JP5221355B2

JP5221355B2 - 治療及び診断用途のための選択的αｖβ３レセプターペプチドアンタゴニスト

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Publication number: JP5221355B2
Application number: JP2008534912A
Authority: JP
Inventors: デル・ガット，アンナリタ; ザッカロ，ラウラ; ペドーネ，カルロ; サヴィアーノ，ミケーレ
Original assignee: Advanced Accelerator Applications SA
Current assignee: Advanced Accelerator Applications SA
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2006-10-09
Publication date: 2013-06-26
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Description

発明の背景
インテグリンは、細胞−細胞接着プロセスおよび細胞−マトリックス接着プロセスにおいて重要な役割を演じるヘテロダイマー膜貫通細胞表面レセプターのファミリーのメンバーである（Hynes, R.O. Cell 1992, 69, 11-25）。これらのレセプターは、定められた組み合わせにおいて非共有結合的に会合するα−サブユニットおよびβ−サブユニットからなる（Eble, J.A. Integrin-Ligand Interaction; Springer: Heidelberg, 1997; pp 1-40）。それらの大部分は、多くの細胞外マトリックスタンパク質（即ちビトロネクチン）（Serini, G.; et al. A sticky business. Exp. Cell. Res. 2005, in press）およびへび毒ディスインテグリン（Ruoslahti, E.; Pierschbacher, M. Cell 1986, 44, 517-518; D'Souza, S.R.; et al. Trends Biochem. Sci. 1991, 16, 246-250; Gould, R.J.; et al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1990, 195, 168-171）において見出されるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）トリアッドを認識する。種々のインテグリンがＲＧＤ配列を含有する種々のタンパク質を認識するとしても、いくつかの研究は、高アフィニティーリガンドのＲＧＤ配列をフランキングするアミノ酸残基はインテグリン複合体との相互作用のそれらの特異性をモデュレーションすることを証明した。文献で報告された多数の研究にもかかわらず、種々のインテグリンサブタイプに対するリガンド選択性は、依然として難題である。その理由は主として、インテグリンサブタイプの三次元構造の大部分は未知のままであるからである（Marinelli, L.; et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 4166-4177）。

このレセプタークラスの徹底的に研究されたメンバーは、インテグリンα_ｖβ_３である。このインテグリンは、活性化された内皮細胞およびメラノーマ細胞上に強く発現されるが、対照的に、それは静止血管（quiescent blood vessels）および腫瘍前メラノーマ（pre-neoplastic melanomas）において弱く発現される（Hood, J.D.; Cheresh, D.A. Nat. Rev. Cancer 2002, 2, 91-100）。α_ｖβ_５インテグリンとともに、α_ｖβ_３は、血管新生および組織修復を含む生理学的プロセスおよび病理学的状態、例えば腫瘍で誘導された血管新生（Eliceiri, B.P.; Cheresh, D. A. J. Clin. Invest. 1999, 103, 1227-1230; Kumar, C. C. Curr, Drug Targets 2003, 4, 123-131）、腫瘍細胞移動および浸潤（Clezardin, P. Cell. Mol. Life Sci. 1998, 54, 541-546）に関与することが報告されている。両インテグリンはビトロネクチンへの細胞接着を促進しそして同じプロセスに参加するという事実にもかかわらず、それらは異なるシグナリング事象に応答するように構造的にデザインされていることが報告されている。以前の研究は、ｂＦＧＦで誘導された血管新生はα_ｖβ_３により媒介されるが、これに対してＶＥＧＦで誘導される血管新生はα_ｖβ_５により媒介されるという証拠を提供した（Friedlander, M.; et al. Science 1995, 270, 1500-1502）。α_ｖβ_３を発現するメラノーマ細胞は、外来性サイトカイン刺激の必要なしにｉｎｖｉｔｒｏで移動しそしてｉｎｖｉｖｏで転移する（Filardo, E.J.; et al. J Cell Biol. 1995,130, 441-450）。反対に、α_ｖβ_５インテグリンを発現する腫瘍細胞は、ビトロネクチン上の運動性およびｉｎｖｉｖｏ散在（dissemination）のためにチロシンキナーゼレセプター媒介シグナリング事象を必要とする（Brooks, P.C.; et al J Clin Invest. 1997, 99, 1390-1398）。α_ｖβ_５は、多くの悪性腫瘍細胞により広く発現されるが、α_ｖβ_３は、α_ｖβ_５の細胞分布と比較して相対的に限定された細胞分布を有する（Pasqualini, R.; et al. J. Cell Science 1993, 105, 101-111; Walton, H.L.; et al. J. Cell. Biochem. 2000, 78, 674-680）。従って、診断または治療目的でα_ｖβ_３媒介プロセスをターゲティングするために、α_ｖβ_３とα_ｖβ_５とを区別することができる新規な化合物の開発が必要とされる。

