JP5263979B2 - How to distinguish colorectal cancer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、大腸癌の判別方法に関し、より詳細には、悪性や転移性の大腸癌を判別する方法に関する。 The present invention relates to a method for discriminating colorectal cancer, and more particularly to a method for discriminating malignant or metastatic colorectal cancer.
近年、大腸癌は、日本人の中で罹患率が増加傾向にある。主要部位別の統計でも、男女共、胃癌、肺癌に次ぐ第３位である。大腸癌は、癌の発生及び進行に伴って複数の癌関連遺伝子が関与する多段階発癌過程をとる。具体的には、ＡＰＣ等の癌抑制遺伝子異常により大腸ポリープができ、癌遺伝子ｒａｓの変異による活性化、癌抑制遺伝子ｐ５３の変異による不活性化等の異常が加わると、ポリープは肥大化及び癌化する。さらに、別の癌遺伝子の異常により、癌が浸潤や転移するようになる。大腸癌と診断されても、その詳細は、腫瘍組織を除去すれば問題のない良性のものから、小さくても転移しやすい悪性度の高いものまで多様である。 In recent years, colorectal cancer tends to increase in prevalence among Japanese. According to statistics by main site, it is the third place after both men and women, stomach cancer and lung cancer. Colorectal cancer takes a multi-stage carcinogenic process involving multiple cancer-related genes as the cancer develops and progresses. Specifically, colon polyps can be formed due to abnormalities in tumor suppressor genes such as APC, and when abnormalities such as activation due to mutations in the oncogene ras and inactivation due to mutations in the tumor suppressor gene p53 are added, the polyps become enlarged and cancerous. Turn into. In addition, abnormalities in other oncogenes cause cancer to infiltrate and metastasize. Even if colorectal cancer is diagnosed, the details vary from benign ones that do not pose a problem if the tumor tissue is removed, to those that are small and have high malignancy that can easily metastasize.
大腸癌は、早期に発見できれば、治癒が比較的容易である。単純なポリペクトミーから粘膜切除術も近年積極的に行なわれるようになってきた。また、手術による治療法も、癌が大腸壁中にどの程度深く入っているか、リンパ節転移、遠隔転移の有無等で規定される臨床病期や悪性度に応じて異なる。したがって、大腸癌の完全治癒を目指すには、早期発見と正確な臨床病理的な診断が重要である。 Colorectal cancer is relatively easy to cure if it can be detected early. In recent years, mucosal resection from simple polypectomy has been actively performed. In addition, treatment by surgery also varies depending on the clinical stage and malignancy defined by how deeply the cancer enters the colon wall, the presence of lymph node metastasis, distant metastasis, and the like. Therefore, early detection and accurate clinicopathological diagnosis are important in aiming for complete cure of colorectal cancer.
大腸癌の診断では、一般的に、注腸造影検査、内視鏡検査、腫瘍マーカー、各種画像診断等が行われる。大腸癌が疑われる場合、生検を行ない、癌の組織学的悪性度、脈管への浸潤等の病理診断が行われる。 In colorectal cancer diagnosis, enema imaging examination, endoscopy, tumor marker, various image diagnosis, and the like are generally performed. When colorectal cancer is suspected, a biopsy is performed, and pathological diagnosis such as histological grade of cancer, invasion of blood vessels, etc. is performed.
病理診断では、病理医が摘出した組織や臓器を肉眼で見て、病変の部位、大きさ、性状、広がりを確認し、診断に必要な部分を切り取って生体試料標本とする。その生体試料標本を病理医が顕微鏡で観察し、組織的悪性度（分化度）の確認、手術で断端が完全に取り切れたかどうかのチェック、追加治療が必要かどうか、脈管やリンパ管への浸潤等を判断し、臨床医に伝える。病理診断にとって癌組織の悪性度を判断することが大事であるが、この悪性度を正確に判断することは、熟練を要し、病理医の専門性の高い領域である。 In pathological diagnosis, a tissue or organ removed by a pathologist is observed with the naked eye, and the site, size, property, and spread of the lesion are confirmed, and a portion necessary for diagnosis is cut out to obtain a biological sample specimen. A pathologist observes the biological specimen with a microscope, confirms organizational malignancy (differentiation), checks whether the stump has been completely removed by surgery, whether additional treatment is required, vascular and lymphatic vessels Judgment of invasion and other information is reported to the clinician Although it is important to determine the malignancy of cancer tissue for pathological diagnosis, accurate determination of this malignancy requires skill and is a highly specialized area for pathologists.
糖鎖は、タンパク質の翻訳後修飾を担う生体高分子であり、癌の発症に伴ってその構造が変化する。大腸癌では、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ５０、ＣＳＬＥＸ（シアリルＬｅｘ抗原）、ＳＬＸ（シアリルＬｅｘ−ｉ抗原）、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）等の糖鎖関連の癌関連抗原が腫瘍マーカーとして利用されている。 A sugar chain is a biopolymer responsible for post-translational modification of proteins, and its structure changes with the onset of cancer. In colon cancer, CA19-9, CEA, CA50, CSLEX (sialyl Le x antigen), use SLX (sialyl Le x -i antigen), STN (sialyl Tn antigen) sugar chain-related cancer-associated antigen such as a tumor marker Has been.
糖鎖は、大腸癌の悪性度や転移性にも関与していると推測される。例えば、非特許文献１には、Ｄｕｋｅｓ分類やＴＭＮ分類のＧｒａｄｅの低い大腸癌では、Ｎ型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα１→６結合でフコース（コアフコースともいう）を付加するＦＵＴ８の酵素活性が高い値を示し、上記分類のＧｒａｄｅが高くなる、すなわち悪性度が高くなると、ＦＵＴ８の活性は有意に低下すると報告されている。 It is speculated that sugar chains are also involved in the malignancy and metastasis of colorectal cancer. For example, in Non-Patent Document 1, FUT8 that adds fucose (also referred to as core fucose) by α1 → 6 bond to N-acetylglucosamine at the reducing end of N-type sugar chain in colorectal cancer with a low grade of Dukes classification or TMN classification. It is reported that the activity of FUT8 is significantly decreased when the above grade of Grade is high, that is, when the grade of Grade is high, that is, the grade of malignancy is high.
癌化に伴う細胞表面の糖鎖構造の変化や転移に関わる情報を得るために、糖鎖に結合するレクチンを利用することが考えられる。従来、上記コアフコースを検出するレクチンとして、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）が知られている。ＡＡＬは、α１→２、α１→３、α１→４やα１→６結合のフコースと親和性を有する。しかし、後述の実施例に示すように、ＡＡＬを用いた検出方法では、原発癌と転移癌との間や悪性度の違いで有意差がでない。 In order to obtain information related to changes in the sugar chain structure on the cell surface accompanying canceration and metastasis, it may be possible to use lectins that bind to sugar chains. Conventionally, as a lectin for detecting the above-mentioned core fucose, a yellow bamboo lectin (AAL) is known. AAL has an affinity for fucose of α1 → 2, α1 → 3, α1 → 4 and α1 → 6 bonds. However, as shown in Examples described later, in the detection method using AAL, there is no significant difference between the primary cancer and the metastatic cancer or the difference in malignancy.
そこで、本発明の課題は、大腸癌の悪性化や転移に伴う糖鎖構造の変化を、レクチンを用いて容易に判別する方法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for easily discriminating a change in a sugar chain structure accompanying malignancy or metastasis of colorectal cancer using a lectin.
本発明者らは、フコースα１→６糖鎖とのみ特異的に結合するレクチンを新規に単離した。このレクチンを用いて大腸癌腫瘍組織を組織学的に精査したところ、大腸癌腫瘍組織は癌化によりフコースが増加するが、悪性度の高い癌や転移癌ではα１→６結合フコースが減少していることを確認した。本発明者らはこれらの知見をもとに本発明を完成させた。すなわち、本発明は、大腸癌の腫瘍組織から採取した検体に、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有する
フコースα１→６特異的レクチンを作用させることを含む、大腸癌の判別方法を提供する。
The present inventors newly isolated a lectin that specifically binds only to the fucose α1 → 6 sugar chain. When colon cancer tumor tissue was examined histologically using this lectin, fucose increased due to canceration of colon cancer tumor tissue, but α1-> 6-linked fucose decreased in cancers with high malignancy and metastatic cancer. I confirmed. The present inventors have completed the present invention based on these findings. That is, the present invention provides a sample collected from a tumor tissue of colorectal cancer,
(1) can be extracted from basidiomycetes,
(2) The molecular weight by SDS electrophoresis is 4,000 to 40,000, and
(3) including the action of a fucose α1 → 6 specific lectin having an affinity represented by a binding constant of 1.0 × 10 4 M −1 or more (at 25 ° C.) on the fucose α1 → 6 sugar chain. A method for distinguishing colorectal cancer is provided.
上記レクチンは、フコースα１→６を有する糖鎖、糖ペプチドや糖タンパク質に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上という、従来よりも極めて高い親和性を有し、すなわち、フコースα１→６糖鎖構造を有する糖鎖を特異的に認識する。この特異性を利用した本発明は、悪性や転移性の大腸癌を判別することができる。すなわち、大腸癌で悪性度の低いものや原発癌では、α１→６結合フコースを含むL-フコース全般が増加する。一方、大腸癌の悪性度が高いものや転移癌では、α１→６結合フコースが減少する傾向がある。そこで、一次スクリーニングで大腸癌と診断された者の大腸癌の腫瘍組織に上記フコースα１→６特異的レクチンを作用させ、α１→６結合フコースの量を調べると、悪性度の高い大腸癌や転移癌の判別が可能となる。 The lectin has an extremely high affinity for sugar chains, glycopeptides and glycoproteins having fucose α1 → 6, which is a binding constant of 1.0 × 10 4 M −1 or more, that is, fucose α1. → Specifically recognizes sugar chains having 6 sugar chain structures. The present invention using this specificity can discriminate malignant or metastatic colorectal cancer. That is, L-fucose in general, including α1 → 6-linked fucose, increases in colon cancer with low malignancy and primary cancer. On the other hand, α1- → 6-linked fucose tends to decrease in colon cancer with high malignancy or metastatic cancer. Therefore, when the above-mentioned fucose α1 → 6 specific lectin is allowed to act on the tumor tissue of colon cancer of a person diagnosed with colorectal cancer in the primary screening and the amount of α1 → 6 binding fucose is examined, colon cancer or metastasis with high malignancy Cancer can be identified.
前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに、（４）フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことが好ましい。 It is preferable that the fucose α1 → 6 specific lectin further does not substantially bind to (4) a high mannose sugar chain and / or glycolipid not containing the fucose α1 → 6 sugar chain.
