JP5360960B2 - High production method of target gene products in recombinant plants - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ターミネーターを利用した目的の遺伝子産物の植物における高生産方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a target gene product in plants using a terminator.
近年、遺伝子の高発現化及びタンパク質の高蓄積化に関わる技術の開発が行われている。例えば、改変プロモーターの開発や新規プロモーターの単離に基づき、目的の遺伝子を高発現化し、さらに安定的発現や組織特異的発現を図る技術が報告されている（例えば、特許文献１〜３）。また、単離されたプロモーターの５'上流配列を外来遺伝子と連結して組換え導入することにより、その導入遺伝子の発現を安定化する技術についても報告されている（非特許文献１、特許文献４）。一方、単離されたターミネーター配列やその改変配列が遺伝子発現量やタンパク質生産量に及ぼす影響についてはほとんど報告がない。
In recent years, technologies related to high gene expression and high protein accumulation have been developed. For example, based on the development of a modified promoter and the isolation of a novel promoter, a technique has been reported for achieving high expression of a target gene and further achieving stable expression or tissue-specific expression (for example,
一般に、遺伝子組換え作物の作製には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のTiプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配列（nosターミネーター）が使われる場合が多い。しかし不都合なことに、このnosターミネーターの遺伝子転写における終止機能は不完全であり、nosターミネーターより下流の塩基配列も転写してしまうリードスルー現象が知られている（非特許文献２、非特許文献３）。また食品・医薬品等の製造のためには、バクテリア由来のターミネーターよりも、植物体での組換え生産により適した植物由来のターミネーターを利用することが好ましいと考えられる。
In general, the terminator sequence (nos terminator) of the nopaline synthase gene derived from the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens is often used for the production of genetically modified crops. However, unfortunately, the termination function in gene transcription of this nos terminator is incomplete, and a read-through phenomenon in which a base sequence downstream from the nos terminator is also transcribed is known (Non-patent
一方、ミラクルフルーツ（Richadella dulcifica）は、その果実中にミラクリンと呼ばれる食味修飾タンパク質を含んでいることで知られる植物である。ミラクリンは、1968年にミラクルフルーツの機能性成分であることが同定された（非特許文献４）。その後、ミラクリンタンパク質の全アミノ酸配列が決定され（非特許文献５）、その遺伝子の完全長cDNA配列も報告されている（非特許文献６；GenBankアクセッション番号D38598）。しかしその遺伝子発現制御機構についてはほとんど知られていない。
On the other hand, miracle fruit (Richadella dulcifica) is a plant known to contain a taste-modifying protein called miraculin in its fruit. Miracrine was identified in 1968 as a functional component of miracle fruit (Non-Patent Document 4). Thereafter, the entire amino acid sequence of the miraculin protein was determined (Non-patent document 5), and the full-length cDNA sequence of the gene was also reported (Non-patent
本発明は、組換え植物において目的のタンパク質を高生産させる方法を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the method of producing the target protein highly in a recombinant plant.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、遺伝子産物の組換え生産において、ミラクリン遺伝子ターミネーター領域内の配列を目的遺伝子下流に配置して用いることによりその目的遺伝子の遺伝子産物を高生産させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have determined that the gene of the target gene can be used by arranging the sequence in the miraculin gene terminator region downstream of the target gene in the recombinant production of the gene product. The present inventors have found that a product can be produced at a high yield and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1]以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのDNAからなる、ターミネーター。
（ａ）配列番号３で示される塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号２の塩基番号１から、塩基番号４５０〜５５０のいずれかまでの塩基配列からなり、かつ、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターと比較して、その上流に連結された遺伝子の発現産物量を増加させるターミネーター機能を有するDNA
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のDNAの塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターと比較して、その上流に連結された遺伝子の発現産物量を増加させるターミネーター機能を有するDNA
[2]プロモーター及び遺伝子挿入部位の下流に連結された上記[1]に記載のターミネーターを含む、発現ベクター。
[3]プロモーターが植物プロモーターである、上記[2]に記載の発現ベクター。
[4]プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターである、上記[2]に記載の発現ベクター。
[5]遺伝子挿入部位に挿入された遺伝子をさらに含む、上記[2]〜[4]に記載の発現ベクター。
[6]遺伝子の下流に連結された上記[1]に記載のターミネーターを含む、DNA構築物。
[7]前記ターミネーターが、プロモーター及びその制御下に配置された遺伝子の下流に連結されている、上記[6]に記載のDNA構築物。
[8]プロモーターが植物プロモーターである、上記[7]に記載のDNA構築物。
[9]プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターである、上記[7]に記載のDNA構築物。
[10]上記[2]〜[5]に記載の発現ベクター又は上記[7]〜[9]に記載のDNA構築物を含む、形質転換体。
[11]形質転換植物である、上記[10]に記載の形質転換体。
[12]上記[5]に記載の発現ベクター、又は上記[7]〜[9]に記載のDNA構築物を植物細胞に導入することを特徴とする、植物において前記遺伝子の遺伝子産物を組換え生産させる方法。
That is, the present invention includes the following.
[1] A terminator comprising the DNA of any one of the following (a) to (c).
(A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3
(B) Expression product amount of a gene consisting of the base sequence from
(C) consisting of a base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence of the DNA of (a) or (b), and compared with the nopaline synthase gene terminator, DNA with a terminator function that increases the amount of the expression product of the gene linked upstream
[2] An expression vector comprising the promoter and the terminator described in [1] linked downstream of the gene insertion site.
[3] The expression vector according to [2] above, wherein the promoter is a plant promoter.
[4] The expression vector according to [2] above, wherein the promoter is a cauliflower mosaic virus 35S promoter.
[5] The expression vector according to the above [2] to [4], further comprising a gene inserted into the gene insertion site.
[6] A DNA construct comprising the terminator according to the above [1] linked downstream of the gene.
[7] The DNA construct according to [6] above, wherein the terminator is linked downstream of a promoter and a gene placed under the control of the promoter.
[8] The DNA construct according to [7] above, wherein the promoter is a plant promoter.
[9] The DNA construct according to [7] above, wherein the promoter is a cauliflower mosaic virus 35S promoter.
[10] A transformant comprising the expression vector according to [2] to [5] above or the DNA construct according to [7] to [9] above.
[11] The transformant according to [10] above, which is a transformed plant.
[12] Recombinant production of the gene product of the gene in a plant, characterized by introducing the expression vector according to [5] above or the DNA construct according to [7] to [9] above into a plant cell How to make.
本発明によれば、組換え植物において導入遺伝子の遺伝子産物の生産量を効果的に増加させることができる。 According to the present invention, the production amount of a gene product of a transgene can be effectively increased in a recombinant plant.
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターとその取得
本発明は、ミラクリンタンパク質をコードする遺伝子（ミラクリン遺伝子）のターミネーター領域内の配列を含むDNA断片が、ターミネーター機能として、転写終結機能と共に、その制御下にある遺伝子から発現される遺伝子産物の生産量を効果的に向上させる発現量調節的な機能を有するという驚くべき知見に基づくものである。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. The miraculin gene terminator according to the present invention and its acquisition The present invention provides a DNA fragment containing a sequence in the terminator region of a gene encoding a miraculin protein (miraculin gene) as a terminator function as well as a transcription termination function. This is based on the surprising finding that it has a function of regulating the expression level, which effectively improves the production amount of the gene product expressed from the gene.
本発明において「ターミネーター」とは、その上流に連結された遺伝子の転写（mRNAの合成）を終結させる機能（転写終結機能）を少なくとも有する核酸を意味する。この転写終結機能は、当業者であれば、例えば、慣用されるプロモーター、構造遺伝子、及び当該ターミネーターの順に連結した核酸構築物を含むベクターを用いて容易に確認することができる。 In the present invention, “terminator” means a nucleic acid having at least a function (transcription termination function) for terminating transcription (synthesis of mRNA) of a gene linked upstream thereof. This transcription termination function can be easily confirmed by those skilled in the art using, for example, a vector containing a nucleic acid construct linked in the order of a commonly used promoter, a structural gene, and the terminator.
本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターは、具体的には、ミラクルフルーツ（Richadella dulcifica）由来のミラクリン遺伝子のORF（オープンリーディングフレーム）の下流領域の一部の塩基配列からなり、かつ、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター（Tnos）と比較して、その上流に連結された遺伝子の発現産物量を増加させるターミネーター機能を有するDNAである。 The miraculin gene terminator according to the present invention is specifically composed of a partial base sequence of the downstream region of the ORF (open reading frame) of the miraculin gene derived from miracle fruit (Richadella dulcifica), and the nopaline synthase gene terminator Compared with (Tnos), it is a DNA having a terminator function that increases the amount of the expression product of the gene linked upstream thereof.
好適な１つの実施形態では、この本発明のミラクリン遺伝子ターミネーターは、より具体的には、以下の（ａ）〜（ｃ）のDNAを含むものである。
（ａ）配列番号３で示される塩基配列からなるDNA。この配列番号３で示される塩基配列は、ミラクルフルーツ（Richadella dulcifica）からミラクリン遺伝子のターミネーター領域として単離されたDNA断片の塩基配列（配列番号２）中の、塩基番号１から塩基番号５０７までの塩基配列に相当する。
（ｂ）配列番号２の塩基番号１から始まり、塩基番号４５０〜５５０のいずれかまで（より好ましくは、塩基番号４８０〜５３０のいずれかまで、さらに好ましくは塩基番号５００〜５１０のいずれかまで）の塩基配列からなり、かつ、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター（Tnos）と比較して、その上流に連結された遺伝子の発現産物量を増加させるターミネーター機能を有するDNA。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のDNAの塩基配列において１若しくは複数個（２〜４０個、好ましくは数個（２〜９個））の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター（Tnos）と比較して、その上流に連結された遺伝子の発現産物量を増加させるターミネーター機能を有するDNA。
In one preferred embodiment, the miraculin gene terminator of the present invention more specifically comprises the following DNAs (a) to (c):
(A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 consists of
(B) Starting from
(C) A base in which one or more (2 to 40, preferably several (2 to 9)) bases are deleted, substituted or added in the base sequence of the DNA of (a) or (b) A DNA comprising a sequence and having a terminator function for increasing the expression product amount of a gene linked upstream of the nopaline synthase gene terminator (Tnos).
本発明において、本発明に係るDNA（ターミネーター）についての「ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター（Tnos）と比較して、その上流に連結された遺伝子の発現産物量を増加させるターミネーター機能」とは、当該DNA（ターミネーター）による転写終結作用を受けるように当該ターミネーターの上流に連結された目的の遺伝子をさらにその上流にプロモーターを連結して発現誘導させた場合に、その目的の遺伝子から発現される遺伝子産物（mRNA、rRNA等のRNA又はタンパク質、より好ましくはタンパク質）の量を、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター（Tnos）を同条件で使用した場合と比較して増加させるように転写翻訳機構を調節する機能を意味する。本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターは、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター（Tnos）を同条件で使用した場合と比較して、例えば1.2倍〜50倍、典型的には2倍〜10倍、より一般的には5倍〜7倍の発現産物（遺伝子産物）が目的の遺伝子から生産（又は蓄積）されるように、遺伝子の転写翻訳機構を制御することができる。この本発明に係るターミネーターによる目的の遺伝子の発現産物量を増加させる効果は、例えば、目的の遺伝子として、当業者に公知のレポーター遺伝子（例えば、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子）を使用し、後述の実施例に記載の手順に従って、そのレポーター活性を測定する手法を用いて好適に調べることができる。 In the present invention, the terminator function for increasing the amount of the expression product of the gene linked upstream thereof compared to the nopaline synthase gene terminator (Tnos) for the DNA (terminator) according to the present invention is the DNA When a target gene linked upstream of the terminator so as to receive a transcription termination action by (terminator) is further linked to a promoter upstream to induce expression, a gene product expressed from the target gene ( Means the function to regulate the transcription and translation mechanism to increase the amount of RNA or protein such as mRNA, rRNA, etc., more preferably protein, compared to when nopaline synthase gene terminator (Tnos) is used under the same conditions. To do. The miraculin gene terminator according to the present invention is, for example, 1.2 times to 50 times, typically 2 times to 10 times, more generally compared to the case where nopaline synthase gene terminator (Tnos) is used under the same conditions. Can control the transcription / translation mechanism of a gene so that an expression product (gene product) of 5 to 7 times is produced (or accumulated) from the target gene. The effect of increasing the expression product amount of the target gene by the terminator according to the present invention is described below using, for example, a reporter gene (for example, β-glucuronidase (GUS) gene) known to those skilled in the art as the target gene. According to the procedure described in the Examples, it can be suitably examined using a technique for measuring its reporter activity.
