JP5410722B2

JP5410722B2 - Method for detecting pancreatic tissue injury or cell proliferative disease

Info

Publication number: JP5410722B2
Application number: JP2008253879A
Authority: JP
Inventors: 耕一郎松田; 悠一郎藤岡; 光伸島津
Original assignee: LSI Medience Corp
Current assignee: LSI Medience Corp
Priority date: 2008-09-30
Filing date: 2008-09-30
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2028-09-30
Also published as: JP2010081861A

Description

本発明は、膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患を検出する方法に関する。詳細には、本発明は、膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中の、該疾患に伴って放出される遊離RNAを分析することにより、膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患を検出する方法に関する。さらに本発明は、上記被験者から採取された血清あるいは血漿中の特定のRNA量を複数回測定し、該測定結果により、被験者の膵臓における組織傷害や細胞増殖性疾患の状態を検出する方法に関する。 The present invention relates to a method of detecting pancreatic tissue injury or cell proliferative disease. Specifically, the present invention analyzes the free RNA released with the disease in serum or plasma collected from a subject suspected of having pancreatic tissue injury or cell proliferative disease. The present invention relates to a method for detecting tissue injury or cell proliferative disease. Furthermore, the present invention relates to a method for measuring the amount of specific RNA in serum or plasma collected from the subject a plurality of times and detecting the tissue injury or the state of cell proliferative disease in the pancreas of the subject based on the measurement result.

膵臓の疾患
膵臓は、アミラーゼ、トリプシン、リパーゼなどの消化酵素を含む弱アルカリ性の膵液を分泌して胃酸の中和や食物消化に関わる働き（外分泌）と、インスリン、グルカゴン、ソフトスタチンなどのホルモンを分泌して血糖濃度調節に関わる働き（内分泌）をもつ臓器である。膵臓の疾患として、急性膵炎、慢性膵炎などの組織傷害性疾患、膵臓がん、膵内分泌腫瘍などの細胞増殖性疾患、さらに糖尿病などが知られており、いずれも年々患者数が増加傾向にある（厚生労働省統計による情報）。 Pancreatic diseases The pancreas secretes weak alkaline pancreatic juice containing digestive enzymes such as amylase, trypsin, and lipase to work on gastric acid neutralization and food digestion (exocrine), and hormones such as insulin, glucagon, and soft statin. It is an organ that secretes and has a function (endocrine) related to blood glucose level regulation. Known pancreatic diseases include tissue-damaging diseases such as acute pancreatitis and chronic pancreatitis, cell proliferative diseases such as pancreatic cancer and pancreatic endocrine tumors, and diabetes, all of which are increasing year by year. (Information from Ministry of Health, Labor and Welfare statistics).

膵炎は、膵液に含まれる消化酵素が何らかの原因で膵臓自体を消化することで、膵臓に炎症が発生する疾病であり、重症の場合は周囲の臓器にまで炎症が及び、出血、壊死を起こして死に至る場合もある。慢性膵炎では、炎症が何度も繰り返すことで膵臓細胞が徐々に破壊されて線維化や石灰化が進行し、外分泌や内分泌に異常をきたす。日本では、慢性膵炎からの膵臓がん発生率は一般人口に比べて10〜20倍高く、慢性膵炎は膵臓がんの危険因子である（日本膵臓学会編集「科学的根拠に基づく膵癌診療ガイドライン2006年版」）。 Pancreatitis is a disease that causes inflammation in the pancreas by digesting the pancreas itself for some reason by digestive enzymes contained in the pancreatic juice. In severe cases, inflammation extends to surrounding organs, causing bleeding and necrosis. It can lead to death. In chronic pancreatitis, inflammation repeats many times, pancreatic cells are gradually destroyed, fibrosis and calcification progress, and exocrine and endocrine abnormalities occur. In Japan, the incidence of pancreatic cancer from chronic pancreatitis is 10 to 20 times higher than that of the general population, and chronic pancreatitis is a risk factor for pancreatic cancer (edited by the Japan Pancreas Society, Guidelines for Clinical Practice of Pancreatic Cancer 2006 Year edition ").

膵臓がんは膵臓にできた悪性腫瘍であり、その90％以上は外分泌に関係した細胞、特に膵液を運搬する膵管の細胞から発生する膵管がんである。膵臓がんは、早期での特徴的症状がないため膵臓がん検診の受診率が低く、膵臓がんが発見された時にはかなりがんが進行した状態であることが殆どである。後述するが、膵臓がん診断用の腫瘍マーカーや膵酵素（膵臓特異的な消化酵素）は、早期がんの検出が非常に難しい。さらに、膵臓は身体の中心にあって、胃、十二指腸、小腸、大腸、肝臓、胆嚢、脾臓などに囲まれているため、膵臓がんの画像診断がかなり困難であることが知られている。日本では、毎年22,000人以上の人が膵臓がんで死亡しており、罹患率は死亡率とほぼ等しく、膵臓がん罹患者の生存率が低いことが示されている（国立がんセンターのウェブ公開情報）。 Pancreatic cancer is a malignant tumor of the pancreas, of which more than 90% are pancreatic duct cancers arising from cells related to exocrine secretion, particularly cells of the pancreatic duct that carry pancreatic juice. Because pancreatic cancer has no characteristic symptoms at an early stage, the rate of screening for pancreatic cancer screening is low, and when pancreatic cancer is discovered, the cancer is usually in a state of advanced considerably. As will be described later, tumor markers for pancreatic cancer diagnosis and pancreatic enzymes (pancreatic specific digestive enzymes) are very difficult to detect early cancer. Furthermore, since the pancreas is in the center of the body and is surrounded by the stomach, duodenum, small intestine, large intestine, liver, gallbladder, spleen and the like, it is known that imaging diagnosis of pancreatic cancer is quite difficult. In Japan, more than 22,000 people die from pancreatic cancer every year, and the morbidity rate is almost equal to the mortality rate, indicating that the survival rate of people with pancreatic cancer is low (National Cancer Center website) Public information).

膵臓疾患の診断方法
急性膵炎の診断と重症度判定は、臨床症状・徴候の診察、画像検査、血液・尿検査などから診断基準（厚生労働省急性膵炎診断基準、APACHE II、Ranson Criteria、Glasgow Criteriaなど）に基づいて総合的に行われる（日本腹部救急医学会・日本膵臓学会「エビデンスに基づいた急性膵炎の診療ガイドライン(第一版)」。以下、「急性膵炎ガイドライン」という）。血液検査では、炎症、感染の有無、膵臓の傷害などを調べるために多角的に検査が行われる。項目の中には、膵臓の組織傷害を調べる目的で、血清中膵酵素の活性あるいは濃度レベルを測定する検査がある。急性膵炎の診断に測定される膵酵素の感度と特異度は、全アミラーゼ（感度、特異度：67−100%、85−98%）、膵アミラーゼ（67−100%、83−98%）、リパーゼ（82−100%、82−100%）、トリプシン（89−100%、79−83%）、エラスターゼI（97−100%、79−96%）である（「急性膵炎ガイドライン」）。本ガイドラインでは、急性膵炎の診断には測定法の簡便さ・迅速さから血清中リパーゼ活性の測定が推奨されている。ただし、リパーゼ活性など上記の膵酵素の値は、重症度（症状）との相関が不明確であるのが理由で、重症度判定に使用される推奨度は高くない。重症度判定にはCRP (C-reactive protein)が推奨されているが、重症度判定のリミットとされる72時間以内には、血清中のCRP濃度レベルは増加しない場合もあり、検出感度は十分ではない。 Diagnosis method for pancreatic disease Diagnosis and severity of acute pancreatitis are based on diagnostic criteria such as diagnosis of clinical symptoms and signs, imaging tests, blood and urine tests, etc. (Ministry of Health, Labor and Welfare acute pancreatitis diagnostic criteria, APACHE II, Ranson Criteria, Glasgow Criteria etc. (The Japanese Society for Abdominal Emergency Medicine and the Japan Pancreas Society "Evidence-based Clinical Practice Guidelines for Acute Pancreatitis (First Edition)", hereinafter referred to as "Acute Pancreatitis Guidelines"). Blood tests are performed in multiple ways to check for inflammation, infection, pancreatic injury, and the like. Among the items are tests that measure the activity or concentration level of serum pancreatic enzymes in order to examine pancreatic tissue damage. The sensitivity and specificity of pancreatic enzymes measured in the diagnosis of acute pancreatitis are total amylase (sensitivity, specificity: 67-100%, 85-98%), pancreatic amylase (67-100%, 83-98%), Lipase (82-100%, 82-100%), trypsin (89-100%, 79-83%), elastase I (97-100%, 79-96%) ("Acute Pancreatitis Guidelines"). In this guideline, measurement of serum lipase activity is recommended for the diagnosis of acute pancreatitis because of the simplicity and speed of the measurement method. However, the value of the above-mentioned pancreatic enzymes such as lipase activity is not highly recommended for determining the severity because the correlation with the severity (symptom) is unclear. Although CRP (C-reactive protein) is recommended for severity determination, the CRP concentration level in serum may not increase within 72 hours, which is the limit for severity determination, and detection sensitivity is sufficient. is not.

膵臓がんの診断は、日本膵臓学会「科学的根拠に基づく膵癌診療ガイドライン2006年版」（以下、「膵がん診療ガイドライン」という）では次のように示されている。まず、臨床症状、膵酵素、腫瘍マーカー、危険因子、超音波検査(US)を調べ、膵臓がんの疑いある患者を選別する。次に、コンピュータ断層撮影(CT)、磁気共鳴撮像法(MRI)、または磁気共鳴胆管膵管造影(MRCP)のいずれか、または全てを行い、さらに必要あれば、超音波内視鏡検査(EUS)、内視鏡的逆行性胆管膵管造影(ERCP)、陽電子放射断層撮影(PET)等で精査し、診断を確定する。確定できない場合は、さらに、細胞診、組織診を行い、診断を確定する。 Diagnosis of pancreatic cancer is described as follows in the Japan Pancreas Society "Scientific-based pancreatic cancer clinical practice guideline 2006" (hereinafter referred to as "pancreatic cancer clinical practice guideline"). First, the clinical symptoms, pancreatic enzymes, tumor markers, risk factors, and ultrasonography (US) are examined to select patients suspected of having pancreatic cancer. Next, perform any or all of computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), or magnetic resonance cholangiopancreatography (MRCP), and if necessary, endoscopic ultrasound (EUS) The diagnosis is confirmed by endoscopic retrograde cholangiopancreatography (ERCP), positron emission tomography (PET), etc. If it cannot be determined, further cytology and histology will be performed to confirm the diagnosis.

血液検査では、CA19-9、DUPAN-2、NCC-ST-439、Span-1などの腫瘍マーカーが利用される。これらの腫瘍マーカーは、様々ながんにおいて陽性を示すマーカーであり、膵臓がんを特異的に検出するマーカーではない。そのため、臨床では膵臓がんの検出陽性率向上を目的に、腫瘍マーカーと膵酵素の組合せ検査（CA19-9、DUPAN-2、エラスターゼIの組合せなど）が行われることもある。 In blood tests, tumor markers such as CA19-9, DUPAN-2, NCC-ST-439, and Span-1 are used. These tumor markers are markers that are positive in various cancers, and are not markers that specifically detect pancreatic cancer. Therefore, in combination with tumor markers and pancreatic enzymes (CA19-9, DUPAN-2, elastase I, etc.) may be tested clinically to improve the detection rate of pancreatic cancer.

日本膵臓学会のまとめでは、進行がんでの上記マーカーの検出感度は、CA19-9が70〜80%、Dupan-2が48% 、Span-1が80%となっている（非特許文献１、及び２）。CA19-9の擬陽性率は20〜30%（肝臓、胆嚢、膵臓の疾患で擬陽性が高い）、腫瘍径2cm以下の膵臓がんでの検出感度は52%である（非特許文献３）。また、進行がんにおける膵酵素の検出率は20〜30%である（非特許文献４、及び５）。進行がんでの評価ばかりである理由は、膵臓がんは発見された時点で進行がんの場合が多いことによる。すなわち、早期の膵臓がんでは、上述した腫瘍マーカーや膵酵素の血清中濃度は殆どが異常値を示さない。早期の膵臓がんは、自覚症状がないことや、画像診断で微小な腫瘍の発見が困難であることから、腫瘍マーカー検査等の臨床検査で検出できることが望まれている。しかしながら、既存の膵臓がんマーカーは早期ステージでの検出率が低く、現状では、膵臓がんの早期発見が非常に難しい。 According to the summary of the Pancreatic Society of Japan, the detection sensitivity of the above markers in advanced cancer is 70 to 80% for CA19-9, 48% for Dupan-2 and 80% for Span-1 (Non-patent Document 1, And 2). CA19-9 has a false positive rate of 20-30% (high false positive in liver, gallbladder, and pancreatic diseases), and detection sensitivity of pancreatic cancer with a tumor diameter of 2 cm or less is 52% (Non-patent Document 3). Moreover, the detection rate of pancreatic enzymes in advanced cancer is 20-30% (Non-patent Documents 4 and 5). The reason that only the evaluation of advanced cancer is due to the fact that pancreatic cancer is often advanced cancer when it is discovered. That is, in early pancreatic cancer, serum concentrations of the above-described tumor markers and pancreatic enzymes hardly show abnormal values. Early pancreatic cancer is desired to be detectable by clinical tests such as a tumor marker test because there is no subjective symptom and it is difficult to find a minute tumor by image diagnosis. However, existing pancreatic cancer markers have a low detection rate at an early stage, and at present, early detection of pancreatic cancer is very difficult.

