JP5192693B2 - Pamの使用 - Google Patents
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Description
的フラグメントもしくは誘導体の使用によって解決される。
AW921303(hscDNAのbp960〜1394に対応する;配列番号4)
AW918711(hscDNAのbp8188〜8632に対応する;配列番号5)
BQ201485(hscDNAのbp8966〜9633に対応する;配列番号6)
BE112881(hscDNAのbp10311〜10830に対応する;配列番号7)
AW441131(hscDNAのbp13569〜14152に対応する;配列番号8)
BF409872(hscDNAのbp13569〜14807に対応する;配列番号9)。
a)PAMの機能を活性化または増強する能力(すなわち、その、細胞内cAMPレベルを低める能力、ACのようなその他のファクター(特にAC)と相互作用する能力、ACを阻害する能力、または、その痛みの感覚を低める能力)、または、
b)PAMをRNAレベルで活性化する能力(すなわち、PAM転写の活性化、または、転写物の安定化によって)、または、
c)PAMをタンパク質レベルで活性化する(すなわち、PAMの翻訳またはその翻訳後プロセシングの活性化によって;PAMの翻訳後修飾調節によって、または、その安定の活性化もしくはその分解の阻害によって)。
a.2つのサンプルを準備する工程、
b。PAMまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含む1つのサンプルと、化合物とを接触させる工程、
c.化合物の存在下で、PAM活性を決定する工程、
d.化合物の非存在下で、PAM活性を決定する工程、および、
e.c)によるPAM活性と、d)によるPAM活性とを比較する工程。
クレオチドである。
1)標識されたプローブと解析しようとする核酸サンプルとを、65℃で、または、オリゴヌクレオチドプローブの場合、オリゴヌクレオチドとサンプルとからなる二本鎖のアニーリング温度または融解温度より5℃低い温度で(アニーリング温度および融解温度は、以下では同義語とする)一晩、50mMトリス(pH7.5)、1MのNaCl、1%SDS、10%硫酸デキストラン、0.5mg/mlの変性サケまたはニシン精子DNA中で、ハイブリダイズする。
2)2×SSC中で、室温で10分間洗浄する。
3)1×SSC/0.1%SDS中で、65℃(または、オリゴヌクレオチドの場合:アニーリング温度より5℃低い温度)で、30分間洗浄する。
4)0.1×SSC/0.1%SDS中で、65℃(または、オリゴヌクレオチドの場合:アニーリング温度より5℃低い温度)で、30分間洗浄する。
a)試験化合物として、PAMの活性を調節する化合物を選択すること、および、
b)前記試験化合物を被検体に投与して、痛みが調節されているかどうかを測定すること。
1.動物切片標本の製造:
野生型スプラギー・ダーレー(Sprague Dawley)ラットを、チャールス・リバー・ウィガ社(Charles River Wiga GmbH,ズルツフェルト,ドイツ)から購入した。実験の前は、動物は、えさと水を自由に摂取できるようにした。それらを環境と光を制御した部屋(24+0.5℃)で維持した。各動物は、1回の実験のみで用いられた。全ての実験において、意識のある動物を研究するための倫理ガイドラインに従い、その手法は、地域倫理委員会で認証された。殺した後に、成体ラットを、0.1Mリン酸緩衝食塩水(PBS,pH7.2)中の4%パラホルムアルデヒドで、1時間潅流することによって固定した。組織を、クライオスタットを用いて、水平面で厚さ14〜16μmの切片標本にした。切片標本を、スーパーフロスト・プラス・スライド(Superfrost Plus Slides)(フィッシャー・サイエンティフィック社(Fisher Scientific Co.),ピッツバーグ,ペンシルベニア州)にマウントし、使用するまで−80℃で保存した。
リボプローブを、これまで説明した通りにして作成した(Yang等,2002年)。ラットPAMのアンチセンス、および、センスリボプローブを、プラスミドをHindIII(アンチセンス)およびBamHI(センス)で線状化した後に、それぞれT7およびT3ポリメラーゼを用いて得た(Yang等,2002年を参照)。インビトロでの転写を、製造元(プロメガ(Promega),マディソン,ウィスコンシン州)の推奨に従って、[35S]UTP−αS(ICN,アーバイン,カリフォルニア州)、線状化したPAMcDNA、NTPの存在下で、37℃で1時間行った。RNAの転写物を、RNAプローブ精製キット(Pequlab,エルランゲン,ドイツ)を用いて精製した。
