JP5203600B2 - Gold colloid for in vitro diagnostics - Google Patents
Gold colloid for in vitro diagnostics Download PDFInfo
- Publication number
- JP5203600B2 JP5203600B2 JP2006327719A JP2006327719A JP5203600B2 JP 5203600 B2 JP5203600 B2 JP 5203600B2 JP 2006327719 A JP2006327719 A JP 2006327719A JP 2006327719 A JP2006327719 A JP 2006327719A JP 5203600 B2 JP5203600 B2 JP 5203600B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gold colloid
- compound
- gold
- antibody
- linker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 111
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims description 28
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 72
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 37
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 20
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 claims description 12
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 11
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 5
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 17
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 8
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 8
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 7
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 4
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000004685 tetrahydrates Chemical class 0.000 description 4
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- -1 dithiol compound Chemical class 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 3
- 235000019187 sodium-L-ascorbate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011755 sodium-L-ascorbate Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000001132 ultrasonic dispersion Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B22—CASTING; POWDER METALLURGY
- B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
- B22F1/00—Metallic powder; Treatment of metallic powder, e.g. to facilitate working or to improve properties
- B22F1/05—Metallic powder characterised by the size or surface area of the particles
- B22F1/054—Nanosized particles
- B22F1/0545—Dispersions or suspensions of nanosized particles
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B22—CASTING; POWDER METALLURGY
- B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
- B22F2999/00—Aspects linked to processes or compositions used in powder metallurgy
Description
本発明は、体外診断薬として好適な金コロイドに関する。 The present invention relates to a gold colloid suitable as an in vitro diagnostic agent.
イムノクロマト法や生体物質の染色等による体外診断において、金コロイドを用いた診断方法が知られている。金コロイドを用いた場合、表面プラズモン共鳴により赤色の強い発色が観察可能となり、視覚による簡易的な診断が行える。また、金コロイドの発色は、時間経過による退色が少なく、生体物質等を固定した場合にも観察可能であるため、体外診断薬として好適である。 A diagnostic method using colloidal gold is known for in vitro diagnosis by immunochromatography or staining of biological materials. When gold colloid is used, strong red coloration can be observed by surface plasmon resonance, and simple visual diagnosis can be performed. In addition, the color development of colloidal gold is suitable as an in vitro diagnostic agent because it causes little fading over time and can be observed even when a biological substance or the like is fixed.
体外診断薬における金コロイドの具体的な使用方法としては、イムノクロマト法等において、金コロイドに抗体を固定した標識粒子を用いる方法が知られている。イムノクロマト法における使用例としては、抗原が存在する場合、前記標識粒子に抗原の結合した複合体を形成させて、移動層上を展開し、対応する抗体の固定された判定部において複合体を捕捉する方法が知られている。従って、この方法では、判定部において発色が見られるかどうかにより、抗原の有無を確認することができる。 As a specific method for using a gold colloid in an in vitro diagnostic agent, a method using a labeled particle in which an antibody is immobilized on a gold colloid is known in an immunochromatography method or the like. As an example of use in immunochromatography, when an antigen is present, the labeled particle forms a complex bound to the antigen, develops on the moving bed, and captures the complex in the determination part to which the corresponding antibody is immobilized. How to do is known. Therefore, in this method, the presence or absence of an antigen can be confirmed based on whether or not coloring is observed in the determination unit.
前記した標識粒子作成のため、金コロイドに抗体を固定する方法としては、溶媒中で金コロイドと抗体とを分散させ、物理吸着により固定する方法が知られているが、この際、金コロイド粒子同士の凝集を生じる場合があった。また、金コロイドに抗体以外のタンパク質が固定されることもあった。 As a method for immobilizing an antibody on a colloidal gold for producing the aforementioned labeled particles, a method is known in which a colloidal gold and an antibody are dispersed in a solvent and immobilized by physical adsorption. In some cases, agglomeration occurred between the two. In addition, proteins other than antibodies may be immobilized on the gold colloid.
そこで、金コロイド粒子同士の凝集を防ぎ、金コロイドに目的の抗体を選択的に固定するため、金コロイドをリンカーで修飾する方法が知られている。リンカーとは、共有結合等の形式で抗体の固定化を可能とする化合物であり、例えば、特許文献１には、ＳＨ基を有する非架橋デキストランまたはアミノデキストランからなるリンカーが示されている。また、特許文献２には、アルカンチオール、アルカンチオール誘導体、ジチオール化合物及びトリチオール化合物をリンカーとする金コロイドが示されている。このリンカーを用いることにより、抗体の特異的吸着を促進することができると共に、金コロイド同士の凝集も防ぐことができる。
Therefore, a method is known in which the colloidal gold is modified with a linker in order to prevent aggregation of colloidal gold particles and selectively fix the target antibody to the colloidal gold. A linker is a compound that enables immobilization of an antibody in a form such as a covalent bond. For example,
上述した体外診断薬は、診断の精度向上や早期発見が望まれるため、明確な発色により目的とする抗原等の有無が確認できること、抗原等が微量の場合にも検出可能であること等が求められる。従って、体外診断薬に用いる金コロイドとしては、発色の強度が大きく、微量の抗原とも反応して充分な発色を示すものが好適である。また、体外診断においては、目的の抗原等の種類により、様々な粒径の金コロイドを必要とする場合があるため、広範な粒径において良好な発色を示す金コロイドは、体外診断薬としての利用性が高い。 The above-mentioned in vitro diagnostic agents are required to improve diagnosis accuracy and early detection. Therefore, it is necessary to be able to confirm the presence or absence of the target antigen by clear color development, and to be detectable even when the amount of antigen is small. It is done. Accordingly, as the gold colloid used for the in-vitro diagnostic agent, a colloid having a high intensity of color development and reacting with a small amount of antigen to exhibit sufficient color development is preferable. In addition, in in vitro diagnosis, gold colloids with various particle sizes may be required depending on the type of target antigen, etc., so gold colloids that exhibit good color development over a wide range of particle sizes are useful as in vitro diagnostic agents. High availability.