膵臓の組織傷害性疾患、細胞増殖性疾患の診断における理想的なバイオマーカーは、膵臓特異性があり、上記疾患の検出感度が高く、病態の重症度とバイオマーカーの量的変動に相関があることである。しかし、急性膵炎においては膵臓特異的な物質（膵酵素）はあるものの、重症度と相関するものがないこと、膵臓がんにおいては膵臓特異的な物質（腫瘍マーカー）はなく、また、低ステージがんの検出感度が高いものがないことが大きな問題点である。 The ideal biomarker in the diagnosis of pancreatic tissue damaging diseases and cell proliferative diseases has pancreatic specificity, high detection sensitivity of the above diseases, and correlates with severity of pathological condition and quantitative variation of biomarkers That is. However, there is a pancreas-specific substance (pancreatic enzyme) in acute pancreatitis, but there is no correlation with the severity, pancreatic cancer has no pancreas-specific substance (tumor marker), and low stage The major problem is that there is no cancer detection sensitivity.

バイオマーカーとしての遊離核酸
遊離核酸は血清や血漿中に浮遊して存在する細胞外核酸である。遊離核酸の由来は詳細が依然不明であるものの、ネクローシス、アポトーシス、アクティブリリースにより傷害臓器より放出されるものと考えられている。
例えば、K-ras遺伝子の遊離核酸が報告されている。K-ras遺伝子は、EGFR (epidermal growth factor receptor)の関与するシグナル伝達系の下流において主要な役割を担う分子として知られている。K-ras遺伝子は、膵臓がん、大腸がん、肺がん、前立腺がん、皮膚がん、甲状腺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮内膜がん、腎臓がん、脳腫瘍、精巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、乳がん等、数多くのがん組織でコドン12変異（K-ras変異）が認められている。K-ras変異は、がん組織のみならず血清・血漿中に浮遊する遊離核酸中にも存在しており、がんのバイオマーカーに応用されつつある。 Free nucleic acid as a biomarker Free nucleic acid is an extracellular nucleic acid that floats in serum or plasma. Although the origin of the free nucleic acid is still unclear, it is considered to be released from the damaged organ by necrosis, apoptosis, and active release.
For example, a free nucleic acid of the K-ras gene has been reported. The K-ras gene is known as a molecule that plays a major role downstream of the signal transduction system involving EGFR (epidermal growth factor receptor). The K-ras gene includes pancreatic cancer, colon cancer, lung cancer, prostate cancer, skin cancer, thyroid cancer, liver cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, kidney cancer, brain tumor, and testis. Codon 12 mutation (K-ras mutation) has been observed in many cancer tissues such as cancer, bladder cancer, head and neck cancer and breast cancer. K-ras mutations are present not only in cancer tissues but also in free nucleic acids floating in serum and plasma, and are being applied to cancer biomarkers.

エンリッチ(Enriched) PCR-RFLP法を用いた膵臓がん患者血清中のK-ras変異の検出率は71％(41例中29例) (非特許文献６)、ミューテーションスペシフィックミスマッチライゲーションアッセイ(mutation-specific mismatch ligation assay)を用いた別の報告での検出率は35%（26例中9例）であり（非特許文献７）、血清中にK-ras DNAが浮遊していることが報告されている。しかしながら、非特許文献６及び７の報告は、膵臓がんであることを前提に遊離DNA中のK-ras変異を検出したものであり、K-rasは膵臓だけではなく様々な臓器で発現しているため、被験者が膵臓がんを患っているか否かが全く明らかでない場合には、膵臓を原がん臓器として特定することは困難である。 The detection rate of K-ras mutation in the serum of pancreatic cancer patients using the Enriched PCR-RFLP method was 71% (29/41) (non-patent document 6), mutation-specific mismatch ligation assay (mutation) -specific mismatch ligation assay) was reported in another report with a detection rate of 35% (9 out of 26 cases) (Non-Patent Document 7), and reported that K-ras DNA was suspended in serum. Has been. However, the reports of Non-Patent Documents 6 and 7 have detected K-ras mutations in free DNA on the premise of pancreatic cancer, and K-ras is expressed not only in the pancreas but also in various organs. Therefore, it is difficult to specify the pancreas as the original cancer organ when it is not clear at all whether or not the subject has pancreatic cancer.

がん患者血清より遊離RNAを検出した例も数多く報告されている。上咽頭がん患者血漿（EVウィルス関連RNA）、乳がん（hTR、hTERT、mammaglobin、CK19、5T4）、肺がん（Her2/neu、hnRNP-B1、5T4）、大腸がん（hTERT、CEA、β-カテニン）、メラノーマ（チロシナーゼ、gp100、MART-1、PBGD、MAGE-3、MUC-18、p97、c-abl）、リンパ腫（hTERT）、甲状腺がん（hTR、hTERT）、肝臓がん（hTERT）、前立腺がん（PSMA、CEA）で、遊離RNAを検出している（非特許文献８〜２７）。しかしながらこれらの殆どはがんの細胞増殖に関与する遺伝子群であり、臓器特異的な発現を示すのはわずかにマンマグロビン (mammaglobin; 乳房）とPSMA（前立腺）のみである。よって、遊離mammaglobin mRNAが乳がんを検出できること、遊離PSMA mRNAが前立腺がんを検出できること以外は、他のがんを診断できる可能性は示されていない。 There have been many reports of detecting free RNA from the serum of cancer patients. Plasma of patients with nasopharyngeal cancer (EV virus-related RNA), breast cancer (hTR, hTERT, mammaglobin, CK19, 5T4), lung cancer (Her2 / neu, hnRNP-B1, 5T4), colon cancer (hTERT, CEA, β-catenin) ), Melanoma (tyrosinase, gp100, MART-1, PBGD, MAGE-3, MUC-18, p97, c-abl), lymphoma (hTERT), thyroid cancer (hTR, hTERT), liver cancer (hTERT), Free RNA is detected in prostate cancer (PSMA, CEA) (Non-patent Documents 8 to 27). However, most of these are genes involved in cancer cell growth, and only mammaglobin (breast) and PSMA (prostate) show only organ-specific expression. Therefore, there is no possibility that other cancers can be diagnosed except that free mammaglobin mRNA can detect breast cancer and free PSMA mRNA can detect prostate cancer.

問題点のまとめ
以上より、膵臓における組織傷害の診断では膵酵素、細胞増殖性疾患の診断では腫瘍マーカーと膵酵素の血液検査が行われているが、検出感度及び病態の重症度との相関の点で十分なものではない。また、血清や血漿中のK-ras変異検出は、膵臓特異性がないために傷害臓器を特定できるものではない。さらに、膵臓特異的な発現を示す遺伝子の存在が知られているが、膵臓の組織傷害や細胞増殖性疾患の患者血清中の遊離RNAから、膵臓特異的なRNAを検出した例は全く報告がない。 Summary of problems From the above, blood tests of pancreatic enzymes are performed for diagnosis of tissue injury in the pancreas, and tumor markers and pancreatic enzymes for diagnosis of cell proliferative diseases. Not enough in terms. In addition, detection of K-ras mutations in serum and plasma cannot identify an injured organ due to lack of pancreatic specificity. Furthermore, the presence of a gene exhibiting pancreas-specific expression is known, but there have been no reports of detection of pancreas-specific RNA from free RNA in the serum of patients with pancreatic tissue injury or cell proliferative disorders. Absent.

すなわち、血清や血漿などの体液中に遊離して存在する膵臓特異的なRNA量を特定することにより、膵臓における組織傷害や細胞増殖性疾患を診断することが可能か否かは全く明らかにされておらず、血清や血漿などの体液中の膵臓特異的RNA量の変化を検出することにより、膵臓における組織傷害や細胞増殖性疾患の存在を検出することについての試みは全くなされていなかった。 In other words, it is completely clarified whether it is possible to diagnose tissue damage or cell proliferative diseases in the pancreas by identifying the amount of pancreas-specific RNA that is free and present in body fluids such as serum and plasma. However, no attempt has been made to detect the presence of tissue damage or cell proliferative diseases in the pancreas by detecting changes in pancreas-specific RNA levels in body fluids such as serum and plasma.

Satake, K. et al., 1990. Int. J. Pancreatol. 7, 25-36.Satake, K. et al., 1990. Int. J. Pancreatol. 7, 25-36. Nazli, O. et al., 2000. Hepatogastroenterol. 47, 1750-1752.Nazli, O. et al., 2000. Hepatogastroenterol. 47, 1750-1752. 江川新一, 他, 2004. 膵臓 19, 558-566.Shinichi Egawa, et al., 2004. Pancreas 19, 558-566. 真口宏介, 他. 1995. 外科 57, 256-261.Kosuke Maguchi, et al. 1995. Surgical 57, 256-261. 日本膵臓学会膵癌登録委員会 2001. 膵臓 16, 115-147.Pancreatic Cancer Registration Committee 2001. Pancreas 16, 115-147. Dianxu, F. et al., 2002. Pancreas 25, 336-3421.Dianxu, F. et al., 2002. Pancreas 25, 336-3421. Uemura, T. et al., 2004. J. Gastroenterol 39, 56-60.Uemura, T. et al., 2004. J. Gastroenterol 39, 56-60. Wieczorek, A.J. et al., 1989. Schweiz Med Wochenschr 119, 1342-1343.Wieczorek, A.J. et al., 1989. Schweiz Med Wochenschr 119, 1342-1343. Hasselmann, D.O. et al., 2001. Clin Chem 47, 1488-1489.Hasselmann, D.O. et al., 2001.Clin Chem 47, 1488-1489. Lo, K.M. et al., 1999. Clin. Chem. 45, 1292-1294.Lo, K.M. et al., 1999. Clin. Chem. 45, 1292-1294. Kopreski, M.S., 1999. Cancer Res. 5, 1961-1965.Kopreski, M.S., 1999.Cancer Res.5, 1961-1965. Chen, X.Q., 2000. Clin. Cancer Res. 6, 3823-3826.Chen, X.Q., 2000. Clin. Cancer Res. 6, 3823-3826. Gal, S. et al., 2001. Ann. N. Y. Acad. Sci. 945, 192-194.Gal, S. et al., 2001. Ann. N. Y. Acad. Sci. 945, 192-194. Silva, J.M. et al., 2001. Clin. Cancer Res. 7, 2821-2825.Silva, J.M. et al., 2001. Clin. Cancer Res. 7, 2821-2825. Fleischhacker, M. et al., 2001. Ann. N. Y. Acad. Sci. 945, 179.Fleischhacker, M. et al., 2001. Ann. N. Y. Acad. Sci. 945, 179. Sueoka, E. et al., 2005. Lung Cancer 48, 77-83.Sueoka, E. et al., 2005. Lung Cancer 48, 77-83. Lledo, S.M. et al., 2004. Colorectal Dis. 6, 236-242.Lledo, S.M. et al., 2004. Colorectal Dis. 6, 236-242. Silva, J.M. et al., 2002. Gut 50, 530-534.Silva, J.M. et al., 2002. Gut 50, 530-534. Wong, S.C. et al., 2004. Clin. Cancer Res. 10, 1613-1617.Wong, S.C. et al., 2004. Clin. Cancer Res. 10, 1613-1617. Hasselmann, D.O. et al., 2001. Oncol. Rep. 8, 115.Hasselmann, D.O. et al., 2001. Oncol. Rep. 8, 115. Hoon, D.S. et al., 2000. Cancer Res. 60, 2253.Hoon, D.S. et al., 2000.Cancer Res. 60, 2253. Dasi, F. et al., 2001. Lab. Invest. 81, 767-769.Dasi, F. et al., 2001. Lab. Invest. 81, 767-769. Kopreski, M.S., 2001. Ann. N. Y. Acad. Sci. 945, 172.Kopreski, M.S., 2001. Ann. N. Y. Acad. Sci. 945, 172. Novakovic, S. et al., 2004. Oncol. Rep. 11, 245.Novakovic, S. et al., 2004. Oncol. Rep. 11, 245. Miura, N. et al., 2003. Oncology 64, 430.Miura, N. et al., 2003. Oncology 64, 430. Miura, N. et al., 2005. Clin. Cancer Res. 11, 3205.Miura, N. et al., 2005. Clin. Cancer Res. 11, 3205. Papadopoulou, E. et al., 2004. Oncol. Rep. 14, 439.Papadopoulou, E. et al., 2004. Oncol. Rep. 14, 439.

上記に述べたように、血液検査において、膵臓における組織傷害や細胞増殖性疾患を特異的に高感度で診断できるマーカーや、このようなマーカーを使用する検査方法は未だ無い。
すなわち、本発明が解決しようとする課題は、膵臓における組織傷害や細胞増殖性疾患を特異的に高感度で検出できる診断用マーカーを提供し、当該診断用マーカーを用いた膵臓における組織傷害や細胞増殖性疾患の検査方法およびモニタリングする方法を提供することである。 As described above, in blood tests, there are no markers that can specifically diagnose tissue damage or cell proliferative diseases in the pancreas with high sensitivity, or test methods that use such markers.
That is, the problem to be solved by the present invention is to provide a diagnostic marker that can specifically and highly sensitively detect tissue damage and cell proliferative disease in the pancreas, and tissue damage and cells in the pancreas using the diagnostic marker. It is to provide a method for testing and monitoring proliferative diseases.

