JP5309657B2 - Culture vessel - Google Patents

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    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a culture container which can maintain an optimal culture density to efficiently culture on the culture of cells, tissues, microorganisms or the like and can realize the reduction in the damage of the cells, the improvement in the efficiency of works, and the reduce in the risk of contamination. <P>SOLUTION: The culture container, 1 in which cells and a culture medium are sealed to culture the cells, has at least one passage 3 for connecting the front portion of the receiving portion of the culture container 1 to the rear portion. The receiving portion is separated into the front portion and the rear portion with a dividing member 8. One of the front portion and the rear portion is used as a culture portion 11 for culturing the cells, and the other is used as a culture medium-supplying portion 12 for receiving the culture medium to be supplied to the culture portion 11. The culture medium is charged in the culture container 1, and the cells, microorganisms, multicellular organisms, tissues, organs, or the like are further charged in the culture container 1. The passage 3 can be equipped with a non-return valve, and a tube can be used as the passage. When the dividing member 8 is moved to the culture medium-supplying portion 12 side, the culture medium in the culture medium-supplying portion 12 is supplied to the culture portion 11 through the passage 3. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&amp;INPIT

Description

本発明は、細胞や組織、微生物等を培養するための培養容器に関する。   The present invention relates to a culture container for culturing cells, tissues, microorganisms and the like.

近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような細胞培養においては、細胞の増殖に併せて、細胞の生育に必要な培地を補給する必要がある。
培地の補給にあたり、従来は、細胞が培養容器内で十分に増殖すると、図１１に示すように、より容量の大きな培養容器などに移し替え（植え継ぎ）、これを繰り返すことで、細胞の大量培養が行われていた。 In recent years, in the fields of pharmaceutical production, gene therapy, regenerative medicine, immunotherapy, and the like, it has been required to efficiently culture a large amount of cells, tissues, microorganisms, and the like in an artificial environment.
In such cell culture, it is necessary to replenish a medium necessary for cell growth together with cell proliferation.
In supplementing the medium, conventionally, when the cells are sufficiently proliferated in the culture container, as shown in FIG. Incubation was taking place.

すなわち、同図に示す通り、まずフラスコ内に培地と細胞を入れて培養し、細胞増殖に併せて培地を追加して培養するとともに植え継ぎを行い、一定量に増殖した時点で、より容量の大きいバックなどに移し替えて、さらに培養と培地の補給、植え継ぎを繰り返し、細胞の大量培養が行われていた。
このように細胞を大量培養するにあたり植え継ぎを行うのは、培養開始時の細胞密度が低いと、細胞の増殖が抑制されるためである。 That is, as shown in the figure, the medium and cells are first placed in the flask and cultured, and the medium is added and cultured in conjunction with cell growth. The cells were transferred to a large bag, etc., and culture, medium supplementation, and planting were repeated to mass-culture cells.
The reason why the cells are transplanted when mass-culturing the cells is that the cell growth is suppressed when the cell density at the start of the culture is low.

ところが、このような細胞培養においては、植え継ぎのたびに新たなフラスコやバックなどの培養容器に培養細胞の一部を移さなければならず作業が煩雑になるとともに、細胞にダメージを与える可能性がある。また、コンタミネーション（contamination：汚染）のリスクが高いという問題があった。
そこで、植え継ぎを行なうことなく適正な培養環境を維持するための技術が種々提案されている。 However, in such cell culture, every time a planting is carried out, a part of the cultured cells must be transferred to a new culture container such as a flask or bag, and the work becomes complicated and the cells may be damaged. There is. In addition, there is a problem that the risk of contamination is high.
Therefore, various techniques for maintaining an appropriate culture environment without planting are proposed.

例えば、特許文献１に記載の細胞培養用具によれば、バッグ中の培養液の流通を阻止するための部材を用いて、培養領域を段階的に拡張可能とされている。このため、培養細胞の植え継ぎは必要なく、コンタミネーションのリスクを軽減することが可能となっている。   For example, according to the cell culture instrument described in Patent Document 1, the culture region can be expanded stepwise by using a member for preventing the flow of the culture solution in the bag. For this reason, it is not necessary to transplant cultured cells, and the risk of contamination can be reduced.

また、特許文献２に記載の培養容器は、単一のバッグ様密閉室をサブ区画室に分けるための外部区分手段を備えている。
この外部区分手段により、バッグ様密閉室の一部を締め付けることで複数のサブ区画室をつくることができ、培養開始時に適した細胞密度を確保するために十分に小さな規模の出発環境を提供できる。そして、このようなコンタミネーションが発生しない環境で、培養領域を段階的に拡張することができるようになっている。 Moreover, the culture container described in Patent Document 2 includes external sorting means for dividing a single bag-like sealed chamber into sub-compartments.
By this external partitioning means, a plurality of subcompartments can be created by tightening a part of the bag-like sealed chamber, and a sufficiently small starting environment can be provided to ensure a suitable cell density at the start of culture. . In addition, the culture region can be expanded stepwise in an environment where such contamination does not occur.

