JP5305427B2 - Method for producing antibody against influenza virus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はインフルエンザウイルスに対する抗体の産生方法に関する。より詳しくは鳥類好ましくは、ダチョウを用いその卵からインフルエンザウイルスに対する抗体を産生する方法に関するものである。 The present invention relates to a method for producing an antibody against influenza virus. More particularly, the present invention relates to a method for producing antibodies against influenza virus from eggs, preferably using ostriches.
インフルエンザウイルスにはＡ、ＢおよびＣの３つの型がある。世界的な流行を起こし、多くの死者が出るのは主にＡ型である。Ａ型インフルエンザウイルスは更にウイルス表面のタンパク質であるヘマグルチニン（haemagglutinin:以下ＨＡと略す）およびノイラミニダーゼ（以下、ＮＡと略す）の抗原性により多くの亜型に分類される。これまでに少なくともＨＡに１６種類、ＮＡに９種類の変異が見つかっており、その組み合わせの数の亜型が存在し得る。これら亜型の違いはＨ１Ｎ１〜Ｈ１６Ｎ９といった略称で表現されている。 There are three types of influenza viruses: A, B and C. It is type A that causes a global epidemic and causes many deaths. Influenza A virus is further classified into many subtypes depending on the antigenicity of hemagglutinin (hereinafter abbreviated as HA) and neuraminidase (hereinafter abbreviated as NA), which are proteins on the surface of the virus. So far, at least 16 mutations have been found in HA and 9 mutations in NA, and there can be as many subtypes as there are combinations thereof. Differences between these subtypes are expressed by abbreviations such as H1N1 to H16N9.
インフルエンザウイルスは、ヒトを含む哺乳類および鳥類に感染する。従来は種の壁があるためヒトにはヒトインフルエンザ、鳥類にはトリインフルエンザのみが感染すると考えられてきたが、近年ヒトおよびトリの両方に感染するインフルエンザウイルスが出現している。これらの中で、特にＨ５Ｎ１は高病原性トリインフルエンザウイルスと呼ばれ（日本では家畜伝染病予防法で規定されている）、これに感染した場合は、ヒトおよびトリの両者で極めて致死率が高い。 Influenza viruses infect mammals and birds, including humans. Conventionally, due to the species barrier, it has been considered that only human influenza is infected in humans and avian influenza is infected in birds. In recent years, influenza viruses that infect both humans and birds have emerged. Among these, H5N1 is particularly called highly pathogenic avian influenza virus (in Japan, it is regulated by the Livestock Infectious Disease Prevention Law), and when infected, both humans and birds have extremely high mortality rates. .
インフルエンザウイルスの検出、治療、予防、防疫には、抗体が有用である。抗体の製造方法としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギのような哺乳動物を使用する方法の他、鳥類を使用する方法がある。 Antibodies are useful for detection, treatment, prevention and prevention of influenza viruses. As a method for producing an antibody, there is a method using a bird, in addition to a method using a mammal such as a mouse, rat, rabbit, or goat.
哺乳類と比べ鳥類は大変高い免疫能力を持つことが知られている。これは鳥類が哺乳類とは全く異なった進化の過程を経てきているからといわれている。また鳥類の雌が有する抗体は卵となって体外に排出されるので、抗体の作製にも利用されている。例えば、ニワトリに抗原を接種し、抗原に特異的な抗体をニワトリ体内に形成させる。抗体が形成された後、このニワトリが産卵した卵の全卵、卵黄または卵白より特異的抗体を含有する材料を大量に得る方法が開示されている（特許文献１参照）。 Birds are known to have much higher immunity than mammals. This is said to be because birds have undergone a completely different evolutionary process from mammals. In addition, the antibodies possessed by avian females are excreted out of the body as eggs, so they are also used for the production of antibodies. For example, an antigen is inoculated into a chicken, and an antibody specific for the antigen is formed in the chicken. A method for obtaining a large amount of a material containing a specific antibody from the whole egg, egg yolk or egg white of the egg laid by the chicken after the antibody is formed is disclosed (see Patent Document 1).
この抗原にはインフルエンザウイルスを用いた場合も検討されており、鶏卵から得られた抗体をスプレーで粘膜に噴霧する技術の開示がある（特許文献２参照）。また、鶏卵から得られた抗体を担持するマスクといった技術もある（特許文献３参照）。 The case of using an influenza virus as an antigen has been studied, and there is a disclosure of a technique for spraying antibodies obtained from chicken eggs onto the mucous membrane by spraying (see Patent Document 2). There is also a technique such as a mask that carries antibodies obtained from chicken eggs (see Patent Document 3).
また、鶏卵から得られる抗体を含有する卵黄には、鶏卵特有の色や臭いがあるため、使いづらいという課題に対してニワトリへの飼料からカロチノイドを抜き、鶏卵特有の色や臭いのない白色化卵黄を得る技術の開示もある（特許文献４参照）。
近年、ヒトおよびトリにおいて、インフルエンザの爆発的な流行が懸念されている。インフルエンザウイルスに感染した動物の治療、二次感染の予防、防疫等に用いる手段として、抗体は重要である。したがって、抗インフルエンザウイルス抗体を、大量且つ短期間で製造できるシステムの確立が待望されている。 In recent years, there has been concern about the explosion of influenza in humans and birds. Antibodies are important as a means for treating animals infected with influenza virus, preventing secondary infection, preventing epidemics, and the like. Therefore, establishment of a system capable of producing a large amount of anti-influenza virus antibody in a short time is desired.
抗体の製造方法としては、マウスやウサギに抗原を免疫し、その血清よりポリクローナル抗体を製造する方法が一般的であるが、１個体より得られる抗体の量は少量である。また、マウス等を使用してモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し、これを培養することで抗体を製造する方法もあるが、ハイブリドーマの作成に長期間を要し、さらに大量製造には大規模設備を要する。 As a method for producing an antibody, a method of immunizing a mouse or rabbit with an antigen and producing a polyclonal antibody from the serum thereof is generally used, but the amount of antibody obtained from one individual is small. In addition, there is a method of producing a hybridoma that produces a monoclonal antibody using a mouse or the like and culturing the hybridoma. However, it takes a long time to produce the hybridoma, and it is a large scale for mass production. Requires equipment.
比較的大量に抗体を製造する方法としては、鶏卵を利用する方法がある。しかしながら、鶏卵は１つの卵が小さく、大量に抗体を産生する場合は多くのニワトリを用いる必要がある。ニワトリは個体が違えば免疫力も異なり、産生される抗体もそれぞれ異なる。従って同じ抗原を用いても免疫した個体が異なれば、全くの同一物ではない。それゆえ、得られた抗体は、個体の違いによるロット差が発生してしまうという課題がある。抗体を利用する場合はできるだけ、均一な品質でロット間による違いのないものが望ましい。 As a method for producing an antibody in a relatively large amount, there is a method using chicken eggs. However, chicken eggs are small in size and need to use many chickens if they produce antibodies in large quantities. Different chicks have different immunity and different antibodies are produced. Therefore, even if the same antigen is used, if the immunized individuals are different, they are not exactly the same. Therefore, the obtained antibody has a problem that lot differences due to individual differences occur. When using antibodies, it is desirable that they are as uniform as possible with no difference between lots.
本発明者は鋭意検討の結果、Ｈ１型、Ｈ３型およびＢ型の各型１種以上を含むインフルエンザウイルス由来のＨＡを雌性鳥類、好ましくはダチョウ（Struthio camelus）に免疫し、その卵から抗体を回収することで、インフルエンザウイルスに結合する抗インフルエンザウイルス抗体を大量に且つ比較的短期間に製造する方法を見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies, the inventor immunized female birds, preferably struthio camelus, with HA derived from influenza virus containing at least one of each of H1, H3 and B types, and antibody from the eggs. By recovering, a method for producing a large amount of anti-influenza virus antibody that binds to influenza virus in a relatively short time was found, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は、Ｈ１型、Ｈ３型およびＢ型の各型１種以上を含むインフルエンザウイルス由来のＨＡを同時に雌性鳥類に免疫する工程および該鳥類が産卵した卵の卵黄からＩｇＹを回収する工程を含む、抗インフルエンザウイルス抗体を製造する方法に関する。好ましくは、上記方法において、Ｈ１型がＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）であり、Ｈ３型がＡ／広島／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）であり、およびＢ型がＢ／マレーシア／２５０６／２００４である。好ましくは、上記方法において、鳥類はニワトリまたはダチョウであり、より好ましくは、ダチョウである。 That is, the present invention includes a step of simultaneously immunizing female birds with HA derived from influenza virus containing at least one of each of H1, H3 and B types, and a step of recovering IgY from the egg yolks laid by the birds The present invention relates to a method for producing an anti-influenza virus antibody. Preferably, in the above method, H1 type is A / New Caledonia / 20/99 (H1N1), H3 type is A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2), and B type is B / Malaysia / 2506 / 2004. Preferably, in the above method, the bird is a chicken or an ostrich, more preferably an ostrich.
さらに好ましくは、本発明は、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／広島／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／マレーシア／２５０６／２００４由来のＨＡを同時に雌性ダチョウに免疫する工程および該ダチョウが産卵した卵の卵黄からＩｇＹを回収する工程を含む、抗インフルエンザウイルス抗体を製造する方法に関する。
さらには、本発明は、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／広島／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／マレーシア／２５０６／２００４由来のＨＡを同時に雌性ダチョウに免疫する工程、高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１由来のＨ５蛋白質を追加免疫する工程および該ダチョウが産卵した卵の卵黄からＩｇＹを回収する工程を含む、抗インフルエンザウイルス抗体を製造する方法に関する。
More preferably, the invention comprises simultaneously immunizing female ostriches with HA from A / New Caledonia / 20/99 (H1N1), A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) and B / Malaysia / 2506/2004 and The present invention relates to a method for producing an anti-influenza virus antibody, comprising the step of collecting IgY from the egg yolk of eggs laid by the ostrich.
Furthermore, the present invention provides a process for simultaneously immunizing female ostriches with HA from A / New Caledonia / 20/99 (H1N1), A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) and B / Malaysia / 2506/2004, The present invention relates to a method for producing an anti-influenza virus antibody, comprising a step of boosting with H5 protein derived from pathogenic avian influenza virus H5N1 and a step of recovering IgY from egg yolk laid by the ostrich.
