JP5178196B2 - クレードA/G、クレードB、およびクレードC改変HIVenv、gag、およびpol遺伝子を発現する組換えMVAウイルス - Google Patents
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Description
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV) env、gag、およびpol遺伝子を発現する、ワクシニアウイルスの複製欠損株である改変ワクシニアアンカラ(modified vaccinia Ankara;MVA)を提供する。
本願は、2004年8月27日に出願された米国仮特許出願第60/604,918号の恩典を主張するものであり、その開示は全体が参照として本明細書に明確に組み入れられる。
有効なヒト免疫不全ウイルス(HIV)ワクチンを同定するための探究において、多くの新規な候補およびアプローチが開発されている。有効なHIV-1ワクチンの作製には、強力な細胞性免疫の誘導および一次HIV-1を中和し得る反応性の広い抗エンベロープ抗体が必要であり得り、理想的なワクチンはT細胞およびB細胞応答の両方を誘導することが必要であり得る。プラスミドDNAワクチン接種は液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘発することができ(Tang et al. 1992 Nature 356: 152-154;Ulmer et al. 1993 Science 259:1745-1749;およびWolff et al. 1990 Science 247:1465-1468)、これらは非病原性エイズウイルスによる攻撃から非ヒト霊長類を防御し(Boyer et al. 1997 Nat. Med. 3:526-532;およびLetvin et al. 1997 PNAS U.S.A. 94:9378-9383)、病原性サル免疫不全ウイルス(SIV)による疾患からの適度な防御を提供する(Egan et al. 2000 J. Virol. 74:7485-7495;およびLu et al. 1996 J. Virol. 70: 3978-3991)。
本発明は、組換えMVAウイルスからの発現によりHIV Env、Gag、およびPol抗原を産生させるための、HIV env、gag、およびpol遺伝子、またはそれらの改変遺伝子を発現する組換えMVAウイルスであり、HIV env遺伝子が、gp120、ならびにgp41の膜貫通および外部ドメインから構成されるがgp41の細胞質ドメインの一部またはすべてを欠くHIV Envタンパク質をコードするよう改変された組換えMVAウイルス、ならびに薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって;HIV env、gag、もしくはpol遺伝子、またはそれらの改変遺伝子がクレードAGから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:1またはそれと少なくとも約97%、98%、99%、もしくは99.9%の同一性を有する配列を有し、HIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:2またはそれと少なくとも約97%、98%、99%、もしくは99.9%の同一性を有する配列を有するか;またはHIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードBから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:3またはそれと少なくとも約97%、98%、99%、もしくは99.9%の同一性を有する配列を有し、HIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:4またはそれと少なくとも約97%、98%、99%、もしくは99.9%の同一性を有する配列を有するか;またはHIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードCから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:5またはそれと少なくとも約97%、98%、99%、もしくは99.9%の同一性を有する配列を有し、HIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:6またはそれと少なくとも約97%、98%、99%、もしくは99.9%の同一性を有する配列を有する薬学的組成物;ならびに関連するその作製方法および使用方法に関する。
以下の微生物は、ブダペスト条約の条項に従って、記載の日付でアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection;ATCC)、バージニア州、マナッサスに寄託された:
組換えMVAウイルス
ポックスウイルス科のオルトポックスウイルス属のメンバーであるワクシニアウイルスは、ヒト天然痘疾患に対して免疫化するための生ワクチンとして使用された。ワクシニアウイルスによる世界的なワクチン接種の成功により、天然痘の原因因子である痘瘡ウイルス(variola virus)が根絶された(「The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication」. History of Public Health, No. 4, Geneva: World Health Organization, 1980)。そのWHOの宣言以来、ポックスウイルス感染症の危険性の高い人々(例えば、研究所員)を除き、ワクチン接種は一般に中断されている。
後天性免疫不全症候群(エイズ)の病原因子は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)と称される、レンチウイルス属に典型的な特徴を示すレトロウイルスであると認識されている。ヒトレンチウイルスの系統発生関係を図1に示す。HIV-2は、HIV-1よりも、野生のスーティーマンガベイザルから単離されたウイルスであるSIVsmmとより近縁関係にある。現在では、HIV-2は、SIVsmmのヒトへの人畜共通感染を表すと考えられている。SIVcpzと命名された捕獲チンパンジーに由来する一連のレンチウイルス分離株は、HIV-1と近い遺伝的関係にある。
HIVのGagタンパク質は、他のレトロウイルスと同様に、非感染性ウイルス様粒子の形成に必要かつ十分である。レトロウイルスGagタンパク質は一般的にポリタンパク質前駆体として合成され;HIV-1 Gag前駆体は、その見かけの分子量に基づいてPr55Gagと命名されている。上述したように、Pr55GagのmRNAは、細胞質中でのその発現にRevを必要とするスプライシングされていない9.2-kb転写産物である(図4)。pol ORFが存在する場合、ウイルスプロテアーゼ(PR)が、細胞からの出芽中またはその直後にPr55Gagを切断して、成熟Gagタンパク質p17(MA)、p24(CA)、p7(NC)、およびp6が生成される(図4を参照されたい)。ビリオン中、MAはウイルスエンベロープの脂質二重層のすぐ内側に局在し、CAは粒子の中心にある円錐形コア構造の外側部分を形成し、NCはウイルスRNAゲノムとのリボヌクレオタンパク質複合体内のコア中に存在する(図5)。
gagの下流には、HIVゲノムの最も高度に保存された領域である、3つの酵素:PR、RT、およびINをコードするpol遺伝子が位置する(図4を参照されたい)。RTおよびINは、それぞれウイルスRNAゲノムの二本鎖DNAコピーへの逆転写のため、およびウイルスDNAの宿主細胞染色体への組込みのために必要とされる。PRは、成熟感染性ビリオンの産生を媒介することにより、生活環の後期に重要な役割を果たす。pol遺伝子産物は、Pr160Gag-Polと称される160-kd Gag-Pol融合タンパク質の酵素切断により導出される。この融合タンパク質は、Pr55Gagの翻訳過程におけるリボソームフレームシフトにより産生される(図4を参照されたい)。他の多くのレトロウイルスによっても利用されるGag-Pol発現のためのフレームシフト機構は、pol由来タンパク質が、Gagの約5%〜10%という低レベルで発現されることを確実にする。Pr55Gagと同様に、Pr160Gag-PolのN末端はミリスチル化され、原形質膜に標的化される。
トリレトロウイルスを用いて行われた初期のパルスチェイス研究から、レトロウイルスのGagタンパク質がポリタンパク質前駆体として最初に合成され、これが切断されてより小さな産物が生じることが示された。続く研究により、プロセシング機能は細胞酵素ではなくウイルス酵素により提供されること、ならびにGagおよびGag-Pol前駆体のタンパク質分解消化がウイルス感染力に必須であることが実証された。レトロウイルスPRの配列解析により、このPRが、ペプシンおよびレニンのような細胞の「アスパラギン酸」プロテアーゼに関連することが示された。これらの細胞酵素と同様に、レトロウイルスPRは、活性部位にある2つの並んだAsp残基を使用して、標的タンパク質中のペプチド結合の加水分解を触媒する水分子を配位する。偽二量体として機能する(活性部位を生じるために同一分子内の2つの折りたたみを使用する)細胞のアスパラギン酸プロテアーゼと異なり、レトロウイルスPRは真の二量体として機能する。HIV-1 PRからのx線結晶学的データより、2つの単量体が、各単量体のN末端およびC末端に由来する4本鎖逆平行βシートにより部分的にまとまっていることが示される。基質結合部位は、2つの単量体間に形成される間隙内に位置する。その細胞相同体と同様に、HIV PR二量体は、結合部位に突出した可動性「フラップ」を含み、間隙内の基質を安定化し得り;活性部位Asp残基は二量体の中心に位置する。興味深いことに、いくつかの限定されたアミノ酸相同性が活性部位残基の周囲に認められるものの、レトロウイルスPRの一次配列は高度に多岐にわたり、それにもかかわらずそれらの構造は著しく類似している。
