JP5380174B2 - Fluorescent hydrogel beads and saccharide measurement sensor for implantation in the body using the same - Google Patents
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Description
本発明は、蛍光ハイドロゲルビーズおよびそれを用いた体内埋め込み用の糖類測定用センサーに関する。 The present invention relates to a fluorescent hydrogel bead and a saccharide measurement sensor for implantation in the body using the same.
体内埋め込み型センサーは、様々な疾患においてその病状の経過観察や治療効果のモニタなどに有用であり、近年、盛んに研究されている分野の一つである。特に、糖尿病治療においては、連続血糖測定による血糖コントロールが、病状の進行遅延や合併症の罹病の低減に貢献すると言われている。 Implantable sensors are useful for monitoring the progress of disease states and monitoring therapeutic effects in various diseases, and are one of the fields that have been actively studied in recent years. In particular, in diabetes treatment, blood glucose control by continuous blood glucose measurement is said to contribute to the reduction of disease progression delay and morbidity of complications.
現状の糖尿病患者の多くは、血糖の自己管理のために、指等の穿刺によって血液試料を採取し、血糖計に供給して測定値を読み取ることを行っている。しかし、このような方法は患者への苦痛や簡便性の点で問題があり、一日に数回の測定が限界で、血糖値変化の動向を頻繁に測定して把握することが難しいのが現状である。このような理由から、埋め込み型連続血糖計の有用性は高いと考えられる。 Many current diabetic patients collect blood samples by puncturing their fingers or the like and supply them to a blood glucose meter to read the measured values for self-management of blood glucose. However, this method has problems in terms of pain and convenience for patients, and it is difficult to measure the blood glucose level frequently by measuring it several times a day. Currently. For these reasons, the usefulness of the implantable continuous blood glucose meter is considered high.
一方、生体内のグルコース濃度を継続的に測定するための技術開発は古くからなされており、例えば、可逆的にグルコースと反応して蛍光を発する物質を用いて蛍光量の変化でグルコース濃度を測定するものがある。このような蛍光物質として、特許文献１には、発蛍光性原子団と、少なくとも１つのフェニルボロン酸部位と、少なくとも１つのアミン性窒素とを有し、アミン性窒素がフェニルボロン酸部位の近傍に配置されて該フェニルボロン酸と分子内結合する分子構造を有する発蛍光性化合物が開示されている。また、特許文献２には、水性環境中での検体の濃度検出のための指示高分子として、親水性モノマーとアントラセンホウ酸エステル誘導体などのエキシマー形成多環芳香族炭化水素を有する指示成分モノマーとの共重合体が開示されている。さらに、特許文献３には、蛍光センサーとして、プラスチックフィルムなどの固相に直接蛍光物質を固定化する方法が開示されている。 On the other hand, technological development for continuously measuring the glucose concentration in the living body has been made for a long time. For example, the glucose concentration is measured by changing the amount of fluorescence using a substance that reversibly reacts with glucose and emits fluorescence. There is something to do. As such a fluorescent substance, Patent Document 1 has a fluorescent group, at least one phenylboronic acid moiety, and at least one amine nitrogen, and the amine nitrogen is in the vicinity of the phenylboronic acid moiety. Fluorescent compounds having a molecular structure that is disposed in the molecule and binds intramolecularly to the phenylboronic acid are disclosed. Patent Document 2 discloses an indicator component monomer having an excimer-forming polycyclic aromatic hydrocarbon such as a hydrophilic monomer and an anthracene borate derivative as an indicator polymer for detecting the concentration of an analyte in an aqueous environment. Copolymers are disclosed. Furthermore, Patent Document 3 discloses a method of directly immobilizing a fluorescent substance on a solid phase such as a plastic film as a fluorescent sensor.
しかし、上記特許文献１〜３に記載のセンサー物質は、フィルム形状やシート形状であり、体内に埋め込んで使用する場合、侵襲が少なくないという問題がある。かような問題に対し、特許文献４では、蛍光センサー物質を、シランカップリング剤等を用いて（メタ）アクリルアミド膜等の基材に固定させた糖類測定用センサーが提案されている。 However, the sensor substances described in Patent Documents 1 to 3 have a film shape or a sheet shape, and there is a problem that there is not much invasion when the sensor substance is embedded in the body. For such a problem, Patent Document 4 proposes a saccharide measurement sensor in which a fluorescent sensor substance is fixed to a substrate such as a (meth) acrylamide film using a silane coupling agent or the like.
しかしながら、上記特許文献４に記載の糖類測定用センサーでは、体内へ埋め込む際、皮膚の切開が必要となるため、侵襲をできるだけ抑制するという点で改良の余地があった。 However, the saccharide measurement sensor described in Patent Document 4 requires room for improvement in terms of suppressing invasion as much as possible because it requires incision of the skin when implanted in the body.
そこで、本発明は、グルコースなどの糖類の検出能に優れ、かつ低侵襲性である蛍光ハイドロゲルビーズ、およびそれを用いた体内埋め込み用の糖類測定用センサーを提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a fluorescent hydrogel bead excellent in ability to detect saccharides such as glucose and being minimally invasive, and a saccharide measuring sensor for implantation in the body using the same.
本発明者らは、鋭意研究を積み重ねた結果、蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性モノマーとを共重合させて得られる蛍光ハイドロゲルビーズが、グルコースなどの糖類の検出能に優れており、かつより低侵襲で体内に埋め込むことができることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that fluorescent hydrogel beads obtained by copolymerizing a fluorescent monomer compound and a polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue are excellent in the ability to detect sugars such as glucose. And the present invention has been completed.
本発明による蛍光ハイドロゲルビーズ、およびそれを用いた糖類測定用センサーは、体液中の糖類検出能に優れ、かつ低侵襲的に体内に埋め込むことが可能であるため、長期間の埋め込みに耐える蛍光センサーとなる。 The fluorescent hydrogel beads according to the present invention and the saccharide measurement sensor using the same are excellent in ability to detect saccharides in body fluids and can be embedded in the body in a minimally invasive manner. It becomes.
本発明の第一は、下記化学式１で表される構造を有する、蛍光ハイドロゲルビーズである。 The first of the present invention is a fluorescent hydrogel bead having a structure represented by the following chemical formula 1.
前記化学式１中、Ｘ１およびＸ２は同一または異なっていてもよく、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＨ２ＮＲ−、−ＮＲ−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＲＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＲ−、および−ＣＯ−からなる群より選択される少なくとも１種の置換基を含む炭素数１〜３０の直鎖状または分枝状のアルキレン基であり、この際、Ｒは、水素原子、または置換されているかもしくは非置換の炭素数１〜１０の直鎖状もしくは分枝状のアルキル基である。 In Formula 1, X 1 and X 2 may be the same or different, and —COO—, —OCO—, —CH 2 NR—, —NR—, —NRCO—, —CONR—, —SO 2 NR— , —NRSO 2 —, —O—, —S—, —SS—, —NRCOO—, —OCONR—, and —CO— containing at least one substituent selected from the group consisting of —CO— In which R is a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms. .
炭素数１〜３０の直鎖状または分枝状のアルキレン基の具体的な例としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、ブチレン基、イソブチレン基、ｓｅｃ−ブチレン基、ｔｅｒｔ−ブチレン基、ペンチレン基、イソペンチレン基、ネオペンチレン基、へキシレン基、へプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、デシレン基、ウンデシレン基、ドデシレン基、トリデシレン基、テトラデシレン基、ペンタデシレン基、ヘキサデシレン基、ヘプタデシレン基、オクタデシレン基、ノナデシレン基、エイコシレン基、ヘンイコシレン基、ドコシレン基、トリコシレン基、テトラコシレン基、ペンタコシレン基、ヘキサコシレン基、ヘプタコシレン基、オクタコシレン基、ノナコシレン基、またはトリアコンチレン基などが挙げられる。好ましくは、炭素数３〜１２のアルキレン基であり、より好ましくはプロピレン基、ヘキシレン基、またはオクチレン基である。 Specific examples of the linear or branched alkylene group having 1 to 30 carbon atoms include, for example, a methylene group, an ethylene group, a propylene group, an isopropylene group, a butylene group, an isobutylene group, a sec-butylene group, tert-butylene group, pentylene group, isopentylene group, neopentylene group, hexylene group, heptylene group, octylene group, nonylene group, decylene group, undecylene group, dodecylene group, tridecylene group, tetradecylene group, pentadecylene group, hexadecylene group, heptadecylene group Group, octadecylene group, nonadecylene group, eicosylene group, heicosylene group, docosylene group, tricosylene group, tetracosylene group, pentacosylene group, hexacosylene group, heptacosylene group, octacosylene group, nonacosylene group, or triacontylene group Etc., and the like. Preferably, it is a C3-C12 alkylene group, More preferably, they are a propylene group, a hexylene group, or an octylene group.
前記アルキレン基に含まれる置換基は、アルキレン基の末端に位置してもよいし、アルキレン基の内部に位置してもよい。好ましい置換基は、−ＮＲＣＯ−または−ＣＯＮＲ−である。Ｒは、水素原子または炭素数１〜１０の直鎖状もしくは分枝状のアルキル基であり、より好ましくは水素原子である。 The substituent contained in the alkylene group may be located at the end of the alkylene group or may be located inside the alkylene group. A preferred substituent is —NRCO— or —CONR—. R is a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, more preferably a hydrogen atom.
