JP5203600B2 - Gold colloid for in vitro diagnostics - Google Patents
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Description
本発明は、体外診断薬として好適な金コロイドに関する。 The present invention relates to a gold colloid suitable as an in vitro diagnostic agent.
イムノクロマト法や生体物質の染色等による体外診断において、金コロイドを用いた診断方法が知られている。金コロイドを用いた場合、表面プラズモン共鳴により赤色の強い発色が観察可能となり、視覚による簡易的な診断が行える。また、金コロイドの発色は、時間経過による退色が少なく、生体物質等を固定した場合にも観察可能であるため、体外診断薬として好適である。 A diagnostic method using colloidal gold is known for in vitro diagnosis by immunochromatography or staining of biological materials. When gold colloid is used, strong red coloration can be observed by surface plasmon resonance, and simple visual diagnosis can be performed. In addition, the color development of colloidal gold is suitable as an in vitro diagnostic agent because it causes little fading over time and can be observed even when a biological substance or the like is fixed.
体外診断薬における金コロイドの具体的な使用方法としては、イムノクロマト法等において、金コロイドに抗体を固定した標識粒子を用いる方法が知られている。イムノクロマト法における使用例としては、抗原が存在する場合、前記標識粒子に抗原の結合した複合体を形成させて、移動層上を展開し、対応する抗体の固定された判定部において複合体を捕捉する方法が知られている。従って、この方法では、判定部において発色が見られるかどうかにより、抗原の有無を確認することができる。 As a specific method for using a gold colloid in an in vitro diagnostic agent, a method using a labeled particle in which an antibody is immobilized on a gold colloid is known in an immunochromatography method or the like. As an example of use in immunochromatography, when an antigen is present, the labeled particle forms a complex bound to the antigen, develops on the moving bed, and captures the complex in the determination part to which the corresponding antibody is immobilized. How to do is known. Therefore, in this method, the presence or absence of an antigen can be confirmed based on whether or not coloring is observed in the determination unit.
前記した標識粒子作成のため、金コロイドに抗体を固定する方法としては、溶媒中で金コロイドと抗体とを分散させ、物理吸着により固定する方法が知られているが、この際、金コロイド粒子同士の凝集を生じる場合があった。また、金コロイドに抗体以外のタンパク質が固定されることもあった。 As a method for immobilizing an antibody on a colloidal gold for producing the aforementioned labeled particles, a method is known in which a colloidal gold and an antibody are dispersed in a solvent and immobilized by physical adsorption. In some cases, agglomeration occurred between the two. In addition, proteins other than antibodies may be immobilized on the gold colloid.
そこで、金コロイド粒子同士の凝集を防ぎ、金コロイドに目的の抗体を選択的に固定するため、金コロイドをリンカーで修飾する方法が知られている。リンカーとは、共有結合等の形式で抗体の固定化を可能とする化合物であり、例えば、特許文献1には、SH基を有する非架橋デキストランまたはアミノデキストランからなるリンカーが示されている。また、特許文献2には、アルカンチオール、アルカンチオール誘導体、ジチオール化合物及びトリチオール化合物をリンカーとする金コロイドが示されている。このリンカーを用いることにより、抗体の特異的吸着を促進することができると共に、金コロイド同士の凝集も防ぐことができる。
Therefore, a method is known in which the colloidal gold is modified with a linker in order to prevent aggregation of colloidal gold particles and selectively fix the target antibody to the colloidal gold. A linker is a compound that enables immobilization of an antibody in a form such as a covalent bond. For example,
上述した体外診断薬は、診断の精度向上や早期発見が望まれるため、明確な発色により目的とする抗原等の有無が確認できること、抗原等が微量の場合にも検出可能であること等が求められる。従って、体外診断薬に用いる金コロイドとしては、発色の強度が大きく、微量の抗原とも反応して充分な発色を示すものが好適である。また、体外診断においては、目的の抗原等の種類により、様々な粒径の金コロイドを必要とする場合があるため、広範な粒径において良好な発色を示す金コロイドは、体外診断薬としての利用性が高い。 The above-mentioned in vitro diagnostic agents are required to improve diagnosis accuracy and early detection. Therefore, it is necessary to be able to confirm the presence or absence of the target antigen by clear color development, and to be detectable even when the amount of antigen is small. It is done. Accordingly, as the gold colloid used for the in-vitro diagnostic agent, a colloid having a high intensity of color development and reacting with a small amount of antigen to exhibit sufficient color development is preferable. In addition, in in vitro diagnosis, gold colloids with various particle sizes may be required depending on the type of target antigen, etc., so gold colloids that exhibit good color development over a wide range of particle sizes are useful as in vitro diagnostic agents. High availability.
