JP5483108B2 - γ線を利用したマメ科植物の栽培方法 - Google Patents
γ線を利用したマメ科植物の栽培方法 Download PDFInfo
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Description
なお、本願明細書で引用した文献は参照により本願明細書に組み込む。
また、本明細書中、「種子」とは、完熟の種子のみならず、未熟の種子をも含む。このような未熟の種子は、日本などで食用とされている。
本発明による方法では、遺伝子工学的手法による食品の安全性の問題や植物の多様性確保の問題などを生じさせることなく、種子の収穫量を増加したり特定代謝物質の豊富化を達成することができる。また、従来行なわれてきた品種改良技術では、品種改良に非常に大きな労力や長い時間を要していたが、本発明は、このような障壁を取り除き簡易な方法で増産や改良を可能とする。
従来は、マメ科植物を含む各種植物で、種子、塊根、実生の段階で各種放射線を照射する多くの試みがなされていたが(非特許文献1)、分化が進んだ実生段階後でのγ線の照射がマメ科植物の種子の増産を生じさせるという報告はこれまでなされていない。また、このようなγ線の照射が種子中の特定の物質を増加させるとの報告もこれまでなされていない。従って、本発明は、実生後の段階でγ線を植物体に照射することでこれらの現象を生じさせるという知見を初めて提示する。
大きな種子を形成する観点からは、莢の充実までの期間でγ線により更に種子の大型化が進む可能性があるので、γ線の照射を、少なくとも莢の中の種子が膨らみ始めるまで行うことが好ましく、数個から10個程度の莢が膨らみ始めるまで行うことがより好ましく、少なくとも1つの莢が充実するまで行うことが更に好ましく、総ての莢の内80%以上の莢が充実するまで行うことが特に好ましいであろう。
より具体的には、上記所定の期間、植物体に、線量率0.1〜0.3Gy/日、好ましくは線量率0.15〜0.25Gy/日、より好ましくは線量率0.18〜0.23Gy/日でγ線を照射すると、得られるマメ科植物の種子中で、ピルビン酸、グルタミン酸、及びシステイン等が非照射の場合に比べ豊富化されることが見出された。
更には、上記所定の期間、植物体に、線量率0.05〜0.08Gy/日、好ましくは0.05〜0.07Gy/日の範囲でγ線を照射することで、NADH、アスコルビン酸、ニコチン酸、システイン、シスチン、及び芳香族アミノ酸(トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン)等が非照射の場合に比べ豊富化されることが見出された。
また、照射日の合計は、好ましくは10日以上、より好ましくは15日以上、さらに好ましくは20日以上、特に好ましくは25日以上とする。
また、線量率0.05〜0.08Gy/日(総線量、照射時期は既に述べた通り)でγ線を照射する工程を含む更に他の実施の形態による方法で得られたマメ科植物の種子、又はその破砕物若しくは抽出物を、NADH、アスコルビン酸、乳酸、ニコチン酸、システイン、シスチン、及び芳香族アミノ酸(トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン)等の物質の供給源として、食品、動物用飼料、医薬品、化粧品等の各種工業製品又はこれら製品のための原料を製造するために利用することができる。
従って、本発明は、各実施の形態による方法で得られたマメ科植物の種子、又はその破砕物若しくは抽出物を含む、食品、動物用飼料、医薬品、化粧品又はその他の工業製品、或いはこれら製品のための原料をも提供する。各製品及び原料の製造方法については特に制限は無く、得られた種子を、必要に応じて、慣用若しくは既知の方法で破砕若しくは抽出し、他の成分へ添加若しくは混合すればよい。