特開２０００−１２５８４８号公報JP 2000-125848 A 特許第２９８１６８４号公報Japanese Patent No. 2981684

しかしながら、特許文献１に記載の細胞培養用具を用いる場合は、培養の拡大に合わせて新しい培地を補給する必要がある。その際、手作業での培地の補給はコンタミネーションのリスクを高めることになる。また、培地入りの容器からチューブを介して補給する場合では、コンタミネーションのリスクは低下するが、培養容器とは別に培地入りの容器が必要となり、スペースや容器コストの点でのデメリットがあった。また、培養領域を段階的にしか拡張することができず、連続的に拡張することはできない。
また、特許文献２に記載の培養容器を用いる場合、培養領域はサブ区画室ごとに段階的に拡張されるため、細胞密度の連続性を得ることはできず、増殖に最適な細胞密度を維持することは困難である。
さらに、このような培養用具や容器を用いる場合、その構造上、大量培養を自動化して行うことは難しい。 However, when using the cell culture instrument described in Patent Document 1, it is necessary to replenish a new medium in accordance with the expansion of the culture. At that time, manually supplying the medium increases the risk of contamination. In addition, when replenishing from a container with a medium via a tube, the risk of contamination is reduced, but a container with a medium is required separately from the culture container, which has disadvantages in terms of space and container cost. . Further, the culture area can be expanded only in stages, and cannot be expanded continuously.
In addition, when the culture vessel described in Patent Document 2 is used, since the culture region is expanded step by step for each subcompartment, continuity of cell density cannot be obtained, and the optimal cell density for growth is maintained. It is difficult to do.
Furthermore, when such a culture tool or container is used, it is difficult to automate mass culture because of its structure.

本発明は、上記の事情にかんがみなされたものであり、細胞増殖に伴う培地の追加と培養領域の拡張にあたり、最適な培養密度を維持して効率的な培養を実現するとともに、作業性の向上、コンタミネーションリスクの低減、省スペース化を達成することの可能な培養容器に関する。   The present invention has been considered in view of the above circumstances, and in addition of a medium accompanying cell growth and expansion of a culture region, while maintaining an optimum culture density and realizing efficient culture, improvement in workability The present invention relates to a culture vessel capable of reducing contamination risk and achieving space saving.

上記目的を達成するため、本発明の培養容器は、細胞と培地を封入して細胞の培養を行うための培養容器であって、当該培養容器の収容部の前部と後部とをつなぐ、少なくとも一の流路を備えた構成としてある。
この収容部は、仕切部材により前部と後部に分離され、前部又は後部の一方が培養を行うための培養部、他方が培養部に対する補充用の培地を収容する培地供給部として用いられる。 In order to achieve the above object, the culture container of the present invention is a culture container for culturing cells by enclosing cells and a medium, and connects at least the front part and the rear part of the accommodating part of the culture container, The configuration includes one flow path.
This storage part is separated into a front part and a rear part by a partition member, and one of the front part and the rear part is used as a culture part for culturing, and the other part is used as a medium supply part for storing a supplementary medium for the culture part.

培養容器には、培地が充填され、さらに細胞、微生物、多細胞生物、組織、器官等が充填される。
また、流路に逆止弁を備えることで、培地が培養部から培地供給部へ逆流することを防止することができる。培地供給部から培養部へ培地を供給するポンプなどを用いることも好ましい。
また、流路を培養容器の少なくとも収容部の一部に形成することが好ましく、一又は二以上のチューブで形成することも好ましい。 The culture container is filled with a medium and further filled with cells, microorganisms, multicellular organisms, tissues, organs, and the like.
Further, by providing a check valve in the flow path, it is possible to prevent the culture medium from flowing back from the culture section to the culture medium supply section. It is also preferable to use a pump for supplying a medium from the medium supply unit to the culture unit.
Moreover, it is preferable to form a flow path in at least a part of the accommodating portion of the culture container, and it is also preferable to form the flow path with one or more tubes.

また、本発明の培養容器は、仕切部材を培地供給部側へ移動させることで、培地供給部における培地が流路を介して培養部へ供給される。
さらに、本発明の培養容器は、培養容器の収容部が仕切部材により、培養を行うための一又は二以上の培養部と、培養部に対する補充用の培地を収容する一又は二以上の培地供給部とに分離され、培養部と培地供給部とをつなぐ、少なくとも一の流路を備えたものとすることも好ましい。 Moreover, the culture container of this invention moves the partition member to the culture-medium supply part side, and the culture medium in a culture-medium supply part is supplied to a culture part via a flow path.
Furthermore, the culture container of the present invention is provided with one or two or more culture units for culturing, and one or two or more culture medium supply media for supplementing the culture unit, with the accommodating part of the culture container being a partition member. It is also preferable to include at least one flow path that is separated into a part and connects the culture part and the medium supply part.

