis as described above can be purified by appropriately selecting chromatography or the like as described above.
（７）光学活性３−キヌクリジノールの生成
本発明において、３−キヌクリジノンの塩又は３−キヌクリジノールの塩とは、当該化合物中に存在する窒素原子を、有機酸又は鉱酸等により塩を形成させたものを意味する。
(7) Production of optically active 3-quinuclidinol In the present invention, a salt of 3-quinuclidinone or a salt of 3-quinuclidinol is formed by forming a salt of a nitrogen atom present in the compound with an organic acid or a mineral acid. Means things.
鉱酸塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等が例示できる。有機酸塩としては酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、フマル酸、マロン酸、シュウ酸等の脂肪族有機酸塩、安息香酸等の芳香族有機酸塩等が例示される。 Examples of mineral acid salts include hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate and the like. Examples of organic acid salts include aliphatic organic acid salts such as acetate, propionate, butyrate, fumaric acid, malonic acid, and oxalic acid, and aromatic organic acid salts such as benzoic acid.
本発明において、酵素とは、精製酵素に限定されず、当該酵素を含む微生物、粗精製物、固定化物等も含まれる。また、本発明において、形質転換微生物とは本発明の酵素をコードする遺伝子が導入され、該遺伝子が発現した組換え微生物をいう。その宿主としては、例えば、エシェリキア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ピキア（Pichia）属、カンジダ（Candida）属、アスペルギルス（Aspergillus）属などが挙げられる。 In the present invention, the enzyme is not limited to a purified enzyme, and includes a microorganism containing the enzyme, a roughly purified product, an immobilized product, and the like. In the present invention, a transformed microorganism refers to a recombinant microorganism into which a gene encoding the enzyme of the present invention has been introduced and expressed. Examples of the host include the genus Escherichia, the genus Bacillus, the genus Pseudomonas, the genus Pichia, the genus Candida, and the genus Aspergillus.
さらに、形質転換微生物の「処理物」とは、アセトン乾燥微生物菌体、凍結乾燥微生物菌体、機械的並びに酵素的方法により細胞壁を破砕した無細胞抽出物、界面活性剤、有機溶媒などにより処理したものあるいはそれらの固定化物などをいう。 In addition, “processed products” of transformed microorganisms are treated with acetone-dried microbial cells, freeze-dried microbial cells, cell-free extracts whose cell walls have been disrupted by mechanical and enzymatic methods, surfactants, organic solvents, etc. Or the immobilization product thereof.
本発明において、不斉還元反応によるＲ−３−キヌクリジノール又はその塩の生産は、以下の方法で行うことができる。グルコース、ギ酸、イソプロパノール、エタノール、メタノール等のエネルギー源の存在下、水または緩衝液等の反応溶媒中で３−キヌクリジノン又はその塩に酵素、形質転換微生物、または該菌体処理物を接触させることにより行うことができる。このとき、必要に応じて補酵素（NADH、NADPH、NAD+、NADP+）を添加すればよい。本発明においてはNADHを添加することが好ましい。 In the present invention, production of R-3-quinuclidinol or a salt thereof by an asymmetric reduction reaction can be performed by the following method. Contacting 3-quinuclidinone or a salt thereof with an enzyme, a transformed microorganism, or a treated product thereof in the presence of an energy source such as glucose, formic acid, isopropanol, ethanol, or methanol in a reaction solvent such as water or a buffer solution. Can be performed. At this time, a coenzyme (NADH, NADPH, NAD + , NADP + ) may be added as necessary. In the present invention, it is preferable to add NADH.
当該反応は一バッチで行っても良いし、反応基質（３−キヌクリジノン又はその塩）、補酵素、エネルギー源等を適宜加え、反応を継続させることも可能である。継続して反応を行う場合には、反応液のpHを制御しながら反応を行えばよい。 The reaction may be performed in one batch, or a reaction substrate (3-quinuclidinone or a salt thereof), a coenzyme, an energy source, or the like may be appropriately added to continue the reaction. When the reaction is continued, the reaction may be performed while controlling the pH of the reaction solution.