前記担子菌は、例えばモエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科又はタコウキン科に属する。前記担子菌は、特にツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケである。 The basidiomycete belongs to, for example, Moegitakeceae, Kisimeidae, Amanita or Tacokinaceae. The basidiomycetes are in particular Tsutsugitake, Sugitake, Numerisutaketake, Salmonella, Kuritake, Komurasajiji or Fly agaric.
前記検体には、便潜血検査、腫瘍マーカー、直腸指診、大腸内視鏡検査、バリウム注腸二重撮像法及びＣＴ（コンピュータ断層撮影）からなる群の少なくとも一種により大腸癌と診断されたものであることが好ましい。 The specimen was diagnosed as colon cancer by at least one of the group consisting of fecal occult blood test, tumor marker, digital rectal examination, colonoscopy, double barium enema imaging, and CT (computed tomography) It is preferable that
非特許文献２には、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）、ニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）、セイヨウニワトコレクチン（ＳＮＡ）、キカラスウリレクチン（ＴＪＡ）、ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）、ＰＨＡ（インゲンマメレクチン）、ドリコスマメレクチン（ＤＳＡ）、ラッパスイセン（ＮＰＡ）、ナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）、スノードロップレクチン（ＧＮＡ）、アマリリスレクチン（ＨＨＡ）、トマトレクチン（ＬＥＬ）、ジャガイモレクチン（ＳＴＡ）、イラクサレクチン（ＵＤＡ）、ジャックフルーツレクチン（Ｊａｃａｌｉｎ）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−Ｉ）、ミヤゴグサレクチン（Ｌｏｔｕｓ）、イヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）で大腸癌の組織がレクチン染色で陽性であることが報告されており、前記検体には、前記レクチンからなる群から選ばれる少なくとも一種を用いたレクチン染色で陽性であったものを用いることが可能である。より好ましくは、前記検体には、ＡＡＬ、ＬＣＡ、ＰＳＡ、ラッパスイセンレクチン、ソラマメレクチン、麹菌レクチン、ＵＥＡ−Ｉ及びＬｏｔｕｓからなる群から選ばれる少なくとも一種を用いたレクチン染色で陽性であったものを用いてもよい。 Non-Patent Document 2 includes chickpea lectin (AAL), lentil lectin (LCA), pea lectin (PSA), daffodils lectin (NPA), broad bean lectin (VFA), gonococcal lectin (AOL), Japanese chicken collectin ( SSA), chickpea collectin (SNA), yellow lectin lectin (TJA), castor lectin (RCA120), PHA (green bean lectin), dricos bean lectin (DSA), daffodils (NPA), bean lectin (ConA), snowdrop lectin (GNA), amaryllis lectin (HHA), tomato lectin (LEL), potato lectin (STA), nettle lectin (UDA), jackfruit lectin (Jacalin), harineishi lecti (UEA-I), Miyagogus lectin (Lotus), and canine endurectin (MAM) have been reported that colon cancer tissues are positive for lectin staining, and the specimen is selected from the group consisting of the lectins. It is possible to use those that were positive by lectin staining using at least one of the above. More preferably, the specimen is positive in lectin staining using at least one selected from the group consisting of AAL, LCA, PSA, daffodil lectin, broad bean lectin, Neisseria gonorrhoeae lectin, UEA-I and Lotus. It may be used.
前記検体には、フコシル化反応に必須のドナー基質であるＧＤＰ−フコースの合成経路の酵素の一つであるＧＤＰ−マンノースデヒドロゲナーゼ（ＧＭＤ）を認識する抗ＧＭＤ抗体を用いた組織染色で陽性であったものを用いてもよい。 The specimen was positive by tissue staining using an anti-GMD antibody that recognizes GDP-mannose dehydrogenase (GMD), which is one of enzymes in the synthesis pathway of GDP-fucose, which is an essential donor substrate for fucosylation reaction. May be used.
前記判別方法は、例えば標識した前記フコースα１→６特異的レクチンで前記検体をレクチン染色することからなる。 The discrimination method comprises, for example, lectin staining the specimen with the labeled fucose α1 → 6 specific lectin.
前記レクチン染色は、フコースα１→６特異的レクチンによる大腸癌の腫瘍組織の染色結果が、正常細胞の場合と同等かあるいはそれ以下であったら、悪性度が高いということを示唆することを含む。 The lectin staining includes suggesting that the degree of malignancy is high if the staining result of tumor tissue of colon cancer with fucose α1 → 6 specific lectin is equal to or less than that of normal cells.
前記悪性度が高いとは、大腸がんが将来転移しやすいこと、又は、分化度が未分化であることをいう。 The high malignancy means that colorectal cancer is likely to metastasize in the future, or that the degree of differentiation is undifferentiated.
本発明は、また、フコースα１→６特異的レクチンであって、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有する
前記フコースα１→６特異的レクチンを含む、大腸癌判別用診断薬又はキットを提供する。
The present invention is also a fucose α1 → 6 specific lectin,
(1) can be extracted from basidiomycetes,
(2) The molecular weight by SDS electrophoresis is 4,000 to 40,000, and
(3) Colorectal cancer discrimination comprising the fucose α1 → 6 specific lectin having an affinity of 1.0 × 10 4 M −1 or more (at 25 ° C.) for fucose α1 → 6 sugar chain A diagnostic agent or kit for use is provided.
前記大腸癌判別用診断薬又はキットには、大腸癌の一次スクリーニング用として、ＡＡＬ及び／又は抗ＧＭＤ抗体を含むことが好ましい。 The diagnostic agent or kit for distinguishing colorectal cancer preferably contains AAL and / or anti-GMD antibody for primary screening of colorectal cancer.
本発明の大腸癌の判別方法及び大腸癌判別用診断薬又はキットによれば、大腸癌患者等から採取された腫瘍組織を用いて調製された検体中の脱フコシル化を新規なα１→６特異的レクチンで検出することで、大腸癌の悪性度を客観的に評価できる可能性がある。すなわち、癌組織の一部にフコシル化欠損部を有する腫瘍は、将来的にどこか他の臓器に転移する可能性が高い悪性度の高い癌という予測診断ができる。また、転移リンパ節の染色から、悪性度を予測し、免疫療法、抗体医薬、抗がん薬等の治療法の選択の指標となり得る。 According to the method for distinguishing colorectal cancer and the diagnostic agent or kit for colorectal cancer discrimination according to the present invention, defucosylation in a specimen prepared using a tumor tissue collected from a colorectal cancer patient or the like is a novel α1 → 6 specific Detection with a target lectin may objectively evaluate the malignancy of colorectal cancer. That is, a tumor having a fucosylation defect in a part of cancer tissue can be predicted to be a highly malignant cancer that is likely to metastasize to some other organ in the future. In addition, the degree of malignancy can be predicted from staining of metastatic lymph nodes, and it can be used as an index for selection of treatment methods such as immunotherapy, antibody drugs, and anticancer drugs.
以下に、本発明の大腸癌の判別方法の一実施形態を説明する。本発明の方法は、大腸癌の腫瘍組織から採取した検体に、特定のフコースα１→６特異的レクチンを作用させることからなる。このレクチンで大腸癌腫瘍組織を染色すると、原発癌と転移癌とで陽性率に差が現れる（図９）。また、悪性度の違いでも陽性率に差が現れる（図１０）。本発明の方法がこの効果を奏するには、検体は、大腸癌の生検もしくは手術によって大腸癌と診断された腫瘍組織である必要がある。一次スクリーニングとして、従来公知の方法を用いることができる。例えば、腫瘍マーカー等が挙げられる。 Below, one Embodiment of the discrimination method of the colon cancer of this invention is described. The method of the present invention comprises allowing a specific fucose α1 → 6 specific lectin to act on a specimen collected from a tumor tissue of colorectal cancer. When colorectal cancer tumor tissue is stained with this lectin, there is a difference in positive rate between primary cancer and metastatic cancer (FIG. 9). In addition, a difference appears in the positive rate even with a difference in malignancy (FIG. 10). In order for the method of the present invention to exert this effect, the specimen needs to be a tumor tissue diagnosed as colorectal cancer by colorectal cancer biopsy or surgery. As the primary screening, a conventionally known method can be used. For example, a tumor marker etc. are mentioned.
上記腫瘍マーカーには、ＣＡ１９−９（ハプテン構造：２→３シアリルＬｅａ）、Ｃ−５０（２→３シアリルＬｅａ）、ＫＭ０１（２→３シアリルＬｅａ）ＣＡ１９５（ＬｅａとシアリルＬｅａ）等がある。これらの腫瘍マーカーを検出する手段には、腫瘍マーカーに特異的なモノクローナル抗体、腫瘍マーカーと親和性を有するレクチン等を用いることができる。 The tumor markers include CA19-9 (hapten structure: 2 → 3 sialyl Le a ), C-50 (2 → 3 sialyl Le a ), KM01 (2 → 3 sialyl Le a ) CA195 (Le a and sialyl Le a). ) Etc. As means for detecting these tumor markers, monoclonal antibodies specific for the tumor markers, lectins having affinity for the tumor markers, and the like can be used.
ＡＡＬは、図１の糖結合特異性の調査結果に示すように、α１→６結合フコースとα１→６結合以外のフコースとに親和性を有する。さらに、実施例１に示すように、ＡＡＬは、原発癌及び転移癌のいずれにも高い陽性率（図７）を示し、また、悪性度と陽性率との間で相関がない（図８）点で、大腸癌の一次スクリーニング用に好適である。 AAL has affinity for α1 → 6 linked fucose and fucose other than α1 → 6 linked, as shown in the investigation results of sugar binding specificity in FIG. Furthermore, as shown in Example 1, AAL shows a high positive rate (FIG. 7) for both primary cancer and metastatic cancer, and there is no correlation between the malignancy and the positive rate (FIG. 8). In this respect, it is suitable for primary screening for colorectal cancer.
上記レクチンを用いた大腸癌の検出方法には、従来公知のレクチン染色が有効である。 Conventionally known lectin staining is effective for the method of detecting colorectal cancer using the lectin.