本発明によれば、単一の培養容器を用いて、培地の追加及び培養領域の連続的な拡張を行うことができる。
このため、最適な培養密度を維持して効率的な培養を行うことができるとともに、細胞へのダメージの低減、作業の効率化、コンタミネーションリスクの低減を実現することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to add a medium and continuously expand a culture region using a single culture container.
Therefore, efficient culture can be performed while maintaining an optimal culture density, and it is possible to reduce damage to cells, increase work efficiency, and reduce contamination risk.

以下、本発明の培養容器の好ましい実施形態について、図１及び図２を参照して説明する。図１は、本実施形態の培養容器を示す図である。図２は、本実施形態の培養容器を用いた培養方法を示す図である。
本実施形態の培養容器１は、図１に示すように、培地を充填するための収容部を備えており、かつ、収容部の前後をつなぐ流路を有している。 Hereinafter, a preferred embodiment of the culture vessel of the present invention will be described with reference to FIGS. 1 and 2. FIG. 1 is a diagram showing a culture container according to this embodiment. FIG. 2 is a diagram showing a culture method using the culture container of the present embodiment.
As shown in FIG. 1, the culture container 1 according to the present embodiment includes a storage unit for filling a culture medium, and has a flow path that connects the front and back of the storage unit.

図１（ａ）の例では、収容部の一方の側部付近に、容器を構成する袋の上面と下面を前後方向（図１（ａ）において上下方向）に接着する接着部２を形成してある。この接着部２は、袋の前端及び後端までは至っていない。したがって、この接着部２により、袋の一側端に沿って、流路３が形成される。この接着部２は、袋の上面と下面を熱で溶かして圧着し、ヒートシールにより張り合わせたものである。
培養容器１を、このようにすれば、収容部の前部において細胞が増殖し、培地を追加する場合、後述する仕切部材を移動させることなどにより、収容部の後部における培地を、流路３を通じて収容部の前部に供給することができる。 In the example of FIG. 1A, an adhesive portion 2 is formed in the vicinity of one side portion of the housing portion to bond the upper surface and the lower surface of the bag constituting the container in the front-rear direction (vertical direction in FIG. 1A). It is. The bonding portion 2 does not reach the front end and the rear end of the bag. Accordingly, the flow path 3 is formed along one side end of the bag by the bonding portion 2. The bonding portion 2 is obtained by melting the upper surface and lower surface of the bag with heat and press-bonding them, and bonding them together by heat sealing.
In this way, when the culture container 1 is configured as described above, when cells grow in the front part of the storage part and a culture medium is added, the culture medium in the rear part of the storage part is moved to the flow path 3 by moving a partition member to be described later. Can be supplied to the front part of the accommodating part.

また、培養容器１は、図１（ａ）に示すように、容器外部につながれる、２本以上のチューブ４を接続した構成にすることができる。このチューブ４のうち、１本は培養する細胞や培地を外部から培養容器１内に注入するための注入用、他の１本は培養した細胞や培地を培養容器１内から回収するための回収用とすることができる。また、図１のように、チューブ４が３本取り付けられている場合、３本目は培養した細胞や培地をサンプルとして培養容器１内から取り出すためのサンプリング用とすることができる。   Moreover, the culture container 1 can be made into the structure which connected the two or more tubes 4 connected to the exterior of a container, as shown to Fig.1 (a). Of these tubes 4, one is for injection for injecting cells and medium to be cultured into the culture container 1 from the outside, and the other is for recovering cultured cells and medium from the culture container 1. Can be used. Further, as shown in FIG. 1, when three tubes 4 are attached, the third tube can be used for sampling for taking out cultured cells and culture media from the culture vessel 1 as samples.

また、培養容器１は、軟包材を材料として、袋状（バッグ型）に形成したものとすることが好ましい。軟包材を用いることで、培養容器に可撓性・柔軟性を付与することができる。軟包材としては、例えば、特開２００２−２５５２７７号公報（軟包材フィルムシートを用いた食品包装体及び食品の取り出し方法）や、特開２００４−３２３０７７号公報（加圧抽出形の袋状容器）に記載されているものなどを用いることができる。   Moreover, it is preferable that the culture container 1 shall be formed in the bag shape (bag type | mold) using the soft packaging material. By using a soft packaging material, flexibility and softness can be imparted to the culture vessel. Examples of the soft packaging material include, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-255277 (a food packaging body using a soft packaging material film sheet and a method for taking out food), and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-323077 (a pressure extraction type bag shape). Those described in (Containers) can be used.

また、培養容器１は、細胞培養に必要なガス透過性を有しており、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有している。このような条件を満たす培養容器の材料としては、例えばポリオレフィン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、スチレン系エラストマー、オレフィン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーンゴム等を挙げることができる。   Moreover, the culture container 1 has gas permeability required for cell culture, and a part or all of it is transparent so that the contents can be confirmed. Examples of the culture container material that satisfies such conditions include polyolefin, ethylene-vinyl acetate copolymer, styrene elastomer, olefin thermoplastic elastomer, polyester thermoplastic elastomer, silicone thermoplastic elastomer, silicone rubber, and the like. Can be mentioned.