以上のように、金コロイドは、上記した特性を満たしている場合に、体外診断薬として、より好適なものとなる。一方、前記した特許文献１や特許文献２に記載の金コロイドによれば、金コロイドの凝集を防ぎ、目的とする抗体を特異的に固定することが可能となるが、体外診断薬として特に好適な金コロイドとするための上記特性を、全て満たしているものではなかった。
As described above, the colloidal gold is more suitable as an in vitro diagnostic agent when it satisfies the above-described characteristics. On the other hand, according to the gold colloid described in
そこで、本発明は、体外診断薬として好適な金コロイドであって、発色の強度が大きく、微量の抗原とも反応して充分な発色を示す体外診断用の金コロイドの提供を目的とする。また、本発明は、広範な粒径において、良好な発色を示す体外診断薬用の金コロイドを提供する。 Therefore, an object of the present invention is to provide a gold colloid suitable for an in vitro diagnostic agent, which has a high color development intensity and reacts with a small amount of antigen to exhibit sufficient color development. The present invention also provides gold colloids for in vitro diagnostic agents that exhibit good color development over a wide range of particle sizes.
本発明者等は、鋭意検討を行い、上記課題を解決することのできる化合物を含むリンカーを見出し、本発明に想到した。すなわち、本発明は、金コロイドと、前記金コロイドを修飾し抗体を固定するためのリンカーと、を含む体外診断薬用金コロイドであって、前記リンカーは、化１及び／又は化２で示される化合物からなり、置換基Ｒ１、Ｒ２及び／又は炭素数ｎ１、ｎ２の異なる２種以上の化合物からなることを特徴とする体外診断薬用金コロイドに関する。
本発明における、化１又は化２で示される化合物は、アルキル基の末端にジスルフィド基又はチオール基を有し、アルキル基の他の端部に置換基Ｒ１又はＲ２を有する。ジスルフィド基とチオール基は、金コロイドを修飾する際に作用する置換基であり、置換基Ｒ１、Ｒ２は、抗体を固定する際に作用する置換基である。 In the present invention, the compound represented by Chemical Formula 1 or Chemical Formula 2 has a disulfide group or a thiol group at the terminal of the alkyl group, and has a substituent R 1 or R 2 at the other end of the alkyl group. The disulfide group and the thiol group are substituents that act when modifying the gold colloid, and the substituents R 1 and R 2 are substituents that act when immobilizing the antibody.
また、本発明の金コロイドは、置換基Ｒ１、Ｒ２及び／又は炭素数ｎ１、ｎ２の異なる２種以上の化合物からなるリンカーを含むことにより、発色の強度が大きく、微量の抗原とも反応して良好な発色を示す体外診断薬とすることができる。このような効果が得られるのは、本発明のリンカーであれば、置換基Ｒ１、Ｒ２及び／又は炭素数ｎ１、ｎ２を選択することにより、金コロイド１粒子当たりに固定される抗体数を調整でき、金コロイド１粒子当たりの発色強度を効率的に利用できるためであると考えられる。 In addition, the gold colloid of the present invention contains a linker composed of two or more compounds having different substituents R 1 and R 2 and / or carbon numbers n 1 and n 2. In vitro diagnostic agents that react well with each other and exhibit good color development. Such an effect can be obtained if the linker of the present invention is fixed per one colloidal gold particle by selecting the substituents R 1 and R 2 and / or the carbon number n 1 and n 2. This is probably because the number of antibodies can be adjusted, and the color intensity per gold colloid particle can be used efficiently.
尚、本発明の化１、化２で示される化合物は、置換基Ｒ１、Ｒ２が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アミノ基のいずれかであり、炭素数ｎ１、ｎ２が２〜１０の範囲内のものである。上記した置換基は、それぞれ抗体と結合する反応性が異なるものであり、これら反応性の異なる置換基を含む化合物を２種以上用いることで、金コロイドに結合する抗体数を調整できると考えられるからである。また、炭素数ｎ１、ｎ２が２〜１０で異なる２種以上の化合物を用いることも、同様に、金コロイドと抗体との反応性の違いを利用するためのものである。 In the compounds represented by the chemical formulas 1 and 2 of the present invention, the substituents R 1 and R 2 are any of a carboxyl group, a hydroxyl group, an aldehyde group, and an amino group, and the number of carbon atoms n 1 and n 2 is It is within the range of 2-10. Each of the above-described substituents has different reactivity for binding to an antibody, and it is considered that the number of antibodies bound to the colloidal gold can be adjusted by using two or more compounds containing substituents having different reactivity. Because. In addition, the use of two or more kinds of compounds having 2 to 10 carbon numbers n 1 and n 2 which are different from each other is also to utilize the difference in reactivity between the colloidal gold and the antibody.