インサイチュハイブリダイゼーションを、前述した通りに行った(Yang等,2002年):切片標本を、0.1Mリン酸緩衝食塩水(pH7.2)中の4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.25%無水酢酸と0.1Mトリエタノールアミンで前処理し、0.2×SSCでリンスし、アルコール濃度を連続的に高めて脱水させた。切片標本を、プレハイブリダイゼーション溶液(50%脱イオン化ホルムアミド、0.6M塩化ナトリウム、10mMトリスHCl(pH7.6)、50mMのEDTA、0.025%ピロリン酸ナトリウム、0.02%フィコール、0.02%BSA、0.02%ポリビニルピロリドン、10mMのDTT、および、熱変性させた異種核酸(0.005%の酵母tRNA、タイプX、0.05%の酵母全RNA、タイプI、0.05%サケ精巣DNA、タイプIII))で、室温で2時間プレハイブリダイズさせ;ハイブリダイゼーション溶液(2.5×106cpm/切片標本)、50%脱イオン化ホルムアミド、および、50%ハイブリダイゼーション緩衝液[0.6M塩化ナトリウム、10mMトリスHCl(pH7.6)、50mMのEDTA、0.025%ピロリン酸ナトリウム、0.02%フィコール、0.02%BSA、0.02%ポリビニルピロリドン、熱変性させた異種核酸(0.005%の酵母tRNA、タイプX、0.005%の酵母全RNA、タイプI、0.05%サケ精巣DNA、タイプIII)、100mMのDTT、0.0005%ポリアデニル酸、10%硫酸デキストランを含む]中で、50℃で一晩、リボプローブとハイブリダイズさせた。切片標本を、RT(室温)で、2×、1×、0.5×SSCでリンスした。20μg/mlのRNアーゼA(シグマ,セントルイス,ミズーリ州)中で消化させた後、切片標本を、室温で、1×RNアーゼ緩衝液、2×、1×、0.5×SSC中で、および、45℃で、0.1×SSC中で一晩洗浄した。切片標本をアルコール濃度を連続的に高めて脱水させ、コダック(Kodak)のバイオマックスMRフィルム(Biomax MR film)(コダック,ロチェスター,ニューヨーク州)に−80℃で3〜7日間露光した。
ヒトPAMのアミノ酸残基135〜153および4601〜4614(それぞれ配列番号1に対応する)からなるペプチド(バイオトレンド(BioTrend),ケルン,ドイツ)を用いて、抗血清をウサギで商業的に生成させた。その抗血清を、標準的な手法に従って、バイオトレンド(ケルン,ドイツ)で商業的に生産させた。脊髄とDRGの切片におけるPAMの分布をモニターするために、切片を、0.1%トリトンX−100中で5分間浸透させた。切片を、PBS中の3%BSA中で1時間ブロッキングし、次に、抗PAM抗血清(1:50希釈)と共に1時間インキュベートした。続いて、これを、3%BSAを含むPBS中のFITC標識したヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートした。次に、切片をPBSで洗浄し、フルオマウント(fluoromount)TMを用いてマウントした。
ラットの脊髄およびDRGからの全RNAを、グアニジンイソチオシアネート/フェノール/クロロホルム抽出によって単離した(ChomczynskiおよびSacchi,1987年)。全RNA2μgを、0.6μMのそれぞれのオリゴ(dT)プライマーとアニールし、逆転写酵素(プロメガ,マディソン,ウィスコンシン州)を用いて37℃で30分間逆転写した。次に、即座にcDNAを増幅に用いた。ラットGADPHの増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、5’−GAAGGGTGGGGCCAAAAG−3’(センス;配列番号10)、および、5’−GGATGCAGGGATGATGTTCT−3’(アンチセンス;配列番号11;Trajkovic等,2000年)であった。ACアイソフォームを増幅するためのプライマーを、Bek等によって公開されているようにして選択した(Bek等,2001年)。ラットPAMのためのプライマーは、5’−GGTGGTGAAGCTCGCTGTGATGCT−3’(センス;配列番号12)、および、5’−CGTGTGAGCATTTCTGCACACTCC−3’(アンチセンス;配列番号13)であった。そのPCR産物は、ヒトPAMcDNAヌクレオチド13692〜14064に対応する。それに対応するラット配列は、ESTクローンAW441131(配列番号8)から得た。半定量PCRのために、SAWDAY DNAポリメラーゼ(Peqlab,エルランゲン,ドイツ)を用いた。最初の95℃で5分間での変性工程の後に、95℃で1分間、55℃で30秒間、および、72℃で10秒間の30サイクルを行い、その後に、最終の72℃で10分の伸長工程を行った。定量PCRを、TaqmanTMシステムおよび試薬(アプライド・バイオシステムズ,ヴァイターシュタット,ドイツ)を製造元の説明書に従って用いて行った。