エダマメ用ダイズの早生種である奥原早生(サカタ種苗)を試験に使用した。一晩水中に浸したエダマメ種子を、2008年5月14日(1日目)に、6号ポット(鉢)中の有機培養土(Plantation Iwamoto社製)内に播き、鳥害を避けるために8日間屋内で栽培した。種子は、5日目頃に発芽し、9日目には地上部から4〜10cmの大きさとなった。9日目に屋外(5階建て建物屋上)に出し栽培を続け、42日目(2008年6月24日)に幾つかの苗で蕾が数個形成されていることを確認した。この時点で、ポット(鉢)当たり1〜3本の苗がある複数のポット(鉢)を、コントロールと3つの照射群に、それぞれ10本程度の苗が割り当てられ、丈の分布が各群でおおよそ揃うようにして振り分けた。3つの照射群をポットのままで、42日目から、約82TBqの60Coを線源とするγ線をそれぞれ0.02Gy/day、0.06Gy/day及び0.2Gy/dayの線量率で照射するガンマ線フィールド(茨城県常陸大宮市に所在)に設置した。線量率はγフィールド内で線源(60Co)から10m間隔毎、地上1mで熱ルミネセンス線量計(TLD)で測ったのち、それをもとに回帰式(log10Y(Gy/h)=A+B×log10X(m))を描きA、Bを算出し、距離に応じた線量率(Gy/h)を出し、1日の線量率(この実施例ではGy/8hを1日の線量率(Gy/day)として表記した)とした。測定日からの減衰は(Y)×(1/2)t/Tにより補正し距離を決定した。(Yは検査日の線量率であり、Xは線源からの距離であり、Tは線源の半減期であり、tは検査日からの経過時間である)。
栽培期間を通じて各群の灌水は2〜3回/週で行なった。
照射期間終了した日の翌日(2008年7月31日、種子を播いてから79日目)に、植物体から莢を収穫した。なお、虫害などにより著しく枯れた個体又は枯死した個体は除いた。
同様の試験を翌年の2009年にも行った。種蒔を、2009年5月14日(1日目)に行い、43日目(2009年6月25日)でγ線照射を開始し、その後、2009年6月27日、6月28日、7月4日、7月5日、7月11日、7月12日、7月15日、7月18日、7月19日、7月20日、7月25日、7月26日を除き、1日8時間γ線を照射した。各群の植物体は、2008年度と同様の経過で生育し照射期日合計25日目(2009年7月31日)で殆どの莢が充実した。この時点で照射を中止した。その後3日目(2009年8月3日、種子を播いて82日目)に莢を収穫した。なお、対照群はフィールド外にポットを設置した群のみとした。
3−1.莢の数、莢当たりの平均重量、総莢重量及び種子の平均重量
得られた莢の数、莢当たりの平均重量、総莢重量及び種子の平均重量を各群について計測した。莢の数、莢当たりの平均重量及び総莢重量の試験結果並びにマメの大きさは図1〜8にも示した。
(A)抽出
2008年に収穫された対照群、0.2Gy/dayの線量率(総線量5Gy)の群から得られた種子を、緩衝液(0.05M Tris−HCl pH 7.5 1mM EDTA,1mM PMSF,1mM DTT)に3%(w/v)PVP(ポリビニルピロリドン)を加えた溶液に入れ、液体窒素中で破砕し、1gのサンプルに対して10mlの緩衝液(0.05M Tris−HCl pH 7.5 1mM EDTA、1mM PMSF、1mM DTT)を加えて遠心した(18800g、30min、4℃)。
得られたペレットを顆粒性画分のタンパク質採取のため緩衝液(100mM Tris−HCl pH8.5、4%SDS,2%メルカプトエタノール、20%グリセロール、2mM PMSF)に入れ、沸騰水中に3分入れた。冷却後、遠心(18800g、10min、室温)し、上清をとり0.22μmPVDFメンブレンフィルターをとおし、アセトン抽出にかけた(8倍体積量のアセトン中、−20℃、一晩)。
アセトン抽出にかけたサンプルを遠心(18800g、10min、4℃)し、得られたペレットを80%アセトンで再攪拌し、溶解液を−20℃に90min置き、さらに遠心(18800g,10min,4℃)して、得られたペレットを溶解バッファー(5M Urea,2Mチオ尿素,2%CHAPS,2%SB3−10,1%DTT)に溶解した。最後に溶解液を超遠心(100,000g,+20℃、1h)にかけ、得られた上清を顆粒性画分サンプルとして電気泳動に使用した。
70μgのタンパク質を1次元目はpH4−7(13cm)のImmobiline DryStrip(GEヘルスケア社)で電気泳動を行い、その後12%SDS−PAGEで2次元目の電気泳動を行った。泳動終了後、SYPRO Ruby染色(Invitrogen社)し、FLA−5100イメージングアナライザー(富士フィルム)で画像化した。
図9に示す通り、主要なタンパク質の発現パターンは対照群と照射群で類似しているが幾つかのタンパク質(図中にマークした)で顕著な増減が認められた。このことは照射され栽培されたマメは対照群と同じ時期に収穫したものであるが質的に変化していることを示している。