今日まで、抗体（Gutheil, J. C. et al. Clin. Cancer Res. 2000, 6, 3056-3061）、小分子（Miller, W.H.; et al. Drug Discov. Today 2000, 5, 397-408; Marugan, J.J.; et al. J. Med. Chem. 2005, 48, 926-934）、ペプチド模倣物（peptidomimetics）（Sulyok, G.A.; et al. J.Med. Chem. 2001, 44, 1938-1950; Belvisi, L.; et al. Org. Lett. 2001, 3, 1001-1004）および環状ペプチド（Mitjans, F. et al. Int. J. Cancer 2000, 87, 716-723; Dechantsreiter, M.A.; et al J. Med. Chem. 1999, 42, 3033-3040）を含む種々の治療候補者が、臨床的に評価されそしてα_ｖβ_３媒介プロセスをモデュレーションするのに成功することが示された。これまで、ｃ（ＲＧＤｆ［ＮＭｅ］Ｖ）と呼ばれるペンタペプチドシクロ（−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＭｅＶａｌ−）（Eskens, F.A.; et al Eur. J. Cancer 2003, 39, 917-926）は、文献に報告された最も活性なα_ｖβ_３アンタゴニストの１つである。以前の研究は、α_ｖβ_５に比較してインテグリンα_ｖβ_３に対するこのペプチドのより高いアフィニティーを示しておりそして種々の腫瘍細胞系でアッセイされるときマイクロモル範囲のＩＣ_５０値でのα_ｖβ_３媒介細胞接着の抑制を報告した（Goodman, S.L.; et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 1045-1051）。

インテグリンα_ｖβ_３のライゲーションされていない状態およびｃ（ＲＧＤｆ［ＮＭｅ］Ｖ）との複合体におけるその細胞外セグメントの結晶構造およびα_ｖβ_３インテグリンリガンドに対するドッキングの研究は、主要な相互作用は、正に帯電したアルギニンとαサブユニットとの間およびアニオン性アスパラギン酸とβサブユニットとの間にあることを示し（Marinelli, L.; et al. J. Med. Chem. 2003, 46, 4393-404; Xiong, J.P; et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin α_ｖβ_3. Science 2001, 294, 339-345; Xiong, J.P.; et al. Science 2002, 296, 151-155）、そして異なるサブユニット間の選択性は、ＲＧＤ配列コンホメーションにより達成されることを示した。以前の研究は、エキスタチン、クサリヘビ（Echis carinatus）ディスインテグリンの最小物（４９残基）は、インテグリンα_ｖβ_３、α_５β_１およびα_ＩＩｂβ_３の強力なアンタゴニストであること（Wierzbicka-Patynowski, I.; et al. J. Biol. Chem. 1999, 274, 37809-37814）および４１〜４９Ｃ末端残基と共にＲＧＤモチーフに隣接したアミノ酸はインテグリンの選択的認識のために決定的に重要であると思われることも報告していてる。突然変異及びフォトアフィニティー架橋実験およびドッキング研究と組み合わせたＮＭＲコンホメーション解析（Yahalom, D.; et al. Biochemistry 2002, 41, 8321-8331; Saudek, V.; et al. Biochemistry 1991, 30, 7369-7372）は、エキスタチン（Echistatin）のＣ末端領域が、小ペプチドリガンドにおけるＲＧＤトリアッドをフランキングする残基に結合する部位とは異なる、α_ｖβ_３のβ_３サブユニット内の部位に結合するという証拠を提供した。

発明の要約
本発明は、α_ｖβ_３レセプターの強力な且つ選択的アンタゴニストとしてＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含有するペプチドまたはペプチド模倣化合物に関し、即ち、本発明の化合物は、新規な抗癌薬物としておよび／またはα_ｖβ_３ターゲティングされた治療およびイメージング用の適当なツールとして新規な種類の診断非侵襲性トレーサーとして使用することができる。

発明の詳細な説明
本発明の化合物は、下記式（Ｉ）：

（式中、
ＡＡ１は、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｐｅｎ、ＤａｂまたはＤａｐの群から選ばれた少なくとも３つの官能基を含有するαアミノ酸であり；
ＡＡ２は、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｐｅｎ、ＤａｂまたはＤａｐの群から選ばれた少なくとも３つの官能基を含有するαアミノ酸であり；
Ｌは、０〜２の数のアミノ酸残基からなるリンカー配列、例えば配列ＰＧであり；
（Ｘａａ）ｎは、ｎが１〜３の範囲にあるアミノ酸配列であり、該配列はエキスタチンの配列２８〜３０の配列：ＭＤＤに対して実質的に相同性であり；
（Ｙａａ）ｍは、ｍが２〜９の範囲にあるアミノ酸配列であり、該配列はエキスタチンのＣ末端（４１〜４９）の配列：ＲＮＰＨＫＧＰＡＴに対して実質的に相同性である）
を有する。