また、本発明のリンカーは、化１、化２で示される化合物を両方含むものとすることができる。化１で示される化合物と、化２で示される化合物とは、アルキル基の一端にジスルフィド基を有するか、チオール基を有するかという相違点を有しているが、ジスルフィド基は、還元によって容易にチオール基となり、チオール基は、酸化によってジスルフィド基となる関係にある。従って、化１で示される化合物と、化２で示される化合物とは、相溶性が高いため、混合して用いることができるものと考えられる。 In addition, the linker of the present invention can include both compounds represented by Chemical Formula 1 and Chemical Formula 2. The compound represented by Chemical Formula 1 and the compound represented by Chemical Formula 2 are different in that they have a disulfide group or a thiol group at one end of the alkyl group, but the disulfide group is easily reduced by reduction. It becomes a thiol group, and the thiol group has a relationship of becoming a disulfide group by oxidation. Therefore, it is considered that the compound represented by Chemical Formula 1 and the compound represented by Chemical Formula 2 have high compatibility and can be used as a mixture.
上記したように、化１で示される化合物と化２で示される化合物とは、混合して用いることもできるが、本発明で適用するリンカーは、化１又は化２で示される化合物のいずれかのみからなることが好ましい。ジスルフィド基と、チオール基とは、抗体との反応性に違いがあると考えられるからである。すなわち、化１で示される化合物と、化２で示される化合物とを混合して用いると、置換基Ｒ１、Ｒ２及び／又は炭素数ｎ１、ｎ２の異なる２種以上の化合物を含むことにより抗体との反応性を調整した場合であっても、さらにジスルフィド基とチオール基との反応性の相違の影響が加わることから、目標とする反応性に調整しにくくなると考えられるからである。
As described above, the compound represented by the
化１又は化２で示される化合物のいずれかのみからなる場合、リンカーは、置換基Ｒ１又はＲ２がカルボキシル基である第１の化合物と、置換基Ｒ１又はＲ２がカルボキシル基以外の置換基である第２の化合物とを含むことが好ましい。抗体との反応性が異なる置換基を含む化合物を用いることにより、金コロイド１粒子当たりに固定される抗体の数を調整できると考えられるからである。また、上記した第２の化合物の置換基Ｒ１又はＲ２は、ヒドロキシル基であることが好ましい。カルボキシル基は、タンパク質中のアミノ基との結合性が高い置換基の１つとして知られており、ヒドロキシル基は、タンパク質中のアミノ基ともカルボキシル基とも、あまり反応しない置換基として知られている。このため、抗体との反応性が高いカルボキシル基と、反応性の低いヒドロキシル基を含むリンカーを用いれば、金コロイドに固定される抗体の数を、より正確に調整できると考えられる。
If consisting of only a compound represented by
また、カルボキシル基を有する第１の化合物と、カルボキシル基以外の置換基を有する第２の化合物とをリンカーとする場合、第１の化合物の炭素数と第２の化合物の炭素数との差は、２以上であることが好ましい。炭素数の差によっても、抗体との反応性に相違が生じることから、置換基の種類による抗体との反応性調整効果と併用することで、金コロイドに固定される抗体の数を、より正確に調整できる。さらに、第１の化合物は、炭素数ｎ１又はｎ２が４〜１０の化合物であり、第２の化合物は、炭素数ｎ１又はｎ２が２〜８の化合物であることが好ましい。金コロイドを体外診断薬として用いた場合に、発色強度の大きなものとすることができ、微量の抗原とも反応して発色を示すものとできるからである。 When the first compound having a carboxyl group and the second compound having a substituent other than the carboxyl group are used as a linker, the difference between the carbon number of the first compound and the carbon number of the second compound is It is preferable that it is 2 or more. The difference in reactivity with the antibody also occurs due to the difference in the number of carbon atoms, so the number of antibodies immobilized on the colloidal gold can be determined more accurately by using it together with the reactivity adjustment effect with the antibody depending on the type of substituent. Can be adjusted. Further, the first compound is preferably a compound having 4 to 10 carbon atoms n 1 or n 2 , and the second compound is preferably a compound having 2 to 8 carbon atoms n 1 or n 2 . This is because when gold colloid is used as an in-vitro diagnostic agent, the color development intensity can be increased, and color development can be achieved by reacting with a small amount of antigen.
更に、カルボキシル基を有する第１の化合物と、カルボキシル基以外の置換基を有する第２の化合物とをリンカーとする場合、両化合物の混合比率は、モル比で１：１〜０．１：９．９とするのが好ましく、１：１〜１：９がさらに好ましい。１：１〜０．１：９．９の割合であれば、体外診断薬として良好な発色を示す金コロイドとなり、１：１〜１：９であれば、より発色強度の大きいものとすることができるからである。特に、金コロイドの粒径が大きい場合には、第２の化合物の割合を多くすることで、抗体との反応性を低くして、金コロイド１粒子当たりに固定される抗体数が過剰とならないように調整することが好ましいと考えられる。金コロイドの粒径が大きいと、金コロイド１粒子当たりに固定される抗体数が多くなりやすく、固定される抗体数が多いと、体外診断薬として用いる場合、診断に必要な量よりも過剰の抗原が必要になると考えられるからである。 Furthermore, when using the 1st compound which has a carboxyl group, and the 2nd compound which has substituents other than a carboxyl group as a linker, the mixing ratio of both compounds is 1: 1-0.1: 9 by molar ratio. .9, preferably 1: 1 to 1: 9. If the ratio is 1: 1 to 0.1: 9.9, a gold colloid showing good color development as an in-vitro diagnostic agent is obtained, and if it is 1: 1 to 1: 9, the color intensity is higher. Because you can. In particular, when the particle size of the gold colloid is large, the reactivity with the antibody is lowered by increasing the proportion of the second compound, and the number of antibodies immobilized per gold colloid particle does not become excessive. It is considered preferable to adjust so. If the colloidal gold particle size is large, the number of antibodies immobilized per colloidal gold particle tends to increase. If the number of immobilized antibodies is large, when used as an in vitro diagnostic agent, the amount is excessive in excess of that required for diagnosis. This is because an antigen is considered necessary.
