JP4952085B2 - Luminescent activity inhibition method and trace heavy metal determination method - Google Patents
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Description
本発明は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン系の発光反応における発光活性阻害方法、及びその阻害方法を用いた微量の重金属を定量する方法に関する。 The present invention relates to a method for inhibiting luminescence activity in a luciferase-luciferin luminescence reaction, and a method for quantifying trace amounts of heavy metals using the inhibition method.
発光蛋白質および発光酵素（ルシフェラーゼ）は、産業上重要な酵素として、広く利用されている。例えば、発光反応にカルシウムイオンを補欠分子として必要とするカルシウム結合型発光蛋白質は、レポーターとしてのよく知られた利用以外にも、10-7Mから10-4Mの間でカルシウムイオンの定量に利用されている（例えば、非特許文献１参照）。また、ホタルのルシフェラーゼは、その発光反応にマグネシウムイオンが必須であることから、マグネシウムイオンの検出への利用が期待されているが、これは、安定的連続発光反応にはミリモル濃度のマグネシウムイオンの存在が必要であることから、実用には至っていない。 Photoproteins and luminescent enzymes (luciferases) are widely used as industrially important enzymes. For example, calcium-binding photoproteins that require calcium ions as prosthetic molecules for luminescent reactions can be used to quantify calcium ions between 10 -7 M and 10 -4 M in addition to the well-known use as reporters. (For example, refer nonpatent literature 1). Firefly luciferase is expected to be used for the detection of magnesium ions because magnesium ions are essential for its luminescence reaction. Since it needs to exist, it has not been put to practical use.
一方、金属イオンが酵素活性を阻害したり、活性化したりすることは、広く知られている。金属イオンによる酵素活性の阻害機序は多岐にわたり、また、阻害金属イオン濃度も広い範囲で阻害が認められるが、この金属による酵素阻害作用は、金属定量などに利用されていない。また、その阻害濃度領域に関しては、マイクロモルからミリモル濃度で顕著な阻害効果を示し、ナノモル濃度の金属イオンで阻害を示す酵素は、ほとんど知られていない（例えば、非特許文献２参照）。 On the other hand, it is widely known that metal ions inhibit or activate enzyme activity. There are various mechanisms of inhibition of enzyme activity by metal ions, and inhibition is observed in a wide range of inhibitory metal ion concentrations, but this enzyme inhibitory action by metals has not been used for metal quantification and the like. In addition, regarding the inhibitory concentration region, few enzymes are known that show a remarkable inhibitory effect from micromolar to millimolar concentrations and show inhibition with nanomolar metallic ions (see Non-Patent Document 2, for example).
重金属イオンは、環境問題に関して重要であり、多くは生体へ悪影響を与える因子であることから、重金属イオンを簡易に且つ高感度に検出する方法の開発が期待されている。
そこで、本発明は、極めて微量の重金属イオンを用いてルシフェラーゼ−ルシフェリン系の発光反応における発光活性を阻害する阻害方法、及びその阻害方法を用いた微量の重金属定量方法を提供することを課題とする。
Heavy metal ions are important for environmental problems, and many are factors that adversely affect the living body. Therefore, development of a method for detecting heavy metal ions easily and with high sensitivity is expected.
Then, this invention makes it a subject to provide the inhibition method which inhibits the luminescent activity in the luminescence reaction of a luciferase-luciferin system using a very small amount of heavy metal ions, and the determination method of a trace amount of heavy metal using the inhibition method. .
本発明者らは、生物発光に関与する発光酵素（ルシフェラーゼ）について、生化学的な研究をする過程で、微量の重金属イオンが、発光活性を顕著に阻害することを見出した。具体的には、発光酵素活性を有するオプロフォーラスルシフェラーゼのサブユニットである19kDa蛋白質（以下、「19kOLase」ともいう）、又はカルシウム結合型発光蛋白質（イクオリン）とカルシウムイオンを反応させることによって得られる青色蛍光蛋白質（bFP-aq）と、イミダゾピラジンノン骨格を有するセレンテラジン又はその類縁体を反応させる際に、微量の重金属イオンを添加すると、発光活性が減少することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
The present inventors have found that a trace amount of heavy metal ions remarkably inhibits luminescence activity in the course of conducting biochemical studies on a luminescent enzyme (luciferase) involved in bioluminescence. Specifically, a blue color obtained by reacting a calcium ion with a 19 kDa protein (hereinafter also referred to as “19kOLase”) or a calcium-binding photoprotein (aequorin), which is a subunit of optophorous luciferase having a luminescent enzyme activity. When a fluorescent protein (bFP-aq) is reacted with coelenterazine having an imidazopyrazinone skeleton or its analog, addition of a trace amount of heavy metal ions has been found to reduce luminescence activity, leading to the completion of the present invention. It was.
That is, the present invention is as follows.
［1］ルシフェラーゼがルシフェリンを基質として触媒する発光反応における発光活性を阻害する方法であって、重金属イオンを含む反応系で、該発光反応を行うことを特徴とする方法。
［2］前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドを有することを特徴とする前記［1］に記載の方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
［3］前記重金属イオンが、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、又はニッケルイオンであることを特徴とする前記［2］に記載の方法。
［4］前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドを有することを特徴とする前記［1］に記載の方法。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
［5］前記重金属イオンが、銅イオンであることを特徴とする前記［4］に記載の方法。
［6］前記ルシフェリンが、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であることを特徴とする前記［1］〜［5］のいずれかに記載の方法。
［7］前記セレンテラジン類縁化合物が、下記化学式（1）又は（2）で表わされることを特徴とする前記［6］に記載の方法。
［8］前記化学式（1）又は（2）において、Ｒ1が非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基もしくはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、又はシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ2が非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、又は硫黄を含む複素環式基であり、Ｒ3は、水素原子、メチル基又は２−ヒドロキシエチル基であり、Ｘ1は、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基又はアミノ基であり、Ｙはメチレン基、エチレン基、プロピレン基又はビニレン基であることを特徴とする前記［7］に記載の方法。
［9］前記化学式（1）又は（2）において、Ｒ1がフェニル基、ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−ブロモベンジル基、ｐ−ヨードベンジル基、３,４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基又は２−メチルプロピル基であり、Ｒ2がフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロぺニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基又はチオフェン−２−イル基であることを特徴とする前記［7］又は［8］に記載の方法。
［10］被験溶液に存在する重金属イオンを検出する方法であって、重金属イオンが事実上存在しない溶液において、ルシフェラーゼがルシフェリンを基質として触媒する発光反応を行い、前記発光反応において生じる第１の発光活性の値を測定する工程と、被験溶液を用いて、前記発光反応と同じ条件で発光反応を行い、前記被験溶液における第２の発光活性の値を測定する工程と、前記重金属イオンが事実上存在しない溶液に対する第１の値と、前記被験溶液に対する第２の値を比較することにより、前記被験溶液に存在する重金属イオンの有無を判断する工程と、を含むことを特徴とする方法。
［11］被験溶液に存在する重金属イオンの濃度を定量する方法であって、所定濃度の重金属イオンの存在下で、ルシフェラーゼがルシフェリンを基質として触媒する発光反応において生じる発光活性の値を測定し、前記値と、前記重金属イオン濃度との相関関係を求める工程と、被験溶液を用いて、前記発光反応と同じ条件で発光反応を行い、前記被験溶液における発光活性の値を測定する工程と、前記相関関係より、前記被験溶液における前記値から、前記被験溶液に存在する重金属イオンの濃度を算出する工程と、を含む方法。
［12］ルシフェラーゼがルシフェリンを基質として触媒する発光反応における発光活性を阻害するための阻害剤であって、重金属イオンを含むことを特徴とする阻害剤。
［13］前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドを有することを特徴とする前記［12］に記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
［14］前記重金属イオンが、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、又はニッケルイオンであることを特徴とする前記［13］に記載の阻害剤。
［15］前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドを有することを特徴とする前記［12］に記載の阻害剤。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
［16］前記重金属イオンが、銅イオンであることを特徴とする前記［15］に記載の阻害剤。
［17］前記ルシフェリンが、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であることを特徴とする前記［12］〜［16］のいずれかに記載の阻害剤。
［18］被験溶液に存在する重金属イオンを検出するためのキットであって、ルシフェラーゼとルシフェリンを含むことを特徴とするキット。
［19］前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドを有することを特徴とする前記［18］に記載のキット。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
［20］前記重金属イオンが、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、又はニッケルイオンであることを特徴とする前記［19］に記載のキット。
［21］前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドを有することを特徴とする前記［18］に記載のキット。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
［22］前記重金属イオンが、銅イオンであることを特徴とする前記［21］に記載のキット。
［23］前記ルシフェリンが、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であることを特徴とする前記［18］〜［22］のいずれかに記載のキット。
［24］前記セレンテラジン類縁化合物が、下記化学式（1）又は（2）で表わされることを特徴とする前記［23］に記載のキット。
［25］前記化学式（1）又は（2）において、Ｒ1が非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基もしくはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、又はシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ2が非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、又は硫黄を含む複素環式基であり、Ｒ3は、水素原子、メチル基又は２−ヒドロキシエチル基であり、Ｘ1は、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基又はアミノ基であり、Ｙはメチレン基、エチレン基、プロピレン基又はビニレン基であることを特徴とする前記［24］に記載のキット。
［26］前記化学式（1）又は（2）において、Ｒ1がフェニル基、ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−ブロモベンジル基、ｐ−ヨードベンジル基、３,４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基又は２−メチルプロピル基であり、Ｒ2がフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロぺニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基又はチオフェン−２−イル基であることを特徴とする前記［24］又は［25］に記載のキット。
[1] A method for inhibiting luminescence activity in a luminescence reaction catalyzed by luciferase using luciferin as a substrate, wherein the luminescence reaction is carried out in a reaction system containing heavy metal ions.
[2] The method according to [1], wherein the luciferase has the following peptide (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and Peptide having luminescence activity [3] The method according to [2], wherein the heavy metal ion is a copper ion, a cadmium ion, a zinc ion, or a nickel ion.
[4] The method according to [1] above, wherein the luciferase has the following peptide (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and Peptide having luminescence activity [5] The method according to [4], wherein the heavy metal ion is a copper ion.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the luciferin is coelenterazine or a coelenterazine-related compound.
[7] The method according to [6], wherein the coelenterazine analogue is represented by the following chemical formula (1) or (2).
[8] In the chemical formula (1) or (2), R 1 is substituted with an unsubstituted aryl group, an unsubstituted arylalkyl group, an arylalkyl group substituted with a hydroxyl group or a halogen atom, or a cyclohexyl group. A linear or branched alkyl group, wherein R 2 is an unsubstituted aryl group, an aryl group substituted with a hydroxyl group, an unsubstituted arylalkyl group, an arylalkyl group substituted with a hydroxyl group, an unsubstituted An arylalkenyl group, an unsubstituted linear or branched alkyl group, a linear alkyl group optionally substituted by an aliphatic cyclic group, a branched alkenyl group, or a heterocyclic group containing sulfur and a, R 3 is a hydrogen atom, a methyl group or a 2-hydroxyethyl group, X 1 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a fluorine atom, a methoxy group or an amino group, Y is main The method according to [7], wherein the alkylene group, an ethylene group, a propylene group or a vinylene group.
