JP5229093B2 - 骨成長に対するエストロゲン作用の判定 - Google Patents
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(1) 雄新生子ラットに対して、アロマターゼ阻害剤の投与により内因性エストロゲンの産生を抑制した条件下で、被検物質を投与し、次いで陰茎骨の長さを測定することを含む、被検物質の骨代謝に対するエストロゲン作用の判定方法。
(2) アロマターゼ阻害剤を妊娠雌ラットの周産期およびその産子の新生子期に投与する、上記(1) 記載の方法。
(3) 上記(1) または(2) 記載のエストロゲン作用の判定方法を用いて、試料中のエストロゲン様作用物質を検出する方法。
(4) 雄新生子ラットに対して、候補物質を投与し、次いで陰茎骨の骨成長を調べることにより、アロマターゼの阻害によるエストロゲンの産生の抑制の有無を判定することを含む、候補物質のアロマターゼ阻害作用の判定方法。
(5) 候補物質を妊娠雌ラットの周産期およびその産子の新生子期に投与する、上記(4) 記載の方法。
本発明の別の態様は、候補物質のアロマターゼ阻害作用の判定方法であり、この方法は雄新生子ラットの新生子期において候補物質を投与し、次いで陰茎骨の骨成長を調べることにより、アロマターゼの阻害によるエストロゲンの産生の抑制の有無を判定することを含む。
ラット陰茎骨はアンドロゲン依存性に成長すると考えられていたが、アンドロゲンがどのように陰茎骨に作用しているかは知られていない。実施例1では、ラット陰茎骨の骨長と、アンドロゲン受容体(AR)、エストロゲン受容体α(ER)、アロマターゼの発現分布について、年齢を追って調べた。骨長は軟X線装置を用い、受容体およびアロマターゼの発現については免疫組織化学染色法を用いて実験を行った。その結果、陰茎骨は生後1〜40日に著しく成長した。ARは陰茎骨原基である間葉組織に広範に発現したが、成長期の陰茎骨の軟骨や骨芽細胞などの骨組織には発現しなかった。一方でERやアロマターゼは陰茎骨成長の早期段階である1〜40日において、軟骨細胞や骨芽細胞で発現が認められた。以上より、アンドロゲンは陰茎骨付近にて局所的にエストロゲンに置換されて骨成長に関与すると考えられた。
(材料と方法)
供試動物には、Wistar-Imamichi系ラットを用いた。1、2、5、10、20、40、60、120、180日齢の雄ラットを、それぞれ3匹ずつ用いた。全てのラットは標準的条件下(室温21±1℃、明暗周期12時間)で飼育し、ラット用固形試料および飲料水を自由に摂取させた。
(結果)
陰茎骨は5日齢ごろに分化し、40日までに著しく成長することが示された(図1)。陰茎骨は生後1〜40日に著しく成長した。ARは陰茎骨原基である間葉組織に広範に発現したが、5日以降の骨分化した陰茎骨の軟骨や骨芽細胞などの骨組織には発現しなかった。一方でERやアロマターゼは陰茎骨成長の早期段階である1〜40日において、軟骨細胞や骨芽細胞で発現が認められた。これらの発現は40日以降において著しく低下した(図3、4、表1)。詳しくは下記に示す。
1.軟X線所見(図1)
陰茎骨近位部:1および2日齢の陰茎には陰茎骨近位部の陰影は認められず、5日齢の陰茎で初めて針状の微小な陰影が観察された。陰茎骨近位部の陰影の長さの成長は、20日齢まで急速に進行した後、その成長度が暫減し、60日齢以降にはプラトーに達した。また、5日齢には針状を呈した骨陰影は、徐々に短軸方向にも成長して太さを増し、10〜40日齢には近位端のやや膨らんだ楊枝様を呈した。短軸方向は特に20〜120日齢にかけて急速に成長し、60日齢以降には全体的に太さを増した骨陰影は、近位端の膨らんだマンドリン様を呈した。
2.免疫組織化学的所見(図2〜4、表1)
図2におけるA、Bはそれぞれ図3および図4で観察した大まかな位置を示す。
(1) 抗AR抗体
ARは、1および2日齢の陰茎の陰茎骨原基となる間葉細胞において広範に陽性を示した。5および10日齢には、ARは骨周囲層に発現したが、膜性骨および硝子軟骨で陽性反応は認められなかった。40日齢以降の陰茎骨ではARの陽性反応は認められなかった。
(2) 抗アロマターゼ抗体
1および2日齢の陰茎の陰茎骨原基において、アロマターゼの陽性反応は認められなかった。5〜40日齢には膜性骨の骨形成層および硝子軟骨の軟骨細胞に陽性反応が認められた。60日齢の陰茎骨では、膜性骨の骨形成層で弱い染色性を示すのみとなり、120日齢以降は近位部での陽性反応が認められなかった。
(3) 抗ER抗体
1および2日齢の陰茎では、ERの陽性反応を示す細胞が陰茎骨形成予定領域に散在した。5〜10日齢には、ERは膜性骨の骨形成層、骨芽細胞および軟骨細胞で陽性反応を示した。40日齢以降はERの陽性反応は認められなかった。