(A)前処理
2009年に収穫された対照群、0.06Gy/day線量率(総線量1.5Gy)の群、及び0.2Gy/dayの線量率(総線量5Gy)の群から得られた種子100mgあたり、内部標準物質の終濃度を50μMとしたメタノール溶液を500μL加え、破砕用チューブに入れ液体窒素により凍結し、ビーズ式細胞破砕装置(トミー精工社製、MS−100R)を用いて破砕(4,000rpm,60秒×5回)し代謝物質の抽出をした。これを500μL遠沈管に移し取り、500μLのクロロホルム及び200μLのMilli−Q水を加え撹拌し、遠心分離(2,300×g,4°C,5分)を行った。遠心分離後、水相を限外ろ過チューブ(MILLIPORE,ウルトラフリーMC UFC3 LCC遠心式フィルターユニット 5 KDa)に200μL×2本移し取った。これを遠心(9,100×g,4°C,120分)し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び50μLのMilli−Q水に溶解して測定に供した。得られたピーク強度、形状から判断して、カチオンモードでの測定には10倍、アニオンモードでの測定には2倍に希釈した試料を用いた。
カチオンモード及びアニオンモードの測定を以下に示す条件で行った。なお、以下の文献を参照した。
1) T.Soga,D.N.Heiger: Amino acid analysis by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.Anal.Chem.72: 1236-1241,2000.
2) T.Soga,Y.Ueno,H.Naraoka,Y.Ohashi,M.Tomita et al.: Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.Anal.Chem.74: 2233-2239,2002.
3) T.Soga,Y.Ohashi,Y.Ueno,H.Naraoka,M.Tomita et al.: Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.J.Proteome Res. 2: 488-494,2003.
装置:Agilent CE−TOFMS system(Agilent Technologies社)3号機
キャピラリー:石英ガラスキャピラリー i.d.50μm×80cm
測定条件:
泳動バッファー:カチオンバッファー溶液(p/n:H3301−1001)
リンスバッファー:カチオンバッファー溶液(p/n:H3301−1001)
サンプルインジェクション:加圧インジェクション 50mbar,10sec
CE 電圧:Positive,27kV
MSイオン化:ESI Positive
MS キャピラリー電圧:4,000V
MS スキャンレンジ:m/z 50−1,000
シース液:HMT Sheath Liquid(p/n:H3301−1020)
装置:Agilent CE−TOFMS system(Agilent Technologies社)5号機
キャピラリー:石英ガラスキャピラリー i.d.50μm×80cm
測定条件:
泳動バッファー:アニオンバッファー溶液(p/n:H3302−1021)
リンスバッファー:アニオンバッファー溶液(p/n:H3302−1022)
サンプルインジェクション:加圧インジェクション 50mbar,25sec
CE電圧:Positive,30kV
MSイオン化:ESI Negative
MS キャピラリー電圧:3,500V
MSスキャンレンジ:m/z 50−1,000
シース液:HMT Sheath Liquid(p/n:H3301−1020)
(C−1)データ処理
CE−TOFMSで検出されたピークは、自動積分ソフトウェアのMasterHands ver.1.0.6.12(慶應義塾大学開発)を用いて自動抽出し、ピーク情報として質量電荷比(m/z)、泳動時間(Migration time:MT)とピーク面積値を得た。得られたピーク面積値は下記の式を用いて相対面積値に変換した。
次に、m/zとMTの値をもとに、各試料間のピークの照合・整列化を行った。このとき、ピーク以外のノイズは削除した。また、これらのデータにはNa+やK+などのアダクトイオン及び、脱水、脱アンモニウムなどのフラグメントイオンが含まれているので、これらの分子量関連イオンを削除した。しかし、物質特異的なアダクトやフラグメントも存在するため、すべてを精査することはできなかった。