以上のように、金コロイドは、上記した特性を満たしている場合に、体外診断薬として、より好適なものとなる。一方、前記した特許文献1や特許文献2に記載の金コロイドによれば、金コロイドの凝集を防ぎ、目的とする抗体を特異的に固定することが可能となるが、体外診断薬として特に好適な金コロイドとするための上記特性を、全て満たしているものではなかった。
As described above, the colloidal gold is more suitable as an in vitro diagnostic agent when it satisfies the above-described characteristics. On the other hand, according to the gold colloid described in
そこで、本発明は、体外診断薬として好適な金コロイドであって、発色の強度が大きく、微量の抗原とも反応して充分な発色を示す体外診断用の金コロイドの提供を目的とする。また、本発明は、広範な粒径において、良好な発色を示す体外診断薬用の金コロイドを提供する。 Therefore, an object of the present invention is to provide a gold colloid suitable for an in vitro diagnostic agent, which has a high color development intensity and reacts with a small amount of antigen to exhibit sufficient color development. The present invention also provides gold colloids for in vitro diagnostic agents that exhibit good color development over a wide range of particle sizes.
本発明者等は、鋭意検討を行い、上記課題を解決することのできる化合物を含むリンカーを見出し、本発明に想到した。すなわち、本発明は、金コロイドと、前記金コロイドを修飾し抗体を固定するためのリンカーと、を含む体外診断薬用金コロイドであって、前記リンカーは、化1及び/又は化2で示される化合物からなり、置換基R1、R2及び/又は炭素数n1、n2の異なる2種以上の化合物からなることを特徴とする体外診断薬用金コロイドに関する。
本発明における、化1又は化2で示される化合物は、アルキル基の末端にジスルフィド基又はチオール基を有し、アルキル基の他の端部に置換基R1又はR2を有する。ジスルフィド基とチオール基は、金コロイドを修飾する際に作用する置換基であり、置換基R1、R2は、抗体を固定する際に作用する置換基である。 In the present invention, the compound represented by Chemical Formula 1 or Chemical Formula 2 has a disulfide group or a thiol group at the terminal of the alkyl group, and has a substituent R 1 or R 2 at the other end of the alkyl group. The disulfide group and the thiol group are substituents that act when modifying the gold colloid, and the substituents R 1 and R 2 are substituents that act when immobilizing the antibody.
また、本発明の金コロイドは、置換基R1、R2及び/又は炭素数n1、n2の異なる2種以上の化合物からなるリンカーを含むことにより、発色の強度が大きく、微量の抗原とも反応して良好な発色を示す体外診断薬とすることができる。このような効果が得られるのは、本発明のリンカーであれば、置換基R1、R2及び/又は炭素数n1、n2を選択することにより、金コロイド1粒子当たりに固定される抗体数を調整でき、金コロイド1粒子当たりの発色強度を効率的に利用できるためであると考えられる。 In addition, the gold colloid of the present invention contains a linker composed of two or more compounds having different substituents R 1 and R 2 and / or carbon numbers n 1 and n 2. In vitro diagnostic agents that react well with each other and exhibit good color development. Such an effect can be obtained if the linker of the present invention is fixed per one colloidal gold particle by selecting the substituents R 1 and R 2 and / or the carbon number n 1 and n 2. This is probably because the number of antibodies can be adjusted, and the color intensity per gold colloid particle can be used efficiently.
尚、本発明の化1、化2で示される化合物は、置換基R1、R2が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アミノ基のいずれかであり、炭素数n1、n2が2〜10の範囲内のものである。上記した置換基は、それぞれ抗体と結合する反応性が異なるものであり、これら反応性の異なる置換基を含む化合物を2種以上用いることで、金コロイドに結合する抗体数を調整できると考えられるからである。また、炭素数n1、n2が2〜10で異なる2種以上の化合物を用いることも、同様に、金コロイドと抗体との反応性の違いを利用するためのものである。 In the compounds represented by the chemical formulas 1 and 2 of the present invention, the substituents R 1 and R 2 are any of a carboxyl group, a hydroxyl group, an aldehyde group, and an amino group, and the number of carbon atoms n 1 and n 2 is It is within the range of 2-10. Each of the above-described substituents has different reactivity for binding to an antibody, and it is considered that the number of antibodies bound to the colloidal gold can be adjusted by using two or more compounds containing substituents having different reactivity. Because. In addition, the use of two or more kinds of compounds having 2 to 10 carbon numbers n 1 and n 2 which are different from each other is also to utilize the difference in reactivity between the colloidal gold and the antibody.