[9] In the above chemical formula (1) or (2), R 1 is phenyl group, benzyl group, p-hydroxybenzyl group, p-fluorobenzyl group, p-chlorobenzyl group, p-bromobenzyl group, p-iodo. Benzyl group, 3,4-difluorobenzyl group, pentafluorobenzyl group, phenylethyl group, phenylpropyl group, naphthylmethyl group, cyclohexylmethyl group, methyl group, 1-methylpropyl group or 2-methylpropyl group, R 2 is a phenyl group, p-hydroxyphenyl group, benzyl group, α-hydroxybenzyl group, phenylethyl group, phenylvinyl group, cyclohexyl group, cyclohexylmethyl group, cyclohexylethyl group, methyl group, ethyl group, propyl group, 2- Methylpropyl, 2-methylpropenyl, adamantylmethyl, cycl The method according to [7] or [8] above, which is a lopentylmethyl group or a thiophen-2-yl group.
[10] A method for detecting heavy metal ions present in a test solution, wherein a luminescence reaction in which luciferase catalyzes luciferin as a substrate is performed in a solution in which heavy metal ions do not substantially exist, and the first luminescence generated in the luminescence reaction A step of measuring a value of activity, a step of performing a luminescence reaction under the same conditions as the luminescence reaction using a test solution, and measuring a second value of luminescence activity in the test solution; Determining the presence or absence of heavy metal ions present in the test solution by comparing a first value for a non-existing solution and a second value for the test solution.
[11] A method for quantifying the concentration of heavy metal ions present in a test solution, wherein in the presence of heavy metal ions at a predetermined concentration, the value of luminescence activity generated in a luminescence reaction in which luciferase catalyzes luciferin as a substrate is measured, Obtaining a correlation between the value and the heavy metal ion concentration, using a test solution, performing a luminescence reaction under the same conditions as the luminescence reaction, and measuring a value of luminescence activity in the test solution; Calculating the concentration of heavy metal ions present in the test solution from the value in the test solution based on correlation.
[12] An inhibitor for inhibiting luminescence activity in a luminescence reaction catalyzed by luciferase using luciferin as a substrate, comprising an heavy metal ion.
[13] The inhibitor according to [12], wherein the luciferase has the following peptide (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and Peptide having luminous activity [14] The inhibitor according to [13], wherein the heavy metal ion is a copper ion, a cadmium ion, a zinc ion, or a nickel ion.
[15] The inhibitor according to [12], wherein the luciferase has the following peptide (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and Peptide having luminescence activity [16] The inhibitor according to [15], wherein the heavy metal ion is a copper ion.
[17] The inhibitor according to any one of [12] to [16], wherein the luciferin is coelenterazine or a coelenterazine-related compound.
[18] A kit for detecting heavy metal ions present in a test solution, comprising luciferase and luciferin.
[19] The kit according to [18], wherein the luciferase has the following peptide (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and Peptide having luminous activity [20] The kit according to [19], wherein the heavy metal ion is a copper ion, a cadmium ion, a zinc ion, or a nickel ion.
[21] The kit according to [18], wherein the luciferase has the following peptide (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and Peptide having luminescence activity [22] The kit according to [21], wherein the heavy metal ion is a copper ion.
[23] The kit according to any one of [18] to [22], wherein the luciferin is coelenterazine or a coelenterazine-related compound.
[24] The kit according to [23], wherein the coelenterazine-related compound is represented by the following chemical formula (1) or (2).
[25] In the chemical formula (1) or (2), R 1 is substituted with an unsubstituted aryl group, an unsubstituted arylalkyl group, an arylalkyl group substituted with a hydroxyl group or a halogen atom, or a cyclohexyl group. A linear or branched alkyl group, wherein R 2 is an unsubstituted aryl group, an aryl group substituted with a hydroxyl group, an unsubstituted arylalkyl group, an arylalkyl group substituted with a hydroxyl group, an unsubstituted An arylalkenyl group, an unsubstituted linear or branched alkyl group, a linear alkyl group optionally substituted by an aliphatic cyclic group, a branched alkenyl group, or a heterocyclic group containing sulfur and a, R 3 is a hydrogen atom, a methyl group or a 2-hydroxyethyl group, X 1 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a fluorine atom, a methoxy group or an amino group, Y is main The kit according to [24], wherein the alkylene group, an ethylene group, a propylene group or a vinylene group.
[26] In the above chemical formula (1) or (2), R 1 is phenyl group, benzyl group, p-hydroxybenzyl group, p-fluorobenzyl group, p-chlorobenzyl group, p-bromobenzyl group, p-iodo. Benzyl group, 3,4-difluorobenzyl group, pentafluorobenzyl group, phenylethyl group, phenylpropyl group, naphthylmethyl group, cyclohexylmethyl group, methyl group, 1-methylpropyl group or 2-methylpropyl group, R 2 is a phenyl group, p-hydroxyphenyl group, benzyl group, α-hydroxybenzyl group, phenylethyl group, phenylvinyl group, cyclohexyl group, cyclohexylmethyl group, cyclohexylethyl group, methyl group, ethyl group, propyl group, 2- Methylpropyl group, 2-methylpropenyl group, adamantylmethyl group, The kit according to [24] or [25], wherein the Ropenchirumechiru a group or a thiophen-2-yl group.
なお、bFP-aqは、発光基質としてセレンテラジン（CTZ）を含むイクオリン（AQ）にカルシウムイオンを徐々に反応させて得られる化学発光活性を有する蛍光タンパク質複合体（bFP）をいう。bFPとbFP-aqは、同一物質を表わす。
また、「重金属イオンが事実上存在しない溶液」とは、溶液中に重金属イオンの量が極めて少なく、その量は、被検溶液中の重金属イオンの存在または量を判定するのに、事実上問題にならないレベルである、対照実験のための溶液のことをいう。
Note that bFP-aq is a fluorescent protein complex (bFP) having chemiluminescence activity obtained by gradually reacting calcium ions with aequorin (AQ) containing coelenterazine (CTZ) as a luminescent substrate. bFP and bFP-aq represent the same substance.
In addition, “a solution in which heavy metal ions are not substantially present” means that the amount of heavy metal ions in the solution is extremely small, and this amount is a problem in determining the presence or amount of heavy metal ions in the test solution. Refers to a solution for a control experiment at a level that does not become.
本発明により、極めて微量の重金属イオンを用いてルシフェラーゼ−ルシフェリン系の発光反応における発光活性を阻害する阻害方法、及びその阻害方法を用いた微量の重金属定量方法を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide an inhibition method for inhibiting luminescence activity in a luciferase-luciferin luminescence reaction using a very small amount of heavy metal ions, and a trace amount heavy metal determination method using the inhibition method.
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
Unless otherwise stated in the embodiments and examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Standard Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The method described in the protocol collection, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention and are shown for illustration or explanation, and the present invention is not limited to them. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
＝＝＝発光活性阻害方法＝＝＝
ルシフェラーゼ−ルシフェリン系の発光反応において、その発光活性を阻害するには、発光反応させるための溶液中に重金属化合物を含有させればよい。
ここで、ルシフェラーゼとは、生物発光の触媒をする酵素（発光酵素）の総称のことであり、ルシフェリンとは、ルシフェラーゼが発光する際の基質（発光基質）の総称であり、ルシフェラーゼ−ルシフェリン系の発光反応とは、ルシフェラーゼがルシフェリンを基質として触媒する発光反応のことである。この発光反応として、例えば、ヒメヒオドシエビルシフェラーゼ、ヒメヒオドシエビルシフェラーゼを構成する19kDa蛋白質（配列番号1で表されるペプチド）、ガウシアルシフェラーゼ、カルシウム結合型発光蛋白質イクオリンとカルシウムイオンを反応させることによって得られる青色蛍光蛋白質（bFP）（配列番号2で表されるペプチドをアポ蛋白質として含む）、ウミホタルルシフェラーゼ等の発光酵素と、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物等のルシフェリンによる発光反応が挙げられる。この発光反応は、市販の発光測定装置を用いて測定することができる。
=== Method of inhibiting luminescence activity ===
In order to inhibit the luminescence activity in the luciferase-luciferin luminescence reaction, a heavy metal compound may be contained in the solution for the luminescence reaction.
Here, luciferase is a general term for enzymes (luminescent enzymes) that catalyze bioluminescence, and luciferin is a general term for substrates (luminescent substrates) when luciferase emits light, and is a luciferase-luciferin system. The luminescence reaction is a luminescence reaction catalyzed by luciferase using luciferin as a substrate. As this luminescence reaction, for example, the reaction is carried out by reacting calcium ion with a 19 kDa protein (peptide represented by SEQ ID NO: 1), Gaussia luciferase, calcium-binding photoprotein aequorin that constitutes the hydrangeovir luciferase. And a luminescent reaction by a luminescent enzyme such as blue fluorescent protein (bFP) (containing the peptide represented by SEQ ID NO: 2 as an apoprotein), a sea urchin luciferase, and a luciferin such as coelenterazine or a coelenterazine-related compound. This luminescence reaction can be measured using a commercially available luminescence measuring device.
本発明において、「重金属」とは、密度が４（ｋｇ／ｄｍ３）以上の金属をいい、「重金属イオン」とは、溶液中において、重金属がイオン化した状態を示す。なお、本発明では、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、又はニッケルイオン等の重金属イオンが好ましく利用できる。本発明では、例えば、CuCl2、CdCl2、ZnCl2、Zn(OH)2、NiCl2等の重金属化合物が利用できる。これらの重金属化合物を溶液中に添加することで、重金属イオンとして存在する。なお、発光反応溶液中のpH、温度は、反応が生じる条件であれば、特に限定はないが、pHは6〜9、温度は4℃〜37℃であることが好ましい。 In the present invention, “heavy metal” refers to a metal having a density of 4 (kg / dm 3 ) or more, and “heavy metal ion” refers to a state in which heavy metal is ionized in a solution. In the present invention, heavy metal ions such as copper ions, cadmium ions, zinc ions, or nickel ions can be preferably used. In the present invention, for example, heavy metal compounds such as CuCl 2 , CdCl 2 , ZnCl 2 , Zn (OH) 2 , and NiCl 2 can be used. By adding these heavy metal compounds to the solution, they exist as heavy metal ions. The pH and temperature in the luminescent reaction solution are not particularly limited as long as the reaction occurs, but the pH is preferably 6 to 9 and the temperature is preferably 4 ° C to 37 ° C.
重金属イオンを含有させるには、前段階の反応系から持ち込んでもよく、重金属イオンを含有する発光活性阻害剤として発光反応溶液に添加してもよい。この際、阻害剤の形状は限定されず、阻害剤が発光反応溶液に添加する適量の重金属イオンを含有していればよい。 In order to contain heavy metal ions, they may be brought in from the previous reaction system or may be added to the luminescence reaction solution as a luminescence activity inhibitor containing heavy metal ions. At this time, the shape of the inhibitor is not limited as long as the inhibitor contains an appropriate amount of heavy metal ions to be added to the luminescence reaction solution.