ペンタペプチドの環状構造は、ＡＡ１のＣＯとＡＡ２のＮＨとのペプチド結合の形成により得られる。

ＡＡ２は好ましくはＤ−アミノ酸である。

好ましい（Ｘａａ）ｎ配列はＭＤＤであり、これに対して好ましい（Ｙａａ）ｍ配列はＲＮＰＨＫＧＰＡＴである。

Ｘａａ基は、ＡＡ２の側鎖とＸａａのＮ末端とのアミド結合の形成によりＡＡ２に連結される。

本発明のペプチドは、Ｎ末端における遊離アミノ基またはアセチル化されたアミノ基およびＣ末端位置における遊離カルボキシル基またはアミド化されたカルボキシル基を有し；１つまたは２つ以上のアミノ酸残基がＣ末端端部に付加されうる。

本発明は、キレート化基の使用により標識されているか、放射性もしくは常磁性金属または放射性ハロゲンにより直接標識されている式（Ｉ）の化合物およびその生理学的に許容される有機もしくは無機塩基との塩または生理学的に許容される有機もしくは無機酸のアニオンとの塩にも関する。

アミノ酸を含有する本発明の化合物について、アミノ酸残基は、慣用の実施に従う一文字表記または三文字表記により示される。本発明で使用されるアミノ酸のすべては、Ｄ−またはＬ−異性体であることができる。特記しない限り、Ｌ−異性体が好ましい。遺伝子でコードされていない普通に遭遇するアミノ酸を本発明で使用することもできる。

「実質的に相同性である」という用語は、特定の化合物のアミノ酸配列が、配列中の少なくとも３つのアミノ酸を任意のアミノ酸で、好ましくは保存的置換により突然変異させることができるエキスタチンのＣ末端配列のアミノ酸配列に対する実質的な対応を示すことを意味する。上記に使用された「任意のアミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸のＬおよびＤ異性体ならびに、天然のペプチドの合成アナログを調製するためにペプチド化学で普通に使用される「非タンパク質」アミノ酸、例えば、ＬおよびＤ配置のαおよびβ位置において置換されたおよび置換されていないαアミノ酸、ならびに不飽和αおよびβアミノ酸を指す。「非タンパク質アミノ酸」の例は、ノルロイシン、ノルバリン、アロイソロイシン、アロトレオニン、ホモアルギニン、チオプロリン、デヒドロプロリン、ヒドロキシプロリン、ピペコリン酸、アゼチジン酸、ホモセリン、シクロヘキシルグリシン、α−アミノ−ｎ−酪酸、シクロヘキシルアラニン、アミノフェニル酪酸、芳香族環のオルト、メタおよびパラ位置で一置換および二置換されたフェニルアラニン、セリン、トレオニンおよびチロシンのＯ−アルキル化誘導体、Ｓアルキル化システイン、ε−アルキル化リシン、δ−アルキル化オルニチン、環のメタまたはパラ位置で置換された芳香族アミノ酸、例えば、フェニルアラニン−ナイトレート、フェニルアラニン−サルフェート、フェニルアラニン−ホスフェート、フェニルアラニン−アセテート、フェニルアラニン−カーボネート、フェニルアラニン−メチルスルホネート、フェニルアラニン−メチルホスホネート、チロシン−サルフェート、チロシン−ホスフェート、チロシン−スルホネート、チロシン−ホスホネート、パラ−アミド−フェニルアラニン、Ｃ−α，α−ジアルキル化アミノ酸、例えば、α，α−ジメチルグリシン（Ａｉｂ）、α−アミノシクロプロパンカルボン酸（Ａｃ３ｃ）、α−アミノシクロブタンカルボン酸（Ａｃ４ｃ）、αアミノシクロペンタンカルボン酸（Ａｃ５ｃ）、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸（Ａｃ６ｃ）、ジエチルグリシン（Ｄｅｇ）、ジプロピルグリシン（Ｄｐｇ）、ジフェニルグリシン（Ｄｐｈ）、である。β−アミノ酸の例は、β−アラニン、シスおよびトランス２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）である。他の非タンパク質アミノ酸は、ウエブサイトhttp://CHEMLIBRARY.BRI.NRC.CA/に示される。

本発明のペプチドまたはペプチド模倣化合物は、例えば、M. Bodansky and M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, published by Interscience Publishing Co., New York, 1966; F.M. Finn and K. Hoffman, The Proteins, volume 2, edited by H. Neurath, R.L. Hill, Academic Press Inc., New York, 1976; Nobuo Izumiya et al., Peptide Synthesis, published by Maruzen Co., 1976; Nobuo Izumiya et al. Fundamental Peptide Synthesis and Experiment, published by Maruzen Co., 1985; Lecture Series on Biochemical Experiment, edited by the Association of Biochemistry, Japan, volume 1, “Chemistry of Protein IV”, chapter II, Haruaki Yajima, Peptide Synthesis, 1977に記載のとおり、通常のペプチド化学で使用される慣用の方法により合成されうる。