実施例1のとおりアンドロゲンがエストロゲンに置換されて効果を及ぼすのであれば、アロマターゼ阻害によって骨長が短縮するはずである。実施例2では、妊娠雌ラットの周産期およびその産子の新生子期にアロマターゼ阻害剤(ATD)を0.5 mg/30 μl皮下投与し、エストロゲンの合成されない条件にしたときの陰茎骨の大きさを比較した。生後10日の陰茎骨を採材し、軟X線装置にて骨長を測定したところ、通常骨長の平均が2.1 mmだったのに対し、ATD投与群では1.7 mm程度と、陰茎骨長が有意に低下した。以上より、内因性のエストロゲン産生を抑制した場合、陰茎骨がエストロゲンの作用を受けることができず、骨成長が抑制されることが示唆された。
(材料と方法)
供試動物には、Wistar-Imamichi系ラットを用いた。性成熟に達した雌ラット(200〜280g)8匹とその雄新生子29匹を用いた。全てのラットは標準的条件下(室温21±1℃、明暗周期12時間)で飼育し、ラット用固形試料および飲料水を自由に摂取させた。
(結果)
周産期アロマターゼ阻害の影響(図5)
ATD投与群では、体重とは無関係に陰茎骨長が減少する傾向が認められた。偽薬投与群とATD投与群で、10日齢の新生雄ラットの陰茎骨近位部長を比較した。両群で体重に有意差は認められなかった。通常骨長の平均が2.1 mmだったのに対し、ATD投与群では1.7 mm程度と、陰茎骨長が有意に低下した。
通常の骨の成長は性成熟の後も続くことから、長い実験期間が必要である。また、通常の骨はアンドロゲンとエストロゲンの両方の受容体を持ち、二つの作用が混在するため結果は複雑になる。しかし、実施例1でみられたように、陰茎骨は性成熟前には成長が終了するうえ、エストロゲン受容体しか存在しない。このため、実施例2の様な内在性エストロゲン産生を阻害した幼若ラットに、エストロゲン様作用物質を投与すれば、その物質がもつ骨成長への影響を素早く調べられると考えられる。実施例3では、アロマターゼ阻害ラットにエストロゲンの一種であるestradiol 17βを投与し、エストロゲンが陰茎骨の成長に及ぼす影響を調べた。幼若雄ラット8匹を実験に用いた。生後1日目より1日おきに、ATD 0.5 mg/30μlもしくはATD 0.5 mg + estradiol 17β10 ng/30μlを同ラットに皮下投与した。生後12日目に陰茎骨を採材し、軟X線装置にて陰茎近位骨長を測定したところ、ATDのみ投与した群に比べ、estradiol 17βを同時投与した群の陰茎骨長は有意に増加した(111±3.3%)。以上より、本実施例に沿った実験法を用いることで、エストロゲン様作用物質の骨成長に対する影響を簡便に測定できることが示唆された。
(材料と方法)
供試動物には、Wistar-Imamichi系ラットを用いた。母親ラット(2匹)とその雄新生子(同腹6匹、計12匹)を用いた。ラットは標準的な環境条件 (室温21±1℃、明暗周期12時間)で飼育し、母親ラットにはラット用固形試料および飲料水を自由に摂取させた。
(結果)
ATD投与とともにEを投与したときの陰茎骨長の変化(図6)
2腹の新生子ラットにおいて実験を行った結果、ATD群の陰茎骨長は2.26±0.086 mmだったのに対し、ATD+E群の陰茎骨長は2.52±0.102 mmと、陰茎骨の伸長が観察された。ATD投与群の陰茎骨長の平均値を腹ごとにそれぞれ100 (%)として、ATD+E投与群の変化率を求めたところ、ATDのみ投与した群に対し、estradiol 17βの同時投与群では111±3.3 %と、陰茎骨長の有意な増加が観察された。
Claims (5)
- 雄新生子ラットに対して、アロマターゼ阻害剤の投与により内因性エストロゲンの産生を抑制した条件下で、被検物質を投与し、次いで陰茎骨の長さを測定することを含む、被検物質の骨代謝に対するエストロゲン作用の判定方法。
- 雄新生子ラットに対する内因性エストロゲンの産生の抑制を、アロマターゼ阻害剤を、該雄新生子ラットを分娩する前の妊娠雌ラットの周産期に投与しておき、次いでその雄の産子の新生子期に投与することにより行うことを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 請求項1または2記載のエストロゲン作用の判定方法を用いて、試料中のエストロゲン様作用物質を検出する方法。
- 雄新生子ラットにおいて、候補物質を投与し、次いで陰茎骨の骨成長を調べることにより、アロマターゼの阻害によるエストロゲンの産生の抑制の有無を判定することを含む、候補物質のアロマターゼ阻害作用の判定方法。
- 候補物質の投与を、前記雄新生子ラットを分娩する前の妊娠雌ラットの周産期、次いでその雄の産子の新生期に行い、該雄新生子ラットの陰茎骨の骨成長を調べることを特徴とする、請求項4記載の方法。
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