＝＝＝重金属イオン検出方法＝＝＝
以下の実施例に記載の通り、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系の発光反応溶液中に銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン等の重金属イオンが存在すると、その発光活性が阻害される。従って、被験溶液においてルシフェリン−ルシフェラーゼ系の発光反応を行い、その発光活性を測定し、該重金属イオンが含まれない溶液の発光強度より弱ければ、溶液中の重金属イオンの存在が示唆される。
ルシフェリン−ルシフェラーゼ系の発光反応は、上記「発光活性阻害方法」に記載の発光酵素及び発光基質を用いて行うことができる。発光酵素としては、特に、ヒメヒオドシエビルシフェラーゼを構成する19kDa蛋白質（19k0Lase）、又は青色蛍光蛋白質（bFP）を使用することが好ましい。
ヒメヒオドシエビルシフェラーゼを構成する19kDa蛋白質（19k0Lase）は、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するが、このアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されていても、発光活性を有していればよい。19k0Laseは、天然由来であっても、遺伝子組換えであってもよい。遺伝子組換えの19k0Laseを作製する場合、例えば、19k0Laseを大腸菌内で発現させることによって、このペプチドを作製することができる。すなわち、19k0Laseをコードする遺伝子（以下、「KAZ遺伝子」ともいう）を単離し、この遺伝子を含む発現ベクターを構築し、この発現ベクターを大腸菌などに導入し、所定の目的に合わせて発現させることによって、19k0Laseを作製できる。なお、19k0LaseにHisタグやmycタグなどのタグ配列を付加した融合蛋白質を大腸菌内で発現させることにより、各タグに対応した吸着物を用いたアフィニティークロマト法によって、融合蛋白質を容易に精製することができるようになる。
=== Method for detecting heavy metal ions ===
As described in the following examples, when heavy metal ions such as copper ions, cadmium ions, zinc ions, nickel ions are present in the luciferin-luciferase-based luminescence reaction solution, the luminescence activity is inhibited. Therefore, the luminescence reaction of the luciferin-luciferase system is performed in the test solution, the luminescence activity is measured, and if the luminescence intensity is lower than the luminescence intensity of the solution not containing the heavy metal ions, the presence of heavy metal ions in the solution is suggested.
The luminescence reaction of the luciferin-luciferase system can be performed using the luminescent enzyme and the luminescent substrate described in the above “Method for inhibiting luminescent activity”. As the luminescent enzyme, it is particularly preferable to use a 19 kDa protein (19k0Lase) or a blue fluorescent protein (bFP) that constitutes the hyodohydose luciferase.
The 19 kDa protein (19k0Lase) that constitutes Himeodoshie luciferase has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. In this amino acid sequence, one or several amino acids are deleted, substituted, or added. As long as it has luminescence activity. 19k0Lase may be naturally derived or genetically modified. When producing 19k0Lase of gene recombination, this peptide can be produced by, for example, expressing 19k0Lase in E. coli. That is, a gene encoding 19k0Lase (hereinafter also referred to as “KAZ gene”) is isolated, an expression vector containing this gene is constructed, this expression vector is introduced into Escherichia coli and expressed in accordance with a predetermined purpose. Can produce 19k0Lase. In addition, by expressing a fusion protein in which a tag sequence such as a His tag or myc tag is added to 19k0Lase in E. coli, the fusion protein can be easily purified by affinity chromatography using an adsorbate corresponding to each tag. Will be able to.
また、青色蛍光蛋白質（bFP）は、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質、セレンテラミド又はその類縁化合物、及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価もしくは3価のイオンから構成されている蛍光蛋白質である。ここで、アポ蛋白質（アポイクオリン）は、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するが、このアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されていても、発光活性を有していればよい。また、青色蛍光蛋白質（bFP）調製のためのイクオリンは、組換え体でも良く、天然から単離されたものでもよい。天然からの単離方法は、Johnsonと Shimomuraが報告している文献（Johnson, F.H. & Shimomura, O (1978) Methods Enzymol.57: 271-328）に従って精製することができる。 Blue fluorescent protein (bFP) is a fluorescent protein composed of apoprotein of calcium-binding photoprotein, coelenteramide or its related compounds, and divalent or trivalent ions that can replace calcium ions or calcium ions. is there. Here, the apoprotein (apoaequorin) has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and in this amino acid sequence, even if one or several amino acids are deleted, substituted or added, the luminescence activity As long as it has. The aequorin for preparing the blue fluorescent protein (bFP) may be recombinant or may be isolated from nature. Isolation methods from nature can be purified according to the literature reported by Johnson and Shimomura (Johnson, F.H. & Shimomura, O (1978) Methods Enzymol. 57: 271-328).
セレンテラミド又はその類縁化合物は、下記式（3）又は式（4）で表される。
ここで、式中、Ｒ1は、例えば、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアリールアルキル基、又は脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖あるいは分枝鎖のアルキル基である。好ましくは、非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基もしくはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、又はシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基である。さらに好ましくは、フェニル基、ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−ブロモベンジル基、ｐ−ヨードベンジル基、３,４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基又は２−メチルプロピル基である。
Ｒ2は、例えば、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアリールアルキル基、置換もしくは非置換のアリールアルケニル基、又は脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖あるいは分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖もしくは分枝鎖のアルケニル基、又は複素環式基である。好ましくは、非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、又は硫黄を含む複素環式基である。さらに好ましくは、フェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロぺニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基又はチオフェン−2−イル基である。
Ｒ3は、例えば、水素原子、又は置換もしくは非置換のアルキル基である。好ましくは、水素原子、メチル基又は２−ヒドロキシエチル基である。
Ｘ1は、例えば、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基又はアミノ基であり、特に好ましくは、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基又はアミノ基である。
Ｘ2は、例えば、水素原子又は水酸基である。
Ｙは、例えば、1〜4個の炭素原子を有する2価の炭化水素基であり、好ましくは、メチレン基、エチレン基、プロピレン基又はビニレン基である。
Here, in the formula, R 1 represents, for example, a linear or branched alkyl which may be substituted with a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted arylalkyl group, or an aliphatic cyclic group. It is a group. An unsubstituted aryl group, an unsubstituted arylalkyl group, an arylalkyl group substituted with a hydroxyl group or a halogen atom, or a linear or branched alkyl group optionally substituted with a cyclohexyl group is preferred. More preferably, phenyl group, benzyl group, p-hydroxybenzyl group, p-fluorobenzyl group, p-chlorobenzyl group, p-bromobenzyl group, p-iodobenzyl group, 3,4-difluorobenzyl group, pentafluoro A benzyl group, a phenylethyl group, a phenylpropyl group, a naphthylmethyl group, a cyclohexylmethyl group, a methyl group, a 1-methylpropyl group or a 2-methylpropyl group.
R 2 represents, for example, a linear or branched group optionally substituted by a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted arylalkyl group, a substituted or unsubstituted arylalkenyl group, or an aliphatic cyclic group. A chain alkyl group, a linear or branched alkenyl group optionally substituted by an aliphatic cyclic group, or a heterocyclic group. Preferably, an unsubstituted aryl group, an aryl group substituted with a hydroxyl group, an unsubstituted arylalkyl group, an arylalkyl group substituted with a hydroxyl group, an unsubstituted arylalkenyl group, an unsubstituted linear or branched chain, They are an alkyl group, a linear alkyl group optionally substituted by an aliphatic cyclic group, a branched alkenyl group, or a heterocyclic group containing sulfur. More preferably, phenyl group, p-hydroxyphenyl group, benzyl group, α-hydroxybenzyl group, phenylethyl group, phenylvinyl group, cyclohexyl group, cyclohexylmethyl group, cyclohexylethyl group, methyl group, ethyl group, propyl group, A 2-methylpropyl group, a 2-methylpropenyl group, an adamantylmethyl group, a cyclopentylmethyl group or a thiophen-2-yl group;
R 3 is, for example, a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group. Preferably, they are a hydrogen atom, a methyl group, or a 2-hydroxyethyl group.
X 1 is, for example, a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, an alkoxyl group or an amino group, and particularly preferably a hydrogen atom, a hydroxyl group, a fluorine atom, a methoxy group or an amino group.
X 2 is, for example, a hydrogen atom or a hydroxyl group.
Y is, for example, a divalent hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and is preferably a methylene group, an ethylene group, a propylene group, or a vinylene group.
好ましくは、アポ蛋白質とセレンテラミド又はその類縁化合物との複合体中の分子数の比が1：1であり、アポ蛋白質とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価もしくは3価のイオンとの複合体中の分子数の比が1：1〜4である。より好ましくは、アポ蛋白質とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価もしくは3価のイオンとの複合体中の分子数の比が1：2〜3である。なお、青色蛍光蛋白質（bFP）は、Inouyeが報告している文献（Inouye (2004) FEBS Lett. 577:105-110）に記載されているように、イクオリンより、極めて緩やかな条件で、カルシウムイオンを反応させることによって作製することができる。また、半合成イクオリンも同様に、Inouyeらが報告している文献（Inouye and Sasaki (2006) FEBS Lett. 580:1977-1982）に記載されているように、カルシウムイオンとゆっくり反応させることにより調製できる。すなわち、イクオリンは、カルシウム結合型蛋白質の一種であり、アポ蛋白質であるアポイクオリンの内部にセレンテラジンが配位した状態で存在するのであるが、カルシウムイオンとの反応によって、イクオリンに配位したセレンテラジンが、セレンテラミドと二酸化炭素に分解されるため、それを極めて緩やかな条件で行うことによって、セレンテラミドを、イクオリン内部に配位したままにすることができる。 Preferably, the ratio of the number of molecules in the complex of the apoprotein and coelenteramide or its related compound is 1: 1, and the complex of the apoprotein and calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions The ratio of the number of molecules in the body is 1: 1 to 4. More preferably, the ratio of the number of molecules in the complex of apoprotein and calcium ions or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions is 1: 2 to 3. In addition, blue fluorescent protein (bFP) is calcium ion under extremely mild conditions than aequorin as described in the literature (Inouye (2004) FEBS Lett. 577: 105-110) reported by Inouye. Can be made by reacting. Similarly, semisynthetic aequorin is also prepared by slowly reacting with calcium ions as described in the literature reported by Inouye et al. (Inouye and Sasaki (2006) FEBS Lett. 580: 1977-1982). it can. In other words, aequorin is a kind of calcium-binding protein, and coelenterazine exists in the state of coelenterazine being coordinated inside apoaequorin, which is an apoprotein. Since it is decomposed into coelenteramide and carbon dioxide, coelenteramide can be left coordinated inside the aequorin by performing it under extremely mild conditions.
例えば、高粘度のカルシウム結合型発光蛋白質溶液に、非常に希薄なカルシウムイオン等の溶液を重層し、低温で長時間にわたって反応させればよい。この場合、反応温度は、好ましくは0℃〜30℃、より好ましくは4℃である。また反応時間は、蛋白質の濃度によっても異なるが、24時間以上であることが好ましい。この際、カルシウムイオンの濃度は小さい方が好ましい。カルシウムイオンの濃度が小さい方が好ましい。カルシウムイオンの濃度が小さければ、カルシウムイオンがカルシウム結合型発光蛋白質と接触（反応）する頻度が低くなるからである。逆に、カルシウム結合型発光蛋白質溶液の濃度は高い方が好ましい。蛋白質複合体溶液の濃度が高ければ、蛋白質複合体溶液の粘度も高くなり、カルシウムイオン溶液と蛋白質複合体溶液との混合がゆっくり進行するからである。
具体的には、10-7M（mol/l）以下の濃度のカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価もしくは3価のイオンの水溶液を、カルシウムイオン結合型発光蛋白質に対して1〜4のモル比となるように添加して、両者を反応させる。カルシウムイオン等のイオンとカルシウムイオン結合型発光蛋白質のモル比は、反応が緩やかに進められるならば、目的とする化学発光活性を有する蛍光蛋白質（bFP）における分子数の比以上（例えば、4以上）であっても構わない。本発明で必要とされる反応条件を達成するためには、反応容器のデザインの変更、溶媒の選択、半透膜の使用等のバリエーションが考えられ、本明細書に記載されたものに限定されるものではない。
ここで、発光基質は、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であることが好ましく、これらの化合物は、下記化学式（1）又は（2）で表わされる。これらの化合物は、化学合成によって作製してもよいし、市販のものでもよい。
Specifically, an aqueous solution of calcium ions having a concentration of 10 −7 M (mol / l) or less or divalent or trivalent ions that can be substituted for calcium ions is used for 1 to 4 of calcium ion-binding photoprotein. Are added so as to have a molar ratio, and both are reacted. The molar ratio of ions such as calcium ions and calcium ion-binding photoprotein is greater than the ratio of the number of molecules in the target fluorescent protein (bFP) having chemiluminescence activity (for example, 4 or more) if the reaction proceeds slowly. ). In order to achieve the reaction conditions required in the present invention, variations such as a change in the design of the reaction vessel, selection of a solvent, use of a semipermeable membrane, etc. are conceivable and are limited to those described in this specification. It is not something.
