JP5302341B2 - バイオ分析センサー用途における、二重層膜を横切る作用物質の輸送を研究するための方法およびデバイス - Google Patents

バイオ分析センサー用途における、二重層膜を横切る作用物質の輸送を研究するための方法およびデバイス Download PDF

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Description

本発明は、二重層膜を横切る作用物質の輸送を測定するための方法およびデバイスに関する。
膜を横切る輸送、および膜タンパク質などの膜に付随した分子の影響は、例えば、新薬を開発しているとき、および多くの他の状況における研究に重要である。
１８９５年に、Overtonは、分子は、その油−水分配係数と同じ相対的な程度で細胞に浸透することを示し［１］、１９４３年に、Danielliは、連続的な脂質二重層は、細胞膜を横切る受動拡散速度を決定する拡散バリアとして作用することを提示した［２］。しかし、隔離された脂質二重層を横切る浸透を直接研究するための最初の手段は、２つの水性コンパートメントを分離している単一の脂質二重層を調製するための手段の開発を通じて、６０年代初期に利用可能となった［３］。この技法は、帯電した溶質の浸透性の研究によく適しているが、水輸送および薬剤取込みを含めた、非電解質の受動輸送および能動輸送を研究するための現在の標準的な手法は、懸濁した脂質ベシクル（いわゆるリポソーム）の、浸透圧に誘発されたサイズ変化の測定に頼っている［４］。この方法は、脂質膜を横切る、浸透圧によって誘発された水の移動に応答したリポソームの寸法変化としての、散乱光強度の変動の動的光散乱（ＤＬＳ）測定に基づき、移動の際、リポソームは、水がリポソームから拡散するので最初に（１ｍｓ未満）縮み、引き続いて、溶質分子の内向きの浸透によって推進されて水がリポソームに再び入るので膨張する［５］。受動的および能動的な溶質浸透の性質に対する多数の研究への適用に成功しているが［６］、この方法は、リポソームサイズの変化は、間接的な効果であり、これは実際の溶質輸送と必ずしも相関しないという事実によって制限される。さらに、リポソームサイズだけではなく、リポソームの運動、溶質の屈折率、および膜凝集も散乱光の強度に寄与するので、溶質移動の定量化は必ずしも簡単明瞭とは限らない［７，８］。実用的観点から、この方法はまた、低い信号対雑音比を被っており、これは、複数のデータ系列から平均することが、カイネティックトレース（ｋｉｎｅｔｉｃ ｔｒａｃｅ）を分解するために一般に必要とされることを意味する。さらに、測定は、懸濁したリポソームに対して実施されるので、この方法は、まったく同じリポソーム試料の並列または連続のスクリーニングと互換性ではない。これはさらには、相当な量の物質が一般に必要とされることを意味する。幾分改善された感受性を除いて、これらの限定は、それほど広く普及していない方法にも当てはまり、この方法では、浸透圧によって誘発されたリポソームサイズの変動は、リポソームが縮小し、同時にフルオロフォア濃度が増加する際のリポソームに捕捉されたフルオロフォアの自己消光の変化をモニターすることによって記録される［９］。順次または同時に複数の認識事象をスクリーニングする可能性は、表面に基づくバイオ分析センサー技術の主な利点のうちの１つであり、この場合、まったく同じセットの表面に固定化されたプローブ分子は、自動化された様式で一連の様々な化合物に曝される。生命科学におけるこれらのセンサーの新たに現れている重要性の追加の理由は、これらがマイクロ流体の取り扱いと組み合わせることができるという事実に由来し［１０］、これはこれらのセンサーを小さい試料容積と適合性にし、したがって、希少で豊富ではない物質に対する測定によく適している。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、現在、支配的な表面に基づくバイオ分析センサーである。これは、平面の金属（通常金）基板で、横方向に伝播する表面プラズモンの励起に基づき、ＳＰＲ励起のための条件は、例えば、表面にごく接近した領域（一般に数百ナノメートル）内での生体分子の結合によって誘発された界面の屈折率の変化、Δｎinterfaceに極端に敏感である。したがって、表面上にプローブ分子を固定化することによって、この固定化されたプローブへの標的の結合は、良好な近似に対してΔｎinterfaceに比例した応答を介してリアルタイムでモニターすることができる［１１，１２］。
膜を横切る輸送を研究するための他の既知のデバイスには溶液中のリポソームが含まれる。リポソーム膜に、例えば、対象とする膜タンパク質が付随し、膜タンパク質に媒介される、膜を横切る作用物質の輸送は、例えば、蛍光および／または放射能測定を伴う方法を使用して研究される。
US2004/0033624には、膜受容体試薬およびアッセイデバイスが開示されている。リポソームはアンカー基で表面に繋ぎ止められている。この表面は、表面に繋ぎ止められた試薬リガンドを含む。リガンドはリポソーム膜中の受容体に可逆的に結合することができる。リポソーム中の膜タンパク質は、表面から放出されるエネルギーによって励起される能力を有する分子と付随し、それによって検出可能なシグナルを生じる。表面上の試薬リガンドへのリポソーム膜中の膜タンパク質の結合は、表面に向けてリポソームを引っ張る傾向がある。膜タンパク質に対する親和性を有する試験分子は膜タンパク質に競合的に結合し、表面上の試薬リガンドをある程度置換する。これは、膜タンパク質は表面から離れ、リポソーム膜中に再分配される一方で、リポソームは表面に依然として固定されているという結果になる。膜タンパク質は表面からの平均距離がより大きく、そのため、表面から受けるエネルギーはより少ない。これは、表面からのエネルギー移動が距離に依存するためである。これは検出することができる。US2004/0033624における方法は、機能するためにフルオロフォアなどの何らかの標識を必要とする。