Ｒで用いられうる炭素数１〜１０の直鎖状または分枝状のアルキル基の具体的な例としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉｓｏ−アミル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−へキシル基、３−メチルペンタン−２−イル基、３−メチルペンタン−３−イル基、４−メチルペンチル基、４−メチルペンタン−２−イル基、１，３−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブタン−２−イル基、ｎ−ヘプチル基、１−メチルヘキシル基、３−メチルヘキシル基、４−メチルヘキシル基、５−メチルヘキシル基、１−エチルペンチル基、１−（ｎ−プロピル）ブチル基、１，１−ジメチルペンチル基、１，４−ジメチルペンチル基、１，１−ジエチルプロピル基、１，３，３−トリメチルブチル基、１−エチル−２，２−ジメチルプロピル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、２−メチルヘキサン−２−イル基、２，４−ジメチルペンタン−３−イル基、１，１−ジメチルペンタン−１−イル基、２，２−ジメチルヘキサン−３−イル基、２，３−ジメチルヘキサン−２−イル基、２，５−ジメチルヘキサン−２−イル基、２，５−ジメチルヘキサン−３−イル基、３，４−ジメチルヘキサン−３−イル基、３，５−ジメチルヘキサン−３−イル基、１−メチルヘプチル基、２−メチルヘプチル基、５−メチルヘプチル基、２−メチルヘプタン−２−イル基、３−メチルヘプタン−３−イル基、４−メチルヘプタン−３−イル基、４−メチルヘプタン−４−イル基、１−エチルヘキシル基、２−エチルヘキシル基、１−プロピルペンチル基、２−プロピルペンチル基、１，１−ジメチルヘキシル基、１，４−ジメチルヘキシル基、１，５−ジメチルヘキシル基、１−エチル−１−メチルペンチル基、１−エチル−４−メチルペンチル基、１，１，４−トリメチルペンチル基、２，４，４−トリメチルペンチル基、１−イソプロピル−１，２−ジメチルプロピル基、１，１，３，３−テトラメチルブチル基、ｎ−ノニル基、１−メチルオクチル基、６−メチルオクチル基、１−エチルヘプチル基、１−（ｎ−ブチル）ペンチル基、４−メチル−１−（ｎ−プロピル）ペンチル基、１，５，５−トリメチルヘキシル基、１，１，５−トリメチルヘキシル基、２−メチルオクタン−３−イル基、ｎ−デシル基、１−メチルノニル基、１−エチルオクチル基、１−（ｎ−ブチル）ヘキシル基、１，１−ジメチルオクチル基、または３，７−ジメチルオクチル基などが挙げられる。より好ましくは炭素数１〜５の直鎖状または分枝状のアルキル基である。 Specific examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms that can be used for R include, for example, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, Isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, iso-amyl group, tert-pentyl group, neopentyl group, n-hexyl group, 3-methylpentan-2-yl group, 3-methyl Pentan-3-yl group, 4-methylpentyl group, 4-methylpentan-2-yl group, 1,3-dimethylbutyl group, 3,3-dimethylbutyl group, 3,3-dimethylbutan-2-yl group N-heptyl group, 1-methylhexyl group, 3-methylhexyl group, 4-methylhexyl group, 5-methylhexyl group, 1-ethylpentyl group, 1- (n-propyl) butyl group, 1,1 Dimethylpentyl group, 1,4-dimethylpentyl group, 1,1-diethylpropyl group, 1,3,3-trimethylbutyl group, 1-ethyl-2,2-dimethylpropyl group, n-octyl group, 2-ethylhexyl Group, 2-methylhexan-2-yl group, 2,4-dimethylpentan-3-yl group, 1,1-dimethylpentan-1-yl group, 2,2-dimethylhexane-3-yl group, 2, 3-dimethylhexane-2-yl group, 2,5-dimethylhexane-2-yl group, 2,5-dimethylhexane-3-yl group, 3,4-dimethylhexane-3-yl group, 3,5- Dimethylhexane-3-yl group, 1-methylheptyl group, 2-methylheptyl group, 5-methylheptyl group, 2-methylheptan-2-yl group, 3-methylheptan-3-yl group, 4-methylheptyl group Tan-3-yl group, 4-methylheptan-4-yl group, 1-ethylhexyl group, 2-ethylhexyl group, 1-propylpentyl group, 2-propylpentyl group, 1,1-dimethylhexyl group, 1,4 -Dimethylhexyl group, 1,5-dimethylhexyl group, 1-ethyl-1-methylpentyl group, 1-ethyl-4-methylpentyl group, 1,1,4-trimethylpentyl group, 2,4,4-trimethyl Pentyl group, 1-isopropyl-1,2-dimethylpropyl group, 1,1,3,3-tetramethylbutyl group, n-nonyl group, 1-methyloctyl group, 6-methyloctyl group, 1-ethylheptyl group 1- (n-butyl) pentyl group, 4-methyl-1- (n-propyl) pentyl group, 1,5,5-trimethylhexyl group, 1,1,5-trimethylhexyl group , 2-methyloctane-3-yl group, n-decyl group, 1-methylnonyl group, 1-ethyloctyl group, 1- (n-butyl) hexyl group, 1,1-dimethyloctyl group, or 3,7- A dimethyloctyl group etc. are mentioned. More preferably, it is a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
前記化学式１中、Ｚ１およびＺ２は同一または異なっていてもよく、−Ｏ−または−ＮＲ’−であり、この際、Ｒ’は水素原子または置換されているかもしくは非置換の炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｚ１およびＺ２としては、−Ｏ−がより好ましい。 In Formula 1, Z 1 and Z 2 may be the same or different and are —O— or —NR′—, wherein R ′ is a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted carbon number of 1 -10 alkyl groups. Z 1 and Z 2 are more preferably —O—.
Ｒ’で用いられうる炭素数１〜１０の直鎖状または分枝状のアルキル基の具体的な例は、上記と同様であるので、ここでは説明を省略する。より好ましくは炭素数１〜５の直鎖状もしくは分枝状のアルキル基である。 Specific examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms that can be used for R ′ are the same as described above, and thus the description thereof is omitted here. More preferably, it is a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
Ｑ、Ｑ’、Ｑ’’、Ｑ’’’は同一または異なっていてもよく、水素原子、ヒドロキシ基、置換されているかもしくは非置換の炭素数１〜１０の直鎖状もしくは分枝状のアルキル基、炭素数２〜１１のアシル基、置換されているかもしくは非置換の炭素数１〜１０の直鎖状もしくは分枝状のアルコキシ基、ハロゲン原子を含む基、カルボキシル基、カルボン酸エステル基、カルボン酸アミド基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、または炭素数１〜１０のアルキルアミノ基である。 Q, Q ′, Q ″ and Q ′ ″ may be the same or different, and are a hydrogen atom, a hydroxy group, a substituted or unsubstituted C 1-10 linear or branched An alkyl group, an acyl group having 2 to 11 carbon atoms, a substituted or unsubstituted linear or branched alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms, a group containing a halogen atom, a carboxyl group, a carboxylic acid ester group , A carboxylic acid amide group, a cyano group, a nitro group, an amino group, or an alkylamino group having 1 to 10 carbon atoms.
炭素数１〜１０の直鎖状または分枝状のアルキル基の具体的な例は、上記と同様であるので、ここでは説明を省略する。 Specific examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms are the same as described above, and thus the description thereof is omitted here.
炭素数２〜１１のアシル基は、下記化学式２で表される基であることが好ましい。 The acyl group having 2 to 11 carbon atoms is preferably a group represented by the following chemical formula 2.
前記化学式２中、Ｌは置換されているかまたは非置換の炭素数１〜１０の直鎖状または分枝状のアルキル基である。 In Chemical Formula 2, L is a substituted or unsubstituted linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
炭素数２〜１１のアシル基の例としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、またはイソバレリル基などが挙げられる。前記化学式２中のＬのアルキル基の炭素数は、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１（すなわちアセチル基）である。アントラセン残基にアシル基を導入することにより、励起波長と極大蛍光波長との間隔が拡大するという効果が得られる。 Examples of the acyl group having 2 to 11 carbon atoms include an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyryl group, a valeryl group, and an isovaleryl group. The number of carbon atoms of the L alkyl group in the chemical formula 2 is preferably 1 to 4, more preferably 1 (that is, an acetyl group). By introducing an acyl group into the anthracene residue, an effect of increasing the interval between the excitation wavelength and the maximum fluorescence wavelength can be obtained.
炭素数１〜１０の直鎖状または分枝状のアルコキシ基の例としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、１，２−ジメチル−プロポキシ基、ｎ−へキシルオキシ基、３−メチルペンタン−２−イルオキシ基、３−メチルペンタン−３−イルオキシ基、４−メチルペンチルオキシ基、４−メチルペンタン−２−イルオキシ基、１，３−ジメチルブチルオキシ基、３，３−ジメチルブチルオキシ基、３，３−ジメチルブタン−２−イルオキシ基、ｎ−ヘプチルオキシ基、１−メチルヘキシルオキシ基、３−メチルヘキシルオキシ基、４−メチルヘキシルオキシ基、５−メチルヘキシルオキシ基、１−エチルペンチルオキシ基、１−（ｎ−プロピル）ブチルオキシ基、１，１−ジメチルペンチルオキシ基、１，４−ジメチルペンチルオキシ基、１，１−ジエチルプロピルオキシ基、１，３，３−トリメチルブチルオキシ基、１−エチル−２，２−ジメチルプロピルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、２−エチルヘキシルオキシ基、２−メチルヘキサン−２−イルオキシ基、２，４−ジメチルペンタン−３−イルオキシ基、１，１−ジメチルペンタン−１−イルオキシ基、２，２−ジメチルヘキサン−３−イルオキシ基、２，３−ジメチルヘキサン−２−イルオキシ基、２，５−ジメチルヘキサン−２−イルオキシオキシ基、２，５−ジメチルヘキサン−３−イルオキシ基、３，４−ジメチルヘキサン−３−イルオキシ基、３，５−ジメチルヘキサン−３−イルオキシ基、１−メチルヘプチルオキシ基、２−メチルヘプチルオキシ基、５−メチルヘプチルオキシ基、２−メチルヘプタン−２−イルオキシ基、３−メチルヘプタン−３−イルオキシ基、４−メチルヘプタン−３−イルオキシ基、４−メチルヘプタン−４−イルオキシ基、１−エチルヘキシルオキシ基、２−エチルヘキシルオキシ基、１−プロピルペンチルオキシ基、２−プロピルペンチルオキシ基、１，１−ジメチルヘキシルオキシ基、１，４−ジメチルヘキシルオキシ基、１，５−ジメチルヘキシルオキシ基、１−エチル−１−メチルペンチルオキシ基、１−エチル−４−メチルペンチルオキシ基、１，１，４−トリメチルペンチルオキシ基、２，４，４−トリメチルペンチルオキシ基、１−イソプロピル−１，２−ジメチルプロピルオキシ基、１，１，３，３−テトラメチルブチルオキシ基、ｎ−ノニルオキシ基、１−メチルオクチルオキシ基、６−メチルオクチルオキシ基、１−エチルヘプチルオキシ基、１−（ｎ−ブチル）ペンチルオキシ基、４−メチル−１−（ｎ−プロピル）ペンチルオキシ基、１，５，５−トリメチルヘキシルオキシ基、１，１，５−トリメチルヘキシルオキシ基、２−メチルオクタン−３−イルオキシ基、ｎ−デシルオキシ基、１−メチルノニルオキシ基、１−エチルオクチルオキシ基、１−（ｎ−ブチル）ヘキシルオキシ基、１，１−ジメチルオクチルオキシ基、または３，７−ジメチルオクチルオキシ基などが挙げられる。 Examples of the linear or branched alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms include, for example, a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an isopropoxy group, an n-butoxy group, an isobutoxy group, and a sec-butoxy group. Tert-butoxy group, n-pentyloxy group, isopentyloxy group, neopentyloxy group, 1,2-dimethyl-propoxy group, n-hexyloxy group, 3-methylpentan-2-yloxy group, 3-methyl Pentane-3-yloxy group, 4-methylpentyloxy group, 4-methylpentan-2-yloxy group, 1,3-dimethylbutyloxy group, 3,3-dimethylbutyloxy group, 3,3-dimethylbutane-2 -Yloxy group, n-heptyloxy group, 1-methylhexyloxy group, 3-methylhexyloxy group, 4-methylhexyl Oxy group, 5-methylhexyloxy group, 1-ethylpentyloxy group, 1- (n-propyl) butyloxy group, 1,1-dimethylpentyloxy group, 1,4-dimethylpentyloxy group, 1,1-diethyl Propyloxy group, 1,3,3-trimethylbutyloxy group, 1-ethyl-2,2-dimethylpropyloxy group, n-octyloxy group, 2-ethylhexyloxy group, 2-methylhexane-2-yloxy group, 2,4-dimethylpentan-3-yloxy group, 1,1-dimethylpentan-1-yloxy group, 2,2-dimethylhexane-3-yloxy group, 2,3-dimethylhexane-2-yloxy group, 2, 5-dimethylhexane-2-yloxyoxy group, 2,5-dimethylhexane-3-yloxy group, 3,4-dimethyl San-3-yloxy group, 3,5-dimethylhexane-3-yloxy group, 1-methylheptyloxy group, 2-methylheptyloxy group, 5-methylheptyloxy group, 2-methylheptan-2-yloxy group, 3-methylheptane-3-yloxy group, 4-methylheptane-3-yloxy group, 4-methylheptan-4-yloxy group, 1-ethylhexyloxy group, 2-ethylhexyloxy group, 1-propylpentyloxy group, 2 -Propylpentyloxy group, 1,1-dimethylhexyloxy group, 1,4-dimethylhexyloxy group, 1,5-dimethylhexyloxy group, 1-ethyl-1-methylpentyloxy group, 1-ethyl-4- Methylpentyloxy group, 1,1,4-trimethylpentyloxy group, 2,4,4-trimethylpe Nyloxy group, 1-isopropyl-1,2-dimethylpropyloxy group, 1,1,3,3-tetramethylbutyloxy group, n-nonyloxy group, 1-methyloctyloxy group, 6-methyloctyloxy group, 1 -Ethyl heptyloxy group, 1- (n-butyl) pentyloxy group, 4-methyl-1- (n-propyl) pentyloxy group, 1,5,5-trimethylhexyloxy group, 1,1,5-trimethyl Hexyloxy group, 2-methyloctane-3-yloxy group, n-decyloxy group, 1-methylnonyloxy group, 1-ethyloctyloxy group, 1- (n-butyl) hexyloxy group, 1,1-dimethyloctyl Examples thereof include an oxy group and a 3,7-dimethyloctyloxy group.
