JP5346229B2 - 被検物質回収装置及び被検物質回収方法 - Google Patents
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図3に示すような、ガラス製の上部ゲル保持管4を使用した。上部ゲル保持管4の円錐部41は、上端外径を45mm、下端外径を20mm、長さを50mmとした。また、直線部42は、外径を20mm、長さを35mmとした。なお、上部ゲル保持管4の厚さは2mmである。このような形状の上部ゲル保持管4内に、架橋剤として0.26%のメチレンビスアクリルアミドを含む10%のアクリルアミドを重合させた分離ゲルG2と、0.26%のメチレンビスアクリルアミドを含む4.5%アクリルアミドを重合させた濃縮ゲルG1とを収容した。分離ゲルG2は、上部ゲル保持管4の下端から70mmの高さまで収容し、その分離ゲルG2の上に高さ10mmの濃縮ゲルG1を収容した。なお、分離ゲルG2と濃縮ゲルG1に含まれる緩衝液は、それぞれ、0.375MTris-HCl,0.1%SDS(pH8.8)、0.125MTris-HCl,0.1%SDS(pH6.8)とした。また、濃縮ゲルG1の上には、電極溶液として、25mMTris, 0.192MGlycine, 0.1%SDSを充填させた。
上記実施例1と同様の回収装置を用いて、市販人血漿(Sigma)から6000〜20000の低分子画分を回収したところ、回収液のタンパク質濃度は0.66mg/mLであった。これを以下に示す方法で質量分析を行った。
切り出したゲルを1mm3以下の細かいゲル片にした後、メチルペンテンをモノマーとするプラスチックであるTPXチューブに移した。そして、100mM炭酸水素アンモニウム水溶液とアセトニトリルとを5.5:4.5の比率で混合した溶液を加え30分間激しく振とうし、脱色・洗浄した。この操作を2回行った後、10mM Tris[2-carboxyethyl]phosphineに続いて50mMヨードアセトアミドを用いてゲル中のタンパク質の還元・アルキル化処理(37度、45分に続いて室温、1時間)を行い、アセトニトリルと100mM炭酸水素アンモニウム水溶液を交互に用いて5分間激しく振とうし、洗浄した。十分に洗浄した後、ゲル中のタンパク質を100mM炭酸水素アンモニウム水溶液中で、トリプシンを用いて酵素消化処理(37度、14時間)を行い、ペプチド断片へと導いた。ゲル片から溶液中に溶出したペプチド断片を別の容器に回収し、1%トリフルオロ酢酸を加えて、質量分析用の試料とした。
ペプチド断片のアミノ酸配列情報に基づいて、その由来となるタンパク質を同定するために、以下に示す装置と操作によってペプチド試料を分析し、タンパク質を同定した(藤井清永ら,J. Mass Spectrom. Soc. Jpn., 53:108-116 (2005))。
2 電気泳動ユニット
3 回収ユニット
4 上部ゲル保持管
41 截頭円錐部(濃縮部)
5 下部ゲル保持管
81 回収室
G1 濃縮ゲル
G2 分離ゲル
G3 ストッパーゲル
Claims (6)
- 被検物質を回収する回収装置であって、
下方に行くにしたがい横断面積が小さくなる濃縮部を有する上部ゲル保持管と、
前記上部ゲル保持管内に保持されるとともに、少なくとも一部が前記濃縮部内であって前記濃縮部の横断断面全体に位置する分離ゲルと、
前記濃縮部内で前記分離ゲル上に保持された濃縮ゲルと、
被検物質が前記分離ゲル内を下方に電気泳動するよう電圧を印加する電圧印加手段と、
前記分離ゲルの下方において前記分離ゲルの下端から漏出した被検物質を回収する回収室と、
を備えた、被検物質回収装置。 - 前記濃縮部は、錐体である、請求項1に記載の被検物質回収装置。
- 前記上部ゲル保持管は前記濃縮部の下方に直線部を備え、前記直線部に前記分離ゲルが位置しており、前記回収室は前記直線部の前記分離ゲルの下端から漏出した被検物質を回収する請求項1または請求項2に記載の被検物質回収装置。
- 前記回収室の下部に上部が接続された下部保持ゲル管と、
前記下部保持ゲル管内に保持され、前記回収室内の底面を画定するストッパーゲルと、
をさらに備えた、請求項1〜3のいずれかに記載の被検物質回収装置。 - 前記回収室に回収された被検物質の質量分析を行う質量分析装置をさらに備えた、請求項1〜4のいずれかに記載の回収装置。
- 分離ゲルを少なくとも一部が下方にいくにしたがい横断面積が小さくなる上部ゲル保持管に収容し、前記上部ゲル保持管の横断断面全体に位置させるステップと、
前記上部ゲル保持管内であって、前記分離ゲル上に濃縮ゲルを保持させるステップと、
被検物質を前記分離ゲル内で下方へ電気泳動させるステップと、
前記分離ゲルの下端から漏出した被検物質を回収するステップと、
を含む、被検物質の回収方法。
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JP2009053700A JP5346229B2 (ja) | 2009-03-06 | 2009-03-06 | 被検物質回収装置及び被検物質回収方法 |
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