ペプチドは、ペプチドの構造に依存して、液相法または固相法を選択することにより合成することができる。ペプチド化合物は、液相法と固相法を組み合わせることにより合成することもできる。

本発明の化合物は、逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製される。化合物は、質量分析法、アミノ酸分析、ＮＭＲ分光法により同定される。

本発明は、一般式（ＩＩ）：

［式中、Ａは一般式（Ｉ）のペプチドであり；ｚは０〜５の整数であり；Ｙはスペーサー鎖であって、それぞれ、ペプチドＡに存在する個々のアミノ酸の側鎖に存在する官能基の１つまたはＡのＮ末端（−ＮＨ_２）基もしくはＣ末端（−ＣＯ_２Ｈ）基に結合しており且つＣに結合したスペーサー鎖であり；ｚが２〜５の整数であるときは、単位Ｙは互いに同じであるかまたは異なることができ；
Ｙは、好ましくは、式（ＩＩＩ）

（式中、
ｒ、ｌおよびｑは各々独立に０または１であり、そしてｐは独立に０〜１０の整数であり、但し、ｌ、ｒおよびｑの少なくとも１つはゼロ以外であるものとし；
Ｒは水素であり；
Ｒ１は水素または−ＣＨ_３基である）
の基であり；
Ｃは、スペーサーＹにもしくは直接ペプチドＡにまたはペプチドＡの１つより多くのアミノ酸単位に共有結合で結合したキレート化剤であって、常磁性金属または放射性同位元素を錯化することができるキレート化剤であることができる］
の化合物も指す。

好ましいキレート化基は、
特に、ジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリ酢酸（ＤＯ３Ａ）、［１０−（２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリ酢酸（ＨＰＤＯ３Ａ）、４−カルボキシ−５，８，１１−トリス（カルボキシメチル）−１−フェニル−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−酸（ＢＯＰＴＡ）、Ｎ−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−３−（４−エトキシフェニル）プロピル］−Ｎ−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチルグリシン（ＥＯＢ−ＤＴＰＡ）、Ｎ，Ｎビス［２［（カルボキシメチル［（メチルカルバモイル）メチル］アミノ］エチル］−グリシン（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）、２−メチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＭＣＴＡ）、（α，α’，α”，α”’）−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＭＡ）から選ばれるポリアミノポリカルボン酸およびその誘導体の残基からなる群より選ばれるか；または、ポリアミノホスフェート酸リガンドもしくはその誘導体、特に、Ｎ，Ｎ’−ビス−（ピリドキサル−５−ホスフェート）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジ酢酸（ＤＰＤＰ）およびエチレンジニトリロテトラキス（メチルホスホン）酸（ＥＤＴＰ）の残基であるか；またはポリアミノホスホン酸リガンドおよびその誘導体またはポリアミノホスフィン酸およびその誘導体、特に１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス［メチレン（メチルホスホン）酸および１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス［メチレン（メチルホスフィン）酸の残基であるか；または大環状キレート化剤、例えばテキサフリン、ポルフィリン、フタロシアニンの残基；またはＮ，Ｎ−ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］Ｌ−グルタミン酸（ＤＴＰＡ−ＧＬＵ）もしくはＬｙｓとコンジュゲーションされたＤＴＰＡ（ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ）である。他のキレート化基は、刊行物“Radionuclide Pepetide Cancer Therapy”edited by M. Chinol and G. Paganelli, Taylor & Francis CRC Press, 2006（ISBN:082428874）に報告されている。

Ｃは、スペーサーＹにもしくはペプチドＡに直接またはペプチドＡの１つより多くのアミノ酸単位に共有結合で結合した、核医学のための放射性トレーサー、例えばＦ１８−ガラクト基であることもできる。他の放射性トレーサーは、刊行物“Radionuclide Peptide Cancer Therapy”edited by M. Chinol and G. Paganelli, Taylor & Francis CRC Press, 2006（ISBN: 0824728874）に報告された放射性トレーサーである。

これらのペプチドは、癌の診断および処置のためにＭＲＩおよび核医学用途に使用することができる。

従って、本発明は、治療的有効量の式ＩまたはＩＩのα_ｖβ_３アンタゴニストを障害に罹患している個体に投与することを含む障害の処置方法も提供する。

病状を含む特異的障害の例は、血管新生および転移、例えば乳癌、筋骨格腫瘍、メラノーマ、頭部および頸部癌（head and neck cancer）、ヒトグリオーマ、子宮頸部癌（cervical cancer）、血管再発狭窄症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチに関する。

