JP5176292B2 - Luminescent activity measurement method - Google Patents
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Description
本発明は、ルシフェラーゼの発光活性の測定方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring the luminescence activity of luciferase.
ドラッグのスクリーニングにおいて、スクリーニング対象の低分子化合物が難水溶性の場合には、通常、低分子化合物をメタノール、エタノール、ジメチルスルホオキサイド、アセトニトリルなどの有機溶媒に溶解して使用する。しかし、一般に、酵素蛋白質は、有機溶媒中を含む水溶液中で不安定であり（例えば、特許文献１参照）、容易に失活することが知られている。同様に、セレンテラジンを発光基質とする発光酵素群（例えば、レニラルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、コンケシアルシフェラーゼ）について、有機溶媒を含む水溶液中での発光反応については、詳細に検討されておらず、高感度レポーターアッセイ系も確立は確立されていなかった。 In drug screening, when a low molecular compound to be screened is poorly water-soluble, the low molecular compound is usually used after being dissolved in an organic solvent such as methanol, ethanol, dimethyl sulfoxide, and acetonitrile. However, it is generally known that enzyme proteins are unstable in an aqueous solution containing an organic solvent (see, for example, Patent Document 1) and easily deactivated. Similarly, for luminescent enzyme groups using coelenterazine as a luminescent substrate (for example, Renilla luciferase, Gaussia luciferase, Conchecluciferase), the luminescence reaction in an aqueous solution containing an organic solvent has not been studied in detail. The establishment of a highly sensitive reporter assay system has not been established.
上記のような現状に鑑み、発光酵素が有機溶媒中であっても発光活性を有し、この発光活性によって、目的物質の検出が可能な発光反応方法が求められている。
そこで、本発明は、有機溶媒存在下において発光酵素の発光活性を測定する方法を提供することを課題とする。
In view of the current situation as described above, there is a demand for a luminescent reaction method in which a luminescent enzyme has a luminescent activity even in an organic solvent, and the target substance can be detected by this luminescent activity.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for measuring the luminescent activity of a luminescent enzyme in the presence of an organic solvent.
オプロフォーラスルシフェラーゼは、静岡県駿河湾の水深800〜1000メートルに棲息し、分類学上十脚類に属するヒメヒオドシエビ（Oplophorus gracilorostris）が有する分泌型エビルシフェラーゼである。この分泌型ルシフェラーゼは、19kDa及び35kDaの蛋白質より構成される分子量106kDaの複合体である（Inouye，S, Watanabe, K., Nakamura, H., Shimomura, O.（2000）FEBS Lett．481：19-25.）が、19kDa蛋白質（以下「19k0Lase」ともいう）が、発光基質であるセレンテラジン（発光基質）への酸素添加により発光反応を触媒する機能を有するのに対し、35kDaの蛋白質は、発光活性をもつ19kDa蛋白質の安定化に寄与している可能性が高く、直接発光反応に関与しない（特開2002-320482号公報）。 Oplophorus luciferase is a secreted ebylluciferase that lives in 800-1000 meters in Suruga Bay, Shizuoka Prefecture, and is possessed by Oplophorus gracilorostris, a taxonomic decapod. This secretory luciferase is a complex with a molecular weight of 106 kDa composed of 19 kDa and 35 kDa proteins (Inouye, S, Watanabe, K., Nakamura, H., Shimomura, O. (2000) FEBS Lett. 481: 19 -25.) Is a 19 kDa protein (hereinafter also referred to as “19k0Lase”) that catalyzes the luminescence reaction by adding oxygen to the luminescent substrate coelenterazine (luminescent substrate), whereas the 35 kDa protein emits luminescence. There is a high possibility that it contributes to the stabilization of an active 19 kDa protein, and it is not directly involved in the luminescence reaction (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-320482).
本発明者らは、上記課題の解決法を求めて鋭意努力した結果、レニラルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、コンケシアルシフェラーゼ等の発光酵素は、有機溶媒を含む水溶液中で非常に不安定であるため、有機溶媒が反応系に持ち込まれるような場合には用いることができないが、オプロフォーラスルシフェラーゼ19kOLaseの発光活性は、有機溶媒存在下においてもその活性を測定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
As a result of diligent efforts to find a solution to the above problems, the present inventors have found that luminescent enzymes such as Renilla luciferase, Gaussia luciferase, and Conchecluciferase are very unstable in an aqueous solution containing an organic solvent. Therefore, it cannot be used when an organic solvent is brought into the reaction system. However, it has been found that the luminescence activity of Oproforus luciferase 19kOLase can be measured even in the presence of the organic solvent, and the present invention is completed. It came.
That is, the present invention is as follows.
［1］以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドが有する発光活性を測定する方法であって、有機溶媒存在下において、発光基質と該ペプチドを反応させることを特徴とする測定方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド。
[1] A method for measuring the luminescence activity of the following peptide (a) or (b), wherein the peptide is reacted with a luminescent substrate in the presence of an organic solvent.
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and A peptide having luminescence activity.
［2］前記有機溶媒が、アルコール類又は水溶性有機溶媒であることを特徴とする前記［1］に記載の測定方法。 [2] The measurement method according to [1], wherein the organic solvent is an alcohol or a water-soluble organic solvent.
［3］前記アルコール類が脂肪族アルコールであることを特徴とする前記［2］に記載の測定方法。 [3] The measurement method according to [2], wherein the alcohol is an aliphatic alcohol.
［4］前記脂肪族アルコールが、メタノール、エタノール又は１−ブタノールであることを特徴とする前記［3］に記載の測定方法。 [4] The measurement method according to [3], wherein the aliphatic alcohol is methanol, ethanol, or 1-butanol.
［5］前記水溶性有機溶媒が、２−メルカプトエタノール、アセトン、ジメチルスルホオキサイド又はアセトニトリルであることを特徴とする前記［2］〜［4］のいずれかに記載の測定方法。 [5] The measuring method according to any one of [2] to [4], wherein the water-soluble organic solvent is 2-mercaptoethanol, acetone, dimethylsulfoxide, or acetonitrile.
［6］前記発光基質が、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であることを特徴とする前記［1］〜［5］のいずれかに記載の測定方法。 [6] The measurement method according to any one of [1] to [5], wherein the luminescent substrate is coelenterazine or a coelenterazine-related compound.
［7］前記セレンテラジン類縁化合物が、下記化学式（１）又は（２）で表わされることを特徴とする前記［6］に記載の測定方法。
Ｒ2は、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアリールアルキル基、置換もしくは非置換のアリールアルケニル基、又は脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖あるいは分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖もしくは分枝鎖のアルケニル基、又は複素環式基であり、
Ｒ3は、水素原子、又は置換もしくは非置換のアルキル基であり、
Ｘ1は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基又はアミノ基であり、
Ｘ2は、水素原子又は水酸基であり、
Ｙは１〜４個の炭素原子を有する２価の炭化水素基である。）
[7] The measurement method according to [6], wherein the coelenterazine-related compound is represented by the following chemical formula (1) or (2).
