JP5470857B2 - Microorganism having ability to produce sugar-type biosurfactant and method for producing sugar-type biosurfactant using the same - Google Patents
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Description
本発明は、バイオサーファクタントを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物、特にバイオサーファクタントを生産する能力を有するマコモ属に属する植物から単離した微生物、ならびに、古くから食品として利用されてきた植物であるマコモ由来の微生物を使用することで、食品産業、農業、畜産業等への利用も期待できるバイオサーファクタント（微生物由来の両親媒性脂質）を製造する方法、より具体的には、古くから食品として利用されてきた植物であるマコモ由来の微生物の使用により、バイオサーファクタントの一種であるセロビオースリピッドを、副生物を含まず選択的に発酵生産する製造方法に関するものである。 The present invention relates to microorganisms belonging to the genus Ustylago having the ability to produce biosurfactants, particularly microorganisms isolated from plants belonging to the genus Macomo having the ability to produce biosurfactants, and plants that have been used as food for a long time. A method of producing biosurfactants (microbe-derived amphipathic lipids) that can be expected to be used in the food industry, agriculture, livestock industry, etc. The present invention relates to a production method for selectively fermentatively producing cellobiose lipid, which is a kind of biosurfactant, without using by-products, by using a microorganism derived from Macomo, which has been used as a plant.
糖脂質は、脂質に１〜１０数個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系・免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていること等が明らかにされつつある。一方で、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する物質は界面活性物質と呼ばれている。 Glycolipids are substances in which 1 to 10 monosaccharides are bound to lipids, are involved in the transmission of information between cells in vivo, and play an important role in maintaining the functions of the nervous system and immune system. Etc. are being revealed. On the other hand, glycolipids are amphipathic substances that have both hydrophilic properties derived from the properties of sugars and lipophilic properties derived from the properties of lipids. being called.
一方、一部の微生物はこれらの界面活性物質を効率良く生産することが知られており、この生物由来界面活性剤（バイオサーファクタント）は、安全性が高く、環境に対する負荷が少ない生分解性に優れた環境先進型界面活性剤として研究が進められている。現在、微生物が生産する界面活性物質としては、糖型系の一つである糖脂質系、アシルペプチド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子化合物系の５つに分類されているが、特にこの内の糖脂質系の界面活性剤については、最もよく研究され、細菌及び酵母によって生産された多くの種類の物質が報告されている。 On the other hand, some microorganisms are known to produce these surfactants efficiently, and this biological surfactant (biosurfactant) is highly safe and biodegradable with low environmental impact. Research is progressing as an excellent environmentally advanced surfactant. Currently, the surface active substances produced by microorganisms are classified into five types of glycolipids, acylpeptides, phospholipids, fatty acids, and polymer compounds, which are one of the glycoforms. Of these, the glycolipid surfactants have been studied the most and many types of substances produced by bacteria and yeast have been reported.
これらの糖脂質等のバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等にこれらのバイオサーファクタントを幅広く適用することは、持続可能社会の実現と高機能製品の提供という、両面を兼ね備えており極めて有意義である。 These biosurfactants such as glycolipids are said to have high biodegradability, low toxicity, environmental friendliness, and novel physiological functions. For this reason, the wide application of these biosurfactants in the food industry, cosmetic industry, pharmaceutical industry, chemical industry, environmental field, etc. has both the realization of a sustainable society and the provision of high-performance products. Meaningful.
糖脂質型のバイオサーファクタントには、次のようなものが例として挙げられる。 Examples of glycolipid-type biosurfactants include the following.
ラムノリピッド（Rhamnolipid；以下、RLと省略する。）は、結核菌の抗生物質としてシュードモナス アエルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（緑膿菌）の培養液から最初に発見されている（非特許文献１参照）。
また、これまでにシュードモナス（Pseudomonas）属の細菌から４種類の同族体が報告されており、当初は数ｇ／Ｌ程度の生産量であったが、現在では１００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献２参照）。
Rhamnolipid (hereinafter abbreviated as RL) was first discovered in the culture solution of Pseudomonas aeruginosa ( Pseudomonas aeruginosa ) as an antibiotic of Mycobacterium tuberculosis (see Non-Patent Document 1).
In addition, four kinds of homologues have been reported so far from bacteria of the genus Pseudomonas , and the initial production was about several g / L, but now it is possible to produce over 100 g / L. (See Non-Patent Document 2).
トレハロースリピッド（Trehalose lipid；以下、TLと省略する。）は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）等の細胞表層物質として発見された。また、類似の物質が、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルディア（Nocardia）、ロドコッカス（Rodococcus）属細菌からも報告されている（非特許文献３参照）。
一般的に、細胞壁に結合しているために生産量は低いが、ロドコッカス エリスロポリス（Rodococcus erythropolis）を窒素制限下で培養を行うとサクシノイルトレハロースリピッドを３２ｇ／Ｌ生産することが報告されている（非特許文献４参照）。
Trehalose lipid (hereinafter abbreviated as TL) has been discovered as a cell surface material such as Corynebacterium . Similar substances have also been reported from Mycobacterium , Nocardia and Rodococcus bacteria (see Non-Patent Document 3).
In general, production is low because it is bound to the cell wall, has been reported to 32 g / L produced succinonitrile yl trehalose lipid When Rhodococcus erythropolis the (Rodococcus erythropolis) is cultured under nitrogen limitation (Refer nonpatent literature 4).
ソホロースリピッド（Sophorose lipids；「ソホロリピッド」とも言われる；以下、ＳＬと省略する。）は、Ｐ．Ａ．Ｇｏｒｉｎらによってスターメレラ（キャンディダ）・ボンビコーラ（Starmerella（Candida）bombicola）の培養液から発見されている（非特許文献５参照）。
その後、その他の酵母菌、例えば、キャンディダ・ボゴリエンシス（Candida bogoriensis）、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）、キャンディダ・グロペンギッセリ（Candida gropengisseri）、キャンディダ・アピコーラ（Candida apicola）によっても、その培養液中に比較的多量に生産されることが報告されている（非特許文献６参照）。
さらに、現在では、３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献７、８参照）。
Sophorose lipids (also referred to as “sophorose lipids”; hereinafter abbreviated as SL) A. It has been discovered by Gorin et al. In a culture solution of Starmerella ( Candida ) bombicola (see Non-Patent Document 5).
Later, other yeasts such as Candida bogoriensis , Candida magnoliae , Candida gropengisseri , and Candida apicola were also used in the culture. It has been reported that it is produced in a relatively large amount (see Non-Patent Document 6).
Furthermore, production of 300 g / L or more is now possible (see Non-Patent Documents 7 and 8).
セロビオースリピッド（Cellobiose lipid；以下、CLと省略する。）は、ウスチラジン酸（ustilagic acid）、フロキュロシン（flocculosin）とも呼ばれる抗微生物活性の高い糖脂質である。
また、CLはウスチラゴ マイディス（Ustilago maydis）により１５ｇ／Ｌ（非特許文献９、１０および１１参照）以上生産されるほか、クリプトコッカス・フミコーラ（Cryptococcus humicola）（非特許文献１２参照）、シュードザイマ・フロキュローサ（Pseudozyma flocculosa）（非特許文献１３、１４参照）、シュードザイマ・フジフォルメータ（Pseudozyma fusiformata）（非特許文献１５参照）などからも生産されることが報告されている。
さらに、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ（ツカムレラ）属の酵母により３０ｇ／Ｌ生産される（非特許文献１６参照）オリゴ糖リピッドについても報告例がある。
Cellobiose lipid (hereinafter abbreviated as CL) is a glycolipid with high antimicrobial activity, also called ustilagic acid or flocculosin.