本実施形態の培養容器１は、収容部の前後をつなぐ少なくとも１つの流路を有するものであれば良く、図１（ａ）の他、例えば図１（ｂ）〜（ｆ）のようなバイパスチューブ５を用いた構成にすることも可能である。
すなわち、図１（ｂ）に示された培養容器１は、収容部の前部側縁（培地を回収するチューブ側）と後部側縁（培地を回収するチューブの反対側）がバイパスチューブ５により接続されている。 The culture container 1 of this embodiment should just have at least 1 flow path which connects the front and back of an accommodating part, and is bypassed like FIG.1 (b)-(f) other than FIG. 1 (a), for example. A configuration using the tube 5 is also possible.
That is, the culture container 1 shown in FIG. 1B has the front side edge (the tube side for collecting the culture medium) and the rear side edge (the opposite side of the tube for collecting the culture medium) of the housing portion by the bypass tube 5. It is connected.

また、チューブ４及びバイパスチューブ５の材料としては、例えば、シリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、オレフィン系熱可塑性エラストマー、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）等を用いることができる。   Examples of the material of the tube 4 and the bypass tube 5 include silicone rubber, soft vinyl chloride resin, polybutadiene resin, ethylene-vinyl acetate copolymer, chlorinated polyethylene resin, olefin-based thermoplastic elastomer, polyurethane-based thermoplastic elastomer. , Polyester-based thermoplastic elastomers, silicone-based thermoplastic elastomers, styrene-based elastomers such as SBS (styrene-butadiene-styrene), SIS (styrene-isoprene-styrene), SEBS (styrene-ethylene-butylene-styrene), SEPS ( Styrene, ethylene, propylene, styrene) and the like can be used.

また、培養容器１を、図１（ｃ）に示すように、バイパスチューブ５を収容部の後端部から、収容部の前部側縁に接続した構成とすることもできる。
このような構成にすれば、培地を、仕切部材を移動させることなどによって、収容部の後部からバイパスチューブ５へより効率的に移動させることが可能となる。 Moreover, as shown in FIG.1 (c), the culture container 1 can also be set as the structure which connected the bypass tube 5 to the front part side edge of the accommodating part from the rear-end part of an accommodating part.
With such a configuration, the culture medium can be more efficiently moved from the rear portion of the storage portion to the bypass tube 5 by moving the partition member.

さらに、培養容器１を、図１（ｄ）に示すように、バイパスチューブ５を収容部の後端部から収容部の前部側縁に接続することに加え、バイパスチューブ５が接続された収容部の後部の両角をカットして収容部を密閉した構成とすることも好ましい。このようにすれば、仕切部材を移動させることなどによって、培地を収容部の後部からバイパスチューブ５へさらに効率的に移動させることが可能となる。
また、収容部の前部側縁におけるバイパスチューブ５を接続した部分の向かい側の角をカットして収容部を密閉した構成とすることにより収容部の前部の培養面積の拡大の制御がより正確に可能となり、培養効率を高く保つことが可能となる。 Further, as shown in FIG. 1 (d), the culture vessel 1 is connected to the bypass tube 5 from the rear end of the storage portion to the front side edge of the storage portion, and the storage to which the bypass tube 5 is connected. It is also preferable to have a configuration in which both corners of the rear part of the part are cut to seal the housing part. If it does in this way, it will become possible to move a culture medium to the bypass tube 5 more efficiently from the rear part of a storage part by moving a partition member.
Moreover, the control of the expansion of the culture area of the front part of the accommodating part is more accurate by cutting the corner on the opposite side of the part where the bypass tube 5 is connected at the front side edge of the accommodating part and sealing the accommodating part. And the culture efficiency can be kept high.

また、培養容器１を、図１（ｅ），（ｆ）に示すように、バイパスチューブ５を収容部の後端部から、収容部の前部側縁に、左右対称に接続した構成とすることも好ましい。このようにすれば、仕切部材を移動させることなどによって、収容部の前部へ培地を供給する際、培地を左右均等に行きわたらせることができるため、培養効率を一層向上させることが可能となる。
さらに、培養容器１に、図１（ａ）に示すような流路３と、図１（ｂ）〜（ｆ）に示すようなバイパスチューブ５を合わせ持つ構成とすることも可能である。 In addition, as shown in FIGS. 1 (e) and 1 (f), the culture vessel 1 has a configuration in which the bypass tube 5 is connected symmetrically from the rear end portion of the housing portion to the front side edge of the housing portion. It is also preferable. In this way, when the culture medium is supplied to the front part of the storage unit by moving the partition member, the culture medium can be spread evenly on the left and right, so that the culture efficiency can be further improved. Become.
Furthermore, the culture vessel 1 can be configured to have both the flow path 3 as shown in FIG. 1A and the bypass tube 5 as shown in FIGS. 1B to 1F.

