JP5465427B2 - Fructosyl-L-valylhistidine measuring enzyme and use thereof - Google Patents
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Description
本発明は、フルクトシルアミノ酸の測定において有用なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、およびその利用法に関する。より詳しくは、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型よりも低下した変異タンパク質、および、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンの測定方法、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン測定用キット、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン測定用センサー等、上記変異タンパク質の利用法に関する。 The present invention relates to a protein having fructosylvalylhistidine oxidase activity useful in the measurement of fructosyl amino acids, and a method for using the same. More specifically, a mutant protein having fructosyl valylhistidine oxidase activity and having a ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to fructosyl-L-valylhistidine reactivity lower than that of the wild type, and fructosyl- The present invention relates to a method for measuring the L-valylhistidine, a method for measuring fructosyl-L-valylhistidine, a sensor for measuring fructosyl-L-valylhistidine, and the like.
糖尿病患者の血糖コントロールマーカーとして、血液タンパク質に含まれる糖化タンパク質であるヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、グリコアルブミンが重用されている。糖化タンパク質は、血液中に存在するＤ−グルコースと、血液タンパク質を構成するアミノ酸残基とが反応して生成する。血液タンパク質における主な糖化部位は、リジン残基のε−アミノ基および血液タンパク質のアミノ末端アミノ酸のα−アミノ基である。ＨｂＡ１ｃを測定する場合、Ｄ−グルコースがヘモグロビンβ鎖のアミノ末端アミノ酸であるバリンのα−アミノ基に結合して生じた糖化タンパク質の量を測定する。 As a blood glucose control marker for diabetic patients, hemoglobin A1c (HbA1c), which is a glycated protein contained in blood protein, and glycoalbumin are frequently used. The glycated protein is produced by a reaction between D-glucose present in blood and amino acid residues constituting the blood protein. The main glycation sites in blood proteins are the ε-amino group of lysine residues and the α-amino group of the amino terminal amino acid of blood proteins. When measuring HbA1c, the amount of glycated protein produced by binding D-glucose to the α-amino group of valine, which is the amino terminal amino acid of hemoglobin β chain, is measured.
近年、血液中の糖化タンパク質を簡便且つ短時間で測定できる酵素的測定法が開発され、既に商品化されている。該酵素的測定法を利用することにより、糖化タンパク質をハイスループットに測定することが可能となり、臨床検査分野で役立てられている。酵素法は、まず、プロテアーゼで糖化タンパク質を加水分解し、次に生じた、フルクトシル−Ｌ−バリン（以下、「Ｆ−Ｖａｌ」ともいう）、ε−フルクトシル−Ｌ−リジン（以下、「Ｆ−Ｌｙｓ」ともいう）などの糖化アミノ酸をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」ともいう）で酸化的加水分解する。最後に、オキシダーゼ反応により生じた過酸化水素をペルオキシダーゼ−色原体反応システムにより比色定量する（特許文献１〜１１参照）。 In recent years, enzymatic measurement methods capable of measuring glycated proteins in blood easily and in a short time have been developed and already commercialized. By utilizing the enzymatic measurement method, it is possible to measure glycated protein with high throughput, which is useful in the clinical laboratory field. In the enzymatic method, first, a glycated protein is hydrolyzed with a protease, and then generated fructosyl-L-valine (hereinafter also referred to as “F-Val”), ε-fructosyl-L-lysine (hereinafter referred to as “F-”). Glycated amino acids such as “Lys”) are oxidatively hydrolyzed with fructosyl amino acid oxidase (hereinafter also referred to as “FAOD”). Finally, the hydrogen peroxide generated by the oxidase reaction is colorimetrically determined by a peroxidase-chromogen reaction system (see Patent Documents 1 to 11).
酵素法による糖化タンパク質の測定では、主反応酵素であるＦＡＯＤの基質特異性が重要な要素となる。例えば、ＨｂＡ１ｃの測定では、Ｆ−Ｖａｌに対する特異性の高い酵素が望まれている。また、糖化ヘモグロビンのβ鎖に特異的な測定を行うためには、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン（以下、「Ｆ−ＶａｌＨｉｓ」ともいう）に作用する酵素が望まれている。これは、ヘモグロビンα鎖およびβ鎖のアミノ末端アミノ酸が共にバリンであることから、β鎖に特異的な測定を行うためには、アミノ末端のアミノ酸２残基（すなわち、Ｆ−ＶａｌＨｉｓ）の認識が必要であるためである（特許文献１２〜１４、非特許文献１、非特許文献２参照）。 In the measurement of glycated protein by the enzymatic method, the substrate specificity of FAOD, which is the main reaction enzyme, is an important factor. For example, in the measurement of HbA1c, an enzyme with high specificity for F-Val is desired. In addition, in order to perform measurement specific to the β chain of glycated hemoglobin, an enzyme that acts on fructosyl-L-valylhistidine (hereinafter also referred to as “F-ValHis”) is desired. This is because the amino terminal amino acids of hemoglobin α-chain and β-chain are both valine, and therefore, amino acid-terminal amino acid 2 residue (ie, F-ValHis) is recognized in order to perform measurement specific to β-chain. (See Patent Documents 12 to 14, Non-Patent Document 1, and Non-Patent Document 2).
これまでに、上記Ｆ−ＶａｌＨｉｓに作用するオキシダーゼは、数種の糸状菌、またはその遺伝子組換え体より抽出、精製されている。また、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（以下、「ＦＶＨＯＤ」ともいう）をコードする遺伝子も単離されている（特許文献１４、非特許文献１、非特許文献２参照）。
しかしながら、タンパク質鎖におけるα−アミノ基は、アミノ末端のアミノ酸１残基分しか存在しないのに対し、Ｆ−Ｌｙｓとなり得るリジン残基は、通常、タンパク質鎖内に数多く存在する。このため、ＨｂＡ１ｃの測定において用いられる従来のＦＶＨＯＤは、Ｆ−ＶａｌＨｉｓに対する基質特異性が高くとも、Ｆ−Ｌｙｓに対する反応性が高いので、ＨｂＡ１ｃを正確に測定することが困難であった。 However, an α-amino group in a protein chain exists only for one amino acid residue at the amino terminal, whereas many lysine residues that can be F-Lys are usually present in a protein chain. For this reason, even if the conventional FVHOD used in the measurement of HbA1c has a high substrate specificity for F-ValHis, it has a high reactivity to F-Lys, so that it is difficult to accurately measure HbA1c.
それゆえに、糖化タンパク質の測定に好適なＦＶＨＯＤ活性を有するタンパク質として、Ｆ−ＶａｌＨｉｓ反応性に対するＦ−Ｌｙｓ反応性の割合が野生型よりも低い変異タンパク質が望まれている。 Therefore, as a protein having FVHOD activity suitable for measurement of glycated protein, a mutant protein having a lower ratio of F-Lys reactivity to F-ValHis reactivity than that of the wild type is desired.
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンの測定に有用なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質であり、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型よりも低下した変異タンパク質を造成し、これを提供することである。また、上記変異タンパク質の代表的な利用例として、当該変異タンパク質を用いたフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンの測定方法、糖化タンパク質の測定キット、および糖化タンパク質センサー等を提供する。 The present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and an object thereof is a protein having fructosyl-valylhistidine oxidase activity useful for measurement of fructosyl-L-valylhistidine, and fructosyl-L- To provide and provide a mutant protein in which the ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to valylhistidine reactivity is lower than that of the wild type. In addition, as a typical application example of the mutant protein, a measurement method for fructosyl-L-valylhistidine using the mutant protein, a kit for measuring a glycated protein, a glycated protein sensor, and the like are provided.
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一部のアミノ酸残基を置換することによって、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型よりも低下した変異タンパク質を造成することに成功した。さらに本発明者らは、当該タンパク質をフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン含有検体に作用させ、生じた過酸化水素をペルオキシダーゼ反応で定量することによって、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンを測定することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下の発明を包含する。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have substituted a part of amino acid residues of a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having fructosyl valyl histidine oxidase activity. By doing so, the inventors succeeded in constructing a mutant protein in which the ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to fructosyl-L-valylhistidine reactivity was lower than that of the wild type. Furthermore, the present inventors can measure fructosyl-L-valylhistidine by allowing the protein to act on a fructosyl-L-valylhistidine-containing specimen and quantifying the resulting hydrogen peroxide by a peroxidase reaction. As a result, the present invention has been completed. That is, the present invention includes the following inventions.
本発明に係るタンパク質は、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）を特徴とするタンパク質である：
（Ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５６番目のアスパラギンが置換され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質；
（ＩＩ）上記（Ｉ）のタンパク質において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、および／または付加され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質。
The protein according to the present invention is a protein characterized by the following (I) or (II):
(I) Asparagine at the 56th position from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having fructosylvalylhistidine oxidase activity and ε-fructosyl-L for fructosyl-L-valylhistidine reactivity A protein with a reduced rate of lysine reactivity than the wild type protein;
(II) In the protein of (I), one or several amino acid residues are substituted, deleted, and / or added, have fructosylvalylhistidine oxidase activity, and fructosyl-L-valylhistidine Protein in which the ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to reactivity is lower than that of wild-type protein.
本発明に係るタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５６番目のアスパラギンが、セリンおよびアラニンで置換されたタンパク質であることが好ましい。 The protein according to the present invention is preferably a protein in which the 56th asparagine from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with serine and alanine.
また本発明に係るタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）を特徴とするタンパク質であってもよい：
（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）上記（ａ）のタンパク質において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質。
The protein according to the present invention may be a protein characterized by the following (a) or (b):
(A) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(B) In the protein of (a) above, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added, having fructosylvalylhistidine oxidase activity, and fructosyl-L- A protein in which the ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to valylhistidine reactivity is lower than that of the wild-type protein.
上記配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、クリプトコッカス・ネオフォーマンス（Cryptococcus neoformans）由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼであってもよい。 The protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be fructosyl valyl histidine oxidase derived from Cryptococcus neoformans.
また本発明は、上記本発明に係るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。 The present invention also includes a polynucleotide encoding the protein according to the present invention.
また本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号４に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。 The polynucleotide according to the present invention may be a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
また上記のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質をコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。 Further, it hybridizes with the above-mentioned polynucleotide under stringent conditions, has fructosyl valyl histidine oxidase activity, and has a ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to fructosyl-L-valyl histidine reactivity. Polynucleotides encoding proteins that are reduced relative to the wild type protein are also included in the present invention.
また本発明は、上記本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクターを包含する。 The present invention also includes a vector comprising the polynucleotide according to the present invention.
また本発明は、上記本発明に係るベクターで形質転換された形質転換体を包含する。 The present invention also includes a transformant transformed with the vector according to the present invention.
また本発明は、上記本発明に係る形質転換体を培養する工程を含むフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの製造方法を包含する。 Moreover, this invention includes the manufacturing method of fructosyl valyl histidine oxidase including the process of culture | cultivating the transformant which concerns on the said invention.
また本発明は、糖化アミンに、本発明に係るタンパク質を作用させる工程を含む、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンの測定方法を包含する。 Moreover, this invention includes the measuring method of fructosyl-L- valyl histidine including the process of making the protein which concerns on this invention act on glycated amine.