本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性患者から採取された血清や血漿中には特定の遺伝子由来の膵臓特異的な遊離mRNAが存在することを見出した。さらにその血清や血漿中の膵臓特異的な遊離mRNA量を健常人と比較することにより、特定の遺伝子由来の遊離mRNAの中に健常人に比べて明らかに増加しているものがあることを見出した。また、該遊離mRNAは、その遺伝子の全長で存在しているわけではなく、ある一部分で存在していることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成に至ったものである。 As a result of diligent studies to achieve the above-mentioned problems, the present inventors have found that pancreatic-specific free mRNA derived from a specific gene is contained in serum or plasma collected from patients with pancreatic tissue injury or cell proliferation. Found that there exists. Furthermore, by comparing the amount of free mRNA specific to the pancreas in the serum and plasma with that of healthy people, it was found that some of the free mRNAs derived from specific genes were clearly increased compared to healthy people. It was. Further, the present inventors have found that the free mRNA does not exist in the full length of the gene but exists in a certain part. The present invention has been completed based on these findings.

すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１２］に記載の発明を提供する。
［１］膵臓における組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中の、該疾患に伴って放出される遊離ＲＮＡを分析することを特徴とする、膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の検出方法。
［２］膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中の特定の遊離ＲＮＡ量が、健常人から採取された血清あるいは血漿中の同じＲＮＡ量より多いことを指標とする、［２］に記載の方法。
［３］膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の検出が、膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中の、該疾患に伴って放出される遊離ＲＮＡを複数回に渡って分析し、該分析結果から、該被験者の膵臓における組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の状態をモニタリングする、［２］又は［３］に記載の方法。
［４］遊離ＲＮＡが、キモトリプシンＣｍＲＮＡ、カルボキシペプチダーゼＡ１ｍＲＮＡ、膵コリパーゼｍＲＮＡ、エラスターゼ２ＡｍＲＮＡ、フォスフォリパーゼ２グループ１ＢｍＲＮＡ、膵リパーゼ関連蛋白質２ｍＲＮＡから選択される１種以上のｍＲＮＡ又はその断片である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］遊離ＲＮＡの検出が、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーとの組合せ、配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーとの組合せ、配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーとの組合せ、配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーとの組合せ、配列番号９で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマーとの組合せ、配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーとの組合せから選択されるプライマー組合せ１種以上を使用する、［４］に記載の方法。
［６］遊離ＲＮＡの検出が、逆転写反応リアルタイム核酸増幅法、逆転写反応競合的ＰＣＲ法、ノザンブロット法、マイクロアレイ法、あるいはビーズアレイ法のいずれかの方法で行われる、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］特定のｍＲＮＡの検出手段を少なくとも含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法を行うための検出キット。
［８］キモトリプシンＣ、カルボキシペプチダーゼＡ１、膵コリパーゼ、エラスターゼ２Ａ、フォスフォリパーゼ２グループ１Ｂ、膵リパーゼ関連蛋白質２から選択される遺伝子のｍＲＮＡからなる、膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の検出用マーカー。
［９］キモトリプシンＣ、カルボキシペプチダーゼＡ１、膵コリパーゼ、エラスターゼ２Ａ、フォスフォリパーゼ２グループ１Ｂ、膵リパーゼ関連蛋白質２から選択される遺伝子の全長又はその断片を増幅することのできる、膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の検出用プライマー。
［１０］キモトリプシンＣ、カルボキシペプチダーゼＡ１、膵コリパーゼ、エラスターゼ２Ａ、フォスフォリパーゼ２グループ１Ｂ、膵リパーゼ関連蛋白質２から選択される遺伝子を分析することのできる、膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の検出用プローブ。
［１１］特定のｍＲＮＡの検出手段が、［８］に記載の検出用マーカー、［９］に記載の検出用プライマー、又は［１０］に記載の検出用プローブである、［７］に記載の検出キット。
［１２］遊離ＲＮＡ抽出手段を更に含む、［７］又は［１１］に記載の検出キット。 That is, the present invention provides the inventions described in [1] to [12] below.
[1] Pancreatic tissue injury characterized by analyzing free RNA released with the disease in serum or plasma collected from a subject suspected of having tissue injury or cell proliferative disease in the pancreas Alternatively, a method for detecting a cell proliferative disease.
[2] The amount of specific free RNA in serum or plasma collected from a subject suspected of having pancreatic tissue injury or cell proliferative disease is greater than the same amount of RNA in serum or plasma collected from a healthy person The method according to [2], wherein is used as an index.
[3] Free RNA released in association with the disease in serum or plasma collected from a subject suspected of having a pancreatic tissue injury or cell proliferative disease is detected by detecting pancreatic tissue injury or cell proliferative disease The method according to [2] or [3], wherein the tissue injury or cell proliferative disease state in the pancreas of the subject is monitored from the analysis result.
[4] One or more mRNAs or fragments thereof, wherein the free RNA is selected from chymotrypsin C mRNA, carboxypeptidase A1 mRNA, pancreatic colipase mRNA, elastase 2A mRNA, phospholipase 2 group 1B mRNA, pancreatic lipase-related protein 2 mRNA The method according to any one of [1] to [3].
[5] A combination of a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 for detecting free RNA, and a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 And a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, a combination comprising a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, A combination of a primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 and a primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 A combination of a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 and a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 Using the above primer combinations one kind et selection method according to [4].
[6] Detection of free RNA is performed by any of the reverse transcription reaction real-time nucleic acid amplification method, reverse transcription reaction competitive PCR method, Northern blot method, microarray method, and bead array method. [1] to [5] ] The method in any one of.
[7] A detection kit for performing the method according to any one of [1] to [6], comprising at least means for detecting a specific mRNA.
[8] For detection of pancreatic tissue injury or cell proliferative disease comprising mRNA of a gene selected from chymotrypsin C, carboxypeptidase A1, pancreatic colipase, elastase 2A, phospholipase 2 group 1B, pancreatic lipase-related protein 2 marker.
[9] Pancreatic tissue injury capable of amplifying the full length of a gene selected from chymotrypsin C, carboxypeptidase A1, pancreatic colipase, elastase 2A, phospholipase 2 group 1B, pancreatic lipase-related protein 2, or a fragment thereof Primer for detection of cell proliferative diseases.
[10] Pancreatic tissue injury or cell proliferative disease capable of analyzing a gene selected from chymotrypsin C, carboxypeptidase A1, pancreatic colipase, elastase 2A, phospholipase 2 group 1B, pancreatic lipase-related protein 2 Probe for detection.
[11] The detection means according to [7], wherein the specific mRNA detection means is the detection marker according to [8], the detection primer according to [9], or the detection probe according to [10]. Detection kit.
[12] The detection kit according to [7] or [11], further comprising free RNA extraction means.

本明細書において、「遊離ＲＮＡの分析」における用語「分析」には、分析対象物質（遊離ＲＮＡ）の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量（濃度）を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
また、本明細書における「遊離ＲＮＡの分析」とは、遊離ＲＮＡの全体又はその一部を分析することを意味し、より具体的には、遊離ＲＮＡ全体を直接、分析（例えば、増幅）する場合や、遊離ＲＮＡの部分領域を分析（例えば、増幅）することにより結果的に遊離ＲＮＡを分析する場合が含まれる。 In this specification, the term “analysis” in “analysis of free RNA” includes “detection” for determining the presence / absence of an analysis target substance (free RNA) and the amount (concentration) of the analysis target substance quantitatively or Includes “measurement” that is semi-quantitatively determined.
In the present specification, “analysis of free RNA” means to analyze the whole or a part of the free RNA, and more specifically, directly analyze (eg, amplify) the whole free RNA. The case where the free RNA is analyzed as a result by analyzing (for example, amplifying) a partial region of the free RNA is included.

本発明によれば、低浸襲性の採取方法で得られる血清あるいは血漿を検査材料として、血清や血漿中に存在する膵臓特異的な遊離mRNA量の増加を検出することにより、膵臓における組織傷害や細胞増殖性疾患を特異的に高感度で検出できる診断用マーカー、及びその検出方法、検出キットが提供される。 According to the present invention, tissue damage in the pancreas is detected by detecting an increase in the amount of pancreatic-specific free mRNA present in the serum or plasma using serum or plasma obtained by a low invasive collection method as a test material. And a diagnostic marker capable of specifically detecting a cell proliferative disease with high sensitivity, a detection method thereof, and a detection kit are provided.

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中の、該疾患に伴って放出される膵臓特異的な遊離mRNAを検出することを特徴とする、膵臓における組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の検出方法である。
本発明において、組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の疑いのある被験者とは、該疾患の検出が可能であり、また必要性を有するものであれば得に制限はなく、ヒト、サル、ウサギ、マウス、ラット等の哺乳類等が挙げられる。これも被験者から採取された血液から、それ自体周知の適当な方法により血清あるいは血漿を取得することができる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention is characterized by detecting pancreatic-specific free mRNA released in association with the disease in serum or plasma collected from a subject suspected of having a tissue injury of the pancreas or a cell proliferative disease. A method for detecting tissue injury or cell proliferative disease in the pancreas.
In the present invention, a subject suspected of having a tissue injury or a cell proliferative disease is not limited as long as the disease can be detected and has a necessity, and humans, monkeys, rabbits, mice And mammals such as rats. Again, serum or plasma can be obtained from blood collected from a subject by an appropriate method known per se.

検出の対象とする疾患の種類としては、上記被験者の膵臓における組織傷害、細胞増殖性疾患であれば特に限定しないが、急性膵炎、慢性膵炎などの組織傷害性疾患、膵臓がん、インスリノーマなどの細胞増殖性疾患、さらに糖尿病などが挙げられる。上記の中でも特に好ましくは、急性膵炎、慢性膵炎、あるいは膵臓がんを挙げることができる。 The type of disease to be detected is not particularly limited as long as it is a tissue injury or a cell proliferative disease in the pancreas of the subject, but it is a tissue damage disease such as acute pancreatitis or chronic pancreatitis, pancreatic cancer, insulinoma, etc. Examples include cell proliferative diseases and diabetes. Among these, particularly preferable are acute pancreatitis, chronic pancreatitis, and pancreatic cancer.

本発明において、血清や血漿中に存在する遊離RNAとは、膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患に伴って放出されると考えられ、該疾患を有する患者の血清あるいは血漿中に含まれる量が、健常者のそれに比べて検出可能な程度に多いものを意味する。また、遊離RNAには、完全長RNAや、生合成過程におけるRNA前駆体、さらに血液中に遊離して存在する間に一部分解を受けたRNA分解物が包含される。 In the present invention, free RNA present in serum or plasma is considered to be released in association with pancreatic tissue injury or cell proliferative disease, and the amount contained in the serum or plasma of a patient having the disease This means that there are many more detectable than that of healthy individuals. Free RNA also includes full-length RNA, RNA precursors in the biosynthetic process, and RNA degradation products that have undergone partial degradation while remaining free in the blood.

本発明における膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患（例えば、急性膵炎、膵臓がんなど）を検出できる診断用マーカーとしては、膵コリパーゼ(CLPS) mRNA、カルボキシペプチダーゼA1 (CPA1) mRNA、カルボキシペプチダーゼA2 (CPA2) mRNA、キモトリプシンC (CTRC) mRNA、エラスターゼ2A(ELA2A)mRNA、エラスターゼ3B(ELA3B)mRNA、フォスフォリパーゼA2グループ1B(PLA2G1B)mRNA、膵リパーゼ(PNLIP)mRNA、膵リパーゼ関連蛋白質2(PNLIPRP2)mRNA等が挙げられる。キモトリプシンC (CTRC)mRNA、カルボキシペプチダーゼA1 (CPA1)mRNA、膵コリパーゼ(CLPS)mRNAは、該疾患の陽性検出率が高いことから好適である。該疾患を診断する際には、これらのうち１種について検出してもよいし、複数を組み合わせることもできる。さらに、従来のマーカーなど他のマーカーを組み合わせて総合的に判断することもできる。 As diagnostic markers capable of detecting pancreatic tissue injury or cell proliferative diseases (for example, acute pancreatitis, pancreatic cancer, etc.) in the present invention, pancreatic colipase (CLPS) mRNA, carboxypeptidase A1 (CPA1) mRNA, carboxypeptidase A2 (CPA2) mRNA, chymotrypsin C (CTRC) mRNA, elastase 2A (ELA2A) mRNA, elastase 3B (ELA3B) mRNA, phospholipase A2 group 1B (PLA2G1B) mRNA, pancreatic lipase (PNLIP) mRNA, pancreatic lipase-related protein 2 ( PNLIPRP2) mRNA and the like. Chymotrypsin C (CTRC) mRNA, carboxypeptidase A1 (CPA1) mRNA, and pancreatic colipase (CLPS) mRNA are preferred because of their high positive detection rate for the disease. When diagnosing the disease, one of these may be detected, or a plurality may be combined. Furthermore, it can also be comprehensively determined by combining other markers such as conventional markers.

