JP4520272B2 - Fluorescent monomer compound for saccharide measurement, fluorescent sensor substance for saccharide measurement, and saccharide measurement sensor for implantation in the body - Google Patents
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Description
本発明は、糖類の検出能に優れる蛍光モノマー化合物、蛍光センサー物質、その製造方法およびそれらを用いた体内埋め込み用の糖類測定用センサー等に関する。 The present invention relates to a fluorescent monomer compound having excellent ability to detect saccharides, a fluorescent sensor substance, a method for producing the same, a saccharide measurement sensor for implantation in the body, and the like.
体内埋め込み型センサーは、様々な疾患においてその病状の経過観察や治療効果のモニタなどに有用であり、近年、盛んに研究されている分野の一つである。特に糖尿病治療においては、連続血糖測定による血糖コントロールが、病状の進行遅延や合併症の罹病の低減に貢献すると言われている。 Implantable sensors are useful for monitoring the progress of disease states and monitoring therapeutic effects in various diseases, and are one of the fields that have been actively studied in recent years. Particularly in the treatment of diabetes, blood glucose control by continuous blood glucose measurement is said to contribute to the reduction of disease progression and morbidity of complications.
現状の糖尿病患者の多くは、血糖の自己管理のために、指等の穿刺によって血液試料を採取し、血糖計に供給して測定値を読み取ることを行っている。しかし、このような方法は患者への苦痛や簡便性のうえで問題があり、一日に数回の測定が限界で、血糖値変化の動向を頻繁に測定して把握することが難しいのが現状である。このような理由から、埋め込み型連続血糖計の有用性は高いと考えられる。 Many current diabetic patients collect blood samples by puncturing with a finger or the like and supply them to a blood glucose meter to read the measured values for self-management of blood glucose. However, this method has problems in terms of pain and convenience for patients, and it is difficult to measure and grasp blood glucose level changes frequently because the measurement is limited to several times a day. Currently. For these reasons, the usefulness of the implantable continuous blood glucose meter is considered high.
一方、生体内のグルコース濃度を継続的に測定するための技術開発は古くからなされており、たとえば、可逆的にグルコースと反応して蛍光を発する物質を用いて蛍光量の変化でグルコース濃度を測定するものがある。このような蛍光物質として、発蛍光性原子団と、少なくとも１つのフェニルボロン酸部位と、少なくとも１つのアミン性窒素とを有し、アミン性窒素がフェニルボロン酸部位の近傍に配置されて該フェニルボロン酸と分子内結合する分子構造を有する発蛍光性化合物が開示されている（特許文献１）。発蛍光性原子団としては、ナフチル基やアンスリル基などがある。該化合物は、そのボロン酸部位を介して糖分子と安定なコンプレックスを形成すると蛍光を発する、というものである。 On the other hand, technological development for continuously measuring the glucose concentration in the living body has been made for a long time. For example, the glucose concentration is measured by changing the amount of fluorescence using a substance that reversibly reacts with glucose and emits fluorescence. There is something to do. As such a fluorescent substance, it has a fluorescent group, at least one phenylboronic acid moiety, and at least one amine nitrogen, and the amine nitrogen is arranged in the vicinity of the phenylboronic acid moiety. A fluorescent compound having a molecular structure in which boronic acid is bonded intramolecularly is disclosed (Patent Document 1). Examples of the fluorescent group include a naphthyl group and an anthryl group. The compound emits fluorescence when it forms a stable complex with a sugar molecule via its boronic acid moiety.
また、水性環境中での検体の濃度検出のための指示高分子として、親水性モノマーと、アントラセンホウ酸エステル誘導体などのエシキマー形成多環芳香族炭化水素とを有する化合物も開示されている（特許文献２）。該エシキマー形成多環芳香族炭化水素は水への溶解性が充分でないためメタクリルアミドなどの親水性基を導入し、水性環境中でも検体濃度を検出できるようにしたものである。 In addition, as an indicator polymer for detecting the concentration of an analyte in an aqueous environment, a compound having a hydrophilic monomer and an eschimer-forming polycyclic aromatic hydrocarbon such as an anthracene borate derivative is also disclosed (patent) Reference 2). Since the epoximer-forming polycyclic aromatic hydrocarbon is not sufficiently soluble in water, a hydrophilic group such as methacrylamide is introduced so that the analyte concentration can be detected even in an aqueous environment.
また、蛍光センサーとして、プラスチックフィルムなどの固相に直接蛍光物質を固定化する方法も開示されている（特許文献３）。特許文献３では発光性、発蛍光性または発色性の原子団にフェニルボロン酸をただ一つ付加したものを用いている。
しかしながら、上記特許文献１記載の化合物は、発蛍光性原子団としてナフチル基やアンスリル基などの嵩高くかつ疎水性の部位を有するため、水溶性の糖類との結合が容易でなく、検出感度の向上が望まれる。また、特許文献２記載の化合物は、実施例６のＧにおいてメタクリル酸などの親水性モノマーと重合を行う際に、エチレングリコールを溶液として用いている。 However, since the compound described in Patent Document 1 has a bulky and hydrophobic site such as a naphthyl group or anthryl group as a fluorescent atomic group, it is not easy to bond with a water-soluble saccharide, and detection sensitivity is low. Improvement is desired. In addition, the compound described in Patent Document 2 uses ethylene glycol as a solution when polymerizing with a hydrophilic monomer such as methacrylic acid in G of Example 6.
一方、蛍光センサーとして使用するために蛍光物質を直接基材に固定すると、蛍光物質による被検出物質の検出能が固定前よりも低下する場合がある。 On the other hand, when a fluorescent substance is directly fixed to a substrate for use as a fluorescent sensor, the detection ability of the substance to be detected by the fluorescent substance may be lower than before fixation.
このような状況下、本発明は、グルコースなどの糖類検出能に優れる蛍光モノマー化合物、蛍光センサー物質および該蛍光センサー物質を使用した糖類測定用センサーを提供することを目的とする。 Under such circumstances, an object of the present invention is to provide a fluorescent monomer compound having excellent ability to detect saccharides such as glucose, a fluorescent sensor substance, and a saccharide measuring sensor using the fluorescent sensor substance.
本発明者は、糖類測定用蛍光モノマー化合物における糖類の結合状態を詳細に検討した結果、糖類検出のためのモノマー化合物に親水性基を導入すると、該疎水性部位の自由度を確保しつつ糖類との結合を促進できること、更に該蛍光モノマー化合物を（メタ）アクリルアミドと共重合させると、これを基材に固定した場合であっても血液や体液などの水溶液中でも検出感度を下げることなく、糖類の測定ができることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of examining in detail the binding state of saccharides in the fluorescent monomer compound for measuring saccharides, the present inventor has introduced a hydrophilic group into the monomer compound for saccharide detection, while ensuring the degree of freedom of the hydrophobic site. Linking the fluorescent monomer compound with (meth) acrylamide, even if it is fixed to a substrate, the sugars can be used without reducing the detection sensitivity even in an aqueous solution such as blood or body fluid. As a result, the present invention was completed.
本発明による、糖類測定用の蛍光モノマー化合物、蛍光センサー物質、および検出層は糖類検出能に優れる。また、体液中の糖類検出能に優れるため、長期間の埋め込みに耐える蛍光センサーとなる。 The fluorescent monomer compound, fluorescent sensor substance, and detection layer for saccharide measurement according to the present invention are excellent in saccharide detection ability. Moreover, since it is excellent in the ability to detect saccharides in body fluids, it becomes a fluorescent sensor that can withstand long-term implantation.
本発明の第一は、化学式１に示す蛍光モノマー化合物である。 The first of the present invention is a fluorescent monomer compound represented by Chemical Formula 1.
化学式１において、Ｘ１およびＸ２は同一または異なっていてもよく、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＨ２ＮＲ−、−ＮＲ−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＲＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＲ−および−ＣＯ−からなる群より選択される少なくとも１種の置換基を含む炭素数１〜３０のアルキレンを示し、Ｒは水素または置換されていてもよいアルキル基である。本明細書において少なくとも１種の置換基を含むアルキレンとは、アルキレンの端部に置換基を結合したもの、およびアルキレンの鎖中に置換基を有するものをいう。アルキレンの炭素数は１〜３０が好ましく、より好ましくは３〜１２である。具体的にはプロピレン、ヘキシレンおよびオクチレンなどがある。該アルキレンに含まれる置換基としては、好ましくは−ＮＲＣＯ−および−ＣＯＮＲ−が好ましい。Ｒがアルキル基である場合、炭素数１〜１０のものが好ましく、より好ましくは１〜５である。具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基またはペンチル基などがある。Ｒとしては水素が好ましい。 In Formula 1, X 1 and X 2 may be the same or different, and —COO—, —OCO—, —CH 2 NR—, —NR—, —NRCO—, —CONR—, —SO 2 NR—, -NRSO 2 -, - O -, - S -, - SS -, - NRCOO -, - OCONR- and -CO- is selected from the group consisting of 1 to 30 carbon atoms containing at least one substituent alkylene R is hydrogen or an optionally substituted alkyl group. In the present specification, an alkylene containing at least one kind of substituent refers to an alkylene having a substituent bonded to an end of the alkylene and an alkylene having a substituent in the chain. As for carbon number of alkylene, 1-30 are preferable, More preferably, it is 3-12. Specific examples include propylene, hexylene and octylene. The substituent contained in the alkylene is preferably —NRCO— or —CONR—. When R is an alkyl group, a C1-C10 thing is preferable, More preferably, it is 1-5. Specific examples include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, and a pentyl group. R is preferably hydrogen.
化学式１において、Ｚ１およびＺ２は同一または異なっていてもよく、−Ｏ−または−ＮＲ’−を示し、Ｒ’は水素または置換されてもよいアルキル基を示す。アルキル基としては、炭素数１〜１０のものが好ましく、より好ましくは１〜５である。具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基またはペンチル基などがある。Ｚ１およびＺ２としては、−Ｏ−が好ましい。 In Chemical Formula 1, Z 1 and Z 2 may be the same or different and each represents —O— or —NR′—, and R ′ represents hydrogen or an optionally substituted alkyl group. As an alkyl group, a C1-C10 thing is preferable, More preferably, it is 1-5. Specific examples include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, and a pentyl group. Z 1 and Z 2 are preferably —O—.
化学式１において、Ｙ１およびＹ２は同一または異なっていてもよく、置換されていてもよい２価の有機残基であり、蛍光モノマー化合物を水に溶解させうる。本発明において「蛍光モノマー化合物を水に溶解させうる」とは、有機溶媒や可溶化剤の存在無しに、蛍光モノマー化合物が、温度２５℃ｐＨ７．０の条件下において濃度１ｍＭ以上水に溶解し得ることをいう。Ｙ１およびＹ２としてアミノ基、カルボキシル基、スルホ基、ニトロ基、アミノ基、リン酸基および水酸基などの親水性基を有するものや、構造中にエーテル結合、アミド結合およびエステル結合などの親水性結合を有するものが例示できる。 In Chemical Formula 1, Y 1 and Y 2 may be the same or different and may be substituted divalent organic residues, and the fluorescent monomer compound can be dissolved in water. In the present invention, “fluorescent monomer compound can be dissolved in water” means that the fluorescent monomer compound is dissolved in water at a concentration of 1 mM or more under the condition of a temperature of 25 ° C. and pH 7.0 without the presence of an organic solvent or a solubilizing agent. Say to get. Y 1 and Y 2 having a hydrophilic group such as amino group, carboxyl group, sulfo group, nitro group, amino group, phosphoric acid group and hydroxyl group, and hydrophilic such as ether bond, amide bond and ester bond in the structure What has a sexual bond can be illustrated.
また、Ｙ１およびＹ２は該有機残基中に、下記化学式２または化学式３に示す構造を含むことが好ましく、更に、他の置換基や２価の有機残基を有していてもよい。化学式２〜３において、ｎは２〜４が好ましく、より好ましくは２または３であり、ｊは１〜３が好ましく、より好ましくは１であり、ｍは２０〜１５０が好ましく、より好ましくは４０〜１２０である。 Y 1 and Y 2 preferably contain a structure represented by the following chemical formula 2 or chemical formula 3 in the organic residue, and may have other substituents or divalent organic residues. . In Chemical Formulas 2-3, n is preferably 2-4, more preferably 2 or 3, j is preferably 1-3, more preferably 1, and m is preferably 20-150, more preferably 40. ~ 120.
該Ｙの分子量としては５００〜１０，０００が好ましく、より好ましくは１，０００〜５，０００である。化学式２または化学式３で示す２価の有機残基は、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールなどのアルキレングリコールまたはビニルアルコールなどを重合することで、調製することができる。 The molecular weight of Y is preferably 500 to 10,000, more preferably 1,000 to 5,000. The divalent organic residue represented by Chemical Formula 2 or Chemical Formula 3 can be prepared by polymerizing, for example, alkylene glycol such as ethylene glycol or propylene glycol, or vinyl alcohol.