In addition, CL is produced by Ustilago maydis over 15 g / L (see Non-Patent Documents 9, 10 and 11), Cryptococcus humicola (see Non-Patent Document 12), Pseudozyma flocculusa (see Pseudozyma Flocculosa) (see non-Patent Document 13 and 14), has been reported to be produced from such Pseudozyma Fuji folder meter (see Pseudozyma Fusiformata) (non-Patent Document 15).
Furthermore, there are also reports on oligosaccharide lipids produced at 30 g / L by Tsukamurella genus yeast (see Non-Patent Document 16).
このCLは、セロビオースあるいはヒドロキシル基が一部アセチル化したセロビオースと、１ないし２分子のヒドロキシ脂肪酸とからなる糖脂質である。セロビオースとは、β１→４結合した２分子のブドウ糖からなる糖であり、ヒドロキシ脂肪酸は、構造中にヒドロキシル基を有する脂肪酸である。CLには、ヒドロキシ脂肪酸の水酸基の数及び位置、末端カルボキシル基のエステル化度などの異なる同族体が存在する。セロビオースリピッドの一般式１を化１に示す。
現在CLは、洗剤、化粧品等幅広い分野で工業利用が進められており、セロビオースリピッドの遺伝子導入剤としての利用（特許文献１参照）およびリポソーム形成剤としての利用（特許文献２参照）、CLを配合した洗浄剤（特許文献３参照）、乳化剤・可溶化剤（特許文献４参照）、タンパク質分離用担体（特許文献５参照）などの報告がある。 Currently, CL is industrially used in a wide range of fields such as detergents and cosmetics, and uses cellobiose lipid as a gene introduction agent (see Patent Document 1) and as a liposome-forming agent (see Patent Document 2). There are reports of blended detergents (see Patent Document 3), emulsifiers / solubilizers (see Patent Document 4), protein separation carriers (see Patent Document 5), and the like.
しかしながら、現時点で上記CL生産微生物について、同じ糖脂質型バイオサーファクタントの一種であるマンノシルエリスリトールリピッド(ウスチラジックリピッド(Ustilagic lipids)またはウスチリピッド（Ustilipids）とも言われる；以下、MELと称する)の生産なしにCLを生産するという報告はない。すなわち、MELの生産によりCLの収量が低下するほか、原料以外にMELを分離する精製工程が必要である。例えばウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)を用いた発酵生産方法では、培地成分の検討により、MEL/CL比を1/9まで向上できるという報告があるが（非特許文献１０）、MELの生成を完全に抑制する技術は未だ報告されていない。 However, there is no production of mannosyl erythritol lipids (also referred to as Ustilagic lipids or Ustilipids; hereinafter referred to as MEL), which is one of the same glycolipid type biosurfactants for the above-mentioned CL-producing microorganisms at present. There are no reports of producing CL. In other words, the production of MEL reduces the yield of CL and requires a purification process for separating MEL in addition to the raw materials. For example, in the fermentation production method using Ustilago maydis, there is a report that the MEL / CL ratio can be improved to 1/9 by examining the medium components (Non-patent Document 10). No technology has yet been reported.
CLを幅広い用途で用いるためには、生産コストを抑え効率良く発酵生産する必要がある。したがって、CLを生産する際にCLのみを生産できる微生物を用いて発酵生産することができれば、MELを生産する発酵生産方法と比べて、目的産物であるCLの収量が向上し、また精製工程の簡略化によって生産コストの低減にも繋がることから、極めて有効である。 In order to use CL for a wide range of applications, it is necessary to reduce the production cost and efficiently carry out fermentation. Therefore, if it can be fermented and produced using microorganisms that can produce only CL when producing CL, the yield of CL, which is the target product, will be improved compared to the fermentation production method that produces MEL, and the purification process Since simplification leads to reduction in production cost, it is extremely effective.
ところで、バイオサーファクタントには汎用の界面活性剤と比較して環境適合性、生体適合性に優れ、様々な生理活性が認められているが、既存の界面活性剤と同様の幅広い用途に利用されているかと言うと決してそうとは限らない。例えば食品用途等には制約がある。これは、多くの場合生産微生物に病原性は知られていないものの、自然界からの単離源が明確でないため、安全性に対する知見に乏しいことによる。特に微生物生産物を食品用途等に展開するためには、使用微生物の単離源が重要視される。例えば、酒類やパンの製造に利用される出芽酵母、乳酸菌や枯草菌（納豆菌）等は、食品分野で活躍する微生物として一般的に良く知られている。これらの微生物は全て食品中から容易に単離可能な微生物である。また、CL生産微生物は、クリプトコッカス・フミコーラを除いて、副生物としてMELを生成する。そのため、CLの収量が低下するほか、原料以外にMELを分離する精製工程が必要であり、余分なエネルギーの消費ならびにコスト上昇を引き起こしているが、MELを生産することなくCLを生産できれば、それらの問題の解消につながる。 By the way, biosurfactants are superior in environmental compatibility and biocompatibility compared to general-purpose surfactants, and various physiological activities are recognized. However, they are used for a wide range of applications similar to existing surfactants. That's not necessarily the case. For example, there are restrictions on food applications. This is due to the fact that although the pathogenicity of the produced microorganism is not known in many cases, the source of isolation from the natural world is not clear, and thus knowledge about safety is poor. In particular, in order to develop a microbial product for food use, an isolation source of microorganisms to be used is regarded as important. For example, budding yeast, lactic acid bacteria, Bacillus subtilis (natto), and the like used for the production of alcoholic beverages and bread are generally well known as microorganisms that play an active role in the food field. These microorganisms are all microorganisms that can be easily isolated from food. Moreover, CL producing microorganisms produce MEL as a by-product except for Cryptococcus fumicola. Therefore, in addition to the decrease in the yield of CL, a purification process for separating MEL in addition to the raw materials is necessary, which causes consumption of extra energy and an increase in cost. However, if CL can be produced without producing MEL, It will lead to the solution of the problem.
そこで、食用植物または日常的に接触する植物群から単離した微生物を用いてMELを生産することなくバイオサーファクタントを製造する技術を開発することができれば、得られるバイオサーファクタントは安全性の面及び生産コストの面で大きな利点を獲得することとなり、生産微生物も含めた生産物全体の適用用途が大きく拡充されるものと期待される。 Therefore, if the technology for producing biosurfactants can be developed without producing MEL using microorganisms isolated from edible plants or plants that come into daily contact, the resulting biosurfactants can be used in terms of safety and production. It will be a great advantage in terms of cost, and it is expected that the application of the entire product including the production microorganism will be greatly expanded.
以上事情を鑑みて、本発明では、化粧品、食品、食品添加物、医薬、農畜水産業関連品（飼料、飼料添加物、肥料、農薬、魚餌）、洗剤など、生体に対する安全性がより求められる用途に対して、従来よりも適応性に優れたバイオサーファクタントを提供するべく、食用植物から単離した微生物、ならびにそれを用いるバイオサーファクタントの発酵製造方法の提供を目的とする。 In view of the above circumstances, in the present invention, safety to living bodies such as cosmetics, foods, food additives, medicines, agricultural and livestock industry-related products (feeds, feed additives, fertilizers, agricultural chemicals, fish foods), detergents, etc. The purpose of the present invention is to provide a microorganism isolated from edible plants and a method for fermenting a biosurfactant using the same, in order to provide a biosurfactant that is more adaptable than before.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、池や沼などに茂生するイネ科の水生植物であり、肥大した新芽が「マコモタケ」として古くから日常的に食用されている「マコモ」から、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を採取し単離すること、当該微生物がCLを生産すること、及び既存のCL生産菌のほとんどがMELを生産するのに対して、MELを生産することなしにCLのみを生産できることを見出し、本発明をなすに至ったものである。 As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventor is a grassy aquatic plant that grows in ponds and swamps, etc. ”To collect and isolate Ustilago esculent a, to produce CL, and to produce MEL, whereas most of the existing CL-producing bacteria produce MEL It has been found that only CL can be produced without any problems, and the present invention has been made.