また、還元反応に付随してＮＡＤＨから生成するＮＡＤ+の、ＮＡＤＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤ+還元能（解糖系など）を用いて行うことができる場合がある。これらＮＡＤ+還元能は、反応系にグルコースやエタノールを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤ+からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。 In some cases, NAD + produced from NADH accompanying the reduction reaction can be regenerated to NADH using the NAD + reducing ability (such as glycolysis) of microorganisms. These NAD + reducing ability can be enhanced by adding glucose or ethanol to the reaction system. Moreover, it can also carry out by adding the microorganisms which have the capability to produce | generate NADH from NAD + , its processed material, and an enzyme to a reaction system.
反応液中の基質濃度は特に限定されるものではないが、例えば、０．０１〜５０重量％が好ましく、生産性等の面からも０．０５〜３０重量％の濃度で実施するのが好ましい。反応液中の酵素等の触媒の濃度は、その形状及びその活性により適宜決定され、特に限定されない。反応温度は０〜６０℃が好ましく、５〜５０℃がより好ましい。 The substrate concentration in the reaction solution is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 50% by weight, for example, and it is preferably carried out at a concentration of 0.05 to 30% by weight from the viewpoint of productivity. . The concentration of a catalyst such as an enzyme in the reaction solution is appropriately determined depending on its shape and its activity, and is not particularly limited. The reaction temperature is preferably 0 to 60 ° C, more preferably 5 to 50 ° C.
反応液のpHは用いる酵素の至適pH等を考慮して、特に限定されず、総合的に決定される。pH５〜１０程度の範囲でも反応を行うことが可能であるが、本酵素の至適ｐＨ6.0から8.0の範囲で実施することがより好ましい。また、反応が進行するに従いpHが変化してくるが、この場合は適当な中和剤を添加して最適pHに調整することができる。 The pH of the reaction solution is not particularly limited and is determined comprehensively in consideration of the optimum pH of the enzyme used. Although it is possible to carry out the reaction even in the range of about pH 5 to 10, it is more preferable to carry out in the range of optimum pH 6.0 to 8.0 for the enzyme. In addition, the pH changes as the reaction proceeds. In this case, an appropriate neutralizing agent can be added to adjust the pH to an optimum value.
反応溶媒は、通常はイオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、３−キヌクリジノン又はその塩の溶解を促進させるために、有機溶媒又は界面活性剤を含んだ系でも反応を行うことができる。 The reaction solvent is usually an aqueous medium such as ion-exchanged water or a buffer. However, in order to promote dissolution of 3-quinuclidinone or a salt thereof, the reaction can be performed in a system containing an organic solvent or a surfactant. Can do.
有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、t-ブチルアルコール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒、その他アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド等の一種又は複数を適宜選択して使用することができる。 Examples of the organic solvent include alcohol solvents such as methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, t-butyl alcohol, and t-amyl alcohol, and aliphatic hydrocarbon solvents such as pentane, hexane, heptane, and octane. , Aromatic hydrocarbon solvents such as benzene, toluene and xylene, halogenated hydrocarbon solvents such as methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride and dichloroethane, ether solvents such as diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran and dioxane, acetic acid Ester solvents such as ethyl, propyl acetate and butyl acetate, ketone solvents such as acetone, methyl ethyl ketone and methyl isobutyl ketone, and one or more of acetonitrile, N, N-dimethylformamide and the like are appropriately selected and used. It can be.
また、これらの有機溶媒又は界面活性剤を水への溶解度以上に加えて２層系で反応を行うことも可能である。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などを向上させることも可能である。
反応時間は、目的とする化合物の量や酵素活性の続く時間等を考慮して、当業者であれば適宜選択することができるが、通常、１時間〜１週間程度、好ましくは１〜72時間程度が好ましい。
It is also possible to carry out the reaction in a two-layer system by adding these organic solvents or surfactants above the solubility in water. By allowing an organic solvent to coexist in the reaction system, the selectivity, conversion rate, yield, and the like can be improved.