また、本発明のリンカーは、化1、化2で示される化合物を両方含むものとすることができる。化1で示される化合物と、化2で示される化合物とは、アルキル基の一端にジスルフィド基を有するか、チオール基を有するかという相違点を有しているが、ジスルフィド基は、還元によって容易にチオール基となり、チオール基は、酸化によってジスルフィド基となる関係にある。従って、化1で示される化合物と、化2で示される化合物とは、相溶性が高いため、混合して用いることができるものと考えられる。 In addition, the linker of the present invention can include both compounds represented by Chemical Formula 1 and Chemical Formula 2. The compound represented by Chemical Formula 1 and the compound represented by Chemical Formula 2 are different in that they have a disulfide group or a thiol group at one end of the alkyl group, but the disulfide group is easily reduced by reduction. It becomes a thiol group, and the thiol group has a relationship of becoming a disulfide group by oxidation. Therefore, it is considered that the compound represented by Chemical Formula 1 and the compound represented by Chemical Formula 2 have high compatibility and can be used as a mixture.
上記したように、化1で示される化合物と化2で示される化合物とは、混合して用いることもできるが、本発明で適用するリンカーは、化1又は化2で示される化合物のいずれかのみからなることが好ましい。ジスルフィド基と、チオール基とは、抗体との反応性に違いがあると考えられるからである。すなわち、化1で示される化合物と、化2で示される化合物とを混合して用いると、置換基R1、R2及び/又は炭素数n1、n2の異なる2種以上の化合物を含むことにより抗体との反応性を調整した場合であっても、さらにジスルフィド基とチオール基との反応性の相違の影響が加わることから、目標とする反応性に調整しにくくなると考えられるからである。
As described above, the compound represented by the
化1又は化2で示される化合物のいずれかのみからなる場合、リンカーは、置換基R1又はR2がカルボキシル基である第1の化合物と、置換基R1又はR2がカルボキシル基以外の置換基である第2の化合物とを含むことが好ましい。抗体との反応性が異なる置換基を含む化合物を用いることにより、金コロイド1粒子当たりに固定される抗体の数を調整できると考えられるからである。また、上記した第2の化合物の置換基R1又はR2は、ヒドロキシル基であることが好ましい。カルボキシル基は、タンパク質中のアミノ基との結合性が高い置換基の1つとして知られており、ヒドロキシル基は、タンパク質中のアミノ基ともカルボキシル基とも、あまり反応しない置換基として知られている。このため、抗体との反応性が高いカルボキシル基と、反応性の低いヒドロキシル基を含むリンカーを用いれば、金コロイドに固定される抗体の数を、より正確に調整できると考えられる。
If consisting of only a compound represented by
また、カルボキシル基を有する第1の化合物と、カルボキシル基以外の置換基を有する第2の化合物とをリンカーとする場合、第1の化合物の炭素数と第2の化合物の炭素数との差は、2以上であることが好ましい。炭素数の差によっても、抗体との反応性に相違が生じることから、置換基の種類による抗体との反応性調整効果と併用することで、金コロイドに固定される抗体の数を、より正確に調整できる。さらに、第1の化合物は、炭素数n1又はn2が4〜10の化合物であり、第2の化合物は、炭素数n1又はn2が2〜8の化合物であることが好ましい。金コロイドを体外診断薬として用いた場合に、発色強度の大きなものとすることができ、微量の抗原とも反応して発色を示すものとできるからである。 When the first compound having a carboxyl group and the second compound having a substituent other than the carboxyl group are used as a linker, the difference between the carbon number of the first compound and the carbon number of the second compound is It is preferable that it is 2 or more. The difference in reactivity with the antibody also occurs due to the difference in the number of carbon atoms, so the number of antibodies immobilized on the colloidal gold can be determined more accurately by using it together with the reactivity adjustment effect with the antibody depending on the type of substituent. Can be adjusted. Further, the first compound is preferably a compound having 4 to 10 carbon atoms n 1 or n 2 , and the second compound is preferably a compound having 2 to 8 carbon atoms n 1 or n 2 . This is because when gold colloid is used as an in-vitro diagnostic agent, the color development intensity can be increased, and color development can be achieved by reacting with a small amount of antigen.
更に、カルボキシル基を有する第1の化合物と、カルボキシル基以外の置換基を有する第2の化合物とをリンカーとする場合、両化合物の混合比率は、モル比で1:1〜0.1:9.9とするのが好ましく、1:1〜1:9がさらに好ましい。1:1〜0.1:9.9の割合であれば、体外診断薬として良好な発色を示す金コロイドとなり、1:1〜1:9であれば、より発色強度の大きいものとすることができるからである。特に、金コロイドの粒径が大きい場合には、第2の化合物の割合を多くすることで、抗体との反応性を低くして、金コロイド1粒子当たりに固定される抗体数が過剰とならないように調整することが好ましいと考えられる。金コロイドの粒径が大きいと、金コロイド1粒子当たりに固定される抗体数が多くなりやすく、固定される抗体数が多いと、体外診断薬として用いる場合、診断に必要な量よりも過剰の抗原が必要になると考えられるからである。 Furthermore, when using the 1st compound which has a carboxyl group, and the 2nd compound which has substituents other than a carboxyl group as a linker, the mixing ratio of both compounds is 1: 1-0.1: 9 by molar ratio. .9, preferably 1: 1 to 1: 9. If the ratio is 1: 1 to 0.1: 9.9, a gold colloid showing good color development as an in-vitro diagnostic agent is obtained, and if it is 1: 1 to 1: 9, the color intensity is higher. Because you can. In particular, when the particle size of the gold colloid is large, the reactivity with the antibody is lowered by increasing the proportion of the second compound, and the number of antibodies immobilized per gold colloid particle does not become excessive. It is considered preferable to adjust so. If the colloidal gold particle size is large, the number of antibodies immobilized per colloidal gold particle tends to increase. If the number of immobilized antibodies is large, when used as an in vitro diagnostic agent, the amount is excessive in excess of that required for diagnosis. This is because an antigen is considered necessary.