尚、本発明の金コロイドは、粒径が１０ｎｍ〜１５０ｎｍであることが好ましく、４０〜１００ｎｍであることがさらに好ましい。粒径が１０ｎｍ〜１５０ｎｍの金コロイドは、体外診断薬としての利用が可能であり、粒径４０〜１００ｎｍであれば、充分な発光強度を示すものとすることができるからである。 The gold colloid of the present invention preferably has a particle size of 10 nm to 150 nm, more preferably 40 to 100 nm. This is because a gold colloid having a particle size of 10 nm to 150 nm can be used as an in vitro diagnostic agent, and if the particle size is 40 to 100 nm, it can exhibit sufficient emission intensity.
以上で説明した本発明の金コロイドは、イムノクロマトグラフ法に用いることができる。具体的には、イムノクロマトグラフ法では、試料を展開するための移動層と、前記移動層の一端に設けられ、抗原に対応する抗体が固定された金コロイドと、前記移動層の他方の端部に含まれる抗原の有無を判定するための部分と、を備えるイムノクロマトグラフィー用診断キットが用いられるが、この金コロイドとして本発明の体外診断薬用金コロイドを用いることができる。 The gold colloid of the present invention described above can be used for immunochromatography. Specifically, in the immunochromatography method, a moving layer for spreading a sample, a gold colloid provided at one end of the moving layer and immobilized with an antibody corresponding to an antigen, and the other end of the moving layer A diagnostic kit for immunochromatography comprising a portion for determining the presence or absence of an antigen contained in the intestine. As the gold colloid, the gold colloid for in vitro diagnostic agents of the present invention can be used.
以上で説明したように、本発明の金コロイドは、体外診断薬として好適な金コロイドとなる。また、発色の強度が大きく、微量の抗原であっても検出可能であり、広範な粒径において発色性が良好なものとなる。 As described above, the gold colloid of the present invention is a gold colloid suitable as an in vitro diagnostic agent. Moreover, the intensity of color development is large, even a very small amount of antigen can be detected, and the color developability is good over a wide range of particle sizes.
以下、本発明における最良の実施形態について説明する。 Hereinafter, the best embodiment of the present invention will be described.
金コロイドを形成させて、リンカーを修飾した後、抗体を固定して体外診断薬用の金コロイド（以下、抗体固定金コロイドという。）を作成した。そして、イムノクロマトグラフィーに用いるテストストリップを作成した後、抗体固定金コロイドと、抗原とを用いて、イムノクロマトグラフィーを行い、金コロイドによる発色の強度を測定した。 After colloidal gold was formed and the linker was modified, the antibody was immobilized to prepare a gold colloid for in vitro diagnostics (hereinafter referred to as antibody-immobilized gold colloid). Then, after preparing a test strip for use in immunochromatography, immunochromatography was performed using the antibody-immobilized gold colloid and the antigen, and the intensity of color developed by the gold colloid was measured.
[金コロイドの形成]
以下の方法により、平均粒径４０ｎｍの金コロイドを形成させた。塩化金酸四水和物０．１７ｇと、クエン酸三ナトリウム二水和物０．４９ｇとを、それぞれ超純水２５ｍｌと１００ｍｌに溶解させて、塩化金酸溶液とクエン酸溶液を調製した。次に、５００ｍｌの三口フラスコ内に、塩化金酸溶液６ｍｌと純水２００ｍｌとを投入して、３０分間加熱還流させた。液温が安定した後、クエン酸溶液５０ｍｌを混合して、１５分間加熱還流した。その後、加熱を停止して室温で放冷し、核コロイドを形成させた。この核コロイド２６ｍｌを、５００ｍｌの三口フラスコに入れ、液温が３０℃になるまで恒温層内で撹拌した。液温が安定したら、塩化金酸四水和物０．０７６ｇを溶解させた塩化金酸溶液２５２ｍｌと、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．０９２ｇを溶解させたＬ−アスコルビン酸溶液２５６ｍｌとを同時に滴下して、１時間撹拌しながら反応させて、平均粒径４０ｎｍの金コロイドを形成させた。
[Gold colloid formation]
A gold colloid having an average particle size of 40 nm was formed by the following method. A chloroauric acid solution and a citric acid solution were prepared by dissolving 0.17 g of chloroauric acid tetrahydrate and 0.49 g of trisodium citrate dihydrate in 25 ml and 100 ml of ultrapure water, respectively. Next, 6 ml of chloroauric acid solution and 200 ml of pure water were put into a 500 ml three-necked flask and heated to reflux for 30 minutes. After the liquid temperature was stabilized, 50 ml of citric acid solution was mixed and heated to reflux for 15 minutes. Thereafter, heating was stopped and the mixture was allowed to cool at room temperature to form a nuclear colloid. 26 ml of this nuclear colloid was placed in a 500 ml three-necked flask and stirred in the thermostatic layer until the liquid temperature reached 30 ° C. When the liquid temperature is stabilized, 252 ml of chloroauric acid solution in which 0.076 g of chloroauric acid tetrahydrate is dissolved and 256 ml of L-ascorbic acid solution in which 0.092 g of sodium L-ascorbate is dissolved are added dropwise simultaneously. Then, the reaction was carried out with stirring for 1 hour to form a gold colloid having an average particle size of 40 nm.