また、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法は、製造された抗体が、インフルエンザウイルスに結合し、好ましくはＡ型インフルエンザウイルスに結合し、より好ましくは高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１由来のＨ５蛋白質に結合する抗体である方法を含む。 In addition, in the method for producing an anti-influenza virus antibody according to the present invention, the produced antibody binds to influenza virus, preferably binds to influenza A virus, more preferably H5 derived from highly pathogenic avian influenza virus H5N1. Including an antibody that binds to a protein.
また、本発明は、インフルエンザウイルス、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／広島／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／マレーシア／２５０６／２００４由来のＨＡを抗原とする、ダチョウ由来のＩｇＹ抗体であって、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５蛋白質に結合するＩｇＹ抗体に関する。 The present invention also relates to an ostrich-derived antigen having HA from influenza virus, A / New Caledonia / 20/99 (H1N1), A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) and B / Malaysia / 2506/2004 as an antigen. The present invention relates to an IgY antibody that binds to an influenza A virus H5 protein.
本発明の別の態様においては、雌性ダチョウを高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１由来のＨ５蛋白質にて免疫する工程、および該ダチョウが産卵した卵の卵黄からＩｇＹを回収する工程を含む、抗インフルエンザウイルス抗体を製造する方法、並びに該方法にて得られるＩｇＹ抗体に関する。本発明のこの態様により、高病原性鳥インフルエンザウイルスを中和しうる抗体を効率よく得ることができる。 In another aspect of the present invention, an anti-influenza virus comprising the steps of immunizing a female ostrich with H5 protein derived from highly pathogenic avian influenza virus H5N1, and recovering IgY from the egg yolk laid by the ostrich The present invention relates to a method for producing an antibody, and an IgY antibody obtained by the method. According to this aspect of the present invention, an antibody capable of neutralizing highly pathogenic avian influenza virus can be efficiently obtained.
さらに、本発明は、上記ダチョウ抗インフルエンザウイルス抗体を含む鳥類抗インフルエンザウイルス抗体を利用した医薬、インフルエンザウイルスを診断、検出する手段（例えば、検出キット）、または防疫する手段（例えば、該抗体を付着させたマスクおよびフィルター）に関する。 Furthermore, the present invention provides a medicine using an avian anti-influenza virus antibody including the ostrich anti-influenza virus antibody, means for diagnosing and detecting influenza virus (for example, a detection kit), or means for preventing epidemic (for example, attaching the antibody) Masks and filters).
本発明に係る抗インフルエンザ抗体の製造方法は、ダチョウを含む鳥類の卵１個から大量の抗体を得ることができる。また、本発明に係る製造方法により製造された抗インフルエンザ抗体は、インフルエンザウイルスに結合することができ、インフルエンザウイルスの検出に有用である。さらに、本発明に係る抗体は、インフルエンザウイルスＨＡに対する抗体であり、ＨＡが宿主細胞へのインフルエンザウイルスの吸着および浸潤に関与することから、中和抗体として利用可能である。 In the method for producing an anti-influenza antibody according to the present invention, a large amount of antibody can be obtained from one egg of birds including ostriches. Moreover, the anti-influenza antibody manufactured by the manufacturing method which concerns on this invention can be couple | bonded with influenza virus, and is useful for the detection of influenza virus. Furthermore, the antibody according to the present invention is an antibody against influenza virus HA, and since HA is involved in the adsorption and invasion of influenza virus to host cells, it can be used as a neutralizing antibody.
（Ａ）本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法
本発明は、少なくとも１種のインフルエンザウイルスのＨＡを同時に雌性鳥類に免疫する工程、該鳥類が産卵した卵の卵黄からＩｇＹを回収する工程を含む抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法を提供する。ここで、鳥類は、好ましくはダチョウである。
(A) Method for producing anti-influenza virus antibody according to the present invention The present invention comprises a step of simultaneously immunizing female birds with HA of at least one influenza virus, and a step of collecting IgY from the egg yolk of the eggs laid by the birds A method for producing an anti-influenza virus antibody is provided. Here, the birds are preferably ostriches.
本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法に使用される免疫抗原は、存在するＡ型およびＢ型のインフルエンザウイルスから選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスが有するＨＡである。 The immunizing antigen used in the method for producing an anti-influenza virus antibody according to the present invention is HA possessed by at least one influenza virus selected from existing influenza A and B influenza viruses.
本明細書で「ＨＡ」とは、インフルエンザウイルスのウイルス表面タンパク質であるヘマグルチニンを意味する。Ａ型インフルエンザウイルスは、ＨＡの抗原性の相違によりＨ１型〜Ｈ１６型までの１６種の亜型に分類され、それぞれは、他の１つのウイルス表面タンパク質であるＮＡ（ノイラミニダーゼ）の抗原性の相違により、Ｎ１型〜Ｎ９型までの９種の亜型に分類される。したがって、Ａ型インフルエンザはＨ１Ｎ１〜Ｈ１６Ｎ９までの１４４通りの亜型に分類される。 As used herein, “HA” means hemagglutinin, a virus surface protein of influenza virus. Influenza A viruses are classified into 16 subtypes ranging from H1 to H16, depending on the antigenicity of HA, each of which has a different antigenicity of NA (neuraminidase), another virus surface protein. Is classified into nine subtypes from N1 type to N9 type. Therefore, influenza A is classified into 144 subtypes from H1N1 to H16N9.
本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法に使用される免疫抗原は、好ましくは、Ｈ１型、Ｈ３型およびＢ型のインフルエンザウイルスから選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスが有するＨＡである。Ｈ１型インフルエンザウイルスとしては、Ｈ１Ｎ１〜Ｈ１Ｎ９のどの亜型でもよく、好ましくは、Ｈ１Ｎ１またはＨ１Ｎ２である。Ｈ３型インフルエンザウイルスとしては、Ｈ３Ｎ１〜Ｈ３Ｎ９のどの亜型でもよく、好ましくはＨ３Ｎ２である。 The immune antigen used in the method for producing an anti-influenza virus antibody according to the present invention is preferably HA possessed by at least one influenza virus selected from H1, H3 and B influenza viruses. The H1 influenza virus may be any subtype of H1N1 to H1N9, preferably H1N1 or H1N2. The H3 influenza virus may be any subtype of H3N1 to H3N9, preferably H3N2.
本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法に使用される免疫抗原は、より好ましくは、Ｈ１型、Ｈ３型およびＢ型の各型１種以上を含むインフルエンザウイルス由来のＨＡである。 More preferably, the immunizing antigen used in the method for producing an anti-influenza virus antibody according to the present invention is an HA derived from an influenza virus including one or more of each of H1, H3 and B types.
国際的に、インフルエンザウイルスは、血清型、宿主名、分離（検出）された場所、分離番号、分離年、血清亜型で特定される。例えば、「Ａ／ｄｕｃｋ／鳥取／５／７７（Ｈ３Ｎ８）」と表記されたインフルエンザウイルスは、
１）血清型が「Ａ」型であり、
２）宿主が「ｄｕｃｋ」（アヒル）であり、
３）分離（検出）地が「鳥取」であり、
４）分離番号が「５」であり、
５）分離年が「７７」、つまり１９７７年であり、
６）ＨＡとＮＡの亜型が、Ｈ３Ｎ８である、
インフルエンザウイルス株であることを意味する。ただし、宿主がヒトの場合は、その表示は省略される（例えば、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））。
Internationally, influenza viruses are identified by serotype, host name, location of isolation (detection), isolation number, isolation year, and serosubtype. For example, an influenza virus written as “A / duck / Tottori / 5/77 (H3N8)”
1) The serotype is “A” type,
2) The host is “duck” (duck),
3) The separation (detection) location is “Tottori”
4) The separation number is “5”,
5) The separation year is “77”, that is, 1977,
6) The subtypes of HA and NA are H3N8,
Means an influenza virus strain. However, when the host is a human, the display is omitted (for example, A / New Caledonia / 20/99 (H1N1)).
本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法に使用される免疫抗原は、いずれのインフルエンザウイルス株由来のＨＡを使用してもよい。例えば、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（北里研究所保存株）、Ａ／Bangkok／１０／８３、Ａ／Yamagata／１２０／８６、Ａ／Osaka ／９３０／８８、Ａ／Suita／１／８９（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）、Ａ／ＰＲ／８／３４〔インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣＶＲ−９５〕、Ａ１／ＦＭ／１／４７〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−９７〕、Ａ／New Jersey／８／７６〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−８９７〕、Ａ／ＮＷＳ／３３〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−２１９〕、Ａ／Weiss ／４３〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−９６〕、Ａ／ＷＳ／３３〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−８２５〕等から選択されるＨ１Ｎ１亜型由来のＨＡを使用してもよい。 As the immunizing antigen used in the method for producing an anti-influenza virus antibody according to the present invention, HA derived from any influenza virus strain may be used. For example, A / New Caledonia / 20/99 (Kitasato Research Institute), A / Bangkok / 10/83, A / Yamagata / 120/86, A / Osaka / 930/88, A / Suita / 1/89 ( As mentioned above, Osaka University Research Institute for Microbial Diseases), A / PR / 8/34 [Influenza (H1N1), ATCC VR-95], A1 / FM / 1/47 [Influenza A (H1N1), ATCC VR-97], A / New Jersey / 8/76 [Influenza A (H1N1), ATCC VR-897], A / NWS / 33 [Influenza A (H1N1), ATCC VR-219], A / Weiss / 43 [Influenza A (H1N1) , ATCC VR-96], A / WS / 33 [influenza A (H1N1), ATCC VR-825], etc. It may be.
また、Ａ／Okuda／５７、Ａ／Adachi／２／５７、Ａ／Kumamoto／1 ／６５、Ａ／Kaizuka ／２／６５、Ａ／Izumi ／５／６５（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）、Ａ２／Japan ／３０５／５７〔インフルエンザＡ（Ｈ２Ｎ２）、ＡＴＣＣ ＶＲ−１００〕等から選択されるＨ２Ｎ２亜型由来のＨＡを使用してもよい。 A / Okuda / 57, A / Adachi / 2/57, A / Kumamoto / 1/65, A / Kaizuka / 2/65, A / Izumi / 5/65 ), A2 / Japan / 305/57 [influenza A (H2N2), ATCC VR-100], etc. may be used.