本発明の特徴である蛍光モノマー化合物は親水性鎖Ｙの導入によって、より具体的には以下のような効果が得られる。（１）蛍光モノマー化合物が水溶性となるため、蛍光センサー物質を形成する際の固定化や重合反応を効率良く行う事が出来る。例えばアクリルアミドゲルを作製する場合は、水のみを溶媒として重合が可能であり、物理的強度、安定性、均一性が高いものが得られる。疎水性のモノマー化合物では可溶化させるために有機溶媒等を使用する必要があり、良好でない性状のゲルとなる場合がある。（２）親水性鎖の導入は被検出物質と相互作用するフェニルボロン酸周辺の環境や運動性を変化させ、感度、精度、応答速度、被測定物質である糖類の選択性の向上に寄与する。（３）親水性鎖が蛍光センサー物質全体、例えば重合された構造を安定化する。（４）水のみで反応できるため、有機溶剤に侵されやすい基材、例えばアクリル製のプレート等の上でも重合を行う事が出来る。 More specifically, the following effects can be obtained by introducing the hydrophilic chain Y in the fluorescent monomer compound which is a feature of the present invention. (1) Since the fluorescent monomer compound becomes water-soluble, it is possible to efficiently perform immobilization and polymerization reaction when forming the fluorescent sensor material. For example, when an acrylamide gel is prepared, polymerization can be performed using only water as a solvent, and a product having high physical strength, stability, and uniformity can be obtained. In order to solubilize the hydrophobic monomer compound, it is necessary to use an organic solvent or the like, which may result in an unfavorable gel. (2) Introduction of a hydrophilic chain changes the environment and motility around phenylboronic acid that interacts with the substance to be detected, contributing to improved sensitivity, accuracy, response speed, and selectivity of the saccharide as the substance to be measured. . (3) The hydrophilic chain stabilizes the entire fluorescent sensor material, for example a polymerized structure. (4) Since it can react only with water, it can superpose | polymerize also on the base material which is easily attacked by the organic solvent, for example, an acrylic plate.
化学式１において、Ｑ、Ｑ’、Ｑ’’およびＱ’’’は、水素、水酸基、置換されていてもよいアルキル基、アシル基、オキシアルキル基、ハロゲン、カルボキシル基、カルボキシエステル、カルボキシアミド、シアノ基、ニトロ基、アミノ基およびアミノアルキル基からなる群より選択される置換基である。アルキル基としては、炭素数１〜１０のものが好ましく、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基またはペンチル基などがあり；アシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基またはイソブチリル基などがあり；オキシアルキル基としては、メトキシ基、エトキシ基などがあり；ハロゲンとしては、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、またはＩ−などがあり；アミノアルキル基としては、メチルアミノ基、エチルアミノ基などがある。Ｑ、Ｑ’、Ｑ’’およびＱ’’’は同一または異なっていてもよく、ＱおよびＱ’は一緒になって縮合環を形成していてもよく、Ｑ’’およびＱ’’’は一緒になって縮合環を形成していてもよい。Ｑ、Ｑ’、Ｑ’’およびＱ’’’として、ニトロ基、シアノ基またはアシル基などを導入すると、蛍光の赤色変移または励起波長ピークと蛍光波長ピークとの間隔拡大に寄与するといった効果が得られる。本発明では、Ｑ、Ｑ’、Ｑ’’およびＱ’’’のうち、少なくとも一つが、アセチル基、カルボキシエステルおよびシアノ基からなる群より選択される１種であり、残りが水素であることが好ましい。 In Formula 1, Q, Q ′, Q ″ and Q ′ ″ are hydrogen, hydroxyl group, optionally substituted alkyl group, acyl group, oxyalkyl group, halogen, carboxyl group, carboxyester, carboxyamide, It is a substituent selected from the group consisting of a cyano group, a nitro group, an amino group, and an aminoalkyl group. As the alkyl group, those having 1 to 10 carbon atoms are preferable, and specifically, there are a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, and the like; examples of the acyl group include a formyl group, an acetyl group, and a propionyl group. Oxyalkyl groups include methoxy groups and ethoxy groups; halogens include F-, Cl-, Br-, and I-; aminoalkyl groups include , Methylamino group, ethylamino group and the like. Q, Q ′, Q ″ and Q ′ ″ may be the same or different, Q and Q ′ may be combined to form a condensed ring, and Q ″ and Q ′ ″ are Together, they may form a condensed ring. Introducing a nitro group, a cyano group or an acyl group as Q, Q ′, Q ″ and Q ′ ″ has the effect of contributing to the red transition of fluorescence or the expansion of the interval between the excitation wavelength peak and the fluorescence wavelength peak. can get. In the present invention, at least one of Q, Q ′, Q ″, and Q ′ ″ is one selected from the group consisting of an acetyl group, a carboxy ester, and a cyano group, and the remainder is hydrogen. Is preferred.
本発明の蛍光モノマー化合物は、糖類検出のためのモノマー化合物に上記Ｘを介してＹを導入する点に特徴があり、これによって蛍光モノマー化合物の物理的性質や安定性、検出感度、検出精度、被測定物質である糖類の選択性などを向上させることができる。 The fluorescent monomer compound of the present invention is characterized in that Y is introduced into the monomer compound for saccharide detection via the above X, whereby the physical properties and stability of the fluorescent monomer compound, detection sensitivity, detection accuracy, It is possible to improve the selectivity of the saccharide that is the substance to be measured.
なお、上記のように、本発明の蛍光モノマー化合物はアントラセン骨格を含むフェニルボロン酸誘導体であり、アントラセン骨格は発蛍光性原子団として作用することが知られている。フェニルボロン酸部位と糖とが安定な複合体を形成すると、発蛍光性原子団の介在によって蛍光を発するが、本発明の蛍光モノマー化合物は２つのフェニルボロン酸を有するため、特に糖類の検出感度に優れている。なお、化学式１においてＺ１、およびＺ２に結合するＣＯＣＨＣＨ２は、該蛍光モノマー化合物が血液などの体液に溶解しないように基材その他と結合させるために導入したものである。 As described above, the fluorescent monomer compound of the present invention is a phenylboronic acid derivative containing an anthracene skeleton, and the anthracene skeleton is known to act as a fluorescent atomic group. When a phenylboronic acid moiety and a saccharide form a stable complex, it fluoresces due to the presence of a fluorescent atomic group. Since the fluorescent monomer compound of the present invention has two phenylboronic acids, the saccharide detection sensitivity is particularly high. Is excellent. Note that COCHCH 2 bonded to Z 1 and Z 2 in Chemical Formula 1 is introduced in order to bond the fluorescent monomer compound to a substrate or the like so as not to dissolve in body fluid such as blood.
本発明の第二は、少なくとも以下に記載の（Ｉ）および（ＩＩ）の２種の化合物を共重合してなる糖類測定用の蛍光センサー物質である。
（Ｉ）：上記化学式１で示す蛍光モノマー化合物
（ＩＩ）：（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体
上記蛍光モノマー化合物を用いて血液に含まれる糖類を検出するには、該蛍光モノマー化合物が、血液または体液などの水溶液に溶解したり流出したりしないように固定される必要がある。しかしながら、単に蛍光モノマー化合物を基材に固定すると、該蛍光モノマー化合物と糖との接触および結合が阻害され検出感度が低下する。本発明では、該蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体を共重合させ、該蛍光モノマー化合物に親水性のポリ（メタ）アクリルアミド鎖を導入して固定化することで蛍光モノマー化合物を不溶化し、かつ該蛍光モノマー化合物と糖との親和性を確保する。
The second of the present invention is a fluorescent sensor material for measuring sugars, which is obtained by copolymerizing at least two compounds (I) and (II) described below.
(I): Fluorescent monomer compound represented by Formula 1 (II): Polymerizable monomer containing (meth) acrylamide residue In order to detect saccharides contained in blood using the fluorescent monomer compound, the fluorescent monomer It is necessary to fix the compound so that it does not dissolve or flow out in an aqueous solution such as blood or body fluid. However, when the fluorescent monomer compound is simply fixed to the substrate, contact and binding between the fluorescent monomer compound and the sugar are inhibited, and the detection sensitivity is lowered. In the present invention, the fluorescent monomer compound and a polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue are copolymerized, and a hydrophilic poly (meth) acrylamide chain is introduced and immobilized on the fluorescent monomer compound. The fluorescent monomer compound is insolubilized and the affinity between the fluorescent monomer compound and sugar is ensured.
（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体としては、得られた重合体がその構造中にアクリロイル基とアミドとを有すればよく、（メタ）アクリルアミドやそれらの誘導体が含まれる。例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｔｒｉｓ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、Ｎ−（ｎ−ブトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−アクリルオイルリジンやＮ−アクリルオイルヘキサメチレンジアミンなどの（メタ）アクリルオイルクロライドとアミノ酸または活性アミノ基をもつ化合物との縮合体、および化学式４に示す化合物等がある。
As the polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue, the obtained polymer may have an acryloyl group and an amide in its structure, and (meth) acrylamide and derivatives thereof are included. For example, acrylamide, methacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-tert-butylacrylamide, N-tris-hydroxymethylacrylamide, N-hydroxymethylacrylamide, N- (n-butoxymethyl) acrylamide, Examples include condensates of (meth) acryloyl chlorides such as N-acryloyl lysine and N-acryloyl hexamethylene diamine with compounds having amino acids or active amino groups, and compounds represented by Chemical Formula 4.
化学式４において、Ａは、水素またはメチル基であり、ＵおよびＵ’は同一または異なっていてもよく、水素または置換されていてもよいアルキル基である。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基またはペンチル基などがある。 In Chemical Formula 4, A is hydrogen or a methyl group, U and U ′ may be the same or different, and are hydrogen or an optionally substituted alkyl group. Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, and a pentyl group.
（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体からなる重合体は親水性が高いため、蛍光モノマー化合物と結合すると、該蛍光モノマー化合物に存在するフェニルボロン酸を含む疎水性の強い発蛍光性原子団が親水性の高い構造体中に取り込まれる。これによって血液や体液に含まれる糖類を測定する場合であっても、水溶性の糖類が容易に該発蛍光性原子団に接近および結合することができる。 A polymer composed of a polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue has high hydrophilicity, and therefore, when combined with a fluorescent monomer compound, it has a strong hydrophobic fluorescent property including phenylboronic acid present in the fluorescent monomer compound. Atomic groups are incorporated into highly hydrophilic structures. Thus, even when measuring saccharides contained in blood or body fluid, water-soluble saccharides can easily approach and bind to the fluorescent atomic group.
蛍光センサー物質を構成する、該蛍光モノマー化合物（Ｉ）と該アクリルアミド残基を含む重合性単量体（ＩＩ）との共重合体組成モル比（（Ｉ）：（ＩＩ））は１：５０〜１：６，０００であることが好ましく、より好ましくは１：１５０〜１：３，０００である。モル比１：５０よりも蛍光モノマー化合物の割合が大きくなると、該蛍光モノマー化合物の嵩高さのため自由度が失われ、糖類との相互作用が低下するおそれがある。一方、モル比１：６，０００よりも蛍光モノマー化合物の割合が小さければ、蛍光強度の絶対量を確保できない場合がある。 The copolymer composition molar ratio ((I) :( II)) of the fluorescent monomer compound (I) and the polymerizable monomer (II) containing the acrylamide residue constituting the fluorescent sensor substance is 1:50. It is preferably ˜1: 6,000, more preferably 1: 150 to 1: 3,000. If the ratio of the fluorescent monomer compound is larger than the molar ratio 1:50, the degree of freedom is lost due to the bulk of the fluorescent monomer compound, and the interaction with the saccharide may be reduced. On the other hand, if the ratio of the fluorescent monomer compound is smaller than the molar ratio 1: 6,000, the absolute amount of fluorescence intensity may not be ensured.
上記二成分からなる蛍光センサー物質の、重量平均分子量は、ＧＰＣによるポリエチレンオキサイド換算で、５０，０００〜７５０，０００が好ましく、より好ましくは１５０，０００〜４５０，０００である。 The weight average molecular weight of the two-component fluorescent sensor material is preferably 50,000 to 750,000, more preferably 150,000 to 450,000 in terms of polyethylene oxide by GPC.
一方、本発明の蛍光センサー物質は、上記蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体とに加えて他の成分を併用してもよい。このような成分としては、架橋性単量体、他の架橋性成分、水中で陽イオンとなり得るカチオン性モノマー、水中で陰イオンとなり得るアニオン性モノマー、およびイオンを持たないノニオン系モノマーがある。 On the other hand, the fluorescent sensor material of the present invention may be used in combination with other components in addition to the fluorescent monomer compound and the polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue. Such components include crosslinkable monomers, other crosslinkable components, cationic monomers that can be cations in water, anionic monomers that can be anions in water, and nonionic monomers that do not have ions.