R 2 represents a linear or branched chain optionally substituted by a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted arylalkyl group, a substituted or unsubstituted arylalkenyl group, or an aliphatic cyclic group. An alkyl group, a linear or branched alkenyl group optionally substituted by an aliphatic cyclic group, or a heterocyclic group,
R 3 is a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group,
X 1 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, an alkoxyl group or an amino group,
X 2 is a hydrogen atom or a hydroxyl group,
Y is a divalent hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms. )
［8］前記化学式（１）又は（２）において、
Ｒ1が非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基もしくはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、又はシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基であり、
Ｒ2が非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、又は硫黄を含む複素環式基であり、
Ｒ3は、水素原子、メチル基又は２−ヒドロキシエチル基であり、
Ｘ1は、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基又はアミノ基であり、
Ｙはメチレン基、エチレン基、プロピレン基又はビニレン基であること、
を特徴とする前記［7］に記載の測定方法。
[8] In the chemical formula (1) or (2),
R 1 is an unsubstituted aryl group, an unsubstituted arylalkyl group, an arylalkyl group substituted with a hydroxyl group or a halogen atom, or a linear or branched alkyl group optionally substituted with a cyclohexyl group;
R 2 is an unsubstituted aryl group, an aryl group substituted with a hydroxyl group, an unsubstituted arylalkyl group, an arylalkyl group substituted with a hydroxyl group, an unsubstituted arylalkenyl group, an unsubstituted linear or branched chain An alkyl group, a linear alkyl group optionally substituted by an aliphatic cyclic group, a branched alkenyl group, or a heterocyclic group containing sulfur;
R 3 is a hydrogen atom, a methyl group or a 2-hydroxyethyl group,
X 1 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a fluorine atom, a methoxy group or an amino group,
Y is a methylene group, ethylene group, propylene group or vinylene group,
The measurement method according to [7] above, wherein
［9］前記化学式（１）又は（２）において、
Ｒ1がフェニル基、ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−ブロモベンジル基、ｐ−ヨードベンジル基、３,４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基又は２−メチルプロピル基であり、
Ｒ2がフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロペニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基又はチオフェン−２−イル基であること、
を特徴とする前記［7］又は［8］に記載の測定方法。
[9] In the chemical formula (1) or (2),
R 1 is phenyl, benzyl, p-hydroxybenzyl, p-fluorobenzyl, p-chlorobenzyl, p-bromobenzyl, p-iodobenzyl, 3,4-difluorobenzyl, pentafluorobenzyl Group, phenylethyl group, phenylpropyl group, naphthylmethyl group, cyclohexylmethyl group, methyl group, 1-methylpropyl group or 2-methylpropyl group,
R 2 is phenyl group, p-hydroxyphenyl group, benzyl group, α-hydroxybenzyl group, phenylethyl group, phenylvinyl group, cyclohexyl group, cyclohexylmethyl group, cyclohexylethyl group, methyl group, ethyl group, propyl group, 2 -Methylpropyl group, 2-methylpropenyl group, adamantylmethyl group, cyclopentylmethyl group or thiophen-2-yl group,
The measurement method according to [7] or [8] above, wherein
［10］ルシフェラーゼの発光活性の反応測定用溶液であって、有機溶媒を含有することを特徴とする溶液。 [10] A solution for measuring the luminescence activity of luciferase, which contains an organic solvent.
［11］前記ルシフェラーゼが（ａ）又は（ｂ）のペプチドであることを特徴とする前記［10］に記載の溶液。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド。
[11] The solution according to [10], wherein the luciferase is the peptide (a) or (b).
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and A peptide having luminescence activity.
［12］前記有機溶媒が、アルコール類又は水溶性有機溶媒であることを特徴とする前記［10］又は［11］に記載の溶液。 [12] The solution according to [10] or [11], wherein the organic solvent is an alcohol or a water-soluble organic solvent.
［13］前記アルコール類が脂肪族アルコールであることを特徴とする前記［12］に記載の溶液。 [13] The solution according to [12], wherein the alcohol is an aliphatic alcohol.
［14］前記脂肪族アルコールが、メタノール、エタノール又は１−ブタノールであることを特徴とする前記［13］に記載の溶液。 [14] The solution according to [13], wherein the aliphatic alcohol is methanol, ethanol or 1-butanol.
［15］前記水溶性有機溶媒が、２−メルカプトエタノール、アセトン、ジメチルスルホオキサイド又はアセトニトリルであることを特徴とする前記［12］〜［14］のいずれかに記載の溶液。 [15] The solution according to any one of [12] to [14], wherein the water-soluble organic solvent is 2-mercaptoethanol, acetone, dimethyl sulfoxide, or acetonitrile.
［16］ルシフェラーゼの発光活性を測定するためのキットであって、前記［10］〜［15］のいずれかに記載の反応測定用溶液を含有することを特徴とするキット。 [16] A kit for measuring the luminescence activity of luciferase, comprising the reaction measurement solution according to any one of [10] to [15].
［17］前記ルシフェラーゼの基質となる発光基質を含有することを特徴とする前記［16］に記載のキット。 [17] The kit according to [16] above, which contains a luminescent substrate that serves as a substrate for the luciferase.
［18］以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドが有する発光活性を増強させる方法であって、有機溶媒存在下において、発光基質と該ペプチドを反応させることを特徴とする増強方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド。
[18] A method for enhancing the luminescence activity possessed by the following peptide (a) or (b), comprising reacting the peptide with a luminescent substrate in the presence of an organic solvent.
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and A peptide having luminescence activity.
［19］前記有機溶媒が、アルコール類又は水溶性有機溶媒であることを特徴とする前記［18］に記載の増強方法。 [19] The enhancement method according to [18], wherein the organic solvent is an alcohol or a water-soluble organic solvent.
［20］前記発光基質が、セレンテラジン類縁化合物であることを特徴とする前記［18］又は［19］に記載の増強方法。 [20] The enhancement method according to [18] or [19], wherein the luminescent substrate is a coelenterazine analogue.
［21］前記発光基質が、ｈ−セレンテラジン、ｎ−セレンテラジン又はｆ−セレンテラジンであることを特徴とする前記［18］〜［20］のいずれかに記載の増強方法。 [21] The enhancement method according to any one of [18] to [20], wherein the luminescent substrate is h-coelenterazine, n-coelenterazine, or f-coelenterazine.
［22］前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、１−ブタノール、２−メルカプトエタノール、又はアセトンであり、
前記発光基質が、ｈｃｐ−セレンテラジン又はBis−セレンテラジンであることを特徴とする前記［18］〜［20］のいずれかに記載の増強方法。
[22] The organic solvent is methanol, ethanol, 1-butanol, 2-mercaptoethanol, or acetone,
The enhancement method according to any one of [18] to [20], wherein the luminescent substrate is hcp-coelenterazine or Bis-coelenterazine.
［23］ルシフェラーゼの発光活性の増強剤であって、有機溶媒を含有することを特徴とする増強剤。 [23] An enhancer for luminescence activity of luciferase, comprising an organic solvent.
［24］前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドであることを特徴とする前記［23］に記載の増強剤。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド。
[24] The enhancer according to [23], wherein the luciferase is the following peptide (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and A peptide having luminescence activity.
［25］前記有機溶媒が、アルコール類又は水溶性有機溶媒であることを特徴とする前記［23］又は［24］に記載の増強剤。 [25] The enhancer according to [23] or [24], wherein the organic solvent is an alcohol or a water-soluble organic solvent.
［26］前記アルコール類が脂肪族アルコールであることを特徴とする前記［25］に記載の増強剤。 [26] The enhancer according to [25], wherein the alcohol is an aliphatic alcohol.
［27］前記脂肪族アルコールが、メタノール、エタノール又は１−ブタノールであることを特徴とする前記［26］に記載の増強剤。 [27] The enhancer according to [26], wherein the aliphatic alcohol is methanol, ethanol or 1-butanol.
［28］前記水溶性有機溶媒が、２−メルカプトエタノール、アセトン、ジメチルスルホオキサイド又はアセトニトリルであることを特徴とする前記［25］に記載の増強剤。 [28] The enhancer according to [25], wherein the water-soluble organic solvent is 2-mercaptoethanol, acetone, dimethyl sulfoxide, or acetonitrile.
［29］ルシフェラーゼの発光活性を増強するためのキットであって、前記［23］〜［28］のいずれかに記載の増強剤を含有することを特徴とするキット。 [29] A kit for enhancing the luminescence activity of luciferase, comprising the enhancer according to any of [23] to [28].
［30］前記ルシフェラーゼの基質となる発光基質を含有することを特徴とする前記［29］に記載のキット。 [30] The kit according to [29] above, which contains a luminescent substrate that serves as a substrate for the luciferase.
本発明により、有機溶媒存在下において発光酵素の発光活性を測定する方法を提供することができる。 The present invention can provide a method for measuring the luminescent activity of a luminescent enzyme in the presence of an organic solvent.