また本発明は、少なくとも上記本発明に係るタンパク質を備えることを特徴とする糖化タンパク質測定キットを包含する。 The present invention also includes a glycated protein measurement kit comprising at least the protein according to the present invention.
また本発明は、少なくとも上記本発明に係るタンパク質を備えることを特徴とする糖化タンパク質センサーを包含する。 The present invention also includes a glycated protein sensor comprising at least the protein according to the present invention.
なお、タンパク質の立体構造が決定されていたとしても、基質特異性を合理的に改良することが困難であることは当業者に広く知られている。更に、現在に至るまでフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの立体構造決定は為されておらず、変異タンパク質造成の指標を得ること自体、技術的に非常に困難であることが当業者に広く知られていた。本発明は、本発明者らの鋭意努力によって上記技術的困難を克服することによって完成された。したがって、本発明は当業者が予想し得ない顕著且つ有利な効果を有するといえる。 It is well known to those skilled in the art that even if the three-dimensional structure of a protein has been determined, it is difficult to rationally improve the substrate specificity. Furthermore, until now, the three-dimensional structure of fructosyl valyl histidine oxidase has not been determined, and it is widely known to those skilled in the art that it is very difficult to obtain an indicator of mutant protein construction itself. It was. The present invention has been completed by overcoming the technical difficulties described above through the diligent efforts of the inventors. Therefore, it can be said that the present invention has a remarkable and advantageous effect that cannot be expected by those skilled in the art.
本発明に係るタンパク質は、以上のように（Ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５６番目のアスパラギンが置換され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質、または（ＩＩ）上記（Ｉ）のタンパク質において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、および／または付加され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質である。従って、本発明により、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン測定用として優れた特性を有する、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、およびその利用法を提供することが可能となる。 As described above, the protein according to the present invention has (I) the substitution of the 56th asparagine from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the fructosylvalylhistidine oxidase activity, and fructosyl-L A protein in which the ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to valylhistidine reactivity is lower than that of the wild-type protein, or (II) one or several amino acid residues are substituted in the protein of (I) above, Deletion and / or addition, have fructosyl valyl histidine oxidase activity, and have a lower ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to fructosyl-L-valyl histidine reactivity than wild type protein It is a protein. Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a protein having fructosyl valyl histidine oxidase activity, which has excellent characteristics for measuring fructosyl-L-valyl histidine, and a method for using the same.
本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「〜」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「★〜☆」と記載されていれば「★以上、☆以下」を示す。また本明細書中の「および／または」は、いずれか一方または両方を意味する。 An embodiment of the present invention will be described in detail as follows, but the present invention is not limited to this. In addition, all the nonpatent literatures and patent literatures described in this specification are used as reference in this specification. In addition, “˜” in the present specification means “above and below”. For example, if “★ to ☆” is described in the specification, it means “★ or more and ☆ below”. In the present specification, “and / or” means either one or both.
〔１．本発明に係るタンパク質〕
本発明に係るタンパク質は、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）を特徴とするタンパク質である。
[1. Protein according to the present invention]
The protein according to the present invention is a protein characterized by the following (I) or (II).
（Ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５６番目のアスパラギンが置換され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質；
（ＩＩ）上記（Ｉ）のタンパク質において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、および／または付加され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質。
(I) Asparagine at the 56th position from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having fructosylvalylhistidine oxidase activity and ε-fructosyl-L for fructosyl-L-valylhistidine reactivity A protein with a reduced rate of lysine reactivity than the wild type protein;
(II) In the protein of (I), one or several amino acid residues are substituted, deleted, and / or added, have fructosylvalylhistidine oxidase activity, and fructosyl-L-valylhistidine Protein in which the ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to reactivity is lower than that of wild-type protein.
上記配列番号１に示されるアミノ酸配列は、公知のＦＶＨＯＤの塩基配列情報を基に、クリプトコッカス・ネオフォーマンス（Cryptococcus neoformans）のゲノムデータベース（http://www.broad.mit.edu/annotation/ genome/aspergillus_group/GenomesIndex.html）〔２００８年１２月１１日検索〕から見出したタンパク質のアミノ酸配列である。 The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is based on the known FVHOD base sequence information, and the Cryptococcus neoformans genome database (http://www.broad.mit.edu/annotation/genome). /aspergillus_group/GenomesIndex.html) [searched on December 11, 2008].
また、本発明において、「野生型タンパク質」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を表す。 In the present invention, the “wild type protein” represents a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
本発明に係るタンパク質においてアミノ酸残基が置換される部位は、置換後のタンパク質がフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質である限りにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端より５６番目のアスパラギンである。なお、当該箇所のアミノ酸を置換するアミノ酸は、置換後のタンパク質がフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質である限りにおいて特に限定されない。例えば、セリンまたはアラニンで置換されてよい。 In the protein according to the present invention, the amino acid residue is substituted at the site where the substituted protein has fructosylvalylhistidine oxidase activity and ε-fructosyl-L-lysine reaction to fructosyl-L-valylhistidine reactivity. As long as the percentage of sex is a protein that is lower than that of the wild type protein, it is the 56th asparagine from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, the amino acid which substitutes the amino acid of the said position has the ratio of (epsilon) -fructosyl-L-lysine reactivity with respect to fructosyl-L-valylhistidine reactivity, and the protein after substitution has fructosyl valyl histidine oxidase activity. The protein is not particularly limited as long as the protein is lower than the wild type protein. For example, it may be substituted with serine or alanine.
本発明に係るタンパク質の一実施形態のアミノ酸配列としては、例えば配列番号３に示されるアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ末端より５６番目のアスパラギンがセリンに置換されたタンパク質である。なお本発明に係るタンパク質はこれに限定されるものではないことは言うまでもない。 As an amino acid sequence of one embodiment of the protein according to the present invention, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 can be mentioned. The protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a protein in which the 56th asparagine from the amino terminus of the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with serine. Needless to say, the protein according to the present invention is not limited thereto.
また本発明には、上記で説示した本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質をも包含するが、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加される部位は、欠失、置換および／または付加後のタンパク質がフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下していれば、該アミノ酸配列中のどの部位であってもよい。ここで「１または数個のアミノ酸残基」とは、具体的には１０個以内の範囲のアミノ酸残基数をいう。 Further, the present invention includes an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence of the protein according to the present invention described above, and fructosyl valyl histidine oxidase activity. And a protein in which the ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to fructosyl-L-valylhistidine reactivity is lower than that of the wild-type protein, but lacks one or several amino acids, The site to be substituted and / or added is that the protein after deletion, substitution and / or addition has fructosylvalylhistidine oxidase activity and ε-fructosyl-L-lysine for fructosyl-L-valylhistidine reactivity If the reactivity ratio is lower than that of the wild-type protein, the amino acid sequence It can be any part in the row. Here, “one or several amino acid residues” specifically refers to the number of amino acid residues within a range of 10 or less.
本明細書において、「反応性」とは、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンまたはε−フルクトシル−Ｌ−リジンを基質として用いて測定したオキシダーゼ活性をいう。反応性は、実施例中に記載したような活性測定法等、種々の公知の方法で評価することができる。 In this specification, “reactivity” refers to oxidase activity measured using fructosyl-L-valylhistidine or ε-fructosyl-L-lysine as a substrate. The reactivity can be evaluated by various known methods such as an activity measurement method as described in Examples.
本明細書において、「フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合」とは、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンを基質としたオキシダーゼ活性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジンを基質としたオキシダーゼ活性の割合を表す。具体的には、ε−フルクトシル−Ｌ−リジンを基質としたオキシダーゼ活性をフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンを基質としたオキシダーゼ活性で除した値を指し、以下、活性比率とも称する。 In the present specification, “ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to fructosyl-L-valylhistidine reactivity” means ε-fructosyl-L-lysine for oxidase activity using fructosyl-L-valylhistidine as a substrate. Represents the ratio of oxidase activity using as a substrate. Specifically, it refers to a value obtained by dividing oxidase activity using ε-fructosyl-L-lysine as a substrate by oxidase activity using fructosyl-L-valylhistidine as a substrate, and is also referred to as an activity ratio hereinafter.
本発明に係るタンパク質は、野生型タンパク質よりも低い活性比率を有することを特徴としている。通常、野生型タンパク質が有する上記活性比率は、０．５〜５の範囲である。本発明に係るタンパク質が有する上記活性比率としては、０．１〜０．４の範囲であることが好ましく、０．１〜０．２５の範囲であることがより好ましい。活性比率が上記範囲内であれば、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンに対する基質特異的な反応性は高く、且つε−フルクトシル−Ｌ−リジンに対する反応のバックグラウンドを抑えることができるため、血液中の糖化タンパク質をより正確に測定することできる。 The protein according to the present invention is characterized by having a lower activity ratio than the wild type protein. Usually, the said activity ratio which a wild type protein has is the range of 0.5-5. As said activity ratio which the protein which concerns on this invention has, it is preferable that it is the range of 0.1-0.4, and it is more preferable that it is the range of 0.1-0.25. If the activity ratio is within the above range, the substrate-specific reactivity with fructosyl-L-valylhistidine is high, and the background of the reaction with ε-fructosyl-L-lysine can be suppressed. Protein can be measured more accurately.
本発明におけるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性は、後述する実施例の「活性測定法」の項において説明した方法によって測定される。フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を測定する場合、Ｆ−ＶａｌＨｉｓを基質として用いればよい。なお、本発明の説明において「フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有する」とは、好ましくはＦ−ＶａｌＨｉｓを基質として０．０５Ｕ／ｍｇ−protein以上の活性を有することを意味し、さらに好ましくは０．５Ｕ／ｍｇ−protein以上の活性を有することを意味する。 The fructosyl valyl histidine oxidase activity in the present invention is measured by the method described in the “activity measurement method” section of the Examples described later. When measuring fructosyl valyl histidine oxidase activity, F-ValHis may be used as a substrate. In the description of the present invention, “having fructosyl valyl histidine oxidase activity” preferably means having an activity of 0.05 U / mg-protein or more using F-ValHis as a substrate, more preferably 0. It means having an activity of 5 U / mg-protein or more.
上記本発明に係るタンパク質は、例えば遺伝子組み換え技術を用いて生産されてもよいし、アミノ酸合成機などを用いて化学合成されてもよい。遺伝子組み換え技術において、好適に用いられる各種組換えタンパク質発現系は、例えば、大腸菌発現系、昆虫細胞発現系、哺乳類細胞発現系、および無細胞発現系を用いてもよく、これらに限定されない。本発明に係るタンパク質等の製造方法については後述する。 The protein according to the present invention may be produced, for example, using a gene recombination technique, or may be chemically synthesized using an amino acid synthesizer or the like. Various recombinant protein expression systems suitably used in the genetic recombination technique may be, for example, an E. coli expression system, insect cell expression system, mammalian cell expression system, and cell-free expression system, but are not limited thereto. A method for producing a protein or the like according to the present invention will be described later.