尚、本発明の金コロイドは、粒径が10nm〜150nmであることが好ましく、40〜100nmであることがさらに好ましい。粒径が10nm〜150nmの金コロイドは、体外診断薬としての利用が可能であり、粒径40〜100nmであれば、充分な発光強度を示すものとすることができるからである。 The gold colloid of the present invention preferably has a particle size of 10 nm to 150 nm, more preferably 40 to 100 nm. This is because a gold colloid having a particle size of 10 nm to 150 nm can be used as an in vitro diagnostic agent, and if the particle size is 40 to 100 nm, it can exhibit sufficient emission intensity.
以上で説明した本発明の金コロイドは、イムノクロマトグラフ法に用いることができる。具体的には、イムノクロマトグラフ法では、試料を展開するための移動層と、前記移動層の一端に設けられ、抗原に対応する抗体が固定された金コロイドと、前記移動層の他方の端部に含まれる抗原の有無を判定するための部分と、を備えるイムノクロマトグラフィー用診断キットが用いられるが、この金コロイドとして本発明の体外診断薬用金コロイドを用いることができる。 The gold colloid of the present invention described above can be used for immunochromatography. Specifically, in the immunochromatography method, a moving layer for spreading a sample, a gold colloid provided at one end of the moving layer and immobilized with an antibody corresponding to an antigen, and the other end of the moving layer A diagnostic kit for immunochromatography comprising a portion for determining the presence or absence of an antigen contained in the intestine. As the gold colloid, the gold colloid for in vitro diagnostic agents of the present invention can be used.
以上で説明したように、本発明の金コロイドは、体外診断薬として好適な金コロイドとなる。また、発色の強度が大きく、微量の抗原であっても検出可能であり、広範な粒径において発色性が良好なものとなる。 As described above, the gold colloid of the present invention is a gold colloid suitable as an in vitro diagnostic agent. Moreover, the intensity of color development is large, even a very small amount of antigen can be detected, and the color developability is good over a wide range of particle sizes.
以下、本発明における最良の実施形態について説明する。 Hereinafter, the best embodiment of the present invention will be described.
金コロイドを形成させて、リンカーを修飾した後、抗体を固定して体外診断薬用の金コロイド(以下、抗体固定金コロイドという。)を作成した。そして、イムノクロマトグラフィーに用いるテストストリップを作成した後、抗体固定金コロイドと、抗原とを用いて、イムノクロマトグラフィーを行い、金コロイドによる発色の強度を測定した。 After colloidal gold was formed and the linker was modified, the antibody was immobilized to prepare a gold colloid for in vitro diagnostics (hereinafter referred to as antibody-immobilized gold colloid). Then, after preparing a test strip for use in immunochromatography, immunochromatography was performed using the antibody-immobilized gold colloid and the antigen, and the intensity of color developed by the gold colloid was measured.