すなわち、本発明の微生物は、以下の〔１〕〜〔３〕に示される。
〔１〕 マンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくセロビオースリピッドを生産する能力を有するウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物。
〔２〕 ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物が、下記の菌学的性質を有する〔１〕に記載の微生物。
記
（１）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。
（２）YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で、３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。
（３）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。
（４）また、前記（１）、（２）及び（３）のいずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
（５）生理性状試験の結果は、表１に示す通りである。
〔３〕 ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物が、ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1（受託番号 FERM P-21725）である〔１〕または〔２〕に記載の微生物。
That is, the microorganism of the present invention is shown in the following [1] to [3].
[1] A microorganism belonging to Ustilago esculenta having the ability to produce cellobiose lipid without producing mannosyl erythritol lipid.
[2] The microorganism according to [1], wherein the microorganism belonging to Ustilago esculenta has the following mycological properties.
Record
(1) After culturing on YM agar medium, PDB agar medium and 5% malt extract medium at 25 ° C. for 7 days, corrugated, semi-lens, wet and creamy colonies are formed.
(2) Formation of hyphae having a width of about 4-5 μm is confirmed after culturing at 25 ° C. for 3 days in YM liquid medium and PD liquid medium.
(3) On YM agar medium, PDB agar medium, and 5% malt extract medium plate medium, formation of hyphae with a septum and pseudohyphae was observed after culturing at 25 ° C. for 7 days.
(4) In any of the cases (1), (2) and (3), no clear sexual genital formation is observed.
(5) The results of the physiological property test are as shown in Table 1.
また、本発明のバイオサーファクタント製造方法は、以下の〔４〕〜〔６〕に示される。
〔４〕 マンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくセロビオースリピッドを生産する能力を有するウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物を培養しバイオサーファクタントを生産することを特徴とする、バイオサーファクタントの製造方法。
〔５〕 ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物が、下記の菌学的性質を有する微生物である〔４〕に記載のバイオサーファクタントの製造方法。
記
（１）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。
（２）YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。
（３）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。
（４）また、前記（１）、（２）及び（３）のいずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
（５）生理性状試験の結果は、上記の表１に示す通りである。
〔６〕 ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物が、ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1（受託番号 FERM P-21725）である〔４〕または〔５〕に記載の微生物バイオサーファクタントの製造方法。
Moreover, the biosurfactant manufacturing method of this invention is shown by the following [ 4 ]-[ 6 ].
[ 4 ] A method for producing a biosurfactant, characterized by culturing a microorganism belonging to Ustilago esculenta having the ability to produce cellobiose lipid without producing mannosyl erythritol lipid and producing biosurfactant.
[ 5 ] The method for producing a biosurfactant according to [ 4 ], wherein the microorganism belonging to Ustilago esculenta is a microorganism having the following mycological properties.
Record
(1) After culturing on YM agar medium, PDB agar medium and 5% malt extract medium at 25 ° C. for 7 days, corrugated, semi-lens, wet and creamy colonies are formed.
(2) Formation of mycelia with a width of about 4-5 μm is confirmed after culturing at 25 ° C. for 3 days in YM liquid medium and PD liquid medium.
(3) On YM agar medium, PDB agar medium, and 5% malt extract medium plate medium, formation of hyphae with a septum and pseudohyphae was observed after culturing at 25 ° C. for 7 days.
(4) In any of the cases (1), (2) and (3), no clear sexual genital formation is observed.
(5) The results of the physiological property test are as shown in Table 1 above.
[ 6 ] The method for producing a microbial biosurfactant according to [ 4 ] or [ 5 ] , wherein the microorganism belonging to Ustilago esculenta is Ustilago esculenta MK-1 (Accession No. FERM P-21725) .
また、本発明のバイオサーファクタントを含有する食品、化粧品、または飼料は、以下の〔７〕、〔８〕または〔９〕に示される。
〔７〕上記〔１〕に記載の微生物を培養することにより得られたセロビオースリピッドを含有する食品。
〔８〕上記〔１〕に記載の微生物を培養することにより得られたセロビオースリピッドを含有する化粧品。
〔９〕 上記〔１〕に記載の微生物を培養することにより得られたセロビオースリピッドを含有する飼料。
Moreover, the foodstuffs, cosmetics, or feed containing the biosurfactant of this invention are shown by the following [ 7 ], [ 8 ] or [ 9 ].
[ 7 ] A food containing cellobiose lipid obtained by culturing the microorganism according to [ 1 ] above.
[ 8 ] A cosmetic containing cellobiose lipid obtained by culturing the microorganism according to [ 1 ] above.
[ 9 ] A feed containing cellobiose lipid obtained by culturing the microorganism according to [ 1 ] above.
本発明によれば、古くから広く食される食用植物であるマコモタケ（黒穂菌に寄生されて肥大したマコモの新芽）の可食部分の本体を構成する微生物、より具体的にはウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を提供することができる。
当該微生物を発酵微生物として用いることにより、得られたバイオサーファクタントの安全性を確保するとともに、これまで利用に制限があった食品用途や家畜飼料、魚餌、農業用途に直接使用できる界面活性剤としての利用が見込まれ、バイオサーファクタントの普及の拡大に著しく貢献できるものと期待される。
さらに本発明に係る製造方法によれば、従来の方法において副生物として混入していたMELを含まないCLのみの発酵生産物を得ることが可能となる。特に、油脂等の疎水性基質を用いず、糖質(グルコースやショ糖)を炭素源として含有する培地を用いることにより、効率的にCLを生産することが可能であり、CLの単離も簡便となる。
以上のように本発明を利用することで、MELを生産しないことで、CLの収量が良くなり、生産効率が向上すること、精製ステップの簡略化が可能であることから、CL生産コストの大幅な低減が可能となり、より低価格なCLを市場に提供し、これまで制約のあった食品、農畜産業も含む幅広い分野へのバイオサーファクタントの利用拡大が期待される。
According to the present invention, microorganisms that constitute the edible portion of the edible plant (Momomo sprouts sprouting and infested with Aspergillus niger), more specifically, Ustyolago esculenta ( Ustilago esculent a) can be provided.
By using the microorganism as a fermentation microorganism, the safety of the obtained biosurfactant is ensured, and as a surfactant that can be used directly for food applications, livestock feeds, fish foods, and agricultural applications that have been limited in use. Expected to be used, it is expected to contribute significantly to the spread of biosurfactants.
Furthermore, according to the production method of the present invention, it becomes possible to obtain a fermented product containing only CL that does not contain MEL mixed as a by-product in the conventional method. In particular, it is possible to efficiently produce CL by using a medium containing a carbohydrate (glucose or sucrose) as a carbon source without using a hydrophobic substrate such as fats and oils. It becomes simple.
By using the present invention as described above, the production of CL can be improved by not producing MEL, the production efficiency can be improved, and the purification step can be simplified. The market is expected to expand the use of biosurfactants in a wide range of fields including food and agricultural and livestock industries that have been restricted so far.