このような本発明に係るターミネーターによる遺伝子の発現産物量の増加は、遺伝子から転写されるmRNAの安定性をそのターミネーターが調節して分解を抑制することにより、もたらされると考えられた。本発明に係るターミネーターが有する、その上流に連結された遺伝子の発現産物量を増加させる機能は、好ましくは、植物（より好ましくは、被子植物、さらに好ましくはナス科植物、特に好ましくはトマト）の細胞においてより顕著に発揮される。 Such an increase in the amount of gene expression product by the terminator according to the present invention was thought to be brought about by the stability of mRNA transcribed from the gene being regulated by the terminator to suppress degradation. The function of the terminator according to the present invention to increase the expression product of the gene linked upstream is preferably that of a plant (more preferably angiosperm, more preferably a solanaceous plant, particularly preferably a tomato). It is more prominent in cells.
本発明のミラクリン遺伝子ターミネーターは、上記のミラクリン遺伝子ターミネーターの塩基配列（例えば、配列番号３の塩基配列）に基づいて、常法により単離することができる。例えば、ミラクルフルーツの葉から常法により抽出されたゲノムDNA等の核酸を鋳型とし、本発明のミラクリン遺伝子ターミネーターの塩基配列に基づいて設計されるプライマーセットを用いたPCR法によってDNA増幅断片として取得することができる。得られたDNA増幅断片は、常法により抽出・精製することが好ましい。あるいは、本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターであるDNA又はその一部を用いてプローブを作製し、それをミラクルフルーツから抽出されたゲノムDNA断片等に対してハイブリダイズさせることにより、本発明に係るターミネーターを取得することもできる。本発明のミラクリン遺伝子ターミネーターはまた、化学合成法を利用して合成してもよい。 The miraculin gene terminator of the present invention can be isolated by a conventional method based on the base sequence of the above miraculin gene terminator (for example, the base sequence of SEQ ID NO: 3). For example, a DNA amplification fragment obtained by PCR using a primer set designed based on the base sequence of the miraculin gene terminator of the present invention, using a nucleic acid such as genomic DNA extracted from the leaves of miracle fruit as a template. can do. The obtained DNA amplified fragment is preferably extracted and purified by a conventional method. Alternatively, the terminator according to the present invention is prepared by preparing a probe using DNA or a part thereof, which is the miraculin gene terminator according to the present invention, and hybridizing it with a genomic DNA fragment or the like extracted from miracle fruit. You can also get The miraculin gene terminator of the present invention may also be synthesized using chemical synthesis methods.
本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターは、具体的には、実施例に記載のようにしてミラクルフルーツ（Richadella dulcifica）から単離することもできる。例えば、ミラクルフルーツから抽出したゲノムDNAを鋳型とし、3'側プライマー（5'-TTT GAA TTC CTA CAA CGT TAC GAA ACG-3'（配列番号１９））と、5'側プライマー（5'-TTT GAG CTC TTG GGT TTG GGG GTG GTT TTT CCA-3'（配列番号２０））を用いたPCR増幅により、本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターを含むDNA断片を取得することができる。 Specifically, the miraculin gene terminator according to the present invention can also be isolated from miracle fruit (Richadella dulcifica) as described in the Examples. For example, using genomic DNA extracted from miracle fruit as a template, 3 ′ side primer (5′-TTT GAA TTC CTA CAA CGT TAC GAA ACG-3 ′ (SEQ ID NO: 19)) and 5 ′ side primer (5′-TTT A DNA fragment containing the miraculin gene terminator according to the present invention can be obtained by PCR amplification using GAG CTC TTG GGT TTG GGG GTG GTT TTT CCA-3 ′ (SEQ ID NO: 20).
また本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターは、天然源から単離されたミラクリン遺伝子ターミネーターの塩基配列を、部位特異的突然変異誘発法等の変異導入法を用いて改変することにより作製してもよい。変異導入には、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。これらの変異導入は、例えば市販の部位特異的突然変異誘発キット（例えばMutan(R)-K、Mutan(R)-Super Express Km、PrimeSTAR(R) Mutagenesis Basal Kit（いずれもTAKARA BIO INC.社製））などを用いて当業者であれば容易に行うことができる。 Further, the miraculin gene terminator according to the present invention may be prepared by modifying the base sequence of the miraculin gene terminator isolated from a natural source using a mutation introducing method such as site-directed mutagenesis. For the introduction of mutation, a known method such as Kunkel method, Gapped duplex method or the like, or a method equivalent thereto can be employed. These mutagenesis can be performed by, for example, commercially available site-directed mutagenesis kits (for example, Mutan (R) -K, Mutan (R) -Super Express Km, PrimeSTAR (R) Mutagenesis Basal Kit (both manufactured by TAKARA BIO INC. ) )) And the like can be easily performed by those skilled in the art.
なお、得られたミラクリン遺伝子ターミネーターについては、塩基配列決定によりその配列を確認することが好ましい。塩基配列決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばABI社製DNAシークエンサー）を用いて行えばよい。 In addition, about the obtained miraculin gene terminator, it is preferable to confirm the arrangement | sequence by base sequence determination. The nucleotide sequence can be determined by a known method such as a Maxam-Gilbert chemical modification method or a dideoxynucleotide chain termination method, but it may be usually performed using an automatic nucleotide sequencer (eg, DNA sequencer manufactured by ABI).
２．本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターを含むベクター、DNA構築物及びそれらを含む形質転換体
本発明は、本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターを組み込んだベクターも提供する。本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターは、任意の組換えベクター中にクローニングすることにより容易に複製可能な形態とすることができる。
2. Vectors comprising the miraculin gene terminator according to the present invention, DNA constructs and transformants comprising them The present invention also provides vectors incorporating the miraculin gene terminator according to the present invention. The miraculin gene terminator according to the present invention can be easily replicated by cloning into an arbitrary recombinant vector.
このために使用可能なベクターとしては、宿主細胞中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。例えばプラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript、pET100/D-TOPO等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YCp50、pPICZαA等）などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等）などが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。ベクター中に本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターを組み込むには、例えば、そのターミネーターを含むDNA断片の末端を適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入し連結すればよい。 The vector that can be used for this purpose is not particularly limited as long as it can be replicated in a host cell, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA. For example, plasmid DNA includes plasmids derived from E. coli (eg, pET22b (+), pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, pET100 / D-TOPO, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.) ), Yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YCp50, pPICZαA, etc.) and the like, and phage DNAs include λ phage (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP, λZAPII, etc.). Furthermore, animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, and insect virus vectors such as baculovirus can also be used. In order to incorporate the miraculin gene terminator according to the present invention into a vector, for example, the end of a DNA fragment containing the terminator is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site of a vector DNA or a multicloning site and ligated. Good.
本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターは、各種プロモーター（限定するものではないが、植物プロモーターがより好ましい）と組み合わせて用いることにより、任意の遺伝子の発現をもたらすことができる。 The miraculin gene terminator according to the present invention can be used in combination with various promoters (but not limited to, but preferably a plant promoter) to bring about the expression of any gene.
特に、本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターを、プロモーター及びその制御下にある遺伝子挿入部位の下流に連結して含む発現ベクターは、目的の遺伝子にコードされる遺伝子産物を宿主細胞（好ましくは、植物細胞）で効率良く生産させるために当該遺伝子を宿主細胞に導入し組換え法により発現させるために用いる、導入遺伝子発現用ツールとして好適である。本発明に係るこれらの発現ベクターは、その遺伝子挿入部位（例えば、制限酵素切断部位）に挿入された目的の遺伝子をさらに含んでもよい。目的の遺伝子は特に限定されず、タンパク質をコードする遺伝子であっても、RNAをコードする遺伝子であってもよいし、２種以上のタンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子でもよい。 In particular, an expression vector comprising the miraculin gene terminator according to the present invention linked downstream of a promoter and a gene insertion site under its control is a host cell (preferably a plant cell) containing the gene product encoded by the gene of interest. In order to efficiently produce the gene, the gene is suitable as a transgene expression tool used for introducing the gene into a host cell and expressing it by a recombinant method. These expression vectors according to the present invention may further include a target gene inserted into the gene insertion site (for example, a restriction enzyme cleavage site). The target gene is not particularly limited, and may be a gene encoding a protein, a gene encoding RNA, or a gene encoding a fusion protein of two or more proteins.
本発明に係る発現ベクターは、さらに、ベクターが細胞内に保持されていることを示す選択マーカーやベクター内に簡単に正しい向きで遺伝子を挿入するためのポリリンカー、エンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、分泌シグナル配列、精製用のヒスチジンタグ配列等の有用な配列を必要に応じて含んでいてもよい。選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子（CAT遺伝子）等が挙げられる。 The expression vector according to the present invention further includes a selection marker indicating that the vector is retained in the cell, a polylinker for easily inserting a gene into the vector in the correct orientation, a cis element such as an enhancer, and a splicing signal. In addition, useful sequences such as a poly A addition signal, a secretion signal sequence, and a histidine tag sequence for purification may be included as necessary. Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, a chloramphenicol resistance gene (CAT gene), and the like.
植物に遺伝子導入するためにアグロバクテリウム法を用いる場合には、アグロバクテリウム由来のバイナリーベクターなどのアグロバクテリウム法に適した発現ベクター又はその改変ベクター（例えば、pBI121、pBIN19、pSMAB704、pCAMBIA、pGreenなど）中のターミネーター（例えば、ノパリン合成酵素遺伝子（nos）ターミネーター）を、本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターで置換することによって、本発明に係る発現ベクターを作製してもよい。このような発現ベクターも、プロモーター及びその制御下にある遺伝子挿入部位の下流に連結された本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターを含む限り、本発明の好ましい態様である。 When the Agrobacterium method is used to introduce a gene into a plant, an expression vector suitable for the Agrobacterium method such as an Agrobacterium-derived binary vector or a modified vector thereof (for example, pBI121, pBIN19, pSMAB704, pCAMBIA, An expression vector according to the present invention may be prepared by substituting a terminator (eg, nopaline synthase gene (nos) terminator) in pGreen and the like with the miraculin gene terminator according to the present invention. Such an expression vector is also a preferred embodiment of the present invention as long as it includes the promoter and the miraculin gene terminator according to the present invention linked downstream of the gene insertion site under its control.