架橋性単量体としては、重合性二重結合によって蛍光センサー物質中に三次元架橋構造を導入し得るものを広く含み、使用する蛍光センサー物質の置換基によっても異なるが、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）−ビス（メタ）アクリルアミド、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリントリ（メタ）アクリレート、グリセリンアクリレートメタクリレート、エチレンオキサイド変性トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレートなどのジビニル化合物がある。本発明では、これらの２種以上を併用してもよい。 The crosslinkable monomer widely includes those capable of introducing a three-dimensional cross-linked structure into the fluorescent sensor substance by a polymerizable double bond, and varies depending on the substituent of the fluorescent sensor substance to be used, but N, N′— Methylenebis (meth) acrylamide, N, N ′-(1,2-dihydroxyethylene) -bis (meth) acrylamide, diethylene glycol di (meth) acrylate, (poly) ethylene glycol di (meth) acrylate, triethylene glycol di (meta) ) Acrylate, propylene glycol di (meth) acrylate, trimethylolpropane di (meth) acrylate, trimethylolpropane tri (meth) acrylate, pentaerythritol di (meth) acrylate, pentaerythritol tri (meth) acrylate, pentaerythritol te La (meth) acrylate, (poly) propylene glycol di (meth) acrylate, glycerin tri (meth) acrylate, glycerin acrylate methacrylate, ethylene oxide modified trimethylolpropane tri (meth) acrylate, pentaerythritol tetra (meth) acrylate, dipenta There are divinyl compounds such as erythritol hexa (meth) acrylate. In the present invention, two or more of these may be used in combination.
他の架橋性成分としては、２個以上の官能基を有する化合物を広く含み、使用する蛍光センサー物質の置換基によっても異なるが、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレート、トリアリルホスフェート、トリアリルアミン、ポリ（メタ）アリロキシアルカン、（ポリ）エチレングリコールジグリシジルエ−テル、グリセロールジグリシジルエーテル、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ペンタエリスリトール、エチレンジアミン、ポリエチレンイミン、グリシジル（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリアリル、トリメチロールプロパンジ（メタ）アリルエーテル、テトラアリロキシエタンまたはグリセロールプロポキシトリアクリレートなども挙げることが出来る。本発明では、これらの２種以上を併用してもよい。 Other crosslinkable components widely include compounds having two or more functional groups, and depending on the substituent of the fluorescent sensor material used, triallyl cyanurate, triallyl isocyanurate, triallyl phosphate, triallylamine , Poly (meth) allyloxyalkane, (poly) ethylene glycol diglycidyl ether, glycerol diglycidyl ether, ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin, pentaerythritol, ethylenediamine, polyethyleneimine, glycidyl (meth) acrylate, Mention may also be made of triallyl isocyanurate, trimethylolpropane di (meth) allyl ether, tetraallyloxyethane or glycerol propoxytriacrylate. In the present invention, two or more of these may be used in combination.
水中で陽イオンとなり得るカチオン性モノマーとしては、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレートまたは４−ビニルピリジンなどを挙げることができる。本発明では、これらの２種以上を併用してもよい。 Examples of the cationic monomer that can become a cation in water include dimethylaminoethyl (meth) acrylate, diethylaminoethyl (meth) acrylate, and 4-vinylpyridine. In the present invention, two or more of these may be used in combination.
水中で陰イオンとなり得るアニオン性モノマーとしては、（メタ）アクリル酸、ビニルプロピオン酸または４−ビニルベンゼンスルホン酸などを挙げることができる。本発明では、これらの２種以上を併用してもよい。 Examples of the anionic monomer that can be an anion in water include (meth) acrylic acid, vinylpropionic acid, 4-vinylbenzenesulfonic acid, and the like. In the present invention, two or more of these may be used in combination.
イオンを持たないノニオン系モノマーとしては、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、３−メトキシプロピル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２−メトキシエチルアクリレートまたは１，４−シクロヘキサンジメタノールモノアクリレートなどを挙げることができる。本発明では、これらの２種以上を併用してもよい。 Nonionic monomers having no ions include 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, 3-methoxypropyl (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl (meth) acrylate, 2-methoxyethyl acrylate, or 1,4-cyclohexanedimethanol A monoacrylate etc. can be mentioned. In the present invention, two or more of these may be used in combination.
またこれらの架橋性単量体、他の架橋性成分、カチオン性モノマー、アニオン性モノマーおよびノニオン系モノマーは２種以上併用してもよい。これらの他の成分の配合量は、蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体との合計量の０．１〜１０モル％が好ましく、より好ましくは２〜７モル％である。これら他の成分の併用によって、三次元架橋構造を形成させることができ、また、親水性の調節、反応起点の導入などを行うことができる。なお、三次元架橋構造については後述する。 These crosslinkable monomers, other crosslinkable components, cationic monomers, anionic monomers and nonionic monomers may be used in combination of two or more. The blending amount of these other components is preferably 0.1 to 10 mol%, more preferably 2 to 7 mol% of the total amount of the fluorescent monomer compound and the polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue. It is. By using these other components in combination, a three-dimensional crosslinked structure can be formed, and hydrophilicity adjustment, introduction of a reaction starting point, and the like can be performed. The three-dimensional crosslinked structure will be described later.
本発明の蛍光センサー物質として、化学式５に示される構造を有していることが好ましい。 The fluorescent sensor material of the present invention preferably has a structure represented by Chemical Formula 5.
化学式５において、Ｘ１、Ｘ２、Ｚ１、Ｚ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｑ、Ｑ’、Ｑ’’およびＱ’’’は化学式１に示した蛍光モノマー化合物と同様である。Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ａ１およびＡ２は化学式４に示した（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体と同様である。 In the chemical formula 5, X 1 , X 2 , Z 1 , Z 2 , Y 1 , Y 2 , Q, Q ′, Q ″ and Q ′ ″ are the same as the fluorescent monomer compound shown in the chemical formula 1. U 1 , U 2 , U 3 , U 4 , A 1 and A 2 are the same as the polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue shown in Chemical Formula 4.
また、ｐ１とｑ１とのモル比（ｐ１：ｑ１）およびｐ２とｑ２とのモル比（ｐ２：ｑ２）は前記（Ｉ）：（ＩＩ）のモル比に対応して、１：５０〜１：６，０００が好ましく、より好ましくは１：１５０〜１：３，０００である。 Further, the molar ratio of p 1 and q 1 (p 1 : q 1 ) and the molar ratio of p 2 and q 2 (p 2 : q 2 ) correspond to the molar ratio of (I) :( II). The ratio is preferably 1:50 to 1: 6,000, more preferably 1: 150 to 1: 3,000.
本発明で使用する蛍光センサー物質は、該共重合体の少なくとも一部が分子間架橋を形成し、三次元架橋構造を示していてもよい。ポリ（メタ）アクリルアミド鎖に三次元架橋を形成させると上記蛍光モノマー化合物が基材に固定され、水溶液中でも蛍光モノマー化合物を溶出させることなく糖類の検出が容易にできる。なお、本発明の蛍光モノマー化合物は上記したように糖類と結合して蛍光を発する疎水性部位を有するが、該疎水性部位はＹで示す二価の有機残基を介してポリ（メタ）アクリルアミド鎖に結合されるために水溶液中で糖類と結合できる自由度が確保されている。従って、三次元架橋構造を形成しても糖類の検出感度を低下させることがない。 In the fluorescent sensor material used in the present invention, at least a part of the copolymer may form an intermolecular crosslink, and may exhibit a three-dimensional crosslink structure. When a three-dimensional cross-link is formed on the poly (meth) acrylamide chain, the fluorescent monomer compound is fixed to the substrate, and saccharides can be easily detected without eluting the fluorescent monomer compound even in an aqueous solution. The fluorescent monomer compound of the present invention has a hydrophobic moiety that emits fluorescence by binding to saccharides as described above, and the hydrophobic moiety is poly (meth) acrylamide via a divalent organic residue represented by Y. Since it is bonded to the chain, a degree of freedom for bonding with saccharides in an aqueous solution is secured. Therefore, even if a three-dimensional cross-linked structure is formed, the sugar detection sensitivity is not lowered.
本発明の蛍光モノマー化合物や蛍光センサー物質の製造方法および、三次元架橋構造の形成方法には制限がないが、以下の方法で製造することができる。 Although there is no restriction | limiting in the manufacturing method of the fluorescent monomer compound and fluorescent sensor substance of this invention, and the formation method of a three-dimensional crosslinked structure, It can manufacture with the following method.
（１−１）蛍光モノマー化合物の製造
化学式１で示される蛍光モノマー化合物として、Ｘが−Ｃ６Ｈ１２−ＮＨＣＯ−、ＹがＰＥＧ残基、Ｚが−Ｏ−、Ｑが−ＣＯＣＨ３基、Ｑ’、Ｑ’’およびＱ’’’が水素である化合物、９，１０−ビス（メチレン）［［Ｎ−（オルトボロノベンジル）メチレン］−Ｎ−［（アクリロイルポリオキシエチレン）カルボニルアミノ］−ｎ−ヘキサメチレン］−２−アセチルアントラセン（Ｆ−ＰＥＧ−ＡＡｍ−１）の製造方法の１例として、図１に示す合成スキームに従って説明する。
(1-1) Production of Fluorescent Monomer Compound As the fluorescent monomer compound represented by Chemical Formula 1, X is —C 6 H 12 —NHCO—, Y is a PEG residue, Z is —O—, Q is —COCH 3 group, Compound in which Q ′, Q ″ and Q ′ ″ are hydrogen, 9,10-bis (methylene) [[N- (orthoboronobenzyl) methylene] -N-[(acryloylpolyoxyethylene) carbonylamino] An example of a method for producing -n-hexamethylene] -2-acetylanthracene (F-PEG-AAm-1) will be described according to the synthesis scheme shown in FIG.
原料として２−アセチル−９，１０−ジメチルアントラセンを使用し、四塩化炭素／クロロホルム溶媒を加熱してＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）および過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）と反応させることにより、２−アセチル−９，１０−ビス（ブロモメチレン）アントラセンとする。次いで、これをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の溶媒中で、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）等の塩基存在下で、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−ヘキシルジアミンを反応させると、ブロモメチレン基が［（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシルアミノ］メチレン基となる。これを、ＤＭＦ等の溶媒中で、ＤＩＥＡ等の塩基存在下で、２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサボナリンを作用させると、９，１０−ビス［［Ｎ−６’−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシル−Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノ］メチル］−２−アセチルアントラセンが得られる。これに塩酸等の酸を作用させて脱保護すると、９，１０−ビス（メチレン）［［Ｎ−（オルトボロノベンジル）メチレン］−Ｎ−（アミノヘキシル）］−２−アセチルアントラセンが得られる。次にアクリロイル−（ポリエチレングリコール）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを塩基性緩衝液中で反応させると、目的物を得ることができる。 By using 2-acetyl-9,10-dimethylanthracene as a raw material and heating a carbon tetrachloride / chloroform solvent to react with N-bromosuccinimide (NBS) and benzoyl peroxide (BPO), 2-acetyl- It is 9,10-bis (bromomethylene) anthracene. Next, when this is reacted with N- (t-butoxycarbonyl) -hexyldiamine in a solvent such as dimethylformamide (DMF) in the presence of a base such as diisopropylethylamine (DIEA), the bromomethylene group is converted to [(t -Butoxycarbonylamino) hexylamino] methylene group. When this is reacted with 2- (2-bromomethylphenyl) -1,3-dioxabonarin in a solvent such as DMF in the presence of a base such as DIEA, 9,10-bis [[N-6′- (T-Butoxycarbonylamino) hexyl-N- [2- (5,5-dimethylborinan-2-yl) benzyl] amino] methyl] -2-acetylanthracene is obtained. When an acid such as hydrochloric acid is allowed to act on this, 9,10-bis (methylene) [[N- (orthoboronobenzyl) methylene] -N- (aminohexyl)]-2-acetylanthracene is obtained. . Next, when acryloyl- (polyethylene glycol) -N-hydroxysuccinimide ester is reacted in a basic buffer, the desired product can be obtained.
なお、原料化合物として、アントラセン骨格に化学式１で示すＱで示す置換基として上記化合物と異なる原料化合物を使用すると、溶媒、添加剤、反応温度、反応時間および分離方法等を適宜選択することでＱとしてアセチル基以外の基を有する化合物を製造することができる。 In addition, when a raw material compound different from the above compound is used as a raw material compound as a substituent represented by Q shown in Chemical Formula 1 in the anthracene skeleton, a solvent, an additive, a reaction temperature, a reaction time, a separation method, and the like can be appropriately selected. A compound having a group other than an acetyl group can be produced.