The reaction time can be appropriately selected by those skilled in the art in consideration of the amount of the target compound and the duration of the enzyme activity, and is usually about 1 hour to 1 week, preferably 1 to 72 hours. The degree is preferred.
反応終了混合液からの目的物の単離は、除菌後、濃縮、抽出、カラム分離、結晶化等通常の公知の方法によって行うことができる。例えば、ｐＨをアルカリ性に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル等のエステル類；ヘキサン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素類；塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類； ブタノール、イソブタノール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒等一般的な溶媒により抽出分離することができる。 The target product can be isolated from the reaction mixture after completion of sterilization by usual known methods such as concentration, extraction, column separation, and crystallization. For example, after adjusting the pH to alkaline, ethers such as diethyl ether and diisopropyl ether; esters such as ethyl acetate; hydrocarbons such as hexane, benzene and toluene; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride; butanol, iso Extraction and separation can be performed using a general solvent such as an alcohol solvent such as butanol or t-amyl alcohol.
目的物が光学活性３−キヌクリジノールであることの確認は、ガスクロマトグラフィーあるいは、高速液体クロマトグラフィーにより、標品と溶出時間を比較することにより行われる。 Confirmation that the target product is optically active 3-quinuclidinol is carried out by comparing the elution time with a sample by gas chromatography or high performance liquid chromatography.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to the scope of these examples.
Microbacterium luteolumのキヌクリジノン還元酵素遺伝子の取得
キヌクリジノンを（R）-キヌクリジノールに還元する公知の酵素（トロピノン還元酵素I及びII：Hashimoto et al. Plant Physiol. (1992) 100, 836-845）のアミノ酸配列を参考にして保存領域を推定し、アミノ酸配列を塩基配列に変換した縮重プライマーを設計した。
Acquiring the quinuclidinone reductase gene of Microbacterium luteolum The amino acid sequence of known enzymes (tropinone reductase I and II: Hashimoto et al. Plant Physiol. (1992) 100, 836-845) that reduce quinuclidinone to (R) -quinuclidinol Conserved regions were estimated with reference, and degenerate primers in which amino acid sequences were converted to base sequences were designed.
Microbacterium luteolum JCM 9174株のゲノムDNAをMicrobial DNA Isolation Kit （MO BIO Laboratories，Inc.）を用いて抽出した。この抽出したゲノムDNAを鋳型として、以下の塩基配列を持つ縮重プライマー（FW1及びRV1）を用いて、KOD -Plus- Ver.2（東洋紡社）及びThermalCyclerを用いて、PCR反応を行った。 Genomic DNA of Microbacterium luteolum JCM 9174 strain was extracted using Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc.). Using this extracted genomic DNA as a template, PCR reaction was performed using KOD-Plus-Ver.2 (Toyobo Co., Ltd.) and ThermalCycler using degenerate primers (FW1 and RV1) having the following base sequences.