また、平均粒径８０ｎｍの金コロイドは、上記により得られた平均粒径４０ｎｍの金コロイドを用いて形成させた。平均粒径４０ｎｍの金コロイド３３．３ｍｌを５００ｍｌの三口フラスコに入れ、液温が３０℃になるまで恒温層内で撹拌した。液温が安定したら、塩化金酸四水和物０．０３９ｇを溶解させた塩化金酸溶液１１８ｍｌと、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．０４３ｇを溶解させたＬ−アスコルビン酸溶液１２０ｍｌとを同時に滴下して、１時間撹拌しながら反応させた。 Moreover, the gold colloid with an average particle diameter of 80 nm was formed using the gold colloid with an average particle diameter of 40 nm obtained by the above. Gold colloid (33.3 ml) having an average particle diameter of 40 nm was placed in a 500 ml three-necked flask and stirred in a constant temperature layer until the liquid temperature reached 30 ° C. When the liquid temperature is stable, 118 ml of chloroauric acid solution in which 0.039 g of chloroauric acid tetrahydrate is dissolved and 120 ml of L-ascorbic acid solution in which 0.043 g of sodium L-ascorbate are dissolved are added dropwise simultaneously. And allowed to react with stirring for 1 hour.
１００ｎｍの金コロイドは、平均粒径４０ｎｍの金コロイド３３．４ｍｌに対し、塩化金酸四水和物０．０７９ｇを溶解させた塩化金酸溶液２４７ｍｌと、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．０９２ｇを溶解させたＬ−アスコルビン酸溶液２５１ｍｌとを滴下したこと以外は、平均粒径８０ｎｍの金コロイドと同様の方法によって形成させた。 The gold colloid of 100 nm dissolves 247 ml of chloroauric acid solution in which 0.079 g of chloroauric acid tetrahydrate is dissolved and 0.092 g of sodium L-ascorbate in 33.4 ml of gold colloid having an average particle diameter of 40 nm. A gold colloid having an average particle size of 80 nm was formed in the same manner as that except that 251 ml of the L-ascorbic acid solution was dropped.
[リンカーの修飾]
上記方法により形成した粒径が４０、８０、１００ｎｍの金コロイドに、炭素数ｎ１、ｎ２や、置換基Ｒ１、Ｒ２の異なる第１の化合物及び第２の化合物を含むリンカーを修飾させた。第１実施形態〜第４実施形態のそれぞれについて、金コロイドの粒径、リンカーとして用いた第１の化合物及び第２の化合物の種類、第１の化合物と第２の化合物とを含む割合のモル比を、表１に示す。
[Modification of linker]
A gold colloid having a particle size of 40, 80, or 100 nm formed by the above method is modified with a linker containing the first compound and the second compound having different carbon numbers n 1 and n 2 and substituents R 1 and R 2. I let you. For each of the first to fourth embodiments, the particle size of the colloidal gold, the types of the first compound and the second compound used as the linker, and the moles of the ratio including the first compound and the second compound The ratio is shown in Table 1.
第１実施形態は、粒径８０ｎｍの金コロイドに、化１の化合物（ジスルフィド基を有する）のみを含むリンカーを修飾させたものと、化２の化合物（チオール基を有する）のみを含むリンカーを修飾させたものとした。第２実施形態は、炭素数ｎ１が３、５、７、１０である第１の化合物を含むリンカーを修飾させたものとした。第３実施形態では、金コロイドの粒径が４０ｎｍ、８０ｎｍ、１００ｎｍである場合において、第１の化合物と第２の化合物とのモル比を１０：０、５：５、１：９としたリンカーを修飾させた。第４実施形態は、第１の化合物のみを含むリンカーを金コロイドに修飾させたものであり、炭素数ｎ１が１０である第１の化合物と、炭素数ｎ１が３、５、７、１０である第１の化合物とを、モル比で１：９の割合で含むリンカーを用いた。 In the first embodiment, a colloidal gold having a particle size of 80 nm is modified with a linker containing only the compound of formula 1 (having a disulfide group) and a linker containing only the compound of formula 2 (having a thiol group). It was assumed to be modified. In the second embodiment, the linker containing the first compound having carbon number n 1 of 3, 5, 7, 10 is modified. In the third embodiment, when the colloidal gold particle size is 40 nm, 80 nm, or 100 nm, the molar ratio of the first compound to the second compound is 10: 0, 5: 5, 1: 9. Was modified. In the fourth embodiment, a linker containing only the first compound is modified with a gold colloid, and the first compound having a carbon number n 1 of 10 and the carbon number n 1 of 3, 5, 7, A linker containing a first compound of 10 at a molar ratio of 1: 9 was used.