Here, the luminescent substrate is preferably coelenterazine or a coelenterazine-related compound, and these compounds are represented by the following chemical formula (1) or (2). These compounds may be produced by chemical synthesis or commercially available.
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ1、Ｘ2、及びＹは、上記の通りである。
被験溶液において重金属イオンを検出する方法は、以下の通りである。まず、事実上重金属イオンが存在しない溶液において、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系の発光反応を行い、この発光反応において生じる発光活性を測定し、得られた値を第1の値とする。次に、被験溶液を用いてこの発光反応と同じ条件で発光反応を行い、被験溶液における発光活性を測定し、第2の値とする。最後に、重金属イオンが存在しない溶液に対する第1の値と、被験溶液に対する第2の値を比較する。第2の値が、第1の値と同じ又は第1の値よりも高い場合、被験溶液に存在する重金属イオンは「無」と判断する。一方、第2の値が、第1の値よりも低い場合、被験溶液に存在する重金属イオンは「有」と判断する。
なお、「重金属イオンが存在しない溶液」の調製において、被験溶液と必ずしも組成が同じでなくても構わないが、最も好ましくは、被験溶液から、重金属イオンを除去する処理を行えばよい。例えば、この溶液を重金属吸着剤、キレート剤、イオン交換カラム等で処理したり、重金属を化学反応で不溶性の塩にして沈殿させたりすればよい。
In the formula, R 1 , R 2 , R 3 , X 1 , X 2 , and Y are as described above.
The method for detecting heavy metal ions in the test solution is as follows. First, a luciferin-luciferase-based luminescence reaction is performed in a solution that is substantially free of heavy metal ions, the luminescence activity generated in this luminescence reaction is measured, and the obtained value is defined as the first value. Next, a luminescence reaction is performed using the test solution under the same conditions as this luminescence reaction, and the luminescence activity in the test solution is measured to obtain a second value. Finally, the first value for the solution without heavy metal ions is compared with the second value for the test solution. When the second value is the same as or higher than the first value, it is determined that the heavy metal ion present in the test solution is “none”. On the other hand, when the second value is lower than the first value, it is determined that the heavy metal ion present in the test solution is “present”.
In the preparation of the “solution without heavy metal ions”, the composition may not necessarily be the same as that of the test solution, but most preferably, a treatment for removing heavy metal ions from the test solution may be performed. For example, the solution may be treated with a heavy metal adsorbent, a chelating agent, an ion exchange column or the like, or the heavy metal may be precipitated as an insoluble salt by a chemical reaction.
＝＝＝重金属イオン定量方法＝＝＝
以下の実施例に記載の通り、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系の発光反応における発光活性の阻害は、溶液中に存在する重金属イオン（例えば、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン等）の濃度に比例する。従って、所定濃度の重金属イオン存在下において、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系の発光反応において生じる発光活性の値を予め測定し、標準曲線を作成しておけば、被験溶液中の発光活性の値を測定することよって、被験溶液中の重金属イオンを定量することができる。
ここで用いられるルシフェリン−ルシフェラーゼ系の発光反応は、上記「重金属イオン検出方法」の発光反応と同様に行うことができる。その反応を用いて重金属イオンを定量するには、まず、複数の濃度の重金属イオン存在下において、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系の発光反応において生じる発光活性の値を測定し、これらの値と、重金属イオン濃度との相関関係を求める。すなわち、例えば検量線を作成することができる。次に、被験溶液を用いて、この発光反応と同じ条件で発光反応を行い、被験溶液における発光活性の値を測定する。最後に、先に求めた相関関係より、被験溶液における値から、被験溶液に存在する重金属イオンの濃度を算出する。この方法により、被験溶液中に存在する、約10nMというような微量の重金属イオンを測定することができる。
=== Method for quantifying heavy metal ions ===
As described in the following examples, the inhibition of the luminescence activity in the luminescence reaction of the luciferin-luciferase system is proportional to the concentration of heavy metal ions (for example, copper ions, cadmium ions, zinc ions, etc.) present in the solution. Therefore, in the presence of heavy metal ions at a predetermined concentration, the value of the luminescence activity generated in the luminescence reaction of the luciferin-luciferase system is measured in advance, and if the standard curve is prepared, the value of the luminescence activity in the test solution is measured. Therefore, heavy metal ions in the test solution can be quantified.
The luminescence reaction of the luciferin-luciferase system used here can be carried out in the same manner as the luminescence reaction in the above “heavy metal ion detection method”. In order to quantify heavy metal ions using the reaction, first, in the presence of multiple concentrations of heavy metal ions, the value of the luminescence activity generated in the luminescence reaction of the luciferin-luciferase system is measured, and these values and the heavy metal ion concentration Find the correlation with. That is, for example, a calibration curve can be created. Next, a luminescence reaction is performed using the test solution under the same conditions as this luminescence reaction, and the value of the luminescence activity in the test solution is measured. Finally, the concentration of heavy metal ions present in the test solution is calculated from the value in the test solution based on the previously obtained correlation. By this method, a trace amount of heavy metal ions such as about 10 nM present in the test solution can be measured.
本発明は、重金属イオンを検出するためのキットとして用いることができる。このキットには、発光酵素（19kDa蛋白質、又は青色蛍光蛋白質（bFP））と、発光基質（例えば、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物）を含んでいることが好ましい。 The present invention can be used as a kit for detecting heavy metal ions. This kit preferably contains a luminescent enzyme (19 kDa protein or blue fluorescent protein (bFP)) and a luminescent substrate (for example, coelenterazine or a coelenterazine-related compound).
以下、実施例を用いて、本発明を更に詳細に説明するが、これは例示であって、本発明をこの実施例に限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail using an Example, this is an illustration and this invention is not limited to this Example.
＝＝＝KAZ遺伝子発現ベクターの構築＝＝＝
本実施例では、以下に記載の通り、常温発現ベクター又は低温発現ベクターを用いて19kOLaseを作製した。
=== Construction of KAZ gene expression vector ===
In this example, 19 kOLase was prepared using a room temperature expression vector or a low temperature expression vector as described below.
（1）常温発現ベクターを用いたKAZ遺伝子発現ベクターの構築
大腸菌内で、大腸菌生育の至適温度である37℃で組換え蛋白質を発現させる発現ベクター系（以下、この至適温度での発現系を「常温発現系」ともいう）を用いた。
まず、19kOLaseをコードするKAZ遺伝子DNA断片を、PCR法を用いて調製し、このDNA断片を、市販のヒスチジンタグを有する常温発現ベクターpTrcHis−Bベクター（インビトロゲン社製）に挿入することによって、KAZ遺伝子発現ベクターを作製した。具体的には、pKAZ−412（Inouye，S, Watanabe, K., Nakamura, H., Shimomura, O.（2000）FEBS Lett．481：19-25.）を鋳型としてPCRプライマーペア：KAZ−3（5’ ccgGCTAGCTTTACGTTGGCAGATTTCGTTGGA 3’）（配列番号3）及びT7−BcaBEST（5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’）（配列番号4）を用いて、PCRキット（日本ジーン社製）にてPCR（サイクル条件：25サイクル；1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃）を行った。得られたDNA断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製し、制限酵素NheI/XhoIで消化した後、pTrcHis−Bの制限酵素NheI/XhoI部位に挿入することによって、発現ベクターpHis−KAZを構築した。なお、DNA シークエンサー（ABI社製）により配列を決定することにより、塩基配列の確認を行った。
(1) Construction of KAZ gene expression vector using room temperature expression vector Expression vector system that expresses recombinant protein in E. coli at 37 ° C, which is the optimal temperature for growth of E. coli (hereinafter, expression system at this optimal temperature) Is also referred to as “room temperature expression system”).
First, a KAZ gene DNA fragment encoding 19 kOLase was prepared using a PCR method, and this DNA fragment was inserted into a commercially available room temperature expression vector pTrcHis-B vector (manufactured by Invitrogen) having a histidine tag. A KAZ gene expression vector was prepared. Specifically, PCR primer pair: KAZ-3 using pKAZ-412 (Inouye, S, Watanabe, K., Nakamura, H., Shimomura, O. (2000) FEBS Lett. 481: 19-25.) As a template. (5 ′ ccgGCTAGCTTTACGTTGGCAGATTTCGTTGGA 3 ′) (SEQ ID NO: 3) and T7-BcaBEST (5 ′ TAATACGACTCACTATAGGG 3 ′) (SEQ ID NO: 4), PCR with PCR kit (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) (cycle conditions: 25 cycles; 1 minute / 94 ° C., 1 minute / 50 ° C., 1 minute / 72 ° C.). The obtained DNA fragment was purified with a PCR purification kit (Qiagen), digested with the restriction enzymes NheI / XhoI, and then inserted into the restriction enzyme NheI / XhoI site of pTrcHis-B, thereby expressing the expression vector pHis-KAZ. It was constructed. The nucleotide sequence was confirmed by determining the sequence with a DNA sequencer (manufactured by ABI).
（2）低温発現ベクターを用いたKAZ遺伝子発現ベクターの構築
低温で機能するcsp (cold shock protein)プロモーターを有する低温発現ベクターpCold II（タカラバイオ株式会社）を用いて、10〜15℃で発現誘導できるベクターを構築した（以下、「低温発現系」ともいう）。
具体的には、前述のpTrcHisB を用いたKAZ遺伝子発現ベクターpHis-KAZをテンプレートとし、N末端にNdeI（KAZ-17N/NedI：5’ gcg CATATGTTTACGTTGGCAGATTTCGTT 3’）（配列番号5）及びC末端にEcoR Iサイトを付加させるようプライマー(KAZ-12C/EcoRI: 5’ cgcGAATTCTTAGGCAAGAATGTTCTCGCAAAGCCT 3’)（配列番号6）を設計しPCR（サイクル条件：25サイクル；1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃）を行って得られたKAZ遺伝子断片を、PCR精製キット（キアゲン社製）で精製し、Nde I及びEcoR Iで消化後、pCold II（タカラバイオ株式会社）のNde I/EcoR I部位に挿入し、発現ベクターpCold-KAZを作成した。なお、DNA シークエンサー（ABI社製）により配列を決定することにより、塩基配列の確認を行った。なお、pCold-KAZがコードする蛋白質は、アミノ末端に6個のヒスチジン配列を有するため、ニッケルキレートゲルによるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
(2) Construction of KAZ gene expression vector using low-temperature expression vector Expression induction at 10-15 ° C using low-temperature expression vector pCold II (Takara Bio Inc.) having a csp (cold shock protein) promoter that functions at low temperatures A vector was constructed (hereinafter also referred to as “low-temperature expression system”).