本発明は、目的の遺伝子の下流に連結された本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターを含むDNA構築物も提供する。このようなDNA構築物を、任意の発現ベクター（好ましくは、植物用の発現ベクター）中のプロモーターの制御下（下流）に組み込むことにより、目的の遺伝子の遺伝子産物をより効率よく生産できる発現ベクターを製造することができる。本発明はまた、プロモーター及び目的の遺伝子の下流に連結された本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターを含むDNA構築物にも関する。 The present invention also provides a DNA construct comprising the miraculin gene terminator according to the present invention linked downstream of the gene of interest. By incorporating such a DNA construct under the control (downstream) of a promoter in any expression vector (preferably an expression vector for plants), an expression vector capable of more efficiently producing the gene product of the target gene is obtained. Can be manufactured. The invention also relates to a DNA construct comprising a promoter and a miraculin gene terminator according to the invention linked downstream of the gene of interest.
本発明において「DNA構築物」とは、２以上の機能単位（遺伝子、プロモーター、ターミネーターなど）のDNAを連結して作製される自律複製能を有しないDNA断片（例えば、遺伝子発現カセット）をいう。 In the present invention, the “DNA construct” refers to a DNA fragment (for example, gene expression cassette) having no autonomous replication ability, which is prepared by linking DNAs of two or more functional units (gene, promoter, terminator, etc.).
本発明でミラクリン遺伝子ターミネーターと組み合わせて用いるプロモーターは、任意のプロモーターであってよいが、植物プロモーターであることがより好ましい。本発明において「植物プロモーター」とは、植物細胞においてプロモーター活性（転写誘導活性）を発揮できるプロモーターをいい、例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター、ユビキチンプロモーター、トマト果実特異的発現プロモーターE8などが挙げられる。本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーターと組み合わせて用いるプロモーターは、構成性プロモーターであっても誘導性プロモーターであってもよいし、組織特異的プロモーター又は時期特異的プロモーターなどの特異的プロモーターであってもよい。遺伝子産物の生産量向上の点では、CaMV 35Sプロモーターとの組み合わせが特に好適である。 The promoter used in combination with the miraculin gene terminator in the present invention may be any promoter, but is more preferably a plant promoter. In the present invention, “plant promoter” refers to a promoter capable of exhibiting promoter activity (transcription induction activity) in plant cells, such as cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, ubiquitin promoter, tomato fruit-specific expression promoter E8 and the like. It is done. The promoter used in combination with the miraculin gene terminator according to the present invention may be a constitutive promoter or an inducible promoter, or may be a specific promoter such as a tissue-specific promoter or a time-specific promoter. . A combination with the CaMV 35S promoter is particularly preferable in terms of improving the production amount of the gene product.
本発明では、上記発現ベクター又は上記DNA構築物を宿主に導入することにより形質転換体（形質転換細胞、形質転換植物など）を作製することができる。具体的には、例えば、本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物を宿主細胞に導入することにより形質転換細胞を作製することができる。なお本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物を宿主細胞（好ましくは、植物細胞）へ導入することにより、発現ベクター中のDNA構築物（プロモーター及びその制御下にある目的の遺伝子の下流に連結されたミラクリン遺伝子ターミネーターを含むDNA断片）又は単離されたDNA構築物は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれうる。あるいは、本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物を宿主細胞へ導入した形質転換体では、その発現ベクター又はDNA構築物が染色体外（細胞質など）で維持されることにより、目的の遺伝子が染色体外で一過性発現されるものでもよい。 In the present invention, transformants (transformed cells, transformed plants, etc.) can be prepared by introducing the expression vector or the DNA construct into a host. Specifically, for example, a transformed cell can be prepared by introducing the expression vector or DNA construct according to the present invention into a host cell. In addition, by introducing the expression vector or DNA construct according to the present invention into a host cell (preferably a plant cell), miraculin linked downstream of the DNA construct (promoter and the target gene under its control) in the expression vector. DNA fragments containing gene terminators) or isolated DNA constructs can be integrated into the genome of the host cell. Alternatively, in a transformant in which the expression vector or DNA construct according to the present invention is introduced into a host cell, the expression vector or DNA construct is maintained extrachromosomally (such as cytoplasm), so that the target gene is extrachromosomally located. It may be transiently expressed.
宿主細胞には、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等、いずれを使用してもよい。本発明においては、目的の遺伝子産物をより高効率に生産する目的では、植物細胞、特に被子植物細胞、より好ましくはナス科植物細胞、さらに好ましくはトマトの細胞を宿主細胞として使用することがより好ましい。 As the host cell, any of bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeast cells, insect cells, animal cells (for example, mammalian cells), plant cells and the like may be used. In the present invention, plant cells, particularly angiosperm cells, more preferably solanaceous plant cells, and more preferably tomato cells are more preferably used as host cells for the purpose of producing a target gene product with higher efficiency. preferable.
本発明では、本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物を植物細胞に導入することにより形質転換植物を作製することも好ましい。 In the present invention, it is also preferable to produce a transformed plant by introducing the expression vector or DNA construct according to the present invention into a plant cell.
本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物を導入する植物としては、特に限定されないが、例えば、ナス科［ナス（Solanum melongena L.）、トマト（Solanum lycopersicum）、ピーマン（Capsicum annuum L. var. angulosum Mill.）、トウガラシ（Capsicum annuum L.）、タバコ（Nicotiana tabacum L.）等］、イネ科［イネ（Oryza sativa）、コムギ（Triticum aestivum L.）、オオムギ（Hordeum vulgare L.）、ペレニアルライグラス（Lolium perenne L.）、イタリアンライグラス（Lolium multiflorum Lam.）、メドウフェスク（Festuca pratensis Huds.）、トールフェスク（Festuca arundinacea Schreb.）、オーチャードグラス（Dactylis glomerata L.）、チモシー（Phleum pratense L.）等］、アブラナ科［シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、アブラナ（Brassica campestris L.）、ハクサイ（Brassica pekinensis Rupr.）、キャベツ（Brassica oleracea L. var. capitata L.）、ダイコン（Raphanus sativus L.）、ナタネ（Brassica campestris L., B. napus L.）等］、マメ科［ダイズ（Glycine max）、アズキ（Vigna angularis Willd.）、インゲン（Phaseolus vulgaris L.）、ソラマメ（Vicia faba L.）等］、ウリ科［キュウリ（Cucumis sativus L.）、メロン（Cucumis melo L.）、スイカ（Citrullus vulgaris Schrad.）、カボチャ（C. moschata Duch., C. maxima Duch.）等］、ヒルガオ科［サツマイモ（Ipomoea batatas）等］、ユリ科［ネギ（Allium fistulosum L.）、タマネギ（Allium cepa L.）、ニラ（Allium tuberosum Rottl.）、ニンニク（Allium sativum L.）、アスパラガス（Asparagus officinalis L.）等］、シソ科［シソ（Perilla frutescens Britt. var. crispa）等］、キク科［キク（Chrysanthemum morifolium）、シュンギク（Chrysanthemum coronarium L.）、レタス（Lactuca sativa L. var. capitata L.）等］、バラ科［バラ（Rose hybrida Hort.）、イチゴ（Fragaria x ananassa Duch.）等］、ミカン科［ミカン（Citras unshiu）、サンショウ（Zanthoxylum piperitum DC.）等］、フトモモ科［ユーカリ（Eucalyptus globulus Labill）等］、ヤナギ科［ポプラ（Populas nigra L. var. italica Koehne）等］、アカザ科［ホウレンソウ（Spinacia oleracea L.）、テンサイ（Beta vulgaris L.）等］、リンドウ科［リンドウ（Gentiana scabra Bunge var. buergeri Maxim.）等］、ナデシコ科［カーネーション（Dianthus caryophyllus L.）等］の植物が挙げられる。とりわけナス科植物、中でもトマトがより好ましい。 The plant into which the expression vector or DNA construct according to the present invention is introduced is not particularly limited, and examples thereof include solanaceae [Solanum melongena L., tomato (Solanum lycopersicum), bell pepper (Capsicum annuum L. var. Angulosum Mill). .), Capsicum (Capsicum annuum L.), tobacco (Nicotiana tabacum L.), etc.], Gramineae [Oryza sativa], wheat (Triticum aestivum L.), barley (Hordeum vulgare L.), perennial ryegrass (Lolium) perenne L.), Italian ryegrass (Lolium multiflorum Lam.), Meadow fescue (Festuca pratensis Huds.), tall fescue (Festuca arundinacea Schreb.), orchard grass (Dactylis glomerata L.), timothy (Phleum pratense L.), etc.], rape Family [Arabidopsis thaliana, Brassica campestris L., Chinese cabbage (Brassica pekinensis Rupr.), Cabbage (Brassica oleracea L var. capitata L.), Japanese radish (Raphanus sativus L.), rapeseed (Brassica campestris L., B. napus L.), etc.], legumes [Glycine max], azuki (Vigna angularis Willd.), green beans (Phaseolus vulgaris L.), broad bean (Vicia faba L., etc.)], cucurbitaceae (Cucumis sativus L.), melon (Cucumis melo L.), watermelon (Citrullus vulgaris Schrad.), Pumpkin (C. moschata Duch) ., C. maxima Duch. Etc.], Convolvulaceae [Ipomoea batatas etc.], Lily family [Allium fistulosum L.], Onion (Allium cepa L.), leek (Allium tuberosum Rottl.), Garlic (Allium sativum L.), Asparagus (Asparagus officinalis L., etc.), Lamiaceae (Perilla frutescens Britt. Var. Crispa, etc.), Asteraceae [Chrysanthemum morifolium), Chrysanthemum coronarium L. , Lettuce (Lactuca sativa L. var. Capitata L.), etc.], rose [ (Rose hybrida Hort.), Strawberry (Fragaria x ananassa Duch., Etc.), citrus family (Citras unshiu, salamander (Zanthoxylum piperitum DC.), Etc.), peach family [Eucalyptus globulus Labill, etc.], Willow [Popula (Populas nigra L. var. Italica Koehne), etc.], Rubiaceae [Spinacia oleracea L.], sugar beet (Beta vulgaris L., etc.), Gentiana [Gentiana scabra Bunge var. Buergeri Maxim .), Etc.], and plants of the family Nadesico [Dianthus caryophyllus L., etc.]. In particular, solanaceous plants, especially tomatoes are more preferable.
本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物を植物に導入する方法としては、植物の形質転換に一般的に用いられる方法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール（PEG）法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法などを用いることができる。これらの植物形質転換法の詳細は、『島本功、岡田清孝 監修 「新版 モデル植物の実験プロトコール 遺伝学的手法からゲノム解析まで」（2001） 秀潤社』などの一般的な教科書の記載や、Hiei Y. et al., "Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA." Plant J. (1994) 6, 271-282; Hayashimoto, A. et al., "A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants." Plant Physiol. (1990) 93, 857-863等の文献を参照すればよい。 Methods for introducing the expression vector or DNA construct according to the present invention into plants include methods generally used for plant transformation, such as the Agrobacterium method, particle gun method, electroporation method, polyethylene glycol (PEG) Method, microinjection method, protoplast fusion method and the like can be used. For details on these plant transformation methods, refer to general textbooks such as “Isao Shimamoto, Kiyotaka Okada“ Experimental Protocols from Model Plants to Genetic Analysis ”(2001) Shujunsha) Hiei Y. et al., "Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA." Plant J. (1994) 6, 271-282; Hayashimoto, A. et al., “A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.” Plant Physiol. (1990) 93, 857-863.