具体的なリンカーの修飾方法について、第３実施形態におけるモル比５：５の金コロイドを例として説明する。上記方法により得られた金コロイド１００ｍｌに、リンカーである第１の化合物のメタノール溶液５ｍｌ（濃度１０μＭ）と、第２の化合物のメタノール溶液５ｍｌ（濃度１０μＭ）とを添加し、室温で２４時間反応させた。その後、１０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ ８．１）１Ｌにより５時間の透析を３回行い未反応の溶液を取り除いて、リンカーを修飾した金コロイドを得た。その他の実施形態についても、それぞれ上記と同様の方法によりリンカーの修飾を行った。
A specific linker modification method will be described with reference to a gold colloid having a molar ratio of 5: 5 in the third embodiment as an example. To 100 ml of gold colloid obtained by the above method, 5 ml of methanol solution (
[抗体の固定]
上記方法により、粒径及びリンカーが異なるそれぞれの金コロイドについて、抗体を固定させた。抗体には、妊娠の成立を診断するために用いる絨毛性性腺刺激ホルモン抗体を用いた。リンカーを修飾した金コロイド９００μｌに、０．０４ｍＭ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボキシルイミド塩酸塩１００ｍｌを加えて１０分間反応させて、１００μｇ／ｍｌ絨毛性性腺刺激ホルモン抗体（抗ヒトモノクローナル抗体 ｃｌｏｎｅ５００８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１００μｌを加え、３時間室温で反応させた。尚、カルボキシルイミド塩酸塩と、絨毛性性腺刺激ホルモン抗体には、緩衝液として１０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．１）を使用した。
[Immobilization of antibody]
By the above method, the antibody was immobilized on each gold colloid having a different particle size and linker. As the antibody, a chorionic gonadotropin antibody used for diagnosing the establishment of pregnancy was used. To 900 μl of gold colloid modified with a linker, 100 ml of 0.04 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carboxylimide hydrochloride was added and allowed to react for 10 minutes to give 100 μg / ml chorionic gonadotropin antibody (anti-antigen). 100 μl of human monoclonal antibody clone 5008 (manufactured by Biochemica) was added and reacted at room temperature for 3 hours. In addition, 10 mM borate buffer solution (pH 8.1) was used as a buffer solution for carboxylimide hydrochloride and chorionic gonadotropin antibody.
その後、１％ ポリエチレングリコール２００００（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を使用した。）を５０μｌと、１０％ ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという。：５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を使用した。）１００μｌを加え、さらに１０分間反応させた。その後、４℃において、１５分間遠心分離を行い、上澄みの９割程度を除去して、沈降した抗体固定金コロイドを採取した。採取した沈殿は、超音波分散させた後、保存液（１．０％ ＢＳＡ、０．０５％ ポリエチレングリコール２００００、０．１％ ＮａＮ３、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２））９００μｌを加えた。この遠心分離による洗浄を、３回繰り返し行った。尚、遠心分離は、金コロイドの粒径が４０ｎｍの場合３０００×ｇ、８０ｎｍ及び１００ｎｍの場合１５００×ｇの条件で行った。洗浄後の抗体固定金コロイドは、分光光度計で吸光度を測定し、波長５２０〜６００ｎｍの間における吸光度の最大値が６となるよう、保存液を用いて調整を行った。 Thereafter, 50 μl of 1% polyethylene glycol 20000 (50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) was used) and 10% bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA): 50 mM potassium phosphate buffer (pH 9.0) ) 100 μl was added and allowed to react for another 10 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 4 ° C. for 15 minutes to remove about 90% of the supernatant, and the precipitated antibody-immobilized gold colloid was collected. The collected precipitate was subjected to ultrasonic dispersion, and then a stock solution (1.0% BSA, 0.05% polyethylene glycol 20000, 0.1% NaN 3 , 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.2)) 900 μl Was added. This washing by centrifugation was repeated three times. Centrifugation was performed under the conditions of 3000 × g when the particle size of the gold colloid was 40 nm and 1500 × g when the particle size was 80 nm and 100 nm. The antibody-immobilized gold colloid after washing was measured for absorbance with a spectrophotometer, and was adjusted using a preservation solution so that the maximum absorbance between wavelengths of 520 and 600 nm was 6.
比較として、リンカーを修飾していない金コロイドについて、抗体固定金コロイドを作成した。平均粒径４０ｎｍ、８０ｎｍ、１００ｎｍの金コロイドを用いて、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）１００μｌと、１００μｇ／ｍｌ絨毛性性腺刺激ホルモン抗体（５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５））１００μｌとを添加して１０分間反応させた以外は、上記と同様の方法により、抗体固定金コロイドを作成した。 For comparison, an antibody-immobilized gold colloid was prepared for a gold colloid in which the linker was not modified. 100 μl of 50 mM KH 2 PO 4 (pH 7.5) and 100 μl of 100 μg / ml chorionic gonadotropin antibody (5 mM KH 2 PO 4 (pH 7.5)) using gold colloid having an average particle size of 40 nm, 80 nm, and 100 nm An antibody-immobilized gold colloid was prepared in the same manner as described above except that and were allowed to react for 10 minutes.
[テストストリップの作成]
イムノクロマトグラフィーによる診断のための、テストストリップを作成した。移動層であるメンブレン上に、抗原の有無を判定するためのテストラインと、金コロイドが、メンブレン上で正常に発色しているかどうかの目安となるコントロールラインとを作成した。テストラインには、抗原と複合体を形成した抗体固定金コロイドのみを捕捉する抗体を塗布し、コントロールラインには、抗原を含まない抗体固定金コロイドを捕捉する抗体を塗布した。
[Create test strip]
Test strips were prepared for immunochromatographic diagnosis. A test line for determining the presence or absence of an antigen on a membrane serving as a moving layer, and a control line serving as a guideline for determining whether or not the gold colloid is normally colored on the membrane were prepared. The test line was coated with an antibody that captures only the antibody-fixed gold colloid that formed a complex with the antigen, and the control line was coated with an antibody that captures the antibody-fixed gold colloid that does not contain the antigen.
テストラインは、抗体として抗ｈαＳ抗体を用いた溶液（表２）を調整し、この溶液０．７５μｌを、定量分注装置（Ｂｉｏｊｅｔ Ｑｕａｎｔｉ ３０００、ＢｉｏＤｏｔ社製）により、５０ｍｍ／秒、２０．８３ｎＬ／ｄｏｔ、０．２８ｍｍピッチの条件で、メンブレンに塗布して作成した。尚、メンブレンとしては、ニトロセルロース製で、幅２５ｍｍ、長さ３０ｃｍのものを使用した。 A test line prepared a solution (Table 2) using an anti-hαS antibody as an antibody, and 0.75 μl of this solution was 50 mm / sec, 20.83 nL using a quantitative dispensing device (Biojet Quanti 3000, manufactured by BioDot). The film was applied to the membrane under the conditions of / dot and 0.28 mm pitch. As the membrane, a membrane made of nitrocellulose and having a width of 25 mm and a length of 30 cm was used.