ハロゲン原子を含む基の例としては、例えば、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、またはＯＩ−（ヨードオキシ基）などが挙げられる。 Examples of the group containing a halogen atom include F-, Cl-, Br-, I-, or OI- (iodooxy group).
炭素数１〜１０のアルキルアミノ基の例としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、ｎ−ペンチルアミノ基、ｎ−ヘキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基、ｎ−デシルアミノ基、またはｎ−イソアミルアミノ基などが挙げられる。 Examples of the alkylamino group having 1 to 10 carbon atoms include, for example, methylamino group, ethylamino group, n-propylamino group, isopropylamino group, n-butylamino group, n-pentylamino group, and n-hexylamino. Group, n-octylamino group, n-decylamino group, n-isoamylamino group and the like.
また、ＱおよびＱ’ならびにＱ’’およびＱ’’’の少なくとも一方は、互いに結合して芳香環または複素環を形成してもよい。前記芳香環の例としては、例えば、ベンゼン環が挙げられる。また、前記複素環の例としては、例えば、ピラゾール環、ピロール環、フラン環、チオフェン環、イミダゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、ピリジン環、ピラジン環、ピリミジン環、ピリダジン環などが挙げられる。 Further, at least one of Q and Q 'and Q "and Q"' may be bonded to each other to form an aromatic ring or a heterocyclic ring. Examples of the aromatic ring include a benzene ring. Examples of the heterocyclic ring include, for example, pyrazole ring, pyrrole ring, furan ring, thiophene ring, imidazole ring, thiazole ring, isothiazole ring, oxazole ring, isoxazole ring, pyridine ring, pyrazine ring, pyrimidine ring, Examples include pyridazine ring.
Ｑ、Ｑ’、Ｑ’’、Ｑ’’’の少なくとも１つに、ニトロ基、シアノ基またはアシル基を導入すると、蛍光の赤色変移または励起波長ピークと蛍光波長ピークとの間隔の拡大に寄与する場合があり、好ましい。 When at least one of Q, Q ′, Q ″, and Q ′ ″ introduces a nitro group, a cyano group, or an acyl group, it contributes to the red transition of fluorescence or the increase in the interval between the excitation wavelength peak and the fluorescence wavelength peak. May be preferable.
本発明においては、Ｑ、Ｑ’、Ｑ’’、およびＱ’’’のうちの少なくとも１つが、ニトロ基、シアノ基、または前記化学式２で表される炭素数２〜１１のアシル基であることが好ましく、ニトロ基、シアノ基、またはアセチル基であることがより好ましく、アセチル基がさらに好ましい。なお、Ｑ、Ｑ’、Ｑ’’、およびＱ’’’のうちの１〜３個が上記置換基で置換されていることが好ましく、より好ましくは１〜２個であり、さらに好ましくは１個である。 In the present invention, at least one of Q, Q ′, Q ″, and Q ′ ″ is a nitro group, a cyano group, or an acyl group having 2 to 11 carbon atoms represented by Formula 2 above. It is preferably a nitro group, a cyano group or an acetyl group, more preferably an acetyl group. In addition, it is preferable that 1-3 of Q, Q ′, Q ″, and Q ′ ″ are substituted with the above substituents, more preferably 1 to 2, and even more preferably 1 It is a piece.
Ｙ１およびＹ２は、同一または異なっていてもよく、置換されていてもよい２価の有機残基である。Ｙ１およびＹ２は、蛍光モノマー化合物を水溶性にできる程度の親水性を有することが好ましい。ここで、蛍光モノマー化合物を水溶性にできる程度の親水性とは、有機溶媒や可溶化剤の存在無しに、蛍光モノマー化合物を重合するために必要な濃度領域において、水に溶解することを意味する。Ｙ１およびＹ２で用いられる基の具体的な例としては、例えば、アミノ基、カルボニルオキシ基、あるいは、スルホン酸基、ニトロ基、アミノ基、リン酸基、またはヒドロキシ基などの親水性基を有する二価の有機残基や、構造中にエーテル結合、アミド結合、またはエステル結合などの親水性結合を有する二価の有機残基が例示できる。 Y 1 and Y 2 may be the same or different and may be a divalent organic residue which may be substituted. Y 1 and Y 2 preferably have such hydrophilicity that the fluorescent monomer compound can be rendered water-soluble. Here, hydrophilicity to the extent that the fluorescent monomer compound can be made water-soluble means that it dissolves in water in the concentration range necessary for polymerizing the fluorescent monomer compound without the presence of an organic solvent or solubilizer. To do. Specific examples of the group used for Y 1 and Y 2 include, for example, an amino group, a carbonyloxy group, or a hydrophilic group such as a sulfonic acid group, a nitro group, an amino group, a phosphoric acid group, or a hydroxy group. And a divalent organic residue having a hydrophilic bond such as an ether bond, an amide bond, or an ester bond in the structure.
Ｙ１およびＹ２の少なくとも一方は、下記化学式３または下記化学式４で表される基を含むことが好ましい。また、Ｙ１およびＹ２の少なくとも一方が、下記化学式３で表される基および下記化学式４で表される基の両方を含んでいてもよく、この際、下記化学式３で表される基および下記化学式４で表される基の配置は、ブロック状でも良いし、ランダム状であってもよい。さらに、他の前記置換基や２価の有機残基を有していてもよい。 At least one of Y 1 and Y 2 preferably contains a group represented by the following chemical formula 3 or the following chemical formula 4. Further, at least one of Y 1 and Y 2 may contain both a group represented by the following chemical formula 3 and a group represented by the following chemical formula 4, and in this case, a group represented by the following chemical formula 3 and The arrangement of the group represented by the following chemical formula 4 may be a block shape or a random shape. Furthermore, you may have another said substituent and a bivalent organic residue.
前記化学式３および前記化学式４中、ｎは２〜５であり、好ましくは２〜４、より好ましくは２または３である。また、ｊは１〜５であり、好ましくは１〜３、より好ましくは１である。さらに、ｍは１〜２００であり、好ましくは２０〜１５０、より好ましくは４０〜１２０である。なお、前記化学式３および前記化学式４中の＊は結合点を表す。 In the chemical formula 3 and the chemical formula 4, n is 2 to 5, preferably 2 to 4, more preferably 2 or 3. Moreover, j is 1-5, Preferably it is 1-3, More preferably, it is 1. Furthermore, m is 1 to 200, preferably 20 to 150, and more preferably 40 to 120. In addition, * in the said Chemical formula 3 and the said Chemical formula 4 represents a bonding point.
Ｙ１およびＹ２部分の分子量は、５００〜１０，０００が好ましく、１，０００〜５，０００がより好ましい。前記化学式２または前記化学式３で表される２価の有機残基は、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールなどのアルキレングリコール、またはビニルアルコールなどを重合することにより、形成することができる。 The molecular weight of the Y 1 and Y 2 moieties is preferably 500 to 10,000, and more preferably 1,000 to 5,000. The divalent organic residue represented by the chemical formula 2 or the chemical formula 3 can be formed, for example, by polymerizing alkylene glycol such as ethylene glycol or propylene glycol, or vinyl alcohol.
Ａ１およびＡ２は同一または異なっていてもよく、水素原子またはメチル基である。 A 1 and A 2 may be the same or different and are a hydrogen atom or a methyl group.
Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３およびＵ４は同一または異なっていてもよく、水素原子、または置換されているかもしくは非置換の炭素数１〜１０の直鎖状もしくは分枝状のアルキル基である。 U 1 , U 2 , U 3 and U 4 may be the same or different and are a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms. .
なお、本明細書において、「置換されているかまたは（もしくは）非置換の」との記載は、フッ素原子；塩素原子；臭素原子；シアノ基；ニトロ基；ヒドロキシ基；炭素数１〜１０の直鎖状もしくは分枝状のアルキル基；炭素数１〜１０の直鎖状もしくは分岐状のアルコキシ基；炭素数６〜３０のアリール基；炭素数２〜３０のヘテロアリール基；炭素数５〜２０のシクロアルキル基；などの置換基で置換されているか、または非置換であることを意味する。 In the present specification, the description of “substituted or (or) unsubstituted” means a fluorine atom; a chlorine atom; a bromine atom; a cyano group; a nitro group; a hydroxy group; A linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms; an aryl group having 6 to 30 carbon atoms; a heteroaryl group having 2 to 30 carbon atoms; It is substituted with a substituent such as cycloalkyl group; or unsubstituted.