アグロバクテリウム法を用いる場合は、アグロバクテリウム法に適したベクターを用いて作製した本発明に係る発現ベクターを、適当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）にエレクトロポレーション法などにより導入し、この菌株を植物細胞又はカルスに接種して感染させることにより、形質転換細胞を含むカルスを得ることができる。好適なアグロバクテリウムとしては、限定するものではないが、C58、C58C1RifR、EHA101、EHA105、AGL1、LBA4404等の株を利用することができ、例えばトマトへ導入する場合には、アグロバクテリウムC58C1RifR株を好適に用いることができる。 When the Agrobacterium method is used, the expression vector according to the present invention prepared using a vector suitable for the Agrobacterium method is electroporated into an appropriate Agrobacterium such as Agrobacterium tumefaciens. Callus containing transformed cells can be obtained by introduction by a method or the like and inoculating plant cells or callus with this strain. Suitable examples of Agrobacterium include, but are not limited to, strains such as C58, C58C1Rif R , EHA101, EHA105, AGL1, and LBA4404. For example, when introduced into tomato, Agrobacterium C58C1Rif R strain can be preferably used.
パーティクルガン法やエレクトロポレーション法には、本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物のいずれを使用してもよい。導入対象の宿主試料としては、植物の切片を使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい（Christou P, et al., Bio/technology (1991) 9: 957-962）。例えばパーティクルガン法では、遺伝子導入装置（例えばPDS-1000（BIO-RAD社）等）を製造業者の説明書に従って使用して、本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物をまぶした金属粒子をこのような試料に打ち込むことにより、植物細胞内に導入させ、形質転換植物細胞を得ることができる。操作条件は、通常は450〜2000psi程度の圧力、4〜12cm程度の距離で行う。 For the particle gun method or the electroporation method, either the expression vector or the DNA construct according to the present invention may be used. As a host sample to be introduced, a section of a plant may be used, or a protoplast may be prepared and used (Christou P, et al., Bio / technology (1991) 9: 957-962). For example, in the particle gun method, a gene transfer device (for example, PDS-1000 (BIO-RAD), etc.) is used in accordance with the manufacturer's instructions, and the metal particles coated with the expression vector or DNA construct according to the present invention are used in this way. Can be introduced into a plant cell to obtain a transformed plant cell. The operating conditions are usually a pressure of about 450 to 2000 psi and a distance of about 4 to 12 cm.
次いで、本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物を導入した形質転換植物細胞を、例えば従来知られている植物組織培養法に従って選択培地で培養し、生存したカルスを再分化培地（適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）を含む）で培養することにより、本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物により形質転換された植物体を再生することができる。 Next, the transformed plant cell into which the expression vector or DNA construct according to the present invention has been introduced is cultured in a selective medium according to, for example, a conventionally known plant tissue culture method, and the surviving callus is transformed into a regeneration medium (plant of appropriate concentration). By culturing with hormones (including auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.), the plant transformed with the expression vector or DNA construct according to the present invention can be regenerated.
本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物が植物中に確実に導入されたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロット法等を利用して行うことができる。例えば、形質転換植物の葉から抽出したゲノムDNAについて、本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物中のプロモーター／ターミネーターや組み込んだ目的遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCR増幅を行えばよい。その増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を明瞭なバンドとして検出することにより、本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物の導入を確認することができる。マイクロプレート等の固相にPCR増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認することもできる。作製した形質転換植物において、導入した本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物中の目的の遺伝子の遺伝子産物活性を確認することも好ましい。 Whether or not the expression vector or DNA construct according to the present invention has been reliably introduced into a plant can be confirmed using a PCR method, Southern hybridization method, Northern hybridization method, Western blot method or the like. For example, PCR amplification may be performed on genomic DNA extracted from the leaves of the transformed plant using a promoter / terminator in the expression vector or DNA construct according to the present invention or a primer specific to the target gene incorporated. The amplification product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplification product is detected as a clear band, thereby achieving the present invention. The introduction of such an expression vector or DNA construct can be confirmed. The PCR amplification product can be bound to a solid phase such as a microplate, and the amplification product can be confirmed by fluorescence or enzymatic reaction. In the produced transformed plant, it is also preferable to confirm the gene product activity of the target gene in the introduced expression vector or DNA construct according to the present invention.
３．本発明に係る形質転換体を用いた目的遺伝子の遺伝子産物の生産
以上のようにして得られる本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物を導入した形質転換細胞又は形質転換植物は、目的の遺伝子の遺伝子産物（mRNA、rRNA等のRNA、又はタンパク質）を効率よく生産し、好ましくは蓄積することができる。本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物を導入した形質転換細胞又は形質転換植物は、特に、プロモーターとその制御下にある目的の遺伝子の下流にノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターを連結させたDNA構築物又はそれを含む発現ベクターを導入した形質転換植物における遺伝子発現と比較して、目的の遺伝子の遺伝子産物をより高生産することができる。この形質転換細胞又は形質転換植物においては、例えば目的の遺伝子から発現される遺伝子産物が酵素である場合には、その酵素活性を測定することによって当該遺伝子の発現産物量を測定することができる。
3. Production of the gene product of the target gene using the transformant according to the present invention A transformed cell or transformed plant into which the expression vector or DNA construct according to the present invention obtained as described above is introduced is the gene of the target gene. A product (RNA such as mRNA, rRNA, or protein) can be efficiently produced and preferably accumulated. The transformed cell or transformed plant into which the expression vector or DNA construct according to the present invention has been introduced is particularly a DNA construct in which a nopaline synthase gene terminator is linked downstream of a promoter and a target gene under its control. Compared with gene expression in a transformed plant into which the expression vector is introduced, the gene product of the target gene can be produced at a higher level. In this transformed cell or transformed plant, for example, when the gene product expressed from the target gene is an enzyme, the amount of the expression product of the gene can be measured by measuring the enzyme activity.
このような形質転換細胞又は形質転換植物からは、目的の遺伝子から合成され蓄積された遺伝子産物を抽出することもできる。従って本発明は、本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物を植物細胞に導入し、目的の遺伝子を発現させることにより、その植物において目的遺伝子の遺伝子産物をより高レベルに生産させる方法も提供する。 From such a transformed cell or transformed plant, a gene product synthesized and accumulated from the target gene can also be extracted. Therefore, the present invention also provides a method for producing a gene product of a target gene at a higher level in the plant by introducing the expression vector or DNA construct according to the present invention into the plant cell and expressing the target gene.
限定するものではないが、導入した発現ベクター又はDNA構築物中の目的の遺伝子を発現させるためには、通常は、形質転換体である細胞（形質転換細胞）を培養することが好ましい。形質転換細胞の培養は、宿主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行えばよい。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換細胞を、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有する培地中に接種して培養すればよい。培地は、形質転換細胞の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培地には、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を添加してもよい。 Although not limited, in order to express the target gene in the introduced expression vector or DNA construct, it is usually preferable to culture cells (transformed cells) that are transformants. The transformed cells may be cultured according to a usual method used for culturing host organisms. For example, transformed cells obtained by using microorganisms such as Escherichia coli and yeast cells as host cells may be inoculated and cultured in a medium containing a carbon source, nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the host microorganism. The medium may be either a natural medium or a synthetic medium as long as it can efficiently culture transformed cells. If necessary, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium.
誘導性プロモーターを含む発現ベクター又はDNA構築物で形質転換した宿主細胞を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加するのが一般的である。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するときにはイソプロピル-１-チオ-β-D-ガラクトシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクター又はDNA構築物で形質転換した宿主細胞を培養するときにはインドール酢酸（IAA）等を培地に添加することができる。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主細胞に適した条件下で行われる。 When culturing host cells transformed with an expression vector or DNA construct containing an inducible promoter, it is common to add an inducer to the medium as necessary. For example, when culturing host cells transformed with an expression vector using the Lac promoter, isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (IPTG) or the like was transformed with an expression vector or DNA construct using the trp promoter. When culturing host cells, indole acetic acid (IAA) or the like can be added to the medium. The culture conditions are not particularly limited, but are preferably performed under conditions suitable for the host cell used for transformation.
培養後、発現された遺伝子産物（典型的には、タンパク質）が細胞内に蓄積される場合にはその細胞を破砕して採取することができる。一方、その遺伝子産物が細胞外に分泌される場合には、それを培養物から直接採取することができるし、培養物から遠心分離等により細胞を除去することにより培養上清として採取することもできる。 When the expressed gene product (typically protein) accumulates in the cell after the culture, the cell can be disrupted and collected. On the other hand, if the gene product is secreted extracellularly, it can be collected directly from the culture, or it can be collected as a culture supernatant by removing the cells from the culture by centrifugation or the like. it can.
本発明では、形質転換を行う代わりに、無細胞翻訳系を使用して本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物中に組み込んだ遺伝子由来の遺伝子産物を製造することもできる。「無細胞翻訳系」とは、大腸菌や酵母細胞等の宿主生物の細胞構造を機械的に破壊して得た懸濁液に、翻訳に必要なアミノ酸などの試薬を加え、試験管中などのin vitro転写翻訳系又はin vitro翻訳系を構成したものである。無細胞翻訳系としては、有利に使用可能なキットが各種市販されている。 In the present invention, instead of performing transformation, a cell product-free translation system can be used to produce a gene product derived from a gene incorporated in the expression vector or DNA construct according to the present invention. "Cell-free translation system" means that a reagent such as amino acids necessary for translation is added to a suspension obtained by mechanically destroying the cell structure of a host organism such as E. coli or yeast cells, It constitutes an in vitro transcription / translation system or an in vitro translation system. As a cell-free translation system, various kits that can be advantageously used are commercially available.
本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物において、組織特異的プロモーター又は時期特異的プロモーターなどの特異的プロモーター（トマト果実特異的発現プロモーターE8など）や構成性プロモーター（CaMV 35Sプロモーターなど）を用いた場合には、その本発明に係る発現ベクター又はDNA構築物を導入した形質転換植物を成長させ又は栽培することにより、目的の遺伝子の遺伝子産物を植物内で高生産させることができる。例えば、構成性プロモーターを使用する場合には、本発明に係る形質転換植物（植物個体、その種子、器官、組織、カルス等を含む）を成長させて、その葉や果実等の様々な植物組織で目的の遺伝子の遺伝子産物を高生産させることができる。また特異的プロモーターを使用する場合には、そのプロモーターの発現誘導が起こる特異的条件に合致した植物組織で目的の遺伝子の遺伝子産物を高生産させることができる。 When an expression vector or DNA construct according to the present invention uses a specific promoter (such as a tomato fruit-specific expression promoter E8) or a constitutive promoter (such as a CaMV 35S promoter) such as a tissue-specific promoter or a time-specific promoter. Can grow a gene plant of a target gene in a plant by growing or cultivating a transformed plant into which the expression vector or DNA construct according to the present invention has been introduced. For example, when a constitutive promoter is used, the transformed plant according to the present invention (including plant individual, its seed, organ, tissue, callus, etc.) is grown and various plant tissues such as leaves and fruits thereof are grown. Can produce a gene product of the target gene at a high level. When a specific promoter is used, the gene product of the target gene can be produced at a high level in a plant tissue that meets the specific conditions under which the expression of the promoter is induced.
生産された遺伝子産物がタンパク質であれば、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより培養液、培養細胞又は発現産物が蓄積した組織（例えば、葉、果実等の植物組織）等から単離精製することができる。遺伝子産物がmRNAなどのRNAであれば、一般的なRNA抽出法を用いて単離精製することができる。しかしながら、場合により、遠心分離や限外濾過型フィルター等を用いて採取又は濃縮した培養上清や溶菌液上清、あるいはそれらの上清をさらに硫安分画後に透析にかけるなどして得た溶液をそのまま使用してもよい。 If the produced gene product is a protein, general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc., alone or in combination as appropriate Can be isolated and purified from a culture solution, a cultured cell, or a tissue in which an expression product is accumulated (for example, a plant tissue such as a leaf or a fruit). If the gene product is RNA such as mRNA, it can be isolated and purified using a general RNA extraction method. However, in some cases, the culture supernatant or lysate supernatant collected or concentrated using a centrifugal separator, an ultrafiltration filter or the like, or a solution obtained by dialysis of the supernatant after further ammonium sulfate fractionation, etc. May be used as they are.