定義によると、レトロウイルスは、感染過程の初期にその一本鎖RNAゲノムを二本鎖DNAに変換する能力を有する。この反応を触媒する酵素はRTであり、その関連するRNアーゼH活性を伴う。レトロウイルスのRTは、3つの酵素活性を有する:(a) RNA依存性DNA重合(マイナス鎖DNA合成のため)、(b) RNアーゼH活性(DNA-RNAハイブリッド中間体に存在するtRNAプライマーおよびゲノムRNAの分解のため)、および(c) DNA依存性DNA重合(第二鎖またはプラス鎖DNA合成のため)。
レトロウイルス複製の際立った特徴は、逆転写後のウイルスゲノムのDNAコピーの宿主細胞染色体への挿入である。組み込まれたウイルスDNA(プロウイルス)はウイルスRNAの合成のための鋳型として働き、感染細胞が存続する間、宿主細胞ゲノムの一部として維持される。組み込む能力が欠損したレトロウイルス変異体は一般に、増殖感染を確立することができない。
HIV Env糖タンパク質は、ウイルスの生活環において主要な役割を果たす。HIV Env糖タンパク質は、CD4受容体およびコレセプターと相互作用する決定基を含み、またウイルスエンベロープの脂質二重層と宿主細胞原形質膜との間の融合反応を触媒する。さらに、HIV Env糖タンパク質は、診断的観点およびワクチン開発観点の両方から重要である、免疫応答を誘発するエピトープを含む。
本発明は、抗原に対するCD8+ T細胞免疫応答の生成、および抗体応答の誘発に関する。より詳細には、本発明は、初回刺激組成物の投与により誘導される免疫応答を、追加免疫組成物の投与によって高める「プライムおよびブースト」免疫投与計画に関する。本発明は、組換え改変ワクシニアアンカラ(MVA)自体を含む種々の異なる種類の初回刺激組成物のいずれかによる初回刺激後に、MVAベクターを用いて効率的な追加免疫が達成され得るという本発明者らの実験的証明に基づく。
MVA/HIV組換え体を作製するために使用するプラスミドシャトルベクターLAS-1およびLAS-2の構築
1. プラスミドシャトルベクターLAS-1
このプラスミドシャトルベクターは、MVAゲノムの欠失IIIに挿入するものであり、以下の段階で構築した:P11ワクシニアウイルスプロモーターおよび大腸菌グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子を、AscIおよびSacI消化によりpLW-51(Wyatt, L.S. et al. 2004 AIDS Res. Human Retroviruses 20:645-653)から除去した。pLW-44(Bisht, H. et al. 2004 PNAS USA 101:6641-6646)からPCR増幅により得られた、AscIおよびSacI末端を有するP11ワクシニアプロモーターおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)を、そのベクター中に連結して、pLW-51GFPを作製した。XhoIおよびNotI消化によりpsynIIプロモーターをpLW-51GFPから除去し、平滑末端化し、再連結してLAS-1を作製した。
このプラスミドシャトルベクターは、MVAゲノムの欠失IIに挿入するものであり、以下の様式で構築した:開始点にHincII部位および末端にSmaIを有する、mH5プロモーター(Wyatt, L.S. et al. 1996 Vaccine 14:1451-58)の相補鎖を含む2つのオリゴをアニールし、これをpLW-16(Wyatt, L.S. et al. 1999 Vaccine 18:392-397)のSmaI部位に挿入して、pLW-37を作製した。MVAフランク(flank)2の最後の217塩基を、内部オリゴの末端上にKpnI、AscI、およびSacI部位を、ならびに外部オリゴの末端上にKpnI部位を有して複製し、pLW-37のKpnI部位に挿入した。pLW-37aと命名したこのプラスミドをAscIおよびSacIで消化し、これに、AscIおよびSacI末端を有するP11ワクシニアプロモーターおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)(上記のように、pLW-44からP11プロモーターおよびGFPをPCR増幅することにより得た)を挿入した。得られたプラスミドpLAS-2と命名した。
プラスミド伝達ベクターpLW-51は、以下のように構築した。欠失III(del III)に隣接するDNAの926 bpおよび530 bpを含むプラスミドpG01(Sutter and Moss. 1992 PNAS USA 89:10847-10851)に、mH5プロモーター(Wyatt et al. 1996 Vaccine 14:1451-1458)を挿入した。プラスミドGA2/JS2(Genbankアクセッション#AF42688)(Smith et al., 2004 AIDS Res Human Retroviruses 20:654-665)中のHIVクレードB(株BH10)DNAに由来するgag-pol配列を、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)により増幅し、TAクローニングプラスミドpCR2.1(Invitrogen Corp.、カリフォルニア州、カールズバッド)に挿入した。ウイルス様粒子(VLP)形成を増強するために、HIV株BH10 gag-polオープンリーディングフレーム(ORF)の最初の1872ヌクレオチドを、HXB2 gag ORFの相当する部分で置換した。このキメラgag-pol ORFを、改変pG01プラスミドのmH5プロモーター後に挿入した。一過性マーカー安定化組換えウイルス単離手順(Wyatt et al. 2004 AIDS Res. Human Retrovir. 20:645-653)を講じるために、左側MVAフランクの最後の280 bpを複製し、P11ワクシニアウイルスプロモーターおよび大腸菌グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子を2つの直接反復配列の間に挿入した。
プラスミド
MVAゲノムのHindIII A断片中の3500-bp欠失の部位に隣接するMVA DNAの配列をPCRにより増幅し、pGEM 4Z(Promega)にクローニングした。左側900-bp DNAフランク用のプライマーは、
および
であった(制限酵素EcoRIおよびKpn Iの部位を下線で示す)。右側600-bp DNAフランク用のプライマーは、
および
であった(制限酵素Pst IおよびHindIIIの部位を下線で示す)。MVA DNAのこれらのフランクの間に、ワクシニアウイルス後期プロモーターP11の制御下の大腸菌lacZ遺伝子、およびワクシニアウイルス初期/後期プロモーターP7.5の制御下の大腸菌gpt遺伝子をクローニングした(Sutter and Moss 1992 PNAS USA 89:10847-10851)。
pLW44は、ワクシニアウイルスP11後期プロモーターによって調節を受ける、強化GFPをコードする遺伝子を含む。
MVAゲノムの左側に位置する欠失IIへの挿入を可能にするため、以下のようにして、新たなプラスミド伝達ベクター、pLW-17を構築した。欠失IIの左側の52ヌクレオチド前から始まるプライマーを用いてPCRすることによりフランク1を調製し、T-Aクローニングベクターにクローニングし、SphIで消化し、pGEM-4Z(Promega、ウィスコンシン州、マディソン)のSphI部位にクローニングした。欠失IIの右側から、EcoRIおよびKpnI適合末端を含むプライマーを用いてPCRすることによりフランク2を調製し、pGEM-4ZのEcoRIおよびKpnI部位にクローニングした。欠失IIの2つの隣接領域を含むこのプラスミドは、pLW-16と命名した。SmaIおよびPstIで消化してpLW-9から改変H5プロモーターを切り出し、pLW-16のSmaIおよびPstI部位にクローニングし、新たなプラスミド伝達ベクター、pLW-17を得た。P. Collinsより分与されたプラスミドからRSV-A2のFコード配列を切り出し、pLW-17のSmaI部位に平滑末端で連結した(Wyatt, L.S. et al. 1999 Vaccine 18:392-397)。
クレードA Env、Gag、およびPolを発現するMVA組換え体
MVA 65A/Gの構築および特徴づけ
本実施例は、クレードA/G HIV株928 EnvおよびGag Polを発現する改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)組換えウイルス、MVA 65A/Gの構築について説明する。この組換えウイルスの顕著な特徴を以下に示す:
1) MVA 65A/Gの構築では緑色蛍光タンパク質(GFP)の一過性スクリーニングマーカーが使用されたため、GFPは最終ウイルス産物から排除される。
2) A/G env遺伝子はMVAゲノムのdel IIに挿入され、A/G gag polはdel IIIに挿入される。
3) MVA 65A/Gのenvおよびgag polはいずれも、ワクシニアPmH5プロモーターにより制御される。