現況技術による膜タンパク質に媒介される膜を横切る輸送を測定するためのアッセイにおいて、使用されなければならない膜タンパク質の量には改善の余地がある。膜タンパク質は、相当な量で精製することが困難で高価であることが多い。
現況技術では、多くのアッセイにおいて標識が使用されなければならないので、やはり改善の余地がある。標識は常に可能であるとは限らない。分析物／受容体の構造および機能を変化させ、調査されるべき分子相互作用を妨害する場合があるためである。さらに、蛍光マーカーは疎水性であり、非特異的なバックグラウンド結合を引き起こす場合がある。
本発明の目的は、膜を横切る輸送を測定するための、既知の分析方法およびデバイスに関連する不利点のうちの少なくともいくつかに対処することであり、改善された方法およびデバイスを提供し、従来技術における問題のうちの少なくともいくつかを軽減することである。既知の方法およびデバイスに関連するさらなる不利点、ならびに本発明の実施形態に関連する利点は、本説明、例、および特許請求の範囲をより綿密に検討すると、当業者に明らかであろう。
参照により本明細書に組み込まれている、特許請求の範囲で定義される方法およびデバイスが開示される。
本発明のさらなる態様、ならびにこれらの利点は、本説明、例、特許請求の範囲、および図面をより綿密に検討すると、当業者に明らかとなるであろう。
定義
本デバイスおよび方法が詳細に説明される前に、本発明は、本明細書に開示される特定の構成、方法ステップ、検出方法、形質導入方法、センサー、および物質に限定されず、したがって、構成、方法ステップ、検出方法、形質導入方法、センサー、および物質は、ある程度変更することができることが理解されるべきである。本明細書に使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的で使用され、限定的であることを意図されていないことも理解されるべきであり、これは、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されるためである。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、脈絡による明らかな別段の指示のない限り、複数の指示対象を含むことも留意されなければならない。したがって、例えば、「分析物」を含有する反応混合物への言及は、２つ以上の分析物の混合物を含む。
用語「約」は、数値との関連で使用されるとき、当業者によく知られており、許容される、精度の間隔を表す。前記間隔は±１０％であることが好ましい。
本発明の説明および請求において、以下の専門用語は、本明細書に設定される定義に従って使用される。
用語「二重層構造」は、本説明および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、原子または分子、および特に脂質の二重層構造を表す。この用語は、それだけに限らないが、曲線状の二重層を含めたすべての形状の二重層を包含する。二重層構造の例には、それだけに限らないが、リポソームが含まれる。
用語「検出容積」は、本説明および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、屈折率が測定される容積を表す。
用語「偏光解析法センサー」は、本説明および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、偏光解析器を含むセンサーを表す。
用語「イオノフォア」は、本説明および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、脂質二重層を横切ってイオンを輸送する能力を有する脂質可溶性分子を表す。
用語「脂質」は、本説明および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、任意の脂肪可溶性分子を表す。脂質の例として、それだけに限らないが、脂肪、油、ワックス、コレステロール、ステロール、モノグリセリド、ジグリセリド、およびリン脂質が挙げられる。
用語「リポソーム」は、本説明および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、脂質二重層膜を含む本質的に球状のベシクルを表す。リポソームは、水溶液のコアを含むことができる。リポソームの脂質膜は、それだけに限らないが、タンパク質、糖脂質、ステリオド（ｓｔｅｒｉｏｄ）、および他の膜関連成分などの成分を含むことができる。
用語「膜」は、本説明および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、それだけに限らないが、二重層膜などのすべての型の膜を含む。膜は、それだけに限らないが、タンパク質および脂質などの分子を含むことができる。
用語「膜タンパク質」は、本説明および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、膜に付随するタンパク質を表す。
用語「センサー」は、本説明および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、あるタイプのエネルギー、ある種のシグナルを使用し、これを、情報転送の目的のための読みに変換するトランスデューサーを表す。