ｐ１とｑ１とのモル比（ｐ１：ｑ１）およびｐ２とｑ２とのモル比（ｐ２：ｑ２）は、１：５０〜１：６，０００であり、好ましくは１：５０〜１：４，０００であり、より好ましくは１：１００〜１：２，０００である。モル比１：５０よりも蛍光モノマー化合物の割合が大きくなると、蛍光モノマー化合物の嵩高さのため自由度が失われ、糖類との相互作用が低下する虞がある。一方、モル比１：６，０００よりも蛍光モノマー化合物の割合が小さければ、蛍光強度の絶対量を確保できない場合がある。 The molar ratio between p1 and q1 (p1: q1) and the molar ratio between p2 and q2 (p2: q2) is 1:50 to 1: 6,000, preferably 1:50 to 1: 4,000. And more preferably 1: 100 to 1: 2,000. When the ratio of the fluorescent monomer compound is larger than the molar ratio 1:50, the degree of freedom is lost due to the bulkiness of the fluorescent monomer compound, and the interaction with the saccharide may be reduced. On the other hand, if the ratio of the fluorescent monomer compound is smaller than the molar ratio 1: 6,000, the absolute amount of fluorescence intensity may not be ensured.
上述したように、本発明の蛍光ハイドロゲルビーズの構造中、二価の有機残基Ｙ１およびＹ２は親水性を有することが好ましい。これにより、具体的には、以下のような効果が得られる。（１）蛍光モノマー化合物が水溶性となるため、蛍光ハイドロゲルビーズを形成する際の重合反応を効率良く行うことができる。（２）親水性鎖の導入は被検出物質と相互作用するフェニルボロン酸周辺の環境や運動性を変化させ、感度、精度、応答速度、被測定物質である糖類の選択性の向上に寄与する。（３）親水性鎖が蛍光ハイドロゲルビーズ全体の構造を安定化させる。（４）水中でのみ反応が行えるため、有機溶剤中に懸濁した状態で重合を行うことができる。 As described above, in the structure of the fluorescent hydrogel beads of the present invention, the divalent organic residues Y 1 and Y 2 are preferably hydrophilic. Thereby, specifically, the following effects can be obtained. (1) Since the fluorescent monomer compound becomes water-soluble, the polymerization reaction when forming the fluorescent hydrogel beads can be performed efficiently. (2) Introduction of a hydrophilic chain changes the environment and motility around phenylboronic acid that interacts with the substance to be detected, contributing to improved sensitivity, accuracy, response speed, and selectivity of the saccharide as the substance to be measured. . (3) The hydrophilic chain stabilizes the entire structure of the fluorescent hydrogel beads. (4) Since the reaction can be performed only in water, the polymerization can be performed in a state suspended in an organic solvent.
上記化学式１で表される構造を有する蛍光ハイドロゲルビーズの重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるポリエチレンオキサイド換算で、５０，０００〜７５０，０００であることが好ましく、１５０，０００〜４５０，０００であることがより好ましい。 The weight average molecular weight of the fluorescent hydrogel beads having the structure represented by the chemical formula 1 is preferably 50,000 to 750,000 in terms of polyethylene oxide by gel permeation chromatography (GPC), and preferably 150,000 to 450. Is more preferable.
本発明の蛍光ハイドロゲルビーズの製造方法は、特に制限されないが、例えば、蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性モノマーとを含む水溶液を用いて水溶液滴を作製する工程と、前記水溶液滴を重合し蛍光ハイドロゲルビーズを製造する工程と、を含む製造方法が挙げられる。 The method for producing the fluorescent hydrogel beads of the present invention is not particularly limited. For example, a step of preparing aqueous solution droplets using an aqueous solution containing a fluorescent monomer compound and a polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue; and the aqueous solution And a step of polymerizing droplets to produce fluorescent hydrogel beads.
前記蛍光モノマー化合物は、下記化学式５で表される構造を有することが好ましい。 The fluorescent monomer compound preferably has a structure represented by the following chemical formula 5.
前記化学式５中、Ｘ１、Ｘ２、Ｚ１、Ｚ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｑ、Ｑ’、Ｑ’’、およびＱ’’’は、前記化学式１と同様の定義である。 In Formula 5, X 1 , X 2 , Z 1 , Z 2 , Y 1 , Y 2 , Q, Q ′, Q ″, and Q ′ ″ are the same definitions as in Formula 1.
このうち、前記蛍光モノマー化合物として好ましい化合物である、９，１０−ビス［［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［６−［（アクリロイルポリオキシエチレン）カルボニルアミノ］ヘキシル］アミノ］メチル］−２−アセチルアントラセン（上記化学式５のＸ１およびＸ２が−Ｃ６Ｈ１２−ＮＨＣＯ−、Ｙ１およびＹ２が上記化学式３のｎが２であるポリエチレングリコール残基、Ｚ１およびＺ２が−Ｏ−、Ｑがアセチル基、Ｑ’、Ｑ’’、およびＱ’’’が水素原子である化合物：以下、単に「Ｆ−ＰＥＧ−ＡＡｍ」とも称する）の製造方法を、下記反応式１を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限されるものではない。 Of these, 9,10-bis [[N- (2-boronobenzyl) -N- [6-[(acryloylpolyoxyethylene) carbonylamino] hexyl] amino] methyl]-, which is a preferable compound as the fluorescent monomer compound. 2-acetylanthracene (X 1 and X 2 in Chemical Formula 5 are —C 6 H 12 —NHCO—, Y 1 and Y 2 are polyethylene glycol residues in which Chemical Formula 3 n is 2, Z 1 and Z 2 are -O-, a compound in which Q is an acetyl group, Q ′, Q ″, and Q ′ ″ are hydrogen atoms (hereinafter also simply referred to as “F-PEG-AAm”) is represented by the following reaction formula 1 Will be described with reference to FIG. However, the present invention is not limited to this.
原料として２−アセチル−９，１０−ジメチルアントラセン（上記反応式１中のＩ）を用い、四塩化炭素（ＣＣｌ４）／クロロホルム混合溶媒を加熱して、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）および過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）と反応させることにより、２−アセチル−９，１０−ビス（ブロモメチレン）アントラセン（上記反応式１中のＩＩ）が得られる。次いで、これを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の溶媒中で、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）等の塩基存在下、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−ヘキシルジアミン（上記反応式１中のＩＩＩ）を反応させると、ブロモメチレン基が［（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシルアミノ］メチレン基（上記反応式１中のＩＶ）となる。これを、ＤＭＦ等の溶媒中で、ＤＩＥＡ等の塩基存在下、２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサボナリン（上記反応式１中のＶ）を作用させると、９，１０−ビス［［Ｎ−６’−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシル−Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノ］メチル］−２−アセチルアントラセン（上記反応式１中のＶＩ）が得られる。これに、塩酸等の酸を作用させて脱保護すると、９，１０−ビス［［Ｎ−（６’−アミノヘキシル）−Ｎ−（２−ボロノベンジル）アミノ］メチル］−２−アセチルアントラセン（上記反応式１中のＶＩＩ）が得られる。次に、アクリロイル−（ポリエチレングリコール）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、塩基性緩衝液中で反応させると、目的物であるＦ−ＰＥＧ−ＡＡｍを得ることができる。 Using 2-acetyl-9,10-dimethylanthracene (I in the above reaction formula 1) as a raw material, heating a carbon tetrachloride (CCl 4 ) / chloroform mixed solvent, N-bromosuccinimide (NBS) and peroxide By reacting with benzoyl (BPO), 2-acetyl-9,10-bis (bromomethylene) anthracene (II in the above reaction scheme 1) is obtained. Then, this is reacted with N- (t-butoxycarbonyl) -hexyldiamine (III in the above reaction scheme 1 in the presence of a base such as diisopropylethylamine (DIEA) in a solvent such as N, N-dimethylformamide (DMF). ), The bromomethylene group becomes a [(t-butoxycarbonylamino) hexylamino] methylene group (IV in the above reaction scheme 1). When this is reacted with 2- (2-bromomethylphenyl) -1,3-dioxabonarine (V in the above reaction formula 1) in the presence of a base such as DIEA in a solvent such as DMF, 9,10- Bis [[N-6 ′-(t-butoxycarbonylamino) hexyl-N- [2- (5,5-dimethylborinan-2-yl) benzyl] amino] methyl] -2-acetylanthracene (the above reaction formula VI) in 1 is obtained. When this was deprotected by the action of an acid such as hydrochloric acid, 9,10-bis [[N- (6′-aminohexyl) -N- (2-boronobenzyl) amino] methyl] -2-acetylanthracene (above VII) in scheme 1 is obtained. Next, when acryloyl- (polyethylene glycol) -N-hydroxysuccinimide ester is reacted in a basic buffer, F-PEG-AAm, which is the target product, can be obtained.
なお、原料化合物として、アントラセン骨格にアセチル基以外のアシル基を有する化合物を使用すると、溶媒、添加剤、反応温度、反応時間および分離方法等を適宜選択することで、アントラセン骨格にアセチル基以外のアシル基を有する化合物を製造することができる。 When a compound having an acyl group other than an acetyl group in the anthracene skeleton is used as the raw material compound, the anthracene skeleton other than the acetyl group can be selected by appropriately selecting a solvent, an additive, a reaction temperature, a reaction time, a separation method, and the like. A compound having an acyl group can be produced.
（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性モノマーとしては、得られた重合体がその構造中に（メタ）アクリロイル基とアミドとを有すればよく、（メタ）アクリルアミドまたはその誘導体が好ましい。具体的な例としては、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｔｒｉｓ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、またはＮ−（ｎ−ブトキシメチル）アクリルアミドなどが挙げられる。また、Ｎ−アクリロイルリジン、Ｎ−アクリロイルヘキサメチレンジアミンなどの（メタ）アクリロイルクロライドとアミノ酸または活性アミノ基を有する化合物との縮合体も用いることができる。より好ましくは、アクリルアミドまたはメタクリルアミドである。 As the polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue, the obtained polymer may have a (meth) acryloyl group and an amide in its structure, and (meth) acrylamide or a derivative thereof is preferable. Specific examples include, for example, acrylamide, methacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-tert-butylacrylamide, N-tris-hydroxymethylacrylamide, N-hydroxymethylacrylamide, or N- (N-butoxymethyl) acrylamide and the like can be mentioned. Moreover, the condensate of (meth) acryloyl chloride, such as N-acryloyl lysine and N-acryloyl hexamethylene diamine, and the compound which has an amino acid or an active amino group can also be used. More preferred is acrylamide or methacrylamide.
前記蛍光モノマー化合物の水溶液中の濃度は、１〜３０質量％であることが好ましく、２〜１０質量％であることがより好ましい。また、前記（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性モノマーの水溶液中の濃度は、５〜５０質量％であることが好ましく、１０〜２０質量％であることがより好ましい。 The concentration of the fluorescent monomer compound in the aqueous solution is preferably 1 to 30% by mass, and more preferably 2 to 10% by mass. Moreover, it is preferable that the density | concentration in the aqueous solution of the polymerizable monomer containing the said (meth) acrylamide residue is 5-50 mass%, and it is more preferable that it is 10-20 mass%.
前記水溶液の溶媒は、特に制限されず、蒸留水、イオン交換水、純水、超純水などを使用することができる。また、リン酸緩衝液に対して、蛍光モノマー化合物および（メタ）アクリルアミド残基を有する重合性モノマーを加えた水溶液を使用することもできる。 The solvent of the aqueous solution is not particularly limited, and distilled water, ion exchange water, pure water, ultrapure water, or the like can be used. In addition, an aqueous solution in which a fluorescent monomer compound and a polymerizable monomer having a (meth) acrylamide residue are added to a phosphate buffer can also be used.