4) 組換えMVA 65A/Gを作製するために用いられるMVAウイルスは、MVA 1974/NIHクローン1である。
プラスミド伝達ベクター、pJD5およびpJD6(それぞれ図7および図8)を使用して、相同組換えにより一重組換えMVAを作製した。これらのプラスミドはそれぞれ一過性GFPマーカーを有し、以下のように構築した:
1. 逆転写酵素活性を不活化するための3つの変異を含み(クレードB組換え体に関して付与されるものに相当する)、インテグラーゼが除去されたHIV A/G 928のgag/pol遺伝子配列(pGA2/928/928+3RTに由来する)を、FailSafe PCRキットを用いてpCR2.1にクローニングした。gag/pol遺伝子を、SalI制限エンドヌクレアーゼ部位を介してMVA欠失III伝達ベクターpLAS-1(最終ウイルスにおいてGFPが排除されるように、2つの直接反復配列が隣接する一過性スクリーニングマーカーGFPを含む)にクローニングし、遺伝子発現を初期/後期改変H5プロモーターの制御下においた。HIV A/G 928 gag/pol遺伝子の配列をDNA配列決定により確認し、この構築物をpJD5 gag polと命名した(図7)。
2. HIV A/G 928のenv遺伝子配列(Harriet RobinsonによるpGA1/928/928から除去した)を、gp41の細胞質尾部中の114アミノ酸をPCR除去することにより切断し、pCR2.1にクローニングした。2つの初期ポックスウイルス終結5TNTシグナルを除去するためのサイレント変異を作製した(QuickChangeキット、Stratagene)。改変切断型env遺伝子をMVA欠失II伝達ベクターpLAS-2(最終ウイルスにおいてGFPが排除されるように、2つの直接反復配列が隣接する一過性スクリーニングマーカーGFPを含む)にクローニングし、遺伝子発現を初期/後期改変H5プロモーターの制御下においた。HIV A/G 928 env遺伝子の配列をDNA配列決定により確認し、この構築物をpJD6と命名した(図8)。
1. Anton Mayr(ドイツ、ミュンヘン)より供与された、2/22/74からの継代572代目のMVAに由来し、国立衛生研究所(National Institute of Health)において最終的に3回希釈されたMVA 1974/NIHクローン1ウイルスを、組換えに使用した。
1. 二重MVA組換え体、MVA 65A/Gを作製するため、それぞれGag PolおよびEnvを発現する2つの一重組換えMVAウイルス、vJD5gag polおよびvJD6 envを用いて、CEF細胞を共にMOI 5で感染させ、37℃で2日間培養し、回収した(図9)。
1. MVA 65A/G感染BS-C-1細胞溶解液の一定分量を、エンベロープおよびGagタンパク質の発現について、それぞれモノクローナル抗体T24および3537を用いて放射性免疫沈降法(RIP)により解析した(図10および図11)。これらのタンパク質のそれぞれに相当する正確な大きさのバンドが検出された。ARA-Cの存在下で細胞を感染させることにより、組換えタンパク質の初期発現が確認された。20%スクロースクッション上で35S標識粒子をペレット化させることにより、組換えウイルスが感染細胞の上清中にgag粒子を産生することが示された。
要約すると、本発明者らは、A/G 928改変切断型エンベロープおよび変異gag polを発現する組換えMVAウイルス、MVA 65A/Gを作製した。MVA二重組換えウイルスは、一方がEngを発現し、他方がGag Polを発現する、一重MVA組換え体の相同組換えにより作製した。これらの一重MVA組換え体は、最終ウイルスにおいて除去される一過性発現GFPマーカーを用いて作製した。MVA/HIV 65A/Gは、LVD種保存液の繰り返し継代を通して安定であることが示された。
抗原としてMVAクレードA gp140 envを使用するELISAで測定されたMVA 65A/G組換えウイルスの免疫原性から、MVA 65A/Gエンベロープは期待するほど免疫原性がないことが示された(表1を参照されたい)。本実施例では、A/Gエンベロープの発現および免疫原性を増大するために行った、MVA 65A/Gプラスミド伝達ベクター、pJD-6に対する改変、および原型MVA 65A/Gウイルスとの比較について記載する。
*107 PFUの指定のウイルスで2回免疫したマウス5匹の血清の、個々にアッセイしたELISA力価。血清抗体応答は、クレードA ELISA応答の抗原として分泌クレードA 928 gp140、市販のp24、および精製ワクシニアウイルスを使用して、2日間ELISAによりアッセイした。
プラスミド伝達ベクター、pJD-6は以下の方法で改変した:
1. クレードA/Gの5'末端にSmaI部位を、およびenv遺伝子の3'末端にNotI部位を組み入れたオリゴを用いて、pJD-6からA/Gエンベロープ遺伝子をPCR増幅した。この挿入物をpLAS-2挿入ベクターのSmaIおよびNotI部位にクローニングして、伝達ベクター、JD-16を作製した(図14)。このプラスミドは、マルチクローニング領域におけるプロモーターの末端とenv遺伝子の開始部位との間の介在配列という1つの観点でのみ、pJD-6(MVA 65 A/G組換えウイルスを作製するために使用した)と異なる(さらなる説明については#2を参照されたい)。
2. pJD-6では、A/G 928 envはNotI制限部位を用いてpLAS-2のマルチクローニング部位にクローニングした。この配置では、プロモーターとエンベロープの開始コドンとの間に介在開始コドンが存在する(SphI制限酵素部位の部分)。pJD-16では、A/G 928 envは、遺伝子の最初に位置するSmaI部位および遺伝子の末端にあるNot Iを用いてpLAS-2のマルチクローニング部位にクローニングし、したがってこの介在開始コドンは除去された。そのため、マルチクローニング領域におけるプロモーターの末端とenv遺伝子の開始部位との間の介在配列のみが、以下に記載するように2つのプラスミドにおける唯一の相違である:
JD-16プラスミドを用いて二重組換えMVAウイルスを作製するため、原型MVA 65A/G構築物において上記した、A/Gウイルスのgag polを発現する一重MVA組換えウイルス、vJD5gag polを用いてCEFを感染させ、pJD-16をこの感染培養物にトランスフェクションした。原型MVA/HIV 65A/Gウイルスについて上記したようにウイルス単離を進行し、得られた二重組換えウイルス(クローンD1.3266-15)をMVA/HIV 65A/G(SmaI)と命名した。
1. MVA/HIV 65A/GおよびMVA/HIV 65A/G(SmaI)感染BS-C-1細胞の一定分量を、envについてはモノクローナル抗体T24およびT32 mAbを用いて(図15)、ならびにgag発現については3537(183-H12-5C、NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)mAbを用いて(図16)、RIPにより解析した。Image Quantプログラムを使用して、各構築物によるT24で免疫沈降されたタンパク質の量を定量した。Env発現は、MVA 65A/Gと比較して改変65A/G(SmaI)で2倍高かった。20%スクロースクッションを通して35S標識粒子をペレット化させることにより、MVA 65A/G (SmaI)が感染細胞の上清中にgag粒子を産生することが示された。
このように、プロモーターにより近い部位にエンベロープを再クローニングして介在コドン開始部位を除去すると、より大量のenvを発現し、かつ免疫原性がはるかに高いウイルスが作製されたが;このウイルスは極めて不安定であるために、候補ワクチンとして探究し得なかった(表3)。
クレードB Env、Gag、およびPolを発現するMVA組換え体
MVA/HIV 62Bの構築および特徴づけ
本実施例は、クレードB HIV株ADA EnvおよびキメラHXB2/BH10 Gag Polを発現する改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)組換えウイルス、MVA/HIV 62Bの構築について説明する。このウイルスは、以前のMVAクレードB組換え体、MVA/HIV 48(同様に同じHIV株ADA EnvおよびHXB2/BH10 Gag Polを発現する)と4つの点で異なる:
1) MVA/HIV 62Bは、MVA/HIV 48で使用されたGUSスクリーニングマーカーの代わりに、緑色蛍光タンパク質(GFP)の一過性スクリーニングマーカーを使用する。
2) env遺伝子はMVAゲノムのdel IIに挿入され、gag polはdel IIIに挿入される。MVA/HIV 48では、envおよびgag polはいずれもdel IIIに挿入される。
3) MVA/HIV 62Bのenvおよびgag polはいずれもPmH5プロモーターにより制御され、MVA/HIV 48ではこれと同じプロモーターがgag polを制御する。
4) 組換えMVA/HIV 62Bを作製するために用いられるMVAウイルスは、MVA/HIV 48を作製するために用いられたMVA 1983/NIHクローン1に代えて、MVA 1974/NIHクローン1である。
プラスミド伝達ベクター、pLAS-1 HXB2/BH10 Gag PolおよびpLAS-2 ADA Env(それぞれ図19および図20)を使用して、相同組換えにより一重組換えMVAを作製した。これらのプラスミドはそれぞれ一過性GFPマーカーを有し、以下のように構築した:
1. インテグラーゼが除去されるようにクレードB gag polを切断し、mH5プロモーターにより制御されるようにプラスミドにクローニングした。この遺伝子は、gagの完全なHXB2配列を含んでいた。pol遺伝子は、RTの活性部位内のアミノ酸185、鎖転移活性を阻害するアミノ酸266、およびRnアーゼH活性を阻害するアミノ酸478において逆転写酵素安全性変異を有する。さらに、インテグラーゼ遺伝子はEcoRI部位を越えて除去されている。
2. pLW-51GFPからPsyn IIワクシニアプロモーターを除去し、平滑末端化し、再連結してpLAS-1を作製した。MVA/HIV 48に由来するクレードB HXB2/BH10 gag pol配列をpLAS-1にクローニングし、プラスミド伝達ベクター、pLAS-1 HXB2/BH10 Gag Polを作製した(図19)。
3. ADAエンベロープは、サイレント5TNT変異を有する切断型である。エンベロープをgp41遺伝子の細胞質尾部中で切断し、細胞質尾部の115アミノ酸を除去した。この切断により、感染細胞の表面上のエンベロープタンパク質の量が増加し、マウスにおけるエンベロープタンパク質の免疫原性および組織培養における組換えウイルスの安定性が増強されることが、本発明者らによって示された。
4. LAS-2構築において記載したようにMVAフランクの直接反復配列を挿入し、その後P11ワクシニアプロモーターにより制御されるGFPを挿入して、pLAS-2を構築した。MVA/HIV 48に由来する上記のADA改変env配列を付加して、プラスミド伝達ベクターpLAS-2 ADA Envを作製した(図20)。
1. Anton Mayr(ドイツ、ミュンヘン)より供与された、2/22/74からの継代572代目のMVAに由来し、国立衛生研究所において最終的に3回希釈されたMVA 1974/NIHクローン1ウイルスを、組換えに使用した。
1. 二重MVA組換え体、MVA/HIV 62Bを作製するため、それぞれGag PolおよびEnvを発現する2つの一重組換えMVAウイルス、MVA 60およびMVA 61を用いて、CEF細胞を共にMOI 5で感染させ、37℃で2日間培養し、回収した(図21)。
1. MVA/HIV 62B感染BS-C-1細胞溶解液の一定分量を、エンベロープおよびGagタンパク質の発現について、それぞれモノクローナル抗体T8および3537を用いて放射性免疫沈降法(RIP)により解析した(図22)。これらのタンパク質のそれぞれに相当する正確な大きさのバンドが検出された。ARA-Cの存在下で細胞を感染させることにより、組換えタンパク質の初期発現が確認された。20%スクロースクッション上で35S標識粒子をペレット化させることにより、組換えウイルスが感染細胞の上清中にgag粒子を産生することが示された。
*107 PFUの指定のウイルスで2回免疫したマウス5匹の血清の、個々にアッセイしたELISA力価。血清抗体応答は、クレードB ELISA応答の抗原として分泌クレードB ADA gp140、市販のp24、および精製ワクシニアウイルスを使用して、2日間ELISAによりアッセイした。
要約すると、本発明者らは、ADA改変切断型エンベロープおよびHXB2/BH10 Gag Polを発現する組換えMVAウイルス、MVA/HIV 62Bを作製した。MVA二重組換えウイルスは、一方がEngを発現し、他方がGag Polを発現する、一重MVA組換え体の相同組換えにより作製した。これらの一重MVA組換え体は、最終ウイルスにおいて除去される一過性発現GFPマーカーを用いて作製した。MVA 62Bウイルスは、粒子を作製し、マウスにおいて免疫原性があることが示された。MVA/HIV 62Bは、LVD種保存液の繰り返し継代を通して安定であることが示された。
抗原としてMVAクレードB gp140を使用するELISAで測定された、マウスにおけるMVA 62Bの免疫原性から(表4)、MVA 62Bエンベロープは期待するほど免疫原性がないことが示された。本実施例では、最終的なMVA 62B二重組換えウイルスにおけるADAエンベロープの発現および免疫原性を増大するために行った、MVA 62Bプラスミド伝達ベクター、pLAS-2 ADA Envに対する改変について記載する。
プラスミド伝達ベクター、pLAS-2 ADA Envは以下の方法で改変した:
1. 制限酵素、XmaI(SmaIの平滑末端切断と比較して、切断して重複末端を生じる、SmaIのアイソシゾマーである)で処理することによりADA envをJD-9 ADA Envから切り出し、LAS-2のXmaI部位に挿入して、pLW-66とも称するpLAS ADA Env (SmaI)を作製した(図26)。このプラスミドは、マルチクローニング領域におけるプロモーターの末端とenv遺伝子の開始部位との間の介在配列という1つの顕著な観点でのみ、pLAS-2 ADA Env(MVA 62 B組換えウイルスを作製するために使用した)と異なる。(これはまた、env遺伝子をプラスミドにクローニングする方法が理由で、env遺伝子の末端のクローニング領域においてpLAS-2 ADA Envと異なるが、このことは遺伝子の発現にとって重要ではない。)(さらなる説明については#3を参照されたい)。
2. pLAS-2 ADA Envを制限酵素Sal Iおよび次いでXhoIで消化してSphI部位(開始コドンを含む)を除去し、再連結して、pJD-17を作製した(図27)。このプラスミドは、マルチクローニング領域におけるプロモーターの末端とenv遺伝子の開始部位との間の介在配列という1つの観点でのみ、pLAS-2 ADA Env(MVA 62B組換えウイルスを作製するために使用した)と異なる(さらなる説明については#3を参照されたい)。
3. プラスミドpLAS-2 ADA Envでは、ADAエンベロープはNotI部位にクローニングされ、プロモーターとの間に以下のヌクレオチド配列を生じた。pLW-66では、ADA envはXmaI部位(SmaI)にクローニングされ、ワクシニアmH5プロモーターとADA env開始コドンとの間に以下に示すような配列を生じた。pJD-17では、SphI部位が単に除去された。これらをすべて、以下に示す:
pLW-66およびpJD-17プラスミドを用いて二重組換えMVAウイルスを作製するため、上記のクレードBウイルスのgag polを発現する一重MVA組換えウイルス、MVA 60を用いてCEF細胞を感染させ、pLW-66またはpJD-17をこれらの感染CEF培養物にトランスフェクトした。原型MVA/HIV 62Bウイルスについて上記したようにウイルス単離を進行し、それぞれ得られた二重組換えウイルスの2つのクローンを、以下のように命名した:
1. MVA/HIV 62Bおよび4つの改変MVA 62Bウイルス感染BS-C-1細胞の一定分量を、envについてはモノクローナル抗体T8を用いて(図28)、およびgag発現については3537 mAbを用いて(図29)、RIPにより解析した。Image Quantプログラムを使用して、各構築物によるT8で免疫沈降されたタンパク質の量を定量した。Env発現は、MVA 62Bと比較して改変構築物で2.6〜3.3倍高かった。MVA 62B構築物はすべて、20%スクロースクッションを通して35S標識粒子をペレット化させることにより、感染細胞の上清中にgag粒子を産生することが示された。
このように、プロモーターにより近い部位にエンベロープを再クローニングして介在コドン開始部位を除去することで、より大量のenvを発現し、かつ免疫原性がはるかに高いウイルスが作製された。これらのウイルスは、候補ワクチンとして探究中である(表5)。
本実施例は、HIV株ADA envおよびキメラHXB2/BH10 gag polを発現する改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)組換えウイルス、MVA/HIVクレードBの構築について説明する。このウイルスは、以前のMVA組換え体、MVA/HIV 48(同様にHIV株ADA envおよびHXB2/BH10 gag polを発現する)と3つの点で異なる:
1) MVA/HIV 56は、MVA/HIV 48で使用されたGUSスクリーニングマーカーの代わりに、緑色蛍光タンパク質(GFP)の一過性スクリーニングマーカーを使用する。
2) MVA/HIV 56のADA envは、MVA/HIV 48においてADA envを発現させるために用いられたPsyn IIプロモーターよりも初期のADA env発現を可能にする新たな改変ワクシニアウイルスプロモーター、Pm2H5により制御される。(gag polは、MVA 48においてgag polを制御するのと同じプロモーターである、ワクシニアウイルスmH5プロモーターにより制御される)。
3) 組換えMVA/HIV 56を作製するために用いられるMVAウイルスは、MVA/HIV 48を作製するために用いられたMVA 1983/NIHクローン1に代えて、MVA 1974/NIHクローン1である。
相同組換えによりMVA/HIV 56を作製するために使用したプラスミド伝達ベクター、pLAS-6は、以下のように構築した:
1. GUSスクリーニングマーカーをプラスミド、pLW-48(WO 002/072759を参照されたい)から除去し、ワクシニアウイルスP11プロモーターにより起動されるGFPスクリーニングマーカーで置換した(pLW-51 GFP)。このGFPスクリーニングマーカーを一過性に使用して、組換えウイルスを2回プラーク精製したが、このマーカーは相同組換えにより最終組換え体において除去された(GFPには2つの直接反復配列が隣接していたため)。