（１−２）蛍光モノマー化合物の製造
化学式１で示される蛍光モノマー化合物として、Ｘが−Ｃ６Ｈ１２−ＮＨＣＯ−、ＹがＰＥＧ残基、Ｚが−Ｏ−、Ｑが−ＣＯＯＣＨ３基、Ｑ’、Ｑ’’およびＱ’’’が水素である化合物、９，１０−ビス（メチレン）［［Ｎ−（オルトボロノベンジル）メチレン］−Ｎ−［（アクリロイルポリオキシエチレン）カルボニルアミノ］−ｎ−ヘキサメチレン］アントラセン−２−カルボキシメチルエステル（Ｆ−ＰＥＧ−ＡＡｍ−２）の製造方法の１例として、図５に示す合成スキームに従って説明する。
(1-2) as the fluorescent monomer compound represented by the manufacturing Formula 1 fluorescent monomer compound, X is -C 6 H 12 -NHCO-, Y is PEG residue, Z is -O-, Q is -COOCH 3 group, Compound in which Q ′, Q ″ and Q ′ ″ are hydrogen, 9,10-bis (methylene) [[N- (orthoboronobenzyl) methylene] -N-[(acryloylpolyoxyethylene) carbonylamino] -N-Hexamethylene] anthracene-2-carboxymethyl ester (F-PEG-AAm-2) is described as an example of the production method according to the synthesis scheme shown in FIG.
原料として９，１０−ジメチル−２−アセチルアントラセンを使用し、ジオキサン／過塩素酸ナトリウム水溶液に添加し、加熱攪拌後に酸を加えて、９，１０−ジメチルアントラセン−２−カルボン酸の沈殿物を得る。次いで、これを塩酸／メタノール溶媒に溶解し、加熱還流することにより、９，１０−ジメチルアントラセン−２−カルボキシメチルエステルとする。これを四塩化炭素／クロロホルム溶媒に溶解し、加熱してＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）および過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）と反応させることにより、９，１０−ビス（ブロモメチレン）アントラセン−２−カルボキシメチルエステルとする。次いで、これをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の溶媒中で、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）等の塩基存在下で、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−ヘキシルジアミンを反応させると、ブロモメチレン基が［（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシルアミノ］メチレン基となる。これを、ＤＭＦ等の溶媒中で、ＤＩＥＡ等の塩基存在下で、２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサボナリンを作用させると、９，１０−ビス［［Ｎ−６’−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシル−Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボキシメチルエステルが得られる。これに塩酸等の酸を作用させて脱保護すると、９，１０−ビス（メチレン）［［Ｎ−（オルトボロノベンジル）メチレン］−Ｎ−（アミノヘキシル）］アントラセン−２−カルボキシメチルエステルが得られる。次にアクリロイル−（ポリエチレングリコール）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを塩基性緩衝液中で反応させると、目的物を得ることができる。 Using 9,10-dimethyl-2-acetylanthracene as a raw material, adding it to a dioxane / sodium perchlorate aqueous solution, adding an acid after heating and stirring, and then depositing a 9,10-dimethylanthracene-2-carboxylic acid precipitate obtain. Next, this is dissolved in hydrochloric acid / methanol solvent and heated to reflux to give 9,10-dimethylanthracene-2-carboxymethyl ester. This is dissolved in a carbon tetrachloride / chloroform solvent and heated to react with N-bromosuccinimide (NBS) and benzoyl peroxide (BPO) to give 9,10-bis (bromomethylene) anthracene-2-carboxymethyl. Esters. Next, when this is reacted with N- (t-butoxycarbonyl) -hexyldiamine in a solvent such as dimethylformamide (DMF) in the presence of a base such as diisopropylethylamine (DIEA), the bromomethylene group is converted to [(t -Butoxycarbonylamino) hexylamino] methylene group. When this is reacted with 2- (2-bromomethylphenyl) -1,3-dioxabonarin in the presence of a base such as DIEA in a solvent such as DMF, 9,10-bis [[N-6′- (T-Butoxycarbonylamino) hexyl-N- [2- (5,5-dimethylborinan-2-yl) benzyl] amino] methyl] anthracene-2-carboxymethyl ester is obtained. When an acid such as hydrochloric acid is allowed to act on this, 9,10-bis (methylene) [[N- (orthoboronobenzyl) methylene] -N- (aminohexyl)] anthracene-2-carboxymethyl ester is obtained. can get. Next, when acryloyl- (polyethylene glycol) -N-hydroxysuccinimide ester is reacted in a basic buffer, the desired product can be obtained.
なお、原料化合物として、アントラセン骨格に化学式１で示すＱで示す置換基として上記化合物と異なる原料化合物を使用すると、溶媒、添加剤、反応温度、反応時間および分離方法等を適宜選択することでＱとしてカルボキシメチルエステル以外の基を有する化合物を製造することができる。 In addition, when a raw material compound different from the above compound is used as a raw material compound as a substituent represented by Q shown in Chemical Formula 1 in the anthracene skeleton, a solvent, an additive, a reaction temperature, a reaction time, a separation method, and the like can be appropriately selected. A compound having a group other than carboxymethyl ester can be produced.
（２）蛍光センサー物質の製造
化学式１で示す蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体との共重合は、溶媒の下で、重合促進剤または重合開始剤を用いることができる。溶媒としては、水を使用することができる。蛍光モノマー化合物を水溶性にできる程度の親水性を有するＹを導入することにより溶媒が水のみでも重合が可能となった。また、水にジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エチレングリコール、ジエチレングリコールなどのいずれか１種以上を混合したものも用いることができる。本発明において、有機溶媒を混合する場合には、その含有量は１０〜５０質量％混合することが好ましく、より好ましくは２０〜３０質量％である。
(2) Production of fluorescent sensor substance Copolymerization of a fluorescent monomer compound represented by Chemical Formula 1 and a polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue is performed using a polymerization accelerator or a polymerization initiator in a solvent. Can do. Water can be used as the solvent. By introducing Y having a hydrophilicity enough to make the fluorescent monomer compound water-soluble, polymerization was possible even if the solvent was water alone. Moreover, what mixed any 1 or more types, such as dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, ethylene glycol, diethylene glycol, in water can also be used. In this invention, when mixing an organic solvent, it is preferable to mix the content 10-50 mass%, More preferably, it is 20-30 mass%.
化学式１で示す蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体との共重合に際して、更に他の成分を配合することもできる。他の成分を配合する場合、その配合量は、蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体との合計量の０．１〜１０モル％が好ましく、より好ましくは２〜７モル％である。他の成分を配合する場合、重合時に、重合開始剤や重合促進剤と同時に添加しておくことが好ましい。 In the copolymerization of the fluorescent monomer compound represented by Chemical Formula 1 and the polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue, other components can be further blended. When the other components are blended, the blending amount is preferably 0.1 to 10 mol%, more preferably 2 to 10% of the total amount of the fluorescent monomer compound and the polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue. 7 mol%. When other components are blended, it is preferably added at the same time as the polymerization initiator and the polymerization accelerator during the polymerization.
重合開始剤としては、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムまたは過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩；過酸化水素；アゾビス−２−メチルプロピオンアミジン塩酸塩またはアゾイソブチロニトリルなどのアゾ化合物；ベンゾイルパーオキシド、ラウロイルパーオキシド、クメンハイドロパーオキシドまたは酸化ベンゾイルなどのパーオキシド等を挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。この際、重合促進剤として亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、モール塩、ピロ重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドナトリウムスルホキシレートまたはアスコルビン酸などの還元剤；エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、グリシンまたはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどのアミン化合物；などの１種または２種以上を併用することもできる。重合温度は１５〜７５℃が好ましく、より好ましくは２０〜６０℃、重合時間は１〜２０時間、より好ましくは２〜８時間である。なお、重合開始剤として過硫酸塩と重合促進剤としてＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンとを併用する場合には、室温で重合を行うことができる点で、特に好ましい。 Examples of the polymerization initiator include persulfates such as ammonium persulfate, sodium persulfate, potassium persulfate or ammonium persulfate; hydrogen peroxide; azo compounds such as azobis-2-methylpropionamidine hydrochloride or azoisobutyronitrile. A peroxide such as benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, cumene hydroperoxide or benzoyl oxide, and the like, and one or more of these can be used. At this time, as a polymerization accelerator, a reducing agent such as sodium bisulfite, sodium sulfite, Mohr salt, sodium pyrobisulfite, sodium formaldehyde sulfoxylate or ascorbic acid; ethylenediamine, sodium ethylenediaminetetraacetate, glycine or N, N, N ′ , N′-tetramethylethylenediamine and other amine compounds; and the like can be used in combination. The polymerization temperature is preferably 15 to 75 ° C, more preferably 20 to 60 ° C, and the polymerization time is 1 to 20 hours, more preferably 2 to 8 hours. In the case of using a persulfate as a polymerization initiator and N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine as a polymerization accelerator in combination, it is particularly preferable because polymerization can be performed at room temperature.
一方、上記化学式５で示す化合物は、化学式１で示す蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体との共重合によらず製造することもできる。化学式１で示す蛍光モノマー化合物は複数の工程で合成されるため、化合物１で示す蛍光モノマー化合物を原料とすることなくその中間産物に他の化合物を作用させても、最終的に化学式５で示す蛍光センサー物質を製造することができる。例えば、図１のスキームで示した９，１０−ビス［［Ｎ−（６’−アミノヘキシル）−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）アミノ］メチル］−２−アセチルアントラセン、または図５のスキームで示した９，１０−ビス［［Ｎ−（６’−アミノヘキシル）−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボキシメチルエステルと（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体の重合物にカルボキシル基を導入したものとをカップリング試薬の存在下で作用させても、化学式５で示す蛍光センサー物質を製造することができる。また別の例として、予め（メタ）アクリルアミド残基を有する重合性単量体を重合した後、重合開始剤や重合促進剤の存在下で上記蛍光モノマー化合物と共重合させても化学式５で示す蛍光センサー物質を製造することができる。 On the other hand, the compound represented by the chemical formula 5 can also be produced regardless of the copolymerization of the fluorescent monomer compound represented by the chemical formula 1 and a polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue. Since the fluorescent monomer compound represented by the chemical formula 1 is synthesized in a plurality of steps, even if another compound is allowed to act on the intermediate product without using the fluorescent monomer compound represented by the compound 1 as a raw material, the chemical monomer compound is finally represented by the chemical formula 5. A fluorescent sensor material can be manufactured. For example, 9,10-bis [[N- (6′-aminohexyl) -N- (ortho-boronobenzyl) amino] methyl] -2-acetylanthracene shown in the scheme of FIG. 1 or the scheme of FIG. 9,10-bis [[N- (6′-aminohexyl) -N- (ortho-boronobenzyl) amino] methyl] anthracene-2-carboxymethyl ester and a polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue The fluorescent sensor substance represented by Chemical Formula 5 can also be produced by allowing a polymer obtained by introducing a carboxyl group to act in the presence of a coupling reagent. As another example, a polymerizable monomer having a (meth) acrylamide residue is previously polymerized and then copolymerized with the fluorescent monomer compound in the presence of a polymerization initiator or a polymerization accelerator, as shown in Chemical Formula 5. A fluorescent sensor material can be manufactured.
（３）三次元架橋構造の形成
本発明の蛍光センサー物質は、三次元架橋を有していてもよいのであるが、三次元架橋の導入方法も限定されない。本発明の蛍光センサー物質に架橋成分を作用させて、蛍光センサー物質と蛍光センサー物質との少なくとも一部に分子間架橋を形成させる方法がある。
(3) Formation of three-dimensional cross-linking structure The fluorescent sensor substance of the present invention may have three-dimensional cross-linking, but the method for introducing the three-dimensional cross-linking is not limited. There is a method in which a crosslinking component is allowed to act on the fluorescent sensor material of the present invention to form intermolecular crosslinks on at least a part of the fluorescent sensor material and the fluorescent sensor material.
また、前記したように、化学式１で示す蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体との共重合に際して、反応溶媒に架橋成分を添加しても三次元架橋を形成させることができる。 Further, as described above, when the fluorescent monomer compound represented by Chemical Formula 1 and the polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue are copolymerized, a three-dimensional crosslinking is formed even if a crosslinking component is added to the reaction solvent. be able to.
一方、蛍光センサー物質を、体内埋め込み用の糖類測定用センサーとして使用する場合には蛍光センサー物質の流出を防止するため、基材に固定されることが一般的であるが、このような基材として、（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体またはその重合体を使用し、化学式１で示す蛍光モノマー化合物に必要に応じて架橋成分を使用し、これらを重合させ、基材への固定と三次元架橋とを同時に行うこともできる。 On the other hand, when a fluorescent sensor substance is used as a saccharide measuring sensor for implantation in the body, it is generally fixed to a base material in order to prevent the fluorescent sensor substance from flowing out. As a polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue or a polymer thereof, a fluorescent monomer compound represented by Chemical Formula 1 is optionally used with a crosslinking component, and these are polymerized to form a base material. Fixing and three-dimensional crosslinking can be performed simultaneously.