以前に公開されたように、ただし数箇所を改変してPAM精製を行った(Scholich等。2001年)。簡単に言えば、HeLa細胞を、10%ウシ胎仔血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM培地中で増殖させた。40個の150mm培養皿の密集した細胞を、1×PBS、1mMのEDTAを用いて回収し、400×gで5分間沈殿させた。細胞を、125mMのNaCl、20μg/mlのアプロチニン、20μg/mlのロイペプチン、1mMのベンズアミジン、5μg/mlのダイズトリプシンインヒビターを含むTED緩衝液(50mMトリスHCl(pH8.0)、1mMのEDTA、1mMのDTT)に再懸濁させ、超音波破砕を2×5秒間行い溶解させた。ホモジネートを、27000×gで、4℃で30分間で遠心分離し、上清を、Q−セファロースXK16カラム(アマシャム・ファルマシア(Amersham Pharmacia),ピスカタウェイ,ニュージャージー州)にローディングし、製造元の説明書に従って、TED中で、150〜350mMのNaClの濃度勾配で溶出させた。標準的な手法に従ってウェスタンブロッティングで分画を解析した;陽性の分画をプールし、そのNaCl濃度を1Mに調節した。次に、タンパク質を、フェニル−セファロースXK16カラム(アマシャム・ファルマシア,ピスカタウェイ,ニュージャージー州)にローディングし、製造元の説明書に従って、TED中の300mMのNaClで洗浄した。流出液分画および洗浄分画にPAMが含まれていた。それらをプールし、製造元の説明書に従って、セントリコン(Centricon)50(アミコン(Amicon),ビバリー,マサチューセッツ州)を用いて緩衝液を上述の100mMのNaClを含むTED緩衝液で交換した。次に、タンパク質を、モノS(Mono S)5/5FPLCカラム(アマシャム・ファルマシア,ピスカタウェイ,ニュージャージー州)にローディングし、製造元の説明書に従って、ローディング緩衝液(TED中、100mMのNaCl)で洗浄した。流出液を回収し、モノQ(Mono Q)5/5FPLCカラム(アマシャム・ファルマシア,ピスカタウェイ,ニュージャージー州)にアプライした。タンパク質を、TED中の150〜400mMのNaClの濃度勾配で溶出させた。陽性の分画をプールし、セントリコン(Centricon)50(アミコン(Amicon),ビバリー,マサチューセッツ州)を用いて緩衝液を50mMトリスHCl(pH8.0)、1mMのDTTと交換し、−80℃で保存したで。保存したPAMは、3週間以内に用いた。
ヘキサヒスチジルタグを有する構成的に活性なGsαのQ213L突然変異体(Gsα*)を、発現させ、Graziano等,1991年で説明されている通りに精製した。Gsα*の最大活性化を確認するために、AC活性分析で使用する前に、MgCl2(25mM)の存在下で、30分間、Gタンパク質を、1μMのGTPγSとインキュベートした。
脊髄を、25mMのHepes(pH7.4)、1mMのEGTA中で溶解させ、KassisおよびFishmanによって説明された通りに細胞膜を調製した。アリコートを使用するまで−80℃で保存した。AC活性分析を、以前に説明された通りに、容積100μlで、室温で15分間、100μMのMgCl2の存在下で行った(Patel等,2002年)。Gsα*(80nM)、または、フォルスコリン(100μM)を用いて、膜中のAC酵素活性(タンパク質10μg)を刺激した。
ラットを、ケタミン(60mg/kg,腹腔内)と、ミダゾラム(0.5〜1mg/kg,腹腔内)で麻酔した。椎骨Th13からL3までの脊柱の上で皮膚を切開した。L2〜3周辺の筋肉組織を取り除いた。L3の棘突起を除去し、L2で椎弓切除術を施した。次に、ポリエチレン製カテーテル(ID0.28mm、OD0.61mm)を、カテーテルの先端がTh9〜10に達するように硬膜外腔に挿入した。カテーテルをシアノアクリレート系接着剤で固定し、頚部の領域で外部に露出させ、皮膚を縫合した。
オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の配列を、以下のようにラットPAM配列から選択した。センス:5’−GACTGGTTTAGCAATGGC−3’(配列番号14)、アンチセンス:5’−GCCATTGCTAAACCAGTC−3’(配列番号15)、および、3つの突然変異(3M−as;突然変異は下線で示した)を含むアンチセンスODN:5’−GCAATTGCTAAATCAGTA−3’(配列番号16)。外科手術の3日後に、ラットを「自由行動系」(CMA,ストックホルム,スウェーデン)の状態に置き、アンチセンス(n=5)、または、センス(n=5)オリゴヌクレオチド(人工髄液中、2.5mg/ml)をカテーテルを通じて、微量注入ポンプ(CMA,ストックホルム,スウェーデン)を用いて、0.05〜0.1μl/分の低速で、100時間注入した。
注入を止めた後15分以内に、ホルマリン試験を行った。5%ホルムアルデヒド溶液50μlを、1本の後肢の背面の皮下に(s.c.)注射した。ホルマリン注射の直後に開始して、1分間のインターバルで60分間まで、フリンチ行動をカウントした。5分間のインターバルのフリンチ行動を、1分あたりの平均フリンチ行動として要約した。グループ間の侵害受容の挙動を比較するために、フリンチ行動の、1時間の観察期間の第二相の合計を、スチューデントのt検定で処理した。αを0.05に設定した。
炎症を誘発させるために、0.03Mのリン酸緩衝食塩水(PBS,pH7.5)30μ
lに懸濁したザイモサンA2.5mg(シグマ,セントルイス,ミズーリ州)を、右の後肢の足底の中央部の領域に皮下注射した。このような足底内部へのザイモサン注射は、信頼できる温熱性および機械刺激痛覚過敏ラットのモデルを誘導することがわかっている(MellerおよびGebhart,1997年)。ラットを、ザイモサン注射の24〜96時間後に、深いイソフルラン麻酔下で心臓穿刺を行うことにより殺した。腰髄および後根神経節(DRG)を切り出し、液体窒素中で急速冷凍し、さらなる解析まで−80℃で保存した。
上記の発明者等によるRT−PCR、免疫組織化学およびインサイチュハイブリダイゼーションを用いた実験で、PAMは、成体ラットの脊髄の感覚ニューロン、同様に、後根神経節(DRG)で発現されることがが初めて実証された。RT−PCRによれば、PAMのmRNAは、脊髄と後根神経節とで発達を通して(E14〜成体)同様のレベルで検出された。PAM発現は、ウェスタンブロットおよびRT−PCRで示されるように、ラットのザイモサン処理の24〜48時間後にアップレギュレートされる。
性が高いようである。
上述したPAMの鎮痛作用に関する証拠は、例えば、以下の仮想的実験によって裏付けることができるだろう:例えば急性の痛みのホルマリンモデルにおけるPAMの鎮痛作用は、例えば、アミノ酸残基1028〜1065に対応するペプチドの髄腔内への適用によって直接決定することができるだろう。このペプチドは、酵母ツーハイブリッドシステムとAC活性分析で測定されるように、PAM−アデニリルシクラーゼの相互作用に介在できることが発見された最小の領域を示す。このペプチドは、バイオポーター(bioporter)リポフェクション試薬(Peqlab,ドイツで市販されている)との複合体として適用され得る。このアプローチにより、ペプチドを組織に進入させ、ACに対する生理学的なPAMの作用を模擬することが可能になる。
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上に列挙した文献は、この参照により開示に含まれる。
特に他の規定がない限り、実験方法は、以下の標準的な文献で列挙された標準的な方法に従って行われた、または、行うことができる:
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edition.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.545 pp or Current Protocols in Molecular Biology;
Current Protocols in Molecular Biology; regularly updated, e.g. Volume 2000; John Wiley & Sons, Inc; Editors: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics; regularly uptdated, e.g. Volume 2003; John Wiley & Sons, Inc; Editors: Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R. Smith.