コントロールラインは、抗体として抗マウス抗体を用いた溶液（表３）を調整し、テストラインと同様の塗布条件で、メンブレン上に作成した。 A control line was prepared on a membrane by preparing a solution (Table 3) using an anti-mouse antibody as an antibody under the same coating conditions as the test line.
テストライン及びコントロールラインを形成したメンブレンは、インキュベータで、４２℃において１時間乾燥させた後、室温でさらに２時間乾燥させた。その後、抗体固定金コロイドのニトロセルロース膜への吸着を防ぐブロッキング溶液である０．５％カセイン（５０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５））に、まずテストライン側を浸漬し、その後に全体を浸漬して、室温で３０分静置した。その後、ブロッキング溶液からメンブレンを取り出し、余分な試薬を除いた後、洗浄液である０．０１％ ドデシル硫酸ナトリウム（５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５））に、前記と同様に浸漬し、３０分静置した。洗浄液からメンブレンを取り出し、２４時間静置した後、吸収パッドを貼り付けて、４ｍｍ幅に切断した。 The membrane on which the test line and the control line were formed was dried in an incubator at 42 ° C. for 1 hour, and further dried at room temperature for 2 hours. Thereafter, the test line side is first immersed in 0.5% casein (50 mM borate buffer (pH 8.5)), which is a blocking solution that prevents the antibody-immobilized gold colloid from adsorbing to the nitrocellulose membrane. Immersion and let stand at room temperature for 30 minutes. Then, after removing the membrane from the blocking solution and removing excess reagents, the membrane was immersed in 0.01% sodium dodecyl sulfate (5 mM phosphate buffer (pH 7.5)) as a washing solution in the same manner as described above for 30 minutes. Left to stand. The membrane was taken out from the cleaning solution and allowed to stand for 24 hours, and then an absorbent pad was attached and cut to a width of 4 mm.
[イムノクロマトグラフィー]
マイクロプレートに、抗原であるリコンピナントｈＣＧ（１％ＢＳＡ、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４））を４０μｌと、抗体固定金コロイド４μｌとを投入して混合した後、テストストリップを差し込み展開させた。
[Immunochromatography]
40 μl of antigen recombinant hCG (1% BSA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.4)) and 4 μl of antibody-fixed gold colloid were mixed in the microplate, and then the test strip was inserted and developed. .
[発色強度の測定]
イムノクロマトグラフィーを行った後、メンブレン上のテストラインにおいて、金コロイドの発色強度を測定した。測定には、反応ライン自動読み取り機器（Ｑｕａｄ Ｓｃａｎ：Ｂｉｏ Ｄｏｔ社製）を用いた。第１実施形態〜第４実施形態のリンカーを修飾した金コロイドの発色強度について、リンカーを修飾しなかった金コロイドの発色強度に対する比率を算出した結果を図１〜４のグラフに示す。
[Measurement of color intensity]
After immunochromatography, the color intensity of colloidal gold was measured on a test line on the membrane. For the measurement, a reaction line automatic reading device (Quad Scan: manufactured by Bio Dot) was used. The graph of FIGS. 1-4 shows the result of having calculated the ratio with respect to the coloring intensity of the gold colloid which modified the linker of 1st Embodiment-4th Embodiment with respect to the coloring intensity of the gold colloid which did not modify a linker.
図１より、第１の化合物と第２の化合物とを、モル比で１：９の割合で含むリンカーを用いた金コロイドによれば、化１のみを用いた場合であっても、化２のみを用いた場合であっても、リンカーを修飾しなかった金コロイドに対する発色強度の比率が１００％以上となり、充分な発色を示す金コロイドとなることが分かった。また、図２より、第１の化合物の炭素数ｎ１が５、７、１０である場合には、ｎ１が３の場合に比べて発色強度の高いものとなることが分かった。
According to FIG. 1, according to the gold colloid using the linker containing the first compound and the second compound in a molar ratio of 1: 9, even when only
図３より、粒径４０、８０、１００ｎｍのいずれの金コロイドを用いたにも、リンカーを修飾しなかった金コロイドに対する発色強度の比率が１００％以上となり、良好な発色が示される金コロイドとなることが分かった。また、第１の化合物と第２の化合物との割合のモル比は、粒径４０ｎｍの場合は５：５（すなわち１：１）、粒径８０ｎｍ及び１００ｎｍの場合には１：９であると、金コロイドの発色強度がより高いものとなることが分かった。 From FIG. 3, the gold colloid having a color development intensity of 100% or more with respect to the gold colloid in which the linker is not modified with any gold colloid having a particle size of 40, 80, or 100 nm is shown to be good color development. I found out that The molar ratio of the ratio of the first compound to the second compound is 5: 5 (ie, 1: 1) when the particle size is 40 nm, and 1: 9 when the particle size is 80 nm and 100 nm. It was found that the color intensity of the colloidal gold was higher.
そして、図４より、第１の化合物のみを用いた場合の金コロイドは、リンカーを修飾しなかった金コロイドに対する発色強度の比率が１００％程度であり、発色強度が高くなりにくいことが分かった。 FIG. 4 shows that the gold colloid using only the first compound has a color development intensity ratio of about 100% with respect to the gold colloid not modified with the linker, and the color development intensity is hardly increased. .