[金コロイドの形成]
以下の方法により、平均粒径40nmの金コロイドを形成させた。塩化金酸四水和物0.17gと、クエン酸三ナトリウム二水和物0.49gとを、それぞれ超純水25mlと100mlに溶解させて、塩化金酸溶液とクエン酸溶液を調製した。次に、500mlの三口フラスコ内に、塩化金酸溶液6mlと純水200mlとを投入して、30分間加熱還流させた。液温が安定した後、クエン酸溶液50mlを混合して、15分間加熱還流した。その後、加熱を停止して室温で放冷し、核コロイドを形成させた。この核コロイド26mlを、500mlの三口フラスコに入れ、液温が30℃になるまで恒温層内で撹拌した。液温が安定したら、塩化金酸四水和物0.076gを溶解させた塩化金酸溶液252mlと、L−アスコルビン酸ナトリウム0.092gを溶解させたL−アスコルビン酸溶液256mlとを同時に滴下して、1時間撹拌しながら反応させて、平均粒径40nmの金コロイドを形成させた。
[Gold colloid formation]
A gold colloid having an average particle size of 40 nm was formed by the following method. A chloroauric acid solution and a citric acid solution were prepared by dissolving 0.17 g of chloroauric acid tetrahydrate and 0.49 g of trisodium citrate dihydrate in 25 ml and 100 ml of ultrapure water, respectively. Next, 6 ml of chloroauric acid solution and 200 ml of pure water were put into a 500 ml three-necked flask and heated to reflux for 30 minutes. After the liquid temperature was stabilized, 50 ml of citric acid solution was mixed and heated to reflux for 15 minutes. Thereafter, heating was stopped and the mixture was allowed to cool at room temperature to form a nuclear colloid. 26 ml of this nuclear colloid was placed in a 500 ml three-necked flask and stirred in the thermostatic layer until the liquid temperature reached 30 ° C. When the liquid temperature is stabilized, 252 ml of chloroauric acid solution in which 0.076 g of chloroauric acid tetrahydrate is dissolved and 256 ml of L-ascorbic acid solution in which 0.092 g of sodium L-ascorbate is dissolved are added dropwise simultaneously. Then, the reaction was carried out with stirring for 1 hour to form a gold colloid having an average particle size of 40 nm.
また、平均粒径80nmの金コロイドは、上記により得られた平均粒径40nmの金コロイドを用いて形成させた。平均粒径40nmの金コロイド33.3mlを500mlの三口フラスコに入れ、液温が30℃になるまで恒温層内で撹拌した。液温が安定したら、塩化金酸四水和物0.039gを溶解させた塩化金酸溶液118mlと、L−アスコルビン酸ナトリウム0.043gを溶解させたL−アスコルビン酸溶液120mlとを同時に滴下して、1時間撹拌しながら反応させた。 Moreover, the gold colloid with an average particle diameter of 80 nm was formed using the gold colloid with an average particle diameter of 40 nm obtained by the above. Gold colloid (33.3 ml) having an average particle diameter of 40 nm was placed in a 500 ml three-necked flask and stirred in a constant temperature layer until the liquid temperature reached 30 ° C. When the liquid temperature is stable, 118 ml of chloroauric acid solution in which 0.039 g of chloroauric acid tetrahydrate is dissolved and 120 ml of L-ascorbic acid solution in which 0.043 g of sodium L-ascorbate are dissolved are added dropwise simultaneously. And allowed to react with stirring for 1 hour.
100nmの金コロイドは、平均粒径40nmの金コロイド33.4mlに対し、塩化金酸四水和物0.079gを溶解させた塩化金酸溶液247mlと、L−アスコルビン酸ナトリウム0.092gを溶解させたL−アスコルビン酸溶液251mlとを滴下したこと以外は、平均粒径80nmの金コロイドと同様の方法によって形成させた。 The gold colloid of 100 nm dissolves 247 ml of chloroauric acid solution in which 0.079 g of chloroauric acid tetrahydrate is dissolved and 0.092 g of sodium L-ascorbate in 33.4 ml of gold colloid having an average particle diameter of 40 nm. A gold colloid having an average particle size of 80 nm was formed in the same manner as that except that 251 ml of the L-ascorbic acid solution was dropped.
[リンカーの修飾]
上記方法により形成した粒径が40、80、100nmの金コロイドに、炭素数n1、n2や、置換基R1、R2の異なる第1の化合物及び第2の化合物を含むリンカーを修飾させた。第1実施形態〜第4実施形態のそれぞれについて、金コロイドの粒径、リンカーとして用いた第1の化合物及び第2の化合物の種類、第1の化合物と第2の化合物とを含む割合のモル比を、表1に示す。
[Modification of linker]
A gold colloid having a particle size of 40, 80, or 100 nm formed by the above method is modified with a linker containing the first compound and the second compound having different carbon numbers n 1 and n 2 and substituents R 1 and R 2. I let you. For each of the first to fourth embodiments, the particle size of the colloidal gold, the types of the first compound and the second compound used as the linker, and the moles of the ratio including the first compound and the second compound The ratio is shown in Table 1.