用語「スペーサー」は、本説明および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、他の分子を一緒に連結するのに使用され、その結果、連結された分子同士間に空間が存在する分子を表す。
用語「表面」は、本説明および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、広い意味で解釈されるべきである。表面は、構造を繋ぎ止めることができる手段を支持するのに、本発明において使用することができる。
用語「表面プラズモン共鳴センサー」は、本説明および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、光による表面プラズモンの励起を利用するセンサーを表す。
用語「繋ぎ止める」は、本説明および特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、物質の移動を必ずしも制限しないが、拘束する様式での表面への物質の付着または捕捉を表す。
本発明の説明
第１の態様では、本発明は、膜を横切る作用物質の輸送を研究するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの表面であり、この表面に繋ぎ止められた二重層構造を有する表面を用意するステップであって、前記二重層構造は、検出容積を含むステップと、
ｂ）この二重層を、分析される少なくとも１つの作用物質と接触させるステップと、
ｃ）膜を横切る作用物質の輸送から生じる、検出容積における屈折率の変化を検出するステップと
を含む方法を提供する。
二重層構造は、溶媒と接触している。一実施形態では、溶媒は水である。二重層構造は、少なくとも１つの膜を含む。
一実施形態では、少なくとも１つの膜タンパク質は、二重層構造に付随している。膜タンパク質によって媒介される、膜を横切る輸送を研究することが望まれる場合、膜タンパク質は、一実施形態では、二重層膜中に挿入される。膜を横切る輸送での他の分子の輸送も研究することができる。例には、それだけに限らないが、膜を横切る分子の受動拡散、および例えば、イオノフォアおよび浸透エンハンサーによって促進される輸送が含まれる。浸透エンハンサーは、分析物を含む溶液に添加され、膜を横切る輸送に影響する分子である。
一実施形態では、膜タンパク質、およびイオノフォアからなる群からの少なくとも１つの実体は、二重層構造に付随する。
表面は、検出容積を含み、この中で屈折率が測定される。表面に繋ぎ止められた二重層構造は、完全または部分的に検出容積内にある。一実施形態では、検出容積は、表面と、表面から２５０ｎｍ、および表面に平行な面とによって限定された容積である。
一実施形態では、検出容積の感度は、表面からの距離とともに指数関数的に減少する。一実施形態では、検出容積は、検出感度が表面での最大感度の１％を超える容積に限定される。したがって、検出容積の感度が、表面からの距離とともに指数関数的に減少する実施形態についても、検出容積を計算することが可能である。検出容積の感度が、表面からの距離とともに指数関数的に減少する実施形態の例には、それだけに限らないが、表面プラズモン共鳴センサーを含む実施形態が含まれる。
二重層構造は、二重層のために、分析物が二重層構造を横切って自由に拡散または移動することができないようになっている。しかし、分析物は、膜を依然として通過することができる。
一実施形態では、二重層構造は、二重層によって少なくとも部分的に囲まれている容積を含む。
調査される分析物は、一実施形態では、二重層構造に接触した溶媒に添加される。分析物の特性に応じて、これは、二重層膜を横切って、非常にゆっくりと移すことができるか、ほとんどまったく移すことができない。いくつかの分析物については、分析物は、より高速で二重層膜を横切って移すことができる。膜を横切る分析物の輸送は、分析物の特性、および二重層中の分子に依存する。
二重層構造に、一実施形態では、研究される少なくとも１つの分子が付随している。そのような分子の例として、それだけに限らないが、イオノフォア、内在性膜貫通タンパク質、疎水性パッチを介して二重層の一面に結合しているタンパク質、共有結合したアルキル鎖を介して疎水的に付着している主に親水性のタンパク質、脂質鎖を引きつけることができる疎水性ポケットを有する主に親水性のタンパク質、および静電気的に結合している親水性タンパク質が挙げられる。
本発明は、分子によって促進される二重層膜を横切る輸送を研究するための可能性を提供する。二重層膜を横切る分析物の輸送は、屈折率を測定することによって測定される。
分析物の例として、それだけに限らないが、陽イオン、陰イオン、薬剤分子、有機分子、無機分子、受容体リガンド、スクロース、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、およびタンパク質が挙げられる。
一実施形態では、分析物は、二重層構造と接触した溶媒に添加され、二重層構造中の二重層の一面上にある容積にわたって広げられる。ある特定の濃度で溶媒中に溶解した分析物は、１つの屈折率を有する。二重層構造中の二重層の他方の面上の容積では、分析物の濃度は異なっていてもよく、これは、その容積について異なる屈折率を与える。屈折率を測定することによって、膜を横切る輸送をモニターすることが可能である。
表面に基づく技法の利点には、これらはマイクロ流体デバイスとより良好に組み合わせることができること、これらは完全に自動化することができること、および測定は、より小さい試料容積を必要とすることが含まれる。
一実施形態では、センサーは、表面にごく接近した屈折率変化を測定する技法を利用する。一実施形態では、センサーは、表面から０〜２５０ｎｍの間隔内の屈折率の変化を測定する能力を有する。