さらに、Ａ／広島／５２／２００５（北里研究所保存株）、Ａ／Fukuoka ／Ｃ２９／８５、Ａ／Sichuan ／２／８７、Ａ／Ibaraki ／１／９０、Ａ／Suita ／１／９０（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）、Ａ／Port Chalmers ／１／７３〔インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）、ＡＴＣＣ ＶＲ−８１０〕、Ａ２／Aichi ／２／６８〔インフルエンザＡ、ＡＴＣＣ ＶＲ−５４７〕等から選択されるＨ３Ｎ２亜型由来のＨＡを使用してもよい。 In addition, A / Hiroshima / 52/2005 (Kitasato Research Institute), A / Fukuoka / C29 / 85, A / Sichuan / 2/87, A / Ibaraki / 1/90, A / Suita / 1/90 (and above) , Osaka University Research Institute for Microbial Diseases), A / Port Chalmers / 1/73 [Influenza A (H3N2), ATCC VR-810], A2 / Aichi / 2/68 [Influenza A, ATCC VR-547], etc. HA from selected H3N2 subtypes may be used.
また、さらに、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４（北里研究所保存株）、Ｂ／Nagasaki／１／８７（大阪大学微生物病研究所保存株）、Ｂ／Allen ／４５〔インフルエンザＢ、ＡＴＣＣ ＶＲ−１０２〕等から選択されるＢ型インフルエンザウイルス由来のＨＡを使用してもよい。 Furthermore, B / Malaysia / 2506/2004 (Kitasato Research Institute stock), B / Nagasaki / 1/87 (Osaka University Research Institute for Microbial Diseases), B / Allen / 45 [Influenza B, ATCC VR-102 HA derived from influenza B virus selected from the above may be used.
また、その他のインフルエンザウイルス、例えば、Ａ／duck／Czechoslovakia／１／５６（Ｈ４Ｎ６）、Ａ／chiken／Germany “Ｎ”／４９（Ｈ１０Ｎ７）（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）、Ａ／whistling swan／Shimane ／４７６／８３（Ｈ５Ｎ３）、Ａ／whistling swan／Shimane ／３７／８０（Ｈ６Ｎ６）、Ａ／tufted duck ／Shimane ／１２４Ｒ／８０（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／turkey／Ontario ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／turkey／Wisconsin ／６６（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／duck／England ／５６（Ｈ１１Ｎ６）（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）等から選択される株由来のＨＡを使用することも可能である。 In addition, other influenza viruses such as A / duck / Czechoslovakia / 1/56 (H4N6), A / chiken / Germany “N” / 49 (H10N7) (the Osaka University Research Institute for Microbial Diseases), A / whistling swan / Shimane / 476/83 (H5N3), A / whistling swan / Shimane / 37/80 (H6N6), A / tufted duck / Shimane / 124R / 80 (H7N7), A / turkey / Ontario / 6118/68 ( HA derived from strains selected from H8N4), A / turkey / Wisconsin / 66 (H9N2), A / duck / England / 56 (H11N6) (Osaka University Research Institute for Microbial Diseases) Is possible.
さらに好ましくは、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法に使用される免疫抗原は、Ｈ１型、Ｈ３型およびＢ型の各型１種以上を含むインフルエンザウイルス由来のＨＡであり、Ｈ１型としてＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）を、Ｈ３型としてＡ／広島／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）およびＢ型としてＢ／マレーシア／２５０６／２００４由来のＨＡを含むものである。 More preferably, the immunizing antigen used in the method for producing an anti-influenza virus antibody according to the present invention is an HA derived from influenza virus containing at least one of each of H1, H3 and B types, A / New Caledonia / 20/99 (H1N1), A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) as H3 type and HA from B / Malaysia / 2506/2004 as B type.
さらにより好ましくは、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法に使用される免疫抗原は、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／広島／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／マレーシア／２５０６／２００４由来のＨＡである。 Even more preferably, the immunizing antigen used in the method for producing an anti-influenza virus antibody according to the present invention is A / New Caledonia / 20/99 (H1N1), A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) and B / Malaysia. / 2506 / 2004-derived HA.
免疫は本分野で一般的な方法により行われ、例えば、上記免疫抗原を所望により通常のアジュバントと併用して、動物に２〜１４日毎、好ましくは隔週で、静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等で数回、好ましくは２または３回、投与することにより行うことができる。本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法においては、複数免疫抗原を同時に（一度に）免疫してもよいし、順次免疫してもよい。 Immunization is performed by a general method in this field. For example, the above-mentioned immunizing antigen is optionally used in combination with a normal adjuvant, and the animal is intravenously, intradermally, subcutaneously, intraperitoneally every 2 to 14 days, preferably every other week. It can be carried out by administering several times by internal injection or the like, preferably 2 or 3 times. In the method for producing an anti-influenza virus antibody according to the present invention, multiple immunizing antigens may be immunized simultaneously (at once) or sequentially.
また、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法は、免疫後産卵された卵よりＩｇＹ抗体を回収する工程を含み得る。免疫後産卵された卵よりＩｇＹ抗体を回収する工程は、例えば、塩析、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー等の通常の精製手段を用いることができ、例えば、以下の方法を採用できる。
１）卵黄に５倍量のＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．５％ＮａＮ３）と卵黄と１．５倍量の１０％デキストラン硫酸/TBSを加え２０分攪拌する。
２）１ＭＣａＣｌ２／ＴＢＳを卵黄と同量加え攪拌し、１２時間静置する。その後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し上清を回収する。
３）最終濃度４０％になるように硫酸アンモニウムを加え４℃で１２時間静置する。
４）１５０００ｒｐｍで２０分遠心し、沈殿物を回収する。
５）卵黄と同量のＴＢＳに再懸濁し、ＴＢＳにて透析する。
In addition, the method for producing an anti-influenza virus antibody according to the present invention may include a step of collecting IgY antibody from eggs laid after immunization. For the step of recovering IgY antibodies from eggs laid after immunization, for example, usual purification means such as salting out, gel filtration, affinity chromatography, etc. can be used. For example, the following methods can be adopted.
1) Add 5 times amount of TBS (20 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.5% NaN 3 ), egg yolk and 1.5 times amount of 10% dextran sulfate / TBS to egg yolk and stir for 20 minutes.
2) Add 1MCaCl 2 / TBS in the same amount as egg yolk, stir and let stand for 12 hours. Thereafter, the supernatant is recovered by centrifugation at 15000 rpm for 20 minutes.
3) Add ammonium sulfate to a final concentration of 40% and let stand at 4 ° C. for 12 hours.
4) Centrifuge at 15000 rpm for 20 minutes to collect the precipitate.
5) Resuspend in the same amount of TBS as egg yolk and dialyze with TBS.
回収された抗インフルエンザウイルス抗体の精製の程度は、使用目的に応じて適宜設定でき、保存は、いずれの形態でも可能で、例えば、溶液状態または、凍結乾燥状態で保存することができる。 The degree of purification of the recovered anti-influenza virus antibody can be appropriately set according to the purpose of use, and can be stored in any form, for example, stored in a solution state or a lyophilized state.
鳥類としてダチョウを用いる場合、通常上記方法にて、１個の免疫ダチョウ卵より２〜４ｇのＩｇＹを回収することができる。初回免疫からＩｇＹの大量回収までに要した時間は、約４週間である。ウサギを用いて血清からポリクローナル抗体を作製した場合、通常、１個体当たりの免疫グロブリンの回収量は、１０ｍｇ以下であり、免疫から抗体の回収までの期間が２〜３ヶ月であることを考慮すれば、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法は、短期間で大量の抗インフルエンザ抗体を製造できる方法である。 When ostriches are used as birds, 2 to 4 g of IgY can be usually recovered from one immune ostrich egg by the above method. The time required from the first immunization to the mass recovery of IgY is about 4 weeks. When polyclonal antibodies are prepared from serum using rabbits, the amount of immunoglobulin recovered per individual is usually 10 mg or less, and the period from immunization to antibody recovery is 2-3 months. For example, the method for producing an anti-influenza virus antibody according to the present invention is a method capable of producing a large amount of an anti-influenza antibody in a short period of time.
また、ニワトリを免疫し、鶏卵よりＩｇＹを回収する場合、通常、１個の免疫鶏卵から回収されるＩｇＹの量は１００ｍｇ程度であり、免疫から抗体の回収までの期間は１〜２ヶ月である。 When immunizing chickens and collecting IgY from chicken eggs, the amount of IgY collected from one immunized chicken egg is usually about 100 mg, and the period from immunization to antibody collection is 1 to 2 months. .
回収されたＩｇＹ抗体は、インフルエンザウイルスに結合し、より好ましくはＡ型インフルエンザウイルスに結合し、さらに好ましくは、高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１由来のＨ５蛋白質に結合する。ここで、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５蛋白質は、インフルエンザウイルスＨＡの一種である。また、回収されたＩｇＹ抗体は、インフルエンザウイルス、より好ましくはＡ型インフルエンザウイルス、特に高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１による感染を中和する。 The collected IgY antibody binds to influenza virus, more preferably binds to influenza A virus, and more preferably binds to H5 protein derived from highly pathogenic avian influenza virus H5N1. Here, the influenza A virus H5 protein is a kind of influenza virus HA. Further, the collected IgY antibody neutralizes infection by influenza virus, more preferably influenza A virus, particularly highly pathogenic avian influenza virus H5N1.
本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法によれば、抗体を大量に得ることができ、それを診断・検査薬や治療薬として利用できる。一個の卵黄から２〜４ｇのＩｇＹの精製が可能であり、1羽のダチョウから年間４００ｇの抗体を得ることが可能である。つまり1羽で約４０００万人分以上のロット差の少ない診断キットの作製が可能になる。多数のダチョウを使用すれば莫大な量の抗体の生産も可能であり、工業用としての利用価値がある。 According to the method for producing an anti-influenza virus antibody according to the present invention, a large amount of antibody can be obtained, which can be used as a diagnostic / inspection drug or a therapeutic drug. It is possible to purify 2 to 4 g of IgY from one egg yolk, and obtain 400 g of antibody per year from one ostrich. In other words, it is possible to produce a diagnostic kit with a small lot difference of about 40 million people or more. If a large number of ostriches are used, an enormous amount of antibody can be produced, which is useful for industrial use.
回収されたＩｇＹ抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５蛋白質に結合および／またはＨ５型インフルエンザウイルスを中和すれば、ヒトおよびトリで致死率の高いインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１による感染症の治療、予防、診断および防疫に対し極めて有用な手段を提供することができる。 If the recovered IgY antibody binds to influenza A virus H5 protein and / or neutralizes influenza virus H5, treatment, prevention, diagnosis and prevention of infectious diseases caused by influenza virus H5N1 with a high lethality in humans and birds Can provide a very useful means.