第1実施形態は、粒径80nmの金コロイドに、化1の化合物(ジスルフィド基を有する)のみを含むリンカーを修飾させたものと、化2の化合物(チオール基を有する)のみを含むリンカーを修飾させたものとした。第2実施形態は、炭素数n1が3、5、7、10である第1の化合物を含むリンカーを修飾させたものとした。第3実施形態では、金コロイドの粒径が40nm、80nm、100nmである場合において、第1の化合物と第2の化合物とのモル比を10:0、5:5、1:9としたリンカーを修飾させた。第4実施形態は、第1の化合物のみを含むリンカーを金コロイドに修飾させたものであり、炭素数n1が10である第1の化合物と、炭素数n1が3、5、7、10である第1の化合物とを、モル比で1:9の割合で含むリンカーを用いた。 In the first embodiment, a colloidal gold having a particle size of 80 nm is modified with a linker containing only the compound of formula 1 (having a disulfide group) and a linker containing only the compound of formula 2 (having a thiol group). It was assumed to be modified. In the second embodiment, the linker containing the first compound having carbon number n 1 of 3, 5, 7, 10 is modified. In the third embodiment, when the colloidal gold particle size is 40 nm, 80 nm, or 100 nm, the molar ratio of the first compound to the second compound is 10: 0, 5: 5, 1: 9. Was modified. In the fourth embodiment, a linker containing only the first compound is modified with a gold colloid, and the first compound having a carbon number n 1 of 10 and the carbon number n 1 of 3, 5, 7, A linker containing a first compound of 10 at a molar ratio of 1: 9 was used.
具体的なリンカーの修飾方法について、第3実施形態におけるモル比5:5の金コロイドを例として説明する。上記方法により得られた金コロイド100mlに、リンカーである第1の化合物のメタノール溶液5ml(濃度10μM)と、第2の化合物のメタノール溶液5ml(濃度10μM)とを添加し、室温で24時間反応させた。その後、10mM ホウ酸緩衝液(pH 8.1)1Lにより5時間の透析を3回行い未反応の溶液を取り除いて、リンカーを修飾した金コロイドを得た。その他の実施形態についても、それぞれ上記と同様の方法によりリンカーの修飾を行った。
A specific linker modification method will be described with reference to a gold colloid having a molar ratio of 5: 5 in the third embodiment as an example. To 100 ml of gold colloid obtained by the above method, 5 ml of methanol solution (
[抗体の固定]
上記方法により、粒径及びリンカーが異なるそれぞれの金コロイドについて、抗体を固定させた。抗体には、妊娠の成立を診断するために用いる絨毛性性腺刺激ホルモン抗体を用いた。リンカーを修飾した金コロイド900μlに、0.04mM 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボキシルイミド塩酸塩100mlを加えて10分間反応させて、100μg/ml絨毛性性腺刺激ホルモン抗体(抗ヒトモノクローナル抗体 clone5008、Biochemica社製)100μlを加え、3時間室温で反応させた。尚、カルボキシルイミド塩酸塩と、絨毛性性腺刺激ホルモン抗体には、緩衝液として10mM ホウ酸緩衝液(pH8.1)を使用した。
[Immobilization of antibody]
By the above method, the antibody was immobilized on each gold colloid having a different particle size and linker. As the antibody, a chorionic gonadotropin antibody used for diagnosing the establishment of pregnancy was used. To 900 μl of gold colloid modified with a linker, 100 ml of 0.04 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carboxylimide hydrochloride was added and allowed to react for 10 minutes to give 100 μg / ml chorionic gonadotropin antibody (anti-antigen). 100 μl of human monoclonal antibody clone 5008 (manufactured by Biochemica) was added and reacted at room temperature for 3 hours. In addition, 10 mM borate buffer solution (pH 8.1) was used as a buffer solution for carboxylimide hydrochloride and chorionic gonadotropin antibody.
その後、1% ポリエチレングリコール20000(50mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)を使用した。)を50μlと、10% ウシ血清アルブミン(以下、BSAという。:50mM リン酸カリウム緩衝液(pH9.0)を使用した。)100μlを加え、さらに10分間反応させた。その後、4℃において、15分間遠心分離を行い、上澄みの9割程度を除去して、沈降した抗体固定金コロイドを採取した。採取した沈殿は、超音波分散させた後、保存液(1.0% BSA、0.05% ポリエチレングリコール20000、0.1% NaN3、150mM NaCl、20mM Tris−HCl(pH8.2))900μlを加えた。この遠心分離による洗浄を、3回繰り返し行った。尚、遠心分離は、金コロイドの粒径が40nmの場合3000×g、80nm及び100nmの場合1500×gの条件で行った。洗浄後の抗体固定金コロイドは、分光光度計で吸光度を測定し、波長520〜600nmの間における吸光度の最大値が6となるよう、保存液を用いて調整を行った。 Thereafter, 50 μl of 1% polyethylene glycol 20000 (50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) was used) and 10% bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA): 50 mM potassium phosphate buffer (pH 9.0) ) 100 μl was added and allowed to react for another 10 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 4 ° C. for 15 minutes to remove about 90% of the supernatant, and the precipitated antibody-immobilized gold colloid was collected. The collected precipitate was subjected to ultrasonic dispersion, and then a stock solution (1.0% BSA, 0.05% polyethylene glycol 20000, 0.1% NaN 3 , 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.2)) 900 μl Was added. This washing by centrifugation was repeated three times. Centrifugation was performed under the conditions of 3000 × g when the particle size of the gold colloid was 40 nm and 1500 × g when the particle size was 80 nm and 100 nm. The antibody-immobilized gold colloid after washing was measured for absorbance with a spectrophotometer, and was adjusted using a preservation solution so that the maximum absorbance between wavelengths of 520 and 600 nm was 6.