なお、図１（ｂ）に示す培養容器１のバイパスチューブ５にはバルブ６を設けてあり、図１（ｃ）に示す培養容器１のバイパスチューブ５にはポンプ７を設けてある。これらは一例であって、図１（ａ）〜（ｆ）のいずれかの例において、バルブ又はポンプを設けるか否かは自由に選択可能である。   In addition, the valve 6 is provided in the bypass tube 5 of the culture container 1 shown in FIG.1 (b), and the pump 7 is provided in the bypass tube 5 of the culture container 1 shown in FIG.1 (c). These are merely examples, and in any of the examples of FIGS. 1A to 1F, whether or not to provide a valve or a pump can be freely selected.

次に、本実施形態の培養容器１を用いた培養方法について、図２を参照して説明する。
図２（ａ）は、図１（ａ）に示した培養容器を用いた例であり、培養容器１の収容部を、仕切部材８を用いて前部と後部に区分けし、前部を培養を行うための培養部１１、後部を補充用の培地を収容する培地供給部１２とした構成が示されている。 Next, a culture method using the culture container 1 of the present embodiment will be described with reference to FIG.
FIG. 2 (a) is an example using the culture container shown in FIG. 1 (a). The accommodating part of the culture container 1 is divided into a front part and a rear part using a partition member 8, and the front part is cultured. A configuration is shown in which a culture unit 11 for performing the above and a medium supply unit 12 for containing a supplementary medium in the rear part are shown.

接着部２により形成された流路３の中央部には、図示していないが、クリップやバルブあるいはポンプ等が取り付けられ、培養部１１側と培地供給部１２側が分離及び連通可能に接続されている。
仕切部材８としては、培養容器１を培養部１１側と培地供給部１２側に分離して、これらの間の培地の移動を遮断することができるものであれば、特に限定されないが、例えばローラなどを用いることができる。 Although not shown in the figure, a clip, a valve, a pump, or the like is attached to the central portion of the flow path 3 formed by the bonding portion 2, and the culture portion 11 side and the medium supply portion 12 side are connected so as to be separated and communicated. Yes.
The partition member 8 is not particularly limited as long as it can separate the culture vessel 1 into the culture unit 11 side and the culture medium supply unit 12 side and block the movement of the culture medium between them. Etc. can be used.

培養部１１において細胞が増殖し、培地供給部１２から培養部１１に培地を追加する場合は、流路３のクリップをはずし、又はバルブを開けることなどにより、仕切部材８を収容部の後端に向けて移動させる。このバルブとしては、逆止弁などを用いることができる。
このようにすると、培地供給部１２の内圧が高くなって、培地が流路３を経由して、培養部１１に追加される。追加した後は、バルブを閉じて培養部１１と培地供給部１２の間を遮断する。 When cells grow in the culture unit 11 and a culture medium is added from the culture medium supply unit 12 to the culture unit 11, the partition member 8 is inserted into the rear end of the storage unit by removing the clip of the flow path 3 or opening the valve. Move towards. As this valve, a check valve or the like can be used.
If it does in this way, the internal pressure of the culture-medium supply part 12 will become high, and a culture medium will be added to the culture part 11 via the flow path 3. FIG. After the addition, the valve is closed to shut off the culture unit 11 and the medium supply unit 12.

また、本実施形態の培養容器１によれば、このように仕切部材８とバルブ等を用いることで、移動する培地の量を連続的に調整することが可能である。
さらに、細胞の増殖速度に合わせて、仕切部材８を収容部の後端に向けて移動させるとともに、ポンプを用いて能動的に一定量の培地を培養部１１に送り出すことで、常時連続的に培地の供給を行うことも可能である。
このように、本実施形態の培養容器１によれば、移動する培地の量を連続的に調整することが可能であり、培養する細胞の密度を培養に最適な範囲に維持することができる。 Moreover, according to the culture container 1 of this embodiment, it is possible to adjust continuously the quantity of the culture medium to move by using the partition member 8, a valve | bulb, etc. in this way.
Further, the partition member 8 is moved toward the rear end of the accommodating portion in accordance with the cell growth rate, and a constant amount of medium is actively sent to the culturing portion 11 using a pump, so that it can be continuously continuously produced. It is also possible to supply a medium.
As described above, according to the culture container 1 of the present embodiment, the amount of the moving medium can be continuously adjusted, and the density of the cells to be cultured can be maintained within the optimum range for the culture.

ここで、細胞培養において、細胞密度が増殖にどのような影響を与えるのかを図３〜図６を用いて説明する。図３は、培養に最適な細胞密度の範囲を確認するための実験条件を示す図である。図４は、各種細胞密度ごとの培養時間に対する増殖倍率を示す図である。図５は、各種細胞密度ごとの培養時間に対する増殖倍率を示す図の一部を拡大した図である。図６は、細胞培養における最適細胞密度依存性を示す図である。   Here, how cell density affects proliferation in cell culture will be described with reference to FIGS. FIG. 3 is a diagram showing experimental conditions for confirming the optimum cell density range for culture. FIG. 4 is a diagram showing the multiplication factor with respect to the culture time for each cell density. FIG. 5 is an enlarged view of a part of the diagram showing the multiplication rate with respect to the culture time for each cell density. FIG. 6 is a diagram showing the optimum cell density dependence in cell culture.