本発明において用いるDNAの調製、PCR、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、DNA塩基配列決定、プライマーの合成、突然変異誘発、タンパク質の抽出などの分子生物学的・生化学的実験操作は、基本的には通常の実験書の記載に従って行うことができる。そのような実験書としては、例えば、SambrookらのMolecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds., Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Pressを挙げることができる。 Molecular biological and biochemical experimental procedures such as DNA preparation, PCR, ligation into vectors, cell transformation, DNA sequencing, primer synthesis, mutagenesis, protein extraction, etc. Basically, it can be carried out according to the description in a normal experiment document. Examples of such experiments include Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds., Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ミラクリン遺伝子の転写調節領域（プロモーター領域及びターミネーター領域）の単離
（１）DNAの抽出
ミラクルフルーツ（Richadella dulcifica）の葉からCTAB法にてゲノムDNAの抽出を行った。乳鉢に５gのミラクルフルーツの葉を入れ、液体窒素を加えて完全にすりつぶし、５０mLのチューブに移した。これに１０mLの３％ CTAB 溶液（１００mM Tris-HCl pH８．０、２０ｍM EDTA、１．４M NaCl、３％[w/v] CTAB）を加え混和した後、６５℃で３０分間保温した。１０mLのクロロフォルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加え、５分間穏やかに攪拌して、遠心分離（１０，０００回転、２０分、室温）を行った。上層の水層を新しいチューブに回収し、同様にクロロフォルム／イソアミルアルコール（２４：１）抽出を行い、水層を回収した。次に１０mLの冷イソプロピルアルコールを加え、穏やかに転倒混和し、糸状に析出したゲノムDNAを滅菌したガラス棒で巻き取り、５mLの７０％冷エタノールを入れたチューブに移して５分間洗浄した。ゲノムDNAが巻きついたガラス棒を引き上げ、ゲノムDNAを乾燥させ、１mLのRNaseA (１０μg/mL)に入れ３７℃で２時間処理した。１mLのフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、５分間穏やかに撹拌して遠心分離（１０，０００回転、２０分、室温）し、上層の水層を新しいチューブに移した。１mLのイソプロピルアルコールを加え、穏やかに転倒混和し、糸状に析出してきたゲノムDNAをガラス棒で巻き取った。これを５mLの７０％エタノールを入れたチューブに移して５分間洗浄後、ガラス棒ごとゲノムDNAを引き上げて乾燥し、０．４mLの滅菌水に溶解した。単離したゲノムDNAは５０倍希釈して、分光光度計で濃度を測定した（O.D.260＝５０μg/mL）。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Isolation of transcriptional regulatory region (promoter region and terminator region) of miraculin gene (1) Extraction of DNA Genomic DNA was extracted from leaves of miracle fruit (Richadella dulcifica) by CTAB method. Into a mortar, 5 g of miracle fruit leaves were added, and liquid nitrogen was added to completely grind and transfer to a 50 mL tube. To this was added 10 mL of 3% CTAB solution (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 3% [w / v] CTAB), and the mixture was kept at 65 ° C. for 30 minutes. 10 mL of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) was added, and the mixture was gently stirred for 5 minutes and centrifuged (10,000 rotations, 20 minutes, room temperature). The upper aqueous layer was collected in a new tube, and similarly extracted with chloroform / isoamyl alcohol (24: 1), and the aqueous layer was collected. Next, 10 mL of cold isopropyl alcohol was added, gently mixed by inversion, the genomic DNA precipitated in a filament form was wound up with a sterilized glass rod, transferred to a tube containing 5 mL of 70% cold ethanol, and washed for 5 minutes. The glass rod wrapped with the genomic DNA was pulled up, the genomic DNA was dried, placed in 1 mL of RNase A (10 μg / mL), and treated at 37 ° C. for 2 hours. 1 mL of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) was added, gently stirred for 5 minutes, centrifuged (10,000 rpm, 20 minutes, room temperature), and the upper aqueous layer was transferred to a new tube . 1 mL of isopropyl alcohol was added, gently mixed by inversion, and the genomic DNA precipitated in a filamentous shape was wound up with a glass rod. This was transferred to a tube containing 5 mL of 70% ethanol and washed for 5 minutes. Then, the genomic DNA was pulled up together with a glass rod, dried, and dissolved in 0.4 mL of sterile water. The isolated genomic DNA was diluted 50 times and the concentration was measured with a spectrophotometer (OD 260 = 50 μg / mL).
（２）アダプター付きDNAライブラリーの作成
次に、上記（１）で単離したミラクルフルーツ由来ゲノムDNAを用いて、アダプター付きDNAライブラリーを作製した。
このため、まずアダプターの作製を行った。アダプターはADL（４８mer：5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAC GCG TGG TCG ACG GCC CGG GCT GGT-3'（配列番号４））とADS（８mer：5'-ACC AGC CC-NH2-3'）とを６：１の比率（１１２．７μg：１８．６μg）で混合し、６５℃で５分、３７℃で１０分アニールさせることにより作製した（７５．９μl；１００ pmol/μl）。
(2) Preparation of adapter-attached DNA library Next, an adapter-attached DNA library was prepared using the miracle fruit-derived genomic DNA isolated in (1) above.
For this reason, an adapter was first prepared. The adapters are ADL (48mer: 5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAC GCG TGG TCG ACG GCC CGG GCT GGT-3 '(SEQ ID NO: 4)) and ADS (8mer: 5'-ACC AGC CC-NH 2 -3 ') Was mixed at a ratio of 6: 1 (112.7 μg: 18.6 μg) and annealed at 65 ° C. for 5 minutes and at 37 ° C. for 10 minutes (75.9 μl; 100 pmol / μl).
一方、ゲノムDNAを消化するため、平滑末端を生じるEcoRV、PvuII、ScaIの制限酵素を、上記（１）で単離したミラクルフルーツ由来ゲノムDNA 各４μgにそれぞれ添加し、３７℃で一晩（約１５時間）反応させた。次いで、消化したゲノムDNAをフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、さらにイソプロピルアルコール沈殿を行った。沈殿を乾燥し、２０μlの滅菌水に溶解した。 On the other hand, in order to digest genomic DNA, EcoRV, PvuII, and ScaI restriction enzymes that generate blunt ends were added to each 4 μg of miracle fruit-derived genomic DNA isolated in (1) above, and overnight (approximately (15 hours). Next, the digested genomic DNA was extracted with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) and further subjected to isopropyl alcohol precipitation. The precipitate was dried and dissolved in 20 μl of sterile water.
この消化したゲノムDNA断片とアダプターを結合させるため、T4 DNA Ligase（Promega）を利用した。反応液（DNA断片 １０μl、アダプター １μl、５×緩衝液 ４μl、T4 DNA Ligase ２μl、蒸留水 ３μl）をよく混合し、１６℃で一晩（約１５時間）反応させた後、６５℃で１０分間処理し、酵素を失活させた。この産物を１０倍希釈した液をゲノムウォーキングに用いるDNAライブラリーとして−２０℃に保存した。
T4 DNA Ligase (Promega) was used to bind the digested genomic DNA fragment and the adapter. The reaction mixture (DNA fragment 10 μl,
（３）プロモーター領域及びターミネーター領域のクローニング
ミラクリン遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域のクローニングは、ゲノムウォーキングのための改良型PCR法（Siebert et al., Nucl Acids Res (1995) 23, p.1087-1088）により行った。このPCRには、アダプター特異的プライマーAP1：5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3'（配列番号５）、AP2：5'-CTA TAG GGC ACG CGT GGT-3'（配列番号６）およびミラクリン遺伝子特異的プライマーF1/458：5'-ACC CAG GTC CCG AAA CCA TTA GTA GCT-3'（配列番号７）、F2/551：5'-GTT CCT GCA AAG TAA AAT GCG GAG ATG-3'（配列番号８）、R1/248：5'-ACA ACT CTG GGT GGA CAA ACG AAG CTG CCG TT-3'（配列番号９）、R1/139：5'-GGA GTT TCT CTC CGT CTA TGT CAA GAA CCG GAT TG-3'（配列番号１０）、R2/101：5'-GCC GAA TCC GCT GCA CTA AGC AGT GGT TT-3'（配列番号１１）の７つのプライマーを下記の通りに組み合わせて用いた。なおミラクリン遺伝子の上流領域（5'側）の単離にはプライマーR1又はR2を、下流領域（3'側）の単離にはプライマーF1又はF2を用いた。ミラクリン遺伝子特異的プライマーは、既知のミラクリン遺伝子の塩基配列（非特許文献６）に基づいて設計した。
(3) Cloning of promoter region and terminator region Cloning of the promoter region and terminator region of the miraculin gene is performed by an improved PCR method for genome walking (Siebert et al., Nucl Acids Res (1995) 23, p.1087-1088). ). In this PCR, adapter-specific primers AP1: 5′-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3 ′ (SEQ ID NO: 5), AP2: 5′-CTA TAG GGC ACG CGT GGT-3 ′ (SEQ ID NO: 6) ) And miraculin gene specific primer F1 / 458: 5'-ACC CAG GTC CCG AAA CCA TTA GTA GCT-3 '(SEQ ID NO: 7), F2 / 551: 5'-GTT CCT GCA AAG TAA AAT GCG GAG ATG-3 '(SEQ ID NO: 8), R1 / 248: 5'-ACA ACT CTG GGT GGA CAA ACG AAG CTG CCG TT-3' (SEQ ID NO: 9), R1 / 139: 5'-GGA GTT TCT CTC CGT CTA TGT CAA GAA Seven primers of CCG GAT TG-3 ′ (SEQ ID NO: 10), R2 / 101: 5′-GCC GAA TCC GCT GCA CTA AGC AGT GGT TT-3 ′ (SEQ ID NO: 11) were used in combination as follows. . Primer R1 or R2 was used for isolation of the upstream region (5 ′ side) of the miraculin gene, and primer F1 or F2 was used for isolation of the downstream region (3 ′ side). The miraculin gene-specific primer was designed based on the known nucleotide sequence of miraculin gene (Non-patent Document 6).
まず、1st PCRとして、上記（２）で作成したアダプター付きライブラリー（EcoRV、PvuII、ScaIでそれぞれ消化したゲノムDNAから作成）を鋳型として、(i) AP1とF1/458、(ii) AP1とR1/248、(iii) AP1とR1/139の３種類のプライマー・セットを用いてPCR反応を行った。1st PCRのサイクル条件では、９４℃で３０秒（変性）、続いて６８℃で５分（アニーリング及び伸長反応）を１サイクルとして、計３５サイクル行った。こうして得られた1st PCR産物を滅菌水で１００倍希釈し、それを次の2nd PCRの鋳型として用いた。その鋳型DNAと、(i) AP2とF2/551、(ii) AP2とR2/101、(iii) AP2とR2/101の各プライマー・セットを用いて、2nd PCR反応を行った。2nd PCRのサイクル条件では、９４℃で３０秒（変性）、続いて６８℃で５分（アニーリング及び伸長反応）を１サイクルとして、計３５サイクル行った。 First, as the 1st PCR, using the library with adapter (prepared from genomic DNA digested with EcoRV, PvuII, and ScaI, respectively) prepared in (2) above as a template, (i) AP1 and F1 / 458, (ii) AP1 and R1 / 248, (iii) PCR reaction was performed using three types of primer sets, AP1 and R1 / 139. Under the 1st PCR cycle conditions, a total of 35 cycles were performed with 94 ° C. for 30 seconds (denaturation) followed by 68 ° C. for 5 minutes (annealing and extension reaction). The 1st PCR product thus obtained was diluted 100-fold with sterilized water and used as a template for the next 2nd PCR. Using the template DNA and (i) AP2 and F2 / 551, (ii) AP2 and R2 / 101, and (iii) AP2 and R2 / 101 primer sets, a 2nd PCR reaction was performed. Under the 2nd PCR cycle conditions, a total of 35 cycles were performed with 94 ° C. for 30 seconds (denaturation) followed by 68 ° C. for 5 minutes (annealing and extension reaction).