レクチン染色の一例を以下に説明する。まず、腫瘍組織から検体を薄く切り出し、その薄片をガラスプレートに貼り付ける。ブロッキングバッファーにプレートを浸し、室温で緩く攪拌する。適宜、内因性ペルオキシダーゼ不活性化を行う。ビオチン標識レクチン溶液（２〜５μｇ／ｍｌにブロッキングバッファーで希釈）にメンブレンを浸し、室温で１時間、緩く撹拌する。西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識アビジン溶液にプレートを浸し、室温で緩く攪拌する。発色液にプレートを浸し、室温で数分間発色させる。発色が十分確認できたら純水で洗浄し、反応を停止させる。発色した組織を光学顕微鏡で観察する。レクチン染色には、市販のレクチン染色キットを用いることができる。 An example of lectin staining will be described below. First, a specimen is thinly cut from the tumor tissue, and the thin piece is attached to a glass plate. Immerse the plate in blocking buffer and mix gently at room temperature. Where appropriate, endogenous peroxidase inactivation is performed. The membrane is immersed in a biotin-labeled lectin solution (diluted with 2 to 5 μg / ml in blocking buffer), and gently stirred at room temperature for 1 hour. Immerse the plate in horseradish peroxidase (HRP) labeled avidin solution and gently stir at room temperature. Immerse the plate in the coloring solution and let it develop for several minutes at room temperature. When color development is sufficiently confirmed, wash with pure water to stop the reaction. The colored tissue is observed with an optical microscope. A commercially available lectin staining kit can be used for lectin staining.
大腸癌の検出には、従来公知のレクチン染色のほかに、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）法も採用可能である。また、ＦＡＣＳ法を用いて、本発明の大腸癌の判別方法も可能である。ＦＡＣＳ法は、細胞等の粒子１個ずつから、大きさ等の形態の情報、ならびに、ＤＮＡ／ＲＮＡ蛍光染色や、タンパク等を蛍光抗体で染色した蛍光の情報を得ることができる。既に、疾病診断の分野では、白血病や悪性リンパ腫等の造血器腫瘍の診断に応用されている。本発明の判別方法では、例えば、以下のように行うことができる。３〜４ｍｍ角の大腸癌組織を細かく裁断し、１０ｍＭ リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ ７．４、ＰＢＳ）に懸濁する。２１Ｇの針をつけた２．５ｍｌサイズのシリンジで、１０回程度強く出し入れし細胞をほぐした後、５０μｍのメッシュで細胞を濾過する。このように調製した大腸癌組織細胞に、蛍光標識したレクチンの溶液を直接的もしくは間接的に加えて、細胞とレクチンとを結合させる。その後、フローサイトメーター（例えば、ベックマンコールタール社製Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００）で、レクチンの結合した細胞の量や割合を分析する。 For detection of colorectal cancer, a flow cytometry (FACS) method can be employed in addition to the conventionally known lectin staining. In addition, the method for distinguishing colorectal cancer of the present invention using the FACS method is also possible. The FACS method can obtain information on the form such as size and fluorescence information obtained by staining DNA / RNA fluorescence or protein with a fluorescent antibody from each particle such as a cell. In the field of disease diagnosis, it has already been applied to the diagnosis of hematopoietic tumors such as leukemia and malignant lymphoma. In the determination method of the present invention, for example, it can be performed as follows. A 3-4 mm square colorectal cancer tissue is finely cut and suspended in 10 mM phosphate buffered saline (pH 7.4, PBS). A 2.5 ml syringe with a 21G needle is used to loosen the cells about 10 times and loosen the cells. Then, the cells are filtered through a 50 μm mesh. A fluorescently labeled lectin solution is added directly or indirectly to the thus prepared colon cancer tissue cells to bind the cells and the lectin. Thereafter, the amount and ratio of lectin-bound cells are analyzed using a flow cytometer (for example, Cytomics FC 500 manufactured by Beckman Coal Tar).
図１３及び１４に、抗ＧＭＤ抗体を用いた大腸癌の免疫組織染色を示す。抗ＧＭＤ抗体を用いた免疫染色は、大腸癌陽性率がＡＡＬより低いものの、原発癌／転移癌や悪性度に関する陽性率の挙動がＡＡＬと似ている。したがって、抗ＧＭＤ抗体もまた、大腸癌の一次スクリーニングに使用し得る。抗ＧＭＤ抗体を用いた大腸癌の検出法には、従来公知の免疫染色法等を採用する。 13 and 14 show immunohistochemical staining of colorectal cancer using an anti-GMD antibody. Although immunostaining using an anti-GMD antibody has a colorectal cancer positive rate lower than that of AAL, the behavior of the positive rate regarding primary cancer / metastatic cancer and malignancy is similar to that of AAL. Therefore, anti-GMD antibodies can also be used for primary screening of colorectal cancer. As a method for detecting colorectal cancer using an anti-GMD antibody, a conventionally known immunostaining method or the like is employed.
本発明の大腸癌の判別方法には、化学式：
示されるような糖鎖中のフコースα１→６結合を特異的に認識するレクチンの使用が必須である。本発明者らが単離した新規なレクチンは、本発明の大腸癌の判別方法に最適である。このレクチンを以下に詳述する。
The method for distinguishing colorectal cancer of the present invention includes a chemical formula:
It is essential to use a lectin that specifically recognizes fucose α1 → 6 bond in the sugar chain as shown. The novel lectin isolated by the present inventors is optimal for the colorectal cancer discrimination method of the present invention. This lectin is described in detail below.
（１）レクチンの由来
フコースα１→６特異的レクチンの由来となる原料は、担子菌である。担子菌の中でも、モエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科に属することが好ましい。モエギタケ科としては、ツチスギタケ、サケツバタケ、クリタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、ヌメリスギタケ等が挙げられる。キシメジ科としては、コムラサキシメジ等が挙げられる。タコウキン科としては、シロハカワラタケ、ツヤウチワタケ等が挙げられる。テングタケ科としては、ベニテングタケ等が挙げられる。これらの担子菌のうち、レクチンのフコースα１→６糖鎖認識特異性とレクチンの回収効率の観点から、モエギタケ科、キシメジ科又はテングタケ科が特に好ましく、さらに好ましくはツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケである。
(1) Origin of lectin The raw material from which fucose α1 → 6 specific lectin is derived is basidiomycete. Among basidiomycetes, it is preferable to belong to the Moegitake family, Kishimeji family, Octopus family and Amanita family. Examples of the Moegitake family include Tsutsugitake, Salmonella, Kuritake, Sugitake, Numerizugitake, Numerisugitake and the like. Examples of the xyme family include komula shimeji. Examples of the octopus kinaceae include white bamboo shoots and tsuchuuchitake. Examples of amanita mushrooms include fly agaric. Among these basidiomycetes, from the viewpoint of lectin fucose α1 → 6 sugar chain recognition specificity and lectin recovery efficiency, Moegiaceae, Kishimeji or Amanita are more preferred, and more preferred are Tsutsugitake, Sugitake, Numerisugitakemodoki, Salmonella , Kuritake, Komura Saxi-meji or Fly Agaric.
（２）レクチンの分子量
前記フコースα１→６特異的レクチンのＳＤＳ電気泳動法による分子量は、４，０００〜４０，０００であり、好ましくは４，０００〜２０，０００である。ここで、ＳＤＳ電気泳動法による分子量は、例えばＬａｅｍｍｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０頁，１９７６年）に準じて測定されるものである。上記分子量は、本明細書において、レクチンの単量体と複合体の両方を含む意味で使用される。
(2) Molecular weight of lectin The molecular weight of the fucose α1 → 6 specific lectin by SDS electrophoresis is 4,000 to 40,000, preferably 4,000 to 20,000. Here, the molecular weight by SDS electrophoresis is measured according to the Laemmi method (Nature, 227, 680, 1976), for example. In the present specification, the molecular weight is used to include both a lectin monomer and a complex.
（３）レクチンの結合定数
前記フコースα１→６特異的レクチンのフコースα１→６糖鎖に対する結合定数は、１．０×１０４Ｍ−１以上であり、好ましくは１．０×１０５Ｍ−１以上、さらに好ましくは１．０×１０６Ｍ−１以上である。すなわち、フコースα１→６に親和性を有することが従来知られているＡＡＬ、ＡＯＬ、ＬＣＡ、ＮＰＡ及びＰＳＡと比べて、結合定数が著しく高い。これは、前記フコースα１→６特異的レクチンが、従来のレクチンと比べて極めて高い選択性をもってフコースα１→６糖鎖と結合することを意味する。
(3) Binding constant of lectin The binding constant of the fucose α1 → 6 specific lectin to the fucose α1 → 6 sugar chain is 1.0 × 10 4 M −1 or more, preferably 1.0 × 10 5 M −. 1 or more, more preferably 1.0 × 10 6 M −1 or more. That is, the binding constant is significantly higher than AAL, AOL, LCA, NPA and PSA which are conventionally known to have an affinity for fucose α1 → 6. This means that the fucose α1 → 6 specific lectin binds to the fucose α1 → 6 sugar chain with extremely high selectivity compared to the conventional lectin.
上記結合定数は、例えばフロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ法）により測定することができる。ＦＡＣ法の詳細は、例えば、本出願人の一部が出願したＰＣＴ／ＪＰ２００９／００３３４６に記載されている。ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００３３４６を参照のために本明細書に編入する。 The binding constant can be measured by, for example, frontal affinity chromatography (FAC method). Details of the FAC method are described in, for example, PCT / JP2009 / 003346 filed by a part of the present applicant. PCT / JP2009 / 003346 is incorporated herein by reference.
フコースα１→６糖鎖は、その非還元末端にシアル酸を有していてもよい。従来のフコースα１→６特異的レクチン（例えばＬＣＡ、ＮＰＡ及びＰＳＡ）は、非還元末端にシアル酸を有するフコースα１→６糖鎖に対して親和性が低かった。一方、前記フコースα１→６特異的レクチンは、このような糖鎖に対しても高い親和性を有する点でも従来のものより優れる。 The fucose α1 → 6 sugar chain may have sialic acid at its non-reducing end. Conventional fucose α1 → 6 specific lectins (eg, LCA, NPA and PSA) have low affinity for fucose α1 → 6 sugar chains having sialic acid at the non-reducing end. On the other hand, the fucose α1 → 6 specific lectin is superior to the conventional one in that it has a high affinity for such a sugar chain.
（４）レクチンの特異性
前記フコースα１→６特異的レクチンは、フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことが好ましい。これにより、前記フコースα１→６特異的レクチンは、より一層高い結合特異性を有する。本明細書において、「実質的に結合しない」とは、結合定数が１．０×１０３Ｍ−１以下、好ましくは１．０×１０２Ｍ−１以下、特に好ましくは０であることを意味する。
(4) Specificity of lectin It is preferable that the fucose α1 → 6 specific lectin does not substantially bind to a high mannose sugar chain and / or glycolipid not containing fucose α1 → 6 sugar chain. Thereby, the fucose α1 → 6 specific lectin has a higher binding specificity. In the present specification, “substantially does not bind” means that the binding constant is 1.0 × 10 3 M −1 or less, preferably 1.0 × 10 2 M −1 or less, particularly preferably 0. means.