また本発明に係るタンパク質等は、例えば、分子間および／または分子内架橋（例えば、ジスルフィド結合など）が施されたもの、化学修飾（例えば、糖鎖、リン酸もしくはその他の官能基など）されたもの、標識（例えば、ヒスチジンタグなど）が付与されたもの、または融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、およびＧＦＰなど）を付与されたものなどが含まれるが、特にこれらに限定されない。さらに、本発明に係るタンパク質等は、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性が実質的に維持され、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下する限り、数種のタンパク質の断片を組み合わせて構成したキメラタンパク質も含み得る。 In addition, the protein and the like according to the present invention are, for example, those having intermolecular and / or intramolecular crosslinks (for example, disulfide bonds), chemically modified (for example, sugar chains, phosphates or other functional groups). However, the present invention is not particularly limited to these, and those provided with a label (for example, histidine tag) or those provided with a fusion protein (for example, streptavidin, cytochrome, and GFP). Furthermore, in the protein according to the present invention, the fructosyl valylhistidine oxidase activity is substantially maintained, and the ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to fructosyl-L-valylhistidine reactivity is higher than that of the wild type protein. As long as it also decreases, a chimeric protein constituted by combining several types of protein fragments may also be included.
本発明に係るタンパク質と、血清タンパク質や有機酸、デキストランをはじめとする賦形剤等とからフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤を構成してもよい。上記フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤には、酵素剤の構成物品として公知の物品が含まれていてもよい。 The fructosyl valyl histidine oxidase agent may be composed of the protein according to the present invention and excipients such as serum protein, organic acid, dextran and the like. The fructosyl valyl histidine oxidase agent may contain a known article as a constituent article of the enzyme agent.
〔２．本発明に係るポリヌクレオチド等〕
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るタンパク質をコードすることを特徴としている。
[2. Polynucleotide according to the present invention]
The polynucleotide according to the present invention is characterized by encoding the protein according to the present invention.
ここで、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。 Here, the polynucleotide may be present in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA) or RNA (eg, mRNA). DNA or RNA may be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA or RNA may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand).
また、本発明に係るポリヌクレオチドは化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更してもよい。 The polynucleotide according to the present invention may be chemically synthesized, and the codon usage may be changed so that expression of the encoded protein is improved.
本発明に係るポリヌクレオチドを改変する方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、および／または付加することで組換えタンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドを作製してよい。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。 As a method for modifying a polynucleotide according to the present invention, a commonly used method for modifying a polynucleotide is used. That is, a polynucleotide having genetic information of a recombinant protein may be prepared by substituting, deleting, and / or adding a specific base of a polynucleotide having protein genetic information. Specific methods for converting the base of the polynucleotide include, for example, use of a commercially available kit (Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit; manufactured by Clonetech, QuickChange Site Directed Mutagenic Kit; Stratagene, etc.) or polymerase chain reaction. Use. These methods are known to those skilled in the art.
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記本発明に係るタンパク質をコードしていればその塩基配列は特に限定されるものではない。よって本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列に応じた塩基配列からなる全てのポリヌクレオチドが本発明に含まれる。 The base sequence of the polynucleotide according to the present invention is not particularly limited as long as it encodes the protein according to the present invention. Therefore, the present invention includes all polynucleotides having a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the protein according to the present invention.
本発明に係るポリヌクレオチドの一実施形態としては、例えば、配列番号４に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。 As one embodiment of the polynucleotide according to the present invention, for example, a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 can be mentioned.
ここで、配列番号４に示される塩基配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５４番目のアスパラギンがセリンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質（便宜上「Ｎ５４Ｓ」と表記する場合がある）をコードする塩基配列である。 Here, the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is a protein having an amino acid sequence in which the 54th asparagine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with serine (may be referred to as “N54S” for convenience). The base sequence to be encoded.
本発明の一実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチドは化学的に合成された塩基で置換されてもよい。また、本発明に係るポリヌクレオチドが置換される部位は特に限定されず、置換後の塩基配列から発現するタンパク質が好適な性質を有していればよい。つまり、置換後の塩基配列から発現するタンパク質がフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下していればよい。 In one embodiment of the present invention, the polynucleotide according to the present invention may be substituted with a chemically synthesized base. Moreover, the site | part by which the polynucleotide based on this invention is substituted is not specifically limited, The protein expressed from the base sequence after substitution should just have a suitable property. That is, the protein expressed from the substituted base sequence has fructosyl valyl histidine oxidase activity, and the ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to fructosyl-L-valyl histidine reactivity is higher than that of the wild type protein. It only has to be lowered.
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るタンパク質をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、その他の塩基配列が付加されていてもいてもよい。付加される塩基配列としては、限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、およびＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ＧＳＴおよびＭＢＰなど）、プロモーター配列（例えば、酵母由来プロモーター配列、ファージ由来プロモーター配列、および大腸菌由来プロモーター配列など）、およびシグナル配列（例えば、小胞体移行シグナル配列、および分泌配列など）をコードする塩基配列などが挙げられる。これらの塩基配列が付加される部位は特に限定されるものではなく、翻訳されるタンパク質のＮ末端であっても、Ｃ末端でもあってもよい。 The polynucleotide according to the present invention may be composed only of the polynucleotide encoding the protein according to the present invention, but other base sequences may be added thereto. The base sequence to be added is not limited, but includes a label (for example, histidine tag, Myc tag, and FLAG tag), a fusion protein (for example, GST and MBP), a promoter sequence (for example, yeast-derived promoter sequence, phage) Derived promoter sequences, E. coli derived promoter sequences, etc.), and base sequences encoding signal sequences (eg, endoplasmic reticulum translocation signal sequences, secretory sequences, etc.). The site to which these base sequences are added is not particularly limited, and may be the N-terminus or the C-terminus of the translated protein.
また本発明に係るポリヌクレオチドには、上記本発明に係るタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号４に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド）、またはこれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。 Further, the polynucleotide according to the present invention includes a polynucleotide encoding the protein according to the present invention (for example, a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4), or a polynucleotide comprising a base sequence complementary thereto. The ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to fructosyl-L-valylhistidine reactivity is higher than that of the wild-type protein. Also included are polynucleotides that encode reduced proteins.
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドのＴｍ値から１５℃、好ましくは１０℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。具体例としては、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。 Here, the “stringent condition” refers to a condition in which nucleic acids having high homology, for example, hybridize at a temperature ranging from the Tm value of a perfectly matched hybrid to a temperature 15 ° C., preferably 10 ° C. lower. . As a specific example, it means a condition for hybridization in a general hybridization buffer at 68 ° C. for 20 hours.
本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列は、Science, 214: 1205 (1981)に記載されたジデオキシ法により決定され得る。 The base sequence of the polynucleotide according to the present invention can be determined by the dideoxy method described in Science, 214: 1205 (1981).
一方、本発明に係るベクターは、上記本発明に係るポリヌクレオチドを含むものである。上記本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、その他の構成は特に限定されるものではない。本発明に係るベクターを構成するベースとなるベクターとしては、宿主細胞において好適なベクターが適宜選択され得る。本発明に係るベクターとしてプラスミドベクターを用いる場合、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、ｐＵＣ１８などが使用できる。この場合、ベクターが導入される宿主微生物としては、例えば、酵母、大腸菌（エシェリヒア・コリーＷ３１１０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α）、昆虫細胞、哺乳類細胞などに利用可能である。 On the other hand, the vector according to the present invention comprises the polynucleotide according to the present invention. Other configurations are not particularly limited as long as they include the polynucleotide according to the present invention. As a vector serving as a base constituting the vector according to the present invention, a suitable vector in the host cell can be appropriately selected. When a plasmid vector is used as the vector according to the present invention, for example, pBluescript (registered trademark), pUC18, or the like can be used. In this case, examples of the host microorganism into which the vector is introduced include yeast, Escherichia coli (Escherichia coli W3110 (Escherichia coli), Escherichia coli C600, Escherichia coli JM109, Escherichia coli DH5α), insect cells, mammalian cells, and the like. Is available.
上記宿主微生物に本発明に係るベクターを導入する方法としては特に限定されるものではないが、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物にベクターを導入する場合は、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡを導入する方法や、エレクトロポレーション法を用いる方法が適用され得る。その他、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いて遺伝子導入が行われても良い。 The method for introducing the vector according to the present invention into the host microorganism is not particularly limited. For example, when the host microorganism introduces a vector into a microorganism belonging to the genus Escherichia, the recombinant DNA is present in the presence of calcium ions. A method of introducing selenium or a method of using an electroporation method can be applied. In addition, gene transfer may be performed using a commercially available competent cell (for example, competent high JM109, competent high DH5α; manufactured by Toyobo).
本発明に係るベクターを構築するには、本発明に係るポリヌクレオチドを分離および精製した後、制限酵素処理などを用いて切断した該ポリヌクレオチドの断片と、ベースとなるベクターを制限酵素で切断して得た直鎖ポリヌクレオチドを結合閉鎖させて構築することができる。結合閉鎖する際にはＤＮＡリガーゼなどがベクターおよび該ポリヌクレオチドの性質に応じて使用され得る。本発明に係るベクターを複製可能な宿主に導入した後、ベクターのマーカーおよび酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、本発明に係るポリヌクレオチドを含有する形質転換体を得ることができる。よって、本発明に係るベクターには薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。 In order to construct the vector according to the present invention, the polynucleotide according to the present invention is isolated and purified, and then the fragment of the polynucleotide cleaved using a restriction enzyme treatment or the like and the base vector are cleaved with a restriction enzyme. The linear polynucleotide obtained in this manner can be constructed by closing the bond. For ligation and closure, DNA ligase or the like can be used depending on the nature of the vector and the polynucleotide. After introducing the vector according to the present invention into a replicable host, screening is performed using the expression of the vector marker and the enzyme activity as an index, and a transformant containing the polynucleotide according to the present invention can be obtained. Therefore, the vector according to the present invention preferably contains a marker gene such as a drug resistance gene.
なお本発明は、上記本発明に係るベクターで形質転換された形質転換体を包含する。本発明に係るベクターによって形質転換される宿主細胞は、特に限定されないが、酵母、大腸菌、昆虫細胞、および哺乳類細胞などが挙げられる。 The present invention includes a transformant transformed with the vector according to the present invention. The host cell transformed with the vector according to the present invention is not particularly limited, and examples thereof include yeast, Escherichia coli, insect cells, and mammalian cells.
〔３．本発明に係るタンパク質の製造方法〕
本発明に係るタンパク質の製造方法は、上記本発明に係る形質転換体を培養する工程（「培養工程」という）を含むことを特徴としている。本発明に係るタンパク質の製造方法には、上記培養工程の他、形質転換体を用いたタンパク質生産において含まれ得るその他の工程が含まれていてもよい。その他の工程としては、例えば、培養工程後に本発明に係る形質転換体が生産したタンパク質を回収する回収工程や、当該タンパク質を精製する精製工程が挙げられる。
[3. Method for producing protein according to the present invention]
The method for producing a protein according to the present invention is characterized by including a step of culturing the transformant according to the present invention (referred to as “culturing step”). The protein production method according to the present invention may include other steps that may be included in protein production using the transformant in addition to the above-described culture step. Examples of other steps include a recovery step for recovering the protein produced by the transformant according to the present invention after the culturing step and a purification step for purifying the protein.