前記水溶液中には、重合開始剤、重合促進剤、架橋剤など他の成分を含んでもよい。これら他の成分の水溶液中の濃度は、０．０１〜１０質量％であることが好ましく、０．０２〜１．０質量％であることがより好ましい。重合開始剤、重合促進剤、および架橋剤の詳細については後述する。 The aqueous solution may contain other components such as a polymerization initiator, a polymerization accelerator, and a crosslinking agent. The concentration of these other components in the aqueous solution is preferably 0.01 to 10% by mass, and more preferably 0.02 to 1.0% by mass. Details of the polymerization initiator, the polymerization accelerator, and the crosslinking agent will be described later.
前記蛍光モノマー化合物と前記（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性モノマーとを含む水溶液滴は、これらを含む水溶液を、有機溶媒中に添加することで得られる。具体的には、例えば、投入した水溶液を撹拌により有機溶媒中に分散させる方法や、シリンジ、微量分注基等により滴下する水溶液の量を制御して、有機溶媒に滴下する方法などが挙げられる。 The aqueous solution droplet containing the fluorescent monomer compound and the polymerizable monomer containing the (meth) acrylamide residue can be obtained by adding an aqueous solution containing them into an organic solvent. Specifically, for example, a method of dispersing the charged aqueous solution in the organic solvent by stirring, a method of controlling the amount of the aqueous solution dropped by a syringe, a minute dispensing base, etc., and dropping in the organic solvent can be mentioned. .
前記有機溶媒の例としては、例えば、シクロヘキサン、液体パラフィン、ヘキサデカン、コーン油、ミネラル油、シリコーンオイルなどが挙げられ、これらは単独でもまたは２種以上組み合わせて用いてもよい。より好ましくはシリコーンオイルである。 Examples of the organic solvent include cyclohexane, liquid paraffin, hexadecane, corn oil, mineral oil, silicone oil, and the like, and these may be used alone or in combination of two or more. More preferred is silicone oil.
有機溶媒中における水溶液滴の安定性が低い場合は、界面活性剤を用いることが好ましい。界面活性剤の例としては、例えば、モノオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンエステル、レシチン、トリメチルステアリルアンモニウムクロリド、トリメチルセチルアンモニウムクロリド、トリメチルセチルアンモニウムブロミド、トリメチルｎ−テトラデシルアンモニウムクロリド、ハードドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ソフトドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、４−ｎ−オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどのアルキルベンゼンスルホン酸塩、ノニルフェノール硫酸エステルナトリウム塩などの硫酸エステル塩、さらにはジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは単独でもまたは２種以上組み合わせても用いることができる。界面活性剤を添加する場合は、蛍光モノマー化合物等が溶解している水溶液か有機溶媒のどちらか、または両方に添加する。 When the stability of the aqueous solution droplets in the organic solvent is low, it is preferable to use a surfactant. Examples of the surfactant include, for example, sorbitan monooleate, sorbitan sesquioleate, polyoxyethylene (20) sorbitan ester of trioleate, lecithin, trimethyl stearyl ammonium chloride, trimethyl cetyl ammonium chloride, trimethyl cetyl ammonium bromide, trimethyl n-tetradecylammonium chloride, sodium harddecylbenzenesulfonate, sodium softdodecylbenzenesulfonate, alkylbenzenesulfonates such as sodium 4-n-octylbenzenesulfonate, sulfate esters such as nonylphenol sulfate sodium salt, and Examples include sodium dioctyl sulfosuccinate and sodium dodecyl sulfate. These may be used alone or in combination of two or more. When a surfactant is added, it is added to either an aqueous solution or an organic solvent in which a fluorescent monomer compound or the like is dissolved, or both.
最終的に得られる蛍光ハイドロゲルビーズの形状や大きさは、この工程における水溶液滴の形状・大きさにより制御できる。撹拌により投入した水溶液を有機溶媒中に分散させる方法においては、撹拌速度や水溶液・有機溶媒の粘性等により、水溶液滴の大きさを制御することが可能である。また、シリンジ、微量分注器等により水溶液を有機溶媒に滴下する方法においては、その滴下量を制御することで、水溶液滴の大きさの制御が可能である。また得られた蛍光ハイドロゲルビーズを、フィルターなどのふるいにかけることで、必要な粒径の蛍光ハイドロゲルビーズのみを選別することも可能である。 The shape and size of the finally obtained fluorescent hydrogel beads can be controlled by the shape and size of the aqueous solution droplets in this step. In the method of dispersing the aqueous solution added by stirring in the organic solvent, the size of the aqueous solution droplets can be controlled by the stirring speed and the viscosity of the aqueous solution / organic solvent. Moreover, in the method of dripping an aqueous solution to an organic solvent with a syringe, a micro-dispensing device, etc., the size of the aqueous solution droplet can be controlled by controlling the dripping amount. Moreover, it is also possible to select only the fluorescent hydrogel beads having a required particle size by passing the obtained fluorescent hydrogel beads through a sieve such as a filter.
水溶液滴の粒径は、好ましくは１０ｎｍ〜２０００μｍ、より好ましくは１〜１０００μｍである。特に注射器、カニューレ、もしくはカテーテルを用いての埋め込みを行う場合や、マイクロ流路を用いる場合は、１０〜２００μｍであることが特に好ましい。なお、本明細書において、粒径は、実体顕微鏡により測定した値を採用するものとする。 The particle diameter of the aqueous solution droplets is preferably 10 nm to 2000 μm, more preferably 1 to 1000 μm. In particular, when embedding using a syringe, cannula, or catheter, or when using a microchannel, the thickness is particularly preferably 10 to 200 μm. In addition, in this specification, the value measured with the stereomicroscope shall be employ | adopted for a particle size.
水溶液滴を重合させる方法は、特に制限されず、例えば、ラジカル重合開始剤を用いる化学重合法、光重合開始剤を用いる光重合法、または放射線重合法などが挙げられる。 The method for polymerizing the aqueous solution droplets is not particularly limited, and examples thereof include a chemical polymerization method using a radical polymerization initiator, a photopolymerization method using a photopolymerization initiator, and a radiation polymerization method.
化学重合法は、重合開始剤、および必要に応じて重合促進剤を、水溶液中、有機溶媒中、またはその両方に添加することで行われる。重合温度は好ましくは１５〜７５℃、より好ましくは２０〜６０℃である。また、重合時間は好ましくは３分〜２０時間、より好ましくは２０分〜８時間である。重合開始剤の例としては、例えば、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、または過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩；過酸化水素；アゾビス−２−メチルプロピオンアミジン塩酸塩またはアゾイソブチロニトリルなどのアゾ化合物；ベンゾイルパーオキシド、ラウロイルパーオキシド、クメンハイドロパーオキシドまたは酸化ベンゾイルなどのパーオキシド等を挙げることができ、これらは１種単独でもまたは２種以上組み合わせても用いることができる。この際、重合促進剤として、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、モール塩、ピロ重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドナトリウムスルホキシレート、またはアスコルビン酸などの還元剤；エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、グリシン、またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどのアミン化合物；などの１種または２種以上を用いることができる。 The chemical polymerization method is carried out by adding a polymerization initiator and, if necessary, a polymerization accelerator to an aqueous solution, an organic solvent, or both. The polymerization temperature is preferably 15 to 75 ° C, more preferably 20 to 60 ° C. The polymerization time is preferably 3 minutes to 20 hours, more preferably 20 minutes to 8 hours. Examples of polymerization initiators include, for example, persulfates such as sodium persulfate, potassium persulfate, or ammonium persulfate; hydrogen peroxide; azo compounds such as azobis-2-methylpropionamidine hydrochloride or azoisobutyronitrile. A peroxide such as benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, cumene hydroperoxide or benzoyl oxide, and the like. These can be used alone or in combination of two or more. In this case, as a polymerization accelerator, for example, a reducing agent such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite, a mole salt, sodium pyrobisulfite, formaldehyde sodium sulfoxylate, or ascorbic acid; ethylenediamine, ethylenediaminetetraacetate sodium, glycine, or N , N, N ′, N′-Amine compounds such as tetramethylethylenediamine;
光重合法は、例えば、光重合開始剤を予め水溶液に加えておき、有機溶媒中で得られた水溶液滴に対して、紫外光を照射することで行うことができる。 The photopolymerization method can be performed, for example, by adding a photopolymerization initiator to the aqueous solution in advance and irradiating the aqueous solution droplets obtained in the organic solvent with ultraviolet light.
用いられる光重合開始剤の例としては、例えば、アセトフェノン、２，２−ジエトキシアセトフェノン、ｐ−ジメチルアミノアセトフェノン、ｐ−ジメチルアミノプロピオフェノン、ｐ−ジメチルアミノプロピオフェノン、ベンゾフェノン、ｐ，ｐ’−ジクロロベンゾフェノン、ｐ，ｐ’−ビスジエチルアミノベンゾフェノン、ミヒラーケトン、ベンジル、ベンゾイン、ベンゾインメチルエーテル、ベンゾインイソプロピルエーテル、ベンゾイン−ｎ−プロピルエーテル、ベンゾインイソブチルエーテル、ベンジルジメチルケタール、１−ヒドロキシ−シクロヘキシルフェニルケトン、テトラメチルチウラムモノサルファイド、チオキサントン、２−クロロチオキサントン、２，４−ジメチルチオキサントン、２，２−ジメチルプロピオイル ジフェニルフォスフィンオキサイド、２−メチル−２−エチルヘキサノイルジフェニルフォスフィンオキサイド、２，６−ジメチルベンゾイルジフェニルフォスフィンオキサイド、２，６−ジメトキシベンゾイルジフェニルフォスフィンオキサイド、２，４，６−トリメチルベンゾイルジフェニルフォスフィンオキサイド、ビス（２，６−ジメトキシベンゾイル）−２，４，４−トリメチルペンチルフォスフィンオキサイド、２，３，６−トリメチルベンゾイル−ジフェニルフォスフィンオキサイド、ビス（２，３，６−トリメチルベンゾイル）−フェニルフォスフィンオキサイド、２，４，６−トリメトキシベンゾイル−ジフェニルフォスフィンオキサイド、２，４，６−トリクロロベンゾイルジフェニルフォスフィンオキサイド、２，４，６−トリメチルベンゾイルナフチルフォスフォネート、ｐ−ジメチルアミノ安息香酸、ｐ−ジエチルアミノ安息香酸、アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビス（１−アセトキシ−１−フェニルエタン）、ベンゾインパーオキサイド、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイドなどが挙げられる。これらは単独でもまたは２種以上組み合わせても用いることができる。 Examples of the photopolymerization initiator used include, for example, acetophenone, 2,2-diethoxyacetophenone, p-dimethylaminoacetophenone, p-dimethylaminopropiophenone, p-dimethylaminopropiophenone, benzophenone, p, p '-Dichlorobenzophenone, p, p'-bisdiethylaminobenzophenone, Michler's ketone, benzyl, benzoin, benzoin methyl ether, benzoin isopropyl ether, benzoin n-propyl ether, benzoin isobutyl ether, benzyl dimethyl ketal, 1-hydroxy-cyclohexyl phenyl ketone , Tetramethylthiuram monosulfide, thioxanthone, 2-chlorothioxanthone, 2,4-dimethylthioxanthone, 2,2-dimethylpropioyl Diphenylphosphine oxide, 2-methyl-2-ethylhexanoyldiphenylphosphine oxide, 2,6-dimethylbenzoyldiphenylphosphine oxide, 2,6-dimethoxybenzoyldiphenylphosphine oxide, 2,4,6-trimethylbenzoyldiphenyl Phosphine oxide, bis (2,6-dimethoxybenzoyl) -2,4,4-trimethylpentylphosphine oxide, 2,3,6-trimethylbenzoyl-diphenylphosphine oxide, bis (2,3,6-trimethylbenzoyl) ) -Phenylphosphine oxide, 2,4,6-trimethoxybenzoyl-diphenylphosphine oxide, 2,4,6-trichlorobenzoyldiphenylphosphine oxide, 2,4 6-trimethylbenzoylnaphthyl phosphonate, p-dimethylaminobenzoic acid, p-diethylaminobenzoic acid, azobisisobutyronitrile, 1,1′-azobis (1-acetoxy-1-phenylethane), benzoin peroxide, Examples include di-tert-butyl peroxide. These may be used alone or in combination of two or more.