まず、図３に示すような条件で、４０００、１０，０００、４０，０００、１２０，０００、２００，０００（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の各細胞密度に調整した培養バックを準備した。培養バックは、ＬＬＤＰＥ製バック（厚み １００μｍ）、バックサイズ５０×８０（ｍｍ）を用いた。培地は、ＲＰＭＩ１６４０（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０ｍｌを用い、播種細胞は、Jurkat E6.1株（ヒト白血病Tリンパ腫）を用いた。   First, culture bags adjusted to respective cell densities of 4000, 10,000, 40,000, 120,000, and 200,000 (cells / ml) were prepared under the conditions shown in FIG. As the culture bag, a LLDPE bag (thickness: 100 μm) and a back size of 50 × 80 (mm) were used. The medium used was 50 ml of RPMI 1640 (invitrogen), and the Jurkat E6.1 strain (human leukemia T lymphoma) was used as the seeded cells.

そして、それぞれの培養バックを３７℃−５％ＣＯ２雰囲気下で５日間培養し、２４、４８、７２、及び１４４時間後におけるそれぞれの細胞数を測定した。その結果を図４〜図６に示す。図５は、図４における囲み部分を拡大したものである。
図５に示される通り、培養開始時から２４時間後における、細胞密度が小さい培養バック（４０００、１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の増殖倍率は、細胞密度が大きい培養バック（１２０，０００、２００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の増殖倍率に比較して、１／２以下となっている。 Then, each culture back to 5 days of culture under 2 atmosphere 37 ℃ -5% CO, 24,48,72, and to measure the number of each cell after 144 hours. The results are shown in FIGS. FIG. 5 is an enlarged view of the encircled portion in FIG.
As shown in FIG. 5, after 24 hours from the start of the culture, the growth rate of the culture bag having a low cell density (4000, 10,000 cells / ml) is indicated by the culture bag having a high cell density (120,000, 200,000 cells). / Ml) of the growth rate is 1/2 or less.

これは、培養初期において、細胞密度が小さいと増殖効率が低いことを示している。一方、細胞密度が大きい場合には、時間の経過とともに、培地が劣化（酸素不足、乳酸過多、老廃物蓄積）して、増殖効率が低下する。したがって、これらのことから、細胞の培養を行うにあたり、細胞の増殖効率が最も良い細胞密度範囲が存在することが分かる。図６は、このような細胞培養における最適細胞密度依存性をまとめたものである。   This indicates that the growth efficiency is low when the cell density is small in the early stage of culture. On the other hand, when the cell density is high, the culture medium deteriorates with time (oxygen deficiency, excessive lactate, waste accumulation), and the growth efficiency decreases. Therefore, it can be seen from these facts that there is a cell density range in which the cell proliferation efficiency is the best in culturing cells. FIG. 6 summarizes the optimum cell density dependence in such cell culture.

以上説明したように、本実施形態の培養容器によれば、一つの培養容器を用いて、培地の追加及び培養領域の連続的な拡張を行うことができる。
このため、最適な培養密度を維持して効率的な培養を行うことができるとともに、細胞へのダメージの低減、作業の効率化、コンタミネーションリスクの低減を実現することが可能となる。
また、仕切部材の移動及び流路のバルブやポンプ等を制御することで、細胞培養を容易に自動化することが可能である。 As described above, according to the culture container of the present embodiment, it is possible to add a medium and continuously expand a culture region using a single culture container.
Therefore, efficient culture can be performed while maintaining an optimal culture density, and it is possible to reduce damage to cells, increase work efficiency, and reduce contamination risk.
In addition, cell culture can be easily automated by controlling the movement of the partition member and the valves and pumps of the flow path.

（実施例１）
図１（ｂ）に示す、培地を補充するための流路を構成するバイパスチューブ５を備えた培養容器１を用いて、細胞培養を行った。培養容器１としては、ＬＬＤＰＥ製バック（厚み１００μｍ，サイズ１４５×２９５ｍｍ）を、バイパスチューブ５としては、シリコンチューブ（ＴＹＧＯＮ３３５５Ｌ：内径４ｍｍ）を用いた。培地には、ＲＰＭＩ１６４０（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、播種細胞としてJurkat E6.1株（ヒト白血病Tリンパ腫）を１．０×１０７ｃｅｌｌｓ播種した。そして、培養部面積を１７０ｃｍ２から４３０ｃｍ２まで拡張し、細胞密度が１．０×１０５〜８．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように培地量を１００〜５００ｍｌに拡大した。以上の培養条件を図７に示す。 Example 1
Cell culture was performed using a culture vessel 1 provided with a bypass tube 5 that constitutes a flow path for replenishing the medium shown in FIG. The culture vessel 1 was an LLDPE bag (thickness 100 μm, size 145 × 295 mm), and the bypass tube 5 was a silicon tube (TYGON 3355L: inner diameter 4 mm). RPMI1640 (invitrogen) was used as a medium, and Jurkat E6.1 strain (human leukemia T lymphoma) was seeded as 1.0 × 10 7 cells as seeded cells. Then, the culture part area extends from 170cm 2 to 430 cm 2, an enlarged view of the media amounts to cell density of 1.0 × 10 5 ~8.6 × 10 5 cells / ml in 100 to 500 ml. The above culture conditions are shown in FIG.