検出ピークの相対面積値の閾値はカチオンモードでは1.2E-01であり、アニオンモードではおよそ1.8E-02である。ピーク強度が飽和したAla, Asn,g-Aminobutyric acidについては13Cのデータをもとに12Cに換算した相対面積値を示した。
検出されたピークに対してm/zとMTの値をもとにヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社(HMT)代謝物質データベースと照合し、検索を行った。検索のための許容誤差はMTで±0.5min、m/zでは±10ppmとした(質量誤差は以下の式により求めた)。
質量誤差(ppm)=(実測値−理論値)/実測値×106
検索された候補代謝物質のデータを、代謝経路マップへ描画した。代謝経路の描画には、VANTED(Visualization and Analysis of Networks containing Experimental Data、http://vanted.ipk-gatersleben.de/でアクセス可能である)を用いた。尚、代謝経路はヒトで確認された酵素を基に作成している。
(D−1)候補代謝物質検索
エダマメ3検体についてCE−TOFMSによるメタボローム解析を行った。HMT代謝物質データベースに登録された物質のm/z及びMTの値から142(カチオン74,アニオン68)ピークに候補化合物が割り当てられた。この候補化合物142のピークについて、それぞれ各群間の相対面積値比を算出した。結果はグラフにして図10に示した。また、図11の代謝経路図に載っている259の代謝物質を以下の表1−1〜1−6に列挙し、データベースでその中に割り当てられた98の候補化合物については相対面積値を示した。図11の代謝経路図に載らない残りの44の候補化合物については表2に相対面積値と共に列挙し、図20に相対面積値比のグラフを示した。なお、表1及び2中、N.D.はnot detectedを意味する。
候補物質を解糖系/糖新生、ペントースリン酸経路、クエン酸回路、尿素回路、プリン代謝経路、ピリミジン代謝経路及び各種アミノ酸代謝経路に描画した(図11〜19)。図中で略称により示された物質の名称との対応表を以下に示す。
何れかの照射群で2倍以上増加する代謝物は、デオキシチミジン5−一リン酸(dTMP,チミジル酸)、2−アミノアジピン酸、NADH、4−メチル−2−オキソペンタン酸、チアプロリン、システイン(Cys)、ピペコリン酸、乳酸、アスコルビン酸、シスチン、N−アセチルメチオニン、トリプトファン(Trp)、N−アセチル−b−アラニン、ニコチン酸、フルクトース1,6−二リン酸、2−オキソイソ吉草酸、グリセロホスホコリン、チロシン(Tyr)、5−オキソプロリン、ピルビン酸、S−アデノシルホモシステイン、セリン(Ser)−グルタミン酸(Glu)、ホスホエノールピルビン酸(PEP)、グルタミン酸(Glu)、トレハロース−6−リン酸、メチオニン(Met)、オフタルミン酸、ウリジン5−一リン酸(UMP)、NADP+、トリメチルアミン−N−オキシドであった。
また、代謝経路レベルで見ると、まず解糖系の代謝経路に関わる物質の増加が顕著であった。解糖系の重要な代謝中間物質としてピルビン酸があるが、0.2Gy/日の照射で顕著に増加(3.2倍)し、代謝経路でつながっているPEP(2倍)やアセチルCoA(1.6倍)も上昇が認められた。ピルビン酸がアラニンから生成される際にGluを生成するが、Glu、Ser−Glu及びGlu−Gluもそれぞれ0.2Gy/日の照射で5.7倍、2.3倍、及び1.8倍となった。また5−オキソプロリンはGluからの生成物であり、0.06Gy/日照射、0.2Gy/日の照射でそれぞれ1.6,2.4倍となった。これらから、Gluの関与する物質の増加は相互に密接に関連していると推定される。