Specifically, the KAZ gene expression vector pHis-KAZ using pTrcHisB described above was used as a template, NdeI (KAZ-17N / NedI: 5 'gcg CATATGTTTACGTTGGCAGATTTCGTT 3') (SEQ ID NO: 5) at the N-terminus and EcoR at the C-terminus. A primer (KAZ-12C / EcoRI: 5 'cgcGAATTCTTAGGCAAGAATGTTCTCGCAAAGCCT 3') (SEQ ID NO: 6) was designed to add the I site and PCR (cycle conditions: 25 cycles; 1 min / 94 ° C, 1 min / 50 ° C, 1 min) / 72 ° C), the KAZ gene fragment was purified with a PCR purification kit (Qiagen), digested with Nde I and EcoR I, and then Nde I / EcoR I of pCold II (Takara Bio Inc.) The expression vector pCold-KAZ was constructed by inserting into the site. The nucleotide sequence was confirmed by determining the sequence with a DNA sequencer (manufactured by ABI). Since the protein encoded by pCold-KAZ has 6 histidine sequences at the amino terminus, it can be purified by affinity chromatography using nickel chelate gel.
＝＝＝低温発現ベクターによる組換え19k0Laseの調製＝＝＝
（1）大腸菌において組換え19k0Laseを発現させるために、KAZ遺伝子が挿入された低温発現ベクターpCold-KAZを用いた。まず、pCold-KAZで大腸菌BL21（アマシャムバイオサイエンス社）を形質転換し、得られた形質転換体を固形培地上でシングルコロニーにして37℃で一晩培養後、アンピシリン（50μg/ml）を含有する10mlのLB液体培地（水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストイクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH7.2）に植菌し、さらに37℃で18時間培養を行った。次いで、その培養菌を新たなLB液体培地400mlに添加し、さらにクレット測定計での菌体濁度が200クレットになるまで培養し、15℃に冷却した。冷却培養液に、ラクトースオペロン誘導剤IPTGを、最終濃度が0.1mMになるように添加し、15℃で18時間培養した。培養後、菌体を遠心回収（5,000rpm×5分間、3,000×g）し、19k0Laseの抽出出発材料とした。
=== Preparation of recombinant 19k0Lase with cold expression vector ===
(1) In order to express recombinant 19k0Lase in E. coli, a low-temperature expression vector pCold-KAZ into which the KAZ gene was inserted was used. First, Escherichia coli BL21 (Amersham Biosciences) was transformed with pCold-KAZ, and the resulting transformant was converted to a single colony on a solid medium and cultured overnight at 37 ° C. and then contained ampicillin (50 μg / ml). Inoculated into 10 ml of LB liquid medium (10 g of bactotryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of sodium chloride, pH 7.2 per liter of water), and further cultured at 37 ° C. for 18 hours. Subsequently, the cultured bacteria were added to 400 ml of a new LB liquid medium, and further cultured until the turbidity of the cells measured with a Kret meter was 200 klets, and cooled to 15 ° C. The lactose operon inducer IPTG was added to the chilled culture solution so that the final concentration was 0.1 mM, and cultured at 15 ° C. for 18 hours. After culturing, the cells were collected by centrifugation (5,000 rpm × 5 minutes, 3,000 × g), and used as a starting material for 19k0Lase extraction.
（2）培養菌体からの組換え19k0Laseの抽出
本条件では、大腸菌の中で発現した19k0Lase蛋白質は封入体となるため、得られた封入体を尿素処理によって以下のように可溶化した。
まず、集菌した菌体を50mM Tris-HCl（pH7.6）100mlに懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理 (ブランソン社製、モデル 250)を3分間、3回行い、その菌体破砕液を10,000rpm (12,300×g)で20分間遠心し、不溶性沈澱物を得た。得られた不溶性沈澱物を、2M尿素を含む20mM Tris-HCl (pH7.6)20mlに懸濁し、この懸濁液を超音波で破砕処理し、10,000rpm (12,300×g)で10分間遠心した。この作業を再度繰り返し、最終的に得られた2M尿素不溶性沈澱物を、６M尿素を含む20mM Tris-HCl (pH7.6)30mlに懸濁し、Voltex及び超音波破砕処理で溶解させた。この溶液を一晩4℃におき、−20℃にて保存した。これを19k0Laseの精製出発材料とした。
(2) Extraction of recombinant 19k0Lase from cultured cells Under these conditions, the 19k0Lase protein expressed in Escherichia coli becomes an inclusion body, so the obtained inclusion body was solubilized by urea treatment as follows.
First, the collected cells are suspended in 100 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), and subjected to ultrasonic crushing treatment (Branson, model 250) three times for 3 minutes under ice-cooling. The solution was centrifuged at 10,000 rpm (12,300 × g) for 20 minutes to obtain an insoluble precipitate. The obtained insoluble precipitate was suspended in 20 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 2 M urea, and this suspension was sonicated and centrifuged at 10,000 rpm (12,300 × g) for 10 minutes. . This operation was repeated again, and the finally obtained 2M urea-insoluble precipitate was suspended in 30 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 6 M urea and dissolved by Voltex and ultrasonic crushing treatment. This solution was placed at 4 ° C. overnight and stored at −20 ° C. This was used as a starting material for 19k0Lase purification.
（3）尿素溶解画分からの組換え19k0Laseの精製
組換え蛋白質はアミノ末端に6個のヒスチジン配列を有しているので、ニッケルキレートゲルによるアフィニティークロマト法により組換え蛋白質を精製した。
まず、6M尿素溶液30mlを、6M 尿素を含む20mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したニッケルキレートカラム(アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×5 cm)に注入して19k0Lase蛋白質を吸着させた。6M 尿素を含む20mM Tris-HCl (pH7.6)でカラムを洗浄後、19k0Laseを、6M尿素を含む0.3 Mイミダゾール（和光純薬工業社製）で溶出し、溶出液を分画した。各画分の発光活性を測定し、発光活性を有する画分を集め、この50mlの発光活性画分を5Lの0.1M炭酸アンモニウム溶液（pH 8.0）に対して、一晩4℃で透析した。
透析した発光活性画分50mlに最終濃度6Mになるように尿素を溶解させ、再度ニッケルキレートカラム(アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×5 cm)に注入し、6M 尿素を含む20mM Tris-HCl (pH7.6)でカラムを洗浄後、イミダゾール濃度0〜0.3Mまで直線濃度勾配で溶出させたところ、イミダゾール濃度0.08〜0.12Mの画分15mlに発光活性が溶出した。最後に、12％SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法で、その画分が、純度は95％以上の16mgの19k0Laseを含んでいることを確認した。表１に精製収率（％）等をまとめた。
(3) Purification of recombinant 19k0Lase from urea-soluble fraction Since the recombinant protein has six histidine sequences at the amino terminus, the recombinant protein was purified by affinity chromatography using a nickel chelate gel.
First, 30 ml of 6M urea solution was injected into a nickel chelate column (Amersham Biosciences, column size: diameter 1.5 × 5 cm) equilibrated with 20 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 6M urea, and 19k0Lase protein was injected. Adsorbed. After washing the column with 20 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 6 M urea, 19 k0Lase was eluted with 0.3 M imidazole (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 6 M urea, and the eluate was fractionated. The luminescence activity of each fraction was measured, the fractions having luminescence activity were collected, and 50 ml of the luminescence activity fraction was dialyzed against 5 L of 0.1 M ammonium carbonate solution (pH 8.0) at 4 ° C. overnight.
Urea is dissolved in 50 ml of the dialyzed luminescent activity fraction to a final concentration of 6 M, and again injected into a nickel chelate column (Amersham Biosciences, column size: 1.5 × 5 cm diameter), and 20 mM Tris- containing 6 M urea. The column was washed with HCl (pH 7.6) and then eluted with a linear gradient from 0 to 0.3M imidazole concentration. As a result, luminescence activity was eluted in 15 ml fraction with 0.08 to 0.12M imidazole concentration. Finally, it was confirmed by 12% SDS-polyacrylamide electrophoresis that the fraction contained 16 mg of 19k0Lase with a purity of 95% or more. Table 1 summarizes the purification yield (%) and the like.
表１：低温発現ベクターを用いた、400mlの培養菌体からの組換え19kOLaseの精製
＝＝＝常温発現ベクターによる組換え19k0Laseの調製＝＝＝
pTricHis Bから構築したKAZ遺伝子発現ベクターpHis-KAZを、常温発現ベクターとして用いた。なお、菌体培養温度以外の条件は、低温発現ベクターpCold IIを用いたKAZ遺伝子発現精製法と同様であった。端的に言うと、常温（37℃）において、組換え19k0Laseを大腸菌で発現させ、得られた封入体を尿素処理（6M尿素）により可溶化し、ニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×5 cm）に2回流すことにより19k0Lase蛋白質を精製した。この蛋白質の収率及び純度は、上記「低温発現ベクターでの組換え19kOLaseの調製法」によって得られたものと同等であった。
=== Preparation of recombinant 19k0Lase with room temperature expression vector ===
The KAZ gene expression vector pHis-KAZ constructed from pTricHis B was used as the room temperature expression vector. The conditions other than the cell culture temperature were the same as in the KAZ gene expression purification method using the low-temperature expression vector pCold II. In short, recombinant 19k0Lase is expressed in Escherichia coli at room temperature (37 ° C), and the resulting inclusion bodies are solubilized by urea treatment (6M urea), and a nickel chelate column (Amersham Biosciences, column size: The 19k0Lase protein was purified by flowing twice through a 1.5 × 5 cm diameter). The yield and purity of this protein were equivalent to those obtained by the above-mentioned “Preparation of recombinant 19kOLase with low-temperature expression vector”.
＝＝＝エビ由来の天然発光酵素及び19k0Laseの基質特異性＝＝＝
上記のように調整したエビ由来の天然発光酵素（エビルシフェラーゼ）及び19k0Laseを用い、発光反応を測定し、各酵素の基質特異性を調べた。
すなわち、10mM EDTA−30mM Tris-HCl (pH 7.6)溶液（200μl）を反応測定用溶液とし、エビルシフェラーゼ又は精製19k0Lase（1μg）及び市販のセレンテラジン（チッソ株式会社）又はその類縁体化合物（h-セレンテラジン（チッソ株式会社）、hcp-セレンテラジン（和光純薬工業社製）、f-セレンテラジン（和光純薬工業社製）、n-セレンテラジン（和光純薬工業社製）、Bis-セレンテラジン（チッソ株式会社）、e-セレンテラジン（和光純薬工業社製））を1μg加えて撹拌し、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200 (アトー社製)で60秒間発光活性の測定を行い、最大発光強度(Imax)で表記した。得られた結果を表２に示す。なお、ここで用いたセレンテラジン又はその誘導体の構造は、図１に示す通りである。
=== Substrate specificity of shrimp-derived natural luminescent enzyme and 19k0Lase ===
Using the shrimp-derived natural luminescent enzyme (evil luciferase) and 19k0Lase prepared as described above, the luminescence reaction was measured, and the substrate specificity of each enzyme was examined.
That is, a 10 mM EDTA-30 mM Tris-HCl (pH 7.6) solution (200 μl) was used as a solution for reaction measurement, and Evil luciferase or purified 19 k0Lase (1 μg) and a commercially available coelenterazine (Chisso Corporation) or its analog compound (h-coelenterazine) (Chisso Corporation), hcp-coelenterazine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), f-coelenterazine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), n-coelenterazine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), Bis-coelenterazine (Chisso Corporation) , E-Coelenterazine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1μg was added and stirred. Luminescencer-PSN AB2200 (Ato Co., Ltd.) was used to measure luminescence activity for 60 seconds and expressed as the maximum luminescence intensity (Imax). did. The obtained results are shown in Table 2. The structure of coelenterazine or a derivative thereof used here is as shown in FIG.