（３−１）培養工程
上記培養工程では、本発明に係る形質転換体が栄養培地で培養されることにより、多量の組換えタンパク質を安定して生産し得る。形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
(3-1) Culture process In the culture process, a large amount of recombinant protein can be stably produced by culturing the transformant according to the present invention in a nutrient medium. For the culture form of the transformant, the culture conditions may be selected in consideration of the nutritional physiological properties of the host. Industrially, aeration and agitation culture is advantageous.
培養工程で用いられる栄養培地の栄養源としては、培養に通常用いられるものが広く使用されてよい。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、およびピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、および大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。これらに加えて、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて培地に添加されてよい。 As a nutrient source of the nutrient medium used in the culturing step, those commonly used for culturing may be widely used. Any carbon compound that can be assimilated may be used as the carbon source. For example, glucose, sucrose, lactose, maltose, lactose, molasses, and pyruvic acid are used. The nitrogen source may be any nitrogen compound that can be used, and examples thereof include peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, and soybean meal alkaline extract. In addition to these, salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, and the like may be added to the medium as necessary.
本発明に係る形質転換体の培養温度は、当該形質転換体が本発明に係るタンパク質を生産可能な範囲内であれば適宜変更し得るが、例えば、エシェリヒア・コリーを宿主として利用する場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は、本発明に係るタンパク質が最高収量に達する適当な時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは本発明に係る形質転換体が好適に発育し、且つ本発明に係るタンパク質を生産可能な範囲内で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。 The culture temperature of the transformant according to the present invention can be appropriately changed as long as the transformant is within a range capable of producing the protein according to the present invention. For example, when Escherichia coli is used as a host, it is preferable. Is about 20 to 42 ° C. The culture time may be completed at an appropriate time when the protein according to the present invention reaches the maximum yield, and is usually about 6 to 48 hours. The pH of the medium can be appropriately changed within the range in which the transformant according to the present invention is suitably grown and the protein according to the present invention can be produced, but is preferably in the range of about pH 6.0 to 9.0. .
（３−２）回収工程
本発明に係る形質転換体がタンパク質を細胞外に分泌する場合、その培養物には本発明に係るタンパク質が含まれている。よって培養物を本発明に係るタンパク質としてそのまま利用することが可能である。この時、例えばろ過や遠心分離などにより、培養液と本発明に係る形質転換体とを分離してもよい。
(3-2) Recovery step When the transformant according to the present invention secretes the protein outside the cell, the culture contains the protein according to the present invention. Therefore, the culture can be used as it is as the protein according to the present invention. At this time, the culture solution and the transformant according to the present invention may be separated by, for example, filtration or centrifugation.
また本発明に係るタンパク質が形質転換体内に存在する場合、形質転換体を培養して得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段を用いて形質転換体を採取し、該形質転換体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊後、目的のタンパク質を回収すればよい。また、必要に応じて、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡなど）および界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００など）を添加して本発明に係るタンパク質を可溶化し、水溶液として分離採取してもよい。 When the protein according to the present invention is present in the transformant, the transformant is collected from the culture obtained by culturing the transformant by means of filtration or centrifugation, and the transformant is collected. The target protein may be recovered after disruption by a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme. Further, if necessary, a chelating agent (for example, EDTA) and a surfactant (for example, Triton X-100) may be added to solubilize the protein according to the present invention, and separated and collected as an aqueous solution. .
（３−３）精製工程
精製工程は、上記回収工程によって得られたタンパク質を精製する工程である。精製工程の具体的な方法は、精製後のタンパク質がフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下した性質を有する限り、特に限定されるものではないが、例えば、本発明に係るタンパク質を含む溶液を、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムなどを用いる）、または親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトンなど）による分別沈殿法に供すればよい。上記操作によって、目的である本発明に係るタンパク質を沈殿させ、精製することができる。
(3-3) Purification step The purification step is a step of purifying the protein obtained by the recovery step. A specific method of the purification step is that the purified protein has fructosyl valyl histidine oxidase activity, and the ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to fructosyl-L-valyl histidine reactivity is wild type protein. For example, the solution containing the protein according to the present invention is concentrated under reduced pressure, concentrated in a membrane, and salted out (for example, using ammonium sulfate or sodium sulfate). Or a fractional precipitation method using a hydrophilic organic solvent (for example, methanol, ethanol, acetone, etc.). By the above operation, the target protein of the present invention can be precipitated and purified.
また、上記精製工程では、加熱処理、等電点処理、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせを用いて精製工程を行ってもよい。 In the purification step, the purification step may be performed using heat treatment, isoelectric point treatment, gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, or a combination thereof. .
上記手法を用いて得られた目的のタンパク質を含む精製酵素は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。 The purified enzyme containing the target protein obtained using the above technique is preferably purified to such an extent that it shows a single band in electrophoresis (SDS-PAGE).
上記の精製酵素は、例えば凍結乾燥、真空乾燥、およびスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。また、精製酵素を使用する際は、その用途によって適宜緩衝液に溶解した状態で使用することができる。緩衝液としては、例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、およびＧＯＯＤ緩衝液などが目的のタンパク質の性質、および／または実験条件もしくは環境に応じて好適に選択されてよい。さらに、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グルタミン、またはリジンなど）、および血清アルブミンなどを精製酵素に添加することにより安定化することができる。 The purified enzyme can be pulverized and distributed by, for example, freeze drying, vacuum drying, spray drying, or the like. Moreover, when using purified enzyme, it can be used in the state melt | dissolved in the buffer suitably according to the use. As the buffer solution, for example, a borate buffer solution, a phosphate buffer solution, a Tris-HCl buffer solution, and a GOOD buffer solution may be suitably selected according to the properties of the target protein and / or the experimental conditions or environment. . Furthermore, it can be stabilized by adding amino acids (for example, glutamic acid, glutamine, or lysine), serum albumin, and the like to the purified enzyme.
〔４．本発明に係るフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンの測定方法〕
本発明に係るタンパク質（以下、「本発明に係るＦＶＨＯＤ」ともいう）は、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンの測定方法に用いることが可能である。また上記フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンの測定方法は、糖化ヘモグロビンなどのアミノ末端のアミノ酸２残基がＦ−ＶａｌＨｉｓである糖化タンパク質の測定に適用され得る。糖化ヘモグロビンの測定に用いるＦＶＨＯＤの基質特異性の点で留意すべきは、血液タンパク質内部のリジン残基のε−アミノ基が糖化されたＦ−Ｌｙｓに対する反応性といえる。タンパク質鎖におけるα−アミノ基はアミノ末端のアミノ酸１残基分であるのに対し、Ｆ−Ｌｙｓとなり得るリジン残基は通常タンパク質鎖内に数多く存在する。
[4. Method for measuring fructosyl-L-valylhistidine according to the present invention]
The protein according to the present invention (hereinafter also referred to as “FVHOD according to the present invention”) can be used in a method for measuring fructosyl-L-valylhistidine. The method for measuring fructosyl-L-valylhistidine can be applied to the measurement of a glycated protein such as glycated hemoglobin in which two amino-terminal amino acid residues are F-ValHis. It should be noted that the substrate specificity of FVHOD used for the measurement of glycated hemoglobin is the reactivity to F-Lys in which the ε-amino group of the lysine residue in the blood protein is glycated. The α-amino group in the protein chain is one amino acid residue at the amino terminal, whereas many lysine residues that can be F-Lys are usually present in the protein chain.
一方、本発明に係るタンパク質は、ＦＶＨＯＤ活性を有し、且つＦ−ＶａｌＨｉｓ反応性に対するＦ−Ｌｙｓ反応性の割合が野生型よりも低い。それゆえ、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンの測定方法に有用である。本発明に係るＦＶＨＯＤを用いたフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンの測定方法は、アミノ末端のアミノ酸２残基がＦ−ＶａｌＨｉｓである糖化タンパク質、中でもヘモグロビンβ鎖に特異的な測定に有用である。 On the other hand, the protein according to the present invention has FVHOD activity, and the ratio of F-Lys reactivity to F-ValHis reactivity is lower than that of the wild type. Therefore, it is useful for a method for measuring fructosyl-L-valylhistidine. The method for measuring fructosyl-L-valylhistidine using FVHOD according to the present invention is useful for measurement specific to a glycated protein, particularly hemoglobin β chain, in which two amino-terminal amino acid residues are F-ValHis.
以下に本発明に係るＦＶＨＯＤを用いたフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンの測定方法（以下「本発明の測定方法」という）を説明する。 Below, the measuring method (henceforth "the measuring method of this invention") of fructosyl-L-valylhistidine using FVHOD which concerns on this invention is demonstrated.
本発明の測定方法は、少なくとも糖化アミンに本発明に係るタンパク質を作用させることを特徴としている。以下に本発明の測定方法の一実施形態を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。 The measuring method of the present invention is characterized in that the protein according to the present invention is allowed to act on at least a glycated amine. One embodiment of the measurement method of the present invention is shown below, but the present invention is not limited to this.
本発明の測定方法の一実施形態は、
（１）試料とプロテアーゼとを反応させて、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程（便宜上「第１工程」という）、
（２）上記（１）の工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンに本発明に係るタンパク質を作用させる工程（便宜上「第２工程」という）、および、
（３）上記（２）の工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程（便宜上「第３工程」という）、を含む糖化タンパク質を測定するための方法である。
One embodiment of the measurement method of the present invention is:
(1) A step of reacting a sample with a protease to decompose a glycated protein in the sample and preparing a glycated amine derived from the glycated protein in the sample (referred to as “first step” for convenience),
(2) a step of causing the protein according to the present invention to act on a glycated amine derived from a glycated protein in the sample obtained by the step (1) (referred to as “second step” for convenience), and
(3) A method for measuring a glycated protein comprising a step of measuring the amount of hydrogen peroxide generated or consumed oxygen in the step (2) (referred to as “third step” for convenience). .
（４−１）第１工程
第１工程は、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程である。
(4-1) First Step The first step is a step of degrading a glycated protein in a sample to prepare a glycated amine derived from the glycated protein in the sample.
上記「糖化タンパク質」とは、タンパク質を構成するアミノ酸残基の一部または全部に糖が結合した（糖化した）タンパク質を意味する。糖化タンパク質としては、特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質のアミノ末端のα−アミノ基が糖化されたもの（例えばＨｂＡ１ｃ）等が挙げられる。なお上記例示したＨｂＡ１ｃは、糖尿病の診断など臨床診断の指標として使用されている。 The “glycated protein” means a protein in which a sugar is bound (glycated) to a part or all of amino acid residues constituting the protein. Although it does not specifically limit as glycated protein, For example, the thing (for example, HbA1c) etc. by which the alpha amino group of the amino terminal of protein was glycated are mentioned. The HbA1c exemplified above is used as an index for clinical diagnosis such as diabetes diagnosis.