紫外光の波長は２００〜４００ｎｍが好ましく、また、紫外光の照射量は、１００〜２０００ｍＪ／ｃｍ２であることが好ましく、５００〜１５００ｍＪ／ｃｍ２であることがより好ましい。 Wavelength is preferably 200~400nm of ultraviolet light, The irradiation amount of ultraviolet light is preferably 100 to 2000 mJ / cm 2, more preferably 500~1500mJ / cm 2.
放射線重合法は、得られた水溶液滴に対し、放射線を照射することで重合を行う。放射線としては、電子線が好ましく、その照射線量は、１０〜２００ｋＧｙであることが好ましく、２０〜５０ｋＧｙであることがより好ましい。 In the radiation polymerization method, polymerization is performed by irradiating the obtained aqueous solution droplets with radiation. The radiation is preferably an electron beam, and the irradiation dose is preferably 10 to 200 kGy, more preferably 20 to 50 kGy.
電子線により重合を行う場合、重合開始剤や重合促進剤を用いることなく重合が可能であるが、上記化学重合法において例示した重合開始剤および重合促進剤を用いることもできる。 When the polymerization is carried out with an electron beam, the polymerization can be performed without using a polymerization initiator or a polymerization accelerator, but the polymerization initiators and polymerization accelerators exemplified in the chemical polymerization method can also be used.
上記化学式１で表される蛍光ハイドロゲルビーズは、上記化学式５で表される蛍光モノマー化合物と、（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性モノマーとの共重合によらずに製造することが可能である。例えば、予め（メタ）アクリルアミド残基を有する重合性モノマーを重合させて得られる重合物、上記化学式５で表される蛍光モノマー化合物、重合開始剤、および必要に応じて重合促進剤を含む水溶液を有機溶媒に添加し水溶液滴を作製し、得られた水溶液滴を上記の重合方法により重合させても、上記化学式１で表される構造を有する蛍光ハイドロゲルビーズを製造することができる。 The fluorescent hydrogel beads represented by the chemical formula 1 can be produced without copolymerization of the fluorescent monomer compound represented by the chemical formula 5 and a polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue. . For example, an aqueous solution containing a polymer obtained by polymerizing a polymerizable monomer having a (meth) acrylamide residue in advance, a fluorescent monomer compound represented by the above chemical formula 5, a polymerization initiator, and, if necessary, a polymerization accelerator. A fluorescent hydrogel bead having a structure represented by the above chemical formula 1 can also be produced by adding aqueous solution droplets to an organic solvent and polymerizing the obtained aqueous solution droplets by the above polymerization method.
本発明の蛍光ハイドロゲルビーズは、三次元架橋構造を有していてもよい。三次元架橋構造の導入方法は、特に制限されず、例えば、本発明の蛍光ハイドロゲルビーズに架橋剤を作用させて、上記化学式５で表される蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性モノマーとの間の少なくとも一部に、分子間架橋を形成させる方法が挙げられる。ポリ（メタ）アクリルアミド鎖に三次元架橋を形成させると、水溶液中でも蛍光モノマー化合物を溶出させることなく糖類の検出が容易にできる。なお、本発明で用いられる蛍光モノマー化合物は、糖類と結合して蛍光を発する疎水性部位を有するが、該疎水性部位は、上記化学式１中のＹ１およびＹ２で表される二価の有機残基を介してポリ（メタ）アクリルアミド鎖に結合されるため、水溶液中でも糖類と結合できる自由度が確保されている。したがって、三次元架橋構造を形成しても、糖類の検出感度をほとんど低下させない。 The fluorescent hydrogel beads of the present invention may have a three-dimensional crosslinked structure. The method for introducing the three-dimensional crosslinked structure is not particularly limited, and for example, a polymerization is performed including a fluorescent monomer compound represented by the above chemical formula 5 and a (meth) acrylamide residue by causing a crosslinking agent to act on the fluorescent hydrogel beads of the present invention. A method of forming an intermolecular crosslink at least partly with the functional monomer can be mentioned. When a three-dimensional crosslink is formed on a poly (meth) acrylamide chain, saccharides can be easily detected without eluting the fluorescent monomer compound even in an aqueous solution. The fluorescent monomer compound used in the present invention has a hydrophobic moiety that emits fluorescence by binding to a saccharide, and the hydrophobic moiety is a divalent compound represented by Y 1 and Y 2 in the above chemical formula 1. Since it is bonded to a poly (meth) acrylamide chain via an organic residue, a degree of freedom for bonding with a saccharide is ensured even in an aqueous solution. Therefore, even if a three-dimensional crosslinked structure is formed, the detection sensitivity of saccharides is hardly lowered.
本発明で用いられる架橋剤としては、重合性二重結合によって蛍光センサー化合物中に三次元架橋構造を導入し得るものを広く含む。具体的な例としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）−ビス（メタ）アクリルアミド、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリントリ（メタ）アクリレート、グリセリンアクリレートメタクリレート、エチレンオキサイド変性トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレートなどのジビニル化合物；トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレート、トリアリルホスフェート、トリアリルアミン、ポリ（メタ）アリロキシアルカン、（ポリ）エチレングリコールジグリシジルエ−テル、グリセロールジグリシジルエーテル、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ペンタエリスリトール、エチレンジアミン、ポリエチレンイミン、グリシジル（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリアリル、トリメチロールプロパンジ（メタ）アリルエーテル、テトラアリロキシエタン、またはグリセロールプロポキシトリアクリレートなどが挙げられる。これら架橋剤は、単独でもまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。 The crosslinking agent used in the present invention widely includes those capable of introducing a three-dimensional crosslinked structure into a fluorescent sensor compound by a polymerizable double bond. Specific examples include, for example, N, N′-methylenebis (meth) acrylamide, N, N ′-(1,2-dihydroxyethylene) -bis (meth) acrylamide, diethylene glycol di (meth) acrylate, (poly) Ethylene glycol di (meth) acrylate, triethylene glycol di (meth) acrylate, propylene glycol di (meth) acrylate, trimethylolpropane di (meth) acrylate, trimethylolpropane tri (meth) acrylate, pentaerythritol di (meth) acrylate , Pentaerythritol tri (meth) acrylate, pentaerythritol tetra (meth) acrylate, (poly) propylene glycol di (meth) acrylate, glycerol tri (meth) acrylate, glycerol acrylic Divinyl compounds such as thiomethacrylate, ethylene oxide modified trimethylolpropane tri (meth) acrylate, pentaerythritol tetra (meth) acrylate, dipentaerythritol hexa (meth) acrylate; triallyl cyanurate, triallyl isocyanurate, triallyl phosphate , Triallylamine, poly (meth) allyloxyalkane, (poly) ethylene glycol diglycidyl ether, glycerol diglycidyl ether, ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin, pentaerythritol, ethylenediamine, polyethyleneimine, glycidyl (meta ) Acrylate, triallyl isocyanurate, trimethylolpropane di (meth) allyl ether, Tet Arirokishietan or such as glycerol propoxy triacrylate. These crosslinking agents can be used alone or in combination of two or more.
本発明の蛍光ハイドロゲルビーズの形状は、特に制限されず、球状、立方体状、円盤状、円柱状、円錐状など、いずれの形状であってもよい。蛍光ハイドロゲルビーズの埋め込み方法や蛍光検出の際に適した形状とすることが好ましい。 The shape of the fluorescent hydrogel beads of the present invention is not particularly limited, and may be any shape such as a spherical shape, a cubic shape, a disc shape, a cylindrical shape, or a conical shape. It is preferable to adopt a shape suitable for the method of embedding the fluorescent hydrogel beads and the fluorescence detection.
本発明の蛍光ハイドロゲルビーズの粒径は、好ましくは１０ｎｍ〜２０００μｍ、より好ましくは１〜１０００μｍである。特に注射器、カニューレ、もしくはカテーテルを用いての埋め込みを行う場合や、マイクロ流路を用いる場合は、１０〜２００μｍであることが特に好ましい。 The particle size of the fluorescent hydrogel beads of the present invention is preferably 10 nm to 2000 μm, more preferably 1 to 1000 μm. In particular, when embedding using a syringe, cannula, or catheter, or when using a microchannel, the thickness is particularly preferably 10 to 200 μm.
また、ある血糖値において、それぞれの蛍光ハイドロゲルビーズが同程度の蛍光強度を有するように、蛍光ハイドロゲルビーズの粒径は略均一であることが好ましい。特に、マイクロ流路を用いて、蛍光ハイドロゲルビーズを輸送する場合、流路中を流れる蛍光ハイドロゲルビーズと蛍光検出系との間の距離を一定に保つためにも、蛍光ハイドロゲルビーズの粒径は略均一であることが好ましい。 Moreover, it is preferable that the particle size of the fluorescent hydrogel beads is substantially uniform so that each fluorescent hydrogel bead has a similar fluorescence intensity at a certain blood glucose level. In particular, when the fluorescent hydrogel beads are transported using a micro flow channel, the particle size of the fluorescent hydrogel beads is approximately the same in order to keep the distance between the fluorescent hydrogel beads flowing in the flow channel and the fluorescence detection system constant. It is preferable that it is uniform.
蛍光マイクロビーズが得られた後、洗浄液を用いて蛍光マイクロビーズ洗浄を行ってもよい。洗浄液の例としては、例えば、ヘキサン、エタノール、リン酸緩衝液、純水などが挙げられる。 After the fluorescent microbeads are obtained, the fluorescent microbeads may be washed using a washing solution. Examples of the cleaning liquid include hexane, ethanol, phosphate buffer, pure water, and the like.