FW:5’-ACNGCNYTNGTBACNGGYGGY-3’（配列番号５）
RV:5’-NCCNGTNAYRTARCTNGCNGCNGG-3’（配列番号６）
PCR反応液組成：
ゲノムDNA ２μl
プライマー FW１（100μM） １．５μl
プライマー RV１（100μM） １．５μl
×10 buffer for KOD-plus- ver.2 ５μl
２ｍＭ dNTP mix ５μl
２５ｍＭ MgSO4 ３μl
KOD-plus-（DNAポリメラーゼ） １μl
蒸留水 ３１μl
反応は、９４℃で２分間の加熱処理を行った後、９８℃で１０秒間の変性、３７℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で１分間の伸長反応のサイクルを３０サイクル行い、その後６８℃で２分間処理した。精製はWizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ）を用いて行った。
その結果、特異的な約700bpの増幅断片を得た。
得られた増幅断片の塩基配列を決定し、さらに、DNA Walking SppedUp Premix Kit (Seegene社)を用いて、ゲノムDNA上の取得配列両側の未知配列を決定し、Microbacterium luteolumのキヌクリジノン還元酵素遺伝子の全配列を決定した（配列番号２）。
FW: 5'-ACNGCNYTNGTBACNGGYGGY-3 '(SEQ ID NO: 5)
RV: 5'-NCCNGTNAYRTARCTNGCNGCNGG-3 '(SEQ ID NO: 6)
PCR reaction solution composition:
Genomic DNA 2μl
Primer FW1 (100 μM) 1.5 μl
Primer RV1 (100 μM) 1.5 μl
× 10 buffer for KOD-plus- ver.2 5μl
2 mM dNTP mix 5 μl
25 mM MgSO4 3 μl
KOD-plus- (DNA polymerase) 1μl
31μl of distilled water
The reaction was performed at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of denaturation at 98 ° C. for 10 seconds, annealing at 37 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 68 ° C. for 1 minute. For 2 minutes. Purification was performed using Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega).
As a result, a specific amplified fragment of about 700 bp was obtained.
Determine the nucleotide sequence of the obtained amplified fragment, and further determine the unknown sequence on both sides of the acquired sequence on the genomic DNA using the DNA Walking SppedUp Premix Kit (Seegene), and the entire quinuclidinone reductase gene of Microbacterium luteolum. The sequence was determined (SEQ ID NO: 2).
Microbacterium luteolumのキヌクリジノン還元酵素遺伝子の発現ベクターの構築
実施例１にて調製したMicrobacterium luteolum JCM 9174株のゲノムDNAを鋳型として、及び以下のプライマー（FW2及びRV2）を用いてPCRを行った。
Construction of an expression vector for the quinuclidinone reductase gene of Microbacterium luteolum PCR was performed using the genomic DNA of Microbacterium luteolum JCM 9174 strain prepared in Example 1 as a template and using the following primers (FW2 and RV2).
FW2:5’-ATGATCATGAACCTCACCGA-3’（配列番号７）
RV2:5’-CTATTGTGCGGTGTATCCTC-3’（配列番号８）
PCR反応液組成：
ゲノムDNA ２μl
プライマー FW２（100μM） １．５μl
プライマー RV２（100μM） １．５μl
×10 buffer for KOD-plus- ver.2 ５μl
２ｍＭ dNTP mix ５μl
２５ｍＭ MgSO4 ３μl
KOD-plus-（DNAポリメラーゼ） １μl
蒸留水 ３１μl
PCR反応は、KOD -Plus- Ver.2（東洋紡社）及びThermalCyclerを用いて行い（サイクル条件：９４℃で２分間の加熱処理を行った後、９８℃で１０秒間の変性、３７℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で１分間の伸長反応のサイクルを３０サイクル）、得られた特異的な約770bpの増幅断片を得た。得られた増幅断片をpCR（登録商標）2.1-TOPO（登録商標）(promega)にTAクローニングし、TA-BACを作製した。
FW2: 5'-ATGATCATGAACCTCACCGA-3 '(SEQ ID NO: 7)
RV2: 5'-CTATTGTGCGGTGTATCCTC-3 '(SEQ ID NO: 8)
PCR reaction solution composition:
Genomic DNA 2μl
Primer FW2 (100μM) 1.5μl
Primer RV2 (100 μM) 1.5 μl
× 10 buffer for KOD-plus- ver.2 5μl
2 mM dNTP mix 5 μl
25 mM MgSO4 3 μl
KOD-plus- (DNA polymerase) 1μl
31μl of distilled water
PCR reaction was performed using KOD-Plus-Ver.2 (Toyobo Co., Ltd.) and ThermalCycler (cycle conditions: heat treatment at 94 ° C. for 2 minutes, followed by denaturation at 98 ° C. for 10 seconds, and at 37 ° C. for 30 seconds). 30 cycles of annealing for 1 second and extension reaction for 1 minute at 68 ° C.), and a specific amplified fragment of about 770 bp was obtained. The obtained amplified fragment was TA cloned into pCR (registered trademark) 2.1-TOPO (registered trademark) (promega) to prepare TA-BAC.