このような架橋成分としては、前記蛍光センサー物質の配合し得る他の成分の項で記載した架橋性単量体、他の架橋性成分、カチオン性モノマー、アニオン性モノマーおよびノニオン系モノマーを好ましく使用することができ、架橋性単量体および他の架橋性成分をより好ましく用いることができる。本発明では、これらの２種以上を併用してもよい。 As such a cross-linking component, the cross-linkable monomer, other cross-linkable component, cationic monomer, anionic monomer and nonionic monomer described in the section of other components which can be blended with the fluorescent sensor substance are preferably used. It is possible to use a crosslinkable monomer and other crosslinkable components more preferably. In the present invention, two or more of these may be used in combination.
本発明の第三は、上記蛍光センサー物質が基材に固定化されてなる検出層である。また、本発明の第四は、上記検出層を有する体内埋め込み用の糖類測定用センサーである。 A third aspect of the present invention is a detection layer in which the fluorescent sensor substance is immobilized on a substrate. A fourth aspect of the present invention is a saccharide measurement sensor for implantation in the body having the detection layer.
体内埋め込み用の糖類測定用センサーは、蛍光センサー物質が流出しないように基材などの固定材料に、共有結合や疎水結合によって、または電気的、その他の相互作用によって固定されていることが好ましい。本発明の蛍光センサー物質を使用した糖類検出方法の概略を、図２を用いて説明する。 The saccharide measurement sensor for implantation in the body is preferably fixed to a fixing material such as a base material by a covalent bond or a hydrophobic bond, or by electrical or other interaction so that the fluorescent sensor substance does not flow out. An outline of a saccharide detection method using the fluorescent sensor material of the present invention will be described with reference to FIG.
該センサーは、検出層１０を含み、検出層１０には蛍光センサー物質３０が基材４０を介して固定されている。蛍光センサー物質３０は、少なくとも黒丸で示す蛍光モノマー化合物３３と白丸で示す（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体３５を含む共重合体であり、水溶液中の糖類７０が蛍光モノマー化合物３３と相互作用すると蛍光を発する。検出層１０は、光学分離層２０を有していてもよい。検出層１０に光源５０から波長３５０〜４２０ｎｍの光を当て、反射された蛍光量または波長の変化を検出器６０によって検出すると、蛍光量に依存した糖類の濃度を知ることができる。本発明の検出層に使用する基材としては、例えばガラス、金属などの無機材料、プラスチックフィルムなどの有機材料を広く使用することができる。糖類測定用センサーに用いる検出層の基材としては、透明性に優れ、体液中でも溶解や溶出しない材料であることが好ましく、本発明では、ガラスやプラスチックフィルムの中でもポリ（メタ）アクリルアミド膜、またはポリ（メタ）アクリレート膜などを好ましく使用することができる。なお、上述したようにポリ（メタ）アクリルアミド膜を基材として使用すると、蛍光センサー物質の基材への固定と三次元架橋の形成とが同時に行える点で有利である。なお、架橋性重合体を使用した場合の架橋構造は、図２に示すように、（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体部位３５と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体部位３５との間、蛍光モノマー化合物部位３３と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体部位３５との間、または（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体部位３５と基材４０との間に形成される。 The sensor includes a detection layer 10, and a fluorescent sensor material 30 is fixed to the detection layer 10 via a substrate 40. The fluorescent sensor substance 30 is a copolymer including at least a fluorescent monomer compound 33 indicated by a black circle and a polymerizable monomer 35 containing a (meth) acrylamide residue indicated by a white circle, and the saccharide 70 in the aqueous solution is a fluorescent monomer compound 33. Fluoresce when interacting with. The detection layer 10 may have an optical separation layer 20. When light having a wavelength of 350 to 420 nm is applied to the detection layer 10 from the light source 50 and a change in the reflected fluorescence amount or wavelength is detected by the detector 60, the concentration of saccharide depending on the fluorescence amount can be known. As the substrate used for the detection layer of the present invention, for example, inorganic materials such as glass and metal, and organic materials such as plastic films can be widely used. The substrate of the detection layer used in the saccharide measurement sensor is preferably a material that is excellent in transparency and does not dissolve or elute even in body fluids. In the present invention, a poly (meth) acrylamide film among glass and plastic films, or A poly (meth) acrylate film or the like can be preferably used. As described above, the use of a poly (meth) acrylamide film as a substrate is advantageous in that the fluorescent sensor substance can be fixed to the substrate and three-dimensional crosslinking can be formed simultaneously. In addition, as shown in FIG. 2, the crosslinked structure when the crosslinkable polymer is used is a polymerizable monomer portion 35 containing a (meth) acrylamide residue and a polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue. Between the body part 35, between the fluorescent monomer compound part 33 and the polymerizable monomer part 35 containing a (meth) acrylamide residue, or the polymerizable monomer part 35 and a group containing a (meth) acrylamide residue. It is formed between the material 40.
蛍光センサー物質を無機材料または有機材料からなる基材表面に固定する場合、基材と蛍光センサー物質とを架橋剤などを使用して化学的に結合させることもできる。このような架橋剤としては、化学式６に示すシランカップリング剤がある。 When fixing a fluorescent sensor substance to the base material surface which consists of an inorganic material or an organic material, a base material and a fluorescent sensor substance can also be chemically combined using a crosslinking agent etc. As such a crosslinking agent, there is a silane coupling agent represented by Chemical Formula 6.
化学式６において、Ｒ”Ｏは、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基などの炭素数１〜５のアルコキシ基を示し、好ましくはメトキシ基、エトキシ基である。無機材料は、該アルコキシ基と化学結合をすることができる。Ｅは、ビニル基、エポキシ基、アミノ基、メルカプト基、アクリル基、メタクリル基、（メタ）アクリロイル基、またはこれらの誘導体であって、有機材料と化学結合することができる官能基である。本発明で好適に使用できるシランカップリング剤としては、ビニルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルエトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、および３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシランなどがある。 In Chemical Formula 6, R ″ O represents an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms such as a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group, preferably a methoxy group or an ethoxy group. The inorganic material is chemically bonded to the alkoxy group. E is a vinyl group, an epoxy group, an amino group, a mercapto group, an acrylic group, a methacryl group, a (meth) acryloyl group, or a derivative thereof, which can chemically bond with an organic material. Examples of the silane coupling agent that can be suitably used in the present invention include vinyltrimethoxysilane, 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane, N-2- (aminoethyl) -3-aminopropylethoxysilane, 3-mercaptopropyltrimethoxysilane, 3-acryloxypropyltrimethoxysilane, 3-methacryloxy Trimethoxysilane, and 3-methacryloxypropyl triethoxysilane, and the like.
上記シランカップリング剤のうち、Ｅがビニル基、アクリル基、メタクリル基、（メタ）アクリロイル基などの重合性二重結合を有する置換基である場合には、これをガラス、金属ななどの無機材料の表面に予め塗布しておけば、これら表面でフェニルボロン酸残基とアクリルアミド残基とを含む蛍光モノマー化合物と、（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体とを共重合させつつ直接固定化することもできる。なお、シランカップリング剤で表面処理した基材表面に直接蛍光センサー物質を固定することもできる。 Among the above silane coupling agents, when E is a substituent having a polymerizable double bond such as a vinyl group, an acrylic group, a methacryl group, or a (meth) acryloyl group, this is an inorganic material such as glass or metal. If pre-applied to the surface of the material, a fluorescent monomer compound containing a phenylboronic acid residue and an acrylamide residue and a polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue are copolymerized on these surfaces. Direct immobilization is also possible. In addition, a fluorescent sensor substance can also be directly fixed on the surface of a substrate surface-treated with a silane coupling agent.
一方、蛍光センサー物質をプラスチックフィルムなどの有機材料表面に固定するには、プラスチックフィルムに反応活性基を有する置換基を導入し、蛍光センサー物質と結合させてもよい。このような反応活性基の導入方法としては、例えば、特開平５−２４５１９８号公報に記載の、プラズマ、電子線、放射線などによるグリシジル（メタ）アクリレートのグラフト重合法などがある。 On the other hand, in order to fix the fluorescent sensor substance to the surface of an organic material such as a plastic film, a substituent having a reactive group may be introduced into the plastic film and bonded to the fluorescent sensor substance. As a method for introducing such a reactive group, there is, for example, a graft polymerization method of glycidyl (meth) acrylate by plasma, electron beam, radiation or the like described in JP-A-5-245198.
これらシランカップリング処理した無機材料または有機材料、もしくは反応活性基を導入したプラスチックフィルムに蛍光センサー物質をより結合しやすくするには、蛍光センサー物質の合成時に予め反応活性置換基を有する単量体を共重合成分として使用してもよく、蛍光センサー物質合成後に反応活性基を導入してもよい。このような単量体としては、蛍光センサー物質の項で記載したものを使用することができる。このような反応活性基としては、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、ハロゲン化カルボキシル基、スルホニル基、チオール基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、またはエポキシ基等がある。なお、シランカップリング処理した無機材料や有機材料上の反応活性基と蛍光センサー物質との結合は、適当な溶媒、触媒、縮合剤の存在下、非存在下に行うことができる。 In order to facilitate the binding of the fluorescent sensor substance to these silane-coupled inorganic or organic materials, or plastic films into which reactive active groups have been introduced, a monomer having reactive reactive substituents in advance during the synthesis of the fluorescent sensor substance May be used as a copolymerization component, and a reactive group may be introduced after the synthesis of the fluorescent sensor material. As such a monomer, those described in the section of the fluorescent sensor substance can be used. Examples of such reactive groups include amino groups, carboxyl groups, hydroxyl groups, halogenated carboxyl groups, sulfonyl groups, thiol groups, isocyanate groups, isothiocyanate groups, and epoxy groups. In addition, the coupling | bonding of the reactive active group on the inorganic material or organic material which carried out the silane coupling process, and a fluorescence sensor substance can be performed in the presence or absence of a suitable solvent, a catalyst, and a condensing agent.
本発明の体内埋め込み用の糖類測定用センサーは、少なくとも図２に示すように、蛍光センサー物質を固定した検出層、光源および蛍光検出装置を有すればよく、これらが適当なハウジング内に配置されていればよい。 The saccharide measurement sensor for implantation in the body of the present invention may have at least a detection layer, a light source and a fluorescence detection device to which a fluorescence sensor substance is fixed, as shown in FIG. 2, and these are arranged in a suitable housing. It only has to be.
本発明の検出層が、体内埋め込み用の糖類測定用センサー内に用いられる場合、図２に示すように検出層１０に光学分離層２０が積層されることが好ましい。光学分離層２０がセンサーの外表面側に配置されると、検出層１０に含まれる蛍光センサー物質と体液成分であるラジカル、酸化性物質または還元性物質などとの接触を回避することができ、これらの体液内成分による蛍光センサー物質の劣化を防止することができる。また、光学分離層２０を積層すると、光源５０から発した励起光の反射や散乱による検出能の低下も防止することができる。更に、糖類以外の生体物質が光源からの励起光により励起した場合であっても、光学分離層２０の存在によって光源５０からの励起光外部由来の光を遮蔽し、または生体内の有色物質または蛍光物質の影響を排除することもできる。 When the detection layer of the present invention is used in a saccharide measurement sensor for implantation in the body, the optical separation layer 20 is preferably laminated on the detection layer 10 as shown in FIG. When the optical separation layer 20 is disposed on the outer surface side of the sensor, it is possible to avoid contact between the fluorescent sensor substance contained in the detection layer 10 and a radical, an oxidizing substance or a reducing substance that is a body fluid component, Deterioration of the fluorescent sensor material due to these body fluid components can be prevented. Further, when the optical separation layer 20 is laminated, it is possible to prevent a decrease in detection ability due to reflection or scattering of excitation light emitted from the light source 50. Furthermore, even when biological substances other than saccharides are excited by excitation light from the light source, the presence of the optical separation layer 20 blocks light derived from the outside of the excitation light from the light source 50, or It is also possible to eliminate the influence of fluorescent substances.
このような作用を有する光学分離層２０は、光学分離層基材と不透明物質とからなる。光学分離層基材としては、架橋または化学修飾されていてもよい高分子が選択され、高分子として例えばデキストラン、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアミド、ポリウレタン、これらの混合物、またはこれらの共重合体などがある。また、光学分離層基材にはビタミンＥ、ポリフェノール類または金属キレート類などで修飾したり、またはこれらを担持したりしてもよい。また、不透明物質としては、カーボンブラック、フラーレン、カーボンナノチューブ、または酸化鉄などを用いることができる。 The optical separation layer 20 having such an action includes an optical separation layer base material and an opaque substance. As the optical separation layer substrate, a polymer that may be cross-linked or chemically modified is selected. Examples of the polymer include dextran, poly (meth) acrylamide, poly (meth) acrylate, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyamide, and polyurethane. , A mixture thereof, or a copolymer thereof. Further, the optical separation layer substrate may be modified with vitamin E, polyphenols, metal chelates, or the like, or may be supported with these. As the opaque substance, carbon black, fullerene, carbon nanotube, iron oxide, or the like can be used.