表２：組換え19kOLase及びエビルシフェラーゼの基質特異性の比較
このように、組換え19kOLaseは、エビルシフェラーゼと同様に、幅広い基質特異性を示した。特にBis-セレンテラジン及びe-セレンテラジンを用いた時、これらの酵素は、セレンテラジンを用いた時と同等の活性を示し、Bis-セレンテラジン及びe-セレンテラジンが、これらの酵素にとって好ましい基質類縁体であることがわかった。 Thus, the recombinant 19kOLase showed a wide range of substrate specificities similar to Evil luciferase. In particular, when using Bis-coelenterazine and e-coelenterazine, these enzymes show the same activity as when using coelenterazine, and Bis-coelenterazine and e-coelenterazine are preferred substrate analogues for these enzymes. I understood.
＝＝＝エビルシフェラーゼ及び組換え19k0Laseの酵素反応速度定数＝＝＝
上記のように調整したエビルシフェラーゼ及び組換え19ｋ0Laseを用い、セレンテラジン及びBis-セレンテジンを基質として測定した発光反応開始後5秒での発光値に基づき、ラインナ−ウエーバーバーグプロット法によって酵素反応速度定数（Km、Vmax）を決定した。結果を表３に示す。
=== Enzyme reaction rate constant of Evil luciferase and recombinant 19k0Lase ===
Using the Evil luciferase and recombinant 19k0Lase prepared as described above, based on the luminescence value measured at 5 seconds after the start of the luminescence reaction measured using coelenterazine and Bis-coelenterazine as a substrate, the enzyme reaction rate constant ( K m , V max ). The results are shown in Table 3.
表３：組換え19kOLase及びエビルシフェラーゼの反応速度定数の比較
Vmax：最大速度
Table 3: Comparison of reaction rate constants of recombinant 19kOLase and Evil luciferase
V max : Maximum speed
セレンテラジン及びBis-セレンテラジンを基質とする場合、エビルシフェラーゼと組換え19k0LaseのKm値の比は、それぞれ1/26.6、1/32.5である。一方、組換え19k0LaseとエビルシフェラーゼのVmaxは、セレンテラジンを基質とした場合、組換え19k0Laseはエビルシフェラーゼの約20％の活性であり、Bis-セレンテラジンを基質とした場合、組換え19k0Laseはエビルシフェラーゼと同等の活性であった。 If coelenterazine and Bis- coelenterazine as a substrate, the ratio of K m value of shrimp luciferase and recombinant 19k0Lase are each 1 / 26.6,1 / 32.5. On the other hand, the V max of recombinant 19k0Lase and Evil luciferase is about 20% of the activity of Evil luciferase when coelenterazine is used as a substrate, and recombinant 19k0Lase is Evil luciferase when Bis-coelenterazine is used as a substrate. The activity was equivalent.
＝＝＝青色蛍光蛋白質（bFP）の調製法＝＝＝
青色蛍光蛋白質（bFP）調製法は、本発明者らの報告（FEBS Lett. 577:105-110.）に従って調製した。具体的な調製方法は、以下の通りである。
=== Preparation Method of Blue Fluorescent Protein (bFP) ===
The blue fluorescent protein (bFP) preparation method was prepared according to the report of the present inventors (FEBS Lett. 577: 105-110.). A specific preparation method is as follows.
（1）組換えアポイクオリンの大腸菌での発現
まず、大腸菌において組換えアポイクオリンを発現させるために、ベクターとして、アポイクオリン遺伝子を有するpAQ440(特開昭61-135586号公開公報参照)から構築した、アポイクオリン遺伝子発現ベクターpiP-HE(特開平1-132397号公開公報参照)を用いた。宿主として大腸菌WA802株を使用し、常法によりpiP-HEでこの菌株を形質転換した。得られた形質転換株を30℃で一晩培養後、アンピシリン（50μg/ml）を含有する50mlのLB液体培地（水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストイクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH7.2）に植菌し、さらに30℃で8時間培養した。次いで、その培養物を新たなLB液体培地に2リットル添加し、37℃で一昼夜（18時間）培養した。培養後、菌体と培養液を低速度遠心分離（5000×g）によって分離した。菌体及び培養液はともに発現した組換えアポイクオリンを含むため、それぞれ保存し、イクオリンの精製出発材料とした。
(1) Expression of recombinant apoaequorin in Escherichia coli First, in order to express recombinant apoaequorin in E. coli, a vector was constructed from pAQ440 (see JP-A-61-135586) having the apoaequorin gene. The apoaequorin gene expression vector piP-HE (see JP-A-1-32397) was used. Escherichia coli WA802 strain was used as a host, and this strain was transformed with piP-HE by a conventional method. The obtained transformant was cultured overnight at 30 ° C., and then 50 ml of LB liquid medium containing ampicillin (50 μg / ml) (10 g of bactotryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of sodium chloride, pH 7 per liter of water) .2) was inoculated and further cultured at 30 ° C. for 8 hours. Then, 2 liters of the culture was added to a fresh LB liquid medium, and cultured at 37 ° C. overnight (18 hours). After culturing, the cells and the culture solution were separated by low speed centrifugation (5000 × g). Since both the bacterial cells and the culture solution contain the expressed recombinant apoaequorin, each was stored and used as a starting material for purification of aequorin.
（2）培養菌体からのイクオリン（AQ）の精製
集菌した菌体を、還元剤であるジチオスレイトール（DTT、和光純薬社製）200mgを含む400mlの50mM Tris-HCl、10mM EDTA、pH7.6の緩衝液中に懸濁し、氷冷下において超音波破砕装置で2分間処理して菌体を破砕し、12000×gで20分間遠心後、上澄み液を回収した。化学合成したセレンテラジンを少量のメタノールに溶解し、得られた上澄み液に産生アポイクオリンの1.2倍のモル濃度になるように添加し、4℃で5時間以上放置した。この上澄み液を直に、20mM Tris-HCl、10mM EDTA、pH7.6の緩衝液で平衡化したQ-セファロースカラム（ファルマシア製、直径2cm×10cm）に添加してイクオリンを吸着させ、カラムから流出する洗浄液の280nmでの吸光度が0.05以下になるまで20mM Tris-HCl、10mM EDTA、0.1M NaCl、pH7.6でカラムを洗浄した。そして、カラムに吸着したアポイクオリンとイクオリン画分を0.1M NaCl〜0.4M NaClの直線濃度勾配で溶出させた。
セレンテラジンと複合体を形成したイクオリンと複合体を形成しなかったアポイクオリンの分離は、疎水性クロマトグラフィーであるブチルセファロース4ファーストフローゲルを用いて行った。すなわち、Q-セファロースカラムからのオレンジ色の溶出液を、硫酸アンモニウムの最終濃度が2Mになるように調整し、次いで、不溶画分を遠心分離によって除去し、その上澄み液を、2M-硫酸アンモニウムを含有する20mM Tris-HCl、10mM EDTA、pH7.6で平衡したブチルセファロース4ファーストフローカラム（ファルマシア社、カラムサイズ：直径2cm×8cm）に通し、硫酸アンモニウム濃度1Mまで直線濃度勾配により溶出し、化学発光活性を有するオレンジ色のイクオリン画分を回収した。一方、アポイクオリンは、20mM Tris-HCl、10mM EDTA、pH7.6でのみ溶出した。
イクオリン画分について、還元状態で12％ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEによる分析を行った。その結果、精製画分について分子量25kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では98％以上であった。菌体からのイクオリンの回収率は約80％で、このようにして80mgの高純度のイクオリン（AQ）を得た。
(2) Purification of aequorin (AQ) from cultured cells 400 ml of 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA containing 200 mg of reducing agent dithiothreitol (DTT, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) The suspension was suspended in a pH 7.6 buffer, treated with an ultrasonic crusher for 2 minutes under ice-cooling to disrupt the cells, and centrifuged at 12000 × g for 20 minutes, and the supernatant was collected. The chemically synthesized coelenterazine was dissolved in a small amount of methanol, added to the obtained supernatant so as to have a molar concentration 1.2 times that of the produced apoaequorin, and left at 4 ° C. for 5 hours or more. This supernatant is added directly to a Q-Sepharose column (Pharmacia, 2 cm x 10 cm diameter) equilibrated with 20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.6 buffer to adsorb the aequorin and flow out of the column. The column was washed with 20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0.1 M NaCl, pH 7.6 until the absorbance at 280 nm of the washing solution was 0.05 or less. Then, the apoaequorin adsorbed on the column and the aequorin fraction were eluted with a linear concentration gradient of 0.1 M NaCl to 0.4 M NaCl.
Separation of aequorin that did not form a complex with aequorin that formed a complex with coelenterazine was performed using butyl sepharose 4 first flow gel, which is hydrophobic chromatography. That is, the orange eluate from the Q-Sepharose column was adjusted to a final ammonium sulfate concentration of 2M, then the insoluble fraction was removed by centrifugation and the supernatant containing 2M-ammonium sulfate. Through a butyl sepharose 4 fast flow column (Pharmacia, column size: 2cm x 8cm diameter) equilibrated with 20mM Tris-HCl, 10mM EDTA, pH7.6, eluting with a linear concentration gradient to ammonium sulfate concentration 1M, chemiluminescence activity The orange aequorin fraction with On the other hand, apoaequorin was eluted only with 20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.6.
The aequorin fraction was analyzed by SDS-PAGE using a 12% polyacrylamide gel in the reduced state. As a result, a single band corresponding to a protein with a molecular weight of 25 kDa was detected in the purified fraction, and the purity was 98% or more as measured with a densitometer. The recovery rate of aequorin from the cells was about 80%, and thus 80 mg of highly pure aequorin (AQ) was obtained.
（3）培養液からのイクオリン（AQ）の精製
培養液からアポイクオリンを精製する方法は、特開平1-132397号公報の記載に基づいて実施した。すなわち、0.1M酢酸水溶液を用いて培養液を酸性化に処理し、pH5以下にして、4℃60分間以上放置した。白色沈殿となったアポイクオリンを遠心分離によって単離し、これを還元剤を含む上述の緩衝液に溶解させた。そして、菌体からのイクオリンの精製工程と同様に、イクオリンを形成した後、Q-セファロースカラムクロマト法、ブチルセダロース4ファーストカラムクロマト法を用いて、純度98％以上のイクオリンを得た。
得られた精製イクオリンについて、還元状態で12％ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEによる分析を行った。その結果、精製画分について分子量25kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では98％以上であった。菌体からのイクオリンの回収率は約90％で、このようにして45mgの高純度のイクオリン（AQ）を得た。
(3) Purification of Aequorin (AQ) from Culture Solution The method for purifying apoaequorin from the culture solution was performed based on the description in JP-A-1-32397. That is, the culture solution was treated with 0.1M acetic acid aqueous solution to acidification, adjusted to pH 5 or less, and left at 4 ° C. for 60 minutes or more. Apoaequorin that became a white precipitate was isolated by centrifugation and dissolved in the above-mentioned buffer containing a reducing agent. Then, after the formation of aequorin as in the step of purifying aequorin from the bacterial cells, aequorin having a purity of 98% or more was obtained using Q-Sepharose column chromatography and butylsedarose 4 first column chromatography.