一実施形態では、この方法は、表面プラズモン共鳴センサー、偏光解析法センサー、および光導波路レーザー分光法センサーからなる群から選択されるセンサーを用いて屈折率の変化を検出するステップを含む。
一実施形態では、二重層構造は、少なくとも１つのリポソームを含む。さらなる実施形態では、二重層構造は、少なくとも１つの層のリポソームを含む。なおさらなる実施形態では、二重層構造は、繋ぎ止められたリポソームの層である。別の実施形態では、二重層構造は、少なくとも２つの層のリポソームを含む。さらに別の実施形態では、二重層構造は、表面に繋ぎ止められた多数のリポソームである。
一実施形態では、リポソームは、スペーサー分子を用いて表面に繋ぎ止められる。一実施形態では、いくつかの層のリポソームが存在する場合、１つの層中のリポソームを、隣接する層中のリポソームに繋ぎ止める、少なくとも１つのスペーサーが存在する。
一実施形態では、この方法は、二重層構造によって囲まれている容積内の屈折率を測定するステップを含む。
一実施形態では、この方法は、表面に繋ぎ止められたリポソームによって囲まれている容積内の屈折率を測定するステップを含む。
一実施形態では、この方法は、表面に繋ぎ止められた少なくとも１つのリポソームによって囲まれている容積内の屈折率を測定するステップを含む。
一実施形態では、二重層構造は、検出容積の第１の容積を囲み、二重層構造によって囲まれていないが、検出容積内にある容積は、第２の容積であり、第１の容積と第２の容積の比は、第１の容積の屈折率を測定するために最適化される。第１の容積の屈折率を測定することが望まれる場合、第１の容積は、第２の容積と比較して可能な限り大きいべきである。大きい第１の容積により、より高い感度が得られる。第１の容積と第２の容積の適当な比の例には、それだけに限らないが、０．００１、０．０１、０．１、１、および１０が含まれる。２０、５０、１００、５００、および１０００などのより高い比の値も本発明によって包含される。
結論として、細胞膜浸透を研究するための本発明の方法は、生体膜を横切る無電荷の溶質および帯電した溶質の両方の移動速度の直接測定を有利に許容する。この方法は、例えば、表面プラズモン共鳴能動的センサー表面に付随したエバネセント場に閉じ込められたリポソーム内の溶質濃度の浸透に依存した変化に対する、屈折率の時間的変化を分解することに基づく。
本発明の第２の態様では、
ａ）少なくとも１つの表面、
ｂ）この表面に繋ぎ止められた少なくとも１つの二重層構造、および
ｃ）検出容積内の屈折率の変化を検出することができる少なくとも１つのセンサーを含み、二重層構造は、検出容積の第１の容積を囲み、二重層構造によって囲まれていないが、検出容積内にある容積は、第２の容積であり、第１の容積と第２の容積の比は、約０．００１を超えるデバイスが提供される。
代替の実施形態では、第１の容積と第２の容積の比は、約０．００１を超え、好ましくは約０．０１を超え、より好ましくは約０．１を超え、さらにより好ましくは約１を超え、最も好ましくは約１０を超える。高い比が望まれるが、これは、第１の容積内の屈折率測定に関してより良好な感度を導くためである。本発明の一利点は、高い比を提供することによって、感度および精度を増大させることができることである。
一実施形態では、二重層構造は、表面に繋ぎ止められた少なくとも１つのリボソームを含む。さらに別の実施形態では、二重層構造は、表面に繋ぎ止められた多数のリポソームを含む。
一実施形態では、少なくとも１つのリポソームは、少なくとも１つのスペーサーを用いて表面に繋ぎ止められている。スペーサーの例として、それだけに限らないが、ポリマー、核酸、ＤＮＡ、Ｈｉｓタグ、表面に共有結合したアビジンに付着したビオチン化脂質、および疎水的に改変されたデキストランが挙げられる。上述したスペーサーの任意の組合せも使用することができる。
一実施形態では、少なくとも１つのスペーサーは、ポリマーである。別の実施形態では、少なくとも１つのスペーサーは、Ｈｉｓタグである。さらなる実施形態では、ポリマースペーサーおよびＨｉｓタグスペーサーの両方が存在する。
一実施形態では、二重層構造と表面の間の距離は、約２５０ｎｍ未満である。
一実施形態では、検出容積内の屈折率を測定するセンサーは、表面プラズモン共鳴センサー、偏光解析法センサー、および光導波路レーザー分光法センサーからなる群から選択される。
一実施形態では、センサーは、現象表面プラズモン共鳴（ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を利用する。
詳細かつ例示的な説明
図１は、ニュートラビジン／ビオチンＤＮＡ（Ｎ／Ｂ）、０．１Ｍのスクロース（Ｓ１）、２ｍｇ／ｍｌのコレステロールＤＮＡタグ（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ＤＮＡ ｔａｇｇｅｄ）ＰＯＰＣ−リポソーム（ＰＯＰＣ）、０．１Ｍのスクロース（Ｓ２）、４０μＭのメリチン、０．１Ｍのスクロース（Ｓ３）、０．１Ｍのスクロース（Ｓ４）、０．１Ｍのスクロース（Ｓ５）の、ＰＥＧ／ＰＥＧ−ビオチン官能性Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）センサーへの連続的な添加を示す。 図２は、５つのスクロース添加（Ｓ１〜Ｓ５）からの応答（ＲＵ）を示す。挿入図は、図２の部分的な拡大を示す。 図３は、時間の関数としてのリポソーム中へのスクロースの取込みを示し、これは、Ｓ３〜Ｓ５の添加に対するＲＵの変化から、閉じたリポソームへのスクロースの添加（Ｓ２）に対するＲＵの変化を減じることによって得られる。 図４ａおよび４ｂは、グリセロール、尿素、およびヒドロキシ尿素についてのリポソーム浸透性を示す。 図５ａおよび５ｂは、様々な温度に対するグリセロールについての放出および輸送速度を示す。 図６ａ〜６ｃは、シクロデキストリンに曝したときの、リポソームを含むコレステロールの挙動を示す。 図７は、ヨウ化物イオンおよび塩化物イオンの膜輸送を例示する。