このTA-BACを制限酵素EcoRI及びHindIIIで処理後、BAC遺伝子をpET28-a(+)（Novagen社）の制限酵素EcoRI及びHindIIIサイトにサブクローニングし、pET28a-BACを作製した。 This TA-BAC was treated with restriction enzymes EcoRI and HindIII, and then the BAC gene was subcloned into the restriction enzyme EcoRI and HindIII sites of pET28-a (+) (Novagen) to prepare pET28a-BAC.
3-キヌクリジノン還元活性の測定
pET28a-BACを宿主であるE. coli BL21(DE3)株に形質転換し、得られた遺伝子組換え体 E. coli BL21(DE3)株/ pET28a-BACを、4mlのMagic Media（登録商標） E. coli Expression Medium(invitrogen)にカナマイシン(終濃度50μg/ml)を添加した培地に加え、37℃で14時間振とう培養した。培養後、集菌して緩衝液に再懸濁し、超音波破砕した。破砕液を遠心し（１０，０００rpm×１０分）、その上清を粗酵素とした。さらにNi-NTA resin(Qiagen)を用いて部分精製酵素を調製し、3-キヌクリジノン変換反応について調べた。
Measurement of 3-quinuclidinone reducing activity
Transform pET28a-BAC into the host E. coli BL21 (DE3) strain, and transform the resulting recombinant E. coli BL21 (DE3) strain / pET28a-BAC into 4 ml of Magic Media (registered trademark) E The culture medium was added with kanamycin (final concentration 50 μg / ml) to E. coli Expression Medium (invitrogen) and cultured with shaking at 37 ° C. for 14 hours. After culturing, the cells were collected, resuspended in a buffer, and sonicated. The disrupted solution was centrifuged (10,000 rpm × 10 minutes), and the supernatant was used as a crude enzyme. Furthermore, a partially purified enzyme was prepared using Ni-NTA resin (Qiagen) and examined for 3-quinuclidinone conversion reaction.
10ｍM 3-キヌクリジノン、0.3μM NADH及び0.2Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を含む1mlの反応液を、粗酵素を添加前する前に25℃で約5分間予備加温した。加温後、反応液に粗酵素液を加えて速やかに混和後、水を対照に25℃に制御された分光光度計を用いて波長340nmの吸光度変化を2分〜3分間記録し、その初期直線部分より1分間あたりの吸光度変化を求めた。波長340nm におけるNADH の分子吸光係数を6.22mM-1cm-1で、1分間に1μmolのNADHが減少する酵素量を1単位(U)とし、活性値を求めた。
その結果、培養液1mlあたりに換算して０．２３Uの酵素活性を示した。
A 1 ml reaction containing 10 mM 3-quinuclidinone, 0.3 μM NADH and 0.2 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) was pre-warmed for about 5 minutes at 25 ° C. before adding the crude enzyme. After warming, add the crude enzyme solution to the reaction solution and mix it quickly. Record the absorbance change at 340 nm for 2 to 3 minutes using a spectrophotometer controlled at 25 ° C with water as the control. The change in absorbance per minute was determined from the straight line portion. The activity value was determined by setting the molecular extinction coefficient of NADH at a wavelength of 340 nm to 6.22 mM -1 cm -1 and the amount of enzyme that decreases 1 µmol of NADH per minute as 1 unit (U).
As a result, the enzyme activity was 0.23 U in terms of 1 ml of the culture solution.