検出層１０と光学分離層２０とは共有結合、イオン結合または疎水結合などにより、化学結合によって積層させることができる。例えば、光学分離層がその基材としてデキストランを、不透明物質としてカーボンブラックを使用する場合には、溶媒にデキストランを溶解させた後にカーボンブラックを添加し、超音波処理により均一化し、これにアルカリ水溶液とエチレングリコールジグリシジルエーテルを更に添加する。ついで、検出層に噴霧器を用いて上記溶液を均一に噴霧し、加熱および乾燥して検出層に光学分離層を積層する。 The detection layer 10 and the optical separation layer 20 can be laminated by chemical bonds such as covalent bonds, ionic bonds, or hydrophobic bonds. For example, when the optical separation layer uses dextran as a base material and carbon black as an opaque substance, carbon black is added after dissolving dextran in a solvent, and the mixture is homogenized by ultrasonic treatment. And ethylene glycol diglycidyl ether are further added. Next, the solution is uniformly sprayed on the detection layer using a sprayer, heated and dried, and an optical separation layer is laminated on the detection layer.
図３に本発明の体内埋め込み用の糖類測定用センサーの外観の斜視図を示す。該体内埋め込み用の糖類測定用センサーは、その内部を液密に保つハウジング１１０、光学分離層または検出層のみを露出させる窓部１２０および体外のシステムと通信するためのアンテナ部１３０を有する。 FIG. 3 shows a perspective view of the appearance of the saccharide measuring sensor for implantation in the body of the present invention. The in-vivo saccharide measurement sensor has a housing 110 that keeps the inside thereof liquid-tight, a window portion 120 that exposes only the optical separation layer or the detection layer, and an antenna portion 130 that communicates with a system outside the body.
図４に該体内埋め込み用の糖類測定用センサーの内部構造を示す。光学分離層２０または検出層１０が内部を液密に保つために窓部１２０を塞ぐように設けられ、励起光を発する光源５０、光源５０からの光を検出層１０まで導く光学導波路１７０、検出層１０からの蛍光を検出する蛍光検出装置６０、蛍光検出装置６０からの信号データを処理する集積回路１４０および内部の電源である電池１５０が搭載されている。なお、アンテナ部１３０には、アンテナ用コイル１６０が配設されている。なお、図３、図４は概念図であり、実施はこれに限定するものではない。必要に応じて各構成物の大きさ、形状、配置を自由に設定できる。 FIG. 4 shows the internal structure of the saccharide measuring sensor for implantation in the body. An optical separation layer 20 or a detection layer 10 is provided so as to close the window 120 in order to keep the inside liquid-tight, and a light source 50 that emits excitation light, an optical waveguide 170 that guides light from the light source 50 to the detection layer 10, A fluorescence detection device 60 that detects fluorescence from the detection layer 10, an integrated circuit 140 that processes signal data from the fluorescence detection device 60, and a battery 150 that is an internal power source are mounted. The antenna unit 130 is provided with an antenna coil 160. 3 and 4 are conceptual diagrams, and the implementation is not limited to this. The size, shape, and arrangement of each component can be freely set as necessary.
体内埋め込み用の糖類測定用センサーを用いることにより、糖尿病患者が血糖値を自己制御する際の、煩雑性または血糖値のタイムラグの発生を回避することができる。また、体内埋め込み用の糖類測定用センサーを用いることにより、糖尿病患者以外の人々が、健康管理のための血糖値測定を簡便に行うことも可能となる。 By using the saccharide measurement sensor for implantation in the body, it is possible to avoid the complication or time lag of the blood glucose level when a diabetic patient self-controls the blood glucose level. In addition, by using a saccharide measurement sensor for implantation in the body, it is possible for people other than diabetics to easily perform blood glucose measurement for health management.
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but these examples do not limit the present invention at all.
（実施例１：９，１０−ビス（メチレン）［［Ｎ−（オルトボロノベンジル）メチレン］−Ｎ−［（アクリロイルポリオキシエチレン）カルボニルアミノ］−ｎ−ヘキサメチレン］−２−アセチルアントラセン（以下Ｆ−ＰＥＧ−ＡＡｍ−１と記載）の合成）
Ａ）９，１０−ビス（ブロモメチル）−２−アセチルアントラセンの合成
９，１０−ジメチル−２−アセチルアントラセン６００ｍｇ、Ｎ−ブロモスクシンイミド８００ｍｇ、過酸化ベンゾイル５ｍｇを、クロロホルム６ｍＬと四塩化炭素２０ｍＬの混合物に加え、８０℃で２時間加熱還流を行った。溶媒を除去後、残渣をメタノールで抽出し、７８０ｍｇの目的物を得た。
Example 1: 9,10-bis (methylene) [[N- (orthoboronobenzyl) methylene] -N-[(acryloylpolyoxyethylene) carbonylamino] -n-hexamethylene] -2-acetylanthracene ( Synthesis of F-PEG-AAm-1))
A) Synthesis of 9,10-bis (bromomethyl) -2-acetylanthracene 9,10-dimethyl-2-acetylanthracene 600 mg, N-bromosuccinimide 800 mg, benzoyl peroxide 5 mg, a mixture of chloroform 6 mL and carbon tetrachloride 20 mL In addition, the mixture was heated to reflux at 80 ° C. for 2 hours. After removing the solvent, the residue was extracted with methanol to obtain 780 mg of the desired product.
Ｂ） ９，１０−ビス［６’−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシルアミノメチル］−２−アセチルアントラセンの合成
上記Ａ）で得た生成物５００ｍｇ、Ｎ−ＢＯＣ−ヘキシルジアミン１．１２５ｇ、ジイソプロピルエチルアミン１．２５ｍＬをジメチルホルムアミド１０ｍＬに溶解し、４５℃で１時間攪拌反応を行った。反応混合物はクロロホルム６０ｍＬで希釈し、水１００ｍＬで３回、飽和食塩水１００ｍＬで１回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾過後、濃縮しクロロホルム／メタノールを溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、３６７ｍｇの目的物を得た。
B) Synthesis of 9,10-bis [6 ′-(t-butoxycarbonylamino) hexylaminomethyl] -2-acetylanthracene 500 mg of the product obtained in A) above, 1.125 g of N-BOC-hexyldiamine, diisopropyl Ethylamine (1.25 mL) was dissolved in dimethylformamide (10 mL) and stirred at 45 ° C. for 1 hour. The reaction mixture was diluted with 60 mL of chloroform, washed 3 times with 100 mL of water and once with 100 mL of saturated brine, and the organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate. The desiccant was filtered, concentrated, and purified by silica gel column chromatography eluting with chloroform / methanol to obtain 367 mg of the desired product.
Ｃ） ９，１０−ビス［［Ｎ−６’−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシル−Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノ］メチル］−２−アセチルアントラセンの合成
上記Ｂ）で得た生成物２００ｍｇ、２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサボリナン７００ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．３５ｍＬを３ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、２５℃で１６時間攪拌した。溶媒除去後、メタノール／クロロホルムを溶離液とするシリカゲルカラムで精製し目的物１９４ｍｇを得た。
C) 9,10-bis [[N-6 '-(t-butoxycarbonylamino) hexyl-N- [2- (5,5-dimethylborinan-2-yl) benzyl] amino] methyl] -2- Synthesis of acetylanthracene 200 mg of the product obtained in the above B), 700 mg of 2- (2-bromomethylphenyl) -1,3-dioxaborinane, 0.35 mL of N, N-diisopropylethylamine were dissolved in 3 mL of dimethylformamide, 25 Stir at 16 ° C. for 16 hours. After removing the solvent, the residue was purified by a silica gel column using methanol / chloroform as an eluent to obtain 194 mg of the desired product.
Ｄ） ９，１０−ビス［［Ｎ−（６’−アミノヘキシル）−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）アミノ］メチル］−２−アセチルアントラセンの合成
上記Ｃ）で得た生成物１００ｍｇを２ｍＬのメタノールに溶解し、４Ｎ塩酸２ｍＬを加えて２５℃で１０時間攪拌した。蒸発乾固後、ゲル濾過によって無機塩を除去し、目的物９５ｍｇを得た。
D) Synthesis of 9,10-bis [[N- (6′-aminohexyl) -N- (ortho-boronobenzyl) amino] methyl] -2-acetylanthracene 100 mg of the product obtained in C) above was added to 2 mL of methanol. 4N hydrochloric acid 2mL was added, and it stirred at 25 degreeC for 10 hours. After evaporation to dryness, inorganic salts were removed by gel filtration to obtain 95 mg of the desired product.
Ｅ） Ｆ−ＰＥＧ−ＡＡｍ−１の合成
上記Ｄ）で得た生成物１６０ｍｇを０．５ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、アクリロイル−（ポリエチレングリコール）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＰＥＧ分子量３，４００）１．２２ｇの１０ｍＬ１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）溶液に加え、２５℃で２０時間攪拌した。反応混合物をゲル濾過に供し、蛍光高分子画分を採取し、凍結乾燥後、目的物１．２ｇを得た。上記Ａ）〜Ｅ）を図１の合成スキームに示す。Ｆ−ＰＥＧ−ＡＡｍ−１は有機溶媒や可溶化剤の存在無しに、温度２５℃ｐＨ７．０の条件下において濃度１００ｍＭで水に溶解した。重クロロホルム中のＮＭＲデータは以下の通りであった。δ１．３０−１．６５（ｍ，Ｃ−ＣＨ２−Ｃ），２．９０（ｓ，Ａｃ），２．７８（ｍ，−Ｃ（−Ｃ）Ｎ−ＣＨ２−Ｃ），３．２５（ｍ，ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ），３．５０−３．８０（ｓ，ＰＥＧ），５．８０（ｄ，ＣＯＣＨ＝Ｃ），６．１７（ｍ，Ｃ＝ＣＨ２），７．２０−８．２０（ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ）、ＰＥＧ残基由来のピークと重なる水素のシグナルは確認出来なかった。
E) Synthesis of F-PEG-AAm-1 160 mg of the product obtained in D) above was dissolved in 0.5 mL of dimethylformamide, and acryloyl- (polyethylene glycol) -N-hydroxysuccinimide ester (PEG molecular weight 3,400). The solution was added to 1.22 g of 10 mL 100 mM phosphate buffer (pH = 8.0) solution and stirred at 25 ° C. for 20 hours. The reaction mixture was subjected to gel filtration, and the fluorescent polymer fraction was collected and lyophilized to obtain 1.2 g of the desired product. The above A) to E) are shown in the synthesis scheme of FIG. F-PEG-AAm-1 was dissolved in water at a concentration of 100 mM under the conditions of a temperature of 25 ° C. and a pH of 7.0 without the presence of an organic solvent or a solubilizing agent. The NMR data in deuterated chloroform was as follows. δ 1.30-1.65 (m, C—CH 2 —C), 2.90 (s, Ac), 2.78 (m, —C (—C) N—CH 2 —C), 3.25 (m, CH 2 -NH-COO ), 3.50-3.80 (s, PEG), 5.80 (d, COCH = C), 6.17 (m, C = CH 2), 7.20 −8.20 (m, aromatic), a signal of hydrogen overlapping with a peak derived from a PEG residue could not be confirmed.
（実施例２）
最終濃度としてアクリルアミドが１５質量％、実施例１で合成したＦ−ＰＥＧ−ＡＡｍ−１が１０質量％、メチレンビスアクリルアミドが０．３質量％、および過硫酸ナトリウムが０．１８質量％，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンが０．３６質量％となるように純水に溶解・混合して溶液を調製した。予め、シランカップリング剤による表面処理を行ったガラスプレートと無処理のガラスプレートとを隙間を設けて設置し、隙間に上記溶液を流し込み、窒素雰囲気下２５℃で８時間重合させた。重合終了後ガラスプレートを純水につけて、無処理のガラスプレートのみを剥がして、ガラス基材上にアクリルアミド／Ｆ−ＰＥＧ−ＡＡｍ−１（１６０／１モル比）が固定されたゲルシートを得た。
(Example 2)
The final concentration is 15% by mass of acrylamide, 10% by mass of F-PEG-AAm-1 synthesized in Example 1, 0.3% by mass of methylenebisacrylamide, 0.18% by mass of sodium persulfate, N, A solution was prepared by dissolving and mixing in pure water so that N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine was 0.36% by mass. A glass plate that had been surface-treated with a silane coupling agent in advance and an untreated glass plate were installed with a gap, and the solution was poured into the gap, and polymerization was performed at 25 ° C. for 8 hours in a nitrogen atmosphere. After completion of the polymerization, the glass plate was immersed in pure water, and only the untreated glass plate was peeled off to obtain a gel sheet in which acrylamide / F-PEG-AAm-1 (160/1 molar ratio) was fixed on the glass substrate. .