上記「プロテアーゼ」としては、試料中に含まれる糖化タンパク質を糖化アミノ酸または糖化ペプチドに分解し得るものであれば特に限定されるものではない。例えば臨床検査において使用されているプロテアーゼが好ましく利用され得る。 The “protease” is not particularly limited as long as it can decompose a glycated protein contained in a sample into a glycated amino acid or a glycated peptide. For example, proteases used in clinical tests can be preferably used.
また上記「試料」は、糖化タンパク質の有無や濃度を検出すべき対象物であれば特に限定されるものではなく、例えば、全血、血漿、血清、血球等の他に、尿、髄液等の生体試料（すなわち生体から採取された試料）や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。本発明に係る方法は、糖尿病の診断に応用することができるため、上記の中でも特に全血試料、血球試料に有用である。特に限定されるものではないが、赤血球内の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、全血をそのまま溶血したり、全血から分離した赤血球を溶血したりして、この溶血試料を測定用の試料とすればよい。 The “sample” is not particularly limited as long as it is a target to detect the presence or concentration of glycated protein. For example, in addition to whole blood, plasma, serum, blood cells, etc., urine, spinal fluid, etc. The present invention can also be applied to biological samples (i.e., samples collected from living organisms), drinking water such as juice, foods such as soy sauce and sauces. Since the method according to the present invention can be applied to the diagnosis of diabetes, it is particularly useful for whole blood samples and blood cell samples. Although not particularly limited, when measuring glycated hemoglobin in erythrocytes, whole blood is lysed as it is, or erythrocytes separated from whole blood are lysed, and this hemolyzed sample is used as a sample for measurement. And it is sufficient.
試料とプロテアーゼとを反応させる際の具体的な条件は、所望の糖化アミンが調製され得る条件であれば特に限定されるものではなく、試料の濃度や種類、プロテアーゼの種類や濃度に応じて適宜好適な条件を検討の上、採用されればよい。 The specific conditions for reacting the sample with the protease are not particularly limited as long as the desired saccharified amine can be prepared, and may be appropriately determined depending on the concentration and type of the sample and the type and concentration of the protease. What is necessary is just to employ | adopt after considering suitable conditions.
本発明の測定方法に好適に使用できる、プロテアーゼの濃度は例えば０．１Ｕ〜１ＭＵ／ｍｌ（より好ましくは１Ｕ〜５００ＫＵ／ｍｌ、最も好ましくは５Ｕ〜１００ＫＵ／ｍｌ）である。上記のプロテアーゼの濃度は、限定されるものではなく、反応条件、試料の種類並びに状態、実験者の手技および使用する試薬の種類などに応じて、実験者または使用者に好適に決定され得る。 The concentration of protease that can be suitably used in the measurement method of the present invention is, for example, 0.1 U to 1 MU / ml (more preferably 1 U to 500 KU / ml, most preferably 5 U to 100 KU / ml). The concentration of the protease is not limited, and can be suitably determined by the experimenter or the user depending on the reaction conditions, the type and state of the sample, the technique of the experimenter, the type of reagent used, and the like.
また本明細書中で「糖化アミン」とは、アミノ基が糖化された化合物で、より具体的には糖化アミノ酸および糖化ペプチドを指す。上記「糖化アミン」としては、例えば、試料中に含まれる糖化タンパク質に由来のフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン、ε−フルクトシル−Ｌ−リジン、フルクトシル−Ｌ−バリン、フルクトシルグリシン等を挙げることができる。 In the present specification, the “glycated amine” is a compound in which an amino group is glycated, and more specifically refers to a glycated amino acid and a glycated peptide. Examples of the “glycated amine” include fructosyl-L-valylhistidine, ε-fructosyl-L-lysine, fructosyl-L-valine, fructosylglycine and the like derived from a glycated protein contained in a sample. .
（４−２）第２工程
第２工程は、上記第１工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンに本発明に係るタンパク質を作用させる工程である。尚、上記「糖化アミンに本発明に係るタンパク質を作用させる」とは、上記第１工程で得られた糖化アミンを含む試料と本発明に係るタンパク質とを反応させ、本発明に係るタンパク質によって当該試料中に含まれるフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンを選択的に酸化的加水分解させることを指す。上記酸化的加水分解は、例えば、緩衝液中２５〜３７℃に管理された条件下で数分〜数十分間反応させることにより行うことができる。
(4-2) Second Step The second step is a step of allowing the protein according to the present invention to act on the glycated amine derived from the glycated protein in the sample obtained in the first step. The above-mentioned “acting the protein according to the present invention on a glycated amine” means that the sample containing the glycated amine obtained in the first step is reacted with the protein according to the present invention, and the protein according to the present invention It refers to selective oxidative hydrolysis of fructosyl-L-valylhistidine contained in a sample. The oxidative hydrolysis can be performed, for example, by reacting for several minutes to several tens of minutes in a buffer solution under a condition controlled at 25 to 37 ° C.
本発明に係るタンパク質が有し得るＦＶＨＯＤ活性は特に限定されるものではないが、ＦＶＨＯＤ活性が高いほど高感度で糖化アミンを検出することができ、ＦＶＨＯＤタンパク質の使用量を少なくすることができるため好ましい。なお本発明の測定方法に好適に使用できるＦＶＨＯＤタンパク質の濃度は、例えば０．１〜５００Ｕ／ｍｌ（好ましくは０．５〜２００Ｕ／ｍｌ、最も好ましくは１．０〜１００Ｕ／ｍｌ）である。ただし上記のＦＶＨＯＤの濃度は、特に限定されるものではなく、反応条件、試料の種類並びに状態、実験者の手技および使用する試薬の種類などに応じて、適宜、決定され得る。 The FVHOD activity that can be possessed by the protein according to the present invention is not particularly limited. However, the higher the FVHOD activity is, the more sensitive glycated amine can be detected, and the amount of FVHOD protein used can be reduced. preferable. In addition, the density | concentration of FVHOD protein which can be used conveniently for the measuring method of this invention is 0.1-500 U / ml (preferably 0.5-200 U / ml, Most preferably, 1.0-100 U / ml). However, the concentration of the FVHOD is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the reaction conditions, the type and state of the sample, the procedure of the experimenter, the type of reagent used, and the like.
（４−３）第３工程
第３工程は、上記第２工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程である。第３工程は過酸化水素の量または酸素の量を測定し得る方法であれば、その具体的方法は特に限定されるものではない。したがって、公知の方法が適宜適用され得る。
(4-3) Third Step The third step is a step of measuring the amount of hydrogen peroxide generated in the second step or the amount of consumed oxygen. As long as the third step is a method capable of measuring the amount of hydrogen peroxide or the amount of oxygen, the specific method is not particularly limited. Therefore, known methods can be applied as appropriate.
第３工程に用いられる方法は、限定されないが、例えば、酵素法などが挙げられる。酵素法においては、試料中の糖化タンパク質をアミノ酸、またはペプチドのレベルまで酵素（例えば、プロテアーゼ）を用いて断片化する。次に、生じた糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに、ＦＶＨＯＤを加え、酸化還元反応により過酸化水素を発生させる。この試料にＰＯＤ、および酸化により発色する還元剤を添加し、上記ＰＯＤを触媒として上記過酸化水素と上記還元剤との間で酸化還元反応を生じさせる。上記酸化還元反応により上記還元剤を発色させ、この発色強度を測定することにより上記過酸化水素量を測定できる。 Although the method used for the 3rd process is not limited, For example, an enzyme method etc. are mentioned. In the enzymatic method, a glycated protein in a sample is fragmented using an enzyme (for example, a protease) to the amino acid or peptide level. Next, FVHOD is added to the resulting glycated amino acid and / or glycated peptide, and hydrogen peroxide is generated by an oxidation-reduction reaction. POD and a reducing agent that develops color by oxidation are added to this sample, and an oxidation-reduction reaction is caused between the hydrogen peroxide and the reducing agent using the POD as a catalyst. The amount of hydrogen peroxide can be measured by coloring the reducing agent by the oxidation-reduction reaction and measuring the color intensity.
第３工程において好適なＰＯＤは、西洋ワサビ、微生物などに由来するものである。また、上記のＰＯＤの好適な使用濃度は、０．０１〜１００単位／ｍＬである。 POD suitable for the third step is derived from horseradish, microorganisms and the like. Moreover, the suitable use density | concentration of said POD is 0.01-100 units / mL.
第３工程において好適な過酸化水素の測定方法としては、ＰＯＤの存在下でのカップラー（４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）並びに３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）など）に対してフェノール系、アニリン系またはトルイジン系の色原体を酸化縮合反応させることにより色素を生成するトリンダー試薬類、およびＰＯＤの存在下で直接酸化呈色するロイコ色素が使用され得る。これらの方法は、当業者に公知であり、一般に容易に使用され得る。 A suitable method for measuring hydrogen peroxide in the third step is to use a coupler (4-aminoantipyrine (4-AA) and 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH)) in the presence of POD. On the other hand, a Trinder reagent that produces a dye by oxidative condensation reaction of a phenolic, aniline, or toluidine chromogen, and a leuco dye that directly oxidizes and colors in the presence of POD can be used. These methods are known to those skilled in the art and can be readily used in general.
上記トリンダー試薬としては、限定されないが、例えば、フェノール及びその誘導体を用いることができる。 Although it does not limit as said Trinder reagent, For example, phenol and its derivative (s) can be used.
第３工程において好適に使用可能な上記カップラーとしては、４−アミノアンチピリン、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）およびスルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）などが挙げられる。 Examples of the coupler that can be suitably used in the third step include 4-aminoantipyrine, aminoantipyrine derivatives, vanillin diamine sulfonic acid, methylbenzthiazolinone hydrazone (MBTH), and sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone (SMBTH). Is mentioned.
第３工程において好適に使用できる上記ロイコ色素としては、特に限定されないが、例えば、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体などが使用できる。 Although it does not specifically limit as said leuco pigment | dye which can be used conveniently in a 3rd process, For example, a triphenylmethane derivative, a phenothiazine derivative, a diphenylamine derivative etc. can be used.
第３工程における上記過酸化水素量の測定において、上記ＰＯＤ等を用いた発色方法以外に、各種センサー系を用いた測定法が当業者に一般的に知られている（限定されないが、例えば、特開２００１−２０４４９４号公報を参照のこと）。具体的には、各種センサー系に用いる電極としては、酸素電極、カーボン電極、金電極、および白金電極などが挙げられる。本発明において、作用電極として酵素を固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば、白金電極など）、および参照電極（例えば、Ａｇ／Ｃｌ電極など）と共に、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持しながら、作用電極に一定の電圧を加え、さらに試料を添加して、酵素反応の結果生じる過酸化水素に起因する電流の増加値を測定することができる。 In the measurement of the amount of hydrogen peroxide in the third step, in addition to the color development method using the POD or the like, measurement methods using various sensor systems are generally known to those skilled in the art (not limited to, for example, (See JP 2001-204494 A). Specifically, examples of electrodes used in various sensor systems include oxygen electrodes, carbon electrodes, gold electrodes, and platinum electrodes. In the present invention, these electrodes on which an enzyme is immobilized are used as a working electrode, and a buffer under conditions suitable for the present invention is provided together with a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / Cl electrode). A constant voltage is applied to the working electrode while it is inserted into the liquid and kept at a constant temperature, and a sample is added to measure the increase in current caused by hydrogen peroxide resulting from the enzyme reaction. .