本実施例１では、初期培養面積を１７０ｃｍ２とし、培地量を１００ｍｌとすることで、初期培養密度を比較的高く設定している。そして、培養部面積を図８及び図９に示すように、少しづつ段階的に増加させることで、培地の追加に伴う細胞密度の大幅な低下を防止している。
このようにして１２０時間培養を行い、培養された細胞を回収した。回収された細胞数は、４．３×１０８ｃｅｌｌｓであった。この結果を図１０に示す。 In Example 1, the initial culture density is set to be relatively high by setting the initial culture area to 170 cm 2 and the medium amount to 100 ml. And as shown in FIG.8 and FIG.9, the culture part area is increased little by little, and the large fall of the cell density accompanying the addition of a culture medium is prevented.
The culture was performed for 120 hours in this manner, and the cultured cells were collected. The number of cells collected was 4.3 × 10 8 cells. The result is shown in FIG.

（比較例１）
流路を備えていない従来の培養容器を、仕切部材等を用いることなくそのまま使用して、細胞培養を行った。培養容器、培地、及び播種細胞としては、実施例１と同様のものを使用した。そして、実施例１と同量の細胞数を播種し、培養部面積を４３０ｃｍ２、培地量を５００ｍｌの一定に固定したまま１２０時間培養を行い、培養された細胞を回収した。回収された細胞数は、３．３×１０８ｃｅｌｌｓであった。この培養条件を図７に、培養部面積の変化を図８及び図９に、実験結果を図１０に示す。 (Comparative Example 1)
Cell culture was performed using a conventional culture vessel without a flow path as it was without using a partition member or the like. The same culture container, medium and seeded cells as those in Example 1 were used. Then, the same number of cells as in Example 1 was seeded, the culture area was fixed at 430 cm 2 , and the medium amount was fixed at 500 ml for 120 hours, and the cultured cells were collected. The number of cells collected was 3.3 × 10 8 cells. FIG. 7 shows the culture conditions, FIG. 8 and FIG. 9 show changes in the area of the culture part, and FIG. 10 shows the experimental results.

図１０に示される通り、実施例１と比較例１における播種した細胞数は１．０×１０７ｃｅｌｌｓで同一であるが、回収細胞数は、実施例１が４．３×１０８ｃｅｌｌｓ、比較例１が３．３×１０８ｃｅｌｌｓと、実施例１の方が比較例１に対して３割程度多くなっている。 As shown in FIG. 10, the number of cells seeded in Example 1 and Comparative Example 1 was the same at 1.0 × 10 7 cells, but the number of recovered cells was 4.3 × 10 8 cells in Example 1, Comparative Example 1 is 3.3 × 10 8 cells, and Example 1 is about 30% more than Comparative Example 1.

このことから、実施例１のように、細胞の増殖にあわせて少量づつ培養部を拡大するとともに、培地の追加を繰り返し、細胞密度を培養開始時から培養終了時まで大きく変化させることなく培養を行うことで、培養環境をできるだけ最適な状態で均一に保つことができ、細胞の培養速度を速めることができることが確認された。
また、比較例１のように、開始時の培養密度が低い場合には、細胞の増殖に適した環境になるまでに一定の時間が必要となることから、開始時の培養密度がより高い場合に比較して、細胞の培養速度が遅くなることが確認された。 From this, as in Example 1, while expanding the culture portion in small increments in accordance with the growth of the cells, repeating the addition of the medium, the culture is performed without greatly changing the cell density from the start of the culture to the end of the culture. As a result, it was confirmed that the culture environment can be kept uniform in the optimum state as much as possible, and the cell culture speed can be increased.
Further, as in Comparative Example 1, when the culture density at the start is low, a certain amount of time is required until an environment suitable for cell growth is reached. Therefore, when the culture density at the start is higher It was confirmed that the culture rate of the cells was slow compared to.

本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、培養部の面積を所定時間ごとに段階的に拡大するのではなく、仕切部材８を培養開始から培養終了時まで自動的に微量づつ連続的に移動させたり、あるいは、二以上の仕切部材を用いて、培養容器を二以上の培養部又は培地供給部を備えた構成とするなど適宜変更することが可能である。 It goes without saying that the present invention is not limited to the above embodiment, and that various modifications can be made within the scope of the present invention.
For example, instead of expanding the area of the culture part step by step every predetermined time, the partition member 8 is automatically moved continuously from the start of culture to the end of the culture in small amounts, or two or more partition members The culture vessel can be appropriately changed, for example, to have a configuration including two or more culture units or medium supply units.