更に詳しくは、本発明の化合物は、腫瘍細胞の増殖を減少させおよび／または病理学的血管新生をモデュレーションさせることができる。

本発明の化合物は、特に血管新生および転移、例えば乳癌、筋骨格腫瘍、メラノーマ、頭部および頸部癌、ヒトグリオーマ、子宮頸部癌、血管再発狭窄症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチに関係した疾患の診断のために、有効量の本発明の化合物を被験体に投与することによりＭＲＩおよび核医学法（ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ等）を使用する障害の診断に使用することもできる。

本発明は、乳癌、筋骨格腫瘍、メラノーマ、頭部および頸部癌、ヒトグリオーマ、子宮頸部癌、血管再発狭窄症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチなどの病状の血漿中の早期の検出のための上記したα_ｖβ_３アンタゴニストを含む診断キットにも関する。

本発明を下記の実施例により更に詳細に説明する。

実施例
今後ＲＧＤｅｃｈｉと呼ばれる図１に報告された配列を有するペプチドは、環状ＲＧＤモチーフおよびリンカーにより接続されたエキスタチンＣ末端尾部に対応する配列を含有する二官能性キメラ分子である。二官能性分子ＲＧＤｅｃｈｉの活性を評価するために、ｅｃｈｉＬ、ｅｃｈｉ１１〜１９およびｅｃｈｉ８〜１９をデザインした（図１）。Ｅｃｈｉ１１〜１９およびｅｃｈｉ６〜１９は、それぞれ１１〜１９および８〜１９ＲＧＤｅｃｈｉ配列を含みそしてｅｃｈｉＬは、ＲＧＤｅｃｈｉの線状前駆体に対応する。

合成：すべてのペプチドは、ＡＢＩ４３３Ａ自動化ペプチド合成機でＦｍｏｃ固相法を使用して合成された（０．２５ミリモル）。合成は、Ｄ−Ｇｌｕ^５残基をペプチド配列中にそのカルボキシル側鎖により挿入するためにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ−ＯＡｌｌを除いて、すべて標準アミノ酸を使用して、ＮｏｖａｓｙｎＴＧＡ樹脂で行われた（置換０．２９ミリモルg^−１）。最初のアミノ酸を、ＤＣＭ中で３時間Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（５当量）／ＭＳＮＴ（５当量）／Ｍｅｌｍ（３．７５当量）で処理することにより樹脂上に結合させた。Ｆｍｏｃ脱保護工程を、ＤＭＦ中の３０％ピペリジンで１０分間行い、そして活性エステルカップリング反応をＤＭＦ中で４倍過剰のアミノ酸およびＨＢＴＵ（４当量）／ＨＯＢｔ（４当量）／ＤＩＰＥＡ（８当量）の下に行った（Fields, C. G.; et al Pept. Res. 1991, 4, 95-101）。各カップリングを１時間２回繰り返し、次いでキャッピング工程（５分）を無水酢酸／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ（２．６：４．８：９２．６ｖ／ｖ／ｖ）で行った。

Ａｒｇ^１１カップリング反応後に、ペプチジル樹脂のアリクォートを取り出してｅｃｈｉ１１〜１９ペプチドを得た。Ｍｅｔ^６カップリングの終わりに、樹脂の他の部分を取り出してｅｃｈｉ６〜１９ペプチドを得た。ＲＧＤｅｃｈｉ合成期間中Ｌｙｓ^１のＦｍｏｃ脱保護の前に、アリル基からのＤ−Ｇｌｕ^５残基の選択的α−カルボキシル脱保護を、ＤＣＭ中のＰｈＳｉＨ_３（２４当量）／Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４（０．２５当量）によるペプチジル−樹脂の処理により行った。最終の環化の前に、樹脂を２つの部分に分けて、ｅｃｈｉＬを得、そしてＲＧＤｅｃｈｉの合成を続けた。Ｌｙｓ^１のαＮＨとＤ−Ｇｌｕ^５のαＣＯとの環化を、ＤＭＦ中のＰｙＢｏｐ（１．５当量）／ＨＯＢｔ（１．５当量）／DIPEA（２当量）で行った。

ペプチドを樹脂から開裂しそしてＴＥＡ／Ｈ_２Ｏ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９４：２．５：２．５：１ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）の混合物を使用して脱保護した。次いで樹脂をろ過しそしてペプチドを、冷無水ジエチルエーテルを使用して沈殿させた。

粗生成物を、Phenomenex C18 カラム（２１×２５０mm；１５μm；３００Å）および２０mL／分の流速で３０分のＣＨ_３ＣＮ５％〜７０％（０．１％ＴＦＡ）のＨ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ_３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を使用して、ＵＶ−Ｖｉｓ検出器ＳＰＤ−１０Ａを備えたSchimadzu LC-8Aシステムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製したペプチドを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ（Perseptive Biosystem）分析計でのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析法を使用して特徴付け、これによりそれぞれ、ＲＧＤｅｃｈｉ、ｅｃｈｉ１１〜１９、ｅｃｈｉ８〜１９およびｅｃｈｉＬについての２０６１．２、９７８．１、１４９３．６、２０７９．２の予想された分子イオンピーク［Ｍ−Ｈ］＋を得た。

すべてのペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を使用する固相法により合成された。すべてのアミノ酸は、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ技法に従ってカップリングされた（Fields, C. G.; et al Pept. Res. 1991, 4, 95-101）。最終脱保護および樹脂からの開裂は、ＴＦＡおよびスカベンジャーで達成された。ＲＧＤｅｃｈｉ合成期間中、Ｌｙｓ^１のＦｍｏｃ脱保護の前に、アリル基からのＤ−Ｇｌｕ^５残基のα−カルボキシル選択的脱保護は、ＰｈＳｉＨ_３／Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４／ＤＣＭによるペプチジル−樹脂の処理により行われた（Dangles, O. et al., J. Org. Chem. 1987, 52, 4984-93）。最終の環化の前に、樹脂を２つの部分に分けて、ｅｃｈｉＬを得、そしてＲＧＤｅｃｈｉの合成を続けた。Ｌｙｓ^１のαＮＨ基とＤ−Ｇｌｕ^５のαＣＯ基間の環化は、ＤＭＦ中のＰｙＢｏｐ／ＨＯＢｔ／DIPEAで行われた（Coste, J. et al. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 205-8）。

ペプチドの純度および同定は、分析ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により確認された。分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製されたＲＧＤｅｃｈｉ、ｅｃｈｉＬ、ｅｃｈｉ６〜１９およびｅｃｈｉ１１〜１９の全体の収率は、それぞれ、２４％、３０％、５４％および５８％であった。

細胞接着および競合アッセイ：α_ｖもしくはα_ＩＩｂサブユニットおよびβ_３もしくはβ_５サブユニットのｃＤＮＡで安定にコトランスフェクションされたヒト赤白血病Ｋ５６２細胞は、親切にもＤｒ．Ｓ．Ｄ．Ｂｌｙｓｔｏｎｅ（SUNY Upstate Medical University, Syracuse, NY）により提供された。細胞を、３７℃で５％ＣＯ_２で加湿されたインキュベータ中で、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、１００IU/mlペニシリン、５０μg/mLストレプトマイシンおよび５００μg/mLＧ４１８を補充されたＩｓｃｏｖｅの改変されたダルベッコの培地（ＩＭＤＭ）中に維持した。トランスフェクションされたクローンにおけるα_ｖβ_３、α_ｖβ_５およびα_ＩＩｂβ_３の発現は、ＦＩＴＣ標識されたＬＭ６０９、Ｐ１Ｆ６およびＡ２Ａ９／６モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーにより確認された。細胞を使用して、α_ｖβ_３に対するアフィニティーおよびα_ｖβ_５およびα_ＩＩｂβ_３インテグリンとの交差反応性を決定した。ＲＧＤｅｃｈｉを、固定化されたビトロネクチンまたはフィブリノーゲンへの細胞接着を抑制するその能力について試験しそして^１２５Ｉ標識された環状ＲＧＤペプチドとの結合について競合する能力について試験した。他の環状ペプチド、例えば、ｃ（ＲＧＤｆＶ）およびその変異体ｃ（ＲＧＤｙＶ）ならびにＲＧＤｅｃｈｉの特異的配列を比較のために使用した。

細胞接着アッセイは、前記したとおりに行われた（Chiaradonna, F.; et al EMBO J. 1999, 18, 3013-3023）。簡単に言えば、２４ウエルの平底プレートを、ビトロネクチン５μg/mLと一夜インキュベーションした。プレコートされたプレートをＰＢＳですすぎ洗い、１％熱変性ウシ血清アルブミンと２３℃で１時間インキュベーションし、そして再びすすぎ洗いした。次いで、α_ｖβ₃過剰発現Ｋ５６２細胞を、種々の濃度の環状ＲＧＤペプチドまたは希釈剤と４℃で１時間インキュベーションした。ペプチドで処理された細胞（０．２〜０．５×１０６／１００μL／ウエル）を、プレコートされたプレート上に播種し、そして５％ＣＯ_２中で３７℃で１時間接着させた。非接着性細胞を穏やかに洗浄して除去し、これに対して接着性の細胞をトリプシン処理（trypsinization）により引き離しそして計数した。３つの異なる接着アッセイを二重で（in duplicates）行った。各アッセイの結果を、非線型回帰最小二乗法を使用してGraphPad Prism Software Inc, San Diego, CAにより解析して、各ペプチドについてＩＣ_５０値を評価した。

新規なペプチドの選択性を試験するために、α_ｖβ_５またはα_ＩＩｂβ_３過剰発現Ｋ５６２細胞を増加する濃度のｃ（ＲＧＤｆＶ）またはＲＧＤｅｃｈｉとインキュベーションし、そして細胞接着を指示されたビトロネクチンまたはフィブリノーゲンを使用して前記したとおりに決定した。