例１、膜輸送に対するメリチンおよびその効果の研究
物質および方法
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホホコリン（Ｐｈｏｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）（ＰＯＰＣ）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（登録商標）から購入した。ＰＥＧ−ポリマー（３ｋＤａ）、ＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＨ（ＨＳ−ＰＥＧ）ＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ビオチン（ＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン）は、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ（登録商標）ＧｍｂＨから購入した。センサーチップは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標）から購入した。膜タンパク質分析キットは、ＬａｙｅｒＬａｂ（登録商標）製であった。ＨＥＰＥＳ−２は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４である。
リポソームの調製
リポソームは、窒素ガス流を使用して、ＰＯＰＣ脂質から溶媒のクロロホルムを最初に蒸発させることによって作製した。次いで、乾燥した脂質を窒素ガス流下で少なくとも１時間維持し、その後、ＨＥＰＥＳ−２を添加することによって、４ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＯＰＣを得た。溶解したＰＯＰＣ脂質を少なくとも３０分間ボルテックスすることによって、多層状リポソームを得た。単層状リポソームは、ミニ押出機および５０ｎｍの孔サイズを有するＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（登録商標）からの５０ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜を使用して作製した。リポソームの半径は、ガウスサイズ分布を有し、平均半径は３６ｎｍであった。このリポソームを、窒素ガス下で、使用するまで４℃で貯蔵した（２日以内）。
バイオセンサー表面の機能付与
ＨＥＰＥＳ−２中に溶解した、ＨＳ−ＰＥＧ（２００μｇ／ｍｌ）とＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン（２０μｇ／ｍｌ）の混合物（３００μｌ）を、５μｌ／分の流速で、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ａｕセンサーチップ上に注入した。次いで、ニュートラビジン（４０μｇ／ｍｌ）とビオチン−ＤＮＡ（０．７μＭ）の混合物（１５０μｌ）を注入し、表面でＨＳ−ＰＥＧ−ビオチンに結合させた。
リポソームの繋ぎ止め
コレステロール−ＤＮＡタグ（リポソーム当たり３ＤＮＡタグ）を含有するＰＯＰＣリポソーム（２ｍｇ／ｍｌ、ＨＥＰＥＳ−２中）を、５μｌ／分の流速で注入した。コレステロール−ＤＮＡタグのＤＮＡ部分の末端は一本鎖であり、表面でのビオチン−ＤＮＡに配列が相補性であり、センサー表面にリポソームを繋ぎ止めることを可能にしている。
リポソームへのメリチンの結合
ＰＯＰＣリポソームの繋ぎ止めが終了した直後に、メリチンの可逆性結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）計測器で測定した。ＨＥＰＥＳ−２中、０．５〜４０μＭの濃度のメリチン溶液を順に注入した。注入の間、メリチン分子はリポソームに結合し、注入が終了した後、ランニング緩衝液（ＨＥＰＥＳ−２）を表面上に流すと、メリチンが解離する。解離が完了したのち、異なる濃度の新しいメリチン溶液を注入した。
メリチンによるリポソームの破壊
ＰＯＰＣリポソームを繋ぎ止めた直後に、メリチンによるリポソームの破壊を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）計測器で測定した。
３６０μＭ（１ｍｇ／ｍｌ）の濃度でＨＥＰＥＳ−２中に溶解したメリチンを注入し、リポソームが破壊するにつれて応答（ＲＵ）が減少するのをモニターした。
メリチンに媒介されたスクロースの取込み
ニュートラビジン／ビオチン−ＤＮＡを繋ぎ止めた後、連続した順序で以下の注入を行った；０．１Ｍのスクロース、２ｍｇ／ｍｌのコレステロール−ＤＮＡタグＰＯＰＣ−リポソーム、０．１Ｍのスクロース、４０μＭのメリチン、０．１Ｍのスクロース、０．１Ｍのスクロース、０．１Ｍのスクロース。すべての試料は、ＨＥＰＥＳ−２中に溶解させた。
結果
リポソームの繋ぎ止め
バイオセンサー表面へのリポソームの結合があった。表面でのカルボン酸基を、ＥＤＣ／ＮＨＳを使用するアミド結合のために活性化した。その後、ＰＬＬ−ＰＥＧ／ＰＬＬ−ＰＥＧ−ビオチン（５：１）、ニュートラビジン／ビオチン−ＤＮＡ（１：１）、およびコレステロールＤＮＡタグＰＯＰＣ−リポソームを添加した。