本発明の第二は、上記蛍光ハイドロゲルビーズを含む体内埋め込み用の糖類測定用センサーである。本発明のハイドロゲルビーズは微小であるため、低侵襲的に生体内に埋め込むことが出来る。埋込み方法としては、注射器、カニューレ、もしくはカテーテルを用いての埋設、または皮膚表層の一部を剥離した埋設などが挙げられる。また、本発明の蛍光ハイドロゲルビーズは、生体適合性の高いポリ（メタ）アクリルアミド構造を有するため、長期の生体内埋込みに際しての生体への影響が少ない。 The second of the present invention is a saccharide measuring sensor for implantation in the body, which contains the fluorescent hydrogel beads. Since the hydrogel beads of the present invention are very small, they can be embedded in a living body with minimal invasiveness. Examples of the embedding method include embedding using a syringe, cannula or catheter, or embedding in which a part of the skin surface layer is peeled off. In addition, since the fluorescent hydrogel beads of the present invention have a poly (meth) acrylamide structure with high biocompatibility, there is little influence on the living body during long-term implantation in the living body.
本発明の蛍光ハイドロゲルビーズは、生体内で加水分解や酵素分解などの化学的分解を受けないため、長期埋込みの安定性が高いと考えられる。埋込み組織としては、皮内や皮下が好ましく、高感度や小さなタイムラグを実現するためには、血液との体液交換が盛んでありかつ皮膚表面からの深度が浅い真皮層がより好ましい。埋込み場所は、皮膚表面からの光学測定ができる場所ならばどこでもよく、例えば、腕、脚、腹部、耳介等が挙げられる。 Since the fluorescent hydrogel beads of the present invention are not subject to chemical degradation such as hydrolysis or enzymatic degradation in vivo, it is considered that the stability of long-term implantation is high. The embedded tissue is preferably intradermal or subcutaneous, and in order to achieve high sensitivity and a small time lag, a dermis layer that actively exchanges body fluids with blood and has a shallow depth from the skin surface is more preferable. The implantation place may be any place where optical measurement can be performed from the skin surface, and examples thereof include an arm, a leg, an abdomen, and an auricle.
本発明の第三は、上記蛍光ハイドロゲルビーズを体内に埋込み、体外より励起光を照射して、上記蛍光ハイドロゲルビーズから発生する蛍光を計測する手段を有する、体内埋め込み用の糖類測定用センサーである。また、本発明の第四は、上記蛍光ハイドロゲルビーズを、体内に埋め込んだマイクロダイアリシスチューブと前記マイクロダイアリシスチューブに接続された体外の蛍光検出系との間で循環させ、上記蛍光ハイドロゲルビーズから発生する蛍光を計測する手段を有する、体内埋め込み用の糖類測定用センサーである。 A third aspect of the present invention is a saccharide measurement sensor for implanting in the body, comprising means for embedding the fluorescent hydrogel beads in the body and irradiating excitation light from outside the body to measure fluorescence generated from the fluorescent hydrogel beads. . Further, a fourth aspect of the present invention is that the fluorescent hydrogel beads are circulated between a microdialysis tube embedded in the body and an external fluorescence detection system connected to the microdialysis tube. This is a saccharide measuring sensor for implantation in the body, which has means for measuring the generated fluorescence.
マイクロダイアリシスチューブとは、生体内の埋込み部位の一部または全部に半透膜を有する中空形状のチューブである。半透膜は、測定対象である糖類は透過させるが、生体成分のうち細胞等やタンパク質等の高分子を透過させない性質を有するものが好ましい。マイクロダイアリシスチューブ内は緩衝剤を含んでいてもよい水で満たし、その中で蛍光ハイドロゲルビーズを循環させる。マイクロダイアリシスチューブは、生体外に配置された蛍光検出系に接続され、ポンプとともに循環可能な流路を形成している。これら流路は、クローズドループであることが好ましい。蛍光検出系で循環されている蛍光ハイドロゲルビーズの蛍光を連続的に測定することによって、生体内の糖濃度を反映する値を得ることが出来る。 The microdialysis tube is a hollow tube having a semipermeable membrane in a part or all of an implantation site in a living body. The semipermeable membrane preferably has a property of allowing saccharides to be measured to permeate but not permeating macromolecules such as cells and proteins among biological components. The microdialysis tube is filled with water which may contain a buffer, and the fluorescent hydrogel beads are circulated therein. The microdialysis tube is connected to a fluorescence detection system disposed outside the living body, and forms a flow path that can be circulated together with the pump. These channels are preferably closed loop. By continuously measuring the fluorescence of the fluorescent hydrogel beads circulating in the fluorescence detection system, a value reflecting the sugar concentration in the living body can be obtained.
蛍光検出系は、少なくとも１種の光源と、少なくとも１種の光検出器とを含むものが好ましい。光源および光検出器は、光源から発する励起光がなるべく入らないように、かつ蛍光ハイドロゲルビーズから発せられる蛍光が効率よく検出できるよう配置することが好ましい。より具体的な構造の例としては、例えば、図１に示すような、光源２と光検出器３とを９０度の角度となるように配置する構造が挙げられる。また、励起光４と、蛍光ハイドロゲルビーズ１から発生する蛍光５とを分離するために、光学フィルターを用いてもよい。 The fluorescence detection system preferably includes at least one light source and at least one photodetector. The light source and the light detector are preferably arranged so that excitation light emitted from the light source does not enter as much as possible, and fluorescence emitted from the fluorescent hydrogel beads can be detected efficiently. As an example of a more specific structure, for example, a structure in which the light source 2 and the photodetector 3 are arranged at an angle of 90 degrees as shown in FIG. Further, an optical filter may be used to separate the excitation light 4 and the fluorescence 5 generated from the fluorescent hydrogel beads 1.
蛍光信号の測定は、蛍光ハイドロゲルビーズの蛍光特性に合ったランプ、ＬＥＤ、レーザー等の光源および光検出器、また、必要に応じて、光ファイバー、レンズ、鏡、プリズム、光学フィルターなどをセンサー構成物周辺の適当な位置に配置して行うことができる。 The fluorescent signal is measured by using a lamp, LED, laser, or other light source and photodetector suitable for the fluorescence characteristics of the fluorescent hydrogel beads, and if necessary, an optical fiber, lens, mirror, prism, optical filter, etc. It can be performed by arranging it at an appropriate position in the periphery.
本発明の蛍光ハイドロゲルビーズを用いて検出できる糖類は、特に制限されず、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトースなどの単糖類、マルトース、スクロース、ラクトースなどの多糖類が挙げられる。これらの中でも、グルコースがより好ましい。 The saccharide that can be detected using the fluorescent hydrogel beads of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include monosaccharides such as glucose, galactose, and fructose, and polysaccharides such as maltose, sucrose, and lactose. Among these, glucose is more preferable.
上述の体内埋め込み用の糖類測定センサーを用いることにより、糖尿病患者が血糖値を自己制御する際の煩雑性または血糖値のタイムラグを減少させることができる。さらに、上述の体内埋め込み用の糖類測定用センサーを用いることにより、糖尿病患者以外の人々が健康管理のための血糖値測定を簡便に行うことも可能となる。 By using the above-described saccharide measurement sensor for implantation in the body, it is possible to reduce the complexity or time lag of the blood glucose level when a diabetic patient self-controls the blood glucose level. Furthermore, by using the above-described saccharide measurement sensor for implantation in the body, it is possible for people other than diabetics to easily perform blood glucose measurement for health care.
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これら実施例は、本発明を何ら制限するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated more concretely, these Examples do not restrict | limit this invention at all.
（実施例１：９，１０−ビス［［Ｎ−（２−ボロノベンジル）−Ｎ−［６−［（アクリロイルポリオキシエチレン）カルボニルアミノ］ヘキシル］アミノ］メチル］−２−アセチルアントラセンの合成）
（Ａ）９，１０−ビス（ブロモメチル）−２−アセチルアントラセン（上記反応式１中のＩＩ）の合成
９，１０−ジメチル−２−アセチルアントラセン（上記反応式１中のＩ）６００ｍｇ、Ｎ−ブロモスクシンイミド８００ｍｇ、および過酸化ベンゾイル５ｍｇを、クロロホルム６ｍＬと四塩化炭素２０ｍＬの混合物に加え、８０℃で２時間、加熱還流を行った。溶媒を除去した後、残渣をメタノールで抽出し、７８０ｍｇの目的物を得た。
Example 1: Synthesis of 9,10-bis [[N- (2-boronobenzyl) -N- [6-[(acryloylpolyoxyethylene) carbonylamino] hexyl] amino] methyl] -2-acetylanthracene)
(A) Synthesis of 9,10-bis (bromomethyl) -2-acetylanthracene (II in the above reaction scheme 1) 9,10-dimethyl-2-acetylanthracene (I in the above reaction scheme 1) 600 mg, N- Bromosuccinimide (800 mg) and benzoyl peroxide (5 mg) were added to a mixture of chloroform (6 mL) and carbon tetrachloride (20 mL), and the mixture was heated to reflux at 80 ° C. for 2 hours. After removing the solvent, the residue was extracted with methanol to obtain 780 mg of the desired product.
（Ｂ）９，１０−ビス［６’−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシルアミノメチル］−２−アセチルアントラセン（上記反応式１中のＩＶ）の合成
上記（Ａ）で得た生成物５００ｍｇ、Ｎ−ＢＯＣ−ヘキシルジアミン（上記反応式１中のＩＩＩ） １．１２５ｇ、およびジイソプロピルエチルアミン １．２５ｍＬを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬに溶解し、４５℃で１時間攪拌して反応を行った。反応混合物はクロロホルム６０ｍＬで希釈し、水１００ｍＬで３回、飽和食塩水１００ｍＬで１回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾過後、濃縮し、クロロホルム／メタノール（体積比 ９５／５）混合溶媒を溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、３６７ｍｇの目的物を得た。
(B) Synthesis of 9,10-bis [6 ′-(t-butoxycarbonylamino) hexylaminomethyl] -2-acetylanthracene (IV in Reaction Scheme 1) 500 mg of the product obtained in (A) above, 1.125 g of N-BOC-hexyldiamine (III in the above reaction scheme 1) and 1.25 mL of diisopropylethylamine are dissolved in 10 mL of N, N-dimethylformamide (DMF), and stirred at 45 ° C. for 1 hour to react. Went. The reaction mixture was diluted with 60 mL of chloroform, washed 3 times with 100 mL of water and once with 100 mL of saturated brine, and the organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate. The desiccant was filtered, concentrated, and purified by silica gel column chromatography using a mixed solvent of chloroform / methanol (volume ratio 95/5) as an eluent to obtain 367 mg of the desired product.