分子量の測定
実施例３記載の方法で作製した部分精製酵素画分中のキヌクリジノン還元酵素の分子量およびポリアクリルアミドゲル電気泳動の分子量は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用い、以下の条件で検討した。
Measurement of molecular weight The molecular weight of quinuclidinone reductase in the partially purified enzyme fraction prepared by the method described in Example 3 and the molecular weight of polyacrylamide gel electrophoresis were examined under the following conditions using high performance liquid chromatography (HPLC). .
カラムにTSK-GEL G3000SW×X（東ソー株式会社）、溶離液に0.1M NaClを含む0.1M リン酸緩衝液(pH7.0)を使用し、流速1.0ml/minでゲル濾過クロマトグラフィーを行った。 Gel filtration chromatography was performed at a flow rate of 1.0 ml / min using TSK-GEL G3000SW × X (Tosoh Corporation) as the column and 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 M NaCl as the eluent. .
溶出液を分別回収し、各画分における3-キヌクリジノン還元酵素活性の測定結果により3-キヌクリジノン還元酵素の溶出時間（19.975min）を求め、分子量マーカー(MW-Marker；オリエンタル酵母工業株式会社)の溶出時間（表１）と比較して画分中のタンパク質の分子量を求めた。
SDS-PAGEは12.5％(w/v)ポリアクリルアミドゲルを使用した。タンパク質の検出はクマジーブリリアントブルーR-250を用いて行った。
この結果から、本発明の酵素の分子量は約71,800（ゲル濾過）であることが示された。また、SDS-PAGEの結果より、本発明の酵素は、サブユニットが分子量が31,000の２量体であると推定された。
The eluate was collected separately, and the elution time (19.975 min) of 3-quinuclidinone reductase was determined from the measurement results of 3-quinuclidinone reductase activity in each fraction, and the molecular weight marker (MW-Marker; Oriental Yeast Co., Ltd.) The molecular weight of the protein in the fraction was determined by comparison with the elution time (Table 1).
SDS-PAGE used 12.5% (w / v) polyacrylamide gel. Protein detection was performed using Coomassie Brilliant Blue R-250.
From this result, it was shown that the molecular weight of the enzyme of the present invention is about 71,800 (gel filtration). From the results of SDS-PAGE, the enzyme of the present invention was estimated to be a dimer having a subunit molecular weight of 31,000.
至適ｐHの測定
本実施例では、実施例３記載の方法で作製した部分精製酵素を用いて反応pH依存性を調べた。方法は、pH5.0〜8.5の緩衝液を用いた以外は全て実施例３に記載した方法行った。
結果を図２に示す。図２の結果より、本酵素の至適ｐHは、6.5〜7.5であることが示された。
Measurement of optimum pH In this example, the reaction pH dependency was examined using a partially purified enzyme prepared by the method described in Example 3. The method was the same as that described in Example 3 except that a buffer solution having a pH of 5.0 to 8.5 was used.
The results are shown in FIG. The results shown in FIG. 2 indicate that the optimum pH of this enzyme is 6.5 to 7.5.
基質特異性の測定
本実施例では、実施例３記載の方法で作製した部分精製酵素を用いて、表２に記載のケトン類を基質として反応特異性を調べた。反応条件は、基質以外は、実施例３記載の方法で実施した。
その結果、本発明の酵素は3-キヌクリジノンと特異的に反応し、3-キヌクリジノン以外の基質には全く反応しなかった（表２）。
Measurement of substrate specificity In this example, the reaction specificity was examined using the partially purified enzymes prepared by the method described in Example 3 and the ketones described in Table 2 as substrates. The reaction conditions were the same as in Example 3 except for the substrate.
As a result, the enzyme of the present invention reacted specifically with 3-quinuclidinone and did not react at all with substrates other than 3-quinuclidinone (Table 2).