二重層構造は、検出容積の第１の容積を囲んでおり、二重層構造によって囲まれていないが、検出容積内にある容積は、第２の容積である。第１の容積と第２の容積の比は、この特定の場合では約０．１であった。
メリチン結合および孔形成
様々な濃度（０．５〜４０μＭ）のメリチン溶液をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）計測器で５μｌ／分で、結合したリポソーム上に注入した。時間（ｔ）の関数としての応答（ＲＵ）の変化を、ＲＵ＝ＲＵ0＋ＲＵ1 *（１−ｅｘｐ（−ｔ／τ1））＋ＲＵ2 *（１−ｅｘｐ（−ｔ／τ2））にフィッティングした。しかし、０．５μＭのメリチンを注入する間のＲＵの変化は、ただ１つの指数関数（すなわち、ＲＵ2＝０）を使用して記述することができた。高濃度のメリチンは、細胞およびリポソームを破壊する場合があることが知られている。メリチンの非特異的な結合（すなわち、リポソームを含まないバイオセンサー表面への結合）は小さく、リポソーム膜表面へのメリチンの結合の５％未満であった（データを示していない）。観察された速度定数、ｋ1、（ｋ1＝１／τ1）および応答（ＲＵ1）は、バルク溶液［Ｍｅｌ］B中のメリチン濃度の関数として研究した。メリチンのリポソーム膜表面との微視的なオンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）（ｋ+1）およびオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（ｋ-1）は、データをｋ1＝［Ｍｅｌ］B *ｋ+1＋ｋ-1にフィッティングして得、これは、ｋ-1＝０．０３２ｓ-1およびｋ+1＝３６８４Ｍ-1ｓ-1を与えた。振幅、ＲＵ1はまた、微視的な速度定数、ＲＵ1＝ＲＵmax *（ｋ+1／（ｋ+1＋ｋ-1）によって求めた。ｋ-1＝０．０３２ｓ-1およびｋ+1＝３６８４Ｍ-1ｓ-1（［Ｍｅｌ］Bの関数としてのｋ1のフィッティングから得られる）を使用したとき、［Ｍｅｌ］Bの関数として、ＲＵ1は良好にフィットした。
リポソームの結合からの応答（ＲＵ）を、メリチンの結合からの応答と比較することにより、各リポソームに結合するメリチン分子の数を得る。α−ヘリックスのメリチン分子は、平行な配向で膜に結合し、メリチン分子が占有するリポソーム膜の面積は約２１０Å2であることが知られている。リポソーム外膜の表面積は、約１．６３*１０＾６Å2（リポソーム半径≒３６０Å）である。したがって、リポソーム外膜（［Ｍｅｌ］O.M.）でのメリチンの濃度、およびメリチン分子が包含するリポソーム表面の画分（ＦO.M.）を、各［Ｍｅｌ］Bについて計算することができる。
バルク溶液中、２、４、８、および４０μＭのメリチンの濃度で、メリチンのリポソームとの付随は二相性であった。孔形成は、膜表面で、メリチンの閾値濃度で誘発されることが知られている。孔が形成される場合、リポソームの外側のバルク溶液中のメリチン分子は、リポソーム膜を横断し、リポソームの内側の膜表面に結合することができるはずである。したがって、より遅いカイネティック相は、内側の膜へのメリチンの結合を表すと仮定される。観察された速度定数、ｋ2は、［Ｍｅｌ］Bに線形依存することが判明し、これは、孔を通じたメリチンの移動は、律速段階ではない（［Ｍｅｌ］Bに依存しない）ことを示す。線形フィッティングにより、ｋ+2＝５６Ｍ-1ｓ-1およびｋ-2＝０．００４６ｓ-1を得た。ｋ+1（３６８４Ｍ-1ｓ-1）と比較して、見かけ上の拡散係数ｋ-2（５６Ｍ-1ｓ-1）の低い値は、全体として、リポソーム表面よりも、メリチン分子がリポソームの孔を見出す確率が低いことによって説明することができる。孔／リポソームの数は、ガウスの分布型であり、低い［Ｍｅｌ］O.M.で、［Ｍｅｌ］Bが増加すると、１つの孔を有するリポソームの数が増加する。したがって、低い［Ｍｅｌ］Bで、応答（ＲＵ2）は、［Ｍｅｌ］Bだけではなく、孔をまったく有さないリポソームの画分にも依存する。すべてのリポソームが少なくとも１つの孔を有する高い［Ｍｅｌ］Bで、内側の膜でのメリチンの表面普及率は、外膜での表面普及率と等しいはずであり、ＲＵ2は、ＲＵ2max＝ＲＵ1 *（Ａｒｅａln／ＡｒｅａOut）に接近するはずである。したがって、上記結果は、より遅いカイネティック相は、内側の膜へのメリチンの結合を説明することを示す。さらなる支持は、４、８、および４０μＭの注入を停止した後、ＲＵは初期値（注入前）に戻らないという知見に由来し、これは、リポソーム内部に捕捉されているメリチン分子によって説明され、その理由は、膜表面からのメリチン解離により孔が消失するためである。
メリチンの孔に媒介されるスクロース取込み
バイオセンサー表面での、膜を横切る分析物のリアルタイムおよび標識のない取込み測定のための単純な方法は、例えば、膜輸送体を調査する場合、大いに価値がある。ここでは、本発明者らは、分析物が取り込まれるにつれて、この分析物によって生じるリポソーム内部の溶液の屈折率変化を単純に検出することによって、メリチンの孔を通じた、分析物、すなわちスクロースの取込みを測定することが可能であるかどうかを試験することを望んだ。
図１は、ニュートラビジン／ビオチンＤＮＡ（Ｎ／Ｂ）、０．１Ｍのスクロース（Ｓ１）、２ｍｇ／ｍｌのコレステロールＤＮＡタグＰＯＰＣ−リポソーム（ＰＯＰＣ）、０．１Ｍのスクロース（Ｓ２）、４０μＭのメリチン、０．１Ｍのスクロース（Ｓ３）、０．１Ｍのスクロース（Ｓ４）、０．１Ｍのスクロース（Ｓ５）の、ＰＥＧ／ＰＥＧ−ビオチン官能性表面への連続的な添加を示す。