0.06Gy/日照射の場合には、乳酸は3倍、NADHが4.4倍、アスコルビン酸が2.6倍増加した。アスコルビン酸はCysと同様、抗酸化物質であり、一種の酸化ストレスである放射線に対する防御反応として増加している可能性がある。Cysは酸化してシスチンになるがシスチンが0.06Gy/日だけで増加し(2.5倍)、アスコルビン酸も0.06Gy/日で顕著に増加していることから0.2Gy/日よりも0.06Gy/日の場合において生体内酸化ストレスが増加している可能性はある。例えばミトコンドリアはNADHを消費するところであるが、この過程で活性酸素を生成する。NADHが増加したことによるミトコンドリアの活性化が酸化ストレスをもたらしている可能性はある。乳酸の増加が0.06Gy/日で大きいのは、ピルビン酸が乳酸デヒドロゲナーゼにより触媒されるNADHによる還元反応で乳酸になるため、NADHの増加による影響を受けたためとも考えられる。解糖系では平衡はこの方向に傾いている。ニコチン酸(ナイアシン)は、NADの成分でありNADHの増加に関連すると思われる。0.06Gy/日照射でのNADHの顕著な上昇(4.4倍)がどのような仕組みで生じているのかは不明だが解糖系やTCA回路での代謝が促進されていることによる可能性はある。
Trp、Tyr、Met、Gluのようなアミノ酸、Ser−Glu、Glu−Gluのようなペプチド、UMPやdTMPのようなリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドが増加していることは生合成が活発になっていることを示す。MetはCysやシスチンの前駆体でもあり、S−アデノシルホモシステインはMetの代謝に関わるため関連して増加している可能性がある。Cysはグルタチオンの前駆体でもある。グルタチオンは生体内での豊富なSH化合物であり、抗酸化物質である。グルタチオンはCys、Glu、Glyからg−グルタミル経路で生成される。GluやGlyは特に0.2Gy/日での照射の場合に増加し(それぞれ5.7倍、1.6倍)、さらに酸化されたグルタチオンを還元型に戻す際の反応に関連するNADP+も2倍になっていることからグルタチオンの生成、代謝経路が活発化していることが推察される。また植物においてはPEPからシキミ酸経路を介して芳香族アミノ酸であるTrp、Tyr、フェニルアラニンのようなアミノ酸の生合成を行うが、この経路の活発化が示唆される。芳香族アミノ酸をつくる能力は動物にはなく(チロシンはフェニルアラニンから合成できるが)基本的には食事からの摂取が不可欠であるが、Trp、Tyrは2倍以上、フェニルアラニンも0.06Gy/日で1.9倍になっていることは芳香族アミノ酸生産のために本方法は有用な方法であることを示す。
Claims (16)
- 実生時期を経過後に、植物体に、線量率0.04〜0.4Gy/日、総線量0.5〜10.0Gyでγ線を照射する工程を含む、マメ科植物の栽培方法。
- 前記γ線を、線量率0.04〜0.3Gy/日で照射する、請求項1に記載の方法。
- 前記γ線を、線量率0.1〜0.3Gy/日で照射する、請求項1に記載の方法。
- 前記γ線を、線量率0.05〜0.08Gy/日で照射する、請求項1に記載の方法。
- 前記γ線の総線量を、0.8〜6.0Gy程度とする、請求項1から4の何れか1項に記載の方法。
- 前記γ線の総線量を、1.0〜2.0Gy程度とする、請求項1から4の何れか1項に記載の方法。
- 前記マメ科植物がダイズ属の植物である、請求項1から6の何れか1項に記載の方法。
- 前記γ線の照射を、開花前に開始する、請求項1から7の何れか1項に記載の方法。
- 前記γ線の照射を、蕾が形成される前に開始する、請求項1から7の何れか1項に記載の方法。
- 前記γ線の照射を、花芽形成の数日前後以内に開始する、請求項1から7の何れか1項に記載の方法。
- 前記γ線の照射を、少なくとも、莢が形成されるまで行う、請求項1から10の何れか1項に記載の方法。
- 前記γ線の照射を、少なくとも、莢が充実するまで行う、請求項1から10の何れか1項に記載の方法。
- 請求項1から12に記載の方法で栽培されたマメ科植物。
- 請求項13に記載のマメ科植物から得られる種子。
- 請求項14に記載の種子、又はその破砕物若しくは抽出物を含む、食品、動物用飼料、医薬品、化粧品、又はこれら製品のための原料、或いはバイオマスエネルギー資源。
- 請求項14に記載の種子、又はその破砕物若しくは抽出物の、食品、動物用飼料、医薬、化粧品又はこれら製品のための原料を製造するための、アスコルビン酸、シスチン、ピルビン酸、システイン、ニコチン酸、NADH、乳酸、グルタミン酸及び芳香族アミノ酸からなる群から選択される少なくとも1種の物質の供給源としての使用。
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