以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
〈微生物〉
本発明に該当する微生物としては、バイオサーファクタント（但し、マンノシルエリスリトールリピッドを除く）を生産する能力を有するものであればよく、好ましくは当該バイオサーファクタント以外のバイオサーファクタントを生産することがないものであれば特に限定されるものではない。上記に該当するバイオサーファクタントについては、一般的に生産量が高く、原料が比較的安価な糖質や植物油脂等で生産できる糖脂質型のバイオサーファクタントが好ましく、ソホロースリピッド、トレハロースリピッド、セロビオースリピッド、ラムノリピッド等が挙げられる。特にセロビオースリピッド（CL）は生理活性が高いことから望ましい。上記に該当する微生物としては、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物が好ましく、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MK-1株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M17株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M18株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M19株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M20株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M21株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M22株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M23株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M24株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M25株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M26株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M27株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MAFF305616株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MAFF305618株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MAFF305619株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MAFF305621株、などが例示される。
ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株は、本発明者等が日本国内で採取した植物（マコモ）から分離した。本菌株は、YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で、３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。また、いずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株は、リボゾームRNA遺伝子の26SrDNA−D1/D2領域の塩基配列（rDNA配列）を決定し、DNAデータベース（DDBJ）にアクセスし、FASTAプログラム（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/fasta-j.html）を用いて相同性検索を行ったところ、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）のrDNA配列と100％一致した。MK-1の生理性状試験の結果も合わせて、本菌株は担子菌門の一種であるウスチラゴ・エスキュレンタに属することがわかり、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株と命名した。生理性状試験の結果は、表１に示す通りである。本菌株は、平成20年11月17日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（IPOD）（茨城県つくば市東１−１−３）に受託番号FERM P-21725として寄託されている。
なお、本発明に該当するバイオサーファクタント（但し、マンノシルエリスリトールリピッドを除く）を生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物は、マコモ等の天然の植物から単離された菌株、または保存機関から分譲された菌株によらず、あるいはその継代培養であってもよい。
<Microorganism>
The microorganism corresponding to the present invention may be any microorganism as long as it has the ability to produce biosurfactants (excluding mannosylerythritol lipids), and preferably does not produce biosurfactants other than the biosurfactants. There is no particular limitation. For biosurfactants that fall under the above, glycolipid-type biosurfactants that are generally produced in high amounts and that can be produced with relatively inexpensive raw materials such as saccharides and vegetable oils are preferred. Sophorose lipid, trehalose lipid, cellobiose lipid , Rhamnolipid and the like. Cellobiose lipid (CL) is particularly desirable because of its high physiological activity. As the microorganisms corresponding to the above, microorganisms belonging to Ustilago esculenta are preferable, and Ustilago esculenta NBRC9887 strain, Ustilago esculenta MK-1 strain, Ustilago esculenta M17 strain, Ustilago esculenta M18, Ustilago Escurenta M19, Ustilago Escurenta M20, Ustilago Escurenta M21, Ustylago Escurenta M22, Ustilago Escutenta M23, Ustylago Escutenta M24, Ustylago Escurenta M25 , Ustylago Esculenta M27, Ustylago Escutenta MAFF305616, Ustylago Escutenta MAFF305618, Ustylago Escutenta MAFF305619, Ustylago -Esculenta MAFF305621, etc.
The Ustilago esculent a MK-1 strain was isolated from a plant (Makomo) collected by the present inventors in Japan. This strain forms corrugated, semi-lens, wet and cream-colored colonies after culturing at 25 ° C. for 7 days on YM agar medium, PDB agar medium and 5% malt extract medium. The formation of mycelia with a width of about 4-5 μm is confirmed after culturing at 25 ° C. for 3 days in YM liquid medium and PD liquid medium. The formation of hyphae with septa and pseudohyphae was also observed after culturing at 25 ° C. for 7 days on the YM agar medium, PDB agar medium and 5% malt extract medium plate medium. In either case, no clear sexual genital formation is observed.
Ustilago esculent a MK-1 strain determines the nucleotide sequence (rDNA sequence) of the 26S rDNA-D1 / D2 region of the ribosomal RNA gene, accesses the DNA database (DDBJ), and accesses the FASTA program (http: / The homology search using /www.ddbj.nig.ac.jp/search/fasta-j.html) was 100% identical to the rDNA sequence of Ustilago esculent a. Together with the results of the physiological property test of MK-1, it was found that this strain belongs to Ustylago esculenta, a kind of Basidiomycota, and it was named as Ustilago esculenta (Kustilago esculenta ) MK-1. The results of the physiological property test are as shown in Table 1. This strain has been deposited on November 17, 2008 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Microorganism Depositary Center (IPOD) (1-1-3 Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki) under the accession number FERM P-21725 .
In addition, microorganisms belonging to the genus Ustylag having the ability to produce biosurfactants corresponding to the present invention (excluding mannosyl erythritol lipids) are strains isolated from natural plants such as macomo, or distributed from preservation organizations. It may be a subculture or not.
〈バイオサーファクタント生産培地・培養条件〉
本発明の微生物の培養形態は液体培地を用いた回分培養あるいは培養系に糖質および/または有機窒素源を連続添加する流加培養であり、通気攪拌することが望ましい。培地の初期ｐHは酸性から中性の範囲であれば特に問題は無いが、３．０−９．０に調整することが好ましく、６．０−８．０に調整することがより望ましい。培養に適した温度範囲は２０−３５℃、より好ましくは２５−２８℃である。
<Biosurfactant production medium and culture conditions>
The culture form of the microorganism of the present invention is batch culture using a liquid medium or fed-batch culture in which a saccharide and / or organic nitrogen source is continuously added to the culture system, and it is desirable to aeration and agitate. The initial pH of the medium is not particularly limited as long as it is in the acidic to neutral range, but it is preferably adjusted to 3.0-9.0, more preferably 6.0-8.0. The temperature range suitable for culturing is 20-35 ° C, more preferably 25-28 ° C.
本発明において、培地は一般的な半合成培地を用いればよい、CL生産を効率よく行うためには主原料である炭素原料にグルコース、ショ糖、廃糖蜜などの糖質を用いることが望ましい。糖質に加えて、もしくは置き換えて、油脂類などを炭素源として用いてもかまわない。窒素源としては、有機窒素源と無機窒素源を組み合わせて用いることが望ましい。
糖類は当該酵母が資化できるものあれば特に限定されるものではない。例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトースなどの単糖類、ショ糖、マルトースなどの二糖類が用いられるが、好ましくはグルコースである。培養初発濃度は１０−１５０ｇ／Ｌ、好ましくは３０−１００ｇ／Ｌで用いられる。
用いる油脂類としては、特に限定されるものではない。植物油、脂肪酸またはそのエステル類を用いても良い。
使用する植物油としては、例えばダイズ油、ナタネ油、コーン油、綿実油、ヒマワリ油、カポック油、ゴマ油、コメ油、落花生油、ベニバナ油、オリーブ油、アマニ油、キリ油、ヒマシ油、パーム油、パーム核油、ヤシ油もしくはこれらの混合物等が挙げられる。
使用する脂肪酸および脂肪酸エステルには、炭素鎖が１０−２４のもの、好ましくは炭素鎖が１６−１８の脂肪酸または脂肪酸エステルを用いることができる。これらの脂肪酸または脂肪酸エステルは分子内に１−３個の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、デカン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの飽和脂肪酸またはそのエステル、あるいはトウハク酸、リンデル酸、ツズ酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、ソルビン酸、リノール酸、リノエライジン酸、γ―リノレン酸、リノレン酸、アラキドン酸などの不飽和脂肪酸またはそのエステルが挙げられる。
培地に添加する上記油脂類の濃度は、２０−２００ｇ／Ｌ、好ましくは５０−１５０ｇ／Ｌの範囲である。流加培養の様式をとる場合には、培地中濃度が上記の範囲に収まるように培養期間中に連続的もしくは断続的に添加する。
使用する有機窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、カザミノ酸、尿素などの内、一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは酵母エキスを1−８ ｇ／Ｌの濃度範囲で用いるとよい。
無機窒素源としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、アンモニアなどの内、一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは硝酸ナトリウムを用いるとよい。
In the present invention, a general semi-synthetic medium may be used as the medium. In order to efficiently perform CL production, it is desirable to use sugars such as glucose, sucrose, and molasses as the carbon raw material as the main raw material. Oils and fats may be used as a carbon source in addition to or in place of carbohydrates. As the nitrogen source, it is desirable to use a combination of an organic nitrogen source and an inorganic nitrogen source.