（５）レクチンの分岐鎖への結合
前記フコースα１→６特異的レクチンは、フコースα１→６Ｎ結合型の一本、二本、三本及び／又は四本糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有することが好ましく、より好ましくは結合定数１．０×１０５Ｍ−１以上で示される親和性を有する。
(5) Binding of lectin to branched chain The fucose α1 → 6 specific lectin has a binding constant of 1.0 for one, two, three and / or four sugar chains of fucose α1 → 6N bond type. It preferably has an affinity shown by 10 4 M −1 or more (at 25 ° C.), and more preferably has an affinity shown by a binding constant of 1.0 × 10 5 M −1 or more.
（６）レクチンのアミノ酸配列
フコースα１→６特異的レクチンは、特に、表１の配列番号１に示すような共通のアミノ酸構造を有する。配列番号１の第４、５、６及び７番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ａｓｎ／Ｇｌｕ／Ｔｈｒ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ及びＧｌｎ／Ｌｙｓ／Ｇｌｕを意味し、その斜線は「又は」を意味する。
(6) Amino acid sequence of lectin The fucose α1 → 6 specific lectin particularly has a common amino acid structure as shown in SEQ ID NO: 1 in Table 1. The fourth, fifth, sixth and seventh Xaas of SEQ ID NO: 1 mean Asp / Asn / Glu / Thr, Thr / Ser / Ala, Tyr / Phe and Gln / Lys / Glu, respectively, Or ".
本発明の方法に使用し得るフコースα１→６特異的レクチンの具体例を、配列番号２〜６に示す。 Specific examples of fucose α1 → 6 specific lectin that can be used in the method of the present invention are shown in SEQ ID NOs: 2 to 6.
配列番号２に示すレクチンは、ツチスギタケから抽出することのできる、分子量４，５００の新規なレクチン（以下、ＰＴＬという）である。配列番号２の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第２０、２３、２７、３３、３５及び３９番目のＸａａは、それぞれ、Ｔｙｒ／Ｓｅｒ、Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ａｓｎ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ／Ｓｅｒ、Ａｓｎ／Ａｌａ、及び、Ｔｈｒ／Ｇｌｎである。ＰＴＬの糖結合特異性を図４に示す。 The lectin shown in SEQ ID NO: 2 is a novel lectin (hereinafter referred to as PTL) having a molecular weight of 4,500, which can be extracted from Tsutsugitake. The 10th and 17th Xaas of SEQ ID NO: 2 may be any amino acid residue, but are preferably Cys. The 20th, 23rd, 27th, 33th, 35th and 39th Xaas are Tyr / Ser, Phe / Tyr, Arg / Lys / Asn, Asp / Gly / Ser, Asn / Ala, and Thr / Gln, respectively. . The sugar binding specificity of PTL is shown in FIG.
配列番号３に示すレクチンは、サケツバタケから抽出することのできる、分子量４，５００の新規なレクチン（以下、ＳＲＬという）である。配列番号３の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第４、７、９、１３、２０、２７、２９、３３、３４及び３９番目のＸａａは、それぞれ、Ｐｒｏ／Ｇｌｙ、Ｇｌｕ／Ｌｙｓ、Ｖａｌ／Ａｓｐ、Ａｓｎ／Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｈｉｓ／Ｓｅｒ、Ｌｙｓ／Ｈｉｓ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｇｌｙ／Ａｓｎ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、及び、Ａｒｇ／Ｔｈｒである。ＳＲＬの糖結合特異性を図５に示す。 The lectin shown in SEQ ID NO: 3 is a novel lectin (hereinafter referred to as SRL) having a molecular weight of 4,500 that can be extracted from salmon bamboo. The 10th and 17th Xaas of SEQ ID NO: 3 may be any amino acid residue, but are preferably Cys. The 4th, 7th, 9th, 13th, 20th, 27th, 29th, 33th, 34th and 39th Xaas are Pro / Gly, Glu / Lys, Val / Asp, Asn / Asp / Glu, His / Ser, Lys, respectively. / His, Val / Ile, Gly / Asn / Ser, Ala / Thr, and Arg / Thr. The sugar binding specificity of SRL is shown in FIG.
配列番号４に示すレクチンは、コムラサキシメジから抽出することのできる、分子量４，５００の新規なレクチン（以下、「ＬＳＬ」という）である。配列番号４の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１、４、７、８、９、１３、１６、２０、２２、２５、２７、３１及び３４番目のＸａａは、それぞれ、Ａｌａ／Ｇｌｎ、Ｐｒｏ／Ｌｙｓ、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｍｅｔ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｔｙｒ／Ｔｈｒ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｙｓ／Ｇｌｕ、Ａｌａ／Ａｓｎ、Ｖａｌ／Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ａｓｎ、Ｇｌｎ／Ａｒｇ、及び、Ｔｈｒ／Ｖａｌである。 The lectin shown in SEQ ID NO: 4 is a novel lectin (hereinafter referred to as “LSL”) having a molecular weight of 4,500, which can be extracted from komura saxifish. The 10th and 17th Xaas of SEQ ID NO: 4 may be any amino acid residue, but are preferably Cys. 1st, 4th, 7th, 8th, 9th, 13th, 16th, 20th, 22nd, 25th, 27th, 31st and 34th Xaa are Ala / Gln, Pro / Lys, Ala / Ser, Met / Ile / Val, respectively. , Tyr / Thr, Asp / Asn, Lys / Glu, Ala / Asn, Val / Asp / Asn, Asp / Asn, Arg / His / Asn, Gln / Arg, and Thr / Val.
配列番号５に示すレクチンは、クリタケから抽出することのできる新規なレクチン（以下、「ＮＳＬ」という）である。配列番号５の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１３、１４及び１６番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、及び、Ｇｌｎ／Ｌｙｓである。 The lectin shown in SEQ ID NO: 5 is a novel lectin (hereinafter referred to as “NSL”) that can be extracted from Kuritake. The 10th and 17th Xaa of SEQ ID NO: 5 may be any amino acid residue, but is preferably Cys. The thirteenth, fourteenth and sixteenth Xaas are Asp / Thr, Ser / Ala, and Gln / Lys, respectively.
配列番号６に示すレクチンもまた、クリタケから抽出することのできる、分子量４，５００の新規なレクチン（以下、「ＮＳＬ」という）である。配列番号６は、配列番号５のペプチド中に１個のＡｓｎが挿入された変異体である。したがって、配列番号６の第１０及び１８番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１４、１５及び１７番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ及びＧｌｎ／Ｌｙｓである。 The lectin shown in SEQ ID NO: 6 is also a novel lectin having a molecular weight of 4,500 (hereinafter referred to as “NSL”) that can be extracted from Kurita mushroom. SEQ ID NO: 6 is a mutant in which one Asn is inserted into the peptide of SEQ ID NO: 5. Accordingly, the 10th and 18th Xaas of SEQ ID NO: 6 may be any amino acid residue, but is preferably Cys. The 14th, 15th and 17th Xaas are Asp / Thr, Ser / Ala and Gln / Lys, respectively.
配列番号２〜６のレクチンがサブユニットとなって、通常、２〜１０個、好ましくは２〜３個結合したものもまた、フコースα１→６特異的レクチンとして使用可能である。 A lectin of SEQ ID NOs: 2 to 6 is a subunit, and usually 2 to 10 and preferably 2 to 3 bound lectins can also be used as a fucose α1 → 6 specific lectin.
ＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ及びＬＳＬと、従来、フコース特異的レクチンといわれているＡＡＬ、ＡＯＬ、ＬＣＡ及びＰＳＡの各種糖鎖（図１５及び図１６参照）への結合定数（２５℃において）を、表２〜４に列記する。 Binding constants (at 25 ° C.) to PTL, SRL, NSL and LSL and various sugar chains (see FIGS. 15 and 16) of AAL, AOL, LCA and PSA, which are conventionally referred to as fucose-specific lectins, Listed in 2-4.
表２〜４中、ＡＡＬ及びＡＯＬは、フコースα１→６糖鎖（糖鎖Ｎｏ．１５、２０１−２０３、４０１−４１８）とともに、非α１→６である糖脂質系のフコース糖鎖（糖鎖Ｎｏ．７１８、７２２、７２３、７２７、９０９、９１０、９３３）にも結合する。また、ＬＣＡ及びＰＳＡは、フコースα１→６糖鎖を持たない多くの糖鎖（糖鎖Ｎｏ．００３、００５−０１４）にも結合する。 In Tables 2 to 4, AAL and AOL are fucose α1 → 6 sugar chains (sugar chains No. 15, 201-203, 401-418) and non-α1 → 6 glycolipid fucose sugar chains (sugar chains) No. 718, 722, 723, 727, 909, 910, 933). LCA and PSA also bind to many sugar chains (sugar chains No. 003, 005-014) having no fucose α1 → 6 sugar chain.
それに対して、ＰＴＬ及びＳＲＬは、フコースα１→６糖鎖に確実に結合し、かつ非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖に全く結合していない。しかも、ＰＴＬの結合定数は、従来のレクチンよりも大きい（結合定数がＫａ＝１．０×１０５Ｍ−１以上）。さらに、フコースα１→６糖鎖の三本鎖（糖鎖Ｎｏ．４０７−４１３）や四本鎖（糖鎖Ｎｏ．４１８）にも強く結合する。また、シアル酸が付加されていても（糖鎖Ｎｏ．６０１、６０２）、フコースα１→６糖鎖の結合定数が下がっていない。 On the other hand, PTL and SRL are surely bound to fucose α1 → 6 sugar chains and not bound to non-fucose α1 → 6 sugar chains or sugar chains having no fucose. Moreover, the binding constant of PTL is larger than that of conventional lectins (binding constant is K a = 1.0 × 10 5 M −1 or more). Further, it also strongly binds to three chains (sugar chain No. 407-413) and four chains (sugar chain No. 418) of fucose α1 → 6 sugar chain. Further, even when sialic acid is added (sugar chains No. 601 and 602), the binding constant of fucose α1 → 6 sugar chain is not lowered.
ＮＳＬ及びＬＳＬもまた、フコースα１→６糖鎖のみを検出し、非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖を全く検出していない。さらに、フコースα１→６糖鎖の三本鎖や四本鎖にも強く結合する。また、シアル酸が付加されていても、フコースα１→６糖鎖に結合定数が下がらない。 NSL and LSL also detect only fucose α1 → 6 sugar chains, and do not detect non-fucose α1 → 6 sugar chains or sugar chains without fucose at all. Furthermore, it also strongly binds to the triple or quadruple fucose α1 → 6 sugar chain. In addition, even when sialic acid is added, the binding constant of fucose α1 → 6 sugar chain does not decrease.