さらに、得られたゲルシート表面に最終濃度としてアクリルアミドが２０質量％、メチレンビスアクリルアミドが１質量％、および過硫酸ナトリウムが０．１８質量％、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンが０．３６質量％、カーボンブラックが５質量％となるように純水に溶解・混合して調製した溶液を積層し、窒素雰囲気下２５℃で２４時間重合させた。得られたゲルシートを、グルコース濃度５００ｍｇ／ｄＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）への浸漬洗浄３０分間を合計１０回繰り返した。その後５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）への浸漬洗浄３０分間を合計４回繰り返してグルコースを洗い流して検出層を得た。 Furthermore, the final concentration on the gel sheet surface is 20% by mass of acrylamide, 1% by mass of methylenebisacrylamide, 0.18% by mass of sodium persulfate, and N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine. Solutions prepared by dissolving and mixing in pure water such that 0.36% by mass and carbon black were 5% by mass were laminated and polymerized at 25 ° C. for 24 hours in a nitrogen atmosphere. The obtained gel sheet was subjected to immersion washing for 30 minutes in a 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) having a glucose concentration of 500 mg / dL for a total of 10 times. Thereafter, immersion detection in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) for 30 minutes was repeated a total of 4 times to wash out glucose and obtain a detection layer.
（実施例３：９，１０−ビス（メチレン）［［Ｎ−（オルトボロノベンジル）］−Ｎ−［（アクリロイルポリオキシエチレン）カルボニルアミノ］−ｎ−ヘキサメチレン］−アントラセン−２−カルボキシメチルエステル（以下Ｆ−ＰＥＧ−ＡＡｍ−２と記載）の合成）
ａ） ９，１０−ジメチルアントラセン−２−カルボン酸の合成
９，１０−ジメチル−２−アセチルアントラセン１．２ｇを２４ｍＬのジオキサンに溶解し、１０ｍＬの過塩素酸ナトリウム水溶液（有効塩素濃度１０質量％）を加え、８５℃で８時間攪拌反応した。反応混合物を冷却後に希塩酸で酸性とし、析出した沈殿をろ過および少量の水で洗浄した後に真空乾燥し、目的物１．１６ｇを得た。
Example 3: 9,10-bis (methylene) [[N- (orthoboronobenzyl)]-N-[(acryloylpolyoxyethylene) carbonylamino] -n-hexamethylene] -anthracene-2-carboxymethyl Ester (Synthesis of F-PEG-AAm-2)
a) Synthesis of 9,10-dimethylanthracene-2-carboxylic acid 1.2 g of 9,10-dimethyl-2-acetylanthracene was dissolved in 24 mL of dioxane, and 10 mL of an aqueous sodium perchlorate solution (effective chlorine concentration: 10% by mass) ), And the reaction was stirred at 85 ° C. for 8 hours. The reaction mixture was cooled and acidified with dilute hydrochloric acid, and the deposited precipitate was filtered and washed with a small amount of water, followed by vacuum drying to obtain 1.16 g of the desired product.
ｂ） ９，１０−ジメチルアントラセン−２−カルボキシメチルエステルの合成
上記ａ）で得られた生成物１ｇを５質量％塩酸−メタノールに溶解し、２０時間加熱還流を行った。反応混合物を濃縮し、３０ｍＬの水を加え、１００ｍＬのクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層は重炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。これを蒸発乾固し、９１５ｍｇの目的物を得た。
b) Synthesis of 9,10-dimethylanthracene-2-carboxymethyl ester 1 g of the product obtained in the above a) was dissolved in 5% by mass hydrochloric acid-methanol and heated to reflux for 20 hours. The reaction mixture was concentrated, 30 mL of water was added, and extraction was performed with 100 mL of chloroform. The chloroform layer was washed with an aqueous sodium bicarbonate solution and saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. This was evaporated to dryness to obtain 915 mg of the desired product.
ｃ） ９，１０−ビス（ブロモメチレン）アントラセン−２−カルボキシメチルエステルの合成
上記ｂ）で得た生成物６００ｍｇ、Ｎ−ブロモスクシンイミド８００ｍｇ、過酸化ベンゾイル５ｍｇを、クロロホルム６ｍＬと四塩化炭素２０ｍＬの混合物に加え、２時間加熱還流を行った。溶媒を除去後、残渣をメタノールで抽出し、７６７ｍｇの目的物を得た。
c) Synthesis of 9,10-bis (bromomethylene) anthracene-2-carboxymethyl ester 600 mg of the product obtained in the above b), 800 mg of N-bromosuccinimide, and 5 mg of benzoyl peroxide were mixed with 6 mL of chloroform and 20 mL of carbon tetrachloride. In addition to the mixture, it was heated to reflux for 2 hours. After removing the solvent, the residue was extracted with methanol to obtain 767 mg of the desired product.
ｄ） ９，１０−ビス［６’−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシルアミノメチル］アントラセン−２−カルボキシメチルエステルの合成
上記ｃ）で得た生成物５００ｍｇ、Ｎ−ＢＯＣ−ヘキシルジアミン１．１２５ｇ、ジイソプロピルエチルアミン１．２５ｍＬをジメチルホルムアミド１０ｍＬに溶解し、４５℃で２時間攪拌反応を行った。反応混合物はクロロホルム６０ｍＬで希釈し、水１００ｍＬで３回、飽和食塩水１００ｍＬで１回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾過後、濃縮しクロロホルム／メタノールを溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、３０７ｍｇの目的物を得た。
d) Synthesis of 9,10-bis [6 ′-(t-butoxycarbonylamino) hexylaminomethyl] anthracene-2-carboxymethyl ester 500 mg of the product obtained in c) above, 1.125 g of N-BOC-hexyldiamine , 1.25 mL of diisopropylethylamine was dissolved in 10 mL of dimethylformamide and stirred at 45 ° C. for 2 hours. The reaction mixture was diluted with 60 mL of chloroform, washed 3 times with 100 mL of water and once with 100 mL of saturated brine, and the organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate. The desiccant was filtered, concentrated, and purified by silica gel column chromatography eluting with chloroform / methanol to obtain 307 mg of the desired product.
ｅ） ９，１０−ビス［［Ｎ−６’−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシル−Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボキシメチルエステルの合成
上記ｄ）で得た生成物２００ｍｇ、２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサボリナン７００ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．３５ｍＬを３ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、２５℃で１６時間攪拌した。溶媒除去後、メタノール／クロロホルムを溶離液とするシリカゲルカラムで精製し目的物２０３ｍｇを得た。
e) 9,10-bis [[N-6 ′-(t-butoxycarbonylamino) hexyl-N- [2- (5,5-dimethylborinan-2-yl) benzyl] amino] methyl] anthracene-2 -Synthesis of carboxymethyl ester 200 mg of the product obtained in d) above, 700 mg of 2- (2-bromomethylphenyl) -1,3-dioxaborinane, and 0.35 mL of N, N-diisopropylethylamine were dissolved in 3 mL of dimethylformamide. And stirred at 25 ° C. for 16 hours. After removing the solvent, the residue was purified by a silica gel column using methanol / chloroform as an eluent to obtain 203 mg of the desired product.
ｆ） ９，１０−ビス（メチレン）［［Ｎ−（オルトボロノベンジル）メチレン］−Ｎ−（アミノヘキシル）］アントラセン−２−カルボキシメチルエステルの合成
上記ｅ）で得た生成物１００ｍｇを３ｍＬのメタノールに溶解し、８Ｎ塩酸０．５ｍＬを加えて２５℃で２日間攪拌した。蒸発乾固後、ゲル濾過によって無機塩を除去し、目的物８２ｍｇを得た。
f) Synthesis of 9,10-bis (methylene) [[N- (orthoboronobenzyl) methylene] -N- (aminohexyl)] anthracene-2-carboxymethyl ester 3 ml of 100 mg of the product obtained in e) above. Was dissolved in methanol, 0.5 mL of 8N hydrochloric acid was added, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 2 days. After evaporating to dryness, the inorganic salt was removed by gel filtration to obtain 82 mg of the desired product.
ｇ） Ｆ−ＰＥＧ−ＡＡｍ−２の合成
上記ｆ）で得た生成物１６０ｍｇを０．５ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、アクリロイル−（ポリエチレングリコール）−Ｎ−ヒドロキシスクシニイミドエステル（ＰＥＧ分子量３，４００）１．２２ｇの１０ｍＬ１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）溶液に加え、２５℃で２０時間攪拌した。反応混合物をゲル濾過に供し、蛍光高分子画分を採取し、凍結乾燥後、目的物１．１ｇを得た。上記ａ）〜ｅ）を図５の合成スキームに示す。Ｆ−ＰＥＧ−ＡＡｍ−２は有機溶媒や可溶化剤の存在無しに、温度２５℃ｐＨ７．０の条件下において濃度１００ｍＭで水に溶解した。重クロロホルム中のＮＭＲデータは以下の通りであった。d１．３０−１．６５（ｍ，Ｃ−ＣＨ２−Ｃ），２．７８（ｍ，−Ｃ（−Ｃ）Ｎ−ＣＨ２−Ｃ），３．２５（ｍ，ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ），３．５０−３．８０（ｓ，ＰＥＧ），４．１０（ｓ，ＣＯＯＣＨ３），５．８０（ｄ，ＣＯＣＨ＝Ｃ），６．１７（ｍ，Ｃ＝ＣＨ２），７．２０−８．２０（ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ），ＰＥＧ鎖ピークと重なる水素のシグナルは確認出来なかった。
g) Synthesis of F-PEG-AAm-2 160 mg of the product obtained in f) above was dissolved in 0.5 mL of dimethylformamide, and acryloyl- (polyethylene glycol) -N-hydroxysuccinimide ester (PEG molecular weight 3, 400) 1.22 g of 10 mL 100 mM phosphate buffer (pH = 8.0) solution was added and stirred at 25 ° C. for 20 hours. The reaction mixture was subjected to gel filtration, and the fluorescent polymer fraction was collected and lyophilized to obtain 1.1 g of the desired product. The above a) to e) are shown in the synthesis scheme of FIG. F-PEG-AAm-2 was dissolved in water at a concentration of 100 mM under the conditions of a temperature of 25 ° C. and a pH of 7.0 without the presence of an organic solvent or a solubilizing agent. The NMR data in deuterated chloroform was as follows. d1.30-1.65 (m, C-CH 2 -C), 2.78 (m, -C (-C) N-CH 2 -C), 3.25 (m, CH 2 -NH-COO ), 3.50-3.80 (s, PEG), 4.10 (s, COOCH 3 ), 5.80 (d, COCH = C), 6.17 (m, C = CH 2 ), 7. 20-8.20 (m, aromatic), a signal of hydrogen overlapping with the PEG chain peak could not be confirmed.
（実施例４）
実施例３で合成したＦ-ＰＥＧ−ＡＡｍ−２を用いて実施例２と同様の方法でガラス基材上にアクリルアミド／Ｆ−ＰＥＧ−ＡＡｍ−２（１６０／１モル比）が固定されたゲルシートを得た。さらに実施例２と同様の方法で検出層を得た。
Example 4
Gel sheet in which acrylamide / F-PEG-AAm-2 (160/1 molar ratio) was immobilized on a glass substrate in the same manner as in Example 2 using F-PEG-AAm-2 synthesized in Example 3 Got. Further, a detection layer was obtained in the same manner as in Example 2.
（比較例：９，１０−ビス（メチレン）［Ｎ−（アクリロイルアミノヘキシル）−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）メチレン］−アントラセン（以下Ｆ−ＡＡｍと記載）の合成） (Comparative Example: Synthesis of 9,10-bis (methylene) [N- (acryloylaminohexyl) -N- (ortho-boronobenzyl) methylene] -anthracene (hereinafter referred to as F-AAm))
Ａ’） ９，１０−ビス［６’−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシルアミノメチル］アントラセンの合成
９，１０−ビス（クロロメチル）−アントラセン５００ｍｇ、Ｎ−ＢＯＣ−ヘキシルジアミン１．３ｇ、ジイソプロピルエチルアミン１．２５ｍＬをジメチルスルホキシド１０ｍＬに溶解し、６０℃で６時間攪拌反応を行った。反応混合物はクロロホルム６０ｍＬで希釈し、水１００ｍＬで３回、飽和食塩水１００ｍＬで１回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾過後、濃縮しクロロホルム／メタノールを溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、５６ｍｇの目的物を得た。
A ′) Synthesis of 9,10-bis [6 ′-(t-butoxycarbonylamino) hexylaminomethyl] anthracene 9,10-bis (chloromethyl) -anthracene 500 mg, N-BOC-hexyldiamine 1.3 g, diisopropyl Ethylamine (1.25 mL) was dissolved in dimethyl sulfoxide (10 mL), and the mixture was stirred at 60 ° C. for 6 hours. The reaction mixture was diluted with 60 mL of chloroform, washed 3 times with 100 mL of water and once with 100 mL of saturated brine, and the organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate. The desiccant was filtered, concentrated, and purified by silica gel column chromatography eluting with chloroform / methanol to obtain 56 mg of the desired product.