2nd PCRの終了後、反応液の５μLを１％アガロースゲルでの電気泳動にかけて、増幅断片を確認した。増幅断片のうち特異的増幅と判断された断片をWizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製した。これをpGEM(R)-T Easy Vector System I （Promega）のプロトコルに従ってクローニングし、塩基配列を決定した。さらに、得られた増幅断片の塩基配列が、アダプター配列と使用した遺伝子特異的プライマー配列を両末端に含むこと、及び遺伝子特異的プライマーに続く配列がミラクリン構造遺伝子の既知配列と一致することも確認した。 After completion of the 2nd PCR, 5 μL of the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel to confirm the amplified fragment. The fragment determined that specific amplification of the amplified fragment with a Wizard (R) SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) and purified. This was cloned according to the protocol of the pGEM (R) -T Easy Vector System I (Promega), and the nucleotide sequence was determined. Furthermore, it is confirmed that the base sequence of the obtained amplified fragment contains the adapter sequence and the gene-specific primer sequence used at both ends, and that the sequence following the gene-specific primer matches the known sequence of the miraculin structural gene. did.
このようにして配列決定された、ミラクリン構造遺伝子（ORF）の開始コドンの１塩基上流からアダプター配列の１塩基下流までの上流領域（本明細書ではプロモーター領域と呼ぶ）の塩基配列を、配列番号１に示す。同様に配列決定された、ミラクリン構造遺伝子（ORF）の終止コドンの１塩基下流からアダプター配列の１塩基上流までの下流領域（本明細書ではターミネーター領域と呼ぶ）の塩基配列を、配列番号２に示す。 The base sequence of the upstream region (referred to herein as the promoter region) from one base upstream of the start codon of the miraculin structural gene (ORF) to one base downstream of the adapter sequence thus determined is SEQ ID NO: It is shown in 1. Similarly, the base sequence of the downstream region (referred to herein as the terminator region) from one base downstream of the stop codon of miraculin structural gene (ORF) to one base upstream of the adapter sequence is represented by SEQ ID NO: 2. Show.
［実施例２］導入遺伝子発現用の核酸構築物の構築
（１）ベクターの改変
単離したミラクリン遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域をそれぞれ植物発現用に慣用されているバイナリーベクターpBI121中にクローニングするため、まず、pBI121のプロモーター配列中のクローニングサイトにXhoIとKpnI部位を付加する改変を行った。HindIII、XhoI、及びKpnI認識配列（大文字の配列部分）を付加したプライマーpBI121-F-HXK：5'-TTT AAG CTT CTC GAG GGT ACC gca tgc ctg cag gtc-3'（配列番号１２）と、XbaI認識部位（大文字の配列部分）を付加したプライマーpBI121-R-X：5'-TTT TCT AGA gtc ccc cgt gtt ctc tcc-3'（配列番号１３）を用いて、pBI121（TOYOBO；Chen et al.，Mol Breed (2003) 11, p.287-293；GenBankアクセッション番号AF485783）を鋳型としてPCRを行い、増幅断片をpGEM(R)-T Easy Vector System I (Promega) のプロトコルに従いクローニングし、塩基配列の決定を行った。次いで、得られた増幅断片とベクターpBI121をそれぞれHindIIIとXbaIで処理し、pBI121中の35Sプロモーター配列を増幅断片で置換することにより、XhoIとKpnI部位が付加された35Sプロモーター配列を有するように改変された植物発現ベクターを作製した。この改変ベクターをpBI121HXKと名付けた。
[Example 2] Construction of nucleic acid construct for transgene expression (1) Modification of vector To clone the promoter region and terminator region of the isolated miraculin gene into the binary vector pBI121 conventionally used for plant expression, First, modification was made to add XhoI and KpnI sites to the cloning site in the promoter sequence of pBI121. Primer pBI121-F-HXK to which HindIII, XhoI, and KpnI recognition sequences (uppercase sequence portion) were added: 5′-TTT AAG CTT CTC GAG GGT ACC gca tgc ctg cag gtc-3 ′ (SEQ ID NO: 12), XbaI Using pBI121-RX: 5′-TTT TCT AGA gtc ccc cgt gtt ctc tcc-3 ′ (SEQ ID NO: 13) to which a recognition site (uppercase sequence part) was added, pBI121 (TOYOBO; Chen et al., Mol PCR was performed using Breed (2003) 11, p.287-293; GenBank Accession No. AF485783) as a template, and the amplified fragment was cloned according to the protocol of pGEM (R) -T Easy Vector System I (Promega). Made a decision. Next, the obtained amplified fragment and vector pBI121 were treated with HindIII and XbaI, respectively, and the 35S promoter sequence in pBI121 was replaced with the amplified fragment, so that it was modified to have a 35S promoter sequence with XhoI and KpnI sites added. A plant expression vector was prepared. This modified vector was named pBI121HXK.
（２）改変ベクターへのミラクリン遺伝子プロモーターのクローニング
上記でクローニングしたプロモーター領域由来の異なるサイズのプロモーター配列を導入したベクターを作製した。まず、実施例１でクローニングしたプロモーター領域のDNA断片を鋳型とし、3'側プライマーとしてXbaI-T-MIR（5'-TTT TCT AGA TGT TGT AGA GAC TAT AGG GCT-3'；配列番号１４）を、5'側プライマーとして以下の各プライマーを組み合わせてPCRを行った。PCRのサイクル条件は、２２２４bpのミラクリン遺伝子プロモーター配列増幅のために９４℃で３０秒（変性）、５０℃で２５秒（アニーリング）、続いて６８℃で１５０秒（伸長反応）を１サイクルとして、計３５サイクルで実施した。また、１５１２bpおよび１０１２bpのミラクリン遺伝子プロモーター配列増幅のためには、PCRのサイクル条件は、９４℃で３０秒（変性）、５５℃で２５秒、続いて６８℃で９０秒（伸長反応）を１サイクルとして、計３５サイクルで実施した。さらに、PCRのサイクル条件は、５１０bpのミラクリン遺伝子プロモーター配列増幅のためには、９４℃で３０秒（変性）、５５℃で２５秒、続いて６８℃で４０秒（伸長反応）を１サイクルとして、計３５サイクルで実施した。なお各プライマー名に付記した増幅サイズは、プライマーXbaI-T-MIRと組み合わせたPCRで増幅することができる本願のプロモーター領域内の配列（プロモーター配列）のサイズであり、これはXbaI-T-MIR中のXbaI部位の配列を含まない。
1) プライマーP-1/F（増幅サイズ：２２２４bp）：
5'-TTT CTC GAG GAT ATC ATT ATA ATA GTG TGT-3'（配列番号１５）
2) プライマーP-4/F（増幅サイズ：１５１２bp）：
5'-TTT CTC GAG TTA CCA AAC GCT CAA AAA TAA CAG-3'（配列番号１６）
3) プライマーP-7/F（増幅サイズ：１０１２bp)：
5'-TTT CTC GAG TGA CTT AGG ACT TTA ATT TCA CTA-3'（配列番号１７）
4) プライマーP-10/F（増幅サイズ：５１０bp)：
5'-TTT CTC GAG ACT TGG GTT AGT TTG GGT-3'（配列番号１８）。
それぞれの増幅サイズ（２２２４bp、１５１２bp、１０１２bp、５１０bp）のPCR産物を、pGEM(R)-T Easy Vector System I（Promega）のプロトコルに従ってクローニングし、塩基配列を確認した。
(2) Cloning of the miraculin gene promoter into a modified vector A vector was prepared in which promoter sequences of different sizes derived from the promoter region cloned above were introduced. First, using the DNA fragment of the promoter region cloned in Example 1 as a template, XbaI-T-MIR (5′-TTT TCT AGA TGT TGT AGA GAC TAT AGG GCT-3 ′; SEQ ID NO: 14) is used as the 3 ′ primer. PCR was carried out by combining the following primers as 5 ′ side primers. PCR cycle conditions were as follows: 1 cycle of 94 ° C for 30 seconds (denaturation), 50 ° C for 25 seconds (annealing), followed by 68 ° C for 150 seconds (extension reaction) for amplification of the 2224 bp miraculin gene promoter sequence. A total of 35 cycles were performed. For amplification of the 1512 bp and 1012 bp miraculin gene promoter sequences, the PCR cycle conditions were 94 ° C for 30 seconds (denaturation), 55 ° C for 25 seconds, followed by 68 ° C for 90 seconds (extension reaction). A total of 35 cycles were carried out. Furthermore, PCR cycle conditions were as follows: for amplification of the 510 bp miraculin gene promoter sequence, 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), 55 ° C. for 25 seconds, then 68 ° C. for 40 seconds (extension reaction) as one cycle. In total 35 cycles. The amplification size attached to each primer name is the size of the sequence (promoter sequence) in the promoter region of the present application that can be amplified by PCR combined with the primer XbaI-T-MIR. This is XbaI-T-MIR. It does not contain the XbaI site sequence.
1) Primer P-1 / F (Amplification size: 2224 bp):
5'-TTT CTC GAG GAT ATC ATT ATA ATA GTG TGT-3 '(SEQ ID NO: 15)
2) Primer P-4 / F (Amplification size: 1512 bp):
5'-TTT CTC GAG TTA CCA AAC GCT CAA AAA TAA CAG-3 '(SEQ ID NO: 16)
3) Primer P-7 / F (Amplification size: 1012 bp):
5'-TTT CTC GAG TGA CTT AGG ACT TTA ATT TCA CTA-3 '(SEQ ID NO: 17)
4) Primer P-10 / F (Amplification size: 510 bp):
5′-TTT CTC GAG ACT TGG GTT AGT TTG GGT-3 ′ (SEQ ID NO: 18).
Each size of the amplified (2224bp, 1512bp, 1012bp, 510bp ) PCR products were cloned according to the protocol of the pGEM (R) -T Easy Vector System I (Promega), and the nucleotide sequence was confirmed.