被験者から採取された血清あるいは血漿からmRNAを抽出する方法としては、当業者に公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、AGPC（酸グアニジンフェノールクロロフォルム）法、アンビオン社製mirVana PARISキットなどを用いることができる。 As a method for extracting mRNA from serum or plasma collected from a subject, methods known to those skilled in the art can be used. Specifically, for example, AGPC (acid guanidine phenol chloroform) method, mirVana PARIS kit manufactured by Ambion, and the like can be used.

上記のように抽出されたmRNA中に含まれる目的のmRNAを測定する方法としては、本発明で検出するmRNAの発現量を検出できる方法であれば特に限定されない。具体的には、例えば、ノザンブロット法、逆転写反応リアルタイムPCR法、逆転写反応競合的PCR法、マイクロアレイ法、ビーズアレイ法などが挙げられる。逆転写反応リアルタイムPCR法によれば、本発明で検出するmRNAに相補的な逆転写反応用プライマー、及びPCR用プライマーを用いて、例えば相補的なTaqManプローブのような蛍光標識プローブを介して、本発明で検出するmRNAを定量的に検出することができる。 The method for measuring the target mRNA contained in the mRNA extracted as described above is not particularly limited as long as it can detect the expression level of mRNA detected in the present invention. Specific examples include Northern blotting, reverse transcription reaction real-time PCR, reverse transcription competitive PCR, microarray, and bead array. According to the reverse transcription reaction real-time PCR method, using a primer for reverse transcription reaction complementary to the mRNA detected in the present invention, and a primer for PCR, for example, via a fluorescently labeled probe such as a complementary TaqMan probe, The mRNA detected by the present invention can be detected quantitatively.

膵臓特異的なmRNAは、膵コリパーゼ(CLPS) mRNA、カルボキシペプチダーゼA1 (CPA1) mRNA、カルボキシペプチダーゼA2 (CPA2) mRNA、キモトリプシンC (CTRC) mRNA、エラスターゼ2A(ELA2A) mRNA、エラスターゼ3B(ELA3B) mRNA、フォスフォリパーゼA2グループ1B(PLA2G1B) mRNA、膵リパーゼ(PNLIP) mRNA、膵リパーゼ関連蛋白質2(PNLIPRP2) mRNAなどが選択されるが、それらの塩基配列は公知である［NCBI; National Center for Biotechnology Informationデータベース登録、CLPS mRNA: NM_001832（配列表の配列番号２３）, CPA1 mRNA: NM_001868（配列表の配列番号２４）, CPA2 mRNA: NM_001869（配列表の配列番号２５）, CTRC mRNA: NM_007272（配列表の配列番号２６）, ELA2A mRNA: NM_033440（配列表の配列番号２７）, ELA3B mRNA: NM_007352（配列表の配列番号２８）, PLA2G1B mRNA: NM_000928（配列表の配列番号２９）, PNLIP mRNA: NM_000936（配列表の配列番号３０）, PNLIPRP2 mRNA: NM_005396（配列表の配列番号３１）］。なお、前記データベースに登録された各塩基配列は、各mRNAに対応するcDNAの塩基配列であるため、配列表の配列番号２３〜３１の各塩基配列もDNA配列として示す。
当業者は、これら公知の塩基配列に基づいて、本発明で検出すべきmRNAに相補的な逆転写反応用プライマー及びPCR用プライマーの塩基配列、あるいは、ノザンブロット法、マイクロアレイ法、ビーズアレイ法に使用可能なプローブの塩基配列を設計して合成することができる。 Pancreatic mRNAs include pancreatic colipase (CLPS) mRNA, carboxypeptidase A1 (CPA1) mRNA, carboxypeptidase A2 (CPA2) mRNA, chymotrypsin C (CTRC) mRNA, elastase 2A (ELA2A) mRNA, elastase 3B (ELA3B) mRNA Phospholipase A2 group 1B (PLA2G1B) mRNA, pancreatic lipase (PNLIP) mRNA, pancreatic lipase-related protein 2 (PNLIPRP2) mRNA, etc. are selected, and their nucleotide sequences are known [NCBI; National Center for Biotechnology Information database registration, CLPS mRNA: NM_001832 (SEQ ID NO: 23 in the sequence listing), CPA1 mRNA: NM_001868 (SEQ ID NO: 24 in the sequence listing), CPA2 mRNA: NM_001869 (SEQ ID NO: 25 in the sequence listing), CTRC mRNA: NM_007272 (sequence listing) SEQ ID NO: 26), ELA2A mRNA: NM_033440 (SEQ ID NO: 27 in the sequence listing), ELA3B mRNA: NM_007352 (SEQ ID NO: 28 in the sequence listing), PLA2G1B mRNA: NM_000928 (SEQ ID NO: 29 in the sequence listing), PNLIP mRNA: NM_000936 ( Sequence listing SEQ ID NO: 30), PNLIPRP2 mRNA: NM — 005396 (SEQ ID NO: 31 in the sequence listing)]. In addition, since each base sequence registered in the database is a base sequence of cDNA corresponding to each mRNA, each base sequence of SEQ ID NOs: 23 to 31 in the sequence listing is also shown as a DNA sequence.
Those skilled in the art can use the base sequences of the reverse transcription reaction primer and PCR primer complementary to the mRNA to be detected in the present invention based on these known base sequences, or the Northern blot method, microarray method, and bead array method. The base sequence of a possible probe can be designed and synthesized.

また、遊離RNAの存在形態は必ずしも完全長RNAではなく、生合成過程におけるRNA前駆体、さらに血液中に遊離して存在する間に一部分解を受けたRNA分解物などが含まれるため、該プライマーは、公知の技術を使用して、本発明で検出すべき遊離RNAの塩基配列を明らかにし、その領域に相補的な逆転写反応用プライマー及びPCR用プライマーの塩基配列を設計して合成して使用することができる。例えば、公知の塩基配列に基づいて、本発明で検出すべき遊離RNAの全長中の適当な領域に相補的な逆転写反応用プライマー及びPCR用プライマーの塩基配列を数種類設計して合成し、膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患を有する患者由来の血清や血漿中に存在している該遊離RNAの領域を明らかにし、好適なものを選択して使用すれば良い。 In addition, the presence of free RNA is not necessarily full-length RNA, but includes RNA precursors in the biosynthetic process, and RNA degradation products that have undergone partial degradation while they are free and present in blood. Using known techniques, clarify the base sequence of the free RNA to be detected in the present invention, and design and synthesize the base sequence of the reverse transcription reaction primer and PCR primer complementary to that region. Can be used. For example, on the basis of a known base sequence, several kinds of base sequences of reverse transcription reaction primer and PCR primer complementary to an appropriate region in the entire length of the free RNA to be detected in the present invention are designed and synthesized. The region of the free RNA existing in serum or plasma derived from a patient having a tissue injury or a cell proliferative disease may be clarified, and a suitable one may be selected and used.

例えば、カルボキシペプチダーゼA1 (CPA1) mRNA [配列表の配列番号２４; 1380bp; CDS (8-1267)]を診断用マーカーとして使用する場合には、第1000〜1380番（より好ましくは第1100〜1300番、特には第1173〜1239番）の塩基からなるC末端側領域を増幅できるプライマー、あるいは、分析可能なプローブを用いることが好ましい。 For example, when carboxypeptidase A1 (CPA1) mRNA [SEQ ID NO: 24; 1380 bp; CDS (8-1267)] in the sequence listing is used as a diagnostic marker, it is numbered 1000-1380 (more preferably 1100-1300). It is preferable to use a primer that can amplify the C-terminal region consisting of the base No. 1, particularly No. 1173-1239), or an analyzable probe.

好適な領域及びプライマー配列として、具体的には、キモトリプシンC mRNAは配列番号１と２の組合せ、カルボキシペプチダーゼA1 mRNAは配列番号３と４の組合せ、膵コリパーゼmRNAは配列番号５と６の組合せ、エラスターゼ2A mRNAは配列番号７と８の組合せ、フォスフォリパーゼ2グループ1B mRNAは配列番号９と１０の組合せ、膵リパーゼ関連蛋白質2 mRNAは配列番号１１と１２の組合せで増幅可能な領域、および該プライマー配列が挙げられる。なお、上記のプライマーで増幅可能な領域内外あるいは該領域近傍に相補的なプライマーを設計して使用することは、当業者であれば容易に実施できる。 As preferred regions and primer sequences, specifically, chymotrypsin C mRNA is a combination of SEQ ID NOs: 1 and 2, carboxypeptidase A1 mRNA is a combination of SEQ ID NOs: 3 and 4, pancreatic colipase mRNA is a combination of SEQ ID NOs: 5 and 6, Elastase 2A mRNA is a combination of SEQ ID NOs: 7 and 8, phospholipase 2 group 1B mRNA is a combination of SEQ ID NOs: 9 and 10, pancreatic lipase-related protein 2 mRNA is a region that can be amplified by a combination of SEQ ID NOs: 11 and 12, and Examples include primer sequences. A person skilled in the art can easily design and use a complementary primer in or near the region that can be amplified with the above primer or in the vicinity of the region.

かくして測定された特定の遊離RNA量は、コントロールとして健常人の血清あるいは血漿中にある同じ遊離RNA量と比較される。健常人の値（コントロール値）よりも優位に多く該遊離RNAが測定されれば、該被検体は膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患を有していると判断することができる。 The specific amount of free RNA thus measured is compared with the same amount of free RNA in healthy human serum or plasma as a control. If the amount of the free RNA is measured to be significantly higher than the value of a healthy person (control value), it can be determined that the subject has pancreatic tissue injury or a cell proliferative disease.

また、本発明は、膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の疑いのある被験者から採取された血清あるいは血漿中の、該疾患に伴って放出される遊離RNAを複数回に渡って、時系列で分析し、該分析結果から、該被験者の膵臓における組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の状態のモニタリングを行う方法も含まれる。
被験者の膵臓における組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の状態のモニタリングとは、例えば、急性膵炎の治療で行われる輸液投与、薬物療法、栄養療法、外科療法や、膵臓がんの治療で行われる外科療法、化学療法、放射線療法、温熱療法、免疫細胞療法等で、治療後の組織の状態などを検査し、治療効果の確認などを行うことを意味する。 In addition, the present invention relates to serum or plasma collected from a subject suspected of having a pancreatic tissue injury or a cell proliferative disease, and free RNA released with the disease over a plurality of times in a time series. A method of analyzing and monitoring the state of tissue injury or cell proliferative disease in the pancreas of the subject from the analysis result is also included.
Examples of the monitoring of tissue damage or cell proliferative disease in the pancreas of a subject include, for example, infusion administration, pharmacotherapy, nutrition therapy, surgical treatment for acute pancreatitis, and surgical treatment for pancreatic cancer treatment It means that the state of the tissue after treatment is examined by chemotherapy, radiation therapy, thermotherapy, immune cell therapy, etc., and the effect of treatment is confirmed.

さらに本発明によれば、特定のRNAの検出手段を少なくとも含む、上記した本発明による膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の検出方法を行うための検出キットが提供される。
特定のRNAの検出手段としては、特定のRNAを逆転写反応リアルタイムPCR法で検出する際に使用する当該mRNAに特異的なプライマー、及び逆転写反応リアルタイムPCR法を行うための試薬（逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド３リン酸など）などを挙げることができる。 Furthermore, according to the present invention, there is provided a detection kit for performing the above-described method for detecting pancreatic tissue injury or cell proliferative disease according to the present invention, which comprises at least a specific RNA detection means.
Specific RNA detection means include primers specific to the mRNA used to detect specific RNA by reverse transcription reaction real-time PCR, and reagents for reverse transcription reaction real-time PCR (reverse transcriptase) , DNA polymerase, deoxynucleotide triphosphate, etc.).

また、本発明の検出キットは、遊離RNA抽出手段を更に含むことができる。遊離RNA抽出手段としては、例えば、例えば、AGPC（酸グアニジンフェノールクロロフォルム）法を行うための試薬などを挙げることができる。 In addition, the detection kit of the present invention can further include a means for extracting free RNA. Examples of the means for extracting free RNA include a reagent for performing an AGPC (acid guanidine phenol chloroform) method.

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.

《実施例１：膵臓特異的mRNAの選択》
DNAマイクロアレイによって、ヒト組織由来のtotal RNAと膵臓由来のtotal RNAに含まれる遺伝子の発現量を比較することにより、膵臓に特異的に発現する候補遺伝子を選択した。以下に具体的に示す。 << Example 1: Selection of pancreas-specific mRNA >>
Candidate genes that are specifically expressed in the pancreas were selected by comparing the expression levels of genes contained in total RNA derived from human tissue and total RNA derived from pancreas by DNA microarray. This is specifically shown below.