（Ｂ）本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体
本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体は、上記（Ａ）で記載された方法により製造できる。したがって、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体は、ダチョウを含む鳥類由来のＩｇＹを含む。また、本発明に係るインフルエンザウイルス抗体は、上記（Ａ）で記載された方法以外の方法、例えば、ダチョウを含む鳥類を免疫し、その血清から抗体を回収する方法によっても製造できる。したがって、本発明に係る抗インフルエンザ抗体は、ＩｇＧ等、ＩｇＹ以外の他のクラスを含み得る。
(B) Anti-influenza virus antibody according to the present invention The anti-influenza virus antibody according to the present invention can be produced by the method described in (A) above. Therefore, the anti-influenza virus antibody according to the present invention contains IgY derived from birds including ostriches. Moreover, the influenza virus antibody which concerns on this invention can be manufactured also by methods other than the method described in said (A), for example, the method of immunizing birds containing an ostrich, and collect | recovering antibodies from the serum. Accordingly, the anti-influenza antibody according to the present invention may include other classes other than IgY, such as IgG.
本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体は、Ｈ１型、Ｈ３型およびＢ型の各型１種以上を含むインフルエンザウイルス由来のＨＡを抗原とする。好ましくは、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体は、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／広島／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／マレーシア／２５０６／２００４由来のＨＡを抗原とする。 The anti-influenza virus antibody according to the present invention uses an influenza virus-derived HA containing at least one of each of H1, H3 and B types as an antigen. Preferably, the anti-influenza virus antibody according to the present invention has A / New Caledonia / 20/99 (H1N1), A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) and B / Malaysia / 2506/2004 as an antigen. .
本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体は、インフルエンザウイルス、好ましくはＡ型インフルエンザウイルスに結合する。より好ましくは、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体は、インフルエンザウイルスＨＡの１種である、高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１由来のＨ５蛋白質に結合する。 The anti-influenza virus antibody according to the present invention binds to an influenza virus, preferably an influenza A virus. More preferably, the anti-influenza virus antibody according to the present invention binds to H5 protein derived from highly pathogenic avian influenza virus H5N1, which is one type of influenza virus HA.
本発明はまた、雌性ダチョウにＡ型インフルエンザウイルスＨ５蛋白質を免疫する工程、および該ダチョウが産卵した卵の卵黄からＩｇＹを回収する工程を含む、抗インフルエンザウイルス抗体を製造する方法を提供する。本発明のこの態様において、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５蛋白質としては高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１由来のＨ５蛋白質が例示される。 The present invention also provides a method for producing an anti-influenza virus antibody, comprising the steps of immunizing a female ostrich with influenza A virus H5 protein and recovering IgY from the egg yolk laid by the ostrich. In this aspect of the present invention, the influenza A virus H5 protein is exemplified by the H5 protein derived from the highly pathogenic avian influenza virus H5N1.
本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体は、インフルエンザウイルスのＨＡを抗原としたものであるから、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体とインフルエンザウイルスとの結合は、インフルエンザウイルス由来のＨＡとの結合を検出することにより確認できる。検出手段としては、従来この分野でよく知られた免疫測定法、例えば、ＥＬＩＳＡ等のエンザイムイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、フローサイトメトリーによる解析、ウエスタンブロッティング法等を採用できる。 Since the anti-influenza virus antibody according to the present invention uses HA of influenza virus as an antigen, the binding between the anti-influenza virus antibody according to the present invention and influenza virus detects the binding with HA derived from influenza virus. Can be confirmed. As detection means, immunoassay methods well known in the art, for example, enzyme immunoassay methods such as ELISA, radioimmunoassay methods, analysis by flow cytometry, Western blotting methods and the like can be adopted.
例えば、ＥＬＩＳＡによる検出は、下記のように行うことができる。
１）ＥＬＩＳＡ用プレートに、いずれかのインフルエンザ由来のＨＡを固定化し、適切な緩衝液で洗浄する。
２）これに予めビオチン化した本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体を添加し、適切な緩衝液で洗浄する。
３）西洋ワサビペルオキシダーゼが結合したアビジンを添加し、適切な緩衝液で洗浄する。
４）西洋ワサビペルオキシダーゼの酵素反応を利用した発色試薬を添加し、発色させる。
上記ＥＬＩＳＡにおいては、発色の有無により、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体とＨＡとの結合の有無を決定できる。
For example, detection by ELISA can be performed as follows.
1) Immobilize any influenza-derived HA on an ELISA plate and wash with an appropriate buffer.
2) An anti-influenza virus antibody according to the present invention that has been biotinylated in advance is added thereto and washed with an appropriate buffer.
3) Add horseradish peroxidase-conjugated avidin and wash with appropriate buffer.
4) Add a coloring reagent using the enzyme reaction of horseradish peroxidase to develop color.
In the ELISA, the presence or absence of binding between the anti-influenza virus antibody according to the present invention and HA can be determined by the presence or absence of color development.
また、本発明に係る抗インフルエンザ抗体がインフルエンザウイルスと結合できれば、インフルエンザウイルスによる赤血球凝集反応および細胞死が阻害されることから、それら阻害を検出することにより、上記結合を確認できる。 In addition, if the anti-influenza antibody according to the present invention can bind to influenza virus, the hemagglutination reaction and cell death caused by influenza virus are inhibited. Therefore, the binding can be confirmed by detecting these inhibitions.
なお、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体は、上記（Ａ）で記載された方法により製造される抗インフルエンザ抗体から、公知の抗体工学技術により作製できるＦａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ、Ｆ（ａｂ’） ２ 等を含む。
In addition, the anti-influenza virus antibody which concerns on this invention is Fab, scFv, sdFv, and F (ab ') 2 which can be produced with the well-known antibody engineering technique from the anti-influenza antibody manufactured by the method described in said (A). Etc.
さらに、本発明に係る抗インフルエンザ抗体は、上記（Ａ）で記載された方法により製造される抗インフルエンザ抗体を修飾して標識物質を結合させた抗体を含む。これら標識物質には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ，アルコール脱水素酵素，リンゴ酸脱水素酵素，ペニシリナーゼ，カタラーゼ，アポグルコースオキシダーゼ，ウレアーゼ，ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート，フィコビリタンパク，希土類金属キレート，ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等の放射性同位体、ビオチン，アビジン若しくはジゴケシゲニン等の化学物質、又は化学発光物質等を挙げることができる。 Furthermore, the anti-influenza antibody according to the present invention includes an antibody obtained by modifying the anti-influenza antibody produced by the method described in (A) above and binding a labeling substance. These labeling substances include, for example, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, malate dehydrogenase, penicillinase, catalase, apoglucose oxidase, urease. , Enzymes such as luciferase or acetylcholinesterase, fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate, phycobiliprotein, rare earth metal chelates, dansyl chloride or tetramethylrhodamine isothiocyanate, radioisotopes such as 125 I, 14 C, 3 H, Examples thereof include chemical substances such as biotin, avidin and digokesigenin, and chemiluminescent substances.
本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体は、インフルエンザウイルスと結合するので、インフルエンザウイルスの検出に有用である。よって、本発明の実施態様の１つは、本発明の抗インフルエンザ抗体を含む、インフルエンザウイルス検出キットである。キットは、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の抗原抗体反応を利用したものであれば、限定されないが、好ましくは、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体を含むＥＬＩＳＡを含むキットである。 Since the anti-influenza virus antibody which concerns on this invention couple | bonds with influenza virus, it is useful for the detection of influenza virus. Thus, one embodiment of the present invention is an influenza virus detection kit comprising the anti-influenza antibody of the present invention. The kit is not limited as long as it utilizes the antigen-antibody reaction of the anti-influenza virus antibody according to the present invention, but is preferably a kit including an ELISA containing the anti-influenza virus antibody according to the present invention.
上記検出キットを用い、ヒトおよびトリを含む動物由来の体液または糞便を直接試験することもできる。また、一度ＭＤＣＫ細胞で動物体液または糞便由来のウイルスを培養し、その培養ウイルス含有液を上記検出キットで試験することも可能である。したがって、キットには、ＭＤＣＫ細胞の培養に必要な試薬、器材が含まれ得る。その他、キットには、キットの操作、検出データの解釈等を記載した指示書も含み得る。 Body fluids or stool derived from animals including humans and birds can also be directly tested using the detection kit. It is also possible to cultivate animal body fluid or fecal virus once in MDCK cells and test the cultured virus-containing solution with the above detection kit. Therefore, the kit can include reagents and equipment necessary for culturing MDCK cells. In addition, the kit may include instructions describing the operation of the kit, interpretation of detection data, and the like.
また、本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体は、単独で、または、インフルエンザウイルス感染、複製、増殖を抑制する薬剤、または、感染による合併症を予防または軽減する薬剤と組み合わせて、インフルエンザ診断用、検査用、処置用または予防用の医薬組成物とすることができる。本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体と組み合わされる薬剤の例には、アマンタジン、リマンチジン、ザナミビル、オセルタミビル、アセトアミノフェノン等を挙げることができるが、これらに限定はされない。本発明に係る医薬組成物は、さらに医薬上許容可能な担体、賦形剤等を含み得る。 In addition, the anti-influenza virus antibody according to the present invention can be used alone or in combination with a drug that suppresses influenza virus infection, replication, or proliferation, or a drug that prevents or reduces complications due to infection. It can be a pharmaceutical composition for use, treatment or prevention. Examples of the drug combined with the anti-influenza virus antibody according to the present invention include amantadine, rimantidine, zanamivir, oseltamivir, acetaminophenone and the like, but are not limited thereto. The pharmaceutical composition according to the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier, excipient and the like.
本発明に係る医薬組成物は、ヒトおよびトリを含む動物に投与される際に、投与経路に応じて各種の薬学的形態とすることができる。好適な投与経路は、例えば、経口、静脈内、経粘膜、皮下、腹腔内、動脈内、筋肉内、脳室内等を含む。 When administered to animals including humans and birds, the pharmaceutical composition according to the present invention can be made into various pharmaceutical forms depending on the administration route. Suitable routes of administration include, for example, oral, intravenous, transmucosal, subcutaneous, intraperitoneal, intraarterial, intramuscular, intraventricular and the like.