Current Protocols in Protein Science; regularly updated, e.g. Volume 2003; John Wiley & Sons, Inc; Editors: John E. Coligan, Ben M.Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield.
Molecular Biology of the Cell; third edition; Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing, Inc. New York & London, 1994;
Gene Targeting: a practical approach (1995), Editor: A.L. Joyner, IRL Press
Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function; D. Accili, Wiley-Liss., USA, 2000; ISBN: 0-471-35057-5.
Antisense Therapeutics, S. Agrawal, Humana Press, USA, 1996, ISBN: 0-89603-305-8.
AC、アデニリルシクラーゼ;Gsα、アデニリルシクラーゼの促進性Gタンパク質のαサブユニット、Gαs*、Gαsの構成的に活性な(Q213L)突然変異体;Gαi、抑制性Gタンパク質Giのαサブユニット;Gβγ、ヘテロ三量体Gタンパク質のβγサブユニット;PAM、Myc関連タンパク質;RCC1、染色体凝縮の調節因子;TED、50mMトリスHCl(pH8.0)、1mMのEDTA、1mMのDTT;ODN、オリゴデオキシヌクレオチド;RT、室温;
図1:PAMは、脊髄ニューロンで高度に発現される。脊髄の水平切片標本を用いたインサイチュハイブリダイゼーションを、上述したように、ラットPAMに対するセンスまたはアンチセンスプローブとハイブリダイズさせた。
図2:PAMは、DRGニューロンで、同様に、ラット脊髄中のニューロンの細胞で発現される。
パネルA:ラットの脊髄切片標本の免疫組織化学的な解析。切片標本を、抗PAM抗体(緑)、および、抗NeuNまたは抗GFAP(赤)で染色し、ニューロンまたはグリア細胞をそれぞれ可視化した。両方のシグナルの重ね合わせは、右のパネルに示される。対物を20×に拡大した。
パネルB:ラットDRG切片標本の免疫組織化学的な解析。切片標本を、抗PAM抗体(緑)、および、抗Neu68、抗ヒストンまたは抗GFAP(赤)で染色し、それぞれニューロン、核またはグリア細胞を可視化した。両方のシグナルの重ね合わせは、右のパネルに示される。対物を40×に拡大した(ただし、ヒストン染色は、63×に拡大した)。
図3:PAMは、DRGおよび脊髄において、異なる発生段階で差異的に発現される。定量RT−PCR(TaqmanTM)を用いて、16日齢のラット胎児(E16)、出生後の日数が0.5(P0.5)、3(P3)、5(P5)、9(P9)のラット、および、成体ラットの脊髄およびDRGのRNA(40ng)中のPAMを検出した。少なくとも3回の決定の平均±SEMを示す。
プレギュレートされた。
パネルA:コントロール動物、または、ザイモサンで処理して24時間、48時間および96時間後の動物からの脊髄のRNA(40ng)を用いたRT−PCR解析。下部のパネルは、7回の実験の平均±SEMを示す。スチューデントのt検定:*p<0.001。
パネルB:コントロール動物、または、ザイモサンで処理して24時間、48時間および96時間後の動物のラットの脊髄溶解産物(40μg)を用いた、抗PAM抗体および抗ERK1/2を用いた、7%SDS−PAGEゲルを用いたウェスタンブロット解析。
パネルC:コントロール動物、または、ホルマリンで1時間処理した動物からの脊髄のRNA(40ng)を用いた定量RT−PCR解析。
パネルA:RT−PCRを用いて、脊髄およびDRGのRNA(40ng)におけるACアイソフォーム発現を決定した。
パネルB:材料および方法で説明したように、脊髄またはDRGの溶解産物(10μg)を、80nMのGαsの存在下で、AC活性に関して分析した。三連で行われた少なくとも3回の測定の平均±SEMを示す。
図6:PAMに対するアンチセンスODNの髄腔内への適用により、侵害受容の挙動が増加する。