比較として、リンカーを修飾していない金コロイドについて、抗体固定金コロイドを作成した。平均粒径40nm、80nm、100nmの金コロイドを用いて、50mM KH2PO4(pH7.5)100μlと、100μg/ml絨毛性性腺刺激ホルモン抗体(5mM KH2PO4(pH7.5))100μlとを添加して10分間反応させた以外は、上記と同様の方法により、抗体固定金コロイドを作成した。 For comparison, an antibody-immobilized gold colloid was prepared for a gold colloid in which the linker was not modified. 100 μl of 50 mM KH 2 PO 4 (pH 7.5) and 100 μl of 100 μg / ml chorionic gonadotropin antibody (5 mM KH 2 PO 4 (pH 7.5)) using gold colloid having an average particle size of 40 nm, 80 nm, and 100 nm An antibody-immobilized gold colloid was prepared in the same manner as described above except that and were allowed to react for 10 minutes.
[テストストリップの作成]
イムノクロマトグラフィーによる診断のための、テストストリップを作成した。移動層であるメンブレン上に、抗原の有無を判定するためのテストラインと、金コロイドが、メンブレン上で正常に発色しているかどうかの目安となるコントロールラインとを作成した。テストラインには、抗原と複合体を形成した抗体固定金コロイドのみを捕捉する抗体を塗布し、コントロールラインには、抗原を含まない抗体固定金コロイドを捕捉する抗体を塗布した。
[Create test strip]
Test strips were prepared for immunochromatographic diagnosis. A test line for determining the presence or absence of an antigen on a membrane serving as a moving layer, and a control line serving as a guideline for determining whether or not the gold colloid is normally colored on the membrane were prepared. The test line was coated with an antibody that captures only the antibody-fixed gold colloid that formed a complex with the antigen, and the control line was coated with an antibody that captures the antibody-fixed gold colloid that does not contain the antigen.
テストラインは、抗体として抗hαS抗体を用いた溶液(表2)を調整し、この溶液0.75μlを、定量分注装置(Biojet Quanti 3000、BioDot社製)により、50mm/秒、20.83nL/dot、0.28mmピッチの条件で、メンブレンに塗布して作成した。尚、メンブレンとしては、ニトロセルロース製で、幅25mm、長さ30cmのものを使用した。 A test line prepared a solution (Table 2) using an anti-hαS antibody as an antibody, and 0.75 μl of this solution was 50 mm / sec, 20.83 nL using a quantitative dispensing device (Biojet Quanti 3000, manufactured by BioDot). The film was applied to the membrane under the conditions of / dot and 0.28 mm pitch. As the membrane, a membrane made of nitrocellulose and having a width of 25 mm and a length of 30 cm was used.
コントロールラインは、抗体として抗マウス抗体を用いた溶液(表3)を調整し、テストラインと同様の塗布条件で、メンブレン上に作成した。 A control line was prepared on a membrane by preparing a solution (Table 3) using an anti-mouse antibody as an antibody under the same coating conditions as the test line.
テストライン及びコントロールラインを形成したメンブレンは、インキュベータで、42℃において1時間乾燥させた後、室温でさらに2時間乾燥させた。その後、抗体固定金コロイドのニトロセルロース膜への吸着を防ぐブロッキング溶液である0.5%カセイン(50mM ホウ酸緩衝液(pH8.5))に、まずテストライン側を浸漬し、その後に全体を浸漬して、室温で30分静置した。その後、ブロッキング溶液からメンブレンを取り出し、余分な試薬を除いた後、洗浄液である0.01% ドデシル硫酸ナトリウム(5mM リン酸緩衝液(pH7.5))に、前記と同様に浸漬し、30分静置した。洗浄液からメンブレンを取り出し、24時間静置した後、吸収パッドを貼り付けて、4mm幅に切断した。 The membrane on which the test line and the control line were formed was dried in an incubator at 42 ° C. for 1 hour, and further dried at room temperature for 2 hours. Thereafter, the test line side is first immersed in 0.5% casein (50 mM borate buffer (pH 8.5)), which is a blocking solution that prevents the antibody-immobilized gold colloid from adsorbing to the nitrocellulose membrane. Immersion and let stand at room temperature for 30 minutes. Then, after removing the membrane from the blocking solution and removing excess reagents, the membrane was immersed in 0.01% sodium dodecyl sulfate (5 mM phosphate buffer (pH 7.5)) as a washing solution in the same manner as described above for 30 minutes. Left to stand. The membrane was taken out from the cleaning solution and allowed to stand for 24 hours, and then an absorbent pad was attached and cut to a width of 4 mm.