ペプチドｃ（ＲＧＤｙＶ）を、前記したＩｏｄｏ−Ｇｅｎ法を使用して^１２５Ｉで標識した（Del Vecchio, S. et al., Cancer Res. 1993, 53, 3198-3206）。簡単に言えば、ペプチド１００μgをＮａ^１２５Ｉ５００μCiおよびＩｏｄｏ−Ｇｅｎ１２μgと反応させた。１５分後、反応をＮ−アセチルチロシン１μモルの添加により停止させた。放射能標識されたペプチドを、サイズ排除ポリアクリルアミドクロマトグラフィーにより結合しなかったヨウ化物により精製した（Felding Habermann, B. Pathophysiol. Haemost. Thromb. 2003, 33 Suppl 1, 56-58）。放射能標識された生成物は、ＨＰＬＣにより評価して遊離ヨウ化物３％未満を含有していた。次いで細胞（１×１０^６）を大過剰の標識されていない競合体の存在下または不存在下に^１２５Ｉで標識されたｃ（ＲＧＤｙＶ）と４℃で１時間インキュベーションした。徹底的な洗浄の後に、細胞関連の放射能（cell-associated radioactivity）を、ガンマ計数器により決定した。

すべての合成されたペプチドを、ビトロネクチンへの細胞接着を阻害するその能力について試験した。α_ｖβ_３を過剰発現するヒト赤白血病Ｋ５６２細胞（Ｋα_ｖβ_３）を増加する濃度の試験されたペプチドとインキュベーションし、次いでビトロネクチンでコーティングされたプレートに接着させた。ｃ（ＲＧＤｆＶ）（Sulyok, G. A.; et al. J. Med. Chem. 2001, 44, 1938-1950; Dechantstreiter, M. A.; et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 3033-3040）と、匹敵する生物学的活性を有するｃ（ＲＧＤｆ［ＮＭｅ］Ｖ）アナログの両方およびＲＧＤｅｃｈｉは、ビトロネクチンへのＫα_ｖβ_３細胞の接着を阻害することができた。図２は、Ｋα_ｖβ_３をそれぞれｃ（ＲＧＤｆＶ）およびＲＧＤｅｃｈｉとインキュベーションすることにより得られた代表的な阻害曲線を示す。ｃ（ＲＧＤｆＶ）のＩＣ_５０値は０．６４μM〜３．４８μMの範囲にあり、これに対してＲＧＤｅｃｈｉのＩＣ_５０は、０．７９μM〜７．５９μMの範囲にあった。ＲＧＤｅｃｈｉフラグメントを、Ｋα_ｖβ_３細胞接着を阻害するそれらの能力について試験した。ｅｃｈｉ１１〜１９、ｅｃｈｉ６〜１９およびｅｃｈｉＬなどの選ばれたアミノ酸配列１０μMとのインキュベーションは、細胞接着を阻害しなかった。細胞接着は無処理コントロール細胞と比較して９７．５％、９９．０％および８９．５％であった。

新規なペプチドＲＧＤｅｃｈｉの結合の選択性を試験するために、α_ｖβ_５過剰発現細胞（Ｋα_ｖβ_５）を接着アッセイで使用した。図３Ａに、代表的な阻害曲線が報告されている。ｃ（ＲＧＤｆＶ）はビトロネクチンへの細胞の接着を有効に阻害することができたのに対して、ＲＧＤｅｃｈｉは、Ｋα_ｖβ_５細胞接着に対してなんらの有意な阻害効果を示さなかったが、これはα_ｖβ_５との交差反応性の欠如を示している。平行実験において、α_ＩＩｂβ_３過剰発現細胞をＬＭ６０９モノクローナル抗体とプレインキュベーションし、次いで選ばれたペプチドの存在下または不存在下に、フィブリノーゲンに接着させた。図３Ｂは、ｃ（ＲＧＤｆＶ）はフィブリノーゲンへの細胞の接着を有効に阻害することができたが、ＲＧＤｅｃｈｉは、α_ＩＩｂβ_３過剰発現細胞に対してなんらの有意な阻害効果も示さなかったことを示す。

新規なペプチドＲＧＤｅｃｈｉは、α_ｖβ_３過剰発現細胞への結合について^１２５Ｉ［ｃ（ＲＧＤｆＶ）］で標識されたｃ（ＲＧＤｆ［ＮＭｅ］Ｖ）アナログと有効に競合しそしてα_ｖβ₅過剰発現クローンに対してそうでないことを示す競合結合実験から矛盾のない結果が得られた。