The purified aequorin obtained was analyzed by SDS-PAGE using a 12% polyacrylamide gel in the reduced state. As a result, a single band corresponding to a protein with a molecular weight of 25 kDa was detected in the purified fraction, and the purity was 98% or more as measured with a densitometer. The recovery rate of aequorin from the cells was about 90%, and thus 45 mg of high purity aequorin (AQ) was obtained.
（4）イクオリン（AQ）の濃縮
10mM Tris-HCl(pH7.6)、2mM EDTA、1.2M硫酸アンモニウムを含む緩衝液で、イクオリン濃度が8mg/mlのイクオリン溶液を調製した。
このイクオリン溶液1mlを、高速限外濾過フィルターである分画分子量10,000のポリエーテルスルホン膜を有するビバスパン2カラム（ザルトリウス社製）を用いて、冷却高速遠心機（日立社製：CR20B2型）にて、4℃で、5000×g、60分間以上遠心を行い、全量を0.1ml以下に濃縮した。さらに、濃縮溶液のEDTA濃度を、0.1μM以下に下げるために、1mlの0.1μM EDTAを含む10mM Tris-HClをビバスピン2カラムに加え、再度同一条件で遠心を行い、全量を濃縮した。このステップを最低2回繰り返し、濃縮溶液中のEDTAの濃度を0.1μM以下に抑えた。このイクオリン濃縮液は、黄赤色を呈し、肉眼で容易に確認できた。
(4) Concentration of aequorin (AQ)
An aequorin solution having an aequorin concentration of 8 mg / ml was prepared using a buffer containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 2 mM EDTA, and 1.2 M ammonium sulfate.
1 ml of this aequorin solution was cooled with a high-speed ultracentrifuge (Hitachi: CR20B2) using a Vivaspan 2 column (manufactured by Sartorius) having a polyethersulfone membrane with a molecular weight cut off of 10,000, which is a high-speed ultrafiltration filter. At 4 ° C., centrifugation was performed at 5000 × g for 60 minutes or more, and the total amount was concentrated to 0.1 ml or less. Further, in order to reduce the EDTA concentration of the concentrated solution to 0.1 μM or less, 10 mM Tris-HCl containing 1 ml of 0.1 μM EDTA was added to the Vivaspin 2 column, and centrifuged again under the same conditions to concentrate the whole amount. This step was repeated at least twice to keep the concentration of EDTA in the concentrated solution below 0.1 μM. This aequorin concentrate was yellowish red and could be easily confirmed with the naked eye.
（5）bFP-aqの調製
ビバスピン2カラム内で上記の方法によって作製した濃縮イクオリン溶液に、0.9mlの5mM塩化カルシウム（和光純薬社製）、2mMジチオスレイトール（和光純薬社製）を含む50mM Tris-HCl（pH7.6）を重層し、連続発光を開始し、4℃で24時間以上放置した。発光反応の終了は、イクオリン溶液の黄赤色の消失によっても確認できた。さらに、ビバスピン2カラム内へ2mlの5mM塩化カルシウム（和光純薬社製）、2mMジチオスレイトール（和光純薬社製）を含む50mM Tris-HCl（pH7.6）を加え、上記と同一条件で遠心を行い、洗浄した。生成したbFP-aqは、長波長のUVランプ（極大波長＝366nm）の下で、青色の蛍光を放射することを確認した。
(5) Preparation of bFP-aq 0.9 ml of 5 mM calcium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 2 mM dithiothreitol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added to the concentrated aequorin solution prepared by the above method in the bivaspin 2 column. Containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), continuous emission was started, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours or more. The completion of the luminescence reaction could also be confirmed by the disappearance of the yellow-red color of the aequorin solution. Furthermore, add 2 ml of 5 mM calcium chloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 2 mM dithiothreitol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) into the Vivaspin 2 column. Centrifugation was performed and washing was performed. The produced bFP-aq was confirmed to emit blue fluorescence under a long wavelength UV lamp (maximum wavelength = 366 nm).
＝＝＝ルシフェラーゼ−ルシフェリン系の発光反応における、銅イオン添加による発光活性の阻害効果＝＝＝
ルシフェラーゼ−ルシフェリン系の様々な発光反応において重金属イオンによる発光活性の阻害効果を調べるために、重金属イオンである銅イオンを用いて、以下の実験を行った。
まず、１mMの銅イオンの存在下において、200μlの100mMリン酸緩衝液（pH7.5）及び発光基質（1μg）を含む反応液に、それぞれ天然精製オプロフォーラスルシフェラーゼ（以下、「エビルシフェラーゼ」ともいう）、組換えオプロフォーラスルシフェラーゼの19kDa サブユニット（以下、「19k0Lase」ともいう）、組換えレニラルシフェラーゼ、組換えガウシアルシフェラーゼ、青色蛍光蛋白（BFP-aq）、天然ウミホタルルシフェラーゼを加えた。そして、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200 (アトー社製)を用いて、60秒間、発光活性の測定を行った。その結果を表4に示す。なお、相対発光活性（％）とは、コントロール（銅イオンがない場合の発光活性を100％とする）と被験溶液の最大発光強度(Imax)を比較した値である。
=== Inhibitory Effect of Luminescent Activity by Addition of Copper Ion in Luciferase-Luciferin Luminescent Reaction ===
In order to investigate the inhibitory effect of luminescence activity by heavy metal ions in various luminescence reactions of the luciferase-luciferin system, the following experiment was performed using copper ions, which are heavy metal ions.
First, in the presence of 1 mM copper ion, a reaction solution containing 200 μl of 100 mM phosphate buffer (pH 7.5) and a luminescent substrate (1 μg) is also referred to as a natural purified oprophorous luciferase (hereinafter referred to as “Evil luciferase”). ), 19 kDa subunit of recombinant oprophorous luciferase (hereinafter also referred to as “19k0Lase”), recombinant Renilla luciferase, recombinant Gaussia luciferase, blue fluorescent protein (BFP-aq), and natural Cypridina luciferase. Then, the luminescence activity was measured for 60 seconds using a luminescence measuring device Luminescencer-PSN AB2200 (manufactured by ATTO). The results are shown in Table 4. The relative luminescence activity (%) is a value obtained by comparing the maximum luminescence intensity (Imax) of the test solution with the control (the luminescence activity in the absence of copper ions is 100%).
表４：各種ルシフェラーゼを用いた発光反応における、１mM銅イオンの添加による発光活性の阻害効果
その結果、１mMの銅イオンを添加すれば、ほとんどのルシフェラーゼに対し、発光反応の阻害が顕著に認められた。特に、19k0Lase及び青色蛍光蛋白において、発光反応の阻害が強く認められた。 As a result, when 1 mM copper ion was added, the inhibition of the luminescence reaction was remarkably observed for most luciferases. In particular, 19k0Lase and blue fluorescent protein showed strong inhibition of the luminescence reaction.
＝＝＝19k0Laseを用いた発光反応における、各種重金属イオン添加による発光活性の阻害効果＝＝＝
各種重金属イオンが発光反応をどの程度阻害するかを調べるために、以下の実験を行った。
まず、１mMの各種金属イオン及び発光基質（セレンテラジン、1μg）を含む200μlの100 mMリン酸緩衝液（pH7.5）に、19k0Lase（0.5μg）を添加し、発光反応を開始した。その後、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200 (アトー社製)でを用いて、60秒間発光活性を測定した。その結果を表5に示す。なお、相対発光活性（％）は、コントロール（金属イオンがない場合の発光活性を100％とする）と被験溶液の最大発光強度(Imax)を比較した値である。
=== Inhibition effect of luminescence activity by adding various heavy metal ions in luminescence reaction using 19k0Lase ===
In order to investigate how much various heavy metal ions inhibit the luminescence reaction, the following experiment was conducted.
First, 19 k0Lase (0.5 μg) was added to 200 μl of 100 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 mM of various metal ions and a luminescent substrate (coelenterazine, 1 μg) to initiate a luminescence reaction. Thereafter, the luminescence activity was measured for 60 seconds using a luminescence measuring apparatus Luminescencer-PSN AB2200 (manufactured by ATTO). The results are shown in Table 5. The relative luminescence activity (%) is a value obtained by comparing the maximum luminescence intensity (Imax) of the test solution with the control (the luminescence activity in the absence of metal ions is 100%).
表５：19k0Laseを用いた発光反応における、１mMの各種金属イオン添加による発光活性の阻害効果
その結果、CdCl2、ZnCl2、CuCl2、NiCl2の重金属塩において、発光活性の阻害が強く認められた。NaClにおいて阻害活性が認められないことから、Cl-イオンが阻害活性を担っていると考えられず、カドミウムイオン、亜鉛イオン、銅イオン、ニッケルイオン等の重金属イオンが阻害活性を担っていると考えられた。
以上より、ルシフェラーゼ−ルシフェリン系の発光反応において、カドミウムイオン、亜鉛イオン、銅イオン、ニッケルイオン等の重金属イオンを添加すれば、発光活性を阻害することができた。
As a result, in the heavy metal salts of CdCl 2 , ZnCl 2 , CuCl 2 , and NiCl 2 , inhibition of luminescence activity was strongly observed. Since no inhibitory activity is observed in NaCl, Cl − ions are not considered to have inhibitory activity, and heavy metal ions such as cadmium ion, zinc ion, copper ion, nickel ion are considered to have inhibitory activity. It was.
From the above, in the luciferase-luciferin-based luminescence reaction, the addition of heavy metal ions such as cadmium ions, zinc ions, copper ions, nickel ions could inhibit the luminescence activity.
＝＝＝19k0Laseを用いた発光反応における、各濃度の重金属イオン添加による発光活性の阻害効果＝＝＝
以上より、発光活性を阻害する重金属イオンが判明したので、これらの重金属イオンの濃度と阻害効果の関係を調べるために、以下の実験を行った。
まず、塩化銅、塩化カドミウム、塩化亜鉛を用いて0.001μM〜1000μMの銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオンを含む200μl の100mMリン酸緩衝液（pH7.5）を作製し、1μgの19k0Laseを溶解した。次に、この溶液に発光基質（セレンテラジン、1μg）を加え、発光反応を開始した。発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200 (アトー社製)を用いて、60秒間発光活性を測定した。その結果を図2に示す。なお、相対発光活性（％）は、コントロール（重金属イオンがない場合の発光活性を100％とする）と被験溶液の最大発光強度(Imax)を比較した値である。
その結果、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオンにおいて、濃度依存的に発光反応の阻害が認められた。また、発光反応を50％阻害する重金属イオンは、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオンであり、それぞれの重金属イオンの濃度は、50nM、5μM、2μMであった。
=== Inhibition effect of luminescence activity by addition of heavy metal ions at various concentrations in luminescence reaction using 19 k0Lase ===
From the above, heavy metal ions that inhibit luminescence activity have been found. In order to investigate the relationship between the concentration of these heavy metal ions and the inhibitory effect, the following experiment was conducted.
First, 200 μl of 100 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.001 μM to 1000 μM copper ion, cadmium ion, and zinc ion was prepared using copper chloride, cadmium chloride, and zinc chloride, and 1 μg of 19 k0Lase was dissolved. . Next, a luminescent substrate (coelenterazine, 1 μg) was added to this solution to start a luminescent reaction. Luminescence activity was measured for 60 seconds using a luminescence measuring device Luminescencer-PSN AB2200 (manufactured by ATTO). The result is shown in FIG. The relative luminescence activity (%) is a value obtained by comparing the maximum luminescence intensity (Imax) of the test solution with the control (the luminescence activity in the absence of heavy metal ions is 100%).