より好適には、本発明に係る医薬組成物は、スプレー剤として、鼻腔または咽喉の呼吸気道内に投与される。投与に適したスプレー剤としては、特に制限されないが、エアロゾルとして噴霧する吸入エアロゾル型が好ましい。エアロゾルの形成自体は情報によることができる、粒子の大きさは３〜５０μｍ程度が一般的であるが、１０〜３０μｍ程度とするのが、呼吸気道への沈着効率の点から好ましい。抗体は、通常、蒸留水、生理的食塩水等を用いて溶解するのが一般的である。また、必要に応じ、各種の安定剤を添加することもできる。投与量は、気道に吸着した病原体を中和する量であればよく、例えば、ヒトの場合、外出前に本抗体の量が１〜１０ｍｇ程度となるように投与する。 More preferably, the pharmaceutical composition according to the present invention is administered as a spray into the respiratory tract of the nasal cavity or throat. Although it does not restrict | limit especially as a spray suitable for administration, The inhalation aerosol type sprayed as an aerosol is preferable. The formation of the aerosol itself can be based on information. The particle size is generally about 3 to 50 μm, but about 10 to 30 μm is preferable from the viewpoint of deposition efficiency in the respiratory airway. The antibody is generally dissolved using distilled water, physiological saline or the like. Moreover, various stabilizers can be added as necessary. The dose may be an amount that neutralizes the pathogen adsorbed on the respiratory tract. For example, in the case of humans, the dose is about 1 to 10 mg before going out.
本発明に係る抗インフルエンザ抗体は、また、インフルエンザウイルスの防疫に有用な器材にも適用できる。このような器材は、限定されないが、例えば、本発明に係る抗インフルエンザ抗体を含む、インフルエンザウイルス除去用マスクまたはフィルターがある。 The anti-influenza antibody according to the present invention can also be applied to equipment useful for prevention of influenza virus. Such equipment includes, but is not limited to, an influenza virus removal mask or filter containing, for example, an anti-influenza antibody according to the present invention.
本発明に係る抗インフルエンザ抗体を含むインフルエンザウイルス除去用マスクは、従来知られている方法により製造できる。 The influenza virus removal mask containing the anti-influenza antibody according to the present invention can be produced by a conventionally known method.
インフルエンザウイルス除去用マスクは、抗インフルエンザウイルス抗体とそれを担持する担体を含む。担体は、該抗体の活性が発揮されるものであればよく、例えば、綿、絹、ウール、レーヨン等の繊維を挙げることができる。これらは、織布、不織布などの形態で担体を構成することができる。 The influenza virus removal mask includes an anti-influenza virus antibody and a carrier carrying the antibody. The carrier only needs to exhibit the activity of the antibody, and examples thereof include fibers such as cotton, silk, wool, and rayon. These can constitute the carrier in the form of a woven fabric, a nonwoven fabric or the like.
担体に抗体を固定する方法としては、担体をγ-アミノプロピルトリエトキシシランなどを用いてシラン化した後、グルタールアルデヒドなどで担体表面にアルデヒド基を導入し、アルデヒド基と抗体とを共有結合させる方法、未処理の担体を抗体の水溶液中に浸漬してイオン結合により抗体を担体に固定する方法、特定の官能基を有する担体にアルデヒド基を導入し、アルデヒド基と抗体とを共有結合させる方法、特定の官能基を有する担体に抗体をイオン結合させる方法、特定の官能基を有するポリマーで担体をコーティングしたのちにアルデヒド基を導入し、アルデヒド基と抗体とを共有結合させる方法を挙げることができる。ここで、上記の特定の官能基としては、ＮＨＲ基(ＲはＨ以外のメチル、エチル、プロピル、ブチルのうちいずれかのアルキル基)、ＮＨ2基、Ｃ6Ｈ5ＮＨ2基、ＣＨＯ基、ＣＯＯＨ基、ＯＨ基を挙げることができる。 As a method of immobilizing the antibody on the carrier, the carrier is silanized using γ-aminopropyltriethoxysilane, etc., and then an aldehyde group is introduced onto the carrier surface with glutaraldehyde or the like, and the aldehyde group and the antibody are covalently bonded. A method in which an untreated carrier is immersed in an aqueous solution of an antibody and the antibody is fixed to the carrier by ionic bonding, an aldehyde group is introduced into a carrier having a specific functional group, and the aldehyde group and the antibody are covalently bonded. A method, a method of ion-binding an antibody to a carrier having a specific functional group, and a method of covalently bonding an aldehyde group and an antibody by introducing an aldehyde group after coating the carrier with a polymer having a specific functional group Can do. Here, as the specific functional group, NHR group (R is any alkyl group other than H, methyl, ethyl, propyl, butyl), NH 2 group, C 6 H 5 NH 2 group, CHO group , COOH group, and OH group.
また、担体表面の官能基を、ＢＭＰＡ(N-β-Maleimidopropionic acid)などを用いて他の官能基に変換した後、その官能基と抗体とを共有結合させる方法もある（ＢＭＰＡではＳＨ基がＣＯＯＨ基に変換される）。 There is also a method in which the functional group on the surface of the carrier is converted into another functional group using BMPA (N-β-Maleimidopropionic acid) and the like, and then the functional group and the antibody are covalently bonded (in SH, the SH group has a SH group. Converted to COOH groups).
さらに、抗体のＦｃ（12b)の部分に選択的に結合する分子（Ｆｃレセプター、プロテインＡ／Ｇなど）を担体表面に導入し、それに抗体のＦｃ（12b)を結合させる方法もある。この場合、インフルエンザウイルスを捕捉するＦａｂ(12a)が担体に対して外向きとなり、Ｆａｂ(12a)へのインフルエンザウイルスの接触確率が高くなるので、効率よくインフルエンザウイルスを捕捉することができる。 Further, there is a method in which a molecule (Fc receptor, protein A / G, etc.) that selectively binds to the Fc (12b) portion of the antibody is introduced onto the surface of the carrier and the antibody Fc (12b) is bound thereto. In this case, since the Fab (12a) that captures the influenza virus faces outward with respect to the carrier and the probability of contact of the influenza virus with the Fab (12a) increases, the influenza virus can be efficiently captured.
抗体は、リンカーを介して担体に担持されていてもよい。この場合、担体上での抗体の自由度が高くなり、インフルエンザウイルスへの接近が容易となるので、高い除去性能を得ることができる。リンカーとしては、二価以上ののクロスリンク試薬を挙げることができ、具体的には、マレイミド、ＮＨＳ(N-Hydroxysuccinimidyl)エステル、イミドエステル、ＥＤＣ(1-Etyl-3-[3-dimetylaminopropyl]carbodiimido)、ＰＭＰＩ(N-[p-Maleimidophenyl]isocyanete)があり、標的官能基（ＳＨ基、ＮＨ2基、ＣＯＯＨ基、ＯＨ基）に選択的なものと非選択的なものとがある。また、クロスリンク間の距離（スペーサーアーム）もクロスリンク試薬ごとに異なっており、目的の抗体に応じて０．１ｎｍ〜３．５ｎｍ程度の範囲で選択することができる。インフルエンザウイルスを効率的に捕捉するという観点からは、リンカーとして抗体のＦｃ（12b)に結合するものが好ましい。 The antibody may be supported on a carrier via a linker. In this case, the degree of freedom of the antibody on the carrier is increased and access to the influenza virus is facilitated, so that high removal performance can be obtained. Examples of the linker include bi- or higher-valent cross-linking reagents. Specifically, maleimide, NHS (N-Hydroxysuccinimidyl) ester, imide ester, EDC (1-Etyl-3- [3-dimetylaminopropyl] carbodiimido ) And PMPI (N- [p-Maleimidophenyl] isocyanete), which are selective and non-selective for target functional groups (SH group, NH 2 group, COOH group, OH group). Further, the distance between the crosslinks (spacer arm) also differs for each crosslink reagent, and can be selected in the range of about 0.1 nm to 3.5 nm depending on the target antibody. From the viewpoint of efficiently capturing influenza virus, those that bind to the Fc (12b) of the antibody as a linker are preferred.
リンカーを導入する方法としては、抗体にリンカーを結合させておき、それをさらに担体に結合させる方法、担体にリンカーを結合させておき、担体上のリンカーに抗体を結合させる方法のいずれも可能である。 As a method for introducing a linker, either a method in which a linker is bound to an antibody and then further bound to a carrier, or a method in which a linker is bound to a carrier and an antibody is bound to the linker on the carrier is possible. is there.
担体には、抗体の活性度を検知して、それが所定の活性度よりも低くなったときに信号を呈するインジケータが担持されていてもよい。そのようなインジケータが担持されていれば、インフルエンザウイルス除去用マスクの使用の可否や交換の要否を知ることができる。特に、インジケータが抗体の活性度が所定の活性度よりも低くなったときに色調変化するものであれば、一目でその判断をすることができる。そのようなインジケータとしては、例えば、ｐＨ、温度上昇、力学的ストレス等の作用により色調変化を生じるポリジアセチレン膜を挙げることができる。 The carrier may carry an indicator that detects the activity of the antibody and gives a signal when it becomes lower than a predetermined activity. If such an indicator is carried, it is possible to know whether or not the influenza virus removal mask can be used and whether or not replacement is necessary. In particular, if the indicator changes color when the activity of the antibody is lower than a predetermined activity, the determination can be made at a glance. As such an indicator, for example, a polydiacetylene film that causes a change in color tone by the action of pH, temperature increase, mechanical stress and the like can be mentioned.
また、本発明に係る抗インフルエンザ抗体を含む、インフルエンザウイルス除去用フィルターは、従来知られている方法により製造できる。 Moreover, the filter for influenza virus removal containing the anti-influenza antibody which concerns on this invention can be manufactured by a conventionally known method.
インフルエンザウイルス除去用フィルターは、抗インフルエンザウイルス抗体とそれを担持する担体を含む。担体は、該抗体の活性が発揮されるものであればよく、例えば、テレフタル酸、イソフタル酸、エチレングリコール、ジエチレングリコールを含有する非晶性共重合ポリエステル成分とポリアルキレンテレフタレート系ポリエステル成分の複合繊維である。 The influenza virus removal filter includes an anti-influenza virus antibody and a carrier carrying the antibody. The carrier only needs to exhibit the activity of the antibody. For example, the carrier is a composite fiber of an amorphous copolymer polyester component containing terephthalic acid, isophthalic acid, ethylene glycol, diethylene glycol and a polyalkylene terephthalate-based polyester component. is there.
かかる担体への抗体の結合は、いずれの方法によってもよいが、例えば、抗体を含む溶液に当該複合繊維を含浸させることにより達成される。 The antibody may be bound to such a carrier by any method, for example, by impregnating the conjugate fiber in a solution containing the antibody.
（Ｃ）本発明に係るインフルエンザワクチン
本発明に係る抗インフルエンザ抗体の抗原を含む組成物は、ヒトおよびトリを含む動物用のインフルエンザワクチンとして利用できる。
(C) Influenza vaccine according to the present invention The composition containing the antigen of the anti-influenza antibody according to the present invention can be used as an influenza vaccine for animals including humans and birds.