パネルA:説明されているように、成体ラットに、センスおよびアンチセンスODNを髄腔内投与した。ホルマリン処理の後に、脊髄を除去し、抗PAM抗体(緑)、または、抗NeuN(赤)を用いて免疫組織学的な解析で処理した。
パネルB:材料の章において説明されているように、センスまたはアンチセンスODNで処理した動物のホルマリンアッセイ。
1時間にわたるフリンチ行動の合計を示す。少なくとも4回の測定の平均±SEを示す。
パネルC:材料の章において説明されているように、センスまたはアンチセンスODNで処理した動物のホルマリンアッセイ。
1時間にわたるフリンチ行動の回数を示す。少なくとも4回の測定の平均±SEを示す。
図7Cは、24679861〜24962245位の連続した配列を示す。
図8:ラットPAMに関するEST−クローンをコードする配列:
図8A:AW921303(hscDNAのbp960〜1394に対応する;配列番号4)
図8B:AW918711(hscDNAのbp8188〜8632に対応する;配列番号5)
図8C:BQ201485(hscDNAのbp8966〜9633に対応する;配列番号6)
図8D:BE112881(hscDNAのbp10311〜10830に対応する;配列番号7)
図8E:AW441131(hscDNAのbp13569〜14152に対応する;配列番号8)
図8F:BF409872(hscDNAのbp13569〜14807に対応する)。(配列番号9)
図10:ラットPAM RT PCRのためのPCRのためのプライマー。
図11:ラットPAM発現を阻害するためのアンチセンスオリゴデスオキシヌクレオチド、および、コントロールオリゴヌクレオチド。
図12:本発明の環境で使用するための、様々なPAMhsポリペプチド。これらのポリペプチドは、配列番号2に記載のポリペプチドから得られたフラグメントである。
図13A:hsPamcDNAのヌクレオチドの1317〜4366位を含む、配列番号17に記載のタンパク質フラグメントをコードするcDNA配列(配列番号24);
図13B:hsPamcDNAのヌクレオチドの1482〜3332位を含む、配列番号18に記載のタンパク質フラグメントをコードするcDNA配列(配列番号25);
図13C:hsPamcDNAのヌクレオチドの1641〜3341位を含む、配列番号19に記載のタンパク質フラグメントをコードするcDNA配列(配列番号26);
図13D:hsPamcDNAのヌクレオチドの3142〜4046位を含む、配列番号20に記載のタンパク質フラグメントをコードするcDNA配列(配列番号27);
図13E:hsPamcDNAのヌクレオチドの3142〜3446位を含む、配列番号21に記載のタンパク質フラグメントをコードするcDNA配列(配列番号28);
図13F:hsPamcDNAのヌクレオチドの3228〜3839位を含む、配列番号22に記載のタンパク質フラグメントをコードするcDNA配列(配列番号29);
図13G:hsPamcDNAのヌクレオチドの3228〜3341位を含む、配列番号23に記載のタンパク質フラグメントをコードするcDNA配列(配列番号30);
図14:上記の発見に係る脊髄およびDRGのニューロンにおけるPAMシグナル伝達経路の仮説を示す概観。
Claims (13)
- 痛みを軽減、および/または、予防するのに有用な化合物をスクリーニングする方法であって、
a.Myc関連タンパク質(PAM)もしくは前記タンパク質を発現するポリヌクレオチドまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含む2つのサンプルを準備する工程、
b.Myc関連タンパク質(PAM)もしくは前記タンパク質を発現するポリヌクレオチドまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体を含む1つのサンプルと、化合物とを接触させる工程、
c.化合物の存在下で、Myc関連タンパク質(PAM)活性を測定する工程、
d.化合物の非存在下で、Myc関連タンパク質(PAM)活性を測定する工程、および、
e.c)によるMyc関連タンパク質(PAM)活性と、d)によるMyc関連タンパク質(PAM)活性とを比較する工程
を含み、
Myc関連タンパク質(PAM)または前記タンパク質を発現するポリヌクレオチドの機能的フラグメントまたは誘導体は、
配列番号2の400〜1400からなるフラグメント、
配列番号2の446〜1062からなるフラグメント、
配列番号2の499〜1065からなるフラグメント、