〔材料〕
ヒト組織total RNA
Ambion社より市販のヒト組織由来のtotal RNA (食道、甲状腺、子宮、乳房、肝臓、脳、肺、精巣、卵巣、腎臓、小腸、結腸、前立腺、膀胱、副腎、胃)を1種類ずつ使用した。膵臓由来のtotal RNAについては、Ambion社、BioChain社、Clontech社、及びStratagene社より市販されているドナーの異なるtotal RNA 4種類を使用した。血球細胞由来のtotal RNAは、健常人ボランティアよりPAXgene Blood Tube(Becton-Dickinson)を用いて採血した後、PAXgene Blood RNA Kit(QIAGEN)を用いてtotal RNAを抽出した。最終的にtotal RNA濃度を2ng/μLに調整した。〔material〕
Human tissue total RNA
A total of human tissue-derived total RNA (esophagus, thyroid, uterus, breast, liver, brain, lung, testis, ovary, kidney, small intestine, colon, prostate, bladder, adrenal gland, stomach) from Ambion was used. . For total RNA derived from the pancreas, 4 types of total RNA with different donors commercially available from Ambion, BioChain, Clontech, and Stratagene were used. Blood cell-derived total RNA was collected from healthy volunteers using PAXgene Blood Tube (Becton-Dickinson), and then extracted using PAXgene Blood RNA Kit (QIAGEN). Finally, the total RNA concentration was adjusted to 2 ng / μL.

total RNA Mix.調製
ヒト組織total RNA Mix.1として、Ambion社より市販の食道、甲状腺、子宮、乳房、膵臓、肝臓、脳、肺、精巣、卵巣、腎臓、小腸、結腸、前立腺、膀胱、副腎、及び胃由来のtotal RNAを1μgずつ混合し、最終1μg／μLに濃度調整した。
ヒト組織total RNA Mix.2として、Ambion社より市販の食道、甲状腺、子宮、乳房、肝臓、脳、肺、精巣、卵巣、腎臓、小腸、結腸、前立腺、膀胱、副腎、胃、及び血球細胞由来のtotal RNAを1μgずつ混合し、最終1μg／μLに濃度調整した。
膵臓total RNA 1として、Ambion社より市販の膵臓由来total RNAをそのまま使用した。
膵臓total RNA Mix.2として、Ambion社、BioChain社、Clontech社、及びStratagene社より市販のドナーの異なる膵臓由来total RNAを1μgずつ混合し、最終1μg／μLに濃度調整した。 Total RNA Mix. Prepared as human tissue total RNA Mix.1, esophagus, thyroid, uterus, breast, pancreas, liver, brain, lung, testis, ovary, kidney, small intestine, colon, prostate, bladder, adrenal gland, commercially available from Ambion . And 1 μg of total RNA derived from stomach were mixed to adjust the final concentration to 1 μg / μL.
Human tissue total RNA Mix.2, derived from Ambion, esophagus, thyroid, uterus, breast, liver, brain, lung, testis, ovary, kidney, small intestine, colon, prostate, bladder, adrenal gland, stomach, and blood cells Of total RNA was mixed 1 μg at a time, and the final concentration was adjusted to 1 μg / μL.
As pancreatic total RNA 1, a pancreatic total RNA commercially available from Ambion was used as it was.
As pancreas total RNA Mix.2, 1 μg of total RNA derived from pancreas from different donors commercially available from Ambion, BioChain, Clontech, and Stratagene was mixed, and the concentration was adjusted to the final 1 μg / μL.

〔方法〕
mRNA発現プロファイリング
実験1(膵臓total RNA 1とヒト組織total RNA Mix.1の組合せ)、及び、実験2(膵臓total RNA Mix.2とヒト組織total RNA Mix.2の組合せ)においてmRNAの発現量を比較し、膵臓で特異的に発現量の高いmRNAを探索した。実験にはDNAマイクロアレイAceGene(R) Human Oligo Chip 30K(日立ソフトウェアエンジニアリング)を使用した。添付の操作手順書に従い、アンチセンスRNA(aRNA)増幅、蛍光標識、ハイブリダイゼーション、及びスキャニングを行った。それぞれの方法を下記に簡単に記す。〔Method〕
mRNA expression profiling experiment 1 (combination of pancreatic total RNA 1 and human tissue total RNA Mix.1) and experiment 2 (combination of pancreatic total RNA Mix.2 and human tissue total RNA Mix.2) In comparison, mRNAs that were specifically expressed in the pancreas were searched for. A DNA microarray AceGene® Human Oligo Chip 30K (Hitachi Software Engineering) was used for the experiment. Antisense RNA (aRNA) amplification, fluorescent labeling, hybridization, and scanning were performed according to the attached operation procedure manual. Each method is briefly described below.

１）アンチセンスRNA(aRNA)増幅
前述した1μgの total RNA Mix.を初発材料としてAmino Allyl MessageAmp Kit(Ambion)を用い、添付の操作手順書に従ってaRNA増幅した。反応終了後、液量を100μLに調整した。適当な倍率に希釈した後、GeneSpecIII(日立ハイテクノロジーズ)を使用して波長260nmで吸光度測定し、換算式：測定波長260nmでの吸光度1.0＝40ng／μLを用いてaRNA増幅量を算出した。 1) Amplification of antisense RNA (aRNA) Amino Allyl Message Amp Kit (Ambion) was used as the starting material for 1 μg of total RNA Mix. The aRNA was amplified according to the attached operation procedure. After completion of the reaction, the liquid volume was adjusted to 100 μL. After dilution to an appropriate magnification, the absorbance was measured at 260 nm using GeneSpec III (Hitachi High Technologies), and the amount of aRNA amplification was calculated using the conversion formula: absorbance at measurement wavelength 260 nm 1.0 = 40 ng / μL.

２）蛍光標識
Cy5-Mono Reactive Dye、またはCy3-Mono Reactive Dye(Amasham Bioscience)を用いて上記１）で作製したaRNAを蛍光標識した。実験1では、膵臓total RNA 1をCy5、ヒト組織total RNA Mix 1をCy3で標識した。実験2では、膵臓total RNA Mix.2をCy5、ヒト組織total RNA Mix 2をCy3で標識した。 2) Fluorescent label
The aRNA prepared in 1) above was fluorescently labeled using Cy5-Mono Reactive Dye or Cy3-Mono Reactive Dye (Amasham Bioscience). In Experiment 1, pancreatic total RNA 1 was labeled with Cy5 and human tissue total RNA Mix 1 was labeled with Cy3. In Experiment 2, pancreatic total RNA Mix.2 was labeled with Cy5, and human tissue total RNA Mix 2 was labeled with Cy3.

３）ハイブリダイゼーション
DNAマイクロアレイAceGene(R)に上記２）で作製した蛍光標識物を滴下してカバーガラスを載せた後、保湿ケースに入れ、インキュベータを使用して48℃で16時間加温した。時間経過後、添付の操作手順書に従って洗浄した。 3) Hybridization
The fluorescently labeled product prepared in 2) above was dropped onto the DNA microarray AceGene® and placed on a cover glass, and then placed in a moisturizing case and heated at 48 ° C. for 16 hours using an incubator. After a lapse of time, it was washed according to the attached operation procedure manual.

４）スキャニング
次に反応した蛍光標識物のスキャニングを行った。スキャニングは、ScanArray(R) Express(GSI Lumonics)を使用した。スキャナのパラメータであるPMT gain値(以下、PMT)とLaser Power(以下、Laser)は、Cy3をLow(PMT80, Laser78), Middle(PMT82, Laser82), High(PMT86, Laser82)の3条件、Cy5をLow(PMT70, Laser70), Middle(PMT75, Laser70), High(PMT83, Laser70)の3条件に設定し、TIFFデータを取得した。 4) Scanning Next, the reacted fluorescent label was scanned. ScanArray (R) Express (GSI Lumonics) was used for scanning. The PMT gain value (hereinafter referred to as PMT) and Laser Power (hereinafter referred to as Laser), which are the parameters of the scanner, are Cy3 set to Low (PMT80, Laser78), Middle (PMT82, Laser82), and High (PMT86, Laser82). Was set to three conditions of Low (PMT70, Laser70), Middle (PMT75, Laser70), and High (PMT83, Laser70), and TIFF data was acquired.

５）数値化と補正
次に解析ソフトウェアImaGene(R)(BioDiscovery)を使用し、各スポットにおけるTIFFデータを数値化した。さらに、解析ソフトウェアGeneSight(R)(BioDiscovery)を使用し、Low同士、Middle同士、High同士の組合せ(Cy3, Cy5)で、数値のLOWESS補正を行った。Middleでの補正値が1,000〜60,000までのスポットはMiddleより、60,000を超えるスポットはLowより、1,000未満のスポットはHighより補正値を採用してデータを統合し、各スポットにおけるシグナル強度とした。スポットごとに(Cy5シグナル強度)÷(Cy3シグナル強度)を算出し、ヒト組織に対する膵臓のmRNA発現量比(発現比)とした。 5) Digitization and correction Next, TIFF data at each spot was digitized using analysis software ImaGene (R) (BioDiscovery). Furthermore, the analysis software GeneSight (R) (BioDiscovery) was used, and the LOWESS correction of the numerical value was performed with the combination of Lows, Middles, and Highs (Cy3, Cy5). The correction values in the middle range were 1,000 to 60,000. The data was integrated by using correction values from Middle, the spots exceeding 60,000 from Low, and the spots below 1,000 from High. (Cy5 signal intensity) ÷ (Cy3 signal intensity) was calculated for each spot, and was defined as the ratio of pancreatic mRNA expression to human tissues (expression ratio).

６）候補遺伝子の選択
実験1(膵臓total RNA 1とヒト組織total RNA Mix .1の組合せ)、実験2(膵臓total RNA Mix.2とヒト組織total RNA Mix.2の組合せ)において、それぞれ発現比が2倍以上のmRNA種を一次選択した後、Cy5シグナル強度が10,000以上のmRNA種を二次選択した。 6) Expression ratio in candidate gene selection experiment 1 (combination of pancreatic total RNA 1 and human tissue total RNA mix .1) and experiment 2 (combination of pancreatic total RNA mix 2 and human tissue total RNA mix 2), respectively. Was primarily selected, and then mRNA species having a Cy5 signal intensity of 10,000 or more were secondarily selected.

〔結果〕
実験1で選択されたmRNA種は75種類、実験2で選択されたmRNA種は43種類存在し、実験1及び実験2で選択されたmRNA種の合計は79種類であった。〔result〕
There were 75 mRNA species selected in Experiment 1, 43 mRNA species selected in Experiment 2, and the total number of mRNA species selected in Experiment 1 and Experiment 2 was 79.

《実施例２：候補遺伝子の膵臓特異性検証》
リアルタイムPCRによって、実施例１で選択された79種類の候補遺伝子の中から、膵臓における発現が極めて高い特異性を示す遺伝子を選択した。以下に具体的に示す。
〔材料及び方法〕
ヒト組織total RNA
Ambion社より市販のヒト組織由来のtotal RNA (食道、甲状腺、子宮、乳房、肝臓、脳、肺、精巣、卵巣、腎臓、小腸、結腸、前立腺、膀胱、副腎、胃)を1種類ずつ使用した。膵臓由来のtotal RNAは、ドナーの異なる市販品total RNA 5種類（Ambion社製品２種類、BioChain社製品１種類、Clontech社製品１種類、及びStratagene社製品１種類）を使用した。血球細胞由来のtotal RNAは、健常人ボランティアよりPAXgene Blood Tube(Becton-Dickinson)を用いて採血した後、PAXgene Blood RNA Kit(QIAGEN)を用いてtotal RNAを抽出した。最終的にtotal RNA濃度を1μg/μLに調整した。 << Example 2: Verification of pancreatic specificity of candidate genes >>
From 79 kinds of candidate genes selected in Example 1, genes showing very high specificity in pancreas were selected by real-time PCR. This is specifically shown below.
[Materials and methods]
Human tissue total RNA
A total of human tissue-derived total RNA (esophagus, thyroid, uterus, breast, liver, brain, lung, testis, ovary, kidney, small intestine, colon, prostate, bladder, adrenal gland, stomach) from Ambion was used. . As the total RNA derived from the pancreas, five types of commercial total RNA (2 types of Ambion products, 1 type of BioChain product, 1 type of Clontech product, and 1 type of Stratagene product) with different donors were used. Blood cell-derived total RNA was collected from healthy volunteers using PAXgene Blood Tube (Becton-Dickinson), and then extracted using PAXgene Blood RNA Kit (QIAGEN). Finally, the total RNA concentration was adjusted to 1 μg / μL.

cDNA合成
上記で調製したtotal RNA 1μgを材料に、High Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems)を用い、添付の操作手順書に従ってcDNAを合成した（50μL反応系）。反応終了後、cDNA溶液は-80℃で凍結保存した。 cDNA synthesis Using 1 μg of the total RNA prepared above as a material, cDNA was synthesized using the High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) according to the attached operation procedure (50 μL reaction system). After completion of the reaction, the cDNA solution was stored frozen at -80 ° C.