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
Unless otherwise stated in the embodiments and examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Standard Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The method described in the protocol collection, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention and are shown for illustration or explanation, and the present invention is not limited to them. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
＝＝＝発光活性測定方法＝＝＝
ルシフェラーゼの発光活性を測定する際、有機溶媒存在下において、発光基質と前記ペプチドを反応させることができる。対象となるルシフェラーゼは、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドであることが好ましい。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド。
ペプチド（ａ）は、ヒメヒオドシエビルシフェラーゼを構成する19kDaのサブユニット（以下、「19k0Lase」ともいう）である。このペプチドは、天然由来の蛋白質であっても、遺伝子組換え蛋白質であってもよい。なお、この反応によって生じる発光活性は、市販の発光測定装置によって測定することができる。
=== Method for Measuring Luminescent Activity ===
When measuring the luminescence activity of luciferase, the luminescent substrate and the peptide can be reacted in the presence of an organic solvent. The subject luciferase is preferably the following peptide (a) or (b).
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and A peptide having luminescence activity.
Peptide (a) is a 19 kDa subunit (hereinafter, also referred to as “19k0Lase”) that constitutes Himeodoshie luciferase. This peptide may be a naturally derived protein or a gene recombinant protein. The luminescence activity generated by this reaction can be measured with a commercially available luminescence measuring device.
19k0Laseを生物学的実験における検出マーカー等として利用する場合、マーカーの発現レベルを発光活性として測定する。例えば、常法に従い、19k0Laseをコードする遺伝子を単離し、この遺伝子を含む組換えベクターを構築し、この組換えベクターを動物個体や培養細胞などに導入し、所定の目的に合わせて発現させればよい。そして、細胞内で発現させた後、常法に従い、細胞を適当な溶解用緩衝液で溶解する。その後、精製しても精製しなくてもよいが、組換え19k0Lase蛋白質を含む抽出液に発光基質を加えて反応させ、発光活性として発光強度を測定する。この時、19k0Lase蛋白質を発光基質と反応させるための反応測定用溶液中に有機溶媒を含有していても、19kOLase蛋白質の発光活性を測定可能できる。なお、19k0Lase蛋白質を精製しない場合、溶解用緩衝液で細胞を溶解し、その溶液中で反応させてもよく、その際には、溶解用緩衝液が反応測定用溶液を兼ねることになり、溶解用緩衝液に有機溶媒を含有させてもよい。精製する場合は、その精製方法は公知の任意の方法から適宜選択することができる。例えば、ヒスチジンタグ、Ｓ−グルタチオントランスフェラーゼ、その他のタグ配列を19k0Laseに融合させた融合蛋白質を発現させれば、それぞれ、ニッケルキレートアフィニティークロマト法、グルタチオン結合ゲルによるアフィニティークロマト法、抗体アフィニティークロマト法を用いて、融合蛋白質を精製することができる。 When 19k0Lase is used as a detection marker or the like in a biological experiment, the expression level of the marker is measured as the luminescence activity. For example, according to a conventional method, a gene encoding 19k0Lase is isolated, a recombinant vector containing this gene is constructed, this recombinant vector is introduced into an individual animal or cultured cell, and expressed according to a predetermined purpose. That's fine. And after making it express in a cell, according to a conventional method, a cell is melt | dissolved with a suitable buffer for a solution. Thereafter, it may be purified or not purified, but a luminescent substrate is added to the extract containing the recombinant 19k0Lase protein and reacted, and the luminescence intensity is measured as the luminescence activity. At this time, the luminescence activity of the 19kOLase protein can be measured even if the reaction measurement solution for reacting the 19k0Lase protein with the luminescent substrate contains an organic solvent. If the 19k0Lase protein is not purified, the cells may be lysed with a lysis buffer and allowed to react in the solution. In this case, the lysis buffer will also serve as the reaction measurement solution. The organic buffer may contain an organic solvent. In the case of purification, the purification method can be appropriately selected from known arbitrary methods. For example, if a histidine tag, S-glutathione transferase, and other fusion proteins fused with 19k0Lase are expressed, nickel chelate affinity chromatography, glutathione-binding gel affinity chromatography, and antibody affinity chromatography are used, respectively. Thus, the fusion protein can be purified.
有機溶媒としては、アルコール類又は水溶性有機溶媒を例示できる。例えば、アルコール類は、脂肪族アルコールが好ましく、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、２−メチル−２−プロパノール、２−メチルプロパノール、１−ペンタノール、２，２−ジメチルプロパノール、１−ヘキサノール、エテン−オール、２−プロペン−１−オール、２−ブテン−１−オール、２−プロピン−１−オール、１，２−エタンジオール、１，２，３−プロパントリオール等が例示できるが、これらに限定されない。また、水溶性有機溶媒としては、例えば、２−メルカプトエタノール、アセトン、ジメチルスルホオキサイド、アセトニトリル等が挙げられるが、これらに限定されない。80％以上のルシフェラーゼ活性を確保するためには、有機溶媒の濃度に関して、メタノールは20％以下、エタノールは12％以下、１−ブタノールは3.5%以下、２−メルカプトエタノールは6％以下、アセトンは12％以下、ジメチルスルホオキサイドは20％以下にすることが好ましい。
Examples of the organic solvent include alcohols and water-soluble organic solvents. For example, the alcohol is preferably an aliphatic alcohol, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-2-propanol, 2-methylpropanol, 1-pentanol, 2,2-dimethylpropanol, 1-hexanol, ethene-ol, 2-propen-1-ol, 2-buten-1-ol, 2-propyn-1-ol, 1,2-ethanediol, 1,2, Although 3-propanetriol etc. can be illustrated, it is not limited to these. Examples of the water-soluble organic solvent include, but are not limited to, 2-mercaptoethanol, acetone, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, and the like. In order to ensure 80% or more of luciferase activity, regarding the concentration of the organic solvent, methanol is 20% or less, ethanol is 12% or less, 1-butanol is 3.5% or less, 2-mercaptoethanol is 6% or less, acetone is It is preferable to make it 12% or less and
また、使用される発光基質としては、例えば、セレンテラジン、セレンテラジン類縁化合物等が挙げられ、特にセレンテラジン、Bis-セレンテラジンが好ましい。セレンテラジン類縁化合物は、例えば、下記化学式（１）又は（２）で表わされる化合物が好ましい。 Examples of the luminescent substrate to be used include coelenterazine, coelenterazine-related compounds and the like, and coelenterazine and Bis-coelenterazine are particularly preferable. As the coelenterazine analog compound, for example, a compound represented by the following chemical formula (1) or (2) is preferable.
ここで、式中、Ｒ1は、例えば、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアリールアルキル基、又は脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖あるいは分枝鎖のアルキル基であることが好ましく、Ｒ2は、例えば、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアリールアルキル基、置換もしくは非置換のアリールアルケニル基、又は脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖あるいは分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖もしくは分枝鎖のアルケニル基、又は複素環式基であることが好ましく、Ｒ3は、例えば、水素原子、又は置換もしくは非置換のアルキル基であることが好ましく、Ｘ1は、例えば、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基又はアミノ基であることが好ましく、Ｘ2は、例えば、水素原子又は水酸基であることが好ましく、Ｙは、例えば、1〜4個の炭素原子を有する2価の炭化水素基であることが好ましいが、これらに限定されない。 Here, in the formula, R 1 represents, for example, a linear or branched alkyl which may be substituted with a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted arylalkyl group, or an aliphatic cyclic group. R 2 is preferably substituted with, for example, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted arylalkyl group, a substituted or unsubstituted arylalkenyl group, or an aliphatic cyclic group. It is preferably a linear or branched alkyl group, a linear or branched alkenyl group optionally substituted by an aliphatic cyclic group, or a heterocyclic group, and R 3 is, for example, preferably a hydrogen atom, or a substituted or unsubstituted alkyl group, X 1 is, for example, a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, an alkoxyl group or an amino Is preferably, X 2 is, for example, preferably a hydrogen atom or a hydroxyl group, Y is, for example, is preferably a divalent hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, these It is not limited to.
また、上記化学式（１）又は（２）において、Ｒ1は、例えば、非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基もしくはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、又はシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基であることが好ましく、Ｒ2は、例えば、非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、又は硫黄を含む複素環式基であることが好ましく、Ｒ3は、例えば、水素原子、メチル基又は２−ヒドロキシエチル基であることが好ましく、Ｘ1は、例えば、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基又はアミノ基であることが好ましく、Ｙは、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基又はビニレン基であることが好ましいが、これらに限定されない。 In the chemical formula (1) or (2), R 1 is substituted with, for example, an unsubstituted aryl group, an unsubstituted arylalkyl group, an arylalkyl group substituted with a hydroxyl group or a halogen atom, or a cyclohexyl group. It is preferably a linear or branched alkyl group that may be substituted, and R 2 is, for example, an unsubstituted aryl group, an aryl group substituted with a hydroxyl group, an unsubstituted arylalkyl group, or a hydroxyl group. An arylalkyl group, an unsubstituted arylalkenyl group, an unsubstituted linear or branched alkyl group, a linear alkyl group optionally substituted by an aliphatic cyclic group, a branched alkenyl group, or preferably a heterocyclic group containing sulfur, R 3 is, for example, preferably a hydrogen atom, a methyl group or a 2-hydroxyethyl group, 1, for example, a hydrogen atom, a hydroxyl group, a fluorine atom, preferably a methoxy group or an amino group, Y is, for example, methylene group, ethylene group, is preferably a propylene group or a vinylene group, limited to Not.
さらに、上記化学式（１）又は（２）において、Ｒ1は、例えば、フェニル基、ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−ブロモベンジル基、ｐ−ヨードベンジル基、３,４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基又は２−メチルプロピル基であることが好ましく、Ｒ2は、例えば、フェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロペニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基又はチオフェン−2−イル基であることが好ましいがこれらに限定されない。 Further, in the chemical formula (1) or (2), R 1 is, for example, a phenyl group, a benzyl group, a p-hydroxybenzyl group, a p-fluorobenzyl group, a p-chlorobenzyl group, a p-bromobenzyl group, p -Iodobenzyl group, 3,4-difluorobenzyl group, pentafluorobenzyl group, phenylethyl group, phenylpropyl group, naphthylmethyl group, cyclohexylmethyl group, methyl group, 1-methylpropyl group or 2-methylpropyl group R 2 is, for example, phenyl group, p-hydroxyphenyl group, benzyl group, α-hydroxybenzyl group, phenylethyl group, phenylvinyl group, cyclohexyl group, cyclohexylmethyl group, cyclohexylethyl group, methyl group, Ethyl group, propyl group, 2-methylpropyl group, 2-methyl A propenyl group, an adamantylmethyl group, a cyclopentylmethyl group, or a thiophen-2-yl group is preferred but not limited thereto.
＝＝発光活性測定用キット＝＝
本発明のルシフェラーゼ反応測定用キットは、有機溶媒を含有したルシフェラーゼの発光反応測定用溶液を含む。このキットの対象となるルシフェラーゼは、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドであることが好ましい。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド、である。
ここで、反応測定用溶液は、これらの発光酵素を用いて発光反応させるための単一目的であってもよいが、発光活性の測定以前に他の反応を行い、連続して発光反応を行う場合、前に行う反応用緩衝液を兼ねていてもよい。
また、このキットは、反応測定用溶液以外に、発光酵素の基質となる上記発光基質を含んでいてもよい。
== Kit for measuring luminescence activity ==
The luciferase reaction measurement kit of the present invention includes a luciferase luminescence reaction measurement solution containing an organic solvent. The luciferase targeted by this kit is preferably the following peptide (a) or (b).
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and A peptide having luminescence activity.
Here, the solution for reaction measurement may be a single purpose for causing a luminescence reaction using these luminescent enzymes, but another reaction is performed before the measurement of the luminescence activity, and the luminescence reaction is continuously performed. In this case, it may also serve as a buffer for the reaction performed before.
Moreover, this kit may contain the said luminescent substrate used as the substrate of a luminescent enzyme other than the solution for reaction measurement.
＝＝ルシフェラーゼ反応増強剤及び増強方法＝＝
ルシフェラーゼ反応測定溶液中に有機溶媒を含有させて反応を行なう際、有機溶媒の濃度及び反応基質を適切に選択することにより、ルシフェラーゼの反応活性を増強することができる。従って、有機溶媒を含有させることによって、ルシフェラーゼの反応活性を増強するための発光活性増強剤を製造することができる。この際、増強剤に反応測定用溶液に添加する適量の有機溶媒を含有させればよく、増強剤の形状は限定されない。
ルシフェラーゼ反応測定溶液中に有機溶媒を含有させてルシフェラーゼの発光活性を増強させるためには、発光基質として、セレンテラジン類縁化合物を使用すればよい。ここで使用するセレンテラジン類縁化合物は、h-セレンテラジン、n-セレンテラジン、f-セレンテラジン等であることが最も好ましく、この場合、使用する有機溶媒は、アルコール類又は水溶性有機溶媒が好ましい。アルコール類は、脂肪族アルコールが好ましく、特に限定されないが、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、２−メチル−２−プロパノール、２−メチルプロパノール、１−ペンタノール、２，２−ジメチルプロパノール、１−ヘキサノール、エテン−オール、２−プロペン−１−オール、２−ブテン−１−オール、２−プロピン−１−オール、１，２−エタンジオール、１，２，３−プロパントリオール等が例示でき、メタノール、エタノール、１−ブタノールが特に好ましい。また、水溶性有機溶媒は、特に限定されないが、２−メルカプトエタノール、アセトン、ジメチルスルホオキサイド、アセトニトリル等が特に好ましい。Bis-セレンテラジン、又はhcp-セレンテラジンを用いた場合は、有機溶媒として、メタノール、エタノール、１−ブタノール、２−メルカプトエタノール、アセトンを用いればよい。
このような発光基質を使用すれば、ルシフェラーゼの発光活性を増強させることができるので、より高感度に発光活性を測定することができる。
== Luciferase reaction enhancer and enhancement method ==
When the reaction is performed with an organic solvent contained in the luciferase reaction measurement solution, the reaction activity of luciferase can be enhanced by appropriately selecting the concentration of the organic solvent and the reaction substrate. Therefore, a luminescence activity enhancer for enhancing the reaction activity of luciferase can be produced by containing an organic solvent. At this time, an appropriate amount of an organic solvent to be added to the reaction measurement solution may be contained in the enhancer, and the shape of the enhancer is not limited.
In order to enhance the luminescence activity of luciferase by including an organic solvent in the luciferase reaction measurement solution, a coelenterazine-related compound may be used as the luminescent substrate. The coelenterazine-related compound used here is most preferably h-coelenterazine, n-coelenterazine, f-coelenterazine, etc. In this case, the organic solvent used is preferably an alcohol or a water-soluble organic solvent. The alcohol is preferably an aliphatic alcohol, and is not particularly limited. However, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-2-propanol, 2-methylpropanol, 1- Pentanol, 2,2-dimethylpropanol, 1-hexanol, ethene-ol, 2-propen-1-ol, 2-buten-1-ol, 2-propyn-1-ol, 1,2-ethanediol, 1 2,3-propanetriol and the like, and methanol, ethanol, and 1-butanol are particularly preferable. The water-soluble organic solvent is not particularly limited, but 2-mercaptoethanol, acetone, dimethyl sulfoxide, acetonitrile and the like are particularly preferable. When Bis-coelenterazine or hcp-coelenterazine is used, methanol, ethanol, 1-butanol, 2-mercaptoethanol, or acetone may be used as the organic solvent.
If such a luminescent substrate is used, the luminescence activity of luciferase can be enhanced, so that the luminescence activity can be measured with higher sensitivity.
＝＝発光活性測定方法の応用＝＝
本発明の発光活性測定方法は、ヒメヒオドシエビルシフェラーゼを生物学的実験におけるマーカー（例えば、検出マーカー）や医薬診断用マーカー（例えば、高感度プローブ）として使用する際に、利用することができる。特に、発光酵素の反応系に、有機溶媒が持ち込まれるような場合に、有効に利用できる。例えば、薬物のスクリーニングに発光反応を用いるような場合、スクリーニング対象の低分子化合物が難水溶性の場合には、低分子化合物を有機溶媒に溶解して使用することが多い。その時、発光酵素の反応系に、低分子化合物の溶媒からの有機溶媒の持ち込みがあれば、有機溶媒で失活してしまう発光酵素は、検出マーカーや高感度プローブとして使用することができない。しかし、本発明の発光活性測定方法は、このような場合においても、ヒメヒオドシエビルシフェラーゼ等の発光酵素を使用することによって、発光活性を測定することができる。また、本発明の発光活性増強方法に従ってヒメヒオドシエビルシフェラーゼを利用すれば、さらに高感度に発光活性を利用できる。
== Application of luminescent activity measurement method ==
The method for measuring luminescence activity according to the present invention can be used when Himeodoshie biluciferase is used as a marker in biological experiments (for example, a detection marker) or a marker for pharmaceutical diagnosis (for example, a highly sensitive probe). . In particular, it can be effectively used when an organic solvent is brought into the reaction system of the luminescent enzyme. For example, when a luminescent reaction is used for drug screening, if the low-molecular compound to be screened is poorly water-soluble, the low-molecular compound is often dissolved in an organic solvent and used. At that time, if an organic solvent is brought into the reaction system of the luminescent enzyme from the solvent of the low molecular compound, the luminescent enzyme that is inactivated by the organic solvent cannot be used as a detection marker or a highly sensitive probe. However, even in such a case, the luminescent activity measuring method of the present invention can measure the luminescent activity by using a luminescent enzyme such as Himejidoebu luciferase. In addition, when himeodosibiru luciferase is used according to the method for enhancing luminescence activity of the present invention, the luminescence activity can be used with higher sensitivity.
以下、実施例を用いて、本発明を更に詳細に説明するが、これは例示であって、本発明をこの実施例に限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail using an Example, this is an illustration and this invention is not limited to this Example.
＝＝＝天然エビルシフェラーゼの調製＝＝＝
エビ由来の天然発光酵素の調製法は、すでにShimomura らが報告している文献（Biochemistry（1978）17巻pp994-998）に記載のイオン交換クロマト法、ゲルろ過クロマト法の組み合せ、及びInouyeらが報告している文献（Inouye，S, Watanabe, K., Nakamura, H., Shimomura, O.（2000）FEBS Lett．481：19-25.）の疎水性クロマト法、ゲルろ過方法に従い精製した。
=== Preparation of natural Evil luciferase ===
Shrimp-derived natural luminescent enzymes were prepared by combining ion exchange chromatography and gel filtration chromatography described in the literature (Biochemistry (1978) 17 pp 994-998) already reported by Shimomura et al. It was purified according to the reported literature (Inouye, S, Watanabe, K., Nakamura, H., Shimomura, O. (2000) FEBS Lett. 481: 19-25.) Hydrophobic chromatography and gel filtration.
＝＝＝KAZ遺伝子発現ベクターの構築＝＝＝
本実施例では、以下に記載の通り、常温発現ベクター又は低温発現ベクターを用いて19kOLaseを発現させた。
=== Construction of KAZ gene expression vector ===
In this example, as described below, 19 kOLase was expressed using a normal temperature expression vector or a low temperature expression vector.
（1）常温発現ベクターを用いたKAZ遺伝子発現ベクターの構築
まず、大腸菌で発現ベクターを用いて組換え蛋白質の発現を大腸菌生育の至適温度37℃で行った（以下、この至適温度での発現系を「常温発現系」ともいう）。
続いて、19kOLaseをコードするKAZ遺伝子DNA断片を、PCR法を用いて調製し、このDNA断片を、市販のヒスチジンタグを有する常温発現ベクターpTrcHis−Bベクター（インビトロゲン社製）の制限酵素NheI／XhoI部位に挿入することによって、KAZ遺伝子発現ベクターを作製した。具体的には、pKAZ−412（Inouye，S, Watanabe, K., Nakamura, H., Shimomura, O.（2000）FEBS Lett．481：19-25.）を鋳型としてPCRプライマーペア：KAZ−3（5’ ccgGCTAGCTTTACGTTGGCAGATTTCGTTGGA 3’）（配列番号2）及びT7−BcaBEST（5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’）（配列番号3）を用いて、PCRキット（日本ジーン社製）にてPCR（サイクル条件：25サイクル；1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃）を行った。得られた断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製し、制限酵素NheI/XhoIで消化した後、pTrcHis−Bの制限酵素NheI/XhoI部位に挿入することによって、発現ベクターpHis−KAZを構築した。なお、DNA シークエンサー（ABI社製）により塩基配列を決定することにより、インサートＤＮＡの確認を行った。
(1) Construction of KAZ gene expression vector using normal temperature expression vector First, recombinant protein was expressed in Escherichia coli at an optimum temperature of 37 ° C for growth of Escherichia coli (hereinafter referred to as this optimum temperature). The expression system is also referred to as “room temperature expression system”).
Subsequently, a KAZ gene DNA fragment encoding 19 kOLase was prepared using the PCR method, and this DNA fragment was prepared from the restriction enzyme NheI / B of a room temperature expression vector pTrcHis-B vector (manufactured by Invitrogen) having a histidine tag. A KAZ gene expression vector was prepared by inserting into the XhoI site. Specifically, PCR primer pair: KAZ-3 using pKAZ-412 (Inouye, S, Watanabe, K., Nakamura, H., Shimomura, O. (2000) FEBS Lett. 481: 19-25.) As a template. (5 ′ ccgGCTAGCTTTACGTTGGCAGATTTCGTTGGA 3 ′) (SEQ ID NO: 2) and T7-BcaBEST (5 ′ TAATACGACTCACTATAGGG 3 ′) (SEQ ID NO: 3) using PCR kit (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) (cycle conditions: 25 cycles; 1 minute / 94 ° C., 1 minute / 50 ° C., 1 minute / 72 ° C.). The resulting fragment was purified with a PCR purification kit (Qiagen), digested with restriction enzymes NheI / XhoI, and then inserted into the restriction enzyme NheI / XhoI site of pTrcHis-B to construct the expression vector pHis-KAZ. did. The insert DNA was confirmed by determining the base sequence with a DNA sequencer (manufactured by ABI).
（2）低温発現ベクターを用いたKAZ遺伝子発現ベクターの構築
低温で機能するcsp (cold shock protein)プロモーターを有する低温発現ベクターpCold II（タカラバイオ株式会社）を用いて、10〜15℃で発現誘導できるベクターを構築した（以下、「低温発現系」ともいう）。具体的には、前述のpTricHisB を用いたKAZ遺伝子発現ベクターpHis-KAZをテンプレートとし、N末端にNdeI（KAZ-17N/NedI：5’ gcg CATATGTTTACGTTGGCAGATTTCGTT 3’）（配列番号4）及びC末端にEcoR Iサイトを付加させるようプライマー (KAZ-12C/EcoRI: 5’ cgcGAATTCTTAGGCAAGAATGTTCTCGCAAAGCCT 3’)（配列番号5）を設計しPCR（サイクル条件：25サイクル；1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃）を行って得られたKAZ遺伝子断片を、PCR精製キット（キアゲン社製）で精製し、Nde I及びEcoR Iで消化後、pCold II（タカラバイオ株式会社）のNde I/EcoR I部位に挿入し、発現ベクターpCold-KAZを作成した。なお、DNA シークエンサー（ABI社製）により配列を決定することにより、塩基配列の確認を行った。
(2) Construction of KAZ gene expression vector using low-temperature expression vector Expression induction at 10-15 ° C using low-temperature expression vector pCold II (Takara Bio Inc.) having a csp (cold shock protein) promoter that functions at low temperatures A vector was constructed (hereinafter also referred to as “low-temperature expression system”). Specifically, using the above-described KAZ gene expression vector pHis-KAZ using pTricHisB as a template, NdeI (KAZ-17N / NedI: 5 'gcg CATATGTTTACGTTGGCAGATTTCGTT 3') (SEQ ID NO: 4) at the N-terminus and EcoR at the C-terminus A primer (KAZ-12C / EcoRI: 5 'cgcGAATTCTTAGGCAAGAATGTTCTCGCAAAGCCT 3') (SEQ ID NO: 5) was designed to add the I site and PCR (cycle conditions: 25 cycles; 1 minute / 94 ° C, 1 minute / 50 ° C, 1 minute) / 72 ° C), the KAZ gene fragment was purified with a PCR purification kit (Qiagen), digested with Nde I and EcoR I, and then Nde I / EcoR I of pCold II (Takara Bio Inc.) The expression vector pCold-KAZ was constructed by inserting into the site. The nucleotide sequence was confirmed by determining the sequence with a DNA sequencer (manufactured by ABI).
＝＝＝低温発現ベクターによる組換え19k0Laseの調製＝＝＝
（1）大腸菌において組換え19k0Laseを発現させるために、KAZ遺伝子が挿入された低温発現ベクターpCold-KAZを用いた。まず、pCold-KAZで大腸菌BL21（アマシャムバイオサイエンス社）を形質転換した。得られた形質転換体を固形培地上でシングルコロニーにして37℃で一晩培養後、アンピシリン（50μg/ml）を含有する10mlのLB液体培地（水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストイクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、ｐＨ7.2）に植菌し、さらに37℃で18時間培養を行った。次いで、その培養菌を新たなLB液体培地400mlに添加し、さらにクレット測定計での菌体濁度が200クレットになるまで培養し、15℃に冷却した。冷却培養液に、ラクトースオペロン誘導剤IPTGを、最終濃度が0.1mMになるように添加し、15℃で18時間培養した。培養後、菌体を遠心回収（5,000rpm×5分間、3,000×g）し、19k0Laseの抽出出発材料とした。
=== Preparation of recombinant 19k0Lase with cold expression vector ===
(1) In order to express recombinant 19k0Lase in E. coli, a low-temperature expression vector pCold-KAZ into which the KAZ gene was inserted was used. First, E. coli BL21 (Amersham Bioscience) was transformed with pCold-KAZ. The resulting transformant was transformed into a single colony on a solid medium and cultured overnight at 37 ° C. Then, 10 ml of LB liquid medium containing ampicillin (50 μg / ml) (10 g of bactotryptone per liter of water, yeast 5 g of tract, 5 g of sodium chloride, pH 7.2) and inoculated at 37 ° C. for 18 hours. Subsequently, the cultured bacteria were added to 400 ml of a new LB liquid medium, and further cultured until the turbidity of the cells measured with a Kret meter was 200 klets, and cooled to 15 ° C. The lactose operon inducer IPTG was added to the chilled culture solution so that the final concentration was 0.1 mM, and cultured at 15 ° C. for 18 hours. After culturing, the cells were collected by centrifugation (5,000 rpm × 5 minutes, 3,000 × g), and used as a starting material for 19k0Lase extraction.
（2）培養菌体からの組換え19k0Laseの抽出
本条件では、大腸菌の中で発現した19k0Lase蛋白質は封入体となるため、得られた封入体を６M尿素によって以下のように可溶化した。
まず、集菌した菌体を50mM Tris-HCl（pH7.6）100mlで懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理 (ブランソン社製、モデル 250)を3分間、3回行い、その菌体破砕液を10,000rpm (12,300×g)で20分間遠心し、不溶性沈澱画分を得た。得られた不溶性沈澱画分を、2M尿素を含む20mM Tris-HCl (pH7.6)20mlに懸濁し、この懸濁液を超音波破砕処理を行い、10,000rpm (12,300×g)で10分間遠心した。この作業を再度繰り返し、最終的に得られた2M尿素不溶性画分を、６M尿素を含む20mM Tris-HCl (pH7.6)30mlに懸濁し、Voltex及び超音波破砕処理で溶解させた。この画分を一晩4℃におき、−20℃にて保存した。これを19k0Laseの精製出発材料とした。
(2) Extraction of recombinant 19k0Lase from cultured cells Under these conditions, the 19k0Lase protein expressed in Escherichia coli becomes an inclusion body, so the obtained inclusion body was solubilized with 6M urea as follows.
First, the collected cells are suspended in 100 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), and subjected to ultrasonic crushing treatment (Branson, model 250) three times for 3 minutes under ice-cooling. The solution was centrifuged at 10,000 rpm (12,300 × g) for 20 minutes to obtain an insoluble precipitate fraction. The obtained insoluble precipitate fraction was suspended in 20 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 2 M urea, this suspension was subjected to ultrasonic crushing treatment, and centrifuged at 10,000 rpm (12,300 × g) for 10 minutes. did. This operation was repeated again, and the finally obtained 2M urea-insoluble fraction was suspended in 30 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 6 M urea and dissolved by Voltex and ultrasonic crushing treatment. This fraction was placed at 4 ° C. overnight and stored at −20 ° C. This was used as a starting material for 19k0Lase purification.
（3）尿素溶解画分からの組換え19k0Laseの精製
組換え蛋白質はアミノ末端に6個のヒスチジン配列を有しているので、ニッケルキレートゲルによるアフィニティークロマト法により組換え蛋白質を精製した。
まず、6M尿素溶解画分を、6M 尿素を含む20mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したニッケルキレートカラム(アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×5 cm)に添加してKAZを吸着させた。吸着19k0Laseを、6M尿素を含む0.3 Mイミダゾール（和光純薬工業社製）で溶出させ、得られた発光活性画分を5Lの0.1M炭酸アンモニウム溶液（pH 8.0）に対して、一晩4℃で透析した。
透析した発光活性画分50mlに最終濃度6Mになるように尿素を溶解させ、再度ニッケルキレートカラム(アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×5 cm)に吸着させ、イミダゾール濃度0〜0.3Mまで直線濃度勾配で溶出させたところ、イミダゾール濃度0.08〜0.12Mの画分にて発光活性が溶出した。最後に、12％SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法で、その画分が、純度は95％以上の16mgの19k0Laseを含んでいることを確認した。表１に精製収率（％）等をまとめた。
(3) Purification of recombinant 19k0Lase from urea-soluble fraction Since the recombinant protein has six histidine sequences at the amino terminus, the recombinant protein was purified by affinity chromatography using a nickel chelate gel.
First, the 6M urea-soluble fraction was added to a nickel chelate column (Amersham Biosciences, column size: 1.5 × 5 cm diameter) equilibrated with 20 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 6M urea, and KAZ was added. Adsorbed. The adsorbed 19k0Lase was eluted with 0.3 M imidazole (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 6M urea, and the resulting luminescent activity fraction was allowed to stand at 4 ° C overnight against 5L of 0.1M ammonium carbonate solution (pH 8.0). Dialyzed.
Urea is dissolved in 50 ml of the dialyzed luminescent activity fraction to a final concentration of 6 M, and again adsorbed on a nickel chelate column (Amersham Biosciences, column size: diameter 1.5 × 5 cm), to an imidazole concentration of 0 to 0.3 M When elution was performed with a linear concentration gradient, luminescence activity was eluted in a fraction having an imidazole concentration of 0.08 to 0.12M. Finally, it was confirmed by 12% SDS-polyacrylamide electrophoresis that the fraction contained 16 mg of 19k0Lase with a purity of 95% or more. Table 1 summarizes the purification yield (%) and the like.
表１：低温発現ベクターを用いた、400mlの培養菌体からの組換え19kOLaseの精製
＝＝＝常温発現ベクターによる組換え19k0Laseの調製＝＝＝
pTrcHis Bから構築したKAZ遺伝子発現ベクターpHis-KAZを、常温発現ベクターとして用いた。なお、菌体培養温度以外の条件は、低温発現ベクターpCold IIを用いたKAZ遺伝子発現精製法と同様であった。端的に言うと、常温（37℃）において、組換え19k0Laseを大腸菌で発現させ、得られた封入体を尿素処理（6M尿素）により可溶化し、ニッケルキレートを結合させたカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×5 cm）に2回流すことにより19k0Lase蛋白質を精製した。この蛋白質の収率及び純度は、上記「低温発現ベクターでの組換え19kOLaseの調製法」によって得られたものと同等であった。
=== Preparation of recombinant 19k0Lase with room temperature expression vector ===
The KAZ gene expression vector pHis-KAZ constructed from pTrcHis B was used as the room temperature expression vector. The conditions other than the cell culture temperature were the same as in the KAZ gene expression purification method using the low-temperature expression vector pCold II. In short, recombinant 19k0Lase is expressed in E. coli at room temperature (37 ° C), and the resulting inclusion bodies are solubilized by urea treatment (6M urea) and nickel chelate bound (Amersham Biosciences) 19k0Lase protein was purified by flowing twice through a column size (diameter: 1.5 × 5 cm). The yield and purity of this protein were equivalent to those obtained by the above-mentioned “Preparation of recombinant 19kOLase with low-temperature expression vector”.
＝＝＝天然エビルシフェラーゼ及び19k0Laseの基質特異性＝＝＝
上記のように調整した天然エビルシフェラーゼ及び19k0Laseを用い、有機溶媒を含まない通常の条件で発光反応を測定し、各酵素の基質特異性を調べた。
すなわち、10mM EDTA−30mM Tris-HCl (pH 7.6)溶液（200μl）を反応測定用溶液とし、天然エビルシフェラーゼ又は精製19k0Lase（1μg）及び市販のセレンテラジン（チッソ株式会社）又はその類縁体化合物（h-セレンテラジン（チッソ株式会社）、hcp-セレンテラジン（和光純薬工業社製）、f-セレンテラジン（和光純薬工業社製）、n-セレンテラジン（和光純薬工業社製）、Bis-セレンテラジン（チッソ株式会社）、e-セレンテラジン（和光純薬工業社製）を1μg加えて撹拌し、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200 (アトー社製)で60秒間発光活性の測定を行い、最大発光強度(Imax)で表記した。得られた結果を表２に示す。なお、ここで用いたセレンテラジン又はその誘導体の構造は、図１に示す通りである。
=== Substrate specificity of natural Evil luciferase and 19k0Lase ===
Using natural ebylluciferase and 19k0Lase prepared as described above, the luminescence reaction was measured under normal conditions not containing an organic solvent, and the substrate specificity of each enzyme was examined.
That is, a 10 mM EDTA-30 mM Tris-HCl (pH 7.6) solution (200 μl) was used as a reaction measurement solution, and natural Evil luciferase or purified 19k0Lase (1 μg) and a commercially available coelenterazine (Chisso Corporation) or its analog compound (h- Coelenterazine (Chisso Corporation), hcp-Coelenterazine (Wako Pure Chemical Industries), f-Coelenterazine (Wako Pure Chemical Industries), n-Coelenterazine (Wako Pure Chemical Industries), Bis-Coelenterazine (Chisso Corporation) ), 1 μg of e-coelenterazine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and stirred. Luminescencer-PSN AB2200 (manufactured by Ato) was used to measure luminescence activity for 60 seconds and expressed as the maximum luminescence intensity (Imax). The obtained results are shown in Table 2. The structure of coelenterazine or a derivative thereof used here is as shown in FIG.
表２：組換え19kOLase及び天然エビルシフェラーゼの基質特異性の比較
このように、組換え19kOLaseは、天然エビルシフェラーゼと同様に、幅広い基質特異性を示した。特にBis-セレンテラジン及びe-セレンテラジンを用いた時、これらの酵素は、セレンテラジンを用いた時と同等の活性を示し、Bis-セレンテラジン及びe-セレンテラジンが、これらの酵素にとって好ましい基質類縁体であることがわかった。 Thus, the recombinant 19kOLase showed a wide range of substrate specificities, similar to natural ebyl luciferase. In particular, when using Bis-coelenterazine and e-coelenterazine, these enzymes show the same activity as when using coelenterazine, and Bis-coelenterazine and e-coelenterazine are preferred substrate analogs for these enzymes. I understood.
＝＝＝セレンテラジンを発光基質とした場合の、有機溶媒存在下における組換え19k0Lase発光活性＝＝＝
発光反応系の有機溶媒最終濃度が0.5〜100％なるように、各種の有機溶媒（メタノール、エタノール、１−ブタノール、2-メルカプトエタノール、アセトン、ジメチルスルホオキサイド）の存在下において、セレンテラジンを発光基質とした場合の組換え19k0Laseの発光への影響を調べた。発光反応測定法は、10mM EDTA−30mM Tris-HCl (pH 7.6)溶液（200μl）に精製19k0Lase（1μg）及び市販のセレンテラジン1μg加え撹拌後、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200 (アトー社製)で60秒間発光活性の測定を行い、最大発光強度(Imax)で表記した。溶媒の濃度に対して、最大発光強度をプロットした。その結果を図２に示す（なお、図２における相対発光強度は、最大発光強度を意味する）。
80％以上の活性が保持できる有機溶媒濃度は、10％メタノール、3％エタノール、1％１−ブタノール、1.5％ ２-メルカプトエタノール、3％アセトン、8％ジメチルスルホオキサイドであった。
=== Recombinant 19k0Lase Luminescent Activity in the Presence of Organic Solvent when Coelenterazine is Used as Luminescent Substrate ===
Coelenterazine is a luminescent substrate in the presence of various organic solvents (methanol, ethanol, 1-butanol, 2-mercaptoethanol, acetone, dimethylsulfoxide) so that the final concentration of the organic solvent in the luminescent reaction system is 0.5 to 100%. The effect of recombinant 19k0Lase on luminescence was investigated. Luminescence reaction measurement was performed by adding purified 19k0Lase (1 μg) and 1 μg of commercially available coelenterazine to a 10 mM EDTA-30 mM Tris-HCl (pH 7.6) solution (200 μl), stirring, and then using a Luminescencer-PSN AB2200 (manufactured by Ato). Luminescent activity was measured for 2 seconds and expressed as maximum emission intensity (Imax). The maximum emission intensity was plotted against the solvent concentration. The results are shown in FIG. 2 (note that the relative light emission intensity in FIG. 2 means the maximum light emission intensity).
The organic solvent concentration capable of retaining 80% or more of activity was 10% methanol, 3% ethanol, 1% 1-butanol, 1.5% 2-mercaptoethanol, 3% acetone, 8% dimethyl sulfoxide.
＝＝＝Bis-セレンテラジンを発光基質とした場合の、有機溶媒存在下における組換え19k0Lase発光活性＝＝＝
セレンテラジンを発光基質とした場合と同様な有機溶媒存在下での発光反応条件で、Bis-セレンテラジン1μgを発光基質とした場合の組換え19k0Laseの発光活性化について検討を行った。その結果を図３に示す。
80％以上の発光活性が保持できる有機溶媒の濃度は、20％メタノール、12％エタノール、3.5％１−ブタノール、6％２−メルカプトエタノール、12％アセトン、20％ジメチルスルホオキサイドであった。
また、有機溶媒の添加によって、顕著な発光活性の増強が認められた。具体的には、各溶媒での最大活性化率は、10％メタノールで465％、5％エタノールで313％、2％１−ブタノールで323％、3％ 2-メルカプトエタノールで491％、5％アセトンで260％、15％ジメチルスルホオキサイドで302％であった。
以上より、Bis-セレンテラジンを発光基質とした場合、有機溶媒存在下においても、発光酵素の発光活性を測定できること、さらに、有機溶媒を適量加えることにより発光酵素の発光活性を増強できることが明らかになった。
=== Recombinant 19k0Lase Luminescent Activity in the Presence of Organic Solvent Using Bis-Coelenterazine as Luminescent Substrate ===
We investigated the luminescence activation of recombinant 19k0Lase using 1 μg of Bis-coelenterazine as the luminescent substrate under the same luminescent reaction conditions in the presence of organic solvent as when using coelenterazine as the luminescent substrate. The result is shown in FIG.
The concentration of the organic solvent capable of retaining 80% or more of the luminescence activity was 20% methanol, 12% ethanol, 3.5% 1-butanol, 6% 2-mercaptoethanol, 12% acetone, 20% dimethyl sulfoxide.
In addition, significant enhancement of the luminescence activity was recognized by the addition of the organic solvent. Specifically, the maximum activation rate in each solvent is 465% with 10% methanol, 313% with 5% ethanol, 323% with 2% 1-butanol, 3% 491% with 2-mercaptoethanol, 5% It was 260% with acetone and 302% with 15% dimethyl sulfoxide.
From the above, it is clear that when Bis-coelenterazine is used as the luminescent substrate, the luminescent activity of the luminescent enzyme can be measured even in the presence of an organic solvent, and the luminescent activity of the luminescent enzyme can be enhanced by adding an appropriate amount of the organic solvent. It was.
＝＝＝チオール還元剤を用いた天然エビルシフェラーゼ及び組換え19k0Laseの活性測定＝＝＝
19k0Laseのアミノ酸配列（配列番号1）において、164番目のシステイン残基の役割を調べるため、代表的な還元試薬である2-メルカプトエタノール（和光純薬）の、天然エビルシフェラーゼ及び組換え19k0Laseの発光活性への影響を、セレンテラジン及びBis-セレンテラジンを基質として調べた。具体的には、上記反応測定用溶液に0.5％の2-メルカプトエタノールを添加し、これら基質に対するルシフェラーゼの活性を測定した。その結果を表３に示す。
=== Activity measurement of natural Evil luciferase and recombinant 19k0Lase using thiol reducing agent ===
In order to investigate the role of the 164th cysteine residue in the amino acid sequence of 19k0Lase (SEQ ID NO: 1), the light emission of natural Evil luciferase and recombinant 19k0Lase from 2-mercaptoethanol (Wako Pure Chemical), a typical reducing reagent The effect on activity was investigated using coelenterazine and Bis-coelenterazine as substrates. Specifically, 0.5% 2-mercaptoethanol was added to the above reaction measurement solution, and the activity of luciferase on these substrates was measured. The results are shown in Table 3.
表３：最終濃度0.5％の2-メルカプトエタノール(2ME)存在下における、Bis-セレンテラジンとの組み合わせによる発光酵素の活性
天然エビルシフェラーゼにおいても、組換え19kOLaseと同様、セレンテラジン及びBis-セレンテラジンのどちらを基質とした場合でも、2-メルカプトエタノール(2ME)の存在下で顕著な発光活性の減少は認められなかった。従って、天然エビルシフェラーゼであっても、組換え19kOLaseと同様、有機溶媒の存在下で発光反応を測定することができる。 In natural ebyl luciferase, as in the case of recombinant 19kOLase, no significant decrease in luminescence activity was observed in the presence of 2-mercaptoethanol (2ME), regardless of whether coelenterazine or Bis-coelenterazine was used as a substrate. Therefore, even in the case of natural ebyl luciferase, the luminescence reaction can be measured in the presence of an organic solvent as in the case of recombinant 19kOLase.
＝＝＝セレンテラジン類縁化合物を発光基質とした場合の、各種有機溶媒存在下における組換え19k0Lase発光活性＝＝＝
上述したように、Bis-セレンテラジンを発光基質とした場合において、80％以上の発光活性が保持できる有機溶媒の濃度は、20％メタノール、12％エタノール、3.5％１−ブタノール、6％２−メルカプトエタノール、12％アセトン、20％ジメチルスルホオキサイドであることが明らかになった。そこで、このような80％以上の活性が保持できる各種有機溶媒存在下において、セレンテラジン類縁化合物を発光基質とした場合の組換え19k0Laseの発光活性化について検討を行った。その結果を表４に示す。
=== Recombinant 19k0Lase Luminescent Activity in the Presence of Various Organic Solvents Using Coelenterazine Analogue as Luminescent Substrate ===
As described above, when Bis-coelenterazine is used as the luminescent substrate, the concentration of the organic solvent capable of retaining 80% or more of the luminescent activity is 20% methanol, 12% ethanol, 3.5% 1-butanol, 6% 2-mercapto. It was revealed to be ethanol, 12% acetone, and 20% dimethyl sulfoxide. Therefore, we investigated the luminescence activation of recombinant 19k0Lase using coelenterazine analogues as luminescent substrates in the presence of various organic solvents capable of maintaining such an activity of 80% or more. The results are shown in Table 4.
表４：セレンテラジン類縁化合物を発光基質とした場合の、各種有機溶媒存在下における組換え19k0Lase発光活性
Bis-セレンテラジン、h-セレンテラジン、hcp-セレンテラジン、n-セレンテラジン、f-セレンテラジンを発光基質とした場合、ほとんどの種類の有機溶媒の添加によって、発光活性の増強が認められた。特に、ｈ−セレンテラジン、ｎ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジンを発光基質として使用した場合には、全ての種類の溶媒有機溶媒において、その有機溶媒の添加による発光活性の増強が認められ、有機溶媒の種類に関わらずルシフェラーゼの発光活性を増強できることが明らかになった。 When Bis-coelenterazine, h-coelenterazine, hcp-coelenterazine, n-coelenterazine, and f-coelenterazine were used as luminescent substrates, enhancement of luminescence activity was observed by adding most kinds of organic solvents. In particular, when h-coelenterazine, n-coelenterazine, and f-coelenterazine are used as the luminescent substrate, enhancement of luminescence activity by the addition of the organic solvent is recognized in all types of solvent organic solvents. Regardless, it became clear that the luminescence activity of luciferase can be enhanced.
Claims (4)
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
が有する発光活性を増強させる方法であって、
有機溶媒存在下において、発光基質と該ペプチドを反応させ、
前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、１−ブタノール、アセトン、ジメチルスルホオキサイド、又は２−メルカプトエタノールであり、
前記発光基質が、ｈ−セレンテラジンである
ことを特徴とする増強方法。 The following peptide (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added And a method for enhancing the luminescence activity of a peptide having luminescence activity,
Reacting the luminescent substrate with the peptide in the presence of an organic solvent,
The organic solvent is methanol, ethanol, 1-butanol, acetone, dimethyl sulfoxide, or 2-mercaptoethanol;
The luminescent substrate, h - enhancing method, which is a coelenterazine.
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は (A) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド (B) a peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a luminescent activity
が有する発光活性を増強させる方法であって、 A method for enhancing the luminescence activity of
有機溶媒存在下において、発光基質と該ペプチドを反応させ、 Reacting the luminescent substrate with the peptide in the presence of an organic solvent,
前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、１−ブタノール、又は２−メルカプトエタノールであり、 The organic solvent is methanol, ethanol, 1-butanol, or 2-mercaptoethanol;
前記発光基質が、ｈｃｐ−セレンテラジンである The luminescent substrate is hcp-coelenterazine
ことを特徴とする増強方法。 An enhancement method characterized by the above.
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は (A) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド (B) a peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a luminescent activity
が有する発光活性を増強させる方法であって、 A method for enhancing the luminescence activity of
有機溶媒存在下において、発光基質と該ペプチドを反応させ、 Reacting the luminescent substrate with the peptide in the presence of an organic solvent,
前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、ジメチルスルホオキサイド、又は２−メルカプトエタノールであり、 The organic solvent is methanol, ethanol, dimethyl sulfoxide, or 2-mercaptoethanol;
前記発光基質が、ｎ−セレンテラジンである The luminescent substrate is n-coelenterazine
ことを特徴とする増強方法。 An enhancement method characterized by the above.
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は (A) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド (B) a peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a luminescent activity
が有する発光活性を増強させる方法であって、 A method for enhancing the luminescence activity of
有機溶媒存在下において、発光基質と該ペプチドを反応させ、 Reacting the luminescent substrate with the peptide in the presence of an organic solvent,
前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、１−ブタノール、アセトン、ジメチルスルホオキサイド、又は２−メルカプトエタノールであり、 The organic solvent is methanol, ethanol, 1-butanol, acetone, dimethyl sulfoxide, or 2-mercaptoethanol;
前記発光基質が、ｆ−セレンテラジンである The luminescent substrate is f-coelenterazine
ことを特徴とする増強方法。 An enhancement method characterized by the above.
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