The saccharide is not particularly limited as long as the yeast can assimilate. For example, monosaccharides such as glucose, galactose and fructose, and disaccharides such as sucrose and maltose are used, and glucose is preferred. The initial culture concentration is 10-150 g / L, preferably 30-100 g / L.
The fats and oils to be used are not particularly limited. Vegetable oils, fatty acids or esters thereof may be used.
Examples of vegetable oils to be used include soybean oil, rapeseed oil, corn oil, cottonseed oil, sunflower oil, kapok oil, sesame oil, rice oil, peanut oil, safflower oil, olive oil, flaxseed oil, gill oil, castor oil, palm oil, palm Examples thereof include nuclear oil, coconut oil, and mixtures thereof.
As the fatty acid and fatty acid ester to be used, a fatty acid or fatty acid ester having a carbon chain of 10-24, preferably 16-18 carbon chains can be used. These fatty acids or fatty acid esters may contain 1-3 unsaturated bonds in the molecule. For example, saturated fatty acids such as decanoic acid, undecanoic acid, lauric acid, tridecanoic acid, myristic acid, pentadecanoic acid, palmitic acid, margaric acid, stearic acid, nonadecanoic acid, arachidic acid, behenic acid, lignoceric acid, etc. Acids, Linderic acid, Tuzic acid, Myristoleic acid, Palmitoleic acid, Petroselinic acid, Oleic acid, Elaidic acid, Vaccenoic acid, Erucic acid, Sorbic acid, Linoleic acid, Linoleic acid, Gamma-linolenic acid, Linolenic acid, Arachidone Examples thereof include unsaturated fatty acids such as acids or esters thereof.
The concentration of the fats and oils added to the medium is in the range of 20-200 g / L, preferably 50-150 g / L. When adopting a fed-batch culture mode, it is added continuously or intermittently during the culture period so that the concentration in the medium falls within the above range.
As the organic nitrogen source to be used, one or a combination of two or more of yeast extract, malt extract, peptone, polypeptone, corn steep liquor, casamino acid, urea and the like can be used. Yeast extract is preferably used in a concentration range of 1-8 g / L.
As the inorganic nitrogen source, one or a combination of two or more of sodium nitrate, potassium nitrate, ammonium nitrate, ammonium sulfate, and ammonia can be used. Sodium nitrate is preferably used.
〈セロビオースリピッドの回収・精製方法〉
培養液からのCLの抽出・精製は以下のように行う。培養液と等量の酢酸エチルを加え、CLおよび疎水性成分を抽出し、酢酸エチル相を分取する。酢酸エチルをエバポレーター等で取り除くことで、CLおよび疎水性成分を含む画分を得る。さらに、得られた画分をヘキサンによって洗浄することで、CL以外の疎水性成分を除去し、残渣を乾燥することでCL標品を得る。CL標品を再び、メタノールに溶かし、アンスロン硫酸法を用いて、CL量を測定する。ヘキサン洗浄液についても、エバポレーター等でヘキサンを除去することでCL以外の疎水性成分を回収し、重量を測定することで培地中に残存する疎水性成分の量を得る。
<Recovery and purification method of cellobiose lipid>
Extraction and purification of CL from the culture is performed as follows. Add the same amount of ethyl acetate as the culture solution, extract CL and hydrophobic components, and separate the ethyl acetate phase. By removing ethyl acetate with an evaporator or the like, a fraction containing CL and a hydrophobic component is obtained. Further, the obtained fraction is washed with hexane to remove hydrophobic components other than CL, and the residue is dried to obtain a CL preparation. The CL sample is again dissolved in methanol, and the CL amount is measured using the anthrone sulfuric acid method. Also for the hexane washing solution, the hexane is removed by an evaporator or the like to collect a hydrophobic component other than CL, and the weight is measured to obtain the amount of the hydrophobic component remaining in the medium.
〈セロビオースリピッドの構造決定〉
上記により得られる糖脂質成分の構造決定は、以下のようにして行う（ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株を用いてグルコースを炭素源として培養して得られた酸型CLの構造決定手法を例にして以下説明する）。
単離した糖脂質成分は、TLCプレート上で、アンスロン硫酸試薬で青緑色に呈色することにより糖脂質成分であると判断できる。この糖脂質について、1Ｈ、13Ｃ、二次元ＮＭＲ解析を行い、得られたスペクトルと、構造既知であるCLのデータ（非特許文献２から５参照）とを比較することで、構造解析を行う。
<Structure determination of cellobiose lipid>
The structure of the glycolipid component obtained as described above is determined as follows ( Ustilago esculent a) NBRC9887 strain obtained by culturing glucose as a carbon source and determining the structure of acid type CL As an example).
The isolated glycolipid component can be judged to be a glycolipid component by being colored blue-green with an anthrone sulfate reagent on a TLC plate. For this glycolipid, 1 H, 13 C, two-dimensional NMR analysis is performed, and the obtained spectrum is compared with CL data (see Non-Patent Documents 2 to 5) whose structure is known, thereby performing structural analysis. Do.
〈セロビオースリピッドの定量分析方法〉
全糖脂質量はアンスロン硫酸法を用いることで測定できる。CL同属体の含有量と存在比は薄相クロマトグラフィー（TLC）法および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することで測定できる。
<Quantitative analysis method of cellobiose lipid>
The total glycolipid amount can be measured by using the anthrone sulfate method. The content and abundance of CL congeners can be measured using thin phase chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC).
以下に、本発明について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
（ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を用いた、CLの選択的発酵生産；酵母エキス濃度の影響)
〈種培養〉
ディープフリーザー（-８０℃）で冷凍保存されたウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株を３０ ｍＬのＹＭ培地（グルコース１０ ｇ／Ｌ、酵母エキス３ ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ ｇ／Ｌ、ペプトン５ ｇ／Ｌ）に０．５ｍＬ播種し、２８℃で１日間、振蕩培養した。
〈本培養〉
３００ｍＬ容量の三角フラスコに３０ ｍＬの酵母エキス濃度を変えたCL生産用培地を表２（CL生産培地組成）のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した培地を用意した。上述の種培養液を１．５ｍＬを播種し、２８℃で４日間、振蕩培養を行った。培養終了後の培養液から上述の分離・精製方法を用いてCL標品を精製し、CL標品をアンスロン硫酸法にて、測定することで、培地体積あたりのCL生産量を算出した。酢酸エチルで抽出された培養液に含まれる菌体をメタノールおよび水で洗浄後、１０５℃で一晩乾燥させた後、重量を測定することで菌体量を測定した。
(Selective fermentative production of CL using Ustilago esculent a; effect of yeast extract concentration)
<Seed culture>
30 ml of YM medium (glucose 10 g / L, yeast extract 3 g / L, malt extract 3 g / L, peptone) from Ustilago esculent a NBRC9887 strain frozen and stored in a deep freezer (−80 ° C.) 5 g / L) was inoculated with 0.5 mL, and shake-cultured at 28 ° C. for 1 day.
<Main culture>
A medium for CL production with a 30 mL yeast extract concentration changed in a 300 mL Erlenmeyer flask was prepared as shown in Table 2 (CL production medium composition), and a medium sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes was prepared. 1.5 mL of the above seed culture solution was inoculated, and shaking culture was performed at 28 ° C. for 4 days. The CL preparation was purified from the culture broth after completion of the culture using the above-described separation / purification method, and the CL preparation was measured by the anthrone sulfate method to calculate the amount of CL produced per medium volume. The cells contained in the culture solution extracted with ethyl acetate were washed with methanol and water, dried at 105 ° C. overnight, and then the weight was measured to determine the amount of the cells.
〈薄層クロマトグラフィー分析〉
図１に示すように、酵母エキスを８ｇ／Ｌ添加した培地で、２,５００mｇ／ＬのCLを生産することができた。酵母エキスの濃度をコントロールすることで、効率的にCLを生産できることが示された。いずれの条件でもMELは検出されなかった。
<Thin layer chromatography analysis>
As shown in FIG. 1, 2,500 mg / L of CL could be produced in a medium supplemented with 8 g / L of yeast extract. It was shown that CL can be efficiently produced by controlling the concentration of yeast extract. MEL was not detected under any condition.
（ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を用いた、CLの選択的発酵生産；流加培養法）
３００ｍＬ容量の三角フラスコに30 mlのCL生産用培地を表３〔CL生産培地組成(流加培養初期培地)〕のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した培地を用意した。実施例１と同様に調製したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株の種培養液を１．５ ｍＬ播種し、培養期間の間、２日おきに最終濃度が５０ｇ/Ｌ相当する滅菌濃縮グルコース溶液〔表４；CL生産培地組成(流加培地)〕ならびに最終濃度が２ g/Lに相当する滅菌濃縮酵母エキス溶液を添加しながら培養を実施した。培養途中でサンプルを抜き出し、培地中CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度を測定した。CL濃度、菌体濃度に関しては上述の実施例１と同様に測定した。
(Selective fermentation production of CL using Ustilago esculent a; fed-batch culture method)
In a 300 mL Erlenmeyer flask, 30 ml of a CL production medium was prepared as shown in Table 3 [CL production medium composition (feed fed culture initial medium)], and a medium sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes was prepared. 1.5 mL of a seed culture solution of Ustilago esculent a NBRC9887 strain prepared in the same manner as in Example 1 was sown and sterilized concentrated glucose corresponding to a final concentration of 50 g / L every two days during the culture period. Culturing was carried out while adding a solution [Table 4; CL production medium composition (feeding medium)] and a sterile concentrated yeast extract solution corresponding to a final concentration of 2 g / L. A sample was extracted during the culture, and the CL concentration, bacterial cell concentration, and glucose concentration in the medium were measured. The CL concentration and the bacterial cell concentration were measured in the same manner as in Example 1 above.
〈グルコースの定量〉
培養液を遠心分離し、水溶液相を分取した。分取した水溶液相を市販のグルコース検出キット（グルコーステストワコーＣ−ＩＩ、和光純薬工業）を用いて、水溶液相に含まれるグルコース量を測定した。
<Quantitative determination of glucose>
The culture solution was centrifuged and the aqueous phase was separated. The amount of glucose contained in the aqueous solution phase was measured using a commercially available glucose detection kit (Glucose Test Wako C-II, Wako Pure Chemical Industries).
図２に示すように、流加培養法を適用することで、CL生産量は、８日間で６,１００mg/Lであった。MELは検出されなかった。 As shown in FIG. 2, the CL production amount was 6,100 mg / L in 8 days by applying the fed-batch culture method. MEL was not detected.
比較例１
（従来株ウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)を用いたCL生産）
〈種培養〉
ディープフリーザー（-８０℃）で冷凍保存されたウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis) NBRC6907株について、実施例１と同様の方法を用いて行った。
〈本培養〉
本培養に用いる培地はビー・フラウツらの論文（非特許文献１）を参考に表５（培地組成）のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した培地を用意した。種培養液を１．５ ｍＬを播種し、２８℃で７日間、振蕩培養を行った。CLの抽出および分析方法は実施例１と同様に行った。MELの定量はＨＰＬCを用いて分析した。
Comparative Example 1
(CL production using the conventional stock Ustilago maydis )
<Seed culture>
The same method as in Example 1 was used for the Ustilago maydis NBRC6907 strain that had been frozen and stored in a deep freezer (−80 ° C.).
<Main culture>
The medium used for the main culture was prepared as shown in Table 5 (medium composition) with reference to the paper by Bee Frautz et al. 1.5 mL of the seed culture solution was inoculated and shake culture was performed at 28 ° C. for 7 days. CL extraction and analysis were performed in the same manner as in Example 1. The quantification of MEL was analyzed using HPLC.
〈ＨＰＬＣによるMEL生産量の定量〉
培養終了後の培養液から培養液と同量の酢酸エチルを用いてMEL画分の抽出を行った。抽出液中のMEL濃度はシリカゲルカラム（イナートシルＳｉｌ−１００Ａ）を接続したＨＰＬＣを用い、定量分析を行った。溶離液にはクロロホルム／メタノール混合溶媒を用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎで混合比が１０：０から０：１０まで変化するように設定したグラジエントシステムにより溶出した。検出は蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ−ＬＴ、島津製作所製）を用いた。精製したMELを用いて検量線を作成し、ピークエリアからMEL濃度を算出した。
<Quantification of MEL production by HPLC>
The MEL fraction was extracted from the culture broth after culturing using the same amount of ethyl acetate as the culture broth. The MEL concentration in the extract was quantitatively analyzed using HPLC connected to a silica gel column (Inertosyl Sil-100A). The eluent was a chloroform / methanol mixed solvent and eluted with a gradient system set so that the mixing ratio was changed from 10: 0 to 0:10 at a flow rate of 1 mL / min. For detection, an evaporative light scattering detector (ELSD-LT, manufactured by Shimadzu Corporation) was used. A calibration curve was prepared using purified MEL, and the MEL concentration was calculated from the peak area.
実施例１，２および比較例１で生産された糖脂質の定量結果を表６（実施例１、２、及び比較例１において、グルコースもしくは植物油を炭素原料として行ったCL生産試験の結果）に示す。従来の生産微生物であるウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis) NBRC6907株を用いて糖脂質を生産した比較例１ではCLと同時にMELを副生産したが、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株を用いて生産した実施例１および２ではMEL等のCL以外のバイオサーファクタントを生産しなかった。これらの結果から、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株をCL生産菌として利用することで、CLのみを選択的に生産できることがわかる。 The quantitative results of the glycolipids produced in Examples 1 and 2 and Comparative Example 1 are shown in Table 6 (results of a CL production test in which glucose or vegetable oil was used as a carbon raw material in Examples 1 and 2 and Comparative Example 1). Show. In Comparative Example 1 in which glycolipids were produced using the conventional production microorganism Ustilago maydis NBRC6907, MEL was by-produced simultaneously with CL. However, Ustilago esculenta NBRC9887 was used. In the produced Examples 1 and 2, biosurfactants other than CL such as MEL were not produced. From these results, it is understood that only CL can be selectively produced by using the Ustilago esculenta NBRC9887 strain as a CL-producing bacterium.
ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）が生産する糖脂質の構造解析
（糖脂質（セロビオースリピド）の精製）
実施例２と同様に培養した培養液から、酢酸エチルを用いて糖脂質を抽出・回収し、シリカゲルカラムを用いて、各成分を抽出した。抽出された糖脂質成分をTLC分析により分析した結果を図３に示す。より成分(a)を含む精製画分Aと成分(b)を含む精製画分Bを得た。
（糖脂質成分のＮＭＲ解析）
上記で得られた成分（a）、成分（ｂ）について、重水素化メタノール（CD3OD）を溶媒とするＮＭＲ解析により構造の同定を行った。1H、1３C、1H−1H COSY、HMQC、HMBCの各NMRスペクトル解析を行うことで、本糖脂質の構造を完全帰属した。その結果、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株が生産する糖脂質は全てCLであることがわかった。成分(a)中に２種類のCL同属体（成分‐（ａ）‐１および成分‐（ａ）‐２）が混在していることがわかった。同様に成分（ｂ）に関しても２種類のCL同属体（成分‐（ｂ）‐１および成分‐（ｂ）−２）が含まれていることがわかった。化３に一般式３を示す。それぞれの糖脂質に関して、帰属された化学シフトをまとめて表７（成分（ａ）‐１のＮＭＲ分析結果）、表８（成分（ａ）‐２のＮＭＲ分析結果）、表９（成分（ｂ）‐１のＮＭＲ分析結果）、および表１０（成分（ｂ）‐２のＮＭＲ分析結果）に示す。
Structural analysis of glycolipid produced by Ustilago esculent a (purification of glycolipid (cellobiose lipid))
From the culture solution cultured in the same manner as in Example 2, glycolipids were extracted and collected using ethyl acetate, and each component was extracted using a silica gel column. FIG. 3 shows the results of analyzing the extracted glycolipid component by TLC analysis. Thus, purified fraction A containing component (a) and purified fraction B containing component (b) were obtained.