リアルタイムPCRによる定量
上記で調製したcDNA溶液5μL、Universal PCR Master Mix. (Applied Biosystems) 12.5μL、1μM Forward Primer 3.75μL、1μM Reverse Primer 3.75μL、全25μLで、反応液を調製した。測定にはSequence Detection System 7700(Applied Biosystems社)を使用し、温度プログラム{95℃ 10分の後、(95℃ 15秒、60℃ 1分)を1サイクルとした 40サイクル繰り返し}で反応した。リアルタイムPCR法における立ち上がりサイクル数(Ct)値から2^40-Ct値を算出し、見かけのコピー数として定量値を示した。Ct値が35以上の場合は2^40-Ct値を算出するものの、定量限界以下として取扱いした。 Quantification by real-time PCR Reaction solutions were prepared with 5 μL of the cDNA solution prepared above, Universal PCR Master Mix. (Applied Biosystems) 12.5 μL, 1 μM Forward Primer 3.75 μL, 1 μM Reverse Primer 3.75 μL, and total 25 μL. For the measurement, Sequence Detection System 7700 (Applied Biosystems) was used, and the reaction was carried out with a temperature program {95 ° C. for 10 minutes, 40 cycles repeated with 95 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 1 minute) as one cycle}. A 240 ^-Ct value was calculated from the number of rising cycles (Ct) in the real-time PCR method, and a quantitative value was shown as an apparent copy number. When the Ct value was 35 or more, ^240-Ct value was calculated, but it was handled as below the limit of quantification.

〔結果〕
上記の解析の結果、9種類の膵臓特異性が極めて高い遺伝子を選択することができた。図１〜図９に膵臓特異性が極めて高い9遺伝子を示した。各パネルはそれぞれの遺伝子の結果であり、横軸に各組織、縦軸に対応する遺伝子の発現量を示す。膵コリパーゼ (CLPS) mRNA、カルボキシペプチダーゼA1 (CPA1) mRNA、カルボキシペプチダーゼA2 (CPA2) mRNA、キモトリプシンC (CTRC) mRNA、エラスターゼ2A(ELA2A) mRNA、エラスターゼ3B(ELA3B) mRNA、フォスフォリパーゼA2グループ1B(PLA2G1B) mRNA、膵リパーゼ(PNLIP) mRNA、膵リパーゼ関連蛋白質2(PNLIPRP2) mRNAは、膵臓で最も低発現であった検体と他の臓器で最も高発現であった検体における発現量の比が1,000倍以上あった。いずれも膵臓関連、あるいは、非関連の酵素であった。〔result〕
As a result of the above analysis, nine types of genes with extremely high pancreatic specificity could be selected. 1 to 9 show 9 genes with extremely high pancreatic specificity. Each panel shows the result of each gene, and the horizontal axis represents the expression level of each tissue and the vertical axis represents the corresponding gene. Pancreatic colipase (CLPS) mRNA, carboxypeptidase A1 (CPA1) mRNA, carboxypeptidase A2 (CPA2) mRNA, chymotrypsin C (CTRC) mRNA, elastase 2A (ELA2A) mRNA, elastase 3B (ELA3B) mRNA, phospholipase A2 group 1B (PLA2G1B) mRNA, pancreatic lipase (PNLIP) mRNA, pancreatic lipase-related protein 2 (PNLIPRP2) mRNA has a ratio of the expression level in the sample with the lowest expression in the pancreas and the sample with the highest expression in other organs. More than 1,000 times. All were pancreatic or unrelated enzymes.

《実施例３：がん患者血清における、膵臓特異的な遺伝子の遊離mRNAの濃度測定、及び、従来の膵臓がん診断に用いられている腫瘍マーカー、及び、膵酵素との比較》
実施例２で選択した9種類の膵臓特異性が極めて高い遺伝子［膵コリパーゼ (CLPS) mRNA、カルボキシペプチダーゼA1 (CPA1) mRNA、カルボキシペプチダーゼA2 (CPA2) mRNA、キモトリプシンC (CTRC) mRNA、エラスターゼ2A(ELA2A) mRNA、エラスターゼ3B(ELA3B) mRNA、フォスフォリパーゼA2グループ1B(PLA2G1B) mRNA、膵リパーゼ(PNLIP) mRNA、膵リパーゼ関連蛋白質2(PNLIPRP2) mRNA］について、膵癌患者血清中に特異的に遊離しているmRNAの濃度を測定した。次に、従来のがんの診断に用いられている４種類の腫瘍マーカー(CA19-9, DUPAN-2, NCC-ST-439, Span-1抗原)、及び、５種類の膵酵素(エラスターゼ、膵アミラーゼ、リパーゼ、トリプシン、フォスフォリパーゼA2)の濃度を測定した。以下に具体的に記す。 << Example 3: Measurement of concentration of free mRNA of pancreas-specific gene in serum of cancer patients, and comparison with tumor markers and pancreatic enzymes used in conventional diagnosis of pancreatic cancer >>
Nine types of pancreatic specific genes selected in Example 2 [pancreatic colipase (CLPS) mRNA, carboxypeptidase A1 (CPA1) mRNA, carboxypeptidase A2 (CPA2) mRNA, chymotrypsin C (CTRC) mRNA, elastase 2A ( ELA2A) mRNA, elastase 3B (ELA3B) mRNA, phospholipase A2 group 1B (PLA2G1B) mRNA, pancreatic lipase (PNLIP) mRNA, pancreatic lipase-related protein 2 (PNLIPRP2) mRNA] are specifically released in pancreatic cancer patient serum The concentration of mRNA was measured. Next, four types of tumor markers (CA19-9, DUPAN-2, NCC-ST-439, Span-1 antigen) used for conventional cancer diagnosis, and five types of pancreatic enzymes (elastase, The concentrations of pancreatic amylase, lipase, trypsin and phospholipase A2) were measured. This is specifically described below.

３−１）遊離mRNAの測定
〔材料〕
がん患者血清
６例の市販のがん患者血清(ProMedDx社製品)を用いた。がん種類、ID、人種、性別、年齢、病期、血清採取からの経過月を以下の表１に示す。 3-1) Measurement of free mRNA [Material]
Cancer patient serum 6 cases commercially available cancer patients serum of the (ProMedDx's products) was used. Table 1 below shows the cancer type, ID, race, sex, age, stage, and month since serum collection.

健常人ボランティア
本研究への参加について同意を得られた健常人ボランティア16名より、ベノジェクトII真空採血管EDTA-2Na 採血量7mL(テルモ)を用いて採血を行った。採血管を遠心分離(2,400×g, 20℃ 10分間)して血漿を分画し、別の15mL遠心チューブに移注した。血漿を移注した15mL遠心チューブを遠心分離(20,000×g, 20℃ 10分間)し、沈殿物を吸引しないように血漿分画を回収した。回収した血清を250μLずつ分注した後、-80℃で凍結保存した。 Healthy volunteers Blood was collected from 16 healthy volunteers who had consent to participate in this study, using 7 mL (Terumo) of blood collected from Venoject II vacuum blood collection tubes EDTA-2Na. The blood collection tube was centrifuged (2,400 × g, 20 ° C. for 10 minutes) to fractionate the plasma, and transferred to another 15 mL centrifuge tube. The 15 mL centrifuge tube into which the plasma was transferred was centrifuged (20,000 × g, 20 ° C. for 10 minutes), and the plasma fraction was collected so as not to aspirate the precipitate. The collected serum was dispensed in 250 μL aliquots and stored frozen at −80 ° C.

〔方法〕
血清中のmRNA抽出
上記のように調製した6例のがん患者血清、及び、16例の健常人ボランティア血清について、各血清250μLを初発材料に、TRI Reagent BD(Molecular Research Center)を用い、添付の操作手順書に従い、totalRNAを抽出した。抽出後、滅菌蒸留水を加え、液量が50μLになるよう調整した。totalRNA抽出液は-80℃で凍結保存した。〔Method〕
Extraction of mRNA in serum Using the TRI Reagent BD (Molecular Research Center) as an initial material for the serum of 6 cancer patients prepared as described above and the serum of 16 healthy volunteers, using TRI Reagent BD (Molecular Research Center) Total RNA was extracted according to the operating procedure manual. After extraction, sterilized distilled water was added to adjust the liquid volume to 50 μL. The total RNA extract was stored frozen at -80 ° C.

cDNA合成
次に、上記で作製したtotalRNA抽出液50μLを材料に、High Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems)を用い、添付の操作手順書に従い、cDNAを合成した。反応終了後、滅菌蒸留水を加え、液量が250μLになるよう調整した。cDNA溶液は-80℃で凍結保存した。 cDNA synthesis Next, 50 μL of the total RNA extract prepared above was used as a material, and cDNA was synthesized using the High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) according to the attached operation procedure. After completion of the reaction, sterilized distilled water was added to adjust the liquid volume to 250 μL. The cDNA solution was stored frozen at -80 ° C.

リアルタイムPCRによる定量
上記で調製した6例のがん患者血清由来のcDNA、及び、16例の健常人ボランティア血清由来のcDNAを用いて、9種類の膵臓特異的遺伝子［膵コリパーゼ (CLPS) mRNA、カルボキシペプチダーゼA1 (CPA1) mRNA、カルボキシペプチダーゼA2 (CPA2) mRNA、キモトリプシンC (CTRC) mRNA、エラスターゼ2A(ELA2A) mRNA、エラスターゼ3B(ELA3B) mRNA、フォスフォリパーゼA2グループ1B(PLA2G1B) mRNA、膵リパーゼ(PNLIP) mRNA、膵リパーゼ関連蛋白質2(PNLIPRP2) mRNA］の濃度を定量した。該cDNA及び該遺伝子を使用したこと以外は、実施例２と同様の方法で実施した。また、これらの遺伝子の測定に使用したプライマーを以下に示す。 Quantification by real-time PCR Using the cDNAs derived from the 6 cancer patient sera prepared above and the cDNA derived from 16 healthy volunteer sera, 9 pancreatic specific genes [pancreatic colipase (CLPS) mRNA, Carboxypeptidase A1 (CPA1) mRNA, Carboxypeptidase A2 (CPA2) mRNA, Chymotrypsin C (CTRC) mRNA, Elastase 2A (ELA2A) mRNA, Elastase 3B (ELA3B) mRNA, Phospholipase A2 Group 1B (PLA2G1B) mRNA, Pancreatic lipase (PNLIP) mRNA and pancreatic lipase-related protein 2 (PNLIPRP2) mRNA] concentrations were quantified. The same procedure as in Example 2 was performed except that the cDNA and the gene were used. Moreover, the primer used for the measurement of these genes is shown below.

キモトリプシンC (CTRC) mRNA測定用、
配列番号１：CTRC-SENSE ５’−ＴＧＡＡＣＴＧＣＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＧ−３’
配列番号２：CTRC-ANTISENSE ５’−ＧＣＣＧＧＧＡＧＣＣＡＡＡＧＣＴ−３’
カルボキシペプチダーゼA1 (CPA1) mRNA 測定用、
配列番号３：CPA1-SENSE ５’−ＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣ−３’
配列番号４：CPA1-ANTISENSE ５’−ＡＴＧＡＴＧＧＴＣＡＧＡＡＧＣＧＣＣＡ−３’
膵コリパーゼ (CLPS) mRNA測定用、
配列番号５：CLPS-SENSE ５’−ＴＧＣＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＧＡＣＧ−３’
配列番号６：CLPS-ANTISENSE ５’−ＴＴＣＴＧＧＧＣＴＡＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧ−３’
エラスターゼ2A (ELA2A) mRNA測定用、
配列番号７：ELA2A-SENSE ５’−ＧＣＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＴＡＣＧＴ−３’
配列番号８：ELA2A-ANTISENSE ５’−ＧＣＡＣＣＡＣＡＡＴＣＴＴＡＧＡＧＡＣＴＧＡＣ−３’
フォスフォリパーゼA2グループ1B (PLA2G1B) mRNA測定用、
配列番号９：PLA2G1B-SENSE ５’−ＧＣＣＴＴＣＡＴＴＴＧＣＡＡＣＴＧＣＧ−３’
配列番号１０：PLA2G1B-ANTISENSE ５’−ＴＧＣＣＴＴＧＴＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＡ−３’
膵リパーゼ関連蛋白質2 (PNLIPRP2) mRNA測定用、
配列番号１１：PNLIPRP2-SENSE ５’−ＡＧＧＴＧＡＡＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＧＡ−３’
配列番号１２：PNLIPRP2-ANTISENSE ５’−ＣＡＣＧＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＡＣＡＴＴＧ−３’
カルボキシペプチダーゼA2 (CPA2) mRNA測定用、
配列番号１３：CPA2-SENSE ５’−ＴＴＧＡＡＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＧＡＧＣＡ−３’
配列番号１４：CPA2-ANTISENSE ５’−ＴＧＧＣＴＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡ−３’エラスターゼ3B (ELA3B) mRNA測定用、
配列番号１５：ELA3B-SENSE ５’−ＣＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧＡＡＧＧＡＧ−３’
配列番号１６：ELA3B-ANTISENSE ５’−ＡＴＧＣＡＣＡＡＡＧＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧ−３’
膵リパーゼ (PNLIP) mRNA測定用
配列番号１７：PNLIP-SENSE ５’−ＴＡＣＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＡＣＧＴＧＣＡＴＧ−３’
配列番号１８：PNLIP-ANTISENSE ５’−ＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧ−３’ Chymotrypsin C (CTRC) for mRNA measurement,
Sequence number 1: CTRC-SENSE 5'-TGAACTGCCAGTTGGAGAACG-3 '
Sequence number 2: CTRC-ANTISENSE 5'-GCCGGGAGCCAAAGCT-3 '
Carboxypeptidase A1 (CPA1) for mRNA measurement,
Sequence number 3: CPA1-SENSE 5'-TCCTGCTGCCAGCCCTCC-3 '
Sequence number 4: CPA1-ANTISENSE 5'-ATGATGGTCAGAAGCGCCA-3 '
Pancreatic colipase (CLPS) for mRNA measurement,
Sequence number 5: CLPS-SENSE 5'-TGCCATGACGCTGACG-3 '
Sequence number 6: CLPS-ANTISENSE 5'-TTCTGGGCTAGGTGTGGGGAG-3 '
Elastase 2A (ELA2A) for mRNA measurement,
Sequence number 7: ELA2A-SENSE 5'-GCCGGCCACAACCTCTACGT-3 '
Sequence number 8: ELA2A-ANTISENSE 5'-GCACCACAATCTTAGAGACTGAC-3 '
Phospholipase A2 group 1B (PLA2G1B) for mRNA measurement,
Sequence number 9: PLA2G1B-SENSE 5'-GCCTTTCATTGCAACTGCG-3 '
Sequence number 10: PLA2G1B-ANTISENSE 5'-TGCCTTGTTATATGGAGCTTTTGA-3 '
Pancreatic lipase-related protein 2 (PNLIPRP2) for mRNA measurement,
Sequence number 11: PNLIPRP2-SENSE 5'-AGGTGAACTGCATCTGTTGGA-3 '
Sequence number 12: PNLIPRP2-ANTISENSE 5'-CACGCGCTTGGGTGTACATTG-3 '
Carboxypeptidase A2 (CPA2) for mRNA measurement,
Sequence number 13: CPA2-SENSE 5'-TTGAAGGCAATCATGGAGCA-3 '
SEQ ID NO: 14: CPA2-ANTISENSE 5′-TGGCTCTTTGTTCTTCCCCA-3 ′ elastase 3B (ELA3B) for mRNA measurement,
Sequence number 15: ELA3B-SENSE 5'-CGACCGTGCTGTGGAAGGAG-3 '
Sequence number 16: ELA3B-ANTISENSE 5'-ATGCACAAAAGGGTCCCCAG-3 '
Pancreatic lipase (PNLIP) mRNA measurement SEQ ID NO: 17: PNLIP-SENSE 5′-TACTCACCTCTCCAACGTGCATG-3 ′
Sequence number 18: PNLIP-ANTISENSE 5'-TCCTTCCCAGCCCTCCCCAG-3 '