本発明は、大量の細胞を培養する必要のあるバイオ医薬や再生医療、免疫療法等の分野において、好適に利用することが可能である。   The present invention can be suitably used in the fields of biopharmaceuticals, regenerative medicine, immunotherapy and the like that require culturing a large amount of cells.

本発明の実施形態の培養容器を示す図である。It is a figure which shows the culture container of embodiment of this invention. 本発明の実施形態の培養容器を用いた培養方法を示す図である。It is a figure which shows the culture method using the culture container of embodiment of this invention. 培養に最適な細胞密度の範囲を確認するための実験条件を示す図である。It is a figure which shows the experimental condition for confirming the range of the optimal cell density for culture | cultivation. 各種細胞密度ごとの培養時間に対する増殖倍率を示す図である。It is a figure which shows the multiplication factor with respect to the culture | cultivation time for every cell density. 各種細胞密度ごとの培養時間に対する増殖倍率を示す図の一部を拡大した図である。It is the figure which expanded a part of figure which shows the multiplication factor with respect to the culture | cultivation time for every cell density. 細胞培養における最適細胞密度依存性を示す図である。It is a figure which shows the optimal cell density dependence in a cell culture. 本発明の実施例１及び比較例１の実験条件を示す図である。It is a figure which shows the experimental conditions of Example 1 and Comparative Example 1 of this invention. 本発明の実施例１及び比較例１の培養部面積の変化を示す図である。It is a figure which shows the change of the culture part area of Example 1 and Comparative Example 1 of this invention. 本発明の実施例１及び比較例１の実験条件を示す概念図である。It is a conceptual diagram which shows the experimental conditions of Example 1 and Comparative Example 1 of the present invention. 本発明の実施例１及び比較例１の実験結果を示す図である。It is a figure which shows the experimental result of Example 1 and Comparative Example 1 of this invention. 従来の細胞培養方法を示す図である。It is a figure which shows the conventional cell culture method.

符号の説明Explanation of symbols

１ 培養容器
２ 接着部
３ 流路
４ チューブ
５ バイパスチューブ
６ バルブ
７ ポンプ
８ 仕切部材
１０ 培地
１１ 培養部
１２ 培地供給部 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Culture container 2 Adhesion part 3 Flow path 4 Tube 5 Bypass tube 6 Valve 7 Pump 8 Partition member 10 Medium 11 Culture part 12 Medium supply part

Claims (6)

細胞と培地を封入して細胞の培養を行うための培養容器であって、
当該培養容器の収容部が仕切部材により前部と後部に分離され、前部又は後部の一方が培養を行うための培養部、他方が前記培養部に対する補充用の培地を収容する培地供給部として用いられ、
前記培養部と前記培地供給部とを接続する、少なくとも一の流路を備え、
前記仕切部材を前記培地供給部側へ移動させることで、前記培地供給部における培地が前記流路を介して前記培養部へ供給されることを特徴とする培養容器。 A culture vessel for culturing cells by enclosing cells and a medium,
The culture container container is separated into a front part and a rear part by a partition member. One of the front part and the rear part is a culture part for culturing, and the other is a medium supply part for containing a supplementary medium for the culture part. Used,
Comprising at least one flow path connecting the culture unit and the medium supply unit ;
A culture container , wherein the culture medium in the culture medium supply unit is supplied to the culture unit via the flow path by moving the partition member toward the culture medium supply unit . 請求項１記載の培養容器に、培地が充填されていることを特徴とする培養容器。 A culture container, wherein the culture container according to claim 1 is filled with a culture medium. 請求項１又は２記載の培養容器に、細胞、微生物、多細胞生物、組織、器官等が充填されていることを特徴とする培養容器。 A culture vessel characterized in that the culture vessel according to claim 1 or 2 is filled with cells, microorganisms, multicellular organisms, tissues, organs and the like. 前記流路に逆止弁が備えられたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の培養容器。 Culture container according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the check valve provided in said flow path. 前記流路が、少なくとも前記培養容器の収容部の一部に、又は、一又は二以上のチューブにより形成されたことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の培養容器。 The culture vessel according to any one of claims 1 to 4 , wherein the flow path is formed at least in a part of the housing portion of the culture vessel or by one or more tubes. 細胞と培地を封入して細胞の培養を行うための培養容器であって、当該培養容器の収容部が仕切部材により、培養を行うための一又は二以上の培養部と、前記培養部に対する補充用の培地を収容する一又は二以上の培地供給部とに分離され、前記培養部と前記培地供給部とをつなぐ、少なくとも一の流路を備え、前記仕切部材を前記培地供給部側へ移動させることで、前記培地供給部における培地が前記流路を介して前記培養部へ供給されることを特徴とする培養容器。

A culture container for culturing cells by enclosing the cells and the medium, wherein the culture container is provided with one or more culture parts for culturing by the partition member, and the culture part is replenished The medium is separated into one or two or more medium supply units that contain a medium for use, and includes at least one flow path that connects the culture unit and the medium supply unit, and moves the partition member toward the medium supply unit By doing so, the culture medium in the culture medium supply unit is supplied to the culture unit via the flow path .

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