フコースα１→６特異的レクチンは、（ａ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチドの他に、（ｂ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであってもよい。ここで、「機能的に同等」とは、フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上であり、好ましくは１．０×１０５Ｍ−１以上、さらに好ましくは１．０×１０６Ｍ−１以上で示される親和性を有することを意味する。（ｂ）の変異体の一例が、配列番号６に示すタンパク質又はペプチドである。 In addition to the protein or peptide consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 5 (b) in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 5, It may be a protein or peptide functionally equivalent to a protein or peptide having one or more amino acids deleted, inserted or substituted and having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 5. Here, “functionally equivalent” means a binding constant of 1.0 × 10 4 M −1 or more with respect to fucose α1 → 6 sugar chain, preferably 1.0 × 10 5 M −1 or more, Preferably, it means having an affinity of 1.0 × 10 6 M −1 or more. An example of the mutant (b) is the protein or peptide shown in SEQ ID NO: 6.
前記フコースα１→６特異的レクチンは、特に好ましくはＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ及びＬＳＬであり、さらに好ましくはＰＴＬ及びＳＲＬである。ＰＴＬ及びＳＲＬは、従来のフコースα１→６親和性レクチンと相違して、フコースα１→６以外のフコースや、フコースを持たない高マンノース糖鎖と結合しない点で、本発明の判別方法に使用するフコースα１→６特異的レクチンとして最適である。 The fucose α1 → 6 specific lectin is particularly preferably PTL, SRL, NSL and LSL, and more preferably PTL and SRL. Unlike conventional fucose α1 → 6 affinity lectin, PTL and SRL are used in the determination method of the present invention in that they do not bind to fucose other than fucose α1 → 6 or high mannose sugar chains that do not have fucose. It is optimal as a fucose α1 → 6 specific lectin.
フコースα１→６特異的レクチンは、担子菌から、公知の抽出方法、分離方法、精製方法等を適宜組み合わせることにより、単離することができる。例えば、水系媒体を抽出溶媒として用いて、担子菌の水系媒体抽出物を得る工程を含む。この前記抽出物から、ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００、好ましくは４，０００〜２０，０００、及び、フコースα１→６糖鎖に対する結合定数が１．０×１０４Ｍ−１以上、好ましくは１．０×１０５Ｍ−１以上、さらに好ましくは１．０×１０６Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有するレクチンを得る。 The fucose α1 → 6 specific lectin can be isolated from basidiomycetes by appropriately combining known extraction methods, separation methods, purification methods and the like. For example, it includes a step of obtaining an aqueous medium extract of basidiomycetes using an aqueous medium as an extraction solvent. From this extract, the molecular weight by SDS electrophoresis is 4,000 to 40,000, preferably 4,000 to 20,000, and the binding constant for fucose α1 → 6 sugar chain is 1.0 × 10 4 M. -1 or more, preferably 1.0 × 10 5 M −1 or more, more preferably 1.0 × 10 6 M −1 or more (at 25 ° C.).
前記担子菌は、モエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科の少なくとも一種から選ばれることが好ましい。特に、ツチスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ Ｏｖｅｒｈｏｌｔｓ）、スギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ｓｑｕａｒｒｏｓａ （Ｆｒ．） Ｋｕｍｍｅｒ）、ヌメリスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ａｄｉｐｏｓａ （Ｆｒ．） Ｋｕｍｍｅｒ）、ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ nameko）、サケツバタケ（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ ｒｕｇｏｓｏａｎｎｕｌａｔａ Ｆａｒｌｏｗ ｉｎ Ｍｕｒｒ．）、クリタケ（Ｎａｅｍａｔｏｌｏｍａ ｓｕｂｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ （Ｆｒ．） Ｋａｒｓｔ又はＨｙｐｈｏｌｏｍａ ｓｕｂｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ（Ｆｒ．）Ｑｕｅｌ）等のモエギタケ科、コムラサキシメジ（Ｌｅｐｉｓｔａ ｓｏｒｄｉｄａ （Ｓｃｈｕｍ． ： Ｆｒ．） Ｓｉｎｇ．）等のキシメジ科、シロハカワラタケ（Ｔｒｉｃｈａｐｔｕｍ ｅｌｏｎｇａｔｕｍ）、ツヤウチワタケ（Ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ ｖｅｒｎｉｃｉｐｅｓ）等のタコウキン科、ベニテングタケ（Ａｍａｎｉｔａ ｍｕｓｃａｒｉａ）等のテングタケ科に属するものが好ましい。これらの担子菌の使用部位は、子実体であることが好ましい。 It is preferable that the basidiomycete is selected from at least one of Moegiaceae, Kisimeidae, Octopusaceae, and Amanita. In particular, Tsuchisugitake (Pholiota terrestris Overholts), Pholiota squarrosa (Pholiota squarrosa (Fr.) Kummer), Numerisugitake (Pholiota adiposa (Fr.) Kummer), nameko (Pholiota nameko), stropharia rugosoannulata (Stropharia rugosoannulata Farlow in Murr.), Hypholoma lateritium (Naematoloma sublaterium (Fr.) Karst or Hyphoroma sublaterium (Fr.) Quelaceae, such as Lepista sordida (Schum .: Fr.) Sing. tum elongatum), Tsuyauchiwatake (Microporus vernicipes) Takoukin family, etc., fly agaric (Amanita muscaria) is preferably one belonging to the Amanita family, and the like. The site of use of these basidiomycetes is preferably a fruiting body.
水系媒体と担子菌の子実体とから、水系媒体抽出物を得る方法については、水系媒体と担子菌の子実体とを接触させることができれば特に制限はない。抽出効率の観点から、水系媒体中で担子菌の子実体を粉砕して懸濁液とする方法が好ましい。また、粉砕する方法としては、ミキサー、ホモジナイザー等を用いた通常の粉砕方法を挙げることができる。 The method for obtaining the aqueous medium extract from the aqueous medium and the fruiting body of the basidiomycete is not particularly limited as long as the aqueous medium and the fruiting body of the basidiomycete can be brought into contact with each other. From the viewpoint of extraction efficiency, a method of pulverizing basidiomycetous fruit bodies in an aqueous medium to form a suspension is preferred. Moreover, as a method to grind | pulverize, the normal grinding | pulverization method using a mixer, a homogenizer, etc. can be mentioned.
上記水系媒体としては、緩衝液、水と混合し得る有機溶媒と水又は緩衝液との混合物等を挙げることができる。好ましくは、緩衝液又は有機溶媒と緩衝液との混合物を用いる。 Examples of the aqueous medium include a buffer solution, a mixture of an organic solvent that can be mixed with water, and water or a buffer solution. Preferably, a buffer solution or a mixture of an organic solvent and a buffer solution is used.
上記緩衝液としては、特に制限されることなく公知の緩衝液を用いることができる。中でも、ｐＨ３〜１０の範囲に緩衝能を有するものが好ましく、ｐＨ６〜８の範囲に緩衝能を有するものがより好ましい。具体的には、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等を挙げることができる。中でも、抽出効率の観点から、リン酸緩衝液が好ましい。 The buffer solution is not particularly limited, and a known buffer solution can be used. Especially, what has a buffer capacity in the range of pH 3-10 is preferable, and what has a buffer capacity in the range of pH 6-8 is more preferable. Specific examples include a phosphate buffer, a citrate buffer, an acetate buffer, and a Tris buffer. Among these, a phosphate buffer is preferable from the viewpoint of extraction efficiency.
前記緩衝液の塩濃度は、特に制限はないが、抽出効率と緩衝能の点から、１〜１００ｍＭであることが好ましく、５〜２０ｍＭであることがより好ましい。 Although the salt concentration of the said buffer solution does not have a restriction | limiting in particular, From the point of extraction efficiency and a buffer capacity, it is preferable that it is 1-100 mM, and it is more preferable that it is 5-20 mM.
前記緩衝液は、さらに塩類を含むことができる。例えば、リン酸緩衝液に食塩を更に加えたリン酸緩衝化生理食塩水等は、水系媒体として好ましい。 The buffer may further contain salts. For example, phosphate buffered physiological saline obtained by further adding sodium chloride to a phosphate buffer is preferable as the aqueous medium.
前記有機溶媒としては、水と混合し得る有機溶媒であれば特に制限なく用いることができる。中でも、アセトン、メタノール、エタノール、２−プロパノール及びアセトニトリルが好ましい。有機溶媒と水又は緩衝液とを混合する場合の有機溶媒の含有量としては、１０〜４０質量％であることが好ましい。 As the organic solvent, any organic solvent that can be mixed with water can be used without particular limitation. Of these, acetone, methanol, ethanol, 2-propanol and acetonitrile are preferable. As content of the organic solvent in the case of mixing an organic solvent and water or a buffer solution, it is preferable that it is 10-40 mass%.
前記抽出工程は、水系媒体と担子菌の子実体との混合物から、水系媒体に対する不溶物を除去する工程を更に含むことが好ましい。不溶物の除去方法としては、濾過、遠心分離等の方法を挙げることができるが、除去効率の観点から遠心分離が好ましい。 It is preferable that the extraction step further includes a step of removing insoluble matters with respect to the aqueous medium from the mixture of the aqueous medium and the fruiting bodies of basidiomycetes. Examples of the method for removing insoluble materials include filtration, centrifugation, and the like, but centrifugation is preferred from the viewpoint of removal efficiency.
前記抽出工程は、リン酸緩衝化生理食塩水中で、担子菌の子実体を粉砕し、遠心分離によって不溶物を除去して水系媒体抽出物を得る工程であることが特に好ましい。 The extraction step is particularly preferably a step of pulverizing basidiomycetous fruit bodies in phosphate buffered saline and removing insolubles by centrifugation to obtain an aqueous medium extract.
前記フコースα１→６特異的レクチンの製造方法では、以下のいずれかの精製手段を採用すると、一層効率的な精製が可能となる。 In the method for producing a fucose α1 → 6 specific lectin, more efficient purification can be achieved by employing any of the following purification means.
（精製方法１）
上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法にかけることによってレクチン含有画分を得て、得られたレクチン画分を疎水クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーで精製する。
(Purification method 1)
The aqueous medium extract obtained by the above step is subjected to ammonium sulfate precipitation to obtain a lectin-containing fraction, and the obtained lectin fraction is purified by hydrophobic chromatography and reverse phase chromatography.