〔結果〕
以上の結果を、表２の遊離mRNAの欄に示す。最左のカラムには検体の情報（膵癌：原発巣、病期、転移。健常人ボランティア）を記した。横のカラムには各遺伝子を示し、縦のカラムには各検体を示し、それぞれの見かけのコピー数を記した。また、基準値（参考値）はリアルタイムPCRにおける検出限界値とした。背景が白いカラムは、基準値以下であり、背景が黒いカラムは、基準値以上を示す。
健常人ボランティアでは、どの遺伝子に関しても、ほとんど遊離mRNAが検出されなかった。膵癌患者では、CPA2、ELA3B、PNLIPについては、ほとんど遊離mRNAが検出されなかったが、一方、CLPSについては5例／6例中（83.3％）、CPA1については5例／6例中（83.3％）、CTRCについては5例／6例中（83.3％）、ELA2Aについては3例／6例中（50％）、PLA2G1Bについては4例／6例中（66.7％）、PNLIPRP2については2例／6例中（33.3％）において、遊離mRNAの明確な存在、あるいは、健常人ボランティアより高い濃度で存在していることが確認された。〔result〕
The above results are shown in the column for free mRNA in Table 2. The leftmost column contains information on the specimen (pancreatic cancer: primary lesion, stage, metastasis, healthy volunteers). Each gene is shown in the horizontal column, each sample is shown in the vertical column, and the apparent number of copies is shown. The reference value (reference value) was the detection limit value in real-time PCR. A column with a white background is below the reference value, and a column with a black background indicates the reference value or more.
In healthy volunteers, almost no free mRNA was detected for any gene. In pancreatic cancer patients, almost no free mRNA was detected for CPA2, ELA3B, and PNLIP, while CLPS for 5/6 cases (83.3%) and CPA1 for 5/6 cases (83.3%) ), CTRC for 5/6 cases (83.3%), ELA2A for 3/6 cases (50%), PLA2G1B for 4/6 cases (66.7%), PNLIPRP2 for 2 cases / In 6 cases (33.3%), it was confirmed that free mRNA was clearly present or was present at a higher concentration than healthy volunteers.

３−２）従来の腫瘍マーカー及び膵酵素の測定
〔材料及び方法〕
上記３−１）で使用した市販の膵臓がん患者血清6例、及び健常人ボランティア血清16例を用い、従来がんの診断に使用されている腫瘍マーカー及び膵酵素を測定した。測定には下記の市販キットを用い、添付の操作手順書に従った。
CA19-9：ケミルミACS-CA19-9 II（シーメンスメディカルソリューションズダイアグノスティクス社製）
DUPAN-2：デタミナ-DUPAN-2（協和メディックス社製）
NCC-ST-439：ラナザイムST-439（カイノス社製）
Span-1抗原：Span-1リアビーズ（協和メディックス社製）
エラスターゼＩ（Elastase）：イアトロIRE1 II（三菱化学ヤトロン社製）
膵アミラーゼ（Amylase）：ピュアオートS P-AMY-G2（第一化学薬品社製）
リパーゼ（Lipase）：ネスコートVNリパーゼ（アルフレッサファーマ社製）
トリプシン（Trypsin）：リアグノストトリプシン II（セティメディカルラボ社製）
フォスフォリパーゼA2（PLA2）：シオノリア膵PLA2（塩野義製薬社製） 3-2) Measurement of conventional tumor markers and pancreatic enzymes [materials and methods]
Using 6 commercially available pancreatic cancer patient sera and 16 healthy volunteer serums used in 3-1) above, tumor markers and pancreatic enzymes conventionally used for cancer diagnosis were measured. The following commercially available kit was used for the measurement, and the attached operation procedure manual was followed.
CA19-9: Chemilmi ACS-CA19-9 II (Siemens Medical Solutions Diagnostics)
DUPAN-2: Detamina-DUPAN-2 (manufactured by Kyowa Medics)
NCC-ST-439: Ranazyme ST-439 (manufactured by Kainos)
Span-1 antigen: Span-1 rear beads (manufactured by Kyowa Medics)
Elastase I: Eatro IRE1 II (Mitsubishi Chemical Yatron)
Pancreatic amylase: Pure Auto S P-AMY-G2 (Daiichi Chemical Co., Ltd.)
Lipase: Nescoat VN lipase (Alfresa Pharma)
Trypsin: Liagnost Trypsin II (made by Seti Medical Lab)
Phospholipase A2 (PLA2): Shionoria pancreatic PLA2 (manufactured by Shionogi & Co.)

〔結果〕
以上の結果を表２の腫瘍マーカー／膵酵素の欄に示した。横のカラムには各腫瘍マーカー、あるいは、膵酵素を示し、縦のカラムには各検体を示し、それぞれの濃度を記した。また、基準値（参考値）は、添付文書に記載されている正常値の範囲（PLA2、Trypsin、Lipase、Amylaseの場合）、あるいは、正常値の上限（CA19-9、Dupan-2、NCC-ST-439、SPan-1抗原、Elastaseの場合）を記した。背景が白いカラムは、正常値であり、背景が黒いカラムは、基準値以上（異常高値）であり、背景が灰色のカラムは、基準値以下（異常低値）を示す。〔result〕
The above results are shown in the column of tumor marker / pancreatic enzyme in Table 2. The horizontal column shows each tumor marker or pancreatic enzyme, the vertical column shows each sample, and the concentration is shown. The reference value (reference value) is the normal value range (in the case of PLA2, Trypsin, Lipase, Amylase) or the upper limit of normal values (CA19-9, Dupan-2, NCC-) ST-439, SPan-1 antigen, and Elastase) are noted. A column with a white background is a normal value, a column with a black background is above a reference value (abnormally high value), and a column with a gray background shows a value below the reference value (abnormally low value).

健常人ボランティアでは、どの腫瘍マーカー、あるいは、膵酵素に関しても、ほぼ正常値を示した。膵癌患者において、4種類の腫瘍マーカーは、CA19-9については4例／6例中（66.7％）、Dupan-2については5例／6例中（83.3％）、NCC-ST-439については5例／6例中（83.3％）、SPan-1抗原については5例／6例中（83.3％）において、異常高値を示した。5種類の膵酵素は、エラスターゼについては2例／6例中（33.3％）において異常高値を示したが、PLA2については、1例／6例中（16.7％）において異常高値、1例／6例中（16.7％）において異常低値、トリプシンについては、1例／6例中（16.7％）において異常高値、2例／6例中（33.3％において異常低値、リパーゼについては、1例／6例中（16.7％）において異常高値、1例／6例中（16.7％）において異常低値、アミラーゼについては、1例／6例中（16.7％）において異常高値、3例／6例中（50％）において異常低値を示した。 Healthy volunteers showed almost normal values for any tumor marker or pancreatic enzyme. In pancreatic cancer patients, the four types of tumor markers were CA19-9 in 4/6 cases (66.7%), Dupan-2 in 5/6 cases (83.3%), and NCC-ST-439 In 5/6 cases (83.3%), SPan-1 antigen showed abnormally high values in 5/6 cases (83.3%). 5 types of pancreatic enzymes showed abnormally high values in 2/6 cases (33.3%) for elastase, but abnormally high values for PLA2 in 1/6 cases (16.7%), 1/6 Among the cases (16.7%), abnormally low value, for trypsin, 1/6 cases (16.7%) were abnormally high, in 2/6 cases (abnormally low values at 33.3%, for lipase, 1 case / In 6 cases (16.7%), abnormally high value, in 1/6 cases (16.7%), abnormally low value, and amylase in 1/6 cases (16.7%), abnormally high value, in 3/6 cases (50%) showed an abnormally low value.

腫瘍マーカーは、従来、種々のがんを診断する際に使用されており、上記の結果に示すように、膵癌においても高い割合で異常高値を示している。しかし、いずれも膵癌に特異的な腫瘍マーカーではないため、それ単独で膵癌の診断をすることはできない。そのため、臨床では膵臓がんの検出陽性率向上を目的に、腫瘍マーカーと膵酵素の組合せ検査（CA19-9、DUPAN-2、エラスターゼIの組合せなど）が行われている。このうちエラスターゼIの異常高値で膵臓が原がん臓器であることが分かる。 Tumor markers have been used in the past when diagnosing various cancers, and as shown in the above results, they also show abnormally high values at high rates in pancreatic cancer. However, none of them is a tumor marker specific for pancreatic cancer, so it is not possible to diagnose pancreatic cancer alone. Therefore, in combination with tumor markers and pancreatic enzymes (such as a combination of CA19-9, DUPAN-2, and elastase I) has been conducted in clinical practice for the purpose of improving the positive detection rate of pancreatic cancer. Of these, the abnormally high level of elastase I indicates that the pancreas is the primary cancer organ.

膵酵素に関しては、上記の結果に示すように、膵臓がん患者血清3例では膵酵素4種類（フォスフォリパーゼA2、トリプシン、リパーゼ、アミラーゼ）のいずれかが異常低値を示している。膵酵素の異常低値は、膵臓の機能が完全に破綻しているか、手術で完全に提出されている場合になることが知られている。このことから、膵臓がんの検出をするために、該4種類の酵素を用いることは、最適ではないことが示唆される。
一方、膵臓がん患者血清6例における、膵酵素のエラスターゼI陽性率は2例／6例中（33.3%）であるのに対し、遊離RNAのキモトリプシンC(CTRC)、カルボキシペプチダーゼA1(CPA1)、膵コリパーゼ(CLPS)、エラスターゼ2A(ELA2A)、フォスフォリパーゼA2グループ1B(PLA2G1B) mRNA濃度レベルの増加は、いずれも3〜5例／6例中（50〜83.3%）であり、膵酵素のエラスターゼIに比べ高感度であった。本実施例で用いた膵臓がん患者血清は全てかなりの進行がんではあるが、血清、血漿中の遊離mRNA中のキモトリプシンC(CTRC)、カルボキシペプチダーゼA1(CPA1)、膵コリパーゼ(CLPS)、エラスターゼ2A(ELA2A)、フォスフォリパーゼA2グループ1B(PLA2G1B) が既存のバイオマーカーよりも高感度に検出できる特徴を示したものであり、特に、キモトリプシンC、カルボキシペプチダーゼA1、膵コリパーゼmRNAが最も高感度に検出できる特徴を示したものであり、低ステージがんの検出向上につながる可能性がある。 As for the pancreatic enzyme, as shown in the above results, any of the four types of pancreatic enzymes (phospholipase A2, trypsin, lipase, amylase) shows abnormally low values in 3 sera from pancreatic cancer patients. It is known that an abnormally low level of pancreatic enzyme results when the pancreatic function is completely broken or has been submitted completely by surgery. This suggests that it is not optimal to use the four types of enzymes to detect pancreatic cancer.
On the other hand, elastase I positive rate of pancreatic enzyme in 6 patients with pancreatic cancer was 2/6/6 (33.3%), whereas free RNA chymotrypsin C (CTRC), carboxypeptidase A1 (CPA1) , Pancreatic colipase (CLPS), elastase 2A (ELA2A), phospholipase A2 group 1B (PLA2G1B) The increase in mRNA concentration level was 3 to 5 in 6 cases (50 to 83.3%), pancreatic enzymes It was more sensitive than elastase I. The pancreatic cancer patient sera used in this example are all fairly advanced cancers, but serum, chymotrypsin C (CTRC) in free mRNA in plasma, carboxypeptidase A1 (CPA1), pancreatic colipase (CLPS), Elastase 2A (ELA2A) and phospholipase A2 group 1B (PLA2G1B) showed characteristics that can be detected with higher sensitivity than existing biomarkers, with chymotrypsin C, carboxypeptidase A1, and pancreatic colipase mRNA being the highest. It shows the features that can be detected by sensitivity, and may lead to improved detection of low-stage cancer.