本発明に係るインフルエンザワクチンは、存在するＡ型およびＢ型のインフルエンザウイルスから選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスが有するＨＡを含む。好ましくは、本発明に係るインフルエンザワクチンは、Ｈ１型、Ｈ３型およびＢ型のインフルエンザウイルスから選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスが有するＨＡを含む。より好ましくは、本発明に係るインフルエンザワクチンは、Ｈ１型、Ｈ３型およびＢ型の各型１種以上を含むインフルエンザウイルス由来のＨＡを含む。さらに好ましくは、本発明に係るインフルエンザワクチンは、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／広島／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／マレーシア／２５０６／２００４由来のＨＡを含む。 The influenza vaccine which concerns on this invention contains HA which the at least 1 influenza virus selected from the influenza virus of A type and B which exists exists. Preferably, the influenza vaccine according to the present invention comprises HA possessed by at least one influenza virus selected from H1, H3 and B influenza viruses. More preferably, the influenza vaccine according to the present invention comprises HA derived from influenza virus containing at least one of each of H1, H3 and B types. More preferably, the influenza vaccine according to the present invention comprises HA from A / New Caledonia / 20/99 (H1N1), A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) and B / Malaysia / 2506/2004.
本発明に係るインフルエンザワクチンは、さらに、例えば、サポニン、水酸化アルミニウム等の慣用されるアジュバントを含み得る。
本発明に係るインフルエンザワクチンは、従来より知られている方法により、製造され、ヒトおよびトリを含む動物に投与でき、インフルエンザウイルスの感染を予防する。
The influenza vaccine according to the present invention may further contain a conventional adjuvant such as saponin and aluminum hydroxide.
The influenza vaccine according to the present invention is manufactured by a conventionally known method, can be administered to animals including humans and birds, and prevents influenza virus infection.
本発明に係る抗インフルエンザウイルス抗体の製造方法は、インフルエンザウイルスに結合する抗体を大量に、且つ比較的短期間で製造するものである。製造された抗インフルエンザウイルス抗体は、インフルエンザの診断、検査に使用できる検出キットだけでなく、マスク、フィルター等の防疫用の器材にも利用でき、インフルエンザウイルスによる被害の阻止に有用である。 The method for producing an anti-influenza virus antibody according to the present invention produces a large amount of antibodies that bind to influenza virus in a relatively short period of time. The produced anti-influenza virus antibody can be used not only for detection kits that can be used for diagnosing and testing influenza, but also for prevention equipment such as masks and filters, and is useful for preventing damage caused by influenza viruses.
以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１
ダチョウ抗インフルエンザ抗体の作成１
本実施例では、ヒト（あるいはニワトリ）のインフルエンザ感染の診断薬として使われている抗インフルエンザウイルスに対する抗体をダチョウの卵黄にて生産した。市販のインフルエンザウイルスＨＡ抗原（hemaggretinin）ワクチン（北里研究所製）０．５ｍｌを産卵ダチョウに隔週免疫し、初回免疫より３または４週目の卵黄を採取した。卵黄の精製は以下のように行った。
Example 1
Creation of ostrich
In this example, an antibody against an anti-influenza virus used as a diagnostic agent for influenza infection in humans (or chickens) was produced in ostrich egg yolk. Laminated ostriches were immunized every other week with 0.5 ml of commercially available influenza virus HA antigen (hemaggretinin) vaccine (Kitasato Institute), and egg yolks at 3 or 4 weeks were collected from the first immunization. Purification of egg yolk was performed as follows.
まず、卵黄に5倍量のＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．５％ＮａＮ３）と同量の１０％デキストラン硫酸/TBSを加え２０分攪拌する。 First, 5 times the amount of TBS (20 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.5% NaN 3 ) and the same amount of 10% dextran sulfate / TBS are added to egg yolk and stirred for 20 minutes.
そして１ＭＣａＣｌ２／ＴＢＳを卵黄と同量加え攪拌し、１２時間静置する。その後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し上清を回収する。 Then, 1MCaCl 2 / TBS is added in the same amount as egg yolk, stirred and allowed to stand for 12 hours. Thereafter, the supernatant is recovered by centrifugation at 15000 rpm for 20 minutes.
次に、最終濃度４０％になるように硫酸アンモニウムを加え４℃で１２時間静置する。その後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し、沈殿物を回収する。最後に、卵黄と同量のＴＢＳに再懸濁し、ＴＢＳにて透析する。 Next, ammonium sulfate is added to a final concentration of 40%, and the mixture is allowed to stand at 4 ° C. for 12 hours. Then, it centrifuges at 15000 rpm for 20 minutes, and collects the precipitate. Finally, it is resuspended in the same amount of TBS as egg yolk and dialyzed with TBS.
この課程により９０％以上の純度のＩｇＹの回収が可能となった。１個の卵黄より２〜４ｇのＩｇＹを精製することができた。 This process enabled the recovery of 90% or higher purity IgY. 2 to 4 g of IgY could be purified from one egg yolk.
図１は、インフルエンザＨＡ抗原免疫前と免疫後のダチョウ（免疫３週目）（３羽）の卵黄抽出液について、寒天ゲル内沈降反応を用いて抗体の存在を検討したものである。写真中央（１）に抗原として用いたインフルエンザウイルスＨＡ抗原を添加し、写真２−４に、免疫前のダチョウ各個体由来の卵黄抽出液（ＩｇＹ含有）を添加し、写真５−７に、免疫後３週目のダチョウ各個体由来の卵黄抽出液（ＩｇＹ含有）を添加した。どのダチョウ個体由来の卵黄抽出液も、免疫前のものには反応が認められないが、免疫後３週目のものには抗原との沈降線が認められる。
FIG. 1 shows the presence of antibodies in an egg yolk extract of ostrich (3 weeks after immunization) (3 chicks) before and after immunization with influenza HA antigen, using agar gel precipitation reaction. The influenza virus HA antigen used as an antigen was added to the center (1) of the photograph, the yolk extract (containing IgY) from each ostrich individual before immunization was added to the photograph 2-4, and the immune Egg yolk extract (containing IgY) from each
よって、ＨＡ抗原免疫前のダチョウ卵黄には抗体は存在しないが、免疫後のダチョウ卵黄すべてには抗体の存在が確認できた。免疫後４週目のダチョウ全個体由来の卵黄抽出液にも、同様にＨＡ抗原反応性の抗体の存在が確認できた。
Therefore, the antibody was not present in the ostrich yolk before immunization with the HA antigen, but the presence of the antibody was confirmed in all the ostrich yolk after the immunization. In the yolk extract derived from all
1羽のダチョウメスから4月から９月までの産卵期に約１００個の卵が得られることより、最大約４００ｇの抗体（ＩｇＹ）が得られることになる。つまり、６ヶ月で１羽のダチョウから約４００〜４０００万検体分のインフルエンザ診断検査キット等に適応可能な抗体量が回収可能となる。 Since about 100 eggs are obtained from one ostrich female during the spawning season from April to September, a maximum of about 400 g of antibody (IgY) can be obtained. That is, the amount of antibody applicable to about 4 to 40 million samples of influenza diagnostic test kits can be collected from one ostrich in 6 months.
また、マスクやエアコンフィルターに適応すればインフルエンザウイルス除去用の工業用抗体としても応用可能である。ダチョウ卵黄は臭気が少ないので、マスクに適応させても不快感が少ない。 Moreover, if it is adapted to a mask or an air conditioner filter, it can be applied as an industrial antibody for removing influenza virus. Ostrich egg yolk has little odor, so there is little discomfort even when applied to a mask.
実施例２
ダチョウ抗インフルエンザ抗体の作成２
１．ダチョウへの免疫
産卵中の雌性ダチョウに３種のＨＡ（Ａ/ニューカレドニア・20/99(H1N1)由来ＨＡ 30μｇ Ａ/広島/52/2005(H3N2)由来ＨＡ 30μｇ B/マレーシア/2506/2004由来ＨＡ 30μｇ）の混合液を隔週免疫した。初回はフロントの完全アジュバント、2回目以降はフロントの不完全アジュバントを用いた。
免疫前、および免疫後に産卵された卵より卵黄を回収し、上記実施例１と同様の方法によりＩｇＹを精製した。
Example 2
Preparation of ostrich
1. Immunity to ostrich Three types of HA (A / New Caledonia 20/99 (H1N1) -derived HA 30 μg A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) -derived HA 30 μg B / Malaysia / 2506/2004 HA 30 μg) was immunized every other week. For the first time, the front complete adjuvant was used, and for the second and subsequent times, the front incomplete adjuvant was used.
Egg yolk was collected from eggs laid before and after immunization, and IgY was purified by the same method as in Example 1 above.
また、他の産卵中の雌性ダチョウに、上記と同様に３種のＨＡの混合液を免疫し、４週目より５０μｇのＨ５Ｎ１ベトナム株由来Ｈ５リコンビナント抗原（市販品：プロテインサイエンス社）を隔週追加免疫した。 Also immunize other spawning female ostriches with a mixture of 3 types of HA in the same manner as above, and add 50 μg of H5 recombinant antigen from H5N1 Vietnam strain (commercial product: Protein Science) every 4 weeks. I was immunized.
２．ニワトリへの免疫
ダチョウの抗原量の３０分の１量を、上記と同様の方法で免疫し（ただし、アジュバントも３０分の１量）、抗体を精製した。
2. Immunization to chickens One-third of the ostrich antigen was immunized in the same manner as described above (however, the adjuvant was also one-third the amount), and the antibody was purified.