（Ｃ）９，１０−ビス［［Ｎ−６’−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシル−Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノ］メチル］−２−アセチルアントラセン（上記反応式１中のＶＩ）の合成
上記（Ｂ）で得た生成物２００ｍｇ、２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサボリナン（上記反応式１中のＶ）７００ｍｇおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．３５ｍＬを、３ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、室温（２５℃）で１６時間攪拌した。溶媒除去後、メタノール／クロロホルムを溶離液とするシリカゲルカラムで精製し目的物１９４ｍｇを得た。
(C) 9,10-bis [[N-6 ′-(t-butoxycarbonylamino) hexyl-N- [2- (5,5-dimethylborinan-2-yl) benzyl] amino] methyl] -2 -Synthesis of acetylanthracene (VI in the above reaction scheme 1) 200 mg of the product obtained in the above (B), 700 mg of 2- (2-bromomethylphenyl) -1,3-dioxaborinane (V in the above reaction scheme 1) And 0.35 mL of N, N-diisopropylethylamine was dissolved in 3 mL of dimethylformamide and stirred at room temperature (25 ° C.) for 16 hours. After removing the solvent, the residue was purified by a silica gel column using methanol / chloroform as an eluent to obtain 194 mg of the desired product.
（Ｄ）９，１０−ビス［［Ｎ−（６’−アミノヘキシル）−Ｎ−（２−ボロノベンジル）アミノ］メチル］−２−アセチルアントラセン（上記反応式１中のＶＩＩ）の合成
上記（Ｃ）で得られた生成物１００ｍｇを、２ｍＬのメタノールに溶解し、４Ｎ 塩酸２ｍＬを加えて、室温（２５℃）で１０時間攪拌した。蒸発乾固後、ゲル濾過によって無機塩を除去し、目的物９５ｍｇを得た。
(D) Synthesis of 9,10-bis [[N- (6′-aminohexyl) -N- (2-boronobenzyl) amino] methyl] -2-acetylanthracene (VII in the above reaction scheme 1) ) Was dissolved in 2 mL of methanol, 2 mL of 4N hydrochloric acid was added, and the mixture was stirred at room temperature (25 ° C.) for 10 hours. After evaporation to dryness, inorganic salts were removed by gel filtration to obtain 95 mg of the desired product.
（Ｅ）Ｆ−ＰＥＧ−ＡＡｍの合成
上記（Ｄ）で得られた生成物１６０ｍｇを、０．５ｍＬのＤＭＦに溶解し、アクリロイル−（ポリエチレングリコール）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ポリエチレングリコール残基部分の分子量は３，４００）１．２２ｇの１０ｍＬ １００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）溶液に加え、室温（２５℃）で２０時間攪拌した。反応混合物をゲル濾過に供し、蛍光高分子画分を採取し、凍結乾燥後、目的物であるＦ−ＰＥＧ−ＡＡＭを１．２ｇ得た。重クロロホルム中の１Ｈ−ＮＭＲデータは下記表１の通りであり、ＰＥＧ残基由来のピークと重なる水素のシグナルは確認されなかった。
(E) Synthesis of F-PEG-AAm 160 mg of the product obtained in (D) above was dissolved in 0.5 mL of DMF, and acryloyl- (polyethylene glycol) -N-hydroxysuccinimide ester (polyethylene glycol residue part) Was added to a solution of 1.22 g of 10
（実施例２：蛍光ハイドロゲルビーズの製造）
最終濃度としてアクリルアミドが１５質量％、実施例１で合成したＦ−ＰＥＧ−ＡＡｍが５質量％、メチレンビスアクリルアミドが０．３質量％、および過硫酸ナトリウムが０．１８質量％となるように６０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解・混合して水溶液を調製した。
(Example 2: Production of fluorescent hydrogel beads)
The final concentration is 15% by mass, 60 mM so that F-PEG-AAm synthesized in Example 1 is 5% by mass, methylenebisacrylamide is 0.3% by mass, and sodium persulfate is 0.18% by mass. An aqueous solution was prepared by dissolving and mixing in a phosphate buffer (pH 7.4).
別途、シリコーンオイルに対して窒素バブリングを行い、脱酸素を行った後、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチレンジアミンを濃度が０．０４質量％となるように加え、有機溶媒を調製した。 Separately, nitrogen bubbling was performed on the silicone oil, and after deoxygenation, N, N, N ′, N′-tetraethylenediamine was added to a concentration of 0.04% by mass to prepare an organic solvent. .
次に、微量分注器を用いて約０．５μＬの水溶液を、３７℃で窒素バブリングを行っている有機溶媒中に滴下することで、有機溶媒中に水溶液滴を分散させ、３７℃で重合を開始した。この際、水溶液滴の粒径は、１ｍｍであった
３０分の重合の後、得られた蛍光ゲルビーズを分取し、ヘキサンに加え撹拌洗浄を３回行った。同様の操作をエタノール、および６０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）を用いて行い、最後に６０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）中に分散させ、蛍光ハイドロゲルビーズを分散状態で得た。得られた蛍光ハイドロゲルビーズの粒径は１ｍｍであった。
Next, about 0.5 μL of the aqueous solution is dropped into an organic solvent that is nitrogen bubbling at 37 ° C. using a micro-dispensing device, thereby dispersing the aqueous solution droplet in the organic solvent and polymerizing at 37 ° C. Started. At this time, the particle diameter of the aqueous solution droplet was 1 mm. After the polymerization for 30 minutes, the obtained fluorescent gel beads were collected, added to hexane, and washed with stirring three times. The same operation was performed using ethanol and 60 mM phosphate buffer (pH 7.4), and finally dispersed in 60 mM phosphate buffer (pH 7.4) to obtain fluorescent hydrogel beads in a dispersed state. . The obtained fluorescent hydrogel beads had a particle size of 1 mm.
（評価：蛍光顕微鏡を使用した ｉｎ ｖｉｔｒｏ グルコース応答性の評価）
実施例２で得られた蛍光ハイドロゲルビーズを、グルコース濃度が０〜５００ｍｇ／ｄＬである６０ｍＭリン酸緩衝液中に加え、蛍光実体顕微鏡により、各グルコース濃度における蛍光ハイドロゲルビーズの蛍光強度について観察した。グルコース濃度を上昇させた時の結果を図２に、グルコース濃度を下降させた時の結果を図３にそれぞれ示す。
(Evaluation: Evaluation of in vitro glucose responsiveness using a fluorescence microscope)
The fluorescent hydrogel beads obtained in Example 2 were added to a 60 mM phosphate buffer having a glucose concentration of 0 to 500 mg / dL, and the fluorescence intensity of the fluorescent hydrogel beads at each glucose concentration was observed with a fluorescent stereomicroscope. FIG. 2 shows the results when the glucose concentration was raised, and FIG. 3 shows the results when the glucose concentration was lowered.
図２および図３に示すように、グルコース濃度を上昇させた場合と下降させた場合とにおいて、蛍光ハイドロゲルビーズの蛍光強度の違いはほとんどなく、本発明の蛍光ハイドロゲルビーズを用いることにより、安定してグルコース濃度を測定できることが分かった。 As shown in FIG. 2 and FIG. 3, there is almost no difference in fluorescence intensity between the fluorescent hydrogel beads when the glucose concentration is raised and when it is lowered, and the use of the fluorescent hydrogel beads of the present invention stabilizes it. It was found that the glucose concentration could be measured.
１ 蛍光ハイドロゲルビーズ、
２ 光源、
３ 光検出器、
４ 励起光、
５ 蛍光。
1 fluorescent hydrogel beads,
2 light source,
3 photodetectors,
4 excitation light,
5 Fluorescence.
Claims (9)
Ｘ１およびＸ２は同一または異なっていてもよく、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＨ２ＮＲ−、−ＮＲ−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＲＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＲ−、および−ＣＯ−からなる群より選択される少なくとも１種の置換基を含む炭素数１〜３０のアルキレン基であり、この際、Ｒは、水素原子、または置換されているかもしくは非置換の炭素数１〜１０の直鎖状もしくは分枝状のアルキル基であり、
Ｚ１およびＺ２は同一または異なっていてもよく、−Ｏ−または−ＮＲ’−であり、この際、Ｒ’は水素原子または置換されているかもしくは非置換の炭素数１〜１０の直鎖状もしくは分枝状のアルキル基であり、
Ｑ、Ｑ’、Ｑ’’、Ｑ’’’は同一または異なっていてもよく、水素原子、ヒドロキシ基、置換されているかもしくは非置換の炭素数１〜１０の直鎖状もしくは分枝状のアルキル基、炭素数２〜１１のアシル基、置換されているかもしくは非置換の炭素数１〜１０の直鎖状もしくは分枝状のアルコキシ基、ハロゲン原子を含む基、カルボキシル基、カルボン酸エステル基、カルボン酸アミド基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、または炭素数１〜１０のアルキルアミノ基であり、ＱおよびＱ’ならびにＱ’’およびＱ’’’の少なくとも一方は、互いに結合して芳香環または複素環を形成してもよく、
Ｙ１およびＹ２は、同一または異なっていてもよく、置換されていてもよい２価の有機残基であり、
Ａ１およびＡ２は同一または異なっていてもよく、水素原子またはメチル基であり、
Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３およびＵ４は同一または異なっていてもよく、水素原子、または置換されているかもしくは非置換の炭素数１〜１０の直鎖状もしくは分枝状のアルキル基であり、
ｐ１とｑ１とのモル比（ｐ１：ｑ１）およびｐ２とｑ２とのモル比（ｐ２：ｑ２）は、１：５０〜１：６，０００である。 Fluorescent hydrogel beads for embedding the dermis layer having a structure represented by the following chemical formula 1:
X 1 and X 2 may be the same or different and are —COO—, —OCO—, —CH 2 NR—, —NR—, —NRCO—, —CONR—, —SO 2 NR—, —NRSO 2 —. , -O-, -S-, -SS-, -NRCOO-, -OCONR-, and -CO-, an alkylene group having 1 to 30 carbon atoms and containing at least one substituent selected from the group consisting of In this case, R is a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms,
Z 1 and Z 2 may be the same or different and are —O— or —NR′—, wherein R ′ is a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted straight chain having 1 to 10 carbon atoms. A branched or branched alkyl group,
Q, Q ′, Q ″ and Q ′ ″ may be the same or different, and are a hydrogen atom, a hydroxy group, a substituted or unsubstituted C 1-10 linear or branched An alkyl group, an acyl group having 2 to 11 carbon atoms, a substituted or unsubstituted linear or branched alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms, a group containing a halogen atom, a carboxyl group, a carboxylic acid ester group , A carboxylic acid amide group, a cyano group, a nitro group, an amino group, or an alkylamino group having 1 to 10 carbon atoms, and at least one of Q and Q ′ and Q ″ and Q ′ ″ is bonded to each other May form an aromatic ring or a heterocyclic ring,
Y 1 and Y 2 may be the same or different and may be a divalent organic residue that may be substituted;
A 1 and A 2 may be the same or different and each is a hydrogen atom or a methyl group;
U 1 , U 2 , U 3 and U 4 may be the same or different and are a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms. ,
The molar ratio of p1 to q1 (p1: q1) and the molar ratio of p2 to q2 (p2: q2) are 1:50 to 1: 6,000.
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