（精製方法２）
上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、チログロブリンをアガロース等に固定した担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーに供して精製する。
(Purification method 2)
The aqueous medium extract obtained by the above process is purified by subjecting it to affinity chromatography using a carrier in which thyroglobulin is fixed to agarose or the like.
（精製方法３）
上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法にかけることによってレクチン含有画分を得て、透析凍結乾燥を行った後、粗レクチン画分をトリス緩衝液に溶解後、イオン交換クロマトグラフィーに供し、得られた活性画分を濃縮後、ゲルろ過クロマトグラフィーで分離する。
(Purification method 3)
The aqueous medium extract obtained in the above step is subjected to ammonium sulfate precipitation to obtain a lectin-containing fraction, and after dialysis lyophilization, the crude lectin fraction is dissolved in a Tris buffer, and then ion exchange chromatography. The resulting active fraction is concentrated and then separated by gel filtration chromatography.
フコースα１→６特異的レクチンの製造方法には、前記精製工程で得られたレクチンを含む画分を透析処理する工程と、透析処理後のレクチン溶液を凍結乾燥する工程とを含んでもよい。これにより、レクチンを容易に単離することができる。透析処理する工程及び凍結乾燥する工程は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。 The method for producing a fucose α1 → 6 specific lectin may include a step of dialysis treatment of the fraction containing the lectin obtained in the purification step, and a step of freeze-drying the lectin solution after the dialysis treatment. Thereby, a lectin can be isolated easily. The step of dialysis treatment and the step of freeze-drying can be performed by a commonly used known method.
（ａ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、若しくは、（ｂ）配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２〜５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチンは、天然植物からの抽出のほかに、天然由来とは異なる宿主内で人工的に発現させ、又は化学合成させてもよい。宿主内での発現や化学合成は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。 (A) a protein or peptide comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 5, or (b) one or more amino acids deleted or inserted in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 5 Alternatively, fucose α1 → 6 specific lectin, which is a protein or peptide that is substituted and functionally equivalent to the protein or peptide having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 5, is extracted from natural plants. Furthermore, it may be artificially expressed in a host different from the natural origin, or may be chemically synthesized. Expression and chemical synthesis in the host can be performed by a commonly used known method.
大腸癌患者から採取された腫瘍組織は、適宜、凍結保存や、ホルマリン、パラフィン、パラホルムアルデヒド等の固定液で固定することができる。凍結保存等した腫瘍組織から切片を作成し、上記フコースα１→６特異的レクチンを作用させる検体とする。 Tumor tissue collected from patients with colorectal cancer can be appropriately frozen and fixed with a fixative such as formalin, paraffin, paraformaldehyde or the like. A section is prepared from a tumor tissue cryopreserved or the like, and used as a specimen on which the above fucose α1 → 6 specific lectin acts.
上記フコースα１→６特異的レクチンを検体に作用させる方法は、上記ＡＡＬと同様である。特に、組織の形態を維持しながら観察するレクチン染色が好ましい。 The method of allowing the fucose α1 → 6 specific lectin to act on the specimen is the same as that of the AAL. In particular, lectin staining that is observed while maintaining the morphology of the tissue is preferable.
フコースα１→６特異的レクチンによるレクチン染色では、通常、レクチンに標識手段が組み込まれている。標識手段は、特に制限なく、公知の標識化方法を適用可能である。例えば、放射性同位元素による標識化、標識化合物の結合等を挙げることができる。標識化合物としては、この用途に適したものであれば特に制限なく、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素若しくは蛍光化合物を挙げることができる。具体的には、ビオチン、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅ等を挙げることができる。これらの標識化合物は、常法によりレクチンと結合させることができる。 In lectin staining with a fucose α1 → 6 specific lectin, a labeling means is usually incorporated into the lectin. The labeling means is not particularly limited, and a known labeling method can be applied. For example, labeling with a radioisotope, binding of a labeled compound, and the like can be mentioned. The labeling compound is not particularly limited as long as it is suitable for this application, and examples thereof include a direct or indirect labeling compound, an enzyme, or a fluorescent compound. Specific examples include biotin, digoxigenin, horseradish-derived peroxidase, fluorescein isothiocyanate, and CyDye. These labeling compounds can be bound to lectins by a conventional method.
標識したフコースα１→６特異的レクチンでのレクチン染色の手順は、ＡＡＬによる一次スクリーニングで説明したものと同様である。 The procedure of lectin staining with a labeled fucose α1 → 6 specific lectin is the same as that described in the primary screening with AAL.
大腸癌の悪性度の低いもの（例えば低転移性の原発癌）では、α１→６結合フコースが大腸組織の正常細胞よりも増加する。一方、大腸癌の悪性度が高いもの（例えば転移癌や、今後、転移が予測される原発癌）では、α１→６結合フコースが正常細胞と同等か正常細胞よりも減少する傾向がある。 In colon cancer with a low malignancy (for example, a low-metastatic primary cancer), α1 → 6 linked fucose is increased as compared with normal cells of colon tissue. On the other hand, when the malignancy of colorectal cancer is high (for example, metastatic cancer or a primary cancer in which metastasis is predicted in the future), α1- → 6-linked fucose tends to be equal to or less than that of normal cells.
レクチン染色において、フコースα１→６特異的レクチンによる大腸癌の腫瘍組織の染色結果が、正常細胞の場合と同等かあるいはそれ以下であったら、大腸癌の悪性又は転移性を疑う。 In the case of lectin staining, if the staining result of the tumor tissue of colon cancer with fucose α1 → 6 specific lectin is equal to or less than that of normal cells, the malignancy or metastasis of colon cancer is suspected.
前記悪性は、転移しやすい、あるいは局所浸潤しやすいことを意味する。一般的に、未分化癌は分化癌に較べて悪性度が高いと言われている。 The malignant means that it is easy to metastasize or to infiltrate locally. Generally, undifferentiated cancer is said to have a higher degree of malignancy than differentiated cancer.
本発明は、また、フコースα１→６特異的レクチンであって、
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、及び、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有するフコースα１→６特異的レクチンを含む、大腸癌判別用診断薬又はキットを提供する。上記レクチンは、標識されていることが好ましい。
The present invention is also a fucose α1 → 6 specific lectin,
(1) can be extracted from basidiomycetes,
(2) The molecular weight by SDS electrophoresis is 4,000 to 40,000, and
(3) For colorectal cancer discrimination comprising fucose α1 → 6 specific lectin having an affinity of 1.0 × 10 4 M −1 or higher (at 25 ° C.) for fucose α1 → 6 sugar chain A diagnostic or kit is provided. The lectin is preferably labeled.
上記診断薬又はキットには、適宜、緩衝液、プレートガラス等のレクチン染色キットに公知のものを含む。大腸癌の一次スクリーニング用として、ＡＡＬ及び／又は抗ＧＭＤ抗体を含むことが好ましい。 The diagnostic agent or kit appropriately includes those known in lectin staining kits such as buffer solutions and plate glass. For primary screening of colorectal cancer, it is preferable to include AAL and / or anti-GMD antibody.
以下に、本発明の実施例を示して、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔調製例１〕ＰＴＬの製造
以下に示す精製工程に従って、ツチスギタケからツチスギタケレクチン（ＰＴＬ）を単離精製した。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples of the present invention. However, the present invention is not limited to the following examples.
[Preparation Example 1] Production of PTL According to the purification steps shown below, Tsutsugitake lectin (PTL) was isolated and purified from Tsutsugitake.
（抽出）
ツチスギタケ約７．５ｇを凍結乾燥して得られたツチスギタケ凍結乾燥粉末２．５ｇに、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍｌを加えて、４℃下で２時間抽出した。この液を、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して１回目の抽出液を得た。この抽出残渣に、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）を５０ｍｌ加えて、４℃下で一晩抽出した。この液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して２回目の抽出液を得た。これらの抽出液を合わせてろ紙でろ過し、ツチスギタケ抽出液とした。
(Extraction)
50 ml of 10 mM Tris buffer (pH 7.2) was added to 2.5 g of lyophilized powder obtained by lyophilizing about 7.5 g of tsutsugitake, followed by extraction at 4 ° C. for 2 hours. This solution was centrifuged (15,000 rpm, 20 min, 4 ° C.), and the supernatant was subjected to gauze filtration to obtain a first extract. To this extraction residue, 50 ml of 10 mM Tris buffer (pH 7.2) was added and extracted overnight at 4 ° C. This solution was centrifuged (15,000 rpm, 20 min, 4 ° C.), and the supernatant was subjected to gauze filtration to obtain a second extract. These extracts were combined and filtered through a filter paper to obtain Tsutsugitake extract.
（イオン交換クロマトグラフィー）
上記抽出液８７ｍｌを、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に供した。同緩衝液でカラムを洗浄後、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出した。赤血球凝集活性を示す画分（図２の←→部）を合一し、限外ろ過で脱塩後凍結乾燥した。
(Ion exchange chromatography)
87 ml of the extract was subjected to DEAE-Sepharose (GE Healthcare Bioscience) equilibrated with 10 mM Tris buffer (pH 7.2). The column was washed with the same buffer and then eluted with 10 mM Tris buffer (pH 7.2) containing 0.1 M NaCl. Fractions showing hemagglutination activity (← → part in FIG. 2) were combined, desalted by ultrafiltration and lyophilized.
（アフィニティクロマトグラフィー）
上記凍結乾燥粉末を、１０ｍＭ リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４、以後、ＰＢＳと略す）で溶解し、同緩衝液で平衡化したチログロブリン固定化アガロースに供した。ＰＢＳでカラムを洗浄後、０．２Ｍ アンモニアで溶出した。赤血球凝集活性を示す画分（図３の←→部）を合一し、限外ろ過で純水に置換後、凍結乾燥し、ＰＴＬを１．０７ｍｇ得た。
(Affinity chromatography)
The lyophilized powder was dissolved in 10 mM phosphate buffered saline (pH 7.4, hereinafter abbreviated as PBS), and subjected to thyroglobulin-immobilized agarose equilibrated with the same buffer. The column was washed with PBS and eluted with 0.2 M ammonia. Fractions exhibiting hemagglutination activity (← → part in FIG. 3) were combined, replaced with pure water by ultrafiltration, and lyophilized to obtain 1.07 mg of PTL.
〔実施例１〕大腸癌腫瘍組織の組織染色
ＡＡＬは、α１→２、α１→３、１−４、及び１→６結合のフコースを認識し、ＰＴＬはα１→６結合のフコースを特異的に認識する。そのため、この２種類のレクチンによる染色レベルを比較することにより、フコシル化の結合様式の違いを知ることができる。
[Example 1] Tissue staining of colorectal cancer tumor tissue AAL recognizes α1 → 2, α1 → 3, 1-4, and 1 → 6 linked fucose, and PTL specifically recognizes α1 → 6 linked fucose. recognize. Therefore, by comparing the staining levels of these two types of lectins, it is possible to know the difference in the fucosylation binding mode.