また、カーボン電極、金電極、および白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する方法として、固定化電子メディエーターを用いる系がある。例えば、作用電極として酵素およびフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、およびフェナジンメトサルフェートなどの電子メディエーターを吸着、または共有結合法により高分子マトリクスに固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば、白金電極など）、および参照電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。続いて、作用電極に一定の電圧を加え、試料を添加して酵素反応の結果生じる過酸化水素に起因する電流の増加値を測定することができる。 Further, as a method for measuring by an amperometric system using a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, or the like, there is a system using an immobilized electron mediator. For example, an enzyme and an electron mediator such as potassium ferricyanide, ferrocene, osmium derivatives, and phenazine methosulfate are adsorbed or immobilized on a polymer matrix by a covalent bond method as a working electrode, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) Etc.) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode) is inserted into a buffer solution under conditions suitable for the present invention and kept at a constant temperature. Subsequently, a constant voltage can be applied to the working electrode, and a sample can be added to measure the increase in current due to hydrogen peroxide resulting from the enzyme reaction.
第３工程で消費された酸素量を測定することで糖化アミン量を測定することもできる（限定されないが、例えば、特開２００１−２０４４９４号公報を参照のこと）。具体的には、酸素電極を用い、電極表面に酸素を固定化して、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。ここに試料を加えて、電流の減少値を測定する。 The amount of saccharified amine can also be measured by measuring the amount of oxygen consumed in the third step (for example, but not limited to, see JP-A-2001-204494). Specifically, an oxygen electrode is used, oxygen is immobilized on the electrode surface, inserted into a buffer solution under conditions suitable for the present invention, and kept at a constant temperature. A sample is added here, and the decrease value of the current is measured.
カーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する場合には、作用電極として酵素を固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば、白金電極など）、および参照電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に、メディエーターを含む電流の増加量を測定する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、およびフェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。 When measuring by an amperometric system using a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, etc., these electrodes to which an enzyme is immobilized are used as a working electrode, a counter electrode (for example, a platinum electrode), and a reference electrode ( For example, an increase amount of current including a mediator is measured together with an Ag / AgCl electrode. As the mediator, potassium ferricyanide, ferrocene, osmium derivatives, phenazine methosulfate, and the like can be used.
本発明に係る測定法において、各工程を実施する系に本発明に係るタンパク質の安定性を増すために不活性タンパク質を添加してもよい。不活性タンパク質は、血清アルブミン類、グロブリン類および繊維性タンパク質類を含む。好ましいタンパク質は、ウシ血清アルブミンであり、ｗｔ／ｖｏｌにおける好ましい濃度は、０．０５〜１％である。好ましい不活性タンパク質は、酵素分解を起こすプロテアーゼ不純物を含まないものである。 In the measurement method according to the present invention, an inactive protein may be added to the system for performing each step in order to increase the stability of the protein according to the present invention. Inactive proteins include serum albumins, globulins and fibrous proteins. A preferred protein is bovine serum albumin, with a preferred concentration in wt / vol being 0.05-1%. Preferred inactive proteins are those that do not contain protease impurities that cause enzymatic degradation.
フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン濃度の測定は、試料の特定体積および試薬の特定体積を用いて行われる。吸光度測定は、試料ブランクを測定するために、混合後、かつフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンによる有意な吸光度変化が起こる前にできるだけ速やかに行われる。０．５〜５秒後の第１の吸光度測定が適当である。第２の吸光度測定は、吸光度が定常的になった後、典型的には１ｍｇ／ｄＬのフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン濃度において３７℃にて３〜５分間である。典型的には、該試薬は既知のフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン濃度を有する水性または血清溶液にて標準化される。 The measurement of fructosyl-L-valylhistidine concentration is performed using a specific volume of the sample and a specific volume of the reagent. Absorbance measurements are performed as soon as possible after mixing and before significant absorbance changes due to fructosyl-L-valylhistidine occur to measure sample blanks. A first absorbance measurement after 0.5-5 seconds is appropriate. The second absorbance measurement is typically 3-5 minutes at 37 ° C. at a fructosyl-L-valylhistidine concentration of 1 mg / dL after the absorbance has become steady. Typically, the reagent is standardized with an aqueous or serum solution having a known fructosyl-L-valylhistidine concentration.
〔５．本発明に係る糖化タンパク質測定キットおよび糖化タンパク質センサー〕
（５−１）糖化タンパク質測定キット
本発明に係る糖化タンパク質測定キット（以下「本発明のキット」という）は、糖化タンパク質を測定するキットである。本発明のキットは、アミノ末端のアミノ酸２残基がＦ−ＶａｌＨｉｓである糖化タンパク質を測定することができる。当該糖化タンパク質としては、例えば、糖化ヘモグロビンを挙げることができる。本発明のキットは、少なくとも上記本発明に係るタンパク質を含むことを特徴としている。本発明のキットに含まれる、本発明に係るタンパク質の形態は特に限定されるものではないが、例えば、水溶液、懸濁液または凍結乾燥粉末などの形態が採用され得る。上記凍結乾燥粉末は常法に従って作製され得る。
[5. Glycated protein measurement kit and glycated protein sensor according to the present invention]
(5-1) Glycated Protein Measurement Kit A glycated protein measurement kit according to the present invention (hereinafter referred to as “kit of the present invention”) is a kit for measuring glycated protein. The kit of the present invention can measure a glycated protein in which two amino acid amino acid residues are F-ValHis. Examples of the glycated protein include glycated hemoglobin. The kit of the present invention includes at least the protein according to the present invention. The form of the protein according to the present invention contained in the kit of the present invention is not particularly limited. For example, forms such as an aqueous solution, a suspension, or a lyophilized powder can be adopted. The lyophilized powder can be prepared according to a conventional method.
上記添加物の配合法は特に制限されるものではない。例えば、本発明に係るタンパク質を含む緩衝液に添加剤を配合する方法、添加剤を含む緩衝液に本発明に係るタンパク質を配合する方法、または本発明に係るタンパク質および安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。 The method of blending the above additives is not particularly limited. For example, a method of blending an additive in a buffer solution containing a protein according to the present invention, a method of blending a protein according to the present invention into a buffer solution containing an additive, or a protein and a stabilizer according to the present invention in a buffer solution The method of mix | blending simultaneously is mentioned.
本発明のキットは、少なくとも上記本発明に係るタンパク質を備えていればよく、さらに、ペルオキシダーゼ、および色原体を備える試薬組成物等を必要に応じて備えていてもよい。 The kit of the present invention only needs to include at least the protein according to the present invention, and may further include a reagent composition including a peroxidase and a chromogen as necessary.
本発明の測定方法においてフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンの酸化に由来する過酸化水素の検出には、ペルオキシダーゼ反応を利用する。よって上記試薬組成物としては、ペルオキシダーゼおよび色原体（過酸化水素発色試薬）が好ましく用いられる。ただし、上記ペルオキシダーゼおよび色原体（過酸化水素発色試薬）はこれに制限されるものではない。 In the measurement method of the present invention, a peroxidase reaction is used to detect hydrogen peroxide derived from the oxidation of fructosyl-L-valylhistidine. Accordingly, peroxidase and chromogen (hydrogen peroxide coloring reagent) are preferably used as the reagent composition. However, the peroxidase and the chromogen (hydrogen peroxide coloring reagent) are not limited thereto.
本発明に用いられる色原体（過酸化水素発色試薬）は、溶液において安定であり、且つビリルビン干渉が低いものであることが好ましい。本発明に好適に用いることができる色原体（過酸化水素発色試薬）としては、例えば４−アミノアンチピリンもしくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、およびフェノールもしくはその誘導体またはアニリンもしくはその誘導体を組み合わせからなる試薬が挙げられる。また、本発明において用いられる色原体（過酸化水素発色試薬）は、ベンジジン類、ロイコ色素類、４−アミノアンチピリン、フェノール類、ナフトール類およびアニリン誘導体類であってもよい。 The chromogen (hydrogen peroxide coloring reagent) used in the present invention is preferably stable in solution and low in bilirubin interference. Examples of the chromogen (hydrogen peroxide coloring reagent) that can be suitably used in the present invention include 4-aminoantipyrine or 3-methyl-2-benzothiazoline hydrazone (MBTH), and phenol or a derivative thereof or aniline or a derivative thereof. Examples thereof include a reagent comprising a combination of derivatives. The chromogen (hydrogen peroxide coloring reagent) used in the present invention may be benzidines, leuco dyes, 4-aminoantipyrine, phenols, naphthols and aniline derivatives.
また本発明において好適に用いられるペルオキシダーゼは、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましい。上記ペルオキシダーゼは、高純度かつ低価格のものが商業的に入手可能である。酵素濃度は、迅速かつ完全な反応のために充分高くなければならず、好ましくは、１，０００〜５０，０００Ｕ／Ｌである。 The peroxidase preferably used in the present invention is preferably a horseradish peroxidase. The peroxidase is commercially available with high purity and low price. The enzyme concentration must be high enough for a rapid and complete reaction, preferably 1,000 to 50,000 U / L.
また上記試薬組成物には、上記構成の他、緩衝剤（例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、およびＧＯＯＤ緩衝液など）が含まれていてもよい。さらに上記試薬組成物には、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬（例えば、ＥＤＴＡおよびＯ−ジアニシジンなど）、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、各種界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００およびＮＰ−４０など）、ならびに各種抗菌剤および防腐剤（例えば、ストレプトマイシンおよびアジ化ナトリウムなど）などが含まれていてもよい。これらの試薬は、単一試薬でも２種類以上の試薬を組み合わせてなるものであってもよい。 In addition to the above configuration, the reagent composition may contain a buffer (for example, a borate buffer solution, a phosphate buffer solution, a Tris-HCl buffer solution, and a GOOD buffer solution). Furthermore, the reagent composition includes chelating reagents (such as EDTA and O-dianisidine) that capture ions that interfere with the enzyme reaction, ascorbate oxidase that eliminates ascorbic acid, which is a substance that interferes with the determination of hydrogen peroxide, Surfactants (such as Triton X-100 and NP-40) and various antibacterial and preservatives (such as streptomycin and sodium azide) may be included. These reagents may be a single reagent or a combination of two or more reagents.
上記緩衝剤としては特に限定されないが、６〜８．５のｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有する任意の緩衝剤を使用することができる。このｐＨ範囲の緩衝剤としては、リン酸塩、トリス、ビス−トリスプロパン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−モルフォリノエタンスルホン酸１水和物（ＭＥＳ）、ピペラジン―１，４―ビス（２−エタンスルホン酸）（piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)）（ＰＩＰＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid）（ＨＥＰＥＳ）、および３−〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）などが挙げられる。特に、好ましい緩衝剤はＭＥＳおよびＰＩＰＥＳである。また特に、好ましい濃度範囲は、２０〜２００ｍＭであり、ｐＨ６〜７である。 Although it does not specifically limit as said buffering agent, Arbitrary buffering agents which have sufficient buffering ability in the pH range of 6-8.5 can be used. Buffers in this pH range include phosphate, tris, bis-trispropane, N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid (TES), 2-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate (MES), piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1 -Piperazinyl] ethanesulfonic acid (2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid) (HEPES), and 3- [N-tris (hydroxymethyl) methylamino] -2-hydroxypropanesulfonic acid (TAPSO). Particularly preferred buffering agents are MES and PIPES. Moreover, especially a preferable concentration range is 20-200 mM, and is pH 6-7.