図２は、５つのスクロース添加（Ｓ１〜Ｓ５）からの応答（ＲＵ）を示す。スクロースを添加することにより、検出容積、すなわち、センサー表面上のエバネセント場に対応する容積中の溶液の屈折率が変化し、これは、ＲＵのシフトとして現れる。Ｓ１の添加と比較して、Ｓ２を添加した際のＲＵのより小さい増大は、表面に結合したリポソームによって生じたエバネセント場のアクセス可能な容積の低減に対応する。メリチンの添加により、リポソーム膜中に孔が生成し、したがって、リポソームの内側の容積が添加されたスクロース分子にアクセス可能になる。メリチンの添加が停止する場合、メリチンは膜表面から解離し、メリチン−孔を有するリポソームの数が経時的に減少する。図２は、孔／リポソームの数が低減される場合の、スクロースを添加した際のＲＵの変化を示す（Ｓ３〜Ｓ５）。
図３は、時間の関数としてのリポソーム中へのスクロースの取込みを示し、これは、Ｓ３〜Ｓ５の添加に対するＲＵの変化から、閉じたリポソームへのスクロースの添加（Ｓ２）に対するＲＵの変化を減じることによって得られる。取込みの振幅はＳ３〜Ｓ５で減少し、これは、孔を有するリポソームの数の減少によって説明される。速度もＳ３〜Ｓ５で減少し、これは、リポソーム当たりの孔の数の減少によって説明される。図３中のグラフから、スクロースの取込みについての減衰時間を推定することができ、τ3≒２０秒である。取込み後のリポソーム内部のスクロースの濃度が［スクロース］B＝０．１Ｍに等しい場合、約７４００のスクロース分子が約２０秒以内に膜を横断する。表２は、［Ｍｅｌ］Ｂ＝４０μＭでのＲＵ2／ＲＵ2maxは０．８５であることを示し、これは、リポソーム当たり１つを超える孔を有するリポソームの数に対応する。応答の振幅は、０．３４ｋＤａの分子量（Ｍｗ）を有する０．１Ｍのスクロースでリポソームを満たすことから予期することができる値とよく一致している。リポソーム内部の７４００のスクロース分子（０．１Ｍ）の予期されるＲＵは、リポソーム自体を固定化することで得られた応答（ＲＵ＝６７９０）から計算することができる。リポソームのＭｗは３５８００ｋＤａであり、これは０．１９ＲＵ／ｋＤａを与える。７４００のスクロース分子のＭｗは、７４００*０．３４２ｋＤａ＝２５３１ｋＤａであり、これはＲＵ＝２５３１*０．１９＝４８０を与える。リポソームのうちの約８５％しか孔を有さないので、期待値は、４８０／０．８５≒５６０ＲＵであり、これは、Ｓ３注入からの５３０ＲＵの測定された応答とよく一致する。
例２
非電解質のグリセロール、尿素、およびヒドロキシ尿素の浸透性を調査することによる、複数の浸透事象をスクリーニングするためのＳＰＲに基づく方法
すべて生物学的に妥当な分子である、非電解質のグリセロール、尿素、およびヒドロキシ尿素の浸透性を調査することによって、ＳＰＲに基づく方法の効率、および複数の浸透事象のスクリーニングとの適合性を評価した。例えば、グリセロールが、脂肪分子が貯えられている脂肪細胞の膜を横切って輸送される効率は、肥満症およびＩＩ型糖尿病の発症における重要な因子であることが示されている［１７］。一方、尿素は代謝過程における老廃物であり、肝細胞から輸送されて出され、尿を介して体から放出されるが、ヒドロキシ尿素は、癌化学療法［１８］、ならびにＨＩＶ−ウイルス感染の治療［１９］において広く使用されている薬剤である。この方法の適用性は、リポソームのコレステロール含量の、シクロデキストリンに誘発される段階的な低減に対するグリセロール浸透の増大をモニターすることによる、リポソーム浸透性のインサイツ変化および同時のモニタリングについて実証される。この方法のイオンのプローブ輸送に対する適合性も示される。
最初に、例１に従って７０ｎｍのリポソームを得た。図４ａは、７０ｎｍのリポソームの結合、その後の様々な濃度のグリセロール、尿素、ヒドロキシ尿素の注入パルスの繰り返しを示す（挿入図を参照されたい）。図４ｂは、溶質（グリセロール）がリポソーム内側から放出される、すすぎステップのうちの１つの拡大を示す。図４ｂ（破線曲線）には、固定化されたリポソームを含まない同一のすすぎステップも示しており、流体交換の時定数は、１００ｍｓより速いことを示しており、これは、これらの輸送測定を時間的に分解するのに十分である。グリセロール放出速度は、８〜２２℃の温度間隔で試験した。結果を図５ａに示す。予想と一致して、脂質膜を横切る輸送速度は、温度の上昇とともに増加し、アレニウスプロットは、ｌｎ（１／）と１／Ｔの間で線形の依存性を示し、調査した３つの溶質（グリセロール、尿素およびヒドロキシ尿素）についての文献データと非常によく一致した活性化エネルギーを生じている。図５ｂを参照されたい。
図４および５に示した結果は、この方法を使用することによって、取込みではなく、溶質の放出を追跡することにより、脂質膜の浸透係数を正確に求めることができることを実証する。すべてのこれらのデータは、固定化されたリポソームの同じセットを使用した１つの実験から得たことに留意されたい。異なる実験間の再現性は、２％より良好であった。
４０％のコレステロールを含有する７０ｎｍのリポソームを、例１に従って得た。リポソームの結合、その後のリポソームの脂質二重層からコレステロールを除去するシクロデキストリンの注入の繰り返しを図６ａに示す。ＳＰＲ応答は、界面の屈折率に比例しており、これにより、コレステロールの除去を定量化することが可能になる。７回のシクロデキストリンの注入の後、コレステロール含量は、１４％に低減した。
シクロデキストリンの各注入（図６ａ）後に、グリセロールの注入パルスを続け、これにより、グリセロール輸送対コレステロール含量の時定数を定量化することが可能になり、４０％のコレステロールで７ｓから１４％のコレステロールで１ｓの範囲であった。図６ｂを参照されたい。輸送速度の差異は、コレステロール含量のわずか１％の変化について検出可能であったことに留意されたい。