３．ＥＬＩＳＡ法による測定
以下のＥＬＩＳＡにより、得られた抗体の抗原反応性を測定した。
２μg/mLのＨＡ抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの各wellに１００μl入れ、室温で２時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄したのち、市販のブロッキング溶液（ブロックエース：大日本住友製薬）を各wellに１００μl入れ２時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄したのち、免疫前および免疫後（１〜８週）のダチョウの卵黄より抽出したＩｇＹ抗体の段階希釈液（５μg /mLを原液として１００倍、２００倍〜と２倍段階希釈）を各well に５０μl入れ室温で１時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄したのちペルオキシダーゼ標識抗ダチョウＩｇＹ・ウサギポリクローナル抗体（自作）を各wellに１００μl入れ４５分間放置した。ＰＢＳで３回洗浄したのち市販のペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト）により３０分間発色し、ＥＬＩＳＡ用プレートリーダーにより吸光度（４５０nm）を測定した。
得られた結果を、免疫前のＩｇＹの吸光度値の２倍以上となる最高希釈倍率で示した。
ニワトリより得られた抗体についても、同様のＥＬＩＳＡにより、抗原反応性を測定した。
3. Measurement by ELISA method The antigen reactivity of the obtained antibody was measured by the following ELISA.
100 μl of 2 μg / mL HA antigen was added to each well of a 96-well microplate for ELISA and allowed to stand at room temperature for 2 hours. Thereafter, after washing 3 times with PBS, 100 μl of a commercially available blocking solution (Block Ace: Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) was added to each well and left for 2 hours. After washing with PBS three times, serial dilutions of IgY antibody extracted from ostrich egg yolk before and after immunization (1 to 8 weeks) (100 μm, 200 × to 2 × with 5 μg / mL as the stock solution) 50 μl was added to each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Then, after washing 3 times with PBS, 100 μl of peroxidase-labeled anti-ostrich IgY rabbit polyclonal antibody (self-made) was placed in each well and left for 45 minutes. After washing 3 times with PBS, color was developed for 30 minutes with a commercially available color kit for peroxidase (Sumitomo Bakelite), and the absorbance (450 nm) was measured with an ELISA plate reader.
The obtained result was shown by the highest dilution ratio which becomes 2 times or more of the light absorbency value of IgY before immunization.
The antigen reactivity of the antibody obtained from the chicken was also measured by the same ELISA.
４．中和試験
ダチョウＩｇＹ抗体またはニワトリＩｇＹ抗体（各希釈倍率）と高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１（１０４．３ＥＩＤ５０）を ３０分間反応させ、１０日齢の発育鶏卵に接種した。その後、３６℃で発育鶏卵を３日間孵卵し、胚子の死亡が抑制された抗体の最高希釈倍率を示した。
4). Neutralization test Ostrich IgY antibody or chicken IgY antibody (each dilution factor) and highly pathogenic avian influenza virus H5N1 ( 104.3 EID 50 ) were reacted for 30 minutes and inoculated into 10-day-old embryonated chicken eggs. Thereafter, the embryonated chicken eggs were incubated at 36 ° C. for 3 days, and the highest dilution ratio of the antibody in which the death of the embryo was suppressed was shown.
５．得られた抗体の特性
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析
ダチョウに３種のＨＡ混合抗原（Ａ/ニューカレドニア・20/99(H1N1)由来ＨＡ 30μｇ Ａ/広島/52/2005(H3N2)由来ＨＡ 30μｇ B/マレーシア/2506/2004由来ＨＡ 30μｇ）を免疫し、免疫開始後８週目のＩｇＹにつきＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施した。
精製したＩｇＹ液を８．５％ＳＤＳ―ＰＡＧＥし、ゲルをＣＢＢ染色したところ、得られたＩｇＹ（インフルエンザＨＡを免疫してえられたＩｇＹ）は重鎖が８０ｋＤａおよび軽鎖が３０ｋＤａであった（図２）。
5. Characteristics of the obtained antibody (1) Analysis by SDS-PAGE Three kinds of HA mixed antigens (A / New Caledonia 20/99 (H1N1) -derived HA 30 μg A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) -derived HA 30 μg B / Malaysia / 2506 / 2004-derived HA (30 μg) was immunized, and SDS-PAGE electrophoresis was performed on
The purified IgY solution was subjected to 8.5% SDS-PAGE and the gel was stained with CBB. As a result, the obtained IgY (IgY obtained by immunization with influenza HA) had a heavy chain of 80 kDa and a light chain of 30 kDa. (FIG. 2).
（２）３種のＨＡ混合抗原に対する、ダチョウＩｇＹ抗体価の経時変化（5羽の平均）
３種のＨＡ（Ａ/ニューカレドニア・20/99(H1N1)由来ＨＡ 30μｇ Ａ/広島/52/2005(H3N2)由来ＨＡ 30μｇ B/マレーシア/2506/2004由来ＨＡ 30μｇ）の混合液を雌性ダチョウまたはメスニワトリに隔週免疫し、産卵された卵よりＩｇＹを精製し、ＥＬＩＳＡによりＥＬＩＳＡプレートに固相化した上記３種のＨＡ混合抗原との反応性を検討した。
ダチョウについては、免疫２週目より抗体価の上昇が認められ、３週以降で最高値を維持した（図３）。ニワトリについては、免疫３週目より抗体価の上昇が認められた（図４）。ダチョウは、ニワトリより早期に抗体価の上昇が認められた。
(2) Time course of ostrich IgY antibody titer against 3 types of HA mixed antigens (average of 5 birds)
A mixture of 3 types of HA (A / New Caledonia 20/99 (H1N1) -derived HA 30 μg A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) -derived HA 30 μg B / Malaysia / 2506 / 2004-derived HA 30 μg) The hen was immunized every other week, IgY was purified from the laid eggs, and the reactivity with the above-mentioned 3 types of HA mixed antigens immobilized on an ELISA plate was examined by ELISA.
As for ostriches, the antibody titer increased from the 2nd week of immunization, and the maximum value was maintained after 3 weeks (FIG. 3). In chickens, the antibody titer increased from the third week of immunization (FIG. 4). The ostrich showed an increase in antibody titer earlier than the chicken.
（３）３種のＨＡ抗原のそれぞれに対する、ダチョウＩｇＹ抗体価の経時変化（5羽の平均）
３種のＨＡ（Ａ/ニューカレドニア・20/99(H1N1)由来ＨＡ 30μｇ Ａ/広島/52/2005(H3N2)由来ＨＡ 30μｇ B/マレーシア/2506/2004由来ＨＡ 30μｇ）の混合液を雌性ダチョウに隔週免疫し、産卵された卵よりＩｇＹを精製し、固相化した各ＨＡ抗原（Ｈ１Ｎ１型インフルエンザウイルス由来ＨＡ、Ｈ３Ｎ２型インフルエンザウイルス由来ＨＡ、またはＢ型インフルエンザウイルス由来ＨＡ）に対する反応性を検討した。
すべてのＨＡ抗原に対して、免疫２週目より抗体価の上昇が認められ、４週以降でほぼ最高値に達しその後もわずかに増加した（図５、６および７）。つまり、３種のＨＡの混合液を注射することによりそれぞれの抗原に対する抗体が産生されている。
(3) Time course of ostrich IgY antibody titer against each of the three HA antigens (average of 5 birds)
A mixture of 3 types of HA (A / New Caledonia 20/99 (H1N1) -derived HA 30 μg A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) -derived HA 30 μg B / Malaysia / 2506 / 2004-derived HA 30 μg) IgY was purified from laying eggs immunized every other week, and the reactivity to each immobilized HA antigen (HA derived from H1N1 influenza virus, HA derived from H3N2 influenza virus, or HA derived from influenza B virus) was examined. .
For all HA antigens, the antibody titer increased from the second week of immunization, reached almost the highest value after 4 weeks, and increased slightly thereafter (FIGS. 5, 6 and 7). That is, the antibody with respect to each antigen is produced by injecting the liquid mixture of 3 types of HA.
（４）高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１由来Ｈ５リコンビナント蛋白質に対するＩｇＹ抗体価（ＥＬＩＳＡにより測定）（各5羽の平均）
３種のＨＡ（Ａ/ニューカレドニア・20/99(H1N1)由来ＨＡ 30μｇ Ａ/広島/52/2005(H3N2)由来ＨＡ 30μｇ B/マレーシア/2506/2004由来ＨＡ 30μｇ）の混合液をメスのダチョウ１０羽およびニワトリ５羽に隔週毎に免疫した。なお、初回免疫より４，６週目に５羽のダチョウにはＨ５リコンビナント蛋白質を追加で免疫した。
上記３種のＨＡの免疫により、Ｈ５型インフルエンザウイルス（高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１）が有するＨＡであるＨ５蛋白質にも反応するダチョウＩｇＹが産生されていた。ニワトリと比べても著しく抗体価が高かった（４週目以降はニワトリＩｇＹと比べて有意差あり（＊）（student-t検定、P<0.01）（図８）。また、Ｈ５リコンビナント蛋白質の追加免疫によりさらにＨ５蛋白質に対する抗体価が増強した（５週目以降、３種のＨＡ免疫のみのダチョウとくらべて有意差あり（＃）（student-t検定、P<0.01））（図８）。
高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１由来のＨ５蛋白質に反応性のあるダチョウ抗体は、免疫後４〜５週の間に急激に産生される。Ｈ１Ｎ１型、Ｈ３Ｎ２型またはＢ型インフルエンザウイルスに由来するＨＡに反応性のあるダチョウ抗体が免疫後３週目までに急激に産生されること（図５、６および７）から、Ｈ５蛋白質に反応性のあるダチョウ抗体は、免疫後３週目までに産生されるＨ１Ｎ１型、Ｈ３Ｎ２型またはＢ型インフルエンザウイルスに由来するＨＡに反応性のあるダチョウ抗体と異なる分子である。また、免疫後４週目、５週目または４〜５週目の間に得られるダチョウ抗体は、抗原とした３種のＨＡよりもＨ５蛋白質に反応性が高かった（図５、６、７および８）。
また、初回免疫より４，６週目に５羽のダチョウにＨ５リコンビナント蛋白質を追加免疫したところ、Ｈ５蛋白質に対する抗体価の更なる上昇が認められたことから、このような追加免疫が、ダチョウ抗Ｈ５蛋白質抗体の製造に有効であることが確認できた。とりわけ、Ｈ５リコンビナント蛋白質が、高価であり、入手量が限られることを考慮すれば、３種のＨＡ（Ｈ１Ｎ１型、Ｈ３Ｎ２型およびＢ型インフルエンザウイルス由来ＨＡ）免疫後、４、６週でＨ５リコンビナント蛋白質をダチョウに追加免疫する方法は、ダチョウ抗Ｈ５蛋白質抗体の製造法として有用である。また、製造されたダチョウ抗Ｈ５蛋白質抗体は、Ｈ５蛋白質を有する高病原性鳥インフルエンザウイルスの検出に有用である。
(4) IgY antibody titer against highly pathogenic avian influenza virus H5N1-derived H5 recombinant protein (measured by ELISA) (average of 5 each)
A mixture of 3 types of HA (A / New Caledonia, 20/99 (H1N1) -derived HA 30 μg A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) -derived HA 30 μg B / Malaysia / 2506 / 2004-derived HA 30 μg) Ten birds and five chickens were immunized every other week. In addition, 5 ostriches were additionally immunized with H5 recombinant protein at 4 and 6 weeks after the initial immunization.