（３）ミラクリン遺伝子の転写調節領域（プロモーター配列及びターミネーター配列）を組み込んだ、導入遺伝子発現用の核酸構築物の作製
５０７bpのミラクリン遺伝子ターミネーター配列の増幅のために、プライマーEcoRI-T-2：5'-TTT GAA TTC CTA CAA CGT TAC GAA ACG-3'（配列番号１９）と、プライマーSacI-P-MIR：5'-TTT GAG CTC TTG GGT TTG GGG GTG GTT TTT CCA-3'（配列番号２０）を、一方、１０８５bpのターミネーター配列の増幅のためにプライマーEcoRI-T-5：5'-TTT GAA TTC GTC GCT GAA TAA AGG-3'（配列番号２１）と、プライマーSacI-P-MIR：5'-TTT GAG CTC TTG GGT TTG GGG GTG GTT TTT CCA-3'（配列番号２０）を、それぞれ組み合わせて、実施例１でクローニングしたターミネーター領域のDNA断片を鋳型としてPCRを行った。PCRのサイクル条件は、５０７bpのミラクリン遺伝子ターミネーター配列増幅のために９４℃で３０秒（変性）、５５℃で２５秒（アニーリング）、続いて６８℃で４０秒（伸長反応）を１サイクルとして、計３５サイクルで実施した。また１０８５bpのミラクリン遺伝子ターミネーター配列増幅のためには、PCRのサイクル条件は、９４℃で３０秒（変性）、５０℃で２５秒、続いて６８℃で８０秒（伸長反応）を１サイクルとして、計３５サイクルで実施した。得られたPCR産物は、GEMR-T Easy Vector System I（Promega）のプロトコルに従ってクローニングし、塩基配列の確認を行った。クローニングした５０７bpと１０８５bpのターミネーター配列のDNA断片を、上記で作製したベクターpBI121HXKのSacIとEcoRIの間に導入し（すなわちノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター配列（Tnos）を置換し）、それぞれ、pBI121HXK/T0.5、pBI121HXK/T1.1と名付けた。この２つのベクターpBI121HXK/T0.5、pBI121HXK/T1.1及びpBI121HXKベクター（対照）のXhoIとXbaI部位に、さらに、上記（２）でクローニングした異なるサイズのミラクリン遺伝子プロモーター配列をそれぞれ導入し、植物発現ベクターを作製した。
(3) Preparation of nucleic acid construct for transgene expression incorporating transcriptional regulatory region (promoter sequence and terminator sequence) of miraculin gene Primer EcoRI-T-2: 5 ′ for amplification of 507 bp miraculin gene terminator sequence -TTT GAA TTC CTA CAA CGT TAC GAA ACG-3 ′ (SEQ ID NO: 19) and primer SacI-P-MIR: 5′-TTT GAG CTC TTG GGT TTG GGG GTG GTT TTT CCA-3 ′ (SEQ ID NO: 20) On the other hand, the primers EcoRI-T-5: 5′-TTT GAA TTC GTC GCT GAA TAA AGG-3 ′ (SEQ ID NO: 21) and primer SacI-P-MIR: 5′− were used for amplification of the 1085 bp terminator sequence. TTT GAG CTC TTG GGT TTG GGG GTG GTT TTT CCA-3 ′ (SEQ ID NO: 20) was combined, and PCR was performed using the DNA fragment of the terminator region cloned in Example 1 as a template. PCR cycle conditions were as follows: one cycle of 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), 55 ° C. for 25 seconds (annealing), and 68 ° C. for 40 seconds (extension reaction) for amplification of the 507 bp miraculin gene terminator sequence. A total of 35 cycles were performed. For amplification of the 1085 bp miraculin gene terminator sequence, the PCR cycle conditions were 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), 50 ° C. for 25 seconds, and then 68 ° C. for 80 seconds (extension reaction). A total of 35 cycles were performed. The obtained PCR product was cloned according to the protocol of GEM R -T Easy Vector System I (Promega), and the nucleotide sequence was confirmed. The cloned DNA fragments of the 507 bp and 1085 bp terminator sequences were introduced between SacI and EcoRI of the vector pBI121HXK prepared above (ie, the nopaline synthase gene terminator sequence (Tnos) was replaced), and pBI121HXK / T0. 5. It was named pBI121HXK / T1.1. The miraculin gene promoter sequences of different sizes cloned in (2) above were further introduced into the XhoI and XbaI sites of these two vectors pBI121HXK / T0.5, pBI121HXK / T1.1 and pBI121HXK vectors (control), respectively. An expression vector was prepared.
以下に、このようにしてベクターpBI121HXKをベースに作製した発現ベクター中の、ミラクリン遺伝子のプロモーター配列及びターミネーター配列を含むGUS遺伝子発現誘導性の核酸構築物について記載する（図１も参照されたい）。
1) P2.2/T1.1：
ミラクリン遺伝子プロモーター配列（２２２４bp；P2.2と称する；配列番号１の塩基番号１〜２２２４）の下流に、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子、次いでミラクリン遺伝子ターミネーター配列（１０８５bp；T1.1と称する；配列番号２の塩基番号１〜１０８５）が連結されている。
The GUS gene expression-inducible nucleic acid construct containing the miraculin gene promoter sequence and terminator sequence in the expression vector prepared based on the vector pBI121HXK in this manner is described below (see also FIG. 1).
1) P2.2 / T1.1:
Downstream of the miraculin gene promoter sequence (2224 bp; referred to as P2.2;
2) P2.2/Tnos
ミラクリン遺伝子プロモーター配列（２２２４bp；P2.2と称する；配列番号１の塩基番号１〜２２２４）の下流に、GUS遺伝子、次いでノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター（Tnos）が連結されている。
2) P2.2 / Tnos
A GUS gene and then a nopaline synthase gene terminator (Tnos) are linked downstream of the miraculin gene promoter sequence (2224 bp; referred to as P2.2;
3) P2.2/T0.5：
ミラクリン遺伝子プロモーター配列（２２２４bp；P2.2と称する；配列番号１の塩基番号１〜２２２４）の下流に、GUS遺伝子、次いでミラクリン遺伝子ターミネーター配列（５０７bp；T0.5と称する；配列番号２の塩基番号１〜５０７）が連結されている。
3) P2.2 / T0.5:
Downstream of the miraculin gene promoter sequence (2224 bp; referred to as P2.2;
4) P1.5/T1.1：
ミラクリン遺伝子プロモーター配列（１５１２bp；P1.5と称する；配列番号１の塩基番号７１３〜２２２４）の下流に、GUS遺伝子、次いでミラクリン遺伝子ターミネーター配列（１０８５bp；T1.1と称する；配列番号２の塩基番号１〜１０８５）が連結されている。
4) P1.5 / T1.1:
Downstream of the miraculin gene promoter sequence (1512 bp; referred to as P1.5; base numbers 713 to 2224 of SEQ ID NO: 1), the GUS gene and then the miraculin gene terminator sequence (1085 bp; referred to as T1.1; base number of SEQ ID NO: 2) 1-1085) are connected.
5) P1.0/T1.1：
ミラクリン遺伝子プロモーター配列（１０１２bp；P1.0と称する；配列番号１の塩基番号１２１３〜２２２４）の下流に、GUS遺伝子、次いでミラクリン遺伝子ターミネーター配列（１０８５bp；T1.1と称する；配列番号２の塩基番号１〜１０８５）が連結されている。
5) P1.0 / T1.1:
Downstream of the miraculin gene promoter sequence (1012 bp; referred to as P1.0; base numbers 1213 to 2224 of SEQ ID NO: 1), the GUS gene and then the miraculin gene terminator sequence (1085 bp; referred to as T1.1; base number of SEQ ID NO: 2) 1-1085) are connected.
6) P0.5/T1.1：
ミラクリン遺伝子プロモーター配列（５１０bp；P0.5と称する；配列番号１の塩基番号１７１５〜２２２４）の下流に、GUS遺伝子、次いでミラクリン遺伝子ターミネーター配列（１０８５bp；T1.1と称する；配列番号２の塩基番号１〜１０８５）が連結されている。
6) P0.5 / T1.1:
Downstream of the miraculin gene promoter sequence (510 bp; referred to as P0.5; base numbers 1715 to 2224 of SEQ ID NO: 1), the GUS gene and then the miraculin gene terminator sequence (1085 bp; referred to as T1.1; base number of SEQ ID NO: 2) 1-1085) are connected.
7) P35S/T1.1：
カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの下流に、GUS遺伝子、次いでミラクリン遺伝子ターミネーター配列（１０８５bp；T1.1と称する；配列番号２の塩基番号１〜１０８５）が連結されている。
7) P35S / T1.1:
Downstream of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, a GUS gene and then a miraculin gene terminator sequence (1085 bp; referred to as T1.1;
8) P35S/T0.5：
カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの下流に、GUS遺伝子、次いでミラクリン遺伝子ターミネーター配列（５０７bp；T0.5と称する；配列番号３；配列番号２の塩基番号１〜５０７に相当する）が連結されている。
8) P35S / T0.5:
A GUS gene and then a miraculin gene terminator sequence (507 bp; referred to as T0.5; SEQ ID NO: 3; corresponding to
9) P35S/Tnos
ベクターpBI121HXK中に含まれる核酸構築物（対照用）。カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター（以下、35Sプロモーターと称する）の下流に、GUS遺伝子、次いでノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター（Tnos）が連結されている。
9) P35S / Tnos
Nucleic acid construct contained in vector pBI121HXK (for control). A GUS gene and then a nopaline synthase gene terminator (Tnos) are linked downstream of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter (hereinafter referred to as 35S promoter).
次に、これらの発現ベクターをアグロバクテリウムC58C1RifR株（Deblaere et al., Nucl Acids Res (1985) 13, p.4777-4788）にエレクトロポレーション法により導入し、次の実施例においてトマトの形質転換に用いた。 Next, these expression vectors were introduced into Agrobacterium C58C1Rif R strain (Deblaere et al., Nucl Acids Res (1985) 13, p.4777-4788) by the electroporation method. Used for transformation.
［実施例３］形質転換トマトの作製と導入遺伝子発現の測定
トマト（Solanum lycopersicum）の形質転換は、実施例２で作製した植物発現ベクターを各々導入したアグロバクテリウムC58C1RifR株を用いて、Sun et al.（Plant Cell Physiol., (2006) 47, p.426-431）の方法に従って以下の手順で行った。まず、無菌播種したトマト子葉を、葉脈に垂直に切断し一枚の子葉から２切片を作った。葉切片をアグロバクテリウム懸濁液（MS培地に１００μMのアセトシリンゴンと、４０μMのメルカプトルエタノールを加えたものを使用）に浸し、１０分間感染させた後、懸濁液を除き、共存培地（MS培地、３％ショ糖、０．３％ゲルライト、１．５mg/lゼアチン、pH ５．８)に葉の表が下になるように並べた。シャーレをアルミホイルで完全に包み、２５℃の培養室で３〜４日共存培養を行った。その後、選抜培地（MS培地、３％ショ糖、０．３％ゲルライト、１．５mg/lゼアチン、１００mg/l カナマイシン、ｐH５．８）に葉の表が上になるように移し替え、２〜３週間毎に新しい選抜培地に移しながら、２５℃、１６時間日長で培養した。子葉片からカルスが形成されたら、シュートの生長を速めるためゼアチンの濃度を１mg/Lに下げた。カルスから葉が出てきたら、子葉切片部分から切り落とし、それを新しい培地に移した。伸長したシュートの葉は、根元で切り取り、発根培地（１/２ MS培地、１．５％ショ糖、０．３％ゲルライト、５０mg/l カナマイシン）に移した。発根培地で２週間以内に発根した個体を形質転換体の候補として選抜し、順化した。
[Example 3] Production of transformed tomato and measurement of transgene expression Tomato (Solanum lycopersicum) transformation was carried out using the Agrobacterium C58C1Rif R strain into which the plant expression vector produced in Example 2 was introduced. According to the method of et al. (Plant Cell Physiol., (2006) 47, p.426-431), the following procedure was used. First, aseptically seeded tomato cotyledons were cut perpendicularly to the veins to make two sections from one cotyledon. The leaf sections are immersed in an Agrobacterium suspension (MS medium supplemented with 100 μM acetosyringone and 40 μM mercaptorethanol), infected for 10 minutes, the suspension is removed, and the coexisting medium (MS medium, 3% sucrose, 0.3% gellite, 1.5 mg / l zeatin, pH 5.8) were arranged in such a way that the leaves face down. The petri dish was completely wrapped with aluminum foil and co-cultured in a culture room at 25 ° C. for 3-4 days. Thereafter, the cells were transferred to a selective medium (MS medium, 3% sucrose, 0.3% gellite, 1.5 mg / l zeatin, 100 mg / l kanamycin, pH 5.8) so that the surface of the leaf was on top, While transferring to a new selection medium every 3 weeks, the cells were cultured at 25 ° C. for 16 hours. When callus was formed from the cotyledon piece, the concentration of zeatin was lowered to 1 mg / L to speed up the growth of the shoot. When leaves emerged from the callus, they were cut off from the cotyledon sections and transferred to a new medium. The elongated shoot leaves were cut off at the root and transferred to a rooting medium (1/2 MS medium, 1.5% sucrose, 0.3% gellite, 50 mg / l kanamycin). Individuals rooted in the rooting medium within 2 weeks were selected as transformant candidates and acclimated.