2. XhoIおよびNotI消化によりPsyn IIワクシニアプロモーターをpLW-51GFPから除去し、同じ部位において新たなさらなる改変H5ワクシニアウイルスプロモーター、pm2H5で置換した。この新たなプラスミドをpLAS-5と命名した。
m2H5プロモーターの配列:
3. プラスミドのNotI酵素消化によりADA envをpLW-48から除去し、ワクシニアウイルスm2H5プロモーターにより制御されるpLAS-5のNotI部位にクローニングした。SalI消化によりHXB2/BH10 gag pol遺伝子をpLW-48から除去し、mH5プロモーターの制御下にあるSalI部位に配置し、組換えウイルスMVA/HIV 56を作製するために使用するプラスミド伝達ベクター、pLAS-6を作製した(図33)。組換えHIV遺伝子は、トランスフェクションにより発現することが示された。
1. Anton Mayr(ドイツ、ミュンヘン)より供与された、2/22/74からの継代572代目のMVAに由来し、国立衛生研究所において最終的に3回希釈されたMVA 1974/NIHクローン1ウイルスを、組換えに使用した。
1. MVA/HIV 56感染細胞溶解液の一定分量を、ARA-Cの存在下および非存在下において、エンベロープおよびgagタンパク質の発現についてモノクローナル抗体を用いて放射性免疫沈降法(RIP)により解析した。RIPでは、ARA-Cの存在下および非存在下のいずれにおいてもこれらのタンパク質のそれぞれに相当する正確な大きさのバンドが検出され、組換えタンパク質の初期および後期発現の両方が示された(図34)。
4. 改変MVA/HIV 62Bウイルスの繰り返し継代および得られたウイルスの解析から、MVA 62BがLVD種保存液の5継代を通して比較的安定であることが確認された。
要約すると、本発明者らは、ADA改変切断型エンベロープおよびHXB2/BH10 gag polの高発現を有し、MVAゲノムの欠失III内への挿入物を有する組換えMVAウイルス、MVA/HIV 56を作製した。MVA組換えウイルスは、最終ウイルスにおいて除去される一過性発現GFPマーカーを用いて作製した。ADAエンベロープの高発現は、新たなハイブリッド初期/後期プロモーター、Pm2H5により可能となった。MVA 56組換え体は、スクロースを介してペレット化し、PAGEによって解析することにより示されるgag粒子を生成する。MVAゲノムの組換え領域の配列決定から、GFPの不在およびHIV遺伝子の正確な配列が確認された。Env ELISAにより、ADAエンベロープの免疫原性が確認され、またエンベロープおよびp24 gagに対する細胞応答が検出された。
クレードC Env、Gag、Polを発現するMVA組換え体
MVA/HIV 71Cの構築および特徴づけ
本実施例は、インドクレードC HIV IN3 EnvおよびGag Polを発現する改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)組換えウイルス、MVA/HIV 71Cの構築について説明する。この組換えウイルスの顕著な特徴を以下に示す:
1) MVA/HIV 71Cの構築では緑色蛍光タンパク質(GFP)の一過性スクリーニングマーカーが使用されたため、GFPは最終ウイルス産物から排除される。
2) 71C env遺伝子はMVAゲノムのdel IIに挿入され、71C gag polはdel IIIに挿入される。
3) MVA 71Cのenvおよびgag polはいずれも、ワクシニアmH5プロモーターにより制御される。
4) 組換えMVA/HIV 71Cを作製するために用いられるMVAウイルスは、MVA 1974/NIHクローン1である。
プラスミド伝達ベクター、pDC3およびpJD15、それぞれ図35および図36を使用して、相同組換えにより二重組換えMVAを作製した。これらのプラスミドはそれぞれ、最終ウイルス産物においてGFPが排除されるように、直接反復配列が両側に隣接するGFPマーカーを有する。プラスミドは以下のように構築した:
1. 逆転写酵素活性を不活化するための3つの変異を含み(クレードB組換え体に関して付与されるものに相当する)、インテグラーゼが除去されたHIV C IN3 gag polの遺伝子配列(Harriet Robinson、エモリー大学によるインド分離株GenBank #AF286231に由来する)を、FailSafe PCRキットを用いてpCR2.1にクローニングした。gag/pol遺伝子を、SmaI制限エンドヌクレアーゼ部位を介してMVA欠失III伝達ベクターpLAS-1(最終ウイルスにおいてGFPが排除されるように、2つの直接反復配列が隣接するスクリーニングマーカーGFPを含む)にクローニングし、遺伝子発現を初期/後期改変H5プロモーターの制御下においた。HIV C IN3 gag pol遺伝子の配列をDNA配列決定により確認し、この構築物をpDC3と命名した(図35)。
2. HIV C IN3 envの遺伝子配列(Harriet Robinson、エモリー大学によるインド分離株GenBank #AF286231に由来する)を、gp41の細胞質尾部中の120アミノ酸をPCR除去することにより切断し、pCR2.1にクローニングした。2つの初期ポックスウイルス終結5TNTシグナルを除去するためのサイレント変異を作製した(QuickChangeキット、Stratagene)。改変切断型env遺伝子をMVA欠失II伝達ベクターpLAS-2(最終ウイルスにおいてGFPが排除されるように、2つの直接反復配列が隣接するスクリーニングマーカーGFPを含む)のNot I部位にクローニングし、その後、SalI次いでXhoIで順次切断することによりクローニング領域内のSphI部位を除去し、末端を連結してpJD-15を作製した。このプラスミドにおける遺伝子発現は、初期/後期改変H5プロモーターの制御下にある。HIV C IN3 env遺伝子の配列をDNA配列決定により確認し、この構築物をpJD-15と命名した(図36)。
1. Anton Mayr(ドイツ、ミュンヘン)より供与された、2/22/74からの継代572代目のMVAに由来し、国立衛生研究所において最終的に3回希釈されたMVA 1974/NIHクローン1ウイルスを、組換えに使用した。
1. EnvおよびGag Polタンパク質の両方を発現する二重MVA組換え体を作製するため、Gag Polを発現する一重組換えMVAウイルス(MVA 68C)を用いてCEF細胞をMOI 0.05で感染させ、その後1μgのpJD15をトランスフェクトして、37℃で2日間培養し、回収した(図37)。
1. MVA/HIV 71C感染BS-C-1細胞溶解液の一定分量を、エンベロープおよびGagタンパク質の発現について、それぞれモノクローナル抗体T-43および3537を用いて放射性免疫沈降法(RIP)により解析した(図38)。これらのタンパク質のそれぞれに相当する正確な大きさのバンドが検出された。ARA-Cの存在下で発現が起こり、mH5プロモーターの初期部分の機能性が示された。20%スクロースクッション上で35S標識粒子をペレット化させることにより、組換えウイルスが感染細胞の上清中にgag粒子を産生することが示された。発現したクレードCエンベロープの機能性は、融合アッセイ法において、以前の構築物中の同一のC配列を用いて示されていた。
要約すると、本発明者らは、クレードC IN3改変切断型エンベロープおよび変異gag polを発現する組換えMVAウイルス、MVA/HIV 7Cを作製した。MVA二重組換えウイルスは、Gag Polタンパク質を発現する一重MVA組換え体とクレードC Envを発現するプラスミドの相同組換えにより作製した。この二重MVA組換え体は、最終ウイルスにおいて除去される一過性発現GFPマーカーを用いて作製した。RIP実験から、MVA/HIV 71C EnvおよびGag Polタンパク質の発現、ならびにgag粒子の産生が示された。二重組換え体は、LVD種保存液の繰り返し継代を通して比較的安定であることが示された。マウスにおける免疫原性実験から、クレードC envに免疫原性があることが示される(表6を参照されたい)。
a抗原としてgp140クレードC envを使用する捕獲ELISA;
bそれぞれ0週目および4週目に107用量をIM投与してマウス5匹を免疫化。2回目の免疫化から2週間後に採血;
c逆終点希釈度。
成熟および未成熟VLPを発現する多タンパク質HIV-1(CRF02_AG)DNA/MVAワクチンのアカゲザルにおける相対的免疫原性
本発明者らは、HIV-1亜型CRF02_AGに基づく、西アフリカおよび西中央アフリカ用のエイズワクチンを開発した。アカゲザルを、Gag-Pol-Env発現プラスミドDNAで初回刺激し、対応するタンパク質を発現する組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ(rMVA)で追加免疫した。gagおよびpol中の点変異によって異なる2つのDNAワクチン構築物(IC1-90およびIC48)を比較した。IC1-90は主に未成熟(コアがプロセシングされていないPr55Gagを含む)HIV様粒子(VLP)を産生し、IC48はPr55Gagがプロセシングされた成熟VLP、未成熟VLP、および細胞内タンパク質凝集体を産生する。いずれのワクチンも、Gag、Pol、およびEnvに対する顕著な細胞応答を生じた。ピークMVA後エフェクター相(P=0.028)および後期記憶相(P=0.051)それぞれにおいて、IC48動物ではIC1-90動物よりも約2倍高い、GagおよびEnvエピトープに対するELISPOT応答が認められた。ピーク応答時には、IC48初回刺激動物ではIC1-90初回刺激動物よりも広い幅が観察された(P=0.03)。本発明者らの結果から、ワクチンが高頻度T細胞応答を誘発し、抗Env抗体を刺激することが示された。これらの結果からまた、様々な形態のVLPの発現が、誘発する細胞性免疫および液性免疫に顕著な影響を及ぼすことも示唆される。