本発明のキットには、例えば、ＦＶＨＯＤ、緩衝液、プロテアーゼ、ＰＯＤ、発色試薬、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、界面活性剤、安定化剤、賦形剤、抗菌剤、防腐剤、ウェルプレート、蛍光スキャナー、自動分析機、および本発明の測定方法を紙媒体に記載した取り扱い説明書などが含まれていてもよい。 The kit of the present invention includes, for example, FVHOD, buffer solution, protease, POD, coloring reagent, chelating reagent that captures ions that interfere with the enzyme reaction, ascorbic acid that eliminates ascorbic acid, which is a substance that interferes with the determination of hydrogen peroxide. Includes oxidases, surfactants, stabilizers, excipients, antibacterial agents, preservatives, well plates, fluorescence scanners, automatic analyzers, and instruction manuals describing the measurement method of the present invention on paper media May be.
（５−２）糖化タンパク質センサー
本発明に係る糖化タンパク質センサー（以下「本発明のセンサー」）は、糖化タンパク質を検出するために用いられるセンサーである。本発明のセンサーは、アミノ末端のアミノ酸２残基がＦ−ＶａｌＨｉｓである糖化タンパク質を検出することができる。当該糖化タンパク質としては、例えば、糖化ヘモグロビンを挙げることができる。本発明のセンサーは、少なくとも本発明に係るタンパク質を備えている。本発明のセンサーは、本発明の測定方法の実施に用いられる。よって、本発明のセンサーは、本発明の測定方法の実施に用いられる物品により構成されていてもよい。上記物品の説明については、本発明の測定方法および本発明のキットの項における緩衝剤等の説明を援用することができる。
(5-2) Glycated protein sensor The glycated protein sensor (henceforth "the sensor of this invention") based on this invention is a sensor used in order to detect glycated protein. The sensor of the present invention can detect a glycated protein in which two amino acid amino acid residues are F-ValHis. Examples of the glycated protein include glycated hemoglobin. The sensor of the present invention includes at least the protein according to the present invention. The sensor of the present invention is used for carrying out the measuring method of the present invention. Therefore, the sensor of this invention may be comprised by the article | item used for implementation of the measuring method of this invention. For the description of the article, the description of the buffering agent and the like in the section of the measurement method of the present invention and the kit of the present invention can be used.
本発明のセンサーの一実施形態は、本発明に係るタンパク質を支持体に固定して用いることができる。支持体としては、本発明に係るタンパク質を固定化できるものであれば、特に限定されるものではなく、形状や材質は該タンパク質の性質に応じて好適なものを使用してよい。支持体の形状は、本発明に係るタンパク質が固定化できる十分な面積を有するものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、基板、ビーズおよび膜などが挙げられる。支持体の材料としては、例えば、無機系材料、天然高分子、および合成高分子などが挙げられる。 One embodiment of the sensor of the present invention can be used with the protein according to the present invention immobilized on a support. The support is not particularly limited as long as it can immobilize the protein according to the present invention, and a suitable shape and material may be used according to the properties of the protein. The shape of the support is not particularly limited as long as it has a sufficient area to which the protein according to the present invention can be immobilized, and examples thereof include substrates, beads, and membranes. Examples of the support material include inorganic materials, natural polymers, and synthetic polymers.
なお、本発明は上記の各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種種の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 It should be noted that the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made within the scope shown in the claims, and obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments. Embodiments are also included in the technical scope of the present invention.
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。表１に実施例において使用した。活性測定用試薬の組成を示した。なお、実施例において使用した試薬は特記しない限り、ナカライテスク社より購入したものを用いた。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. Table 1 used in the examples. The composition of the reagent for activity measurement is shown. The reagents used in the examples were those purchased from Nacalai Tesque unless otherwise specified.
実施例におけるＦＶＨＯＤの活性測定条件を以下に示した。 Conditions for measuring the activity of FVHOD in the examples are shown below.
（活性測定法）
各基質に対する酵素活性は、酵素反応により生成する過酸化水素を追随するペルオキシダーゼ反応により生じた色素の吸光度の増加で測定した。活性測定試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温後、予め、酵素希釈液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５））で希釈した酵素溶液０．１ｍｌを加え、反応を開始する。３７℃で５分間反応させ、５００ｎｍの吸光度変化を測定する（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液０．１ｍｌを加え、上記同様に操作を行って吸光度変化を測定した（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ）。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づき酵素活性を算出した。尚、上記条件で１分間に１マイクロモルの基質を酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
(Activity measurement method)
The enzyme activity for each substrate was measured by the increase in the absorbance of the dye produced by the peroxidase reaction following the hydrogen peroxide produced by the enzyme reaction. After preheating the 3 ml of activity measuring reagent at 37 ° C. for 5 minutes, 0.1 ml of an enzyme solution previously diluted with an enzyme diluent (50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5)) is added to start the reaction. The reaction is carried out at 37 ° C. for 5 minutes, and the change in absorbance at 500 nm is measured (ΔOD test / min). In the blind test, 0.1 ml of enzyme diluent was added instead of the enzyme solution, and the change in absorbance was measured by performing the same operation as above (ΔOD blank / min). The enzyme activity was calculated from the obtained absorbance change based on the following formula. The amount of enzyme that oxidizes 1 micromole of substrate per minute under the above conditions is defined as 1 unit (U).
（計算式）
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．１（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛１３×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）｝
３．１（ｍｌ）：全液量
１３：ミリモル吸光係数
１．０ｃｍ：セルの光路長
０．１（ｍｌ）：酵素サンプル液量
〔参考例１：ＦＶＨＯＤ遺伝子のクローニング〕
クリプトコッカス・ネオフォーマンス（Cryptococcus neoformans）由来の野生型ＦＶＨＯＤのｃＤＮＡクローニングを行うために、クリプトコッカス・ネオフォーマンスのゲノムデータベース（http://www.tigr.org/tdb/e2k1/cna1/）〔２００８年１２月１１日検索〕を検索した。
(a formula)
Activity value (U / ml) = {ΔOD / min (ΔOD test −ΔOD blank ) × 3.1 (ml) × dilution factor} / {13 × 1.0 (cm) × 0.1 (ml)}
3.1 (ml): total liquid volume 13: millimolar extinction coefficient 1.0 cm: cell optical path length 0.1 (ml): enzyme sample liquid volume [Reference Example 1: Cloning of FVHOD gene]
In order to perform cDNA cloning of wild-type FVHOD derived from Cryptococcus neoformans, the genome database of Cryptococcus neoformance (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/cna1/) [2008] Searched December 11, 2010].
ゲノムデータベースから、ＦＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅをコードすることが予測される遺伝子を抽出した。検索結果から得られた種々の遺伝子のうち、Ｆ−ＶａｌＨｉｓに実質的に作用するＦＶＨＯＤ遺伝子として、Cryptococcusneoformans|chr_2|chr2|186.m03431|CNB00220（http://blast.jcvi.org/er-blast/getSeq.cgi?id=186.m03431&db=/opt/www/blast/db/euk/private/c_neoformans/annotation_dbs/CNA1.cds）〔２００８年１２月１１日検索〕をクローニング候補とした。 A gene predicted to encode FAD-dependent oxidase was extracted from the genome database. Among the various genes obtained from the search results, Cryptococcuscusneoformans | chr_2 | chr2 | 186.m03431 | CNB00220 (http://blast.jcvi.org/er-blast) /getSeq.cgi?id=186.m03431&db=/opt/www/blast/db/euk/private/c_neoformans/annotation_dbs/CNA1.cds) [searched on December 11, 2008] as a candidate for cloning.
次に、上記ＦＶＨＯＤ遺伝子のｃＤＮＡについて、ＥＳＴ解析から明らかとなったＤＤＢＪ番号XM_771926(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=134108731)〔２００８年１２月１１日検索〕において、部分配列が明らかであることから、既知のゲノム配列との比較により、タンパク質をコードする部分に対応するｃＤＮＡ全配列が明らかとなった。この情報をもとに、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成を用いて、ｃＤＮＡ全配列を合成した。 Next, regarding the cDNA of the FVHOD gene, DDBJ number XM — 771926 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=134108731) [2008] Since the partial sequence was clear in the search on December 11, the entire cDNA sequence corresponding to the protein coding portion was revealed by comparison with a known genomic sequence. Based on this information, the entire cDNA sequence was synthesized using the conventional method of total synthesis of gene fragments by PCR.
上記のｃＤＮＡを、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて末端の平滑化を行い、ｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位へサブクローニングした。ｃＤＮＡ部分についてシーケンス解析を行った結果、配列番号２に示した塩基配列が得られた。配列番号２に示した塩基配列におけるｃＤＮＡのコーディング領域は１番目の塩基から１４３１番目の塩基であり、開始コドンは１番目の塩基から３番目の塩基、終止コドンＴＡＧは１４３２番目の塩基から１４３４番目の塩基に相当する。配列番号２に示した塩基配列から明らかとなったアミノ酸配列は、配列番号１に示した。 The above cDNA was blunted using Blunting high (Toyobo Co., Ltd.) and subcloned into the SmaI site of pUC118. As a result of sequence analysis of the cDNA portion, the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 was obtained. The coding region of cDNA in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is from the first base to the 1431st base, the start codon is from the first base to the third base, and the stop codon TAG is from the 1432nd base to the 1434th base. It corresponds to the base of The amino acid sequence clarified from the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is shown in SEQ ID NO: 1.
〔参考例２：ＦＶＨＯＤ遺伝子の大腸菌での大量発現と精製、酵素アッセイ〕
上記ＦＶＨＯＤ遺伝子の大腸菌での大量発現を試みた。ＦＶＨＯＤ遺伝子の終止コドンを除いた全長ｃＤＮＡ領域（配列番号２の１番目〜１４３１番目の塩基）をＰＣＲで増幅した。その際、Ｎ末端側に配列番号５に示すプライマー（5’-GGAATTCCATATGCCACCTTCGCGCGCCAGTACTAAGGTCATA-3’）（上記塩基配列における「CATATG」はＮｄｅＩ部位）を用いてＮｄｅＩ部位、Ｃ末端側に配列番号６に示すプライマー（5'-CCGCTCGAGTTATTAAGCTAGAACTTTGACTCCGACTCGTGCTCC-3’）（上記塩基配列における「CTCGAG」はＸｈｏＩ部位）を用いてＸｈｏＩ部位を挿入した。本ＰＣＲ断片をｐＥＴ−２３ｂベクター（ノバジェン社）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位へＴ７プロモーターと正方向になるようにサブクローニングした。作製したプラスミドは、組換えＦＶＨＯＤ発現用プラスミドとして、ｐＩＥ３１３ＮＡと命名した。
[Reference Example 2: Mass expression and purification of FVHOD gene in E. coli, enzyme assay]
An attempt was made to express a large amount of the FVHOD gene in E. coli. A full-length cDNA region excluding the stop codon of the FVHOD gene (bases 1 to 1431 of SEQ ID NO: 2) was amplified by PCR. At that time, using the primer shown in SEQ ID NO: 5 on the N-terminal side (5'-GGAATTCCATATGCCACCTTCGCGCGCCAGTACTAAGGTCATA-3 ') ("CATATG" in the above base sequence is the NdeI site), the primer shown in SEQ ID NO: 6 on the C-terminal side The XhoI site was inserted using (5′-CCGCTCGAGTTATTAAGCTAGAACTTTGACTCCGACTCGTGCTCC-3 ′) (“CTCGAG” in the above base sequence is the XhoI site). This PCR fragment was subcloned into the NdeI-XhoI site of the pET-23b vector (Novagen) so as to be in the forward direction with the T7 promoter. The prepared plasmid was named pIE313NA as a recombinant FVHOD expression plasmid.