Ｂ’） ９，１０−ビス［［Ｎ−６’−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキシル−Ｎ−［２−（５，５−ジメチルボリナン−２−イル）ベンジル］アミノ］メチル］アントラセンの合成
上記Ａ’）で得た生成物５０ｍｇ、２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサボリナン１７０ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．１ｍＬを１ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、２５℃で５時間攪拌した。溶媒除去後、メタノール／クロロホルムを溶離液とするシリカゲルカラムで精製し目的物３５ｍｇを得た。
B ′) 9,10-bis [[N-6 ′-(t-butoxycarbonylamino) hexyl-N- [2- (5,5-dimethylborinan-2-yl) benzyl] amino] methyl] anthracene Synthesis 50 mg of the product obtained in the above A ′), 170 mg of 2- (2-bromomethylphenyl) -1,3-dioxaborinane, and 0.1 mL of N, N-diisopropylethylamine were dissolved in 1 mL of dimethylformamide at 25 ° C. Stir for 5 hours. After removing the solvent, the residue was purified with a silica gel column using methanol / chloroform as an eluent to obtain 35 mg of the desired product.
Ｃ’） ９，１０−ビス［［Ｎ−（６’−アミノヘキシル）−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセンの合成
上記Ｂ’）で得た生成物３５ｍｇを１ｍＬのメタノールに溶解し、４Ｎ塩酸０．５ｍＬを加えて２５℃で１０時間攪拌した。蒸発乾固後、ゲル濾過によって無機塩を除去し、目的物２６ｍｇを得た。
C ′) Synthesis of 9,10-bis [[N- (6′-aminohexyl) -N- (ortho-boronobenzyl) amino] methyl] anthracene 35 mg of the product obtained in B ′) above was dissolved in 1 mL of methanol. Then, 0.5 mL of 4N hydrochloric acid was added and stirred at 25 ° C. for 10 hours. After evaporation to dryness, the inorganic salt was removed by gel filtration to obtain 26 mg of the desired product.
Ｄ’） Ｆ−ＡＡｍの合成
上記Ｃ’）で得た生成物２５ｍｇをＤＭＦ０．５ｍＬに溶解し、窒素雰囲気下、−１０℃でＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン２０ｍｇ、塩化アクリロイル１２ｍｇを加え、３０分攪拌反応を行った。反応混合物を氷水中に注ぎ、クロロホルムで抽出し、飽和食塩水で洗浄を行った。クロロホルム相は乾燥後、蒸発乾固し、化学式７に示す目的物２６ｍｇを得た。
D ′) Synthesis of F-AAm 25 mg of the product obtained in C ′) above was dissolved in 0.5 mL of DMF, and 20 mg of N, N-diisopropylethylamine and 12 mg of acryloyl chloride were added at −10 ° C. under a nitrogen atmosphere for 30 minutes. A stirring reaction was performed. The reaction mixture was poured into ice water, extracted with chloroform, and washed with saturated brine. The chloroform phase was dried and then evaporated to dryness to obtain 26 mg of the target compound shown in Chemical Formula 7.
Ｅ’）重合
最終濃度としてアクリルアミドが１５質量％、メチレンビスアクリルアミドが０．３質量％、Ｆ−ＡＡｍが１．２質量％、および過硫酸ナトリウムが０．１８質量％、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンが０．３６質量％となるように８０ｖ／ｖ％ジメチルスルホキシド水溶液に溶解・混合して溶液を調製した。予めシランカップリング剤による表面処理を行ったガラスプレートと無処理のガラスプレートとを隙間を設けて設置し、隙間に上記溶液を流し込み、窒素雰囲気下２５℃で８時間重合させた。重合終了後ガラスプレートを純水につけて、無処理のガラスプレートのみを剥がして、ガラス基材状にアクリルアミド／Ｆ−ＡＡｍ（１５０／１モル比）が固定されたゲルシートを得た。
E ′) Polymerization Final concentration of 15% by weight of acrylamide, 0.3% by weight of methylenebisacrylamide, 1.2% by weight of F-AAm, and 0.18% by weight of sodium persulfate, N, N, N ′ , N′-tetramethylethylenediamine was dissolved and mixed in an 80 v / v% dimethyl sulfoxide aqueous solution so that the amount was 0.36% by mass to prepare a solution. A glass plate that had been surface-treated with a silane coupling agent in advance and an untreated glass plate were placed with a gap between them, and the above solution was poured into the gap and polymerized at 25 ° C. for 8 hours in a nitrogen atmosphere. After completion of the polymerization, the glass plate was immersed in pure water, and only the untreated glass plate was peeled off to obtain a gel sheet in which acrylamide / F-AAm (150/1 molar ratio) was fixed on the glass substrate.
さらに、得られたゲルシート表面に最終濃度としてアクリルアミドが２０質量％、メチレンビスアクリルアミドが１質量％、および過硫酸ナトリウムが０．１８質量％、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンが０．３６質量％、カーボンブラックが５質量％となるように純水に溶解・混合して調製した溶液を積層し、窒素雰囲気下２５℃で２４時間重合させた。得られたゲルシートを、グルコース濃度５００ｍｇ／ｄＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）への浸漬洗浄３０分間を合計１０回繰り返した。その後５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）への浸漬洗浄３０分間を合計４回繰り返してグルコースを洗い流して検出層を得た。 Furthermore, the final concentration on the gel sheet surface is 20% by mass of acrylamide, 1% by mass of methylenebisacrylamide, 0.18% by mass of sodium persulfate, and N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine. Solutions prepared by dissolving and mixing in pure water such that 0.36% by mass and carbon black were 5% by mass were laminated and polymerized at 25 ° C. for 24 hours in a nitrogen atmosphere. The obtained gel sheet was subjected to immersion washing for 30 minutes in a 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) having a glucose concentration of 500 mg / dL for a total of 10 times. Thereafter, immersion detection in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) for 30 minutes was repeated a total of 4 times to wash out glucose and obtain a detection layer.
（実施例５）
実施例２、実施例４および比較例で得られたセンサーをそれぞれ評価装置に固定し、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）下で蛍光強度のグルコース応答性を評価した（図６）。励起波長は４０５ｎｍ、蛍光検出波長は４７５ｎｍを用いた。
(Example 5)
The sensors obtained in Example 2, Example 4, and Comparative Example were each fixed to an evaluation apparatus, and the glucose response of fluorescence intensity was evaluated under a phosphate buffer (pH = 7.0) (FIG. 6). The excitation wavelength was 405 nm and the fluorescence detection wavelength was 475 nm.
評価装置は、検出層を固定し内部に液体を循環することのできるセルと、セルの裏面に末端が固定された光学ファイバーの束、そしてその光学ファイバーの他方末端が蛍光分光光度計へ接続された構造になっている。光学ファイバーの束の一部は励起光をセルに送るために、残りは蛍光放射光をセルから返すために用いられる構造となっている。 The evaluation device consists of a cell in which a detection layer is fixed and liquid can be circulated, a bundle of optical fibers whose ends are fixed on the back of the cell, and the other end of the optical fibers connected to a fluorescence spectrophotometer. It has a structure. Part of the bundle of optical fibers is structured to send excitation light to the cell and the rest used to return fluorescent radiation from the cell.
図６から明らかなように、本発明の水溶性蛍光モノマーからなるセンサーは、従来の疎水性モノマーからなるセンサーと比較して、グルコースへの応答性が大幅に改善されていることが明らかとなった。 As is clear from FIG. 6, it is clear that the sensor comprising the water-soluble fluorescent monomer of the present invention has significantly improved responsiveness to glucose compared to the conventional sensor comprising a hydrophobic monomer. It was.
（実施例６）
実施例２、実施例４および比較例で得られたセンサーをそれぞれ評価装置に固定し、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）下で蛍光スペクトルを測定した。
(Example 6)
The sensors obtained in Example 2, Example 4, and Comparative Example were each fixed to an evaluation apparatus, and the fluorescence spectrum was measured under a phosphate buffer (pH = 7.0).
比較例のセンサーは３７７ｎｍの励起で極大蛍光波長が４０３ｎｍと４３０ｎｍなのに対し、実施例２のセンサーは４００ｎｍの励起で極大蛍光波長が４８０ｎｍであり、実施例４のセンサーは４００ｎｍの励起で極大蛍光波長が４５５ｎｍであった。本発明のセンサーは、蛍光波長が長波長側にシフトしており、さらに励起波長と蛍光波長との差が大きく、蛍光特性上有利であり、測定精度が高いと推定される。 The sensor of the comparative example has excitation wavelengths of 377 nm and maximum fluorescence wavelengths of 403 nm and 430 nm, whereas the sensor of Example 2 has excitation of 400 nm and the maximum fluorescence wavelength of 480 nm, and the sensor of Example 4 has excitation of 400 nm and the maximum fluorescence wavelength. Was 455 nm. In the sensor of the present invention, the fluorescence wavelength is shifted to the long wavelength side, and the difference between the excitation wavelength and the fluorescence wavelength is large, which is advantageous in terms of fluorescence characteristics and is estimated to have high measurement accuracy.
１０ 検出層、
２０ 光学分離層、
３０ 蛍光センサー物質、
３３ 蛍光モノマー化合物、
３５ （メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体、
４０ 基材、
５０ 光源、
６０ 蛍光検出装置、
７０ 糖類、
１１０ ハウジング、
１２０ 窓部、
１３０ アンテナ部、
１４０ 集積回路、
１５０ 電池、
１６０ アンテナ用コイル、
１７０ 光学導波路。
10 detection layer,
20 optical separation layer,
30 Fluorescent sensor material,
33 Fluorescent monomer compound,
35 A polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue,
40 base material,
50 light sources,
60 fluorescence detection device,
70 sugars,
110 housing,
120 windows,
130 antenna part,
140 integrated circuit,
150 batteries,
160 antenna coil,
170 Optical waveguide.
Claims (9)
Ｘ１およびＸ２は同一または異なっていてもよく、−ＮＲ−、−ＣＯＮＲ−または−ＮＲＣＯ−を含む炭素数１〜３０のアルキレンを示し、Ｒは水素または置換されていてもよいアルキル基を示し、
Ｚ１およびＺ２は同一または異なっていてもよく、−Ｏ−または−ＮＲ’−を示し、Ｒ’は水素または置換されてもよいアルキル基を示し、
Ｙ１ および／またはＹ２が同一または異なっていてもよく、前記蛍光モノマー化合物を水に溶解させうる２価の有機残基であり、かつ下記化学式２または化学式３であり
Ｑ、Ｑ’、Ｑ’’、およびＱ’’’は同一または異なっていてもよく、水素、水酸基、置換されていてもよいアルキル基、アシル基、オキシアルキル基、ハロゲン、カルボキシル基、カルボキシエステル、カルボキシアミド、シアノ基、ニトロ基、アミノ基およびアミノアルキル基からなる群より選択される置換基であって、さらに、少なくとも１つは水素ではなく、ＱおよびＱ’は一緒になって縮合環を形成していてもよく、Ｑ’’およびＱ’’’は一緒になって縮合環を形成していてもよい。） A fluorescent monomer compound represented by Chemical Formula 1.
X 1 and X 2 may be the same or different and each represents an alkylene having 1 to 30 carbon atoms including —NR—, —CONR— or —NRCO—, and R represents hydrogen or an optionally substituted alkyl group. Show
Z 1 and Z 2 may be the same or different and each represents —O— or —NR′—, R ′ represents hydrogen or an optionally substituted alkyl group,
Y 1 and / or Y 2 may be the same or different, are divalent organic residues capable of dissolving the fluorescent monomer compound in water, and are represented by the following chemical formula 2 or chemical formula 3.
Q, Q ′, Q ″, and Q ′ ″ may be the same or different, and may be hydrogen, a hydroxyl group, an optionally substituted alkyl group, an acyl group, an oxyalkyl group, a halogen, a carboxyl group, or a carboxy ester. A substituent selected from the group consisting of: carboxamido, cyano group, nitro group, amino group and aminoalkyl group, wherein at least one is not hydrogen and Q and Q ′ together are fused rings And Q ″ and Q ′ ″ may be taken together to form a condensed ring. )
（Ｉ）：請求項１に記載の蛍光モノマー化合物
（ＩＩ）：（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体 A fluorescent sensor material for measuring sugars, which is obtained by copolymerizing at least two compounds (I) and (II) described below.
(I): the fluorescent monomer compound according to claim 1 (II): a polymerizable monomer containing a (meth) acrylamide residue
Ａは、水素またはメチル基であり、
ＵおよびＵ’は同一または異なっていてもよく、水素または置換されていてもよいアルキル基である。） The fluorescent sensor substance according to claim 2 or 3 , wherein (II) is a compound represented by Chemical Formula 4.
A is hydrogen or a methyl group;
U and U ′ may be the same or different and are hydrogen or an optionally substituted alkyl group. )
The saccharide measuring sensor for in-vivo implantation according to claim 8 , further comprising a fluorescence detection device.
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