また、血清、血漿中に存在する遊離mRNAが、従来のがんの診断に使用される腫瘍マーカーや膵酵素とは異なる新たな特徴があることも判明した。上記に示したように、実施例３において、膵臓がん患者血清3例では膵酵素4種類（フォスフォリパーゼA2、トリプシン、リパーゼ、アミラーゼ）のいずれかが異常低値を示したが、しかしながら、血清中の酵素をコードする遺伝子由来の遊離mRNA 6種類（CLPS、CPA1、CTRC、ELA2A、PLA2G1B、PNLIPRP2）はそれとは逆に異常高値を示した。これは、遊離mRNA中のキモトリプシンC、カルボキシペプチダーゼA1、膵コリパーゼ、ELA2A、PLA2G1B、PNLIPRP2遺伝子由来のmRNAが、血清あるいは血漿中に遊離mRNAとして存在し、健常人と膵臓疾患患者との間で、その濃度の変動するメカニズムが従来の診断に使用される膵酵素の場合とは異なることを示唆しており、遊離mRNAを測定することで、膵臓疾患を異なるイベントで検出できると考えられる。 It has also been found that free mRNA present in serum and plasma has new features that are different from tumor markers and pancreatic enzymes used in conventional cancer diagnosis. As shown above, in Example 3, in three pancreatic cancer patient sera, any of the four types of pancreatic enzymes (phospholipase A2, trypsin, lipase, amylase) showed abnormally low values, however, On the other hand, 6 types of free mRNAs (CLPS, CPA1, CTRC, ELA2A, PLA2G1B, PNLIPRP2) derived from the genes encoding enzymes in serum showed abnormally high values. This is because mRNA derived from chymotrypsin C, carboxypeptidase A1, pancreatic colipase, ELA2A, PLA2G1B, PNLIPRP2 gene in free mRNA is present as free mRNA in serum or plasma, and between healthy people and pancreatic disease patients, This suggests that the mechanism of varying the concentration is different from that of pancreatic enzymes used in conventional diagnosis, and it is considered that pancreatic diseases can be detected at different events by measuring free mRNA.

《実施例４：カルボキシペプチダーゼA1の遊離mRNAの検出に好適なプライマーの選定》
血清あるいは血漿中に遊離しているmRNAは、その遊離のメカニズムが明らかになっていないため、全長で存在しているのか、部分で存在しているのか等、どのようなフォームで存在しているのか不明である。そこで、上記で使用したプライマーで増幅可能であった領域以外に好適な領域があるか否か、複数のプライマーの組合せを設計し、カルボキシペプチダーゼA1（CPA1）の遊離mRNA検出に好適なプライマー配列を選定した。 << Example 4: Selection of suitable primer for detection of free mRNA of carboxypeptidase A1 >>
Since the release mechanism of serum or plasma is not clear, it is present in any form, such as whether it exists in full length or part. It is unknown. Therefore, whether there is a suitable region other than the region that could be amplified with the primers used above, a combination of multiple primers was designed, and a primer sequence suitable for detecting free mRNA of carboxypeptidase A1 (CPA1) Selected.

使用したプライマーは以下の通りである。CPA1遺伝子上のプライマー位置を図１０に示した。
SENSE1、
配列番号１９ : ５’−ＡＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＴ−３’
ANTISENSE1、
配列番号２０ : ５’−ＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＴＣＣＡ−３’
SENSE2、
配列番号２１ : ５’−ＡＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＣＣＴＴ−３’
ANTISENSE2
配列番号２２ : ５’−ＣＣＧＡＧＴＣＴＴＧＣＧＣＣＡＣＡＴ−３’
SENSE3、
配列番号３ : ５’−ＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣ−３’
ANTISENSE3、
配列番号４ : ５’−ＡＴＧＡＴＧＧＴＣＡＧＡＡＧＣＧＣＣＡ−３’ The used primers are as follows. The primer positions on the CPA1 gene are shown in FIG.
SENSE1,
SEQ ID NO: 19: 5′-ACGGCATCAGCTATGAGACCAT-3 ′
ANTISENSE1,
SEQ ID NO: 20: 5'-GCTCCTGCTCTCCTGCTCCA-3 '
SENSE2,
SEQ ID NO: 21: 5′-AACCCTGATGGCTTTGCCTT-3 ′
ANTISENSE2
SEQ ID NO: 22: 5′-CCGAGTCTTGCGCCACAT-3 ′
SENSE3,
SEQ ID NO: 3: 5'-TCCTGCTGCCAGCCCTCC-3 '
ANTISENSE3,
SEQ ID NO: 5: 5′-ATGATGGTCAGAAGCGCCA-3 ′

また、プライマー以外の材料や方法は、実施例３の遊離mRNAの測定と同様に実施した。
その結果を、表３に示す。最左のカラムには検体の情報（膵癌：原発巣、病期、転移。健常人ボランティア）を記した。横のカラムには各プライマーの組合せを示し、縦のカラムには各検体を示し、それぞれの見かけのコピー数を記した。また、基準値（参考値）はリアルタイムPCRにおける検出限界値とした。背景が白いカラムは、基準値以下であり、背景が黒いカラムは、基準値以上を示す。 The materials and methods other than the primers were the same as in the measurement of free mRNA in Example 3.
The results are shown in Table 3. The leftmost column contains information on the specimen (pancreatic cancer: primary lesion, stage, metastasis, healthy volunteers). The horizontal column indicates the combination of each primer, the vertical column indicates each sample, and the apparent number of copies is shown. The reference value (reference value) was the detection limit value in real-time PCR. A column with a white background is below the reference value, and a column with a black background indicates the reference value or more.

健常人ボランティアでは、どの遺伝子に関しても、ほとんど遊離mRNAが検出されなかった。一方、膵臓がん患者血清中の遊離CPA1 mRNAの検出率は、SENSE1とANTISENSE1の組合せでは2例／6例中（33.3%）、SENSE2とANTISENSE2の組合せでは0例／6例中（0 %）、SENSE3とANTISENSE3の組合せでは5例／6例中（83.3%）であり、SENSE3とANTISENSE3組合せが最も優れていた。これは、遊離RNAは完全長のmRNAだけが浮遊しているのではなく、血液中に遊離して存在する間に一部分解を受けたmRNA分解物も存在することを示している。遊離mRNAの種類ごとに好適なプライマー配列は選び出すことで検出感度を高感度にできると考えられた。 In healthy volunteers, almost no free mRNA was detected for any gene. On the other hand, the detection rate of free CPA1 mRNA in the serum of pancreatic cancer patients was 2/6 cases (33.3%) for the combination of SENSE1 and ANTIENSENSE1, and 0/6 cases (0%) for the combination of SENSE2 and ANTIENSENSE2. The combination of SENSE3 and ANTIENSE3 was 5 out of 6 cases (83.3%), and the combination of SENSE3 and ANTIENSE3 was the best. This indicates that not only the full-length mRNA is suspended in the free RNA, but also an mRNA degradation product that has undergone partial degradation while being free in the blood. It was considered that the detection sensitivity could be increased by selecting a suitable primer sequence for each type of free mRNA.

本発明は、膵臓における組織傷害や細胞増殖性疾患の診断の用途に適用することができる。 The present invention can be applied to the use of diagnosis of tissue injury or cell proliferative disease in the pancreas.

ヒト各組織（食道、甲状腺、子宮、乳房、肝臓、脳、肺、精巣、卵巣、腎臓、小腸、結腸、前立腺、膀胱、副腎、胃、血球）及び膵臓（A社：Ambion社、B社：BioChain社、C社：Clontech社、S社：Stratagene社）における膵コリパーゼ (CLPS)のmRNA発現量を示すグラフである。Human tissues (esophagus, thyroid, uterus, breast, liver, brain, lung, testis, ovary, kidney, small intestine, colon, prostate, bladder, adrenal gland, stomach, blood cells) and pancreas (Company A: Ambion, Company B: It is a graph which shows the mRNA expression level of pancreatic colipase (CLPS) in BioChain, C: Clontech, S: Stratagene. ヒト各組織及び膵臓におけるカルボキシペプチダーゼA1 (CPA1)のmRNA発現量を示すグラフである。It is a graph which shows the mRNA expression level of carboxypeptidase A1 (CPA1) in each human tissue and pancreas. ヒト各組織及び膵臓におけるカルボキシペプチダーゼA2 (CPA2)のmRNA発現量を示すグラフである。It is a graph which shows the mRNA expression level of carboxypeptidase A2 (CPA2) in each human tissue and pancreas. ヒト各組織及び膵臓におけるキモトリプシンC (CTRC)のmRNA発現量を示すグラフである。It is a graph which shows the mRNA expression level of chymotrypsin C (CTRC) in each human tissue and pancreas. ヒト各組織及び膵臓におけるエラスターゼ2A (ELA2A)のmRNA発現量を示すグラフである。It is a graph which shows the mRNA expression level of elastase 2A (ELA2A) in each human tissue and pancreas. ヒト各組織及び膵臓におけるエラスターゼ3B (ELA3B)のmRNA発現量を示すグラフである。It is a graph which shows the mRNA expression level of elastase 3B (ELA3B) in each human tissue and pancreas. ヒト各組織及び膵臓におけるフォスフォリパーゼA2グループ1B (PLA2G1B)のmRNA発現量を示すグラフである。It is a graph which shows the mRNA expression level of phospholipase A2 group 1B (PLA2G1B) in each human tissue and pancreas. ヒト各組織及び膵臓における膵リパーゼ (PNLIP)のmRNA発現量を示すグラフである。It is a graph which shows the mRNA expression level of pancreatic lipase (PNLIP) in each human tissue and pancreas. ヒト各組織及び膵臓における膵リパーゼ関連蛋白質2 (PNLIPRP2)のmRNA発現量を示すグラフである。2 is a graph showing the mRNA expression level of pancreatic lipase-related protein 2 (PNLIPRP2) in human tissues and pancreas. カルボキシペプチダーゼA1（CPA1）全長遺伝子上のプライマー（SENSE1、ANTISENSE1、SENSE2、ANTISENSE2、SENSE3、ANTISENSE3）の位置を示す説明図である。It is explanatory drawing which shows the position of the primer (SENSE1, ANTISENSE1, SENSE2, ANTISENSE2, SENSE3, ANTISENSE3) on carboxypeptidase A1 (CPA1) full length gene.

Claims

A method for detecting pancreatic tissue injury or cell proliferative disease, wherein free RNA released in association with the disease is analyzed in serum or plasma collected from a subject suspected of having tissue injury or cell proliferative disease in the pancreas Wherein the free RNA is at least one mRNA selected from chymotrypsin C mRNA, carboxypeptidase A1 mRNA, pancreatic colipase mRNA, elastase 2A mRNA, phospholipase 2 group 1B mRNA, or a fragment thereof. .

The amount of specific free RNA in serum or plasma collected from subjects suspected of having pancreatic tissue injury or cell proliferative disease is greater than the same amount of RNA in serum or plasma collected from healthy individuals. The method of claim 1.

Detection of pancreatic tissue injury or cell proliferative disease is performed by detecting multiple releases of free RNA released with the disease in serum or plasma collected from subjects suspected of having pancreatic tissue injury or cell proliferative disease. The method according to claim 1, wherein the tissue damage or cell proliferative disease state in the pancreas of the subject is monitored from the analysis result.

For detection of free RNA, a combination of a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: A combination of a primer consisting of a base sequence represented by 4 and a combination of a primer consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and a primer consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 6, represented by SEQ ID NO: 7 A combination of a primer consisting of a base sequence and a primer consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 8, a combination of a primer consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a primer consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 10 The method as described in any one of Claims 1-3 using 1 or more types of primer combinations selected from these.

The detection of free RNA is performed by any of the reverse transcription reaction real-time nucleic acid amplification method, the reverse transcription reaction competitive PCR method, the Northern blot method, the microarray method, and the bead array method. The method according to item.

6. The method according to claim 1, further comprising at least means for detecting one or more specific mRNA selected from chymotrypsin C mRNA, carboxypeptidase A1 mRNA, pancreatic colipase mRNA, elastase 2A mRNA, and phospholipase 2 group 1B mRNA. A detection kit for performing the method according to one item.

The detection kit according to claim 6, further comprising a free RNA extraction means.