(NMR analysis of glycolipid components)
The components (a) and (b) obtained above were identified by NMR analysis using deuterated methanol (CD 3 OD) as a solvent. The structure of the glycolipid was completely assigned by analyzing each NMR spectrum of 1 H, 13 C, 1 H- 1 H COZY, HMQC, and HMBC. As a result, it was found that the glycolipid produced by Ustilago esculent a NBRC9887 strain was all CL. It was found that two types of CL congeners (component- (a) -1 and component- (a) -2) were mixed in component (a). Similarly, regarding the component (b), it was found that two types of CL congeners (component- (b) -1 and component- (b) -2) were included. Formula 3 shows the general formula 3. Table 7 (NMR analysis result of component (a) -1), Table 8 (NMR analysis result of component (a) -2), and Table 9 (component (b) ) -1 NMR analysis results) and Table 10 (component (b) -2 NMR analysis results).
（CLの界面活性測定）
〈表面張力測定〉
実施例３において、精製した成分（ａ）の表面張力低下能を調べた。種々の濃度の成分(a)の水溶液を作成し、その表面張力をペンダントドロップ方式の表面張力計（Ｄｒｏｐ Ｍａｓｔｅｒ ＤＭ５００, 協和界面科学製）を用いて測定した。
(CL surface activity measurement)
<Surface tension measurement>
In Example 3, the ability of the purified component (a) to lower the surface tension was examined. Aqueous solutions of the component (a) having various concentrations were prepared, and the surface tension was measured using a pendant drop type surface tension meter (Drop Master DM500, manufactured by Kyowa Interface Science).
成分（ａ）について、上記の方法を用いて表面張力低下能を測定した。各濃度の成分(ａ)に対する表面張力は図４に示す値を示した。図４の曲線から成分（ａ）の臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）は５８．３ｍｇ／Ｌであり、その時の表面張力値（γｃｍｃ値）は３６．４ ｍＮ／ｍであった。既存の合成界面活性剤とくらべて、十分小さいｃｍｃ値ならびにγｃｍｃ値を示したことから、本発明で生産されるCLは界面活性剤として十分な機能を発揮できることが推察できる。 About component (a), the surface tension reduction ability was measured using said method. The surface tension with respect to component (a) at each concentration showed the values shown in FIG. From the curve in FIG. 4, the critical micelle concentration (cmc) of component (a) was 58.3 mg / L, and the surface tension value (γcmc value) at that time was 36.4 mN / m. Compared with the existing synthetic surfactant, it showed a sufficiently small cmc value and γcmc value, so it can be inferred that the CL produced in the present invention can exhibit a sufficient function as a surfactant.
（発酵槽を用いたCL生産）
食用として用いうるマコモから、新たに分離したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株を用いて培養試験を実施した。３００ ｍＬ容量の三角フラスコ３本にグルコース濃度を５０g/Lにした発酵槽用CL生産用培地（流加培養初期培地）３０ mlを表１１〔発酵槽用CL生産培地組成(流加培養初期培地)〕のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した。実施例１と同様に調製した種培養液を１．５ｍＬ播種し、２日間培養したものを種培養液とした。５Lジャーファーメンターに２L分の発酵槽用CL生産培地組成(流加培養初期培地)の培地を作成し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した。種培養をジャーファーメンターに播種し、培養温度２５℃、攪拌回転速度５００ ｒｐｍ、通気速度 ２ L/min （１ ＶＶＭ）の条件で培養した。培養５５時間で、オートクレーブした５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を400 ｍｌ添加した。培養途中でサンプルを抜き出し、培地中CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度を測定した。CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度に関しては上述の実施例２と同様に測定した。
(CL production using fermenter)
A culture test was carried out using a newly isolated strain of Ustilago esculenta MK-1 from Mako, which can be used for food. 30 mL of fermenter CL production medium (feed-batch initial culture medium) having a glucose concentration of 50 g / L in three 300 mL Erlenmeyer flasks are shown in Table 11 [Composition of fermenter CL production medium (feed-batch culture initial medium). )] And sterilized in an autoclave at 121 ° C. for 20 minutes. A seed culture solution prepared in the same manner as in Example 1 was inoculated with 1.5 mL, and cultured for 2 days as a seed culture solution. A 2L portion of the CL production medium composition for fermenter (feed fed culture initial medium) was prepared on a 5L jar fermenter, and sterilized by autoclaving at 121 ° C for 20 minutes. The seed culture was seeded on a jar fermenter, and cultured under conditions of a culture temperature of 25 ° C., a stirring rotation speed of 500 rpm, and an aeration speed of 2 L / min (1 VVM). After 55 hours of culture, 400 ml of an autoclaved 50% (w / v) glucose solution was added. A sample was extracted during the culture, and the CL concentration, bacterial cell concentration, and glucose concentration in the medium were measured. The CL concentration, bacterial cell concentration, and glucose concentration were measured in the same manner as in Example 2 above.
図５に示したように、食用として用いうるマコモから分離したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株を用いて、ジャーファーメンターでCLを生産した場合、５日間で、１３,０００mｇ／ＬのCLを培地中に蓄積した。５日目における、培地体積当たりのCL生産性は２,５８０mｇ／Ｌ／ｄａｙであった。また、TLC,HPLC,NMRの結果、MEL等のCL以外のバイオサーファクタントは検出されなかった。食用として用いうるマコモから分離した微生物株を利用して、適当な条件でCLを生産した場合、効率的にCLを生産できることが確認された。 As shown in FIG. 5, when CL was produced by a jar fermenter using Ustilago esculent a MK-1 strain isolated from Makomo which can be used for food, 13,000 mg / L of CL was accumulated in the medium. On the fifth day, the CL productivity per medium volume was 2,580 mg / L / day. As a result of TLC, HPLC, and NMR, biosurfactants other than CL such as MEL were not detected. It was confirmed that CL can be efficiently produced when CL is produced under appropriate conditions using a microbial strain isolated from Makomo that can be used for food.
焼酎製造の際、副生する発酵大麦エキスを用いたCL発行生産を実施した。３００ｍＬ容量の三角フラスコ３本にグルコース濃度を５０g/Lにした発酵槽用CL生産用培地３０ mlを実施例５と同様に調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した。実施例１と同様に調製したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株の種培養液を１．５ ｍＬ播種し、２日間培養したものを種培養液とした。５Lジャーファーメンターに手持ち屈折計を用いて５％Brix。に濃度を調整した発酵大麦エキス１．５Lを作成し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した。別にオートクレーブ滅菌した５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を４００ ｍｌ添加し、種培養をジャーファーメンターに播種し、培養温度２５℃、攪拌回転速度５００ ｒｐｍ、通気速度 ２ L/min （１ ＶＶＭ）の条件で培養した。培養６５時間で、オートクレーブした５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を400 ｍＬ添加した。培養途中でサンプルを抜き出し、培地中CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度を測定した。CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度に関しては上述の実施例２と同様に測定した。 During the production of shochu, CL wassuance production was performed using fermented barley extract produced as a by-product. 30 ml of a CL production medium for fermenter having a glucose concentration of 50 g / L was prepared in three 300 mL Erlenmeyer flasks in the same manner as in Example 5 and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. A seed culture solution prepared by seeding 1.5 mL of a seed culture solution of Ustilago esculent a MK-1 strain prepared in the same manner as in Example 1 and culturing for 2 days was used as a seed culture solution. 5% Brix using a hand-held refractometer on a 5L jar fermenter. 1.5 L of fermented barley extract adjusted in concentration was prepared and sterilized in an autoclave at 121 ° C. for 20 minutes. Separately, 400 ml of a 50% (w / v) glucose solution sterilized by autoclaving was added, the seed culture was seeded on a jar fermenter, the culture temperature was 25 ° C., the stirring rotation speed was 500 rpm, and the aeration speed was 2 L / min (1 VVM). The culture was performed under the conditions of After 65 hours of culture, 400 mL of an autoclaved 50% (w / v) glucose solution was added. A sample was extracted during the culture, and the CL concentration, bacterial cell concentration, and glucose concentration in the medium were measured. The CL concentration, bacterial cell concentration, and glucose concentration were measured in the same manner as in Example 2 above.