Due to the immunization with the above three types of HA, ostrich IgY that reacts with the H5 protein, which is the HA of the H5 influenza virus (highly pathogenic avian influenza virus H5N1), was produced. The antibody titer was also significantly higher than that of the chicken (after 4 weeks, there was a significant difference compared to the chicken IgY (*) (student-t test, P <0.01) (Fig. 8), and addition of H5 recombinant protein. The antibody titer against H5 protein was further enhanced by immunization (after 5 weeks, there was a significant difference compared with ostriches with only 3 types of HA immunization (#) (student-t test, P <0.01)) (FIG. 8).
Ostrich antibodies reactive to H5 protein from highly pathogenic avian influenza virus H5N1 are rapidly produced between 4 and 5 weeks after immunization. Reactive to H5 protein because ostrich antibody reactive to HA derived from H1N1, H3N2 or B influenza virus is rapidly produced by 3 weeks after immunization (FIGS. 5, 6 and 7) The ostrich antibody is a molecule different from the ostrich antibody reactive to HA derived from H1N1, H3N2 or B influenza virus produced by the third week after immunization. In addition, the ostrich antibody obtained during the 4th, 5th, or 4th to 5th weeks after immunization was more reactive to the H5 protein than the three types of HA used as antigens (FIGS. 5, 6, and 7). And 8).
In addition, when 5 ostriches were boosted 4 weeks and 6 weeks after the first immunization with H5 recombinant protein, the antibody titer against H5 protein was further increased. It was confirmed to be effective for the production of H5 protein antibody. In particular, considering that H5 recombinant proteins are expensive and limited in availability, H5 recombinants are immunized 4 to 6 weeks after immunization with 3 types of HA (HA derived from H1N1, H3N2 and B influenza viruses). The method of boosting ostrich with protein is useful as a method for producing ostrich anti-H5 protein antibody. Further, the produced ostrich anti-H5 protein antibody is useful for detection of highly pathogenic avian influenza virus having H5 protein.
（５）高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１の不活化効果（中和試験）（各5羽）
３種のＨＡ（Ａ/ニューカレドニア・20/99(H1N1)由来ＨＡ 30μｇ Ａ/広島/52/2005(H3N2)由来ＨＡ 30μｇ B/マレーシア/2506/2004由来ＨＡ 30μｇ）の混合液をメスのダチョウ１０羽およびニワトリ５羽に隔週毎に免疫した。なお、初回免疫より４，６週目に５羽のダチョウにはＨ５リコンビナント蛋白を追加で免疫した。
３種のＨＡの免疫後の卵黄から精製したＩｇＹは、Ｈ５Ｎ１ウイルスの不活化作用（中和活性）を持っており、4週目以降でその中和活性化が著しく増強された。同週のニワトリＩｇＧと比べても著しく抗体価が高かった（４週目以降はニワトリＩｇＹと比べて有意差あり（＊）（student-t検定、P<0.01）。また、Ｈ５リコンビナント蛋白の追加免疫によりさらにＨ５Ｎ１にたいする中和活性価が増強した（５週目以降、３種のみのダチョウとくらべて有意差あり（＃）（student-t検定、P<0.01））。
高病原性鳥インフルエンザウイルスは、非常に致死率が高く、またヒトへの感染も報告されており、近年その爆発的な流行が懸念されている。上記実施例に記載した製造方法で得られた抗体は、上記のように高病原性鳥インフルエンザウイルスの検出、中和に非常に有効であり、高病原性鳥インフルエンザウイルスの治療、感染予防、防疫に有用性の高いものである。
(5) Inactivation effect of highly pathogenic avian influenza virus H5N1 (neutralization test) (5 each)
A mixture of 3 types of HA (A / New Caledonia, 20/99 (H1N1) -derived HA 30 μg A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) -derived HA 30 μg B / Malaysia / 2506 / 2004-derived HA 30 μg) Ten birds and five chickens were immunized every other week. Note that 5 ostriches were additionally immunized with H5 recombinant protein at 4 and 6 weeks after the initial immunization.
IgY purified from egg yolk after immunization with 3 types of HA had an inactivating action (neutralizing activity) of H5N1 virus, and its neutralizing activation was remarkably enhanced after 4 weeks. The antibody titer was significantly higher than that of chicken IgG of the same week (after 4 weeks, there was a significant difference compared to chicken IgY (*) (student-t test, P <0.01). Addition of H5 recombinant protein Immunization further increased the neutralizing activity titer against H5N1 (from
The highly pathogenic avian influenza virus has a very high mortality rate and has been reported to infect humans. In recent years, there is concern about its explosive epidemic. The antibody obtained by the production method described in the above examples is very effective for detection and neutralization of highly pathogenic avian influenza virus as described above, treatment of highly pathogenic avian influenza virus, prevention of infection, and prevention of epidemics. It is highly useful.
実施例３
ダチョウ抗インフルエンザ抗体の作成
１．ダチョウへの免疫
産卵中の雌性ダチョウに３種のＨＡ（Ａ/ニューカレドニア・20/99(H1N1)由来ＨＡ 30μｇ Ａ/広島/52/2005(H3N2)由来ＨＡ 30μｇ B/マレーシア/2506/2004由来ＨＡ 30μｇ）の混合液を隔週免疫した。初回はフロントの完全アジュバント、2回目以降はフロントの不完全アジュバントを用いた。免疫前、および免疫後に産卵された卵より卵黄を回収し、上記実施例１と同様の方法によりＩｇＹを精製した。
Example 3
Production of ostrich anti-influenza antibodies Immunity to ostrich Three types of HA (A / New Caledonia 20/99 (H1N1) -derived HA 30 μg A / Hiroshima / 52/2005 (H3N2) -derived HA 30 μg B / Malaysia / 2506/2004 HA 30 μg) was immunized every other week. For the first time, the front complete adjuvant was used, and for the second and subsequent times, the front incomplete adjuvant was used. Egg yolk was collected from eggs laid before and after immunization, and IgY was purified by the same method as in Example 1 above.
２．ヒトインフルエンザ臨床株に対する中和試験
ヒトインフルエンザ臨床株としては、大阪府下で発症したインフルエンザ患者より分離したヒトインフルエンザ臨床株を用いた。Ａ型Ｈ１Ｎ１、同Ａ型Ｈ３Ｎ２、同Ｂ型それぞれ２０株（２０名の患者よりそれぞれ分離）を用いた。
培養容器にてＭＤＣＫ細胞を培養し、ここへ上記の各ヒトインフルエンザ臨床株１００ＴＣＩＤ５０力価を接種した。ウイルス接種と同時に上記で得られた３種混合ＨＡ抗原を免疫したダチョウのＩｇＹを添加様々な濃度で添加し、ウイルス感染による細胞変性が５０％の細胞において抑制される抗体量を５０％感染抑制価として算出した。試験は各株４連で行った。表１はＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ型それぞれ２０株の平均値で表す。
MDCK cells were cultured in a culture vessel, and each of the above human influenza
表１より明らかなように、本願発明の方法で得られたダチョウＩｇＹは変異の多いヒトのインフルエンザウイルス臨床株に対して感染抑制効果（中和活性）を有する事が判明した。特にＡ型ウイルスに対しては、少量の抗体でも抑制出来ることから、Ａ型への中和活性化能力が高いと判明できる。 As is clear from Table 1, it was found that ostrich IgY obtained by the method of the present invention has an infection suppressing effect (neutralizing activity) against human influenza virus clinical strains with many mutations. In particular, since it can be suppressed even with a small amount of antibody against type A virus, it can be proved that the ability to neutralize and activate type A is high.
実施例４
ダチョウ抗インフルエンザウイルス抗体の高病原性鳥インフルエンザ感染に対する治療効果
１．ダチョウへの免疫
産卵中の雌性ダチョウに、５０μｇのＨ５Ｎ１ベトナム株由来Ｈ５リコンビナント抗原（市販品：プロテインサイエンス社）を隔週免疫した。初回はフロントの完全アジュバント、2回目以降はフロントの不完全アジュバントを用いた。免疫前、および免疫後に産卵された卵より卵黄を回収し、上記実施例１と同様の方法によりＩｇＹを精製した。
２．高病原性鳥インフルエンザ感染に対する治療効果
鶏の雛（１０日齢）に１０７ＥＩＤ５０の高病原性鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）を鼻腔内接種した。接種１時間後にＰＢＳ、免疫前ダチョウＩｇＹ（0.1mｇ/kg)、Ｈ５リコンビナント蛋白免疫ダチョウＩｇＹ（0.1mｇ/kg)を筋肉内投与（注射）した。それぞれ８羽の雛鳥を用いた。
３．結果
図１０に結果を示す。グラフはウイルス接種３日後の死亡率を示す。Ａ：ＰＢＳ，Ｂ：免疫前ＩｇＹ，Ｃ：Ｈ５リコンビナント蛋白免疫ダチョウＩｇＹ。
図１０より高病原性鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）に感染させ、ＰＢＳあるいは免疫前のＩｇＹを投与した雛鳥は１００％死亡したが、Ｈ５リコンビナント蛋白を免疫して作製したダチョウＩｇＹは死亡率を著しく低下させた。即ち、本発明の方法で得られるＩｇＹは高病原性鳥インフルエンザ感染の治療能を有することが確認された。
Example 4
Therapeutic effect of ostrich anti-influenza virus antibody on highly pathogenic avian influenza infection Immunization to Ostriches Female ostriches laying eggs were immunized every other week with 50 μg of H5 recombinant antigen derived from the H5N1 Vietnam strain (commercial product: Protein Science). For the first time, the front complete adjuvant was used, and for the second and subsequent times, the front incomplete adjuvant was used. Egg yolk was collected from eggs laid before and after immunization, and IgY was purified by the same method as in Example 1 above.
2. Therapeutic effect on highly pathogenic avian influenza infection Chicken chicks (10 days old) were inoculated intranasally with 10 7 EID 50 highly pathogenic avian influenza virus (H5N1). One hour after inoculation, PBS, pre-immune ostrich IgY (0.1 mg / kg), and H5 recombinant protein immunized ostrich IgY (0.1 mg / kg) were intramuscularly administered (injected). Eight chicks were used for each.
3. Results FIG. 10 shows the results. Graph shows
Figure 10 shows that chicks infected with highly pathogenic avian influenza virus (H5N1) and administered PBS or pre-immune IgY died 100%, but ostrich IgY produced by immunization with H5 recombinant protein significantly reduced mortality. I let you. That is, it was confirmed that IgY obtained by the method of the present invention has a therapeutic ability for highly pathogenic avian influenza infection.
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