ヒト大腸癌腫瘍組織アレイに対して、ＰＴＬ、ＡＡＬ及び抗ＧＭＤ抗体による免疫組織染色を行った。正常組織の中の実質細胞は、わずかに褐色に染まる。その染色レベルを、本明細書では、「弱陽性（分類１）」と定義した。この染色レベルを基準として、染色結果と名称を表５のように分類した。 Immunohistochemical staining with PTL, AAL and anti-GMD antibody was performed on a human colon cancer tumor tissue array. Parenchymal cells in normal tissue are stained slightly brown. The staining level is defined herein as “weakly positive (Category 1)”. Based on this staining level, the staining results and names were classified as shown in Table 5.
（ＡＡＬによる組織染色）
組織染色の試料として、組織アレイ（倉敷紡績株式会社製、合計１９７例の大腸癌腫瘍組織及び正常組織）を入手した。この組織を脱パラフィンした後、ＰＢＳにて洗浄し、Ｄａｋｏ ＡＢＩＤＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ／ＢＩＯＴＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ （Ｄａｋｏ社）を用いてブロッキング処理（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行った。次いで、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｄａｋｏ社）で内因性ペルオキシダーゼ不活性化を行い、５％子ウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭ トリス干緩衝化生理食塩水（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む）（以下、５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴと記載する）を用いて４℃にて一昼夜、振蘯させた。５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴにて、ビオチン標識ＡＡＬを５μｇ／ｍｌに希釈した。希釈したビオチン標識レクチンを上記組織アレイに添加して、室温にて１時間反応させ、ＰＢＳにて洗浄した。予め５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴにてＡＢＣ ＲＥＡＧＥＮＴ（フナコシ社）を５０倍希釈して振蘯させたものを添加し、室温で３０分間、反応させた。Ｄａｋｏ ＥＮＶＩＳＩＯＮキット／ＨＲＰ ＤＡＢ基質キット（Ｄａｋｏ社）を５０倍希釈した後、組織アレイに添加して、１０×４０倍の顕微鏡で発色を確認した。分類０〜３の顕微鏡写真を図６に示す。
(Tissue staining with AAL)
A tissue array (manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd., 197 colorectal cancer tumor tissues and normal tissues) was obtained as a tissue staining sample. This tissue was deparaffinized, washed with PBS, and subjected to blocking treatment (avidin-biotin blocking) using Dako ABIDIN SOLUTION / BIOTIN SOLUTION (Dako). Subsequently, endogenous peroxidase inactivation was performed with Dako Cytomation Peroxidase Blocking Reagent (Dako), and 10 mM Tris-buffered saline (containing 0.02% Tween 20) containing 5% calf serum albumin (hereinafter, including 5% Tween 20) % BSA-TBST) and shaken overnight at 4 ° C. Biotin-labeled AAL was diluted to 5 μg / ml with 5% BSA-TBST. Diluted biotin-labeled lectin was added to the tissue array, reacted at room temperature for 1 hour, and washed with PBS. A solution prepared by diluting ABC REAGENT (Funakoshi Co., Ltd.) 50 times in advance with 5% BSA-TBST was added and reacted at room temperature for 30 minutes. The Dako ENVISION kit / HRP DAB substrate kit (Dako) was diluted 50-fold, then added to the tissue array, and color development was confirmed with a 10 × 40-fold microscope. FIG. 6 shows micrographs of classifications 0 to 3.
１）原発癌と転移癌との違いによる群分けと組織染色の結果
ＡＡＬ染色した大腸癌症例１２８例を、原発癌又は転移癌の２種類に分類した。結果を表６に示す。
1) Results of grouping and tissue staining according to difference between primary cancer and metastatic cancer 128 cases of colon cancer with AAL staining were classified into two types, primary cancer or metastatic cancer. The results are shown in Table 6.
表６中、全分類に占める分類２及び３の割合を、大腸癌の陽性率と定義した。そして、図７に、原発癌と転移癌とでＡＡＬ染色の陽性率を比較したグラフを示す。陽性率について、カイ二乗検定法による有意差検定を行った。ＡＡＬ染色では、原発癌、転移癌ともに、強陽性のものが多く、有意差は見られなかった。 In Table 6, the ratio of classifications 2 and 3 in all classifications was defined as the positive rate of colorectal cancer. FIG. 7 shows a graph comparing the positive rates of AAL staining between primary cancer and metastatic cancer. About the positive rate, the significant difference test by the chi-square test method was performed. In AAL staining, both primary and metastatic cancers were strongly positive, and no significant difference was observed.
２）悪性度による群分けと組織染色の結果
組織アレイの添付書には、大腸癌の悪性度に応じてＧｒａｄｅ １〜３までの等級が付けられていた。Ｇｒａｄｅが上がることは、組織学的悪性度が高くなることを意味するが、Ｇｒａｄｅに関する詳しい説明は添付書になかった。そこで、各Ｇｒａｄｅの腺癌組織を観察し、Ｇｒａｄｅを表７に示すように定義した。さらに、Ｇｒａｄｅ ２及びＧｒａｄｅ ３を、悪性と評価した。
2) Results of grouping according to malignancy and tissue staining Grades from Grade 1 to 3 were attached to the appendix of the tissue array according to the malignancy of colorectal cancer. Increasing Grade means increasing histological grade, but there was no detailed explanation on Grade in the attached document. Therefore, the adenocarcinoma tissue of each Grade was observed, and Grade was defined as shown in Table 7. Furthermore, Grade 2 and Grade 3 were evaluated as malignant.
大腸癌症例１１２例をＧｒａｄｅ別に分類し、Ｇｒａｄｅ間でのＡＡＬ染色結果の比較を行った。結果を表８に示す。 112 cases of colorectal cancer were classified according to Grade, and AAL staining results were compared between Grades. The results are shown in Table 8.
表８に示すとおり、ＡＡＬ染色では、Ｇｒａｄｅに関係なく強陽性のものが多かった。図８に、Ｇｒａｄｅ（悪性度）別の陽性率を示す。Ｇｒａｄｅ間の陽性率について、カイ二乗検定法により有意差検定を行った。Ｇｒａｄｅ間で陽性率の有意な差は見られなかった。 As shown in Table 8, many AAL stainings were strongly positive regardless of Grade. FIG. 8 shows positive rates by Grade (grade). About the positive rate between Grades, the significant difference test was performed by the chi-square test method. There was no significant difference in positive rate between Grades.
（ＰＴＬによる組織染色）
レクチン染色の検体として、ＡＡＬ染色と同じ組織アレイ（倉敷紡績株式会社製）を入手した。この組織を脱パラフィンした後、ＰＢＳにて洗浄し、Ｄａｋｏ ＡＢＩＤＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ／ＢＩＯＴＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ （Ｄａｋｏ社）を用いてａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇを行った。Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｄａｋｏ社）で内因性ペルオキシダーゼ不活性化を行い、５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴを用いて４℃にて一昼夜、振蘯させた。
(Tissue staining with PTL)
As a specimen for lectin staining, the same tissue array (manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.) as AAL staining was obtained. The tissue was deparaffinized, washed with PBS, and avidin-biotin blocking was performed using Dako ABIDIN SOLUTION / BIOSIN SOLUTION (Dako). Endogenous peroxidase was inactivated with Dako Cytomation Peroxidase Blocking Reagent (Dako) and shaken overnight at 4 ° C. with 5% BSA-TBST.
５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴにて、ビオチン標識ＰＴＬを５０μｇ／ｍｌに希釈した。組織アレイに希釈したレクチンを添加して、室温にて１時間反応させ、ＰＢＳにて洗浄した。予め５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴにてＡＢＣ ＲＥＡＧＥＮＴ（フナコシ社）を５０倍希釈して振蘯させたものを添加し、室温で３０分間、反応させた。Ｄａｋｏ ＥＮＶＩＳＩＯＮキット／ＨＲＰ ＤＡＢ基質キット（Ｄａｋｏ社）を５０倍希釈した後、組織アレイに添加して、１０×４０倍の顕微鏡で発色を確認した。 Biotin-labeled PTL was diluted to 50 μg / ml with 5% BSA-TBST. Diluted lectins were added to the tissue array, reacted at room temperature for 1 hour, and washed with PBS. A solution prepared by diluting ABC REAGENT (Funakoshi Co., Ltd.) 50 times in advance with 5% BSA-TBST was added and reacted at room temperature for 30 minutes. The Dako ENVISION kit / HRP DAB substrate kit (Dako) was diluted 50-fold, then added to the tissue array, and color development was confirmed with a 10 × 40-fold microscope.
１）原発癌と転移癌との違いによる群分けと組織染色の結果
ＰＴＬで染色した大腸癌症例１１６例を、原発癌又は転移癌の２種類に分類した。結果を表９に示す。
1) Results of grouping and tissue staining according to difference between primary cancer and metastatic cancer 116 cases of colon cancer stained with PTL were classified into two types, primary cancer or metastatic cancer. The results are shown in Table 9.
表９に示すとおり、転移癌は、原発癌と比べて、分類２及び３の割合が減少していた。図９に、原発癌と転移癌との陽性率を比較したグラフを示す。カイ二乗検定法による有意差検定を行ったところ、原発癌と転移癌の間との間で陽性率に有意な差が見られた（Ｐ＜０．０１）。 As shown in Table 9, metastatic cancers had a reduced proportion of classifications 2 and 3 compared to primary cancers. FIG. 9 shows a graph comparing the positive rates of primary cancer and metastatic cancer. When a significant difference test by chi-square test was performed, a significant difference was found in the positive rate between primary cancer and metastatic cancer (P <0.01).
２）悪性度による群分けと組織染色の結果
大腸癌症例１１４例をＧｒａｄｅ別に分類し、Ｇｒａｄｅ間での染色結果の比較を行った。結果を表１０に示す。
2) Results of grouping and tissue staining according to malignancy The 114 colorectal cancer cases were classified by Grade, and the staining results were compared between Grades. The results are shown in Table 10.
表１０に示すとおり、ＰＴＬ染色では、Ｇｒａｄｅ ２及びＧｒａｄｅ ３において、分類２及び３の割合が減少した。図１０に、各Ｇｒａｄｅでの陽性率を示す。カイ二乗検定法により有意差検定を行ったところ、Ｇｒａｄｅ １とＧｒａｄｅ ２及びＧｒａｄｅ ３との間で、陽性率に有意な差が見られた（ｐ＜０．０５）。 As shown in Table 10, in PTL staining, the ratio of classifications 2 and 3 decreased in Grade 2 and Grade 3. FIG. 10 shows the positive rate in each grade. When a significant difference test was performed by the chi-square test method, a significant difference was observed in the positive rate between Grade 1, Grade 2, and Grade 3 (p <0.05).
上記のＡＡＬ染色及びＰＴＬ染色の結果から、以下のことが判明した。ＡＡＬで認識されるα１→２、α１→３、１−４、及び１→６結合を含む総体的なフコシル化は、癌化により増加した。一方、悪性度の高い癌や転移癌では、フコシル化には変化がないが、ＰＴＬで認識されるα１→６結合のフコシル化が低下した。 From the results of the above AAL staining and PTL staining, the following was found. Overall fucosylation, including α1 → 2, α1 → 3, 1-4, and 1 → 6 linkages recognized by AAL, increased with canceration. On the other hand, in high-grade cancer and metastatic cancer, fucosylation was not changed, but fucosylation of α1 → 6 bond recognized by PTL was decreased.
（ＡＡＬ染色とＰＴＬ染色の併用）
上記ＡＡＬ染色で分類３（強陽性）となった原発癌及び転移癌の症例８８例から、同一ロットの組織を準備し、さらにＰＴＬ染色した。結果を表１１に示す。
(Combination of AAL staining and PTL staining)
Tissues of the same lot were prepared from 88 cases of primary cancer and metastatic cancer that were classified as Category 3 (strongly positive) by the AAL staining, and further PTL stained. The results are shown in Table 11.
表１１に示すとおり、原発癌ではＡＡＬ染色が「強陽性」であれば、ＰＴＬ染色も「強陽性」もしくは「陽性」である組織が多数を占めた。一方、転移癌では、ＡＡＬ染色で「強陽性」であっても、ＰＴＬ染色では「弱陽性」もしくは「陰性」のものが多数を占めた。図１１に、原発癌と転移癌の間で陽性率を比較したグラフを示す。カイ二乗検定法により有意差検定を行ったところ、原発癌と転移癌との間で陽性率に有意差が見られた（ｐ＜０．０１）。図１２には、組織アレイの同一サンプルでＡＡＬ染色が強陽性かつＰＴＬ染色が陰性となった顕微鏡写真を示す。 As shown in Table 11, when the AAL staining was “strongly positive” in the primary cancer, many tissues were also “strongly positive” or “positive” in the PTL staining. On the other hand, among metastatic cancers, many were “weakly positive” or “negative” in PTL staining even though they were “strongly positive” by AAL staining. FIG. 11 shows a graph comparing the positive rates between primary cancer and metastatic cancer. When a significant difference test was performed by the chi-square test method, a significant difference was observed in the positive rate between primary cancer and metastatic cancer (p <0.01). FIG. 12 shows a photomicrograph of the same sample in the tissue array in which AAL staining was strongly positive and PTL staining was negative.
原発癌ではＡＡＬで認識されるα１→２、α１→３、１−４及び１→６結合のフコシル化が総体的に増加しているが、転移癌ではα１→６結合のフコシル化が低下する傾向にあることがさらに明確になった。これらの知見をもとに、大腸の組織細胞をＡＡＬ染色して大腸癌を一次スクリーニングし、大腸癌と診断された検体についてＰＴＬ染色することで、大腸癌のリンパ節転移を含めた悪性度の予測診断として、情報を得ることができる。 In primary cancers, the fucosylation of α1 → 2, α1 → 3, 1-4, and 1 → 6 bonds recognized by AAL is generally increased, whereas in the metastatic cancer, fucosylation of α1 → 6 bonds is decreased. It became clearer that there was a tendency. Based on these findings, colon tissue cells are AAL-stained for primary screening of colorectal cancer, and specimens diagnosed with colorectal cancer are PTL-stained. Information can be obtained as a predictive diagnosis.
〔応用例１〕
本発明の大腸癌の判別方法に供する大腸癌の腫瘍組織の一次スクリーニングとして、抗ＧＭＤ抗体によるアッセイが可能であるか調査した。
[Application Example 1]
It was investigated whether an assay using an anti-GMD antibody was possible as a primary screening for colorectal tumor tissue used in the colorectal cancer discrimination method of the present invention.
（抗ＧＭＤ抗体による免疫染色）
免疫組織染色のサンプルとして、レクチン免疫染色と同じで２種類の組織アレイによる合計１４３例の大腸癌腫瘍組織及び正常組織を入手した。この組織を脱パラフィンした後、内因性ペルオキシダーゼ不活性化までレクチン免疫染色と同様に処理をした。
(Immunostaining with anti-GMD antibody)
As samples for immunohistochemical staining, a total of 143 colon cancer tumor tissues and normal tissues were obtained in the same manner as lectin immunostaining using two types of tissue arrays. The tissue was deparaffinized and then treated in the same manner as lectin immunostaining until endogenous peroxidase inactivation.
Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ（Ｄａｋｏ社）を添加して１０分静置した。ＰＢＳで洗浄後、抗ＧＭＤ抗体（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １７， １３１１−１３２０， ２００７参照。阪大三善研にて作成）をＤａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｄａｋｏ社）で５μｇ／ｍｌに希釈したものを添加し、４℃にて一昼夜反応させた。 Dako Cytoprotein Protein Block Serum-Free Ready-to-use (Dako) was added and allowed to stand for 10 minutes. After washing with PBS, an anti-GMD antibody (see Glycobiology 17, 1311-1320, 2007. Prepared by Sanzen Lab., Osaka Univ.) Diluted with Dako Cytomation Antibody Diluent (Dako) at 5 μg / ml was added, and 4 ° C. In the day and night reaction.
ＰＢＳで洗浄後、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋Ｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ−ＨＲＰ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ（Ｄａｋｏ社）で作製した２次抗体を添加して３０分室温で反応させた。以降、レクチン免疫染色と同様にして、発色を観察した。 After washing with PBS, a secondary antibody prepared by Dako Cytomation Envision + R System Labeled Polymer-HRP Anti-Rabbit (Dako) was added and allowed to react at room temperature for 30 minutes. Thereafter, color development was observed in the same manner as lectin immunostaining.
１）原発癌と転移癌との違いによる群分けと組織染色の結果
免疫染色した大腸癌症例１１２例を、原発癌又は転移癌の２種類に分類した。結果を表１２に示す。
1) Results of grouping and tissue staining according to difference between primary cancer and metastatic cancer 112 cases of immunostained colon cancer cases were classified into two types, primary cancer or metastatic cancer. The results are shown in Table 12.
表１２に示すとおり、免疫染色は、分類０（陰性）及び分類１（弱陽性）の割合が高かった。図１３に、原発癌と転移癌とで免疫染色の陽性率を比較したグラフを示す。カイ二乗検定法による有意差検定を行ったところ、原発癌と転移癌とで陽性率に有意差は見られなかった。 As shown in Table 12, the ratio of classification 0 (negative) and classification 1 (weak positive) was high in immunostaining. FIG. 13 shows a graph comparing the positive rates of immunostaining between primary cancer and metastatic cancer. When a significant difference test by chi-square test was performed, no significant difference was found in the positive rate between primary cancer and metastatic cancer.
２）悪性度による群分けと組織染色の結果
大腸癌症例８６例をＧｒａｄｅ別に分類し、Ｇｒａｄｅ間での染色結果の比較を行った。結果を表１３に示す。
2) Results of grouping by malignancy and results of tissue staining 86 colorectal cancer cases were classified by Grade, and the staining results were compared between Grades. The results are shown in Table 13.
表１３に示すとおり、免疫染色では、Ｇｒａｄｅに関係なく、陰性及び弱陽性のものが多かった。図１４に、Ｇｒａｄｅ（悪性度）別の陽性率を示す。Ｇｒａｄｅ間の陽性率について、カイ二乗検定法により有意差検定を行ったが、Ｇｒａｄｅ間で陽性率の有意な差は見られなかった。 As shown in Table 13, many immunostainings were negative and weakly positive regardless of Grade. FIG. 14 shows positive rates by Grade (grade). About the positive rate between Grades, the significant difference test was performed by the chi-square test method, but the significant difference of the positive rate was not seen between Grades.
抗ＧＭＤ抗体を用いた免疫染色の結果は、陽性率は低いものの、ＡＡＬ染色と同様の挙動を示した。このことから、ＡＡＬの代わりに抗GMD抗体を用いて、大腸癌患者の一次スクリーニングを行い、大腸癌と診断された患者の検体をさらにＰＴＬ等のフコースα１→６特異的レクチンで染色することで、実施例１と同様の結果が得られることが予想される。 The results of immunostaining using an anti-GMD antibody showed the same behavior as AAL staining, although the positive rate was low. Based on this, primary screening of colorectal cancer patients was performed using anti-GMD antibody instead of AAL, and specimens of patients diagnosed with colorectal cancer were further stained with fucose α1 → 6 specific lectin such as PTL. It is expected that the same result as in Example 1 is obtained.
Claims (9)
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有し、及び
（４）フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しない
フコースα１→６特異的レクチンを作用させることを含む、大腸癌から悪性又は転移性の癌を検出する方法。 In specimens taken from tumor tissue of colorectal cancer,
(1) can be extracted from basidiomycetes,
(2) The molecular weight by SDS electrophoresis is 4,000-40,000 ,
(3) possess an affinity represented by fucose [alpha] 1 → 6 bond constants 1.0 × 10 4 M -1 or more relative to sugar (at 25 ° C.), and
(4) including exerting substantially not bind <br/> fucose [alpha] 1 → 6 specific lectin relative high mannose sugar chains and / or glycolipids not including fucose [alpha] 1 → 6 sugar chain, from colon cancer A method for detecting malignant or metastatic cancer .
（１）担子菌から抽出することができ、
（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００〜４０，０００であり、
（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ−１以上（２５℃において）で示される親和性を有し、及び
（４）フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しない
前記フコースα１→６特異的レクチンを含む、大腸癌から悪性又は転移性の癌を検出する診断薬又はキット。 A fucose α1 → 6 specific lectin,
(1) can be extracted from basidiomycetes,
(2) molecular weight by SDS electrophoresis is Ri der 4,000～40,000,
(3) having an affinity represented by a binding constant of 1.0 × 10 4 M −1 or more (at 25 ° C.) for fucose α1 → 6 sugar chain ; and
(4) malignant or metastasized from colorectal cancer containing the fucose α1 → 6 specific lectin that does not substantially bind to a high mannose sugar chain and / or glycolipid not containing fucose α1 → 6 sugar chain A diagnostic agent or kit for detecting sex cancer .
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