図６ｃは、浸透性の変動（溶質移動速度とベシクルの面積から推定）、および応答の振幅（内部容積に比例している）を示す。予想と一致して、浸透性は、コレステロール含量に対して直線的に減少する一方で、内部移行される容積は、非線形的に増大する。後者の知見は、約２５％のコレステロール含量での膜の構造的変化を反映する。
図３ａ〜ｃに示した測定を用いて、この方法は、溶質移動を、浸透性の観点から定量化することを可能にし、これは、膜特性の構造的変化に同時に相関し得ることが実証される。このタイプの情報は、例えば、薬剤が、細胞−膜の浸透性にどのように影響するかについての研究において妥当性が高い。無電荷の溶質の受動的移動および膜−タンパク質に媒介される移動の両方は、生物学的および薬学的妥当性が高い。しかし、このような方法が、任意のタイプの膜輸送反応に一般的に適用可能であるために、イオン転位も測定することが可能であるべきであり、これは現在、パッチ−クランプに基づくアッセイを使用して一般に測定される。図７は、ヨウ化物（約１０ｓ）および塩化物（約２００ｓ）イオンの膜輸送を例示し、文献データと非常によく一致している。対イオン（Ｋ＋）の共輸送を保証し、したがって、防止しなければ陰イオンの妨げられない輸送を制限する、静電気的な膜貫通電位の確立を防止するために、リポソーム中にグラミシジンを組み込んだことに留意されたい。
図７に示した結果は、帯電した溶質の膜転位反応も時間分解することに対する、この方法の適用性を実証する。この研究の自然な拡張は、薬剤−スクリーニング過程において妥当性が高い、分子およびイオンチャネルで制御された輸送の研究である。
グリセロール、尿素、およびヒドロキシ尿素について例示したように、本発明による方法は、１つの測定で複数の浸透事象をスクリーニングすることを可能にし、浸透性のインサイツ変化を定量化することを可能にし、これは、脂質二重層からのコレステロールの連続的な除去によって例証される。懸濁したリポソームの浸透圧によって誘発されたサイズ変化の間接的な測定に頼る、非電解質移動をプローブするための代替の方法と比較して、この方法は、感度を改善し、試料の必要な量を桁違いに低減する。
図４〜７に示した一連の結果において、電磁エバネセント場内に固定化されたリポソームの脂質二重層膜を横切る溶質輸送は、取込みではなく、溶質の放出に対する、リポソーム内部に移行した容積の屈折率の変化を追跡することによって求めることができることが実証される（図４）。膜特性は、インサイツで変化し、浸透性の変化に相関し得ることも実証される（図５）。図６において、本発明者らは、無電荷の溶質だけではなく、イオンの輸送も、溶質の放出（または取込み）に対して、リポソーム内部に移行した容積の屈折率の変化を追跡することによって測定することができることを実証する。
要約すると、本発明により、１００ｍｓの時間分解能で、膜を横切る非電解質溶質の分子輸送を直接測定するために、この検出原理を使用する可能性が許容される。この方法は、脂質二重層を横切る溶質移動の間接的ではなく直接的な（ＤＬＳ法および蛍光消光法と比較して）測定を可能にするという意味で独特であり、この直接的な方法は、パッチ−クランプ［１４］またはチップに基づく代替法［１５］を使用して、帯電した分子についてのみこれまで可能であった。間接的な方法と比較して、これは、表面に基づく方法のすべての他の利点、例えば、複数の溶質の迅速な連続（または並列）のスクリーニング、ならびにエフェクター分子の添加によるリポソームの浸透性のインサイツでの混乱なども提供する。また、分析されるリポソームのサイズに関して制限がない一方で、ＤＬＳに基づく方法は、相対的に大きいリポソームのみに適用可能であるが、これは、約８０ｎｍより小さい直径を有するリポソームは、本質的に非圧縮性（１％未満）であるためである［１６］。
本発明を、本発明者らが現在知る最良の様式を含む、その好適な実施形態に関して説明してきたが、当業者に明白であるように、様々な変更および改変を、本明細書に添付した特許請求の範囲に示した本発明の範囲から逸脱することなく行うことができることが理解されるべきである。
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Claims (5)

  1. 膜を横切る作用物質の輸送を研究するための方法であって、
    ａ．少なくとも１つの表面であり、前記表面に繋ぎ止められた二重層構造を有する表面を用意するステップであって、前記二重層構造は、検出容積を囲んでいるステップと、
    ｂ．前記二重層を、分析される少なくとも１つの作用物質と接触させるステップと、
    ｃ．前記膜を横切る前記作用物質の輸送から生じる、前記二重層構造によって囲まれている前記検出容積における屈折率の変化を、表面プラズモン共鳴センサー、偏光解析法センサー、および光導波路レーザー分光法センサーからなる群から選択される、少なくとも１つのセンサーを用いて検出するステップと、
    を含む方法。
  2. 膜タンパク質、およびイオノフォアからなる群から選択される少なくとも１つの実体が、前記二重層構造に付随している、請求項１に記載の方法。
  3. 前記二重層構造が少なくとも１つのリポソームを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 少なくとも１つのリポソームが、スペーサー分子を用いて前記表面に繋ぎ止められる、請求項３に記載の方法。
  5. 前記二重層構造が少なくとも２層のリポソームを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
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