発根順化した個体についてゲノムPCR法による導入遺伝子の確認およびフローサイトメーター（PA-II）により倍数性の確認を行った。２倍体で、かつ導入遺伝子が確認できた個体について、導入遺伝子がコードするGUSの活性測定を蛍光法（Kosugi et al., Plant Sci (1990）70, p.133-140）にて行った。まず、発根順化した個体に由来する、粉砕したトマト果実０．２gを１．５mlチューブに入れ、２５０μLの抽出緩衝液（５０mM リン酸緩衝液（pH ７．０）、 １０mM EDTA、０．１％ Triton X-１００、０．１％ ラウロイルサルコシンナトリウム、１０mM β-メルカプトエタノール）を加え攪拌し、遠心分離（１２，０００回転、５分、４℃）した。上清５０μLを新しいチューブに移し、５０μL 4-メチルウンベリフェリルグルクロニド（MUG）溶液（３．５mg MUG/１０ml抽出緩衝液）を加え、よく攪拌し、３７℃で６０分静置した。反応液１００μLに１mLの０．２M 炭酸ナトリウムを加えて反応を終了させた後、F4010型分光蛍光光度計（HITACHI）により、励起波長を３６５nmとし、４５５nmの蛍光波長を測定した。抽出液の全可溶性タンパク質定量はProtein Assay Reagent Kit（PIERCE）を用いて行った。GUS活性は4-MU pmol mg-1 protein min-1として算出した。 For the individuals with rooting acclimation, transgenes were confirmed by genomic PCR and polyploidy was confirmed by a flow cytometer (PA-II). The activity of the GUS encoded by the transgene was measured by fluorescence (Kosugi et al., Plant Sci (1990) 70, p.133-140) for individuals that were confirmed to be transdiploid. . First, 0.2 g of crushed tomato fruit derived from rooting acclimatized individuals was placed in a 1.5 ml tube, and 250 μL of extraction buffer (50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0. 1% Triton X-100, 0.1% sodium lauroyl sarcosine, 10 mM β-mercaptoethanol) was added and stirred, followed by centrifugation (12,000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.). 50 μL of the supernatant was transferred to a new tube, 50 μL of 4-methylumbelliferyl glucuronide (MUG) solution (3.5 mg MUG / 10 ml extraction buffer) was added, stirred well, and allowed to stand at 37 ° C. for 60 minutes. After 1 mL of 0.2 M sodium carbonate was added to 100 μL of the reaction solution to complete the reaction, the excitation wavelength was 365 nm and the fluorescence wavelength of 455 nm was measured with an F4010 type spectrofluorometer (HITACHI). The total soluble protein of the extract was quantified using Protein Assay Reagent Kit (PIERCE). GUS activity was calculated as 4-MU pmol mg -1 protein min -1 .
このGUS活性測定の結果を表１及び図２に示す。有意差検定にはFisherのPSLD法を用いた。 The results of this GUS activity measurement are shown in Table 1 and FIG. Fisher's PSLD method was used for the significant difference test.
表１及び図２に示される通り、５０７bpのミラクリン遺伝子ターミネーター配列（T0.5）は、ミラクリン遺伝子プロモーター配列と35Sプロモーターのいずれを使用した場合でも、１０８５bpのミラクリン遺伝子ターミネーター配列（T1.1）やnosターミネーター（Tnos）と比較して、かなり高いGUS活性値をもたらした。 As shown in Table 1 and FIG. 2, the 507 bp miraculin gene terminator sequence (T0.5) is a 1085 bp miraculin gene terminator sequence (T1.1), regardless of whether the miraculin gene promoter sequence or the 35S promoter is used. Compared with nos terminator (Tnos), it resulted in a considerably higher GUS activity value.
特に、35Sプロモーター（P35S）と５０７bpのミラクリン遺伝子ターミネーター配列（T0.5）の組み合わせを含む核酸構築物（No.8）をトマトに導入した場合には、既存の35Sプロモーターとnosターミネーターの組み合わせを含む核酸構築物（No.9）と比べて、有意に高いGUS活性を示した（表１及び図２）。例えば、No.8とNo.9の核酸構築物についてそれぞれ得られたGUS活性の最大値を比較すると、No.8の方が約2倍高かった。一方、35Sプロモーター（P35S）と１０８５bpのミラクリン遺伝子ターミネーター配列（T1.1）の組み合わせを含む核酸構築物No.7を導入した場合は、核酸構築物No.9と比較して有意に高いGUS活性を示さなかった（表１及び図２）。 In particular, when a nucleic acid construct (No. 8) containing a combination of a 35S promoter (P35S) and a 507 bp miraculin gene terminator sequence (T0.5) is introduced into tomato, the combination of the existing 35S promoter and nos terminator is included. Compared with the nucleic acid construct (No. 9), it showed significantly higher GUS activity (Table 1 and FIG. 2). For example, comparing the maximum GUS activity values obtained for the No. 8 and No. 9 nucleic acid constructs, No. 8 was about twice as high. On the other hand, when nucleic acid construct No. 7 containing a combination of 35S promoter (P35S) and 1085 bp miraculin gene terminator sequence (T1.1) was introduced, it showed significantly higher GUS activity compared to nucleic acid construct No. 9. None (Table 1 and FIG. 2).
これらの結果は、ミラクリン遺伝子の５０７bpのターミネーター配列（T0.5）が、nosターミネーター（Tnos）や１０８５bpのミラクリン遺伝子ターミネーター配列（T1.1）と比べて、導入遺伝子由来の遺伝子産物の生産量を大きく増加させることを示している。 These results show that the 507 bp terminator sequence (T0.5) of the miraculin gene is more effective in producing the transgene-derived gene product than the nos terminator (Tnos) and the 1085 bp miraculin gene terminator sequence (T1.1). It shows a large increase.
このミラクリン遺伝子ターミネーター配列（T0.5）とは対照的に、ミラクリン遺伝子プロモーター配列を連結した核酸構築物（No.1〜6）を導入した場合には、組み合わせるターミネーター配列の種類にかかわらず、既存の35Sプロモーター／nosターミネーターの組み合わせを含む核酸構築物（No.9）よりも有意に高いGUS活性を示すことはなかった（図２中、核酸構築物No.1〜6、9）。このことから、ミラクリン遺伝子のプロモーター領域の発現誘導能は比較的弱いと考えられた。 In contrast to this miraculin gene terminator sequence (T0.5), when a nucleic acid construct (No. 1 to 6) linked to a miraculin gene promoter sequence is introduced, the existing terminator sequence is combined regardless of the type of terminator sequence to be combined. It did not show significantly higher GUS activity than the nucleic acid construct (No. 9) containing the 35S promoter / nos terminator combination (in FIG. 2, nucleic acid constructs No. 1 to 6 and 9). From this, it was considered that the ability to induce expression of the promoter region of the miraculin gene was relatively weak.
本発明のミラクリン遺伝子ターミネーター配列は、植物でのタンパク質等の組換え生産において遺伝子産物の生産量を増加させるために使用することができる。本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーター配列は、限定するものではないが、35Sプロモーターを用いた核酸構築物の遺伝子発現をとりわけ強化したことから、特に植物において、35Sプロモーターを使用した遺伝子発現系でより効率的な組換え生産を行う上で有用である。例えば、本発明に係るミラクリン遺伝子ターミネーター配列を用いて形質転換トマトを作製することにより、トマト果実で目的タンパク質を従来よりも高蓄積させることができる。 The miraculin gene terminator sequence of the present invention can be used to increase the production amount of a gene product in recombinant production of proteins and the like in plants. The miraculin gene terminator sequence according to the present invention is not limited, but is particularly efficient in a gene expression system using the 35S promoter, particularly in plants, because the gene expression of the nucleic acid construct using the 35S promoter was particularly enhanced. It is useful for carrying out simple recombinant production. For example, by producing a transformed tomato using the miraculin gene terminator sequence according to the present invention, the target protein can be accumulated higher in the tomato fruit than in the past.
配列番号１：ミラクリン遺伝子のプロモーター領域
配列番号２：ミラクリン遺伝子のターミネーター領域
配列番号３：ミラクリン遺伝子のターミネーターT0.5
配列番号４：アダプターADL
配列番号５：プライマーAP1
配列番号６：プライマーAP2
配列番号７：プライマーF1/458
配列番号８：プライマーF2/551
配列番号９：プライマーR1/248
配列番号１０：プライマーR1/139
配列番号１１：プライマーR2/101
配列番号１２：プライマーpBI121-F-HXK、塩基番号1〜21はHindIII、XhoI及びKpnI部位
配列番号１３：プライマーpBI121-R-HXK、塩基番号1〜9はXbaI部位
配列番号１４：プロモーター・プライマーXbaI-T-MIR
配列番号１５：プライマーP-1/F
配列番号１６：プライマーP-4/F
配列番号１７：プライマーP-7/F
配列番号１８：プライマーP-10/F
配列番号１９：プライマー EcoRI-T-2
配列番号２０：ターミネーター・プライマーSacI-P-MIR
配列番号２１：プライマー EcoRI-T-5
SEQ ID NO: 1: Promoter region of miraculin gene SEQ ID NO: 2: Terminator region of miraculin gene SEQ ID NO: 3: Terminator T0.5 of miraculin gene
Sequence number 4: Adapter ADL
Sequence number 5: Primer AP1
Sequence number 6: Primer AP2
Sequence number 7: Primer F1 / 458
Sequence number 8: Primer F2 / 551
Sequence number 9: Primer R1 / 248
Sequence number 10: Primer R1 / 139
Sequence number 11: Primer R2 / 101
SEQ ID NO: 12: primer pBI121-F-HXK,
Sequence number 15: Primer P-1 / F
Sequence number 16: Primer P-4 / F
Sequence number 17: Primer P-7 / F
Sequence number 18: Primer P-10 / F
Sequence number 19: Primer EcoRI-T-2
SEQ ID NO: 20: Terminator primer SacI-P-MIR
Sequence number 21: Primer EcoRI-T-5
Claims (12)
（ａ）配列番号３で示される塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号２の塩基番号１から、塩基番号４５０〜５５０のいずれかまでの塩基配列からなり、かつ、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターと比較して、その上流に連結された遺伝子の発現産物量を増加させるターミネーター機能を有するDNA
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のDNAの塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターと比較して、その上流に連結された遺伝子の発現産物量を増加させるターミネーター機能を有するDNA A terminator comprising the DNA of any one of (a) to (c) below.
(A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3
(B) Expression product amount of a gene consisting of the base sequence from base number 1 of SEQ ID NO: 2 to any one of base numbers 450 to 550 and linked upstream of the nopaline synthase gene terminator DNA with terminator function to increase
(C) consisting of a base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence of the DNA of (a) or (b), and compared with the nopaline synthase gene terminator, DNA with a terminator function that increases the amount of the expression product of the gene linked upstream
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