ワクチン免疫原
VLPの構築を評価するため、トランスフェクション培養上清をショ糖勾配によりバンド化し、その結果得られた画分をGagの存在について試験した。ピークVLP画分を、ウサギポリクローナル抗p24抗体を用いて免疫ブロッティングにより解析した(図41A)。IC1-90では、2つのGagポリタンパク質、p55およびp41のみが検出された。IC48では、3つの形態のGag(p55、p41、およびp24)が観察された。Gag p24の存在により、Gagポリタンパク質の切断が示される。以前に実証されているように、サキナビル(HIV-1プロテアーゼ阻害剤)によるHIVプロテアーゼ活性の完全阻害またはワクチン構築物IC25(プロテアーゼ活性の遺伝的改変物)は、主にp55であるGagタンパク質をもたらし、Gagポリタンパク質が切断されていないことが示される(Ellenberger, D. et al. 2004 Virology 319:118-130)。HIVタンパク質凝集体、およびGagの完全切断物から部分切断物を含有するVLPを含む、種々の産物の産生をもたらす対応するプロテアーゼ変異を有するワクチン構築物の概要を図41Bに示す。
0、8、および26週目における3回のDNAプライムならびに41週目における1回のrMVA追加免疫を、IM針注射により1 mlで行った。DNA初回刺激は注射当たり0.6 mgのIC1-90またはIC48であり、MVA追加免疫は1 x 108 pfuであった。16匹のマカクすべてに、初回刺激物質、IC1-90またはIC48によってのみ異なる同一の一定分量を投与した。身体検査、日々の観察、体重、血液学、および臨床化学の測定を行った。注射部における局所発赤も硬化も認められなかった。
ワクチン誘発性T細胞は、MVA追加免疫後に急速に拡大した(図42)。MVA追加免疫前には、HIV-1特異的ELISPOT応答は、DNAプライムそれぞれの後で、本発明者らの検出バックグラウンドかまたはそれ未満であった。時間的ELISPOT解析から、最も高いELISPOT応答は、MVA追加免疫の1週間後(ピーク)であることが判明した。100万個の末梢血単核細胞(PBMC)当たり最大で5300スポットの頻度が、ピーク応答で認められた。特定細胞のこのピークは、DNA/MVA記憶プールへと3倍の縮小を起こした(MVA後8週目)。ピーク後26週目には、T細胞応答はさらに3倍縮小した(後期記憶)。免疫相にかかわらず(ピーク、記憶、または後期記憶)、全ELISPOTは、IC1-90初回刺激動物よりもIC48初回刺激動物で高かった;IC48動物のT細胞応答は、IC1-90動物よりも2.2倍高かった(算術平均)。群および時間における総ELISPOT値の直線回帰を用いた変量効果モデルから、IC48はIC1-90よりも高く、群効果はこのモデルにおいてP値=0.002を有することが実証される。さらに、ピーク応答時(P=0.028)および後期記憶時(P=0.051)に、IC-48初回刺激動物による有意に高い応答が認められた。
aバックグラウンドの2倍のELISPOT数値(>100)を陽性と見なした。
bIFN-γおよびIL-2発現の組み合わせ。
cMVA追加免疫の1週間後。
dMVA追加免疫の8週間後。
eGag、5プール;Pol、6プール(プロテアーゼプールを含む);Env、7プール。
fND、未実施。
g動物当たりの平均CD8+細胞応答、2.2プール。
h動物当たりの平均CD4+細胞応答、6.25プール。
応答するCD4およびCD8 T細胞の頻度を決定するため、細胞内サイトカインアッセイを行った(図46)。CD4およびCD8リンパ球におけるIFN-γおよびIL-2発現のペプチド誘導を測定したが、試験したプラスミドDNAはいずれもMVA追加免疫の刺激に成功していた。MVA追加免疫の1週間後、ELISPOT解析によって見られるようにピーク応答が観察された。遺伝子領域にかかわらず、IC48初回刺激動物による応答は、IC1-90初回刺激動物よりも有意に高かった:Env(P=0.006)およびGag(P=0.026)。Gagエピトープに特異的なCD8細胞は、1匹の動物においては、全CD8 T細胞の2.6%という頻度にまで拡大した。IFN-γ発現およびIL-2の細胞内サイトカイン染色から、DNAプラスミド間でのGagペプチドに対する約4倍の相違が明らかになった;IC48はIC1-90よりも多くのCD8細胞を刺激した。パーセント特異的CD8細胞の幾何平均は、IC48群およびIC1-90群に関してそれぞれ0.54対0.14であった。Env領域では、2倍の相違が検出された(0.28対0.14)。発現するサイトカインにかかわらず、同様の比率が認められた。
抗体応答は、MVAによって強く高められた。ウェスタンブロット解析によれば、ごくわずかな結合抗体がDNA初回刺激により誘発されたが、動物16匹中11匹(6匹のIC1-90サルおよび5匹のIC48サル)は、MVAの3週間後にHIV-1亜型AGウイルス溶解液に対してEnv反応性を示した。11匹の反応性動物はすべて、Env gp120を検出する抗体を産生し、1匹の動物のみがGag p24に応答した。初回刺激動物の2群間に差は認められなかった。
DNA免疫原
DNA構築物は、プロモーターカセット内にイントロンAを含み、RNAを発現するためにCMV前初期プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を使用するpGA1発現ベクター(GenBankアクセッション番号:AF425297)で作製した(Chapman, B.S. et al. 1991 PNAS USA 19:3979-3986、およびRoss, T.M. et al. 2000 Nat. Immunol. 1:127-131)。付随する組換えHIV-1亜型AG(CRF02_AG)株IC0928を逆転写し(GenBankアクセッション番号:AY227361およびAY227362)、DNA PCRにによって生成された断片をpGA1発現ベクターにクローニングした(Ellenberger, D.L. et al. 2002 Virology 302:155-163、およびEllenberger, D. et al. 2004 Virology 319:118-130)。pGA1-IC48(IC48)の構築および説明は、以前に記載されている(Ellenberger, D. et al. 2004 Virology 319:118-130)。pGA1/IC1-90(IC1-90)は、gagおよびpol中の点変異によりIC48と異なる。簡潔に説明すると、IC1-90は、IC48について以前に記載されている、gag NCジンクフィンガーおよびpol RT中に導入された点変異を欠いている(Ellenberger, D. et al. 2004 Virology 319:118-130、Smith, J.M. et al. 2004 AIDS Res. Hum. Retrovir. 20:1335-1347、およびSmith, J.M. et al. 2004 AIDS Res. Hum. Retrovir. 20:654-665)。IC1-90およびIC48はまたプロテアーゼ配列においても異なり、IC1-90中には、70位でのArgからGlyへの置換および90位でのMetからLeuへの置換という2つの置換が存在する。IC48は、以前に記載されているように、48位におけるGlyからValへの置換を有する。プロテアーゼ変異は、部位特異的変異誘発キット(Stratagene、カリフォルニア州、ラホーヤ)を使用し、製造業者の手順に従って作製した。変異はすべて、配列決定により確認した。
IC0928に由来するgag、pol、およびenv領域を発現する組換えMVAは、上記されている。簡潔に説明すると、これは、組換えウイルスを得るための一過性GFPマーカーを、Wyatt et al. (Wyatt, L.S. et al. 2004 AIDS Res. Hum. Retrovir. 20:645-653)により記載されている一過性GUSと同様に使用するという変更を加え、MVA/SHIV89.6について以前に記載されている通りに(Earl, P.L. et al. 2002 Virology 294:270-281)gag-polを欠失IIIに、および切断型envをdel IIに挿入して構築した。
ヒト293T細胞、ヒト腎臓由来細胞株は、10%ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で維持した。293T細胞を、DMEM増殖培地2 ml中に106個細胞/Costar 6ウェルプレートのウェルで添加し、5% CO2加湿雰囲気中、37℃で24時間インキュベートした。24時間後、リポフェクトアミン2000(LipofectAmine2000)試薬(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)とプラスミドDNAを製造業者の手順に従って混合し、各ウェルに添加した。トランスフェクション試薬を添加してから24または48時間後に、上清を回収した。
293T細胞の一過性トランスフェクションの24時間後、培養上清を回収し、200 x gで5分間遠心分離して清澄化し、1 mlを10〜50%ショ糖勾配上に重層した。それぞれ2 mlの50%、40%、30%、20%、および10%ショ糖溶液からなる10 mlの勾配は、超遠心チューブの底から上に添加した。勾配を、SW41Tiローターで40,000 rpmにて16時間遠心分離した。1 mlの画分を、上から底に向かって回収した。画分分割量を、HIV-1 p24抗原捕獲アッセイで解析した。