NADH再生系酵素を共存させた（R）-キヌクリジノールの生産反応
本実施例では、実施例３記載の方法で作製した部分精製酵素を用いて、3-キヌクリジノンから（R）-キヌクリジノールへの変換反応について調べた。
Production reaction of (R) -quinuclidinol in the presence of NADH regenerating enzyme In this example, conversion reaction from 3-quinuclidinone to (R) -quinuclidinol was performed using the partially purified enzyme prepared by the method described in Example 3. Investigated about.
0.5mM NADH、0.12M 3-キヌクリジノン、0.2Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、0.24Mギ酸、0.4U ギ酸脱水素酵素及び部分精製酵素からなる反応液を30℃、120rpm、5時間以上変換反応させた。反応後、上記反応液0.8mlに、6N NAOHを0.16ml及び5mMオクタノールを溶かしたブタノール0.96mlを添加してよく攪拌し、5000rpmで5分間遠心した。上層のブタノール層を新しいチューブに取り、硫酸ナトリウムを加え脱水、15000rpmで1分間遠心をおこない、上澄み液をキヌクリジノールの分析サンプルとした。キヌクリジノールの分析にはガスクロマトグラフを用いた。 A reaction solution consisting of 0.5 mM NADH, 0.12 M 3-quinuclidinone, 0.2 M potassium phosphate buffer (pH 7.0), 0.24 M formic acid, 0.4 U formate dehydrogenase and partially purified enzyme is 30 ° C., 120 rpm, over 5 hours A conversion reaction was performed. After the reaction, 0.16 ml of 6N NAOH and 0.96 ml of butanol in which 5 mM octanol was dissolved were added to 0.8 ml of the reaction solution, and the mixture was stirred well and centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes. The upper butanol layer was placed in a new tube, dehydrated by adding sodium sulfate, centrifuged at 15000 rpm for 1 minute, and the supernatant was used as an analysis sample for quinuclidinol. A gas chromatograph was used for the analysis of quinuclidinol.
（ガスクロマトグラフによるキヌクリジノールの分析方法）
3-キヌクリジノールの定量にはガスクロマトグラフGC-18A(島津製作所)を用いた。分析条件は以下の通りで行った。
(Analysis method of quinuclidinol by gas chromatograph)
Gas chromatograph GC-18A (Shimadzu Corporation) was used for the determination of 3-quinuclidinol. Analysis conditions were as follows.
カラム : Rtx-5 Amine (30m×0.25μm)
カラム温度 : 70℃-180℃(昇温速度10℃/min)
インジェクション温度 : 250℃
検出温度 : 250℃
スプリット比 1対40
内部標準溶液 : 1-ブタノールに5miMオクタノールを溶かしたもの
Column: Rtx-5 Amine (30m × 0.25μm)
Column temperature: 70 ° C-180 ° C (
Injection temperature: 250 ℃
Detection temperature: 250 ℃
Split ratio 1:40
Internal standard solution: 1-butanol dissolved in 5miM octanol
（ガスクロマトグラフによる（R）-キヌクリジノールの分析方法）
(R)-キヌクリジノールの定量にはガスクロマトグラフHP6890シリーズGC system(Hewlett-Packard)を用いた。分析条件は以下の通りで行った。
(Analysis method of (R) -quinuclidinol by gas chromatograph)
A gas chromatograph HP6890 series GC system (Hewlett-Packard) was used for quantification of (R) -quinuclidinol. Analysis conditions were as follows.
カラム : cyclodextrine(25m×0.25μm)
カラム温度 : 70℃-180℃(昇温速度8℃/min)
インジェクション温度 : 250℃
検出温度 : 250℃
スプリット比 1対50
内部標準溶液 : 1-ブタノールに5miMオクタノールを溶かしたもの
それぞれ内部標準(オクタノール)を元にエリア値を補正して、作成した検量線に従いキヌクリジノールの生成量を算出した。
その結果、生成したキヌクリジノールは、（R）体（99%ee以上）であることが確認された。
Column: cyclodextrine (25m × 0.25μm)
Column temperature: 70 ° C-180 ° C (heating rate 8 ° C / min)
Injection temperature: 250 ℃
Detection temperature: 250 ℃
Split ratio 1:50
Internal standard solution: 1-butanol dissolved in 5miM octanol
Each area value was corrected based on the internal standard (octanol), and the amount of quinuclidinol produced was calculated according to the prepared calibration curve.