配列番号2の1028〜1231からなるフラグメント、
配列番号2の1000〜1300からなるフラグメント、
配列番号2の1000〜1100からなるフラグメント、
配列番号2の1028〜1065からなるフラグメント、
配列番号17のアミノ酸配列からなるフラグメント、
配列番号14、24、25、26、28、29または30のうちの一つからなるフラグメント
から選択され、
Myc関連タンパク質(PAM)活性は、アデニリルシクラーゼと相互作用する能力、またはニューロン内イオン濃度を調節する能力である前記方法。 - Myc関連タンパク質(PAM)は、ヒトMyc関連タンパク質(PAM)である、請求項1に記載の方法。
- Myc関連タンパク質(PAM)または前記タンパク質を発現するポリヌクレオチドは、単離されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドである、請求項1または2に記載の方法。
- Myc関連タンパク質(PAM)はポリペプチドである、請求項3に記載の方法。
- Myc関連タンパク質(PAM)またはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体は、配列番号2に記載の配列からなるポリペプチド、配列番号2の400〜1400からなるフラグメント、配列番号2の446〜1062からなるフラグメント、配列番号2の499〜1065からなるフラグメント、配列番号2の1028〜1231からなるフラグメント、配列番号2の1000〜1300からなるフラグメント、配列番号2の1000〜1100からなるフラグメント、もしくは配列番号2の1028〜1065からなるフラグメント、または配列番号1に記載の配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- Myc関連タンパク質(PAM)または前記タンパク質を発現するポリヌクレオチドはポリヌクレオチドである、請求項3に記載の方法。
- Myc関連タンパク質(PAM)もしくは前記タンパク質を発現するポリヌクレオチドまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体は、配列番号1に記載の配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号14、24、25、26、28、29もしくは30のうちの一つからなるフラグメントである、請求項1に記載の方法。
- Myc関連タンパク質(PAM)の機能的フラグメントまたは誘導体は、アデニリルシクラーゼ活性を阻害することができる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- アデニリルシクラーゼは、アデニリルシクラーゼI、VまたはVI型である、請求項8に記載の方法。
- 痛みを軽減または止める化合物を同定するための、Myc関連タンパク質(PAM)もしくは前記タンパク質を発現するポリヌクレオチドまたはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体の使用であって、Myc関連タンパク質(PAM)または前記タンパク質を発現するポリヌクレオチドの機能的フラグメントまたは誘導体は、
配列番号2の400〜1400からなるフラグメント、
配列番号2の446〜1062からなるフラグメント、
配列番号2の499〜1065からなるフラグメント、
配列番号2の1028〜1231からなるフラグメント、
配列番号2の1000〜1300からなるフラグメント、
配列番号2の1000〜1100からなるフラグメント、
配列番号2の1028〜1065からなるフラグメント、
配列番号17のアミノ酸配列からなるフラグメント、
配列番号14、24、25、26、28、29または30の一つからなるフラグメントから選択され、
化合物は請求項1記載の方法により同定される前記使用。 - Myc関連タンパク質(PAM)は、ヒトMyc関連タンパク質(PAM)である、請求項10に記載の使用。
- Myc関連タンパク質(PAM)の機能的フラグメントまたは誘導体は、アデニリルシクラーゼ活性を阻害することができる、請求項10または11に記載の使用。
- アデニリルシクラーゼは、アデニリルシクラーゼI、VまたはVI型である、請求項12に記載の使用。
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