[イムノクロマトグラフィー]
マイクロプレートに、抗原であるリコンピナントhCG(1%BSA、50mM リン酸緩衝液(pH7.4))を40μlと、抗体固定金コロイド4μlとを投入して混合した後、テストストリップを差し込み展開させた。
[Immunochromatography]
40 μl of antigen recombinant hCG (1% BSA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.4)) and 4 μl of antibody-fixed gold colloid were mixed in the microplate, and then the test strip was inserted and developed. .
[発色強度の測定]
イムノクロマトグラフィーを行った後、メンブレン上のテストラインにおいて、金コロイドの発色強度を測定した。測定には、反応ライン自動読み取り機器(Quad Scan:Bio Dot社製)を用いた。第1実施形態〜第4実施形態のリンカーを修飾した金コロイドの発色強度について、リンカーを修飾しなかった金コロイドの発色強度に対する比率を算出した結果を図1〜4のグラフに示す。
[Measurement of color intensity]
After immunochromatography, the color intensity of colloidal gold was measured on a test line on the membrane. For the measurement, a reaction line automatic reading device (Quad Scan: manufactured by Bio Dot) was used. The graph of FIGS. 1-4 shows the result of having calculated the ratio with respect to the coloring intensity of the gold colloid which modified the linker of 1st Embodiment-4th Embodiment with respect to the coloring intensity of the gold colloid which did not modify a linker.
図1より、第1の化合物と第2の化合物とを、モル比で1:9の割合で含むリンカーを用いた金コロイドによれば、化1のみを用いた場合であっても、化2のみを用いた場合であっても、リンカーを修飾しなかった金コロイドに対する発色強度の比率が100%以上となり、充分な発色を示す金コロイドとなることが分かった。また、図2より、第1の化合物の炭素数n1が5、7、10である場合には、n1が3の場合に比べて発色強度の高いものとなることが分かった。
According to FIG. 1, according to the gold colloid using the linker containing the first compound and the second compound in a molar ratio of 1: 9, even when only
図3より、粒径40、80、100nmのいずれの金コロイドを用いたにも、リンカーを修飾しなかった金コロイドに対する発色強度の比率が100%以上となり、良好な発色が示される金コロイドとなることが分かった。また、第1の化合物と第2の化合物との割合のモル比は、粒径40nmの場合は5:5(すなわち1:1)、粒径80nm及び100nmの場合には1:9であると、金コロイドの発色強度がより高いものとなることが分かった。 From FIG. 3, the gold colloid having a color development intensity of 100% or more with respect to the gold colloid in which the linker is not modified with any gold colloid having a particle size of 40, 80, or 100 nm is shown to be good color development. I found out that The molar ratio of the ratio of the first compound to the second compound is 5: 5 (ie, 1: 1) when the particle size is 40 nm, and 1: 9 when the particle size is 80 nm and 100 nm. It was found that the color intensity of the colloidal gold was higher.
そして、図4より、第1の化合物のみを用いた場合の金コロイドは、リンカーを修飾しなかった金コロイドに対する発色強度の比率が100%程度であり、発色強度が高くなりにくいことが分かった。 FIG. 4 shows that the gold colloid using only the first compound has a color development intensity ratio of about 100% with respect to the gold colloid not modified with the linker, and the color development intensity is hardly increased. .
Claims (6)
前記リンカーは、化1で示される化合物であって、
置換基R 1 がカルボキシル基である第1の化合物と、置換基R 1 がヒドロキシル基である第2の化合物とを含み、
更に、第1の化合物の炭素数n1と第2の化合物の炭素数n1とが異なるものである、体外診断薬用金コロイド。
The linker is a compound represented by Chemical Formula 1,
A first compound in which the substituent R 1 is a carboxyl group, and a second compound in which the substituent R 1 is a hydroxyl group,
Furthermore, the number of carbon atoms of the first compounds n 1 and the number of carbon atoms n 1 of the second compound is different from, in vitro diagnostic medicinal colloidal gold.
前記移動層の一端に設けられ、抗原に対応する抗体が固定された金コロイドと、
前記移動層の他方の端部に含まれる抗原の有無を判定するための部分と、を備えるイムノクロマトグラフィー用診断キットであって、
前記金コロイドは、請求項1〜請求項5のいずれかに記載の金コロイドであるイムノクロマトグラフィー用診断キット。
A moving bed for developing the sample;
A colloidal gold provided at one end of the moving layer, to which an antibody corresponding to the antigen is immobilized;
A portion for determining the presence or absence of an antigen contained in the other end of the moving layer, and a diagnostic kit for immunochromatography comprising:
The said gold colloid is a diagnostic kit for immunochromatography which is a gold colloid in any one of Claims 1-5 .
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