結論として、上記の結果は、ＲＧＤｅｃｈｉキメラペプチドがα_ｖβ_３インテグリンに対する新規な且つ選択的なリガンドであることを示す。

図１は合成されたペプチドの略図である。Ｋα_ｖβ_３細胞において行われた接着アッセイから得られた代表的な抑制曲線を示す。細胞を、増加する濃度のｃ（ＲＧＤｆＶ）（パネルＡ、ＩＣ_５００．６８μM）およびＲＧＤｅｃｈｉ（パネルＢ、ＩＣ_５００．８８μM）と４℃で１時間プレインキュベーションし、次いでビトロネクチンをコーティングされたプレート上に播種した。細胞を３７℃で１時間接着させそして最後に計数した。 α_ｖβ_３に対するＲＧＤｅｃｈｉの選択性を示す。パネルＡ．Ｋα_ｖβ₅細胞において行われた接着アッセイから得られた代表的な抑制曲線を示す。細胞を、増加する濃度のｃ（ＲＧＤｆＶ）（黒の四角形）およびＲＧＤｅｃｈｉ（白の四角形）と４℃で１時間プレインキュベーションし、次いで接着を図２に示されたとおりに決定した。結果を、無処理コントロールサンプルを１００％と考えて接着性細胞の百分率として表す。パネルＢ．Ｋα_ＩＩｂβ_３細胞において行われた接着アッセイから得られた代表的な抑制曲線を示す。細胞を抗α_ｖβ_３ブロッキングＬＭ６０９モノクローナル抗体とプレインキュベーションしそしてフィブリノーゲンに対する接着アッセイに供した（１０μg/mL）。

Claims

環状ＲＧＤモチーフおよびスペーサー配列により共有結合で連結された２つのエキスタチンＣ末端部分を含有する、α_ｖβ_３インテグリンに対する選択的アフィニティーを示す、α_ｖβ_３インテグリンのアンタゴニスト化合物であって、該アンタゴニスト化合物は、
下記式（Ｉ）：

（式中、
ＡＡ１は、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｐｅｎ、ＤａｂまたはＤａｐの群から選ばれた、少なくとも３つの官能基を含有するαアミノ酸であり；
ＡＡ２は、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｐｅｎ、ＤａｂまたはＤａｐの群から選ばれた、少なくとも３つの官能基を含有するαアミノ酸であり；
Ｌは、０〜２の数のアミノ酸残基からなるリンカー配列であり；
（Ｘａａ）ｎは、ｎが１〜３の範囲にあるアミノ酸配列であり、該配列はエキスタチンの配列２８〜３０の配列：ＭＤＤに相当し；
（Ｙａａ）ｍは、ｍが２〜９の範囲にあるアミノ酸配列であり、該配列はエキスタチンのＣ末端（４１〜４９）の配列：ＲＮＰＨＫＧＰＡＴに相当する）
を有する、化合物。
Ｌが、配列ＰＧである、請求項１に記載の化合物。
式（ＩＩ）：

［式中、Ａは一般式（Ｉ）のペプチドであり；ｚは０〜５の整数であり；Ｙは、スペーサー鎖であって、それぞれ、ペプチドＡに存在する個々のアミノ酸の側鎖に存在する官能基の１つまたはＡのＮ末端（−ＮＨ_２）基もしくはＣ末端（−ＣＯ_２Ｈ）基に結合しており且つＣに結合しているスペーサー鎖であり；ｚが２〜５の整数であるときは、単位Ｙは互いに同じであるかまたは異なることができ；
Ｙは、下記式（ＩＩＩ）

（式中、
ｒ、ｌおよびｑは各々独立に０または１であり、そしてｐは独立に０〜１０の整数であり、但し、ｌ、ｒおよびｑの少なくとも１つはゼロ以外であるものとし；
Ｒは水素であり；
Ｒ１は水素またはメチルである）
を有し；
Ｃは、スペーサーＹにもしくは直接ペプチドＡにまたはペプチドＡの１つより多くのアミノ酸単位に共有結合で結合したキレート化剤であって、常磁性金属または放射性同位元素または放射性トレーサーを錯化することができるキレート化剤である］
で示される化合物。
治療的有効量の請求項１〜３のいずれか１項に記載のα_ｖβ_３インテグリンのアンタゴニストおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
医薬品として使用するための請求項１〜３のいずれか１項に記載のα_ｖβ_３インテグリンのアンタゴニスト化合物。
乳癌、筋骨格腫瘍、メラノーマ、頭部および頸部癌、ヒトグリオーマ、子宮頸部癌、血管再発狭窄症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチからなる群より選択される血管新生および転移に関する病状の処置に使用するための請求項１〜３のいずれか１項に記載のα_ｖβ_３インテグリンのアンタゴニスト化合物。
乳癌、筋骨格腫瘍、メラノーマ、頭部および頸部癌、ヒトグリオーマ、子宮頸部癌、血管再発狭窄症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチの血漿中の早期の検出、ＭＲＩによる診断又は核医学のための診断キットの一部としての請求項１〜３のいずれか１項に記載のα _ｖ β _３インテグリンのアンタゴニスト化合物。