トランスフェクションした293T細胞を、0.1 Mカコジル酸緩衝液中の2.5%グルタルアルデヒド1 mlを用いて、マルチウェルプレート中で4℃で2時間固定した。同じ緩衝液で3回洗浄した後、0.1 Mカコジル酸緩衝液中の1.0%四酸化オスミウムを添加して1時間インキュベートし、エタノール系で脱水し、エポネート(Eponate)樹脂を用いて包埋した。樹脂を重合した後、細胞を面で切断し、水中の4%酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、Hitachi H-7500透過型電子顕微鏡で観察した。
アッセイは、HIV-1抗原捕獲EIAキット(Coulter、フロリダ州、ハイアリーア)を用いて、製造業者の説明書に従って行った。
プールされたヒト免疫グロブリン抗HIV(カタログ番号3957)は、米国立アレルギー感染病研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)AIDS Research and Reference Reagent Program(メリーランド州、ロックビル)から入手した。Env ELISAは、以前に記載されている通りに行った(Ellenberger, D. et al. 2004 Virology 319:118-130)。
インド起源の成年初期雄非近交系アカゲザル(Macaca mulatta)16匹を、体重により8匹の2つのワクチン群に無作為に分類した。IC1-90群には0.6 mgのIC1-90 DNAを0、8、および26週目に筋肉内(IM)投与し、IC48群には0.6 mgのIC48 DNAを同様に投与した。DNA免疫化は、針およびシリンジを用いてリン酸緩衝食塩水中で行った。1 ml/注射の量で、全部で3回の注射を上外側右大腿に行った。3回目のDNA免疫化の15週間後(41週目)に、すべての動物に、針およびシリンジを用いて、1 x 108 pfuの改変ワクシニアアンカラウイルス(MVA/HIV)追加免疫を上外側右大腿にIM投与した。MVA免疫化は、1 ml量のリン酸緩衝食塩水中で行った。注射部位を、局所炎症反応についてモニターした。
全ウイルス溶解液およびショ糖精製VLPのウェスタンブロット解析は、以前に記載されている通りに行った(Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。全ウイルス溶解液(IC0928)は4〜15%勾配SDSゲルで泳動し、ニトロセルロースに転写した。血漿試料は、ブロッキング緩衝液で1:100希釈した。二次抗体は抗ヒトIgG(Fab)-ホスファターゼであり、検出はBCIP/NBTホスファターゼ基質システム(KPL、メリーランド州、ゲイサーズバーグ)を用いて、製造業者の説明書に従って完了した。ショ糖精製VLPの解析は、米国立アレルギー感染病研究所AIDS Research and Reference Reagent Programから入手したウサギポリクローナル抗p24(カタログ番号4250)を用いて行った。HIV-1 Gagタンパク質バンドは、ECLウェスタンブロッティング検出試薬(Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)を用いて、製造業者により記載される通りに可視化した。発現レベルはホスフォイメージャーを用いて決定した。
HIV-1組換え亜型CRF02_AGペプチドは、ワクチン株に由来する、11が重複した15merであった。ペプチドは、約25ペプチドを含むプールとなるよう集合化した。ペプチドは50〜100 mg/mlでDMSO中に溶解し、保存溶液は-70℃で維持した。ペプチド作業溶液は-20℃で1週間維持した。
ELISPOTアッセイ法は、ヒトCD28およびCD49dに対する2μg/mlの抗体(Becton Dickinson、カリフォルニア州、サンノゼ)をインキュベーションに含めること以外は(Waldrop, S.L. et al. 1998 J. Immunol. 161:5284-5295)、以前に記載されている通りに行った(Amara et al., 2001、およびAmara et al., 2002)。精製PBMCを、各ペプチドについて10μg/mlの最終濃度で使用するペプチドプールと共に、2 x 105細胞/ウェルで96ウェルプレートに2つ組でプレーティングした。4ウェルには、培地のみを添加した。プレートを37℃、5% CO2で36時間インキュベートし、ELISPOTリーダーを用いてスポットを計数した。バックグラウンドは、陰性対照の平均の2倍プラス10と設定した。このバックグラウンド値をペプチドウェルの生数値から減算し、その後100万個のPBMCに変換した。バックグラウンドの2倍(>100)のELISPOT数値のみを有意であると見なした。
2つのDNAワクチンで初回刺激した群による免疫原性試験の比較には、独立試料のウィルコクソン検定およびウィルコクソン符号順位検定を用いた。サルを変量効果とし、群(IC-48またはIC1-90)および時間における総ELISPOT値の直線回帰を用いる混合効果モデルを使用した。また、CD4対CD8 T細胞の応答、Gag対Envに対するT細胞応答、ならびにIFN-γおよびIL-2発現の試験にも、混合効果直線回帰モデルを使用した。
Claims (18)
- 組換えMVAウイルスからの発現によりHIV Env、Gag、およびPol抗原を産生させるための、HIV env、gag、およびpol遺伝子、またはそれらの改変遺伝子を発現する組換えMVAウイルスであり、HIV env遺伝子が、gp120、ならびにgp41の膜貫通および外部ドメインから構成されるがgp41の細胞質ドメインの一部またはすべてを欠くHIV Envタンパク質をコードするよう改変された組換えMVAウイルス、ならびに薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって;
HIV env、gag、もしくはpol遺伝子、またはそれらの改変遺伝子がクレードAGから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:1と少なくとも97%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:2と少なくとも97%の同一性を有する配列を有するか;
またはHIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードBから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:3と少なくとも97%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:4と少なくとも97%の同一性を有する配列を有するか;
またはHIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードCから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:5と少なくとも97%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:6と少なくとも97%の同一性を有する配列を有するものであり、かつ
該env遺伝子は該MVAウイルスの欠失IIに挿入されるものであり、かつ該gag遺伝子およびpol遺伝子は該MVAウイルスの欠失IIIに挿入されるものであり、
HIV Env抗原をコードする配列の転写が第一のプロモーターの制御下にあり、ならびにHIV GagおよびPol抗原をコードする配列の転写が第二のプロモーターの制御下にあり、かつ第一のプロモーターとHIV Env抗原をコードする配列の開始コドンとの間の配列が、ATG配列を含む、薬学的組成物。 - HIV env、gag、もしくはpol遺伝子、またはそれらの改変遺伝子がクレードAGから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:1と少なくとも97%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:2と少なくとも97%の同一性を有する配列を有する、請求項1記載の薬学的組成物。
- HIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードBから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:3と少なくとも97%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:4と少なくとも97%の同一性を有する配列を有する、請求項1記載の薬学的組成物。
- HIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードCから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:5と少なくとも97%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:6と少なくとも97%の同一性を有する配列を有する、請求項1記載の薬学的組成物。
- HIV env、gag、もしくはpol遺伝子、またはそれらの改変遺伝子がクレードAGから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:1と少なくとも98%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:2と少なくとも98%の同一性を有する配列を有するか;
またはHIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードBから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:3と少なくとも98%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:4と少なくとも98%の同一性を有する配列を有するか;
またはHIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードCから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:5と少なくとも98%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:6と少なくとも98%の同一性を有する配列を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の薬学的組成物。 - HIV env、gag、もしくはpol遺伝子、またはそれらの改変遺伝子がクレードAGから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:1と少なくとも99%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:2と少なくとも99%の同一性を有する配列を有するか;
またはHIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードBから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:3と少なくとも99%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:4と少なくとも99%の同一性を有する配列を有するか;
またはHIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードCから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:5と少なくとも99%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:6と少なくとも99%の同一性を有する配列を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の薬学的組成物。 - HIV env、gag、もしくはpol遺伝子、またはそれらの改変遺伝子がクレードAGから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:1と少なくとも99.9%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:2と少なくとも99.9%の同一性を有する配列を有するか;
またはHIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードBから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:3と少なくとも99.9%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:4と少なくとも99.9%の同一性を有する配列を有するか;
またはHIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードCから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:5と少なくとも99.9%の同一性を有する配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:6と少なくとも99.9%の同一性を有する配列を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の薬学的組成物。 - HIV env、gag、もしくはpol遺伝子、またはそれらの改変遺伝子がクレードAGから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:1の配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:2の配列を有するか;
またはHIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードBから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:3の配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:4の配列を有するか;
またはHIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がクレードCから採取され、かつHIV env遺伝子またはその改変遺伝子が配列番号:5の配列を有し、ならびにHIV gagおよびpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子が配列番号:6の配列を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の薬学的組成物。 - 組換えMVAウイルスがATCCアクセッション番号PTA-5095として寄託されたMVA 1974/NIHクローン1である、請求項1〜8のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 組換えMVAウイルスが、該組換えMVAウイルスからの発現によりHIV抗原を産生させるためのさらなるHIV遺伝子またはその改変遺伝子をさらに発現し、該さらなるHIV遺伝子が、vif、vpr、tat、rev、vpu、およびnefからなる群より選択されるメンバーである、請求項1〜9のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- HIV env、gag、もしくはpol遺伝子またはそれらの改変遺伝子がmH5プロモーターの転写調節下にある、請求項1〜10のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 霊長類においてHIV Env、Gag、またはPol抗原に対するCD8+ T細胞免疫応答を高めるための医薬品を製造するための、請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物の使用であって、請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物を含む該医薬品は、該霊長類に投与されるものであり、それにより該霊長類における事前に初回刺激された抗原に対するCD8+ T細胞免疫応答が高められるものである、使用。
- 霊長類においてHIV Env、Gag、またはPol抗原に対するCD8+ T細胞免疫応答を誘導するための医薬品を製造するための、請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物の使用であって、請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物を含む該医薬品は、該霊長類に投与されるものであり、それにより該霊長類における抗原に対するCD8+ T細胞免疫応答が誘導されるものである、使用。
- 霊長類においてHIV Env、Gag、またはPol抗原に対するCD8+ T細胞免疫応答を誘導するための医薬品を製造するための、請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物の使用であって、該抗原をコードする核酸を含む初回刺激組成物が該霊長類に投与されるものであり、続いて請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物を含む該医薬品が追加免疫組成物として該霊長類に投与されるものであり、それにより抗原に対するCD8+ T細胞免疫応答が誘導されるものである、使用。
- 霊長類がヒトである、請求項12〜14のいずれか一項記載の使用。
- 組換えMVAウイルスの投与が無針注射による、請求項12〜14のいずれか一項記載の使用。
- 初回刺激組成物が抗原をコードするプラスミドDNAを含む、請求項14記載の使用。
- HIV env、gag、およびpol遺伝子、またはそれらの改変遺伝子をコードするプラスミド伝達ベクターであって、HIV env遺伝子が、gp120、ならびにgp41の膜貫通および外部ドメインから構成されるがgp41の細胞質ドメインの一部またはすべてを欠くHIV Envタンパク質をコードするよう改変されているプラスミド伝達ベクターを調製する段階、および請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物を産生させるために該プラスミド伝達ベクターをMVAウイルスと組み換える段階を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物を作製する方法。
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