Claims (6)
前記リンカーは、化１で示される化合物であって、
置換基Ｒ １ がカルボキシル基である第１の化合物と、置換基Ｒ １ がヒドロキシル基である第２の化合物とを含み、
更に、第１の化合物の炭素数ｎ１と第２の化合物の炭素数ｎ１とが異なるものである、体外診断薬用金コロイド。
The linker is a compound represented by Chemical Formula 1,
A first compound in which the substituent R 1 is a carboxyl group, and a second compound in which the substituent R 1 is a hydroxyl group,
Furthermore, the number of carbon atoms of the first compounds n 1 and the number of carbon atoms n 1 of the second compound is different from, in vitro diagnostic medicinal colloidal gold.
前記移動層の一端に設けられ、抗原に対応する抗体が固定された金コロイドと、
前記移動層の他方の端部に含まれる抗原の有無を判定するための部分と、を備えるイムノクロマトグラフィー用診断キットであって、
前記金コロイドは、請求項１〜請求項５のいずれかに記載の金コロイドであるイムノクロマトグラフィー用診断キット。
A moving bed for developing the sample;
A colloidal gold provided at one end of the moving layer, to which an antibody corresponding to the antigen is immobilized;
A portion for determining the presence or absence of an antigen contained in the other end of the moving layer, and a diagnostic kit for immunochromatography comprising:
The said gold colloid is a diagnostic kit for immunochromatography which is a gold colloid in any one of Claims 1-5 .
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006327719A JP5203600B2 (en) | 2006-12-05 | 2006-12-05 | Gold colloid for in vitro diagnostics |
| PCT/JP2007/071987 WO2008069002A1 (en) | 2006-12-05 | 2007-11-13 | Gold colloid for in vitro diagnostic |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006327719A JP5203600B2 (en) | 2006-12-05 | 2006-12-05 | Gold colloid for in vitro diagnostics |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008139226A JP2008139226A (en) | 2008-06-19 |
| JP5203600B2 true JP5203600B2 (en) | 2013-06-05 |
Family
ID=39491907
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006327719A Active JP5203600B2 (en) | 2006-12-05 | 2006-12-05 | Gold colloid for in vitro diagnostics |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5203600B2 (en) |
| WO (1) | WO2008069002A1 (en) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5294369A (en) * | 1990-12-05 | 1994-03-15 | Akzo N.V. | Ligand gold bonding |
| DE10027776A1 (en) * | 2000-06-07 | 2002-02-14 | Roche Diagnostics Gmbh | Novel core-shell particles |
| JP3656159B2 (en) * | 2002-02-22 | 2005-06-08 | 独立行政法人理化学研究所 | Screening method of protein having intermolecular interaction with ligand |
| JP2004170367A (en) * | 2002-11-22 | 2004-06-17 | Inst Of Physical & Chemical Res | Manufacturing method for nucleic acid microarray and nucleic acid spotting solution |
| JP3996605B2 (en) * | 2005-03-23 | 2007-10-24 | 富士フイルム株式会社 | Immobilization method, biosensor and test method |
-
2006
- 2006-12-05 JP JP2006327719A patent/JP5203600B2/en active Active
-
2007
- 2007-11-13 WO PCT/JP2007/071987 patent/WO2008069002A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2008139226A (en) | 2008-06-19 |
| WO2008069002A1 (en) | 2008-06-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5358648B2 (en) | Blue gold nanoparticles for immunological measurement, production method thereof and measurement method using the same | |
| JP2537873B2 (en) | Preparation method of gold sol reagent | |
| JP4430234B2 (en) | Method for producing water-soluble crosslinked product | |
| JP5117928B2 (en) | Immunochromatographic device | |
| ES2596323T3 (en) | Colored organic microparticles and diagnostic reagent kit containing the same | |
| JP5728453B2 (en) | Chromatograph method and chromatograph kit | |
| JP3583415B2 (en) | Core-shell metal particles coated with dextran or aminodextran bearing SH groups, and uses thereof | |
| KR20110137384A (en) | Method and device for assay | |
| CN115639366A (en) | Beta 2-microglobulin fluorescence immunochromatography assay kit and detection method thereof | |
| JP5786188B2 (en) | Reagent for measuring C-reactive protein in sample, measuring method, and method for expanding measuring range | |
| JP5203600B2 (en) | Gold colloid for in vitro diagnostics | |
| TWI614502B (en) | Detection method for detecting analyte concentration | |
| JP3408751B2 (en) | Immunochromatography equipment | |
| JP5177677B2 (en) | Method for measuring antigen and antibody against the antigen, and measuring reagent used therefor | |
| JP4585708B2 (en) | Method and reagent for measuring substance forming complex | |
| JP3140758B2 (en) | How to prepare sol | |
| JP2001108681A (en) | Reagent for determining immunoagglutination and measuring method | |
| JPH1048210A (en) | Method for adjusting sensitivity in analysis of specific bond | |
| JP4733595B2 (en) | Liquid reagent for measuring albumin in liquid samples | |
| KR20210112619A (en) | Reagent kit for detecting glycated albumin ratio and detection method of glycated albumin ratio using thereof | |
| EP0468591A2 (en) | Ligand analogs for immunoassays derived from dicarboxylic acid oxidation products | |
| WO2008075193A2 (en) | Assay devices and methods | |
| JPS6018763A (en) | Immunological measurement | |
| JPH05149947A (en) | Immunity reagent, test kit and quick assay for human chorionic gonadotropin | |
| JPH02203271A (en) | Method for measuring bilirubin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091021 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20100318 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120625 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120822 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130205 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130214 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5203600 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160222 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |