JP2022019308A - Fadgdh and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、「ＦＡＤＧＤＨ」とも称する）に関する。より詳しくは、本発明は、メディエーターに対する反応性が改善されたムコール（Ｍｕｃｏｒ）属由来の変異型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、該ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有する発現ベクター、該発現ベクターで形質転換した形質転換体、該変異型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、該変異型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを使用したグルコースの測定方法、および、グルコースセンサに関する。 The present invention relates to flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (hereinafter, also referred to as "FADGDH"). More specifically, the present invention relates to a mutant flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase derived from the genus Mucor with improved reactivity to a mediator, a DNA encoding the FADGDH, an expression vector having the DNA, and the expression thereof. The present invention relates to a transformant transformed with a vector, a method for producing the variant flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase, a method for measuring glucose using the variant flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase, and a glucose sensor.
自己血糖測定（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ－Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ）は糖尿病患者が自己の血糖値を管理し、治療に活用するために重要である。ＳＭＢＧに関しては、多くの方法で実用化が進んでおり、検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点で電気化学的なセンシングが有利である。血糖測定技術におけるセンシングの手法としては血液中のグルコースを基質とする酵素が利用される。そのような酵素の例としては、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）が挙げられる。近年、グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨとも表す。）の中でもアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースに対する選択性の高さや熱に対する安定性が高いという利点から、グルコースセンサ用酵素として実用化されている。特許文献１および特許文献２には、アスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤＧＤＨの酵素特性が報告されている。
Self-monitoring of blood glucose (SMBG) is important for diabetics to manage their own blood glucose level and utilize it for treatment. With regard to SMBG, practical application is progressing in many methods, and electrochemical sensing is advantageous in terms of reducing the amount of sample, shortening the measurement time, and downsizing the apparatus. As a sensing method in blood glucose measurement technology, an enzyme using glucose in blood as a substrate is used. Examples of such enzymes include glucose dehydrogenase (EC 1.1.1.47). In recent years, among glucose dehydrogenases (hereinafter, also referred to as GDH), flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae has the advantages of high selectivity for glucose and high stability to heat. It has been put to practical use as an enzyme for glucose sensors.
ＦＡＤＧＤＨを利用したグルコースセンサは、グルコースを酸化してＤ－グルコノ－δ－ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に流れることで測定される。ＦＡＤＧＤＨと組み合わせて使用されるメディエーターとしては、フェリシアン化カリウムが一般的である。しかしながら、フェリシアン化カリウムは血液中の還元物質の影響を受けやすく、加えて環境の水分の影響で容易に還元型に変化しやすいという問題がある。 The glucose sensor using FADGDH is measured by the electrons generated in the process of oxidizing glucose and converting it into D-glucono-δ-lactone flowing through the mediator to the electrode. Potassium ferricyanide is commonly used as a mediator in combination with FADGDH. However, potassium ferricyanide has a problem that it is easily affected by a reducing substance in blood, and in addition, it is easily changed to a reduced form due to the influence of environmental moisture.
より安定なメディエーターとしては、例えばルテニウム錯体が挙げられる。ルテニウム錯体は保存安定性が優れている反面、アスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤＧＤＨはルテニウム錯体に電子を伝達することができないことが問題であった。この問題を克服するために、特許文献３にはアスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤＧＤＨとルテニウム錯体にフェナジンメトサルフェート（以下、ＰＭＳとも表す。）を加えたグルコースセンサが報告されている。このセンサではグルコースとＦＡＤＧＤＨの酸化反応で得られた電子を、ＰＭＳを介してルテニウム錯体に伝達することができるので、電流応答値を測定することでグルコース濃度を定量することができる。しかしながら、ＰＭＳは環境中の光の影響や水分によって還元しやすい性質があるので、依然として保存安定性に課題がある。
More stable mediators include, for example, ruthenium complexes. While the ruthenium complex has excellent storage stability, the Aspergillus oryzae-derived FADGDH has a problem that it cannot transfer electrons to the ruthenium complex. In order to overcome this problem,
一方、酵素の改良も報告されている。非特許文献１には大腸菌発現系で作製したアスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）由来ＦＡＤＧＤＨの特定のアミノ酸に変異を導入することで、ルテニウム錯体に直接電子を伝達することができるグルコースデヒドロゲナーゼ変異体が報告されている。この方法では、４０３位のヒスチジンをアスパラギン酸に置換したグルコースデヒドロゲナーゼ変異体とルテニウム錯体を用いたグルコースセンサが報告されている。
On the other hand, improvement of the enzyme has also been reported. Non-Patent
特許文献４、アスペルギルス属由来ＦＡＤＧＤＨよりも基質特異性の優れたムコール属由来ＦＡＤＧＤＨが報告されているが、当該ＦＡＤＧＤＨもルテニウム錯体に対する反応性は低く、実用化には至っていない。 Patent Document 4, FADGDH derived from the genus Mucor, which has better substrate specificity than FADGDH derived from the genus Aspergillus, has been reported, but the FADGDH also has low reactivity with the ruthenium complex and has not been put into practical use.
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創作されたものである。その目的の１つは、メディエーターに対する反応性が改良されたＦＡＤＧＤＨを提供することにある。 The present invention has been created in view of the current state of the prior art. One of the purposes is to provide FADGDH with improved reactivity to mediators.
上記課題を解決するために、本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ＦＡＤＧＤＨの特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換することでルテニウム錯体に対する反応性が大幅に改善することを見出した。本発明は係る知見に基づき、更なる研究と改良を重ねた結果完成したものであり、代表的な本発明は、以下の通りである。 In order to solve the above problems, the present inventors have found that the reactivity to the ruthenium complex is significantly improved by substituting a specific amino acid residue of FADGDH with another amino acid as a result of repeated studies. rice field. The present invention has been completed as a result of further research and improvement based on the above findings, and the representative invention is as follows.
項１．
配列番号１と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１の３２２位に相当するアミノ酸残基がトレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンである、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
項２．
配列番号１と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、項１に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
項３．
配列番号１と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、項１または２に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
項４．
配列番号１と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、項１～３のいずれかに記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
項５．
配列番号１の３２２位に相当する位置以外の位置において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されている、項１～４のいずれかに記載のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
項６．
項１～５のいずれかに記載の変異型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ。
項７．
項６に記載のＤＮＡを含むベクター。
項８．
項７に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
項９．
形質転換体がクリプトコッカス属の微生物である、項８に記載の形質転換体。
項１０．
項８または９に記載の形質転換体を培養し、培養液中からグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程を含む、変異型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
項１１．
項１～５のいずれかに記載の変異型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを使用するグルコース測定方法。
項１２．
項１～５のいずれかに記載の変異型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサ。
項１３．
メディエーターとして、ルテニウム化合物を含む、項１２に記載のグルコースセンサ。
項１４．
ルテニウム化合物が、塩化ヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）、（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）、（４，４’－ジメチル－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）、（４，４’－ジフェニル－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）、（４，４’ －ジアミノ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）ルテニウム（ＩＩ）、（４，４’－ジヒドロキシ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）ルテニウム（ＩＩ）、（４，４’－ジカルボキシ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）ルテニウム（ＩＩ）、（４，４’－ジブロモ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）ルテニウム（ＩＩ）、（５，５’－ジメチル－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）ルテニウム（ＩＩ）、（５，５’－ジフェニル－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）ルテニウム（ＩＩ）、（５，５’－ジアミノ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）ルテニウム（ＩＩ）、（５，５’－ジヒドロキシ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）ルテニウム（ＩＩ）、（５，５’－ジカルボキシ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）ルテニウム（ＩＩ）、および、（５，５’－ジブロモ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）からなる群から選択された少なくとも一種である、項１２又は１３に記載のグルコースセンサ。
A flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase having an amino acid sequence having 70% or more identity with SEQ ID NO: 1 and the amino acid residue corresponding to position 322 of SEQ ID NO: 1 is threonine, serine, asparagine or glutamine.
Item 4.
Item 6. The flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase according to any one of
Item 5.
Item 6. Flavin adenine dinucleotide dependence according to any one of
Item 6.
The DNA encoding the mutant flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase according to any one of
Item 7.
Item 6. A vector containing the DNA according to Item 6.
Item 8.
A transformant transformed with the vector according to Item 7.
Item 9.
Item 8. The transformant according to Item 8, wherein the transformant is a microorganism of the genus Cryptococcus.
Item 10.
Item 8. A method for producing a mutant flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase, which comprises a step of culturing the transformant according to Item 8 or 9 and collecting a protein having glucose dehydrogenase activity from the culture medium.
Item 11.
Item 6. The method for measuring glucose using the mutant flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase according to any one of
Item 12.
A glucose sensor comprising the mutant flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase according to any one of
Item 13.
Item 12. The glucose sensor according to Item 12, which comprises a ruthenium compound as a mediator.
Item 14.
The ruthenium compounds are hexaamine ruthenium chloride (III), (bipyridine) rutenium (II), (4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridine) ruthenium (II), (4,4'-diphenyl-2, 2'-bipyridine) lutenium (II), (4,4'-diamino-2,2'-bipyridine) lutenium (II) lutenium (II), (4,4'-dihydroxy-2,2'-bipyridine) lutenium (II) lutenium (II), (4,4'-dicarboxy-2,2'-bipyridine) lutenium (II) lutenium (II), (4,4'-dibromo-2,2'-bipyridine) lutenium ( II) Luthenium (II), (5,5'-dimethyl-2,2'-bipyridine) Luthenium (II) Luthenium (II), (5,5'-diphenyl-2,2'-bipyridine) Luthenium (II) Lutenium (II), (5,5'-diamino-2,2'-bipyridine) Luthenium (II) Luthenium (II), (5,5'-dihydroxy-2,2'-bipyridine) Luthenium (II) Luthenium (II) From II), (5,5'-dicarboxy-2,2'-bipyridine) ruthenium (II) ruthenium (II), and (5,5'-dibromo-2,2'-bipyridine) ruthenium (II). Item 12. The glucose sensor according to Item 12 or 13, which is at least one selected from the group.
ルテニウム錯体に対する反応性に優れたＦＡＤＧＤＨが提供される。ルテニウム錯体はＦＡＤＧＤＨを利用したグルコースセンサのメディエーターとして機能するため、そのようなセンサの提供が可能となる。 FADGDH having excellent reactivity with a ruthenium complex is provided. Since the ruthenium complex functions as a mediator of a glucose sensor using FADGDH, it is possible to provide such a sensor.
以下に、本発明の態様について、詳細に説明する。 Hereinafter, aspects of the present invention will be described in detail.
ＦＡＤＧＤＨはフラビンアデニンジヌクレオチド（以下、ＦＡＤとも記載する。）を補酵素として使用し、グルコースを選択的に酸化する酵素である。 FADGDH is an enzyme that selectively oxidizes glucose using flavin adenine dinucleotide (hereinafter, also referred to as FAD) as a coenzyme.
本発明において、アミノ酸配列はアルファベット１文字または３文字で表記する。また、アミノ酸の変異の位置については次のように表記する。例えば、「Ｈ３２２Ｔ」は３２２位のヒスチジン（Ｈｉｓ）がトレオニン（Ｔｈｒ）に置換することを意味する。なお、配列番号１におけるアミノ酸残基の番号はＮ末端のメチオニン（Ｍｅｔ）を１として番号付けされている。 In the present invention, the amino acid sequence is represented by one or three letters of the alphabet. The positions of amino acid mutations are described as follows. For example, "H322T" means that histidine (His) at position 322 is replaced with threonine (Thr). The amino acid residue numbers in SEQ ID NO: 1 are numbered with the N-terminal methionine (Met) as 1.
一実施形態において、ＦＡＤＧＤＨは、配列番号１と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１の３２２位に相当するアミノ酸残基が、トレオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であることが好ましい。配列番号１の３２２位に相当するアミノ酸残基が、特定のアミノ酸残基であることにより、ルテニウム化合物がＦＡＤＧＤＨのメディエーターとして機能する活性部位近傍にアクセスし易くなり、ＦＡＤＧＤＨとルテニウム化合物との反応性が向上すると考えられる。 In one embodiment, FADGDH has an amino acid sequence having 70% or more identity with SEQ ID NO: 1, and the amino acid residue corresponding to position 322 of SEQ ID NO: 1 is tyrosine, serine, aspartic acid, glutamine, glycine, and the like. It is preferably alanine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, methionine, proline, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, aspartic acid, or glutamic acid. Since the amino acid residue corresponding to position 322 of SEQ ID NO: 1 is a specific amino acid residue, the ruthenium compound can easily access the vicinity of the active site that functions as a mediator of FADGDH, and the reactivity between FADGDH and the ruthenium compound. Is expected to improve.
配列番号１は、Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列である。一実施形態において、ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列に対して、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有することが好ましい。 SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of wild-type FADGDH derived from Mucor hiemalis. In one embodiment, the amino acid sequence of FADGDH is 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93 with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is preferable to have an identity of% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
他の実施形態において、ＦＡＤＧＤＨは、配列番号２０または２１と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１の３２２位に相当するアミノ酸残基がトレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであることが好ましい。配列番号２０または２１との同一性は、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上であることが好ましい。配列番号２０は、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列であり、配列番号２１は、Ｍｕｃｏｒ ｐｒａｉｎｉｉ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列である。 In another embodiment, FADGDH has an amino acid sequence having 70% or more identity with SEQ ID NO: 20 or 21, and the amino acid residue corresponding to position 322 of SEQ ID NO: 1 is threonine, serine, asparagine or glutamine. It is preferable to have. Identity with SEQ ID NO: 20 or 21 is 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more. , 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more is preferable. SEQ ID NO: 20 is the amino acid sequence of wild-type FADGDH derived from Circinella simplex, and SEQ ID NO: 21 is the amino acid sequence of wild-type FADGDH derived from Circinella simplei.
本発明において、アミノ酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで比較した値を意味する。また、あるアミノ酸配列における配列番号１の３２２位に相当する位置は、ＧＥＮＥＴＹＸソフト（ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）で配列の一次構造（例えばアラインメント）を比較したとき、配列番号１の３２２位と対応する位置をもって相当する判断する。必要に応じて、さらに立体構造の知見などを参照しても良い。なお、本発明においては、ＧＥＮＥＴＹＸソフトとしては、ＧＥＮＥＴＹＸ ＷＩＮ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を使用した。 In the present invention, the identity of the amino acid sequence means the value compared by GENETYX software. Further, the position corresponding to the 322 position of SEQ ID NO: 1 in a certain amino acid sequence corresponds to the position corresponding to the 322 position of SEQ ID NO: 1 when the primary structure (for example, alignment) of the sequence is compared with the GENETYX software (GENETYX CORPORATION). To judge. If necessary, further reference may be made to the knowledge of the three-dimensional structure. In the present invention, GENETYX WIN Version 6.1 was used as the GENETYX software.
一実施形態において、ＦＡＤＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する範囲で、配列番号１の３２２位に相当する位置以外の位置において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されていてもよい。「数個」とは、例えば、５０個以下、４５個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、５個以下、３個以下、又は２個以下である。 In one embodiment, FADGDH has one or several amino acids deleted, substituted, added or inserted at positions other than the position corresponding to position 322 of SEQ ID NO: 1 as long as it has glucose dehydrogenase activity. good. "Several pieces" means, for example, 50 pieces or less, 45 pieces or less, 30 pieces or less, 25 pieces or less, 20 pieces or less, 15 pieces or less, 10 pieces or less, 5 pieces or less, 3 pieces or less, or 2 pieces or less. be.
１又は数個のアミノ酸残基が置換されている場合、置換の種類は、特に制限されないが、ポリペプチドの高次構造、表現形又は特性に顕著な負の影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、同様の性質を有するファミリーに分類することができる。よって、アミノ酸置換は、置換前のアミノ酸残基と同一の上記カテゴリーに属する他のアミノ酸残基間で置換されることが好ましい。 When one or several amino acid residues are substituted, the type of substitution is not particularly limited, but is conservative in that it does not significantly negatively affect the higher-order structure, phenotype or properties of the polypeptide. Amino acid substitutions are preferred. "Conservative amino acid substitution" means replacing an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain of similar properties. Amino acid residues depend on their side chains as basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (eg, asparagine, glutamine, serine, threonine, etc.) Tyrosine, cysteine), non-polar side chains (eg glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), branched side chains (eg threonine, valine, isoleucine), aromatic side chains (eg) , Tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) can be classified into families with similar properties. Therefore, it is preferable that the amino acid substitution is substituted between other amino acid residues belonging to the same category as the amino acid residue before the substitution.
一実施形態において、ＦＡＤＧＤＨ活性を維持するために、ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列は、ＦＡＤＧＤＨにおいて保存性の高いアミノ酸残基及び領域を保持していることが好ましい。保存性の高いアミノ酸残基及び領域は、例えば、複数種ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を比較することで特定することができる。 In one embodiment, in order to maintain FADGDH activity, the amino acid sequence of FADGDH preferably retains amino acid residues and regions that are highly conserved in FADGDH. Highly conservative amino acid residues and regions can be identified, for example, by comparing the amino acid sequences of multiple FADGDH species.
一実施形態において、ＦＡＤＧＤＨは、ムコール属またはシルシネラ属の微生物に由来することが好ましく、ムコール属微生物に由来することが好ましい。菌種については、特に限定されないが、ムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ムコール・プライニ（Ｍｕｃｏｒ ｐｒａｉｎｉｉ）、シルシネラ・シンプレックス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ）などが挙げられる。 In one embodiment, FADGDH is preferably derived from a microorganism of the genus Mucor or a genus Mucor, preferably a microorganism of the genus Mucor. The bacterial species is not particularly limited, and examples thereof include Mucor hiemalis, Mucor plainii, and Circinella simplex.
一実施形態において、ＦＡＤＧＤＨは、クリプトコッカス属の微生物を宿主として生産されたＦＡＤＧＤＨであることが好ましい。一実施形態において、ＦＡＤＧＤＨは、その糖鎖を含む分子量（ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定）は、約８０～１１０ｋＤａ、好ましくは約８５～１０５ｋＤａ、より好ましくは約９０～１００ｋＤａである。宿主として用いられるクリプトコッカス属の微生物は特に限定されないが、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｓ－２）（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１０９６１）またはその変異体が好ましい。 In one embodiment, FADGDH is preferably FADGDH produced using a microorganism of the genus Cryptococcus as a host. In one embodiment, FADGDH has a molecular weight (measured by SDS-PAGE) containing a sugar chain of about 80 to 110 kDa, preferably about 85 to 105 kDa, and more preferably about 90 to 100 kDa. The microorganism of the genus Cryptococcus used as a host is not particularly limited, but Cryptococcus sp. S-2 (Cryptococcus sp. S-2) (accession number FERM BP-10961) or a variant thereof is preferred.
ＦＡＤＧＤＨの製造方法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。 The method for producing FADGDH is not particularly limited, but it can be produced by the procedure as shown below.
ＦＡＤＧＤＨを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われている遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作製される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。 As a method for modifying the amino acid sequence constituting FADGDH, a method for modifying genetic information, which is usually performed, is used. That is, a DNA having the genetic information of a modified protein is produced by converting a specific base of the DNA having the genetic information of the protein, or by inserting or deleting a specific base. As a specific method for converting the base sequence in DNA, for example, a commercially available kit (Transformer Mutagenesis Kit; Clonetech, EXOIII / Mung Bean Deletion Kit; Stratagen, Quick Change Site, Digis, etc.) is used. Alternatively, the use of polymerase chain reaction (PCR) can be mentioned.
一実施形態において、ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡは、配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。ここでストリンジェントな条件とは、同一性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドのＴｍから該Ｔｍより１５℃、好ましくは１０℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。具体的には、例えば一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液（５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ，０．０７５Ｍクエン酸－Ｎａ；ｐＨ７．０），１％ブロッキング試薬，０．０２％ ＳＤＳ，０．１％ Ｎ－ラウリルサルコシン）中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。本発明において、ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡは、配列番号２の塩基配列と６０％以上であり、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有することが好ましい。配列番号２は、Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨをコードする塩基配列である。 In one embodiment, the DNA encoding FADGDH hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions, and encodes a protein having glucose dehydrogenase activity. DNA to be used. Here, the stringent condition refers to a condition in which nucleic acids having high identity are hybridized at a temperature in the range of, for example, from a perfectly matched hybrid Tm to a temperature in the range of 15 ° C., preferably 10 ° C. lower than the Tm. Specifically, for example, a general hybridization buffer (5 × SSC (0.75M NaCl, 0.075M citrate-Na; pH 7.0), 1% blocking reagent, 0.02% SDS, 0. 1% N-lauryl sarcosin), which refers to the condition of hybridization at 68 ° C. for 20 hours. In the present invention, the DNA encoding FADGDH is 60% or more with the base sequence of SEQ ID NO: 2, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more. , More preferably, it has 95% or more identity. SEQ ID NO: 2 is a base sequence encoding wild-type FADGDH derived from Mucor hiemalis.
塩基配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴ ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、塩基配列の相同性の値（%）を算出することができる。 Nucleotide sequence identity can be calculated using commercially available or telecommunication line (Internet) analysis tools, such as software such as FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH. To. Specifically, the main initial conditions generally used for BLAST search are as follows. That is, in Advanced BLAST 2.1, the value (%) of the homology of the base sequence can be calculated by using blastn in the program, setting various parameters to the default values, and performing a search.
一実施形態において、ＦＡＧＤＨをコードするＤＮＡは、単離された状態で存在するＤＮＡであることが好ましい。ここで「単離されたＤＮＡ」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態は、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離されたＤＮＡ」は、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まないこと。一実施形態において、ＤＮＡはｃＤＮＡであることが好ましい。 In one embodiment, the DNA encoding FAGDH is preferably DNA that exists in an isolated state. Here, the "isolated DNA" means a state separated from other components such as nucleic acids and proteins that coexist in the natural state. However, it may contain some other nucleic acid components such as an adjacent nucleic acid sequence (for example, a promoter region sequence or a terminator sequence) in the natural state. In the case of DNA prepared by genetic engineering techniques such as cDNA molecules, the "isolated" state is preferably substantially free of cellular components, culture medium and the like. Similarly, in the case of DNA prepared by chemical synthesis, the "isolated DNA" is preferably substantially free of precursors (raw materials) such as dNTPs and chemical substances used in the synthetic process. .. In one embodiment, the DNA is preferably cDNA.
ＤＮＡは、配列番号２の塩基配列に基づいて、化学的なＤＮＡの合成法（例えば、フォスフォアミダイト法）や遺伝子工学的手法を用いて容易に取得することができる。 DNA can be easily obtained based on the base sequence of SEQ ID NO: 2 by using a chemical DNA synthesis method (for example, a phosphoamidite method) or a genetic engineering method.
本発明の一実施形態は、上記のＤＮＡを含むベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養し、ＧＤＨ活性を有するタンパク質を採取する方法、ＧＤＨ活性を有するタンパク質を生産する方法である。以下、これらについて説明する。 One embodiment of the present invention comprises a vector containing the above DNA, a transformant transformed with the vector, a method for culturing the transformant and collecting a protein having GDH activity, and a protein having GDH activity. It is a method of production. These will be described below.
ベクターは、上記ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡを発現可能な様式で含むことが好ましい。ベクターの種類は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。例えば、宿主と指定大腸菌を用いる場合のベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＧＥＭ－Ｔ、ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ、ｐＴＡ２、ｐＥＴなどが挙げられる。 The vector preferably contains the DNA encoding FADGDH in an expressible manner. The type of vector can be appropriately selected depending on the type of host cell. For example, a plasmid vector, a cosmid vector, a phage vector, a viral vector (adenovirus vector, retrovirus vector, herpesvirus vector, etc.) and the like can be mentioned. For example, as a vector when a host and designated Escherichia coli are used, pBR322, pUC19, pGEM-T, pCR-Blnt, pTA2, pET and the like can be mentioned.
一実施形態において、ベクターは、栄養要求性マーカー、薬剤耐性マーカー、発現プロモーターＤＮＡ配列、及び／又は発現ターミネーター配列を含むことが好ましく、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２由来のｏｒｏｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子、キシラナーゼプロモーター、及びキシラナーゼターミネーターを含むことが好ましい。宿主に組換え発現ベクターを導入する方法としては、特に限定するものではないが、エレクトロポレーションなどの方法が挙げられる。 In one embodiment, the vector preferably comprises a nutritional requirement marker, a drug resistance marker, an expression promoter DNA sequence, and / or an expression terminator sequence, and Cryptococcus sp. It preferably contains an orotic phosphoribosyl transferase gene derived from S-2, a xylanase promoter, and a xylanase terminator. The method for introducing a recombinant expression vector into a host is not particularly limited, and examples thereof include electroporation and the like.
一実施形態において、タンパク質の発現効率及び発現成功率を高めるために、タンパク質（ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列）のＮ末満に分泌シグナルペプチドを結合させた状態で発現させることが好ましい。一般的に、分泌タンパク質のＮ末端には、分泌シグナルペプチドが存在しており、この既存の分泌シグナルペプチドを高効率な分泌シグナルペプチドと置換することで、これら分泌タンパク質の発現効率及び発現成功率を上げることができることが報告されている。 In one embodiment, in order to increase the expression efficiency and success rate of the protein, it is preferable to express the protein (amino acid sequence of FADGDH) in a state where the secretory signal peptide is bound to the N-terminal full. In general, a secretory signal peptide is present at the N-terminal of a secretory protein, and by replacing this existing secretory signal peptide with a highly efficient secretory signal peptide, the expression efficiency and success rate of these secretory proteins are achieved. It has been reported that it can be raised.
使用できる分泌シグナルペプチドとしては、例えば、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２が生産する酸性キシラナーゼに由来する分泌シグナルペプチド配列であり、配列番号３で示されるアミノ酸配列は分泌シグナルペプチド配列を開始コドンから１７アミノ酸までとした配列である。一実施形態において、ベクターは、ＦＡＤＧＤＨのＤＮＡに加え、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含むことが好ましい。 Examples of the secretory signal peptide that can be used include Cryptococcus sp. It is a secretory signal peptide sequence derived from the acidic xylanase produced by S-2, and the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 3 is a sequence in which the secretory signal peptide sequence is from the start codon to 17 amino acids. In one embodiment, the vector preferably comprises a base sequence encoding a signal peptide in addition to the DNA of FADGDH.
形質転換体は、ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡで形質転換されていることが好ましい。形質転換に使用する宿主細胞は、特に制限されず、原核細胞及び真核細胞のいずれでもよく、目的に応じて適宜選択できる。発現ベクターと宿主微生物の組み合わせは、特に限定されないが、例えば、遺伝子を組み込む宿主由来の栄養要求性マーカー遺伝子または薬剤耐性マーカー遺伝子と、遺伝子を組み込む宿主由来の発現プロモーターＤＮＡ配列と、遺伝子を組み込む宿主由来のターミネーターＤＮＡ配列とを含む発現ベクターと、栄養要求性変異宿主または薬剤感受性宿主との組み合わせが挙げられる。好ましくは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２由来のｏｒｏｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子と、キシラナーゼプロモーターＤＮＡ配列と、キシラナーゼターミネーターＤＮＡ配列とを含む発現ベクターと、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２との組み合わせが挙げられる。 The transformant is preferably transformed with DNA encoding FADGDH. The host cell used for transformation is not particularly limited, and may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, and can be appropriately selected depending on the intended purpose. The combination of the expression vector and the host microorganism is not particularly limited, and for example, a nutritional requirement marker gene or a drug resistance marker gene derived from the host into which the gene is incorporated, an expression promoter DNA sequence derived from the host into which the gene is incorporated, and a host into which the gene is incorporated. Examples thereof include a combination of an expression vector containing a derived terminator DNA sequence and a nutrient-requiring mutant host or drug-sensitive host. Preferably, Cryptococcus sp. An expression vector containing an orotate phosphoribosyl transphase gene derived from S-2, a xylanase promoter DNA sequence, and a xylanase terminator DNA sequence, and cryptococcus sp. The combination with S-2 can be mentioned.
形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜選択すればよく、多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。なお、培養に先立って、高ＦＡＤＧＤＨ生産細胞株を予め選抜しておくことが有利である。 The culture form of the transformant may be appropriately selected in consideration of the nutritional and physiological properties of the host, and in most cases, liquid culture is used, but industrially, aeration stirring culture is advantageous. It is advantageous to select high FADGDH-producing cell lines in advance prior to culturing.
培養に用いる窒素源は、特定のアミノ酸成分に欠失があるなど特殊なＮ源を除いて、宿主微生物が利用可能な窒素化合物であれば使用できる。これらは主として有機窒素源であり、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。特に、酵母エキスや大豆蛋白質が好ましいが、これに限定されるものではなく、カゼインポリペプトン、発酵麹エキス、麦芽抽出物などを用いることもできる。 The nitrogen source used for culturing can be any nitrogen compound that can be used by the host microorganism, except for a special N source such as a deletion in a specific amino acid component. These are mainly organic nitrogen sources, and for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean meal alkaline decomposition product and the like are used. In particular, yeast extract and soybean protein are preferable, but the present invention is not limited to this, and casein polypeptone, fermented jiuqu extract, malt extract and the like can also be used.
その他の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、キシロース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。 As other nutrient sources, those usually used for culturing microorganisms are widely used. As the carbon source, any carbon compound that can be assimilated may be used, and for example, glucose, shoe cloth, lactose, maltose, xylose, molasses, pyruvic acid and the like are used. In addition, salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, etc. are used as needed.
培養温度は、菌が発育してＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜設計できる。例えば、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２の場合、通常は２０～２５℃程度である。培養時間は、条件によって多少異なるが、ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了することが好ましく、例えば６０～１２０時間程度である。培地ｐＨは、菌が発育しＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜設計でき、通常はｐＨ３．０～９．０程度である。 The culture temperature can be appropriately designed within the range in which the fungus grows and produces FADGDH. For example, Cryptococcus sp. In the case of S-2, it is usually about 20 to 25 ° C. The culturing time varies slightly depending on the conditions, but it is preferable to end the culturing at an appropriate time in anticipation of the time when the FADGDH reaches the maximum yield, for example, about 60 to 120 hours. The medium pH can be appropriately designed within the range in which the bacterium grows and produces FADGDH, and is usually about pH 3.0 to 9.0.
培養物中のＦＡＤＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＦＡＤＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＦＡＤＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及びポリエチレングリコールモノ－ｐ－イソオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ－２０）等の界面活性剤を添加してＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。 It is also possible to collect and use the culture solution containing the cells that produce FADGDH in the culture as it is, but in general, if FADGDH is present in the culture solution, it is filtered, centrifuged, etc. according to a conventional method. It is used after separating the FADGDH-containing solution and the microbial cells. If FADGDH is present in the cells, the cells are collected from the obtained culture by means such as filtration or centrifugation, and then the cells are destroyed by a mechanical method or an enzymatic method such as lysoteam. , If necessary, add a chelating agent such as EDTA and a surfactant such as polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether (Triton-100) and polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween-20) to FADGDH. Is solubilized and separated and collected as an aqueous solution.
上記のようにして得られたＦＡＤＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＦＡＤＧＤＨを得ることができる。 The FADGDH-containing solution obtained as described above is precipitated by, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting out treatment of ammonium sulfate, sodium sulfate, etc., or fractional precipitation method using a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, etc. You just have to do it. Further, heat treatment and isoelectric point treatment are also effective refining means. Then, purified FADGDH can be obtained by performing gel filtration with an adsorbent or a gel filter, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ－６Ｂ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ－６Ｂ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社製）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。 For example, gel filtration with Sephadex gel (manufactured by GE Healthcare Bioscience), DEAE Sephadex CL-6B (manufactured by GE Healthcare Bioscience), Octyl Sephadex CL-6B (GE Healthcare Bioscience). Purified enzyme preparations can be obtained by separation and purification by column chromatography such as (manufactured by Science). The purified enzyme preparation is preferably purified to the extent that it exhibits a single band by electrophoresis (SDS-PAGE).
これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）西村善文，大野茂男 監修；タンパク質実験プロトコール 第１巻 機能解析編，第２巻 構造解析編（秀潤社）ｐ５０－５２
（ｂ）竹縄忠臣 編集；タンパク質ハンドブック ｐ２２－４７ また、以下に例示する方法によって進めることもできる。
These can proceed, for example, according to the following literature.
(A) Supervised by Yoshifumi Nishimura and Shigeo Ohno; Protein
(B) Edited by Tadaomi Takenawa; Protein Handbook p22-47 Alternatively, the method illustrated below can be used.
本発明において、ＤＣＰＩＰを用いたＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。 In the present invention, the activity of GDH using DCPIP is measured under the following conditions.
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む）
２．０ｍＭ ２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ－グルコース溶液
[Test example]
<Reagent>
50 mM PIPES buffer pH 6.5 (containing 0.1% Triton X-100)
2.0
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液２０．５ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液３．０ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液５．９ｍｌを混合して、反応試薬とする。 The above PIPES buffer solution (20.5 ml), DCPIP solution (3.0 ml), and D-glucose solution (5.9 ml) are mixed to prepare a reaction reagent.
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温し、ＦＡＤＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照として、３７℃に制御された分光光度計で６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検としては、ＦＡＤＧＤＨ溶液の代わりにＦＡＤＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて、同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から、次の式（１）に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ－グルコース存在下で、１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
<Measurement conditions>
Preheat 3 ml of the reaction reagent at 37 ° C for 5 minutes, add 0.1 ml of FADGDH solution, mix gently, and then use a spectrophotometer controlled at 37 ° C to change the absorbance at 600 nm for 5 minutes using water as a control. Record and measure the change in absorbance (ΔOD TEST ) per minute from the straight section. As a blinding method, a solvent that dissolves FADGDH is added to the reagent mixture instead of the FADGDH solution, and the change in absorbance (ΔOD BLANK ) per minute is measured in the same manner. From these values, the GDH activity is determined according to the following formula (1). Here, 1 unit (U) in GDH activity is defined as the amount of enzyme that reduces 1 micromol of DCPIP per minute in the presence of D-glucose at a concentration of 200 mM.
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。 In the formula, 3.0 is the reaction reagent + enzyme solution volume (ml), 16.3 is the mmol molecular extinction coefficient (cm 2 / micromol) under the present activity measurement conditions, and 0.1 is the enzyme solution solution. The amount (ml) and 1.0 indicate the optical path length (cm) of the cell.
本発明において、塩化ヘキサアミンルテニウム（III）／臭化３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム（以下、Ｒｕ／ＭＴＴとも表す。）を用いたＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。 In the present invention, the activity of GDH using ruthenium chloride (III) / 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (hereinafter, also referred to as Ru / MTT). The measurement is performed under the following conditions.
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む）
３０ｍＭ 塩化ヘキサアミンルテニウム（III）溶液
１０ｍＭ 臭化３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム溶液
１Ｍ Ｄ－グルコース溶液
上記リン酸緩衝液１０．５ｍｌ、塩化ヘキサアミンルテニウム（III）溶液１０．０ｍｌ、臭化３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム溶液 ３ｍｌ
Ｄ―グルコース溶液５．９ｍｌ
を混合して、反応試薬とする。
[Test example]
<Reagent>
50 mM phosphate buffer pH 6.5 (including 0.1% Triton X-100)
30 mM hexaamine lutenium chloride (III) solution 10 mM bromide 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium solution 1MD-glucose solution 10.5 ml of the above phosphate buffer, hexaamine chloride Phosphoric acid (III) solution 10.0 ml, bromide 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-
D-glucose solution 5.9 ml
Are mixed to prepare a reaction reagent.
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを、３７℃で５分間予備加温する。ＦＡＤＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、５６５ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＦＡＤＧＤＨ溶液の代わりに、ＦＡＤＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて、同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から、次の式（２）に従ってＧＤＨ活性を求める。ここで、ＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ－グルコース存在下で、１分間に１マイクロモルの臭化３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムを還元する酵素量として定義している。
<Measurement conditions>
Preheat 3 ml of the reaction reagent at 37 ° C. for 5 minutes. After adding 0.1 ml of FADGDH solution and mixing gently, the absorbance change at 565 nm was recorded for 5 minutes with a spectrophotometer controlled at 37 ° C. using water as a control, and the absorbance change per minute (ΔOD) was recorded from the linear portion. TEST ) is measured. In blinding, instead of the FADGDH solution, a solvent that dissolves FADGDH is added to the reagent mixture, and the change in absorbance (ΔOD BLANK ) per minute is similarly measured. From these values, the GDH activity is determined according to the following formula (2). Here, 1 unit (U) in GDH activity is 1 micromol of bromide 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5 per minute in the presence of D-glucose at a concentration of 200 mM. -Defined as the amount of enzyme that reduces diphenyltetrazolium.
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、２０．０は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。 In the formula, 3.0 is the reaction reagent + the amount of the enzyme solution (ml), 20.0 is the mmol molecular extinction coefficient (cm 2 / micromol) under the present activity measurement conditions, and 0.1 is the solution of the enzyme solution. The amount (ml) and 1.0 indicate the optical path length (cm) of the cell.
グルコースセンサ
グルコースセンサは、上述のＦＡＤＧＤＨを含むことが好ましい。グルコースセンサが備える電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用いることができる。参照極と作用極上にキャピラリー構造を形成し、キャピラリー内に酵素とメディエーターを充填させるのが一般的である。電極上にＦＡＤＧＤＨを固定化する方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、フェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。該ポリマーとしては、親水性ポリマーが好ましく、例えばカルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリスチレンスルホン酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、アラビアガム、カラギーナンなどが挙げられる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いてＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
Glucose sensor The glucose sensor preferably contains the above-mentioned FADGDH. As the electrode included in the glucose sensor, a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, or the like can be used. It is common to form a capillary structure on the reference and action poles and fill the capillaries with enzymes and mediators. As a method of immobilizing FADGDH on the electrode, there are a method of using a cross-linking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of dialysis, a method of using a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer and the like. It may be fixed in a polymer or adsorbed and fixed on an electrode together with an electron mediator typified by ferrocene or a derivative thereof, or these may be used in combination. The polymer is preferably a hydrophilic polymer, and examples thereof include carboxymethyl cellulose, polyvinyl alcohol, polystyrene sulfonic acid, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, arabic gum, and carrageenan. Typically, FADGDH is immobilized on a carbon electrode with glutaraldehyde and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、ＦＡＤＧＤＨの補酵素であるＦＡＤから電子を受け取り、発色物質や電極に電子を供与しうるものが挙げられる。例えばフェリシアン化物塩、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルフェニレンジアミン、１－メトキシ－フェナジンメトサルフェート、２，６－ジクロロフェノールインドフェノール、２，５－ジメチル－１，４－ベンゾキノン、２，６－ジメチル－１，４－ベンゾキノン、２，５－ジクロロ－１，４－ベンゾキノン、ニトロソアニリン、フェロセン誘導体、オスミウム化合物、ルテニウム化合物等が例示されるが、中でも、ルテニウム化合物が好ましい。 The glucose concentration can be measured as follows. Put buffer in a constant temperature cell and keep it at a constant temperature. Examples of the mediator include those capable of receiving electrons from FAD, which is a coenzyme of FADGDH, and donating electrons to a coloring substance or an electrode. For example, ferricyanide salt, phenazine etsulfate, phenazinemethsulfate, phenylenediamine, N, N, N', N'-tetramethylphenylenediamine, 1-methoxy-phenazinemethsulfate, 2,6-dichlorophenol indophenol, 2 , 5-Dimethyl-1,4-benzoquinone, 2,6-dimethyl-1,4-benzoquinone, 2,5-dichloro-1,4-benzoquinone, nitrosoaniline, phenylene derivative, osmium compound, ruthenium compound and the like are exemplified. However, among them, a ruthenium compound is preferable.
上記のルテニウム化合物としては、塩化ヘキサアミンルテニウム（III）、（ビピリジン）ルテニウム（II）、（４，４’－ジメチル－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（II）、（４，４’－ジフェニル－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（II）、（４，４’－ジアミノ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（II）ルテニウム（II）、（４，４’－ジヒドロキシ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（II）ルテニウム（II）、（４，４’－ジカルボキシ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（II）ルテニウム（II）、（４，４’－ジブロモ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（II）ルテニウム（II）、（５，５’－ジメチル－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（II）ルテニウム（II）、（５，５’－ジフェニル－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（II）ルテニウム（II）、（５，５’－ジアミノ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（II）ルテニウム（II）、（５，５’－ジヒドロキシ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（II）ルテニウム（II）、（５，５’－ジカルボキシ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（II）ルテニウム（II）、（５，５’－ジブロモ－２，２’－ビピリジン）ルテニウム（II）などが例示される。一実施形態において、塩化ヘキサアミンルテニウム（III）が好ましい。 Examples of the above-mentioned ruthenium compound include hexaamine ruthenium chloride (III), (bipyridine) ruthenium (II), (4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridine) ruthenium (II), and (4,4'-diphenyl). -2,2'-bipyridine) lutenium (II), (4,4'-diamino-2,2'-bipyridine) lutenium (II) lutenium (II), (4,4'-dihydroxy-2,2'- Bipyridine) lutenium (II) lutenium (II), (4,4'-dicarboxy-2,2'-bipyridine) lutenium (II) lutenium (II), (4,4'-dibromo-2,2'-bipyridine ) Lutenium (II) Luthenium (II), (5,5'-dimethyl-2,2'-bipyridine) Luthenium (II) Luthenium (II), (5,5'-diphenyl-2,2'-bipyridine) Luthenium (II) Luthenium (II), (5,5'-diamino-2,2'-bipyridine) Luthenium (II) Luthenium (II), (5,5'-dihydroxy-2,2'-bipyridine) Luthenium (II) ) Lutenium (II), (5,5'-dicarboxy-2,2'-bipyridine) Luthenium (II) Luthenium (II), (5,5'-dibromo-2,2'-bipyridine) Luthenium (II) Etc. are exemplified. In one embodiment, hexaamine ruthenium chloride (III) is preferred.
グルコースセンサは、作用電極がＦＡＤＧＤＨを固定化した電極であり、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を備えることが好ましい。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、血液、尿などのグルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定するアンペロメトリーによる方法でグルコース濃度を測定することが好ましい。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。 The working electrode is an electrode on which FADGDH is immobilized, and the glucose sensor preferably includes a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode). After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, the glucose concentration can be measured by an amperometry method that measures the increase in current by adding a sample containing glucose such as blood and urine. preferable. The glucose concentration in the sample can be calculated according to the calibration curve prepared with the glucose solution of the standard concentration.
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。実施例により、本発明が特に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples. The present invention is not particularly limited by the examples.
実施例１：大腸菌発現用ベクターの作製
ムコール・ヒエマリス由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列である配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンを付加したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（配列番号２）を組み換えプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のマルチクローニング部位に挿入した。これで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地（１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布し、３０℃で一晩培養した。寒天培地上にコロニーを形成した形質転換体を、アンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク製）を含んだＬＢ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ；ｐＨ６．５）に接種し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた菌体からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）－Ｐｌａｓｍｉｄ－（東洋紡製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のマルチクローニング部位に配列番号２の塩基配列が挿入されたプラスミドｐＭｈＧＤＨプラスミドを得た。
Example 1: Preparation of vector for expressing Escherichia coli A DNA sequence (SEQ ID NO: 2) encoding an amino acid sequence in which methionine is added to the N-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which is the amino acid sequence of FADGDH derived from Mucor hyemaris, is recombinant plasmid pBluescript. It was inserted into the multi-cloning site of SK (+). This transformed a commercially available E. coli competent cell (E. coli DH5α; manufactured by TOYOBO) and LB agar medium containing ampicillin (1.0% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1.0% NaCl, 1). It was applied to 5.5% agar; pH 7.3) and cultured at 30 ° C. overnight. The transformant that formed colonies on the agar medium was LB liquid medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1.0% NaCl; pH 6.5) containing ampicillin (50 mg / ml; manufactured by Nakaraitesk). ), And shake-cultured overnight at 30 ° C. A plasmid was extracted and purified from the obtained cells using MagExtractor (registered trademark) -Plasmid- (manufactured by Toyobo), and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 was inserted into the multicloning site of pBluescript SK (+). The plasmid pMhGDH plasmid was obtained.
実施例２：変異型ＦＡＤＧＨＤ発現プラスミドの調製
実施例１で得たｐＭｈＧＤＨプラスミドを鋳型として、５８位のグルタミンをアスパラギン酸に置換するよう設計した、配列番号４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な配列番号５の合成オリゴヌクレオチドを使用して、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いてＰＣＲを行った。続いて、ＰＣＲ産物で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α；ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地で、３７℃、１６時間培養した。その後、シングルコロニーを、アンピシリンを含んだＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩振とう培養した。その後、１ｍｌの培養液を接種し、常法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの置換された部位を、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ製）を用いて特定した。配列番号１の５８位のグルタミンをアスパラギン酸に置換した変異型ＦＡＤＧＤＨをコードする塩基配列を含むプラスミドｐＭｈＧＤＨ－Ｑ５８Ｄを得た。同様の手法で配列番号６と配列番号７の合成オリゴヌクレオチドを用いて配列番号１の７９位のアルギニンをグルタミンに置換したプラスミドｐＭｈＧＤＨ－Ｒ７９Ｑを得た。配列番号８と配列番号９の合成オリゴヌクレオチドを用いて配列番号１の３２０位のヒスチジンをグルタミンに置換した変異型ＦＡＤＧＤＨをコードする塩基配列を含むプラスミドｐＭｈＧＤＨ－Ｈ３２０Ｑを得た。配列番号１０と配列番号１１の合成オリゴヌクレオチドを用いて配列番号１の３２２位のヒスチジンをトレオニンに置換した変異型ＦＡＤＧＤＨをコードする塩基配列を含むプラスミドｐＭｈＧＤＨ－Ｈ３２２Ｔを得た。配列番号１２と配列番号１３の合成オリゴヌクレオチドを用いて配列番号１の３２６位のバリンをアルギニンに置換した変異型ＦＡＤＧＤＨをコードする塩基配列を含むプラスミドｐＭｈＧＤＨ－Ｖ３２６Ｒを得た。配列番号１６と配列番号１７の合成オリゴヌクレオチドを用いて配列番号１の４３８位のトレオニンをアスパラギン酸に置換した変異型ＦＡＤＧＤＨをコードする塩基配列を含むプラスミドｐＭｈＧＤＨ－Ｔ４３８Ｄを得た。配列番号１８と配列番号１９の合成オリゴヌクレオチドを用いて配列番号１の４５８位のアスパラギンをアスパラギン酸に置換した変異型ＦＡＤＧＤＨをコードする塩基配列を含むプラスミドｐＭｈＧＤＨ－Ｎ４５８Ｄを得た。
Example 2: Preparation of mutant FADGHD expression plasmid Using the pMhGDH plasmid obtained in Example 1 as a template, the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 4, which was designed to replace glutamine at position 58 with aspartic acid, and a sequence complementary thereto. PCR was performed using the No. 5 synthetic oligonucleotide using QuickChange® Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by STRATAGENE). Subsequently, commercially available E. coli competent cells (E. coli DH5α; manufactured by TOYOBO) were transformed with PCR products and cultured on LB agar medium containing ampicillin at 37 ° C. for 16 hours. The single colonies were then inoculated into LB liquid medium containing ampicillin and cultured at 30 ° C. with shaking overnight. Then, 1 ml of the culture solution was inoculated and the plasmid was extracted by a conventional method. Substituted sites of the extracted plasmid were identified using a DNA sequencer (ABI PRISM® 3700 DNA Analyzer; Perkin-Elmer). A plasmid pMhGDH-Q58D containing a base sequence encoding a mutant FADGDH in which glutamine at position 58 of SEQ ID NO: 1 was replaced with aspartic acid was obtained. The plasmid pMhGDH-R79Q was obtained by substituting glutamine for arginine at position 79 of SEQ ID NO: 1 using synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 in the same manner. Using the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, a plasmid pMhGDH-H320Q containing a base sequence encoding a mutant FADGDH in which histidine at position 320 of SEQ ID NO: 1 was replaced with glutamine was obtained. Using the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, a plasmid pMhGDH-H322T containing a base sequence encoding a mutant FADGDH in which histidine at position 322 of SEQ ID NO: 1 was replaced with threonine was obtained. Using the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, a plasmid pMhGDH-V326R containing a base sequence encoding a mutant FADGDH in which valine at position 326 of SEQ ID NO: 1 was replaced with arginine was obtained. Using the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, a plasmid pMhGDH-T438D containing a base sequence encoding a mutant FADGDH in which the threonine at position 438 of SEQ ID NO: 1 was replaced with aspartic acid was obtained. Using the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19, a plasmid pMhGDH-N458D containing a base sequence encoding a mutant FADGDH in which aspartic acid at position 458 of SEQ ID NO: 1 was replaced with aspartic acid was obtained.
実施例３：大腸菌発現系を用いた変異型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調製
実施例２で取得した７種の変異型ＦＡＤＧＤＨ発現プラスミドで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地で３０℃、１６時間培養しシングルコロニーを取得した。その後、該形質転換体のシングルコロニーを、アンピシリンを含んだ５ｍｌＬＢ液体培地に接種し、３０℃で１６時間振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でガラスビーズを用いて該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
Example 3: Preparation of crude enzyme solution containing mutant FADGDH using an Escherichia coli expression system Escherichia coli JM109 transformed with the seven mutant FADGDH expression plasmids obtained in Example 2 was prepared on an LB agar medium containing ampicillin. A single colony was obtained by culturing at 30 ° C. for 16 hours. Then, the single colony of the transformant was inoculated into a 5 ml LB liquid medium containing ampicillin and cultured with shaking at 30 ° C. for 16 hours. The cells obtained by centrifugation are collected from a part of the culture solution, and the cells are crushed using glass beads in a 50 mM phosphate buffer solution (pH 6.0) to prepare a crude enzyme solution. did.
実施例４：大腸菌発現系を用いた変異体を含む粗酵素液の反応性
実施例３で調製した粗酵素液について、上述したＲｕ／ＭＴＴを用いた活性測定法によりＧＤＨ活性を測定した。表１にその結果を示す。ＧＤＨ活性は、野生型（ＭｈＧＤＨ）のＧＤＨ活性を１．０とした場合、Ｈ３２２Ｔ変異体は３．７倍に増加した。一方、他の変異体いずれも１．０未満であった。この結果からＨ３２２Ｔ変異体はルテニウムに対する反応性が大幅に向上することが判明した。
Example 4: Reactivity of the crude enzyme solution containing the mutant using the Escherichia coli expression system The GDH activity of the crude enzyme solution prepared in Example 3 was measured by the above-mentioned activity measurement method using Ru / MTT. The results are shown in Table 1. As for GDH activity, the H322T mutant increased 3.7-fold when the wild-type (MhGDH) GDH activity was 1.0. On the other hand, all the other mutants were less than 1.0. From this result, it was found that the H322T mutant greatly improved the reactivity to ruthenium.
実施例５：クリプトコッカス発現系を用いたＨ３２２Ｔ変異体の発現
特許第６４６１７９３号に記載のｐＣｓＵＸＸｓ３ＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）を鋳型として、実施例２と同様の手法で配列番号１０と配列番号１１の合成オリゴヌクレオチドを用いて３２２位のヒスチジンをトレオニンに置換したｐＣｓＵＸＸｓ３ＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）－Ｈ３２２Ｔプラスミドを作製した。組換え宿主にはクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２． ＤＡ２５株を使用した。本菌株は、特許第５５８８５７８号に記載されており且つ、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４８２に国際寄託された、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２株の変異体に、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２株に由来するａｄｅ１遺伝子を導入した菌株である。本菌は、形質転換体の選択のために、ウラシル要求性となっており、ｐＣｓＵＸＸｓ３ＭｈＦＡＤＧＬＤ（ｏｐｔ）－Ｈ３２２Ｔプラスミドを形質転換することにより、ウラシル要求性によって形質転換体を選抜することが可能である。
Example 5: Expression of H322T mutant using cryptococcus expression system Using pCsUXXs3MhFADGLD (opt) described in Japanese Patent No. 6461793 as a template, synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 are prepared in the same manner as in Example 2. The pCsUXXs3MhFADGLD (opt) -H322T plasmid was prepared by substituting histidine at position 322 with threonine. Cryptococcus sp. S-2. DA25 strain was used. This strain is described in Japanese Patent No. 5588578 and is internationally deposited in FERM BP-11482, Cryptococcus sp. Cryptococcus sp. It is a strain into which the ade1 gene derived from the S-2 strain has been introduced. This bacterium has become uracil-requiring for selection of transformants, and by transforming the pCsUXXs3MhFADGLD (opt) -H322T plasmid, it is possible to select transformants by uracil-requiring. ..
形質転換は、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． １９９２ Ｍａｒ；６０（３）：１１０１－８．（Ｖａｒｍａら）に記載の方法で実施した。クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２． ＤＡ－２５株を２０ｍｌＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）で２５℃、４８時間培養した。得られた培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定した。次に、この培養液を２００ｍｌ液体培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）に培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）が０．１Ａｂｓになるように植菌して２５℃で培養し、培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）が約１．０Ａｂｓになるまで培養を行った。次に、この培養液を遠心分離して菌体を回収し、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｕｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．６）で菌体を２回洗浄し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．６）に吸光度ＯＤ６６０＝５０Ａｂｓとなるように懸濁した。得られた懸濁液１００μｌに、予めＳｂｆＩによって制限酵素処理し、直鎖化したプラスミド１０μｇ（～５μｌ）を添加し、エレクトロポレーション用のキュベットに移した後、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ （ＢＩＯ－ＲＡＤ社）を用いて通電した。通電条件は、Ｃ＝２５μＦ； Ｖ＝０．４７ｋＶで行った。通電後の液中に６００μｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．６）を加え、選択プレート上に塗り広げた。選択プレートはＹＮＢ－ｕｒａ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ Ｗ／Ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、０．０７８％ －ｕｒａ ＤＯ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％グルコース、１％寒天粉末）を用いた。植菌したプレートを２５℃で１週間静置培養し、生育コロニーを選抜した。 Transformation was performed by Infect Immuno. 1992 Mar; 60 (3): 1101-8. It was carried out by the method described in (Varma et al.). Cryptococcus sp. S-2. The DA-25 strain was cultured in 20 ml YM medium (yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, polypeptone 0.5%, glucose 1.0%) at 25 ° C. for 48 hours. The absorbance (OD660 nm) of the obtained culture solution was measured. Next, this culture broth was placed in a 200 ml liquid medium (yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, polypeptone 0.5%, glucose 1.0%) and the absorptivity (OD660 nm) of the culture broth was 0.1 Abs. The cells were inoculated so as to be so that the cells were cultured at 25 ° C., and the cells were cultured until the absorbance (OD660 nm) of the culture solution became about 1.0 Abs. Next, the culture broth was centrifuged to collect the cells, and the cells were washed twice with Wash buffer (270 mM shoe cloth, 1 mM magnesium chloride, 4 mM DTT, 10 mM Tris-HCl pH 7.6), and the Electroporation buffer was used. It was suspended in (270 mM shoe cloth, 1 mM magnesium chloride, 10 mM Tris-HCl pH 7.6) so that the absorbance was OD660 = 50 Abs. To 100 μl of the obtained suspension, 10 μg (~ 5 μl) of a linearized plasmid was previously treated with a restriction enzyme with SbfI, transferred to a cuvette for electroporation, and then Gene Pulser Xcell (BIO-RAD). ) Was used to energize. The energization conditions were C = 25 μF; V = 0.47 kV. 600 μl Electroporation buffer (270 mM sucrose, 1 mM magnesium chloride, 10 mM Tris-HCl pH 7.6) was added to the liquid after energization and spread on the selection plate. The selection plate used was YNB-ura agar medium (0.67% Yeast Nitrogen Base W / O amino acid, 0.078% -ura DO supplement, 2% glucose, 1% agar powder). The inoculated plate was statically cultured at 25 ° C. for 1 week, and growing colonies were selected.
該形質転換体を、２００ｍｌ液体培地（２％酵母エキス、５％キシロース）で２５℃、６００ｒｐｍ、４８時間培養し、培養液上清のＧＤＨ活性を確認した。 The transformant was cultured in a 200 ml liquid medium (2% yeast extract, 5% xylose) at 25 ° C., 600 rpm for 48 hours, and the GDH activity of the culture solution supernatant was confirmed.
実施例６：Ｈ３２２Ｔ変異体の精製
実施例５でＧＤＨ活性を有することを確認した培養液上清を濾布で濾過し、濾過液を回収した。濾過液を分画分子量３０，０００のＵＦ膜（ミリポア製）を用いて濃縮し、濃縮液に連続してリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を添加することによってバッファーを置換した。続いて、濃縮液に硫酸アンモニウムを４０％（ｗ／ｖ）徐々に添加して、室温で３０分間攪拌した後、ろ過助剤を用いて余分な沈殿を除去した。次に、予め４０％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した２００ｍＬのＰＳセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムに濾過液をチャージし、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に段階的に置換してタンパク質を溶出させた。そして、溶出された画分を、分画分子量１０，０００の中空糸膜（スペクトラムラボラトリーズ製）で濃縮し、濃縮液に連続してリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）を添加することによってバッファーを置換した。続いて、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラム酵素液を通液して、精製酵素を得た。図１に、得られた精製酵素に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果、Ｈ３２２Ｔ変異体の分子量は、約９０－１００ｋＤａであり野生型と同等であった。レーン１は分子量マーカー（BenchMarkTM Protein Ladder Marker）であり、レーン２はＨ３２２Ｔ変異体であり、レーン３は野生型ＭｈＧＤＨである。
Example 6: Purification of H322T mutant The culture solution supernatant confirmed to have GDH activity in Example 5 was filtered with a filter cloth, and the filtrate was collected. The filtrate was concentrated using a UF membrane (manufactured by Millipore) having a molecular weight cut off of 30,000, and the buffer was replaced by continuously adding phosphate buffer (50 mM, pH 6.0) to the concentrate. Subsequently, 40% (w / v) of ammonium sulfate was gradually added to the concentrate, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, and then the excess precipitate was removed using a filtration aid. Next, a 200 mL PS Sepharose FastFlow (GE Healthcare) column equilibrated with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 40% (w / v) ammonium sulfate in advance is charged with the filtrate and 50 mM. The protein was eluted by stepwise replacement with phosphate buffer (pH 6.0). Then, the eluted fraction is concentrated with a hollow fiber membrane (manufactured by Spectrum Laboratories) having a molecular weight cut off of 10,000, and a phosphate buffer solution (50 mM, pH 6.0) is continuously added to the concentrated solution. Replaced the buffer. Subsequently, a DEAE Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) column enzyme solution equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) was passed through to obtain a purified enzyme. FIG. 1 shows the results of SDS-PAGE for the obtained purified enzyme. As a result of SDS-PAGE, the molecular weight of the H322T mutant was about 90-100 kDa, which was equivalent to that of the wild type.
実施例７：Ｈ３２２Ｔ変異体の電気化学式センサにおける応答値の評価
グルコース測定用試薬として、以下の組成からなる溶液（ｐＨ７．０）を作製した。
１ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
４５ｍＭ 塩化ヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）
０．４ｍｇ／ｍｌ ＦＡＤＧＤＨ
Example 7: Evaluation of Response Value of H322T Variant in Electrochemical Sensor As a reagent for measuring glucose, a solution (pH 7.0) having the following composition was prepared.
1 mM sodium citrate (pH 7.0)
45 mM Hexaamine Ruthenium Chloride (III)
0.4mg / ml FADGDH
０．５％のＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）５μＬを、３電極を有するディスポーサブルチップ（ＤＥＰ－ＣＨＩＰ；サイズ：１２．５×４×０．３ｍｍ、カーボン：ＥＰ－ＰＰ、バイオデバイステクノロジーズ社製）の作用極・対極・参照極上に滴下し、５０℃、１０分の加温処理を行って乾燥させた。続いて、上記組成液５μＬを、ＣＭＣを固定化した箇所に滴下し、５０℃、１０分の加温処理を行って、センサチップとした。このセンサチップを、専用ソケットを介してポテンショ／ガルバノスタット（装置名：ＨＳＶ－１１０、ＨＯＫＵＴＯ ＤＥＮＫＯ社製）に接続し、電極上の組成物に０～５００ｍｇ／ｄｌの標準グルコース溶液５μＬを添加して＋０．４２Ｖの電圧を印加して電流値をモニタリングし、印加後３秒時点の電流値を応答値とした。グルコース標準液の濃度と応答値の関係を図２に示す。 Action of disposable chip (DEP-CHIP; size: 12.5 x 4 x 0.3 mm, carbon: EP-PP, manufactured by Biodevice Technologies) having 5 μL of 0.5% CMC (carboxymethyl cellulose) with 3 electrodes. It was dropped onto the electrode, counter electrode, and reference electrode, and heated at 50 ° C. for 10 minutes to dry. Subsequently, 5 μL of the above composition solution was dropped onto the portion where the CMC was immobilized, and heated at 50 ° C. for 10 minutes to obtain a sensor chip. This sensor chip is connected to a potentiometer / galvanostat (device name: HSV-110, manufactured by HOKUTO DENKO) via a dedicated socket, and 5 μL of a standard glucose solution of 0 to 500 mg / dl is added to the composition on the electrode. Then, a voltage of +0.42 V was applied to monitor the current value, and the current value at 3 seconds after the application was used as the response value. The relationship between the concentration of the glucose standard solution and the response value is shown in FIG.
測定の結果、Ｈ３２２Ｔ変異体はグルコース濃度依存的な応答値が得られ、塩化ヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）をメディエーターとして利用できることが判明した。一方で、対照として用いた野生型は各グルコース濃度での応答値が得られず、塩化ヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）をメディエーターとして利用できないことが判明した。 As a result of the measurement, it was found that the H322T mutant obtained a glucose concentration-dependent response value, and that hexaamine ruthenium (III) chloride could be used as a mediator. On the other hand, the wild type used as a control did not give a response value at each glucose concentration, and it was found that hexaamine ruthenium (III) chloride could not be used as a mediator.
実施例８：ＦＡＤＧＤＨの配列相同性比較
ＧＥＮＥＴＹＸソフト（ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を使用して、Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ、Ｍｕｃｏｒ ｐｒａｉｎｉｉ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ由来ＦＡＤＧＤＨのアライメントを実施した結果を図３に示す。Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ由来ＦＡＤＧＤＨのＨ３２２と相同のある部位はＭｕｃｏｒ ｐｒａｉｎｉｉはＨ３４３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘはＨ３４２であることを見出した。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を配列番号２０に示す。Ｍｕｃｏｒ ｐｒａｉｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を配列番号２１に示す。
Example 8: Sequence homology comparison of FADGDH The result of performing alignment of Mucor hiemalis, Mucor purinii, and Circinella simplex-derived FADGDH using GENETYX software (GENETYX CORPORATION) is shown in FIG. It was found that the site homologous to H322 of FADGDH derived from Mucor hiemalis was H343 for Mucor praini and H342 for Circinella simplex. The amino acid sequence of FADGDH derived from Circinella simplex is shown in SEQ ID NO: 20. The amino acid sequence of FADGDH derived from Mucor plainii is shown in SEQ ID NO: 21.
図４にムコール・ヒエマリス由来ＦＡＤＧＤＨの立体構造、及び、Ｈ３２２の位置を示す。図４から、メディエーターとなるルテニウム化合物の活性中心への経路上にＨ３２２が位置することが分かる。＋にチャージするヒスチジンを中性のトレオニンに置換したことで、＋にチャージした塩化ヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）が活性中心にアクセスしやすくなったと考えられる。非特許文献１に記載されるアルペルギルス・フラバス由来ＦＡＤＧＤＨにおけるＨ４０３は、ムコール・ヒエマリス由来ＦＡＤＧＤＨではＴ４３８であるが、このアミノ酸残基について非特許文献１と同様にＴ４３８Ｄ置換に置換しても、表１に示すとおり、ルテニウム化合物の反応性に改善は見られなかった。これは、ムコール・ヒエマリス由来ＦＡＤＧＤＨは、図４の左上に示される大きなαヘリックス構造が存在し、これがＴ４３８近傍を通る活性中心への経路を塞いでいるためと推測される。一方、アルペルギルス・フラバス由来ＦＡＤＧＤＨには、そのような大きなαヘリックス構造は存在しない。図５に、アルペルギルス・フラバス由来ＦＡＤＧＤＨの立体構造を示す。これに対し、図３に示す、Ｍｕｃｏｒ ｐｒａｉｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ ｓｉｍｐｌｅｘ由来ＦＡＤＧＤＨは、いずれもムコール・ヒエマリス由来ＦＡＤＧＤＨと同様の前記αヘリックス構造を有する。図３において当該αヘリックス構造に相当する領域を四角で囲んだ。
FIG. 4 shows the three-dimensional structure of Mucor hiemalis-derived FADGDH and the position of H322. From FIG. 4, it can be seen that H322 is located on the path to the active center of the ruthenium compound serving as a mediator. It is considered that the replacement of histidine charged to + with neutral threonine facilitated access to the active center of ruthenium chloride (III) charged to +. H403 in FADGDH derived from Alpergillus flavus described in
本発明の変異型ＦＡＤＧＤＨは、血糖値測定のための試薬やセンサに適用されることにより、医療、診断の分野において広く用いられることが期待される。 The mutant FADGDH of the present invention is expected to be widely used in the fields of medical treatment and diagnosis by being applied to reagents and sensors for measuring blood glucose levels.
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