図６に示したように、食用として用いうるマコモから分離したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株を用いて、ジャーファーメンターでCLを生産した場合、７日間で、３６,０００mｇ／ＬのCLを培地中に蓄積した。７日目における、培地体積当たりのCL生産性は５,１００mｇ/Ｌ/ｄａｙであった。また、TLC,HPLC,NMRの結果、MEL等のCL以外のバイオサーファクタントは検出されなかった。これまでの報告では、ウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)を用いた培養によって７日間で30 g/Lの糖脂質を生産できるという報告例（Appl. Microbiol. Biotechnol., 51, 33-39 (1999)）があるが、この場合、得られる糖脂質はMELとCLの混合物であり、その含有比はMEL/CL = 9/1となる。つまり、純粋なCLの生産量は約3 g/Lにしか満たない。また最近、別の属の酵母であるシュードザイマ・フロキュローサ（Pseudozyma flocculosa）を用いた培養によって、これまでの最高値である７日間で15 g/Lのフロキュロシンが生産できると言う報告がある（Appl. Microbiol. Biotechnol., 80, 307-315 (2008)）が、本技術では従来技術の２倍以上の生産量で簡便にCLのみを生産することができる。すなわち、発酵大麦エキスを用いた天然培地にて、本菌株を用いて効率的にCLを生産できることが確認された。さらに培養終了後の発酵液から、酢酸エチル・2-プロパノール混合溶媒（混合比４：１）を用いて、CLを回収したところ、９０．１ ｇのCLを回収することができた。 As shown in FIG. 6, when CL was produced with a jar fermenter using Ustilago esculent a MK-1 strain isolated from Makomo which can be used for food, 36,000 mg / day in 7 days L of CL was accumulated in the medium. On the seventh day, the CL productivity per medium volume was 5,100 mg / L / day. As a result of TLC, HPLC, and NMR, biosurfactants other than CL such as MEL were not detected. In previous reports, 30 g / L glycolipid can be produced in 7 days by culturing with Ustilago maydis (Appl. Microbiol. Biotechnol., 51, 33-39 (1999) In this case, the resulting glycolipid is a mixture of MEL and CL, and the content ratio is MEL / CL = 9/1. In other words, the production of pure CL is less than about 3 g / L. Recently, it has been reported that 15 g / L of floculosin can be produced in 7 days, the highest value so far, by culturing with yeast of another genus, Pseudozyma flocculosa (Appl. Microbiol. Biotechnol., 80, 307-315 (2008)), this technology can easily produce only CL at a production amount more than twice that of the prior art. That is, it was confirmed that CL can be efficiently produced using this strain in a natural medium using fermented barley extract. Further, when CL was recovered from the fermentation broth after completion of the culture using a mixed solvent of ethyl acetate and 2-propanol (mixing ratio 4: 1), 90.1 g of CL could be recovered.
（その他新規分離株、登録保存株によるCLの生産）
愛媛県今治産マコモの黒穂菌嬰より、ポテトデキストロール寒天培地を用いて、分離した１１株のウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物株（M１７〜M２７）、ならびに、農林水産省ジーンバンクに登録されているウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物株(ＭＡＦＦ ３０５６１６株, ＭＡＦＦ ３０５６１８株、ＭＡＦＦ ３０５６１９株、ＭＡＦＦ ３０５６２１株)のCL生産性の有無を確認するため、実施例１と同様の方法で、以下の実験を行い、CL生産性を確認した。
(CL production by other new isolates and registered stocks)
From the potato dextrol agar medium from Makoto Komaho produced in Imabari, Ehime Prefecture, using the potato dextrol agar medium, isolated microorganism strains (M17-M27) belonging to Ustilago esculenta , and Genebank, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries In order to confirm the presence or absence of CL productivity of microorganism strains (MAFF 305616 strain, MAFF 305618 strain, MAFF 305619 strain, MAFF 305621 strain) belonging to Ustilago esculent a registered in the US The following experiment was conducted by the method described above to confirm CL productivity.
その結果、前記１５株すべてにおいて、CL生産を確認できた。その生産量は４６０ｍｇ/Ｌから２,５００mｇ／Ｌであった。また、TLC,HPLC,NMRの結果、MEL等のCL以外のバイオサーファクタントは検出されなかった。以上のごとく、新たにマコモ属に属する植物から分離したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）株や、保存機関に寄託されている株でも、MEL等のCL以外のバイオサーファクタントを生産することなくCLを生産できることがわかった。分離株ならびに農林水産省ジーンバンク保存ウスチラゴ・エスキュレンタ株のCL生産量と菌体量を表１２に示す。 As a result, CL production was confirmed in all the 15 strains. The production amount was 460 mg / L to 2500 mg / L. As a result of TLC, HPLC, and NMR, biosurfactants other than CL such as MEL were not detected. As described above, it is possible to produce CL without producing biosurfactants other than CL, such as MEL, even with strains of Ustilago esculent a newly isolated from plants belonging to the genus Macomo and strains deposited with preservation institutions. I found out that it can be produced. Table 12 shows the CL production amount and the bacterial cell amount of the isolated strain and the Usttilago esculenta strain preserved by Genebank, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries.
FERM P-21725
FERM P-21725
Claims (9)
記
（１）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。
（２）YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で、３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。
（３）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。
（４）また、前記（１）、（２）及び（３）のいずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
（５）生理性状試験の結果は、表１に示す通りである。
Record
(1) After culturing on YM agar medium, PDB agar medium and 5% malt extract medium at 25 ° C. for 7 days, corrugated, semi-lens, wet and creamy colonies are formed.
(2) Formation of hyphae having a width of about 4-5 μm is confirmed after culturing at 25 ° C. for 3 days in YM liquid medium and PD liquid medium.
(3) On YM agar medium, PDB agar medium, and 5% malt extract medium plate medium, formation of hyphae with a septum and pseudohyphae was observed after culturing at 25 ° C. for 7 days.
(4) In any of the cases (1), (2) and (3), no clear sexual genital formation is observed.
(5) The results of the physiological property test are as shown in Table 1.
記
（１）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。
（２）YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。
（３）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。
（４）また、前記（１）、（２）及び（３）のいずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
（５）生理性状試験の結果は、上記の表１に示す通りである。 The method for producing a biosurfactant according to claim 4 , wherein the microorganism belonging to Ustilago esculenta is a microorganism having the following mycological properties.
Record
(1) After culturing on YM agar medium, PDB agar medium and 5% malt extract medium at 25 ° C. for 7 days, corrugated, semi-lens, wet and creamy colonies are formed.
(2) Formation of mycelia with a width of about 4-5 μm is confirmed after culturing at 25 ° C. for 3 days in YM liquid medium and PD liquid medium.
(3) On YM agar medium, PDB agar medium, and 5% malt extract medium plate medium, formation of hyphae with a septum and pseudohyphae was observed after culturing at 25 ° C. for 7 days.
(4) In any of the cases (1), (2) and (3), no clear sexual genital formation is observed.
(5) The results of the physiological property test are as shown in Table 1 above.
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