As a result, it was confirmed that the produced quinuclidinol was an (R) isomer (99% ee or higher).
配列番号５：合成DNA
配列番号５：nは、a, c, g又はtを表す（存在位置：３、６、９、１５）
配列番号６：合成DNA
配列番号６：nは、a, c, g又はtを表す（存在位置：１、４、７、１６、１９、２２）
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
Sequence number 5: Synthetic DNA
Sequence number 5: n represents a, c, g, or t (location: 3, 6, 9, 15)
Sequence number 6: Synthetic DNA
Sequence number 6: n represents a, c, g, or t (location: 1, 4, 7, 16, 19, 22)
Sequence number 7: Synthetic DNA
Sequence number 8: Synthetic DNA
Claims (11)
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と96%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質 A quinuclidinone reductase containing the following protein (b) or (c):
(B) a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having quinuclidinone reductase activity (c) the amino acid shown in SEQ ID NO: 2 A protein comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 96% or more and having quinuclidinone reductase activity
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と96%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質 A quinuclidinone reductase gene encoding the following protein (b) or (c):
(B) a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having quinuclidinone reductase activity (c) the amino acid shown in SEQ ID NO: 2 A protein comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 96% or more and having quinuclidinone reductase activity
（ｅ）配列番号１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド A quinuclidinone reductase gene comprising the polynucleotide shown in (e) below.
(E) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encodes a protein having quinuclidinone reductase activity
前記キヌクリジノン還元酵素が、下記の理化学的性質：
（i）分子量：
ゲルろ過法による測定値： 70,000〜73,000Da
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定値： 29,500〜31,500Da
（ii）至適pH：6.0〜8.0
（iii）補酵素としてＮＡＤＨ又はその誘導体を必要とする、
を有するキヌクリジノン還元酵素であり、
前記形質転換体が、以下の（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のタンパク質をコードするキヌクリジノン還元酵素遺伝子：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と96%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質、
または以下の（ｄ）又は（ｅ）に示すポリヌクレオチドを含むキヌクリジノン還元酵素遺伝子：
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含有する組換えベクターを含む形質転換体である、前記製造方法。 Production of R-3-quinuclidinol or a salt thereof, comprising a step of allowing quinuclidinone reductase, a microorganism or transformant producing the enzyme, or a processed product of the microorganism or transformant to act on 3-quinuclidinone or a salt thereof. A method,
The quinuclidinone reductase has the following physicochemical properties:
(I) Molecular weight:
Measurement value by gel filtration method: 70,000-73,000 Da
Measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis: 29,500-31,500 Da
(Ii) Optimal pH: 6.0 to 8.0
(Iii) requires NADH or a derivative thereof as a coenzyme,
A quinuclidinone reductase having
A quinuclidinone reductase gene in which the transformant encodes the following protein (a), (b), or (c):
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence obtained by deleting, substituting or adding one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a quinuclidinone reductase A protein having an activity (c) a protein comprising an amino acid sequence having a homology of 96% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a quinuclidinone reductase activity,
Or a quinuclidinone reductase gene comprising a polynucleotide shown in (d) or (e) below:
(D) a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (e) hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and reducing quinuclidinone The said manufacturing method which is a transformant containing the recombinant vector containing the polynucleotide which codes the protein which has enzyme activity.
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と96%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キヌクリジノン還元酵素活性を有するタンパク質 The production method according to claim 8 , wherein the quinuclidinone reductase contains the following protein (a), (b) or (c).
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence obtained by deleting, substituting or adding one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a quinuclidinone reductase Protein having activity (c) A protein comprising an amino acid sequence having 96% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having quinuclidinone reductase activity
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