上記のプラスミドｐＩＥ３１３ＮＡを用いて、大腸菌ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ストラタジーン社）を形質転換した。その後、アンピシリン耐性を示す形質転換体ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ｐＩＥ３１３ＮＡ）を選択した。 Escherichia coli BL21 CodonPlus (DE3) -RIL (Stratagene) was transformed with the plasmid pIE313NA. Thereafter, a transformant BL21 CodonPlus (DE3) -RIL (pIE313NA) showing ampicillin resistance was selected.
培地として、２００ｍｌのＴＢ培地を２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行った。上記培地を放冷後、別途無菌濾過したアンピシリンを終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように培地に添加した。この培地に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ｐＩＥ３１３ＮＡ）の培養液を２ｍｌ接種した。続いて、３０℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波破砕した。次に、遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液のＦＶＨＯＤ活性を、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン含有測定試薬にて測定したところ、約０．２Ｕ／ｍｌの活性が得られた。 As a medium, 200 ml of TB medium was dispensed into a 2 L Sakaguchi flask, and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. After allowing the medium to cool, ampicillin, which was separately sterilized and filtered, was added to the medium to a final concentration of 100 μg / ml. This medium was inoculated with 2 ml of a culture solution of BL21 CodonPlus (DE3) -RIL (pIE313NA) previously cultured in an LB medium containing 100 μg / ml ampicillin at 30 ° C. for 16 hours. Subsequently, aeration and agitation culture was performed at 30 ° C. for 24 hours. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, suspended in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and then sonicated. Next, centrifugation was performed to obtain a supernatant as a crude enzyme solution. When the FVHOD activity of the obtained crude enzyme solution was measured with a fructosyl-L-valylhistidine-containing measuring reagent, an activity of about 0.2 U / ml was obtained.
上記の粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析を行った。透析後のサンプルを、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）カラムクロマトグラフィー、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）カラムクロマトグラフィーにより分離および精製を行った。次に、フェニルセファロース−ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）カラムクロマトグラフィーにより分離および精製した。最後に、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析を行うことにより、精製酵素標品（ＩＥ３１３ＮＡ）を得た。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、上記精製酵素標品が単一であることを確認した。 The crude enzyme solution was subjected to denucleic acid removal with polyethyleneimine and ammonium sulfate fractionation, and dialyzed against 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The sample after dialysis was separated and purified by DEAE Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience) column chromatography and DEAE Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience) column chromatography. Next, it was separated and purified by phenyl sepharose-FF (manufactured by GE Healthcare Bioscience) column chromatography. Finally, a purified enzyme preparation (IE313NA) was obtained by dialysis against 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). It was confirmed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis that the purified enzyme preparation was single.
上記の精製酵素標品の酵素活性を、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン、フルクトシル−Ｌ−バリン、およびε−フルクトシル−Ｌ−リジンをそれぞれ単独に含有する測定試薬にて測定し、本酵素標品が各基質にオキシダーゼ活性を有することを確認した。 The enzyme activity of the purified enzyme preparation was measured with a measuring reagent containing each of fructosyl-L-valylhistidine, fructosyl-L-valine, and ε-fructosyl-L-lysine. Each substrate was confirmed to have oxidase activity.
すなわち、ＦＶＨＯＤ遺伝子およびＦＶＨＯＤを取得し、精製酵素標品の基質特異性を確認した。 That is, FVHOD gene and FVHOD were obtained, and the substrate specificity of the purified enzyme preparation was confirmed.
〔実施例１：ＦＶＨＯＤ遺伝子の機能改変によるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質の造成と精製、酵素アッセイ〕
発現プラスミドｐＩＥ３１３ＮＡ、および合成オリゴヌクレオチド（配列番号７および配列番号８）を用いて、KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit（東洋紡績製）を使用して、規定のプロトコールに従って変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号１に示したアミノ酸配列の５６番目のアスパラギンがセリンに置換されたＦＶＨＯＤ変異体（配列番号３）をコードする組換えプラスミド（ｐＩＥ３１３ＮＡ−Ｎ５６Ｓ）を取得した。同様の手法で、配列番号１に示したアミノ酸配列の５６番目のアスパラギンがアラニンに置換されたＦＶＨＯＤ変異体をコードする組換えプラスミド（ｐＩＥ３１３ＮＡ−Ｎ５６Ａ）を取得した。
[Example 1: Production and purification of protein having fructosyl valyl histidine oxidase activity by functional modification of FVHOD gene, enzyme assay]
Using the expression plasmid pIE313NA and synthetic oligonucleotides (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8), using KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), performing a mutation treatment operation according to a prescribed protocol, The sequence was determined, and a recombinant plasmid (pIE313NA-N56S) encoding an FVHOD mutant (SEQ ID NO: 3) in which the 56th asparagine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was substituted with serine was obtained. In the same manner, a recombinant plasmid (pIE313NA-N56A) encoding an FVHOD mutant in which the 56th asparagine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was substituted with alanine was obtained.
取得した各プラスミドでＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換後、アンピシリン耐性を示す形質転換体をそれぞれ選択した。 After transforming BL21 CodonPlus (DE3) -RIL with each of the obtained plasmids, transformants showing ampicillin resistance were selected.
参考例２と同様に、各形質転換体を培養し、得られた粗酵素液の精製を行うことにより、それぞれの精製酵素標品（ＩＥ３１３ＮＡ−Ｎ５６Ｓ、ＩＥ３１３ＮＡ−Ｎ５６Ａ）を得た。本方法により得られた各標品は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、単一であることが確認された。 In the same manner as in Reference Example 2, each transformant was cultured, and the resulting crude enzyme solution was purified to obtain respective purified enzyme preparations (IE313NA-N56S, IE313NA-N56A). Each sample obtained by this method was confirmed to be single by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
〔実施例２：各ＦＶＨＯＤタンパク質の特性評価〕
野生型ＦＶＨＯＤ（ＩＥ３１３ＮＡ）、およびＦＶＨＯＤ変異体（ＩＥ３１３ＮＡ−Ｎ５６Ｓ、ＩＥ３１３ＮＡ−Ｎ５６Ａ）の精製酵素標品の酵素活性を、Ｆ−ＶａｌＨｉｓおよびＦ−Ｌｙｓをそれぞれ単独に含有する測定試薬を用いて測定した結果を表２に示す。
[Example 2: Characterization of each FVHOD protein]
The enzyme activities of the purified enzyme preparations of wild-type FVHOD (IE313NA) and FVHOD mutants (IE313NA-N56S, IE313NA-N56A) were measured using measurement reagents containing F-ValHis and F-Lys, respectively. The results are shown in Table 2.
なお、本実施例においてＦＶＨＯＤ変異体を例えば「ＩＥ３１３ＮＡ−Ｎ５６Ｓ」と表記するが、「ＩＥ３１３ＮＡ」は野生型タンパク質、「Ｎ」は置換前のアミノ酸の一文字表記、「５６」は野生型タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）におけるアミノ末端から数えたアミノ酸の置換位置、「Ｓ」は置換後のアミノ酸の一文字表記を示す。その他のＦＶＨＯＤ変異体の表記についても上記と同様にしてアミノ酸の置換位置および置換前後のアミノ酸残基を読み取ることができる。また、表２において、活性比率はε−フルクトシル−Ｌ−リジンに対する酵素活性をフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンに対する酵素活性で除した値を言う。 In this example, the FVHOD mutant is expressed as, for example, “IE313NA-N56S”, where “IE313NA” is a wild-type protein, “N” is a single-letter amino acid before substitution, and “56” is an amino acid of the wild-type protein. The substitution position of the amino acid counted from the amino terminus in the sequence (SEQ ID NO: 1), “S”, indicates a single letter of the amino acid after substitution. As for other FVHOD mutants, the amino acid substitution position and the amino acid residues before and after substitution can be read in the same manner as described above. In Table 2, the activity ratio refers to a value obtained by dividing the enzyme activity for ε-fructosyl-L-lysine by the enzyme activity for fructosyl-L-valylhistidine.
表２の結果から明らかなように、ＦＶＨＯＤ変異体は、いずれの変異体であってもフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型ＦＶＨＯＤに対して低下していることが確認された。 As is clear from the results in Table 2, the FVHOD mutant has a ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to fructosyl-L-valylhistidine reactivity relative to wild-type FVHOD for any mutant. It was confirmed that it was decreasing.
本発明によって、フルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンの測定に有用な基質特異性を有するフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼを新たに創出し、これを提供することが可能となる。また、該フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼを利用したフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジンの測定方法、糖化タンパク質測定用キット、糖化タンパク質センサー等を提供することが可能となる。したがって、予防医学に基づく臨床検査の更なる普及に貢献することができる。 According to the present invention, it is possible to newly create and provide a fructosylvalylhistidine oxidase having substrate specificity useful for measurement of fructosyl-L-valylhistidine. In addition, it is possible to provide a method for measuring fructosyl-L-valylhistidine using the fructosyl valyl histidine oxidase, a kit for measuring glycated protein, a glycated protein sensor, and the like. Therefore, it can contribute to the further spread of clinical tests based on preventive medicine.
Claims (10)
（Ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５６番目のアスパラギンがセリンまたはアラニンで置換され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質；
（ＩＩ）上記（Ｉ）のタンパク質において、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５６番目のアミノ酸残基以外の１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、および／または付加され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有し、且つフルクトシル−Ｌ−バリルヒスチジン反応性に対するε−フルクトシル−Ｌ−リジン反応性の割合が野生型タンパク質よりも低下したタンパク質。 A protein characterized by the following (I) or (II):
(I) The 56th asparagine from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with serine or alanine, has fructosylvalylhistidine oxidase activity, and ε for fructosyl-L-valylhistidine reactivity A protein with a reduced fraction of fructosyl-L-lysine reactivity than the wild type protein;
(II) In the protein of (I), one or several amino acid residues other than the 56th amino acid residue from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted, and / or added. And a protein having fructosyl valyl histidine oxidase activity and having a reduced ratio of ε-fructosyl-L-lysine reactivity to fructosyl-L-valyl histidine reactivity compared to wild-type protein.
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