As a result, in the copper ion, cadmium ion, and zinc ion, inhibition of the luminescence reaction was recognized in a concentration-dependent manner. Heavy metal ions that inhibit the luminescence reaction by 50% were copper ions, cadmium ions, and zinc ions, and the concentrations of the heavy metal ions were 50 nM, 5 μM, and 2 μM, respectively.
以上より、ルシフェラーゼ−ルシフェリン系の発光反応において、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオンを添加すれば、発光活性を阻害することができることが判明した。さらに、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオンにおいては、ナノモルのレベルのイオン濃度で、発光活性を阻害できることが判明した。 From the above, it has been found that in the luciferase-luciferin-based luminescence reaction, the luminescence activity can be inhibited by adding copper ions, cadmium ions, and zinc ions. Furthermore, it has been found that copper ions, cadmium ions, and zinc ions can inhibit luminescence activity at nanomolar ion concentrations.
＝＝＝青色蛍光蛋白質（bFP）を用いた発光反応における、各濃度の銅イオン添加による発光活性の阻害＝＝＝
次に、発光酵素を青色蛍光蛋白質（bFP）にした場合、銅イオンを添加することによって、どのように発光反応が変化するかを調べるために、以下の実験を行った。
まず、0.001μM〜1000μMの銅イオンを含む200μlの100 mMリン酸緩衝液（pH7.5）に、1μgの青色蛍光蛋白質（bFP）を溶解した。次に、この溶液に発光基質（セレンテラジン、1μg）を加え、発光反応を開始した。発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200 (アトー社製)を用いて、60秒間発光活性を測定した。相対発光活性（％）は、コントロール（銅イオンがない場合の発光活性を100％とする）と被験溶液の最大発光強度(Imax)を比較した値である。その結果を図3に示す。
青色蛍光蛋白質（bFP）は、19k0Laseと同様に、銅イオンの添加によって、濃度依存的に発光反応が阻害された。また、発光反応を50％阻害する銅イオンの濃度は、200nMであった。
=== Inhibition of Luminescent Activity by Addition of Copper Ion at Various Concentrations in Luminescent Reaction Using Blue Fluorescent Protein (bFP) ===
Next, in order to investigate how the luminescence reaction changes by adding copper ions when the luminescent enzyme is blue fluorescent protein (bFP), the following experiment was conducted.
First, 1 μg of blue fluorescent protein (bFP) was dissolved in 200 μl of 100 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.001 μM to 1000 μM copper ions. Next, a luminescent substrate (coelenterazine, 1 μg) was added to this solution to start a luminescent reaction. Luminescence activity was measured for 60 seconds using a luminescence measuring device Luminescencer-PSN AB2200 (manufactured by ATTO). The relative luminescence activity (%) is a value obtained by comparing the maximum luminescence intensity (Imax) of the test solution with the control (the luminescence activity in the absence of copper ions is 100%). The results are shown in FIG.
As with 19k0Lase, the blue fluorescent protein (bFP) was inhibited in a concentration-dependent manner by the addition of copper ions. The concentration of copper ions that inhibits the luminescence reaction by 50% was 200 nM.
以上より、ルシフェラーゼ−ルシフェリン系の発光反応において、銅イオンを添加すれば、発光活性を阻害することができること、さらに、その阻害効果はナノモルのレベルの銅イオン濃度で観察されることが判明した。また、その阻害効果は、重金属イオンの濃度依存的に増減することが示された。 From the above, it has been found that in the luciferase-luciferin-based luminescence reaction, if copper ions are added, the luminescence activity can be inhibited, and further, the inhibition effect is observed at a nanomolar level of copper ion concentration. Moreover, it was shown that the inhibitory effect increases / decreases depending on the concentration of heavy metal ions.
Claims (15)
前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
を有し、
前記ルシフェリンが、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であり、
前記重金属イオンが、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、又はニッケルイオンである
ことを特徴とする方法。 A method of inhibiting luminescence activity in a luminescence reaction catalyzed by luciferase using luciferin as a substrate, wherein the luminescence reaction is performed in a reaction system containing heavy metal ions,
The luciferase is a peptide of the following (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added And having a luminescent activity peptide,
The luciferin, Ri coelenterazine or coelenterazine analog compounds der,
Wherein said heavy metal ions, copper ions, cadmium ions, and wherein the zinc ion, or Ru nickel ions der.
前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
を有するアポ蛋白質とセレンテラミドとカルシウムイオンから構成されている青色蛍光蛋白質（ｂＦＰ）であり、
前記ルシフェリンが、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であり、
前記重金属イオンが、銅イオンである
ことを特徴とする方法。 A method of inhibiting luminescence activity in a luminescence reaction catalyzed by luciferase using luciferin as a substrate, wherein the luminescence reaction is performed in a reaction system containing heavy metal ions,
The luciferase is a peptide of the following (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added And a blue fluorescent protein (bFP) composed of an apoprotein having a peptide having luminescence activity, coelenteramide, and calcium ions,
The luciferin, Ri coelenterazine or coelenterazine analog compounds der,
Wherein said heavy metal ion, wherein the Ru copper ions der.
重金属イオンが存在しない溶液において、ルシフェラーゼがルシフェリンを基質として触媒する発光反応を行い、前記発光反応において生じる第１の発光活性の値を測定する工程と、
被験溶液を用いて、前記発光反応と同じ条件で発光反応を行い、前記被験溶液における第２の発光活性の値を測定する工程と、
前記重金属イオンが存在しない溶液に対する第１の値と、前記被験溶液に対する第２の値を比較することにより、第2の値が、第1の値と同じ又は第1の値よりも高い場合、被験溶液に存在する重金属イオンは無いと判断し、第2の値が、第1の値よりも低い場合、被験溶液に存在する重金属イオンは有ると判断する工程と、
を含み、
前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
を有し、
前記ルシフェリンが、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であり、
前記重金属イオンが、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、又はニッケルイオンである
ことを特徴とする方法。 A method for detecting heavy metal ions present in a test solution,
Performing a luminescence reaction in which luciferase catalyzes luciferin as a substrate in a solution free from heavy metal ions, and measuring a first luminescence activity value generated in the luminescence reaction;
Performing a luminescence reaction under the same conditions as the luminescence reaction using a test solution, and measuring a second luminescence activity value in the test solution;
If the second value is the same as or higher than the first value by comparing the first value for the solution without the heavy metal ion and the second value for the test solution, Determining that there is no heavy metal ion present in the test solution, and determining that there is heavy metal ion present in the test solution if the second value is lower than the first value;
Including
The luciferase is a peptide of the following (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added And having a luminescent activity peptide,
The luciferin, Ri coelenterazine or coelenterazine analog compounds der,
Wherein said heavy metal ions, copper ions, cadmium ions, and wherein the zinc ion, or Ru nickel ions der.
重金属イオンが存在しない溶液において、ルシフェラーゼがルシフェリンを基質として触媒する発光反応を行い、前記発光反応において生じる第１の発光活性の値を測定する工程と、
被験溶液を用いて、前記発光反応と同じ条件で発光反応を行い、前記被験溶液における第２の発光活性の値を測定する工程と、
前記重金属イオンが存在しない溶液に対する第１の値と、前記被験溶液に対する第２の値を比較することにより、第2の値が、第1の値と同じ又は第1の値よりも高い場合、被験溶液に存在する重金属イオンは無いと判断し、第2の値が、第1の値よりも低い場合、被験溶液に存在する重金属イオンは有ると判断する工程と、
を含み、
前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
を有するアポ蛋白質とセレンテラミドとカルシウムイオンから構成されている青色蛍光蛋白質（ｂＦＰ）であり、
前記ルシフェリンが、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であり、
前記重金属イオンが、銅イオンである
ことを特徴とする方法。 A method for detecting heavy metal ions present in a test solution,
Performing a luminescence reaction in which luciferase catalyzes luciferin as a substrate in a solution free from heavy metal ions, and measuring a first luminescence activity value generated in the luminescence reaction;
Performing a luminescence reaction under the same conditions as the luminescence reaction using a test solution, and measuring a second luminescence activity value in the test solution;
If the second value is the same as or higher than the first value by comparing the first value for the solution without the heavy metal ion and the second value for the test solution, Determining that there is no heavy metal ion present in the test solution, and determining that there is heavy metal ion present in the test solution if the second value is lower than the first value;
Including
The luciferase is a peptide of the following (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added And a blue fluorescent protein (bFP) composed of an apoprotein having a peptide having luminescence activity, coelenteramide, and calcium ions,
The luciferin, Ri coelenterazine or coelenterazine analog compounds der,
Wherein said heavy metal ion, wherein the Ru copper ions der.
所定濃度の重金属イオンの存在下で、ルシフェラーゼがルシフェリンを基質として触媒する発光反応において生じる発光活性の値を測定し、前記値と、前記重金属イオン濃度との相関関係を求める工程と、
被験溶液を用いて、前記発光反応と同じ条件で発光反応を行い、前記被験溶液における発光活性の値を測定する工程と、
前記相関関係より、前記被験溶液における前記値から、前記被験溶液に存在する重金属イオンの濃度を算出する工程と、
を含み、
前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
を有し、
前記ルシフェリンが、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であり、
前記重金属イオンが、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、又はニッケルイオンである、
方法。 A method for quantifying the concentration of heavy metal ions present in a test solution,
Measuring the value of luminescence activity generated in a luminescence reaction catalyzed by luciferase using luciferin as a substrate in the presence of a heavy metal ion at a predetermined concentration, and determining a correlation between the value and the heavy metal ion concentration;
Using a test solution, performing a luminescence reaction under the same conditions as the luminescence reaction, and measuring a value of luminescence activity in the test solution;
From the correlation, the step of calculating the concentration of heavy metal ions present in the test solution from the value in the test solution;
Including
The luciferase is a peptide of the following (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added And having a luminescent activity peptide,
The luciferin, Ri coelenterazine or coelenterazine analog compounds der,
The heavy metal ions, Ru copper ions, cadmium ions, zinc ions, or nickel ions der,
Method.
所定濃度の重金属イオンの存在下で、ルシフェラーゼがルシフェリンを基質として触媒する発光反応において生じる発光活性の値を測定し、前記値と、前記重金属イオン濃度との相関関係を求める工程と、
被験溶液を用いて、前記発光反応と同じ条件で発光反応を行い、前記被験溶液における発光活性の値を測定する工程と、
前記相関関係より、前記被験溶液における前記値から、前記被験溶液に存在する重金属イオンの濃度を算出する工程と、
を含み、
前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
を有するアポ蛋白質とセレンテラミドとカルシウムイオンから構成されている青色蛍光蛋白質（ｂＦＰ）であり、
前記ルシフェリンが、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であり、
前記重金属イオンが、銅イオンである、
方法。 A method for quantifying the concentration of heavy metal ions present in a test solution,
Measuring the value of luminescence activity generated in a luminescence reaction catalyzed by luciferase using luciferin as a substrate in the presence of a heavy metal ion at a predetermined concentration, and determining a correlation between the value and the heavy metal ion concentration;
Using a test solution, performing a luminescence reaction under the same conditions as the luminescence reaction, and measuring a value of luminescence activity in the test solution;
From the correlation, the step of calculating the concentration of heavy metal ions present in the test solution from the value in the test solution;
Including
The luciferase is a peptide of the following (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added And a blue fluorescent protein (bFP) composed of an apoprotein having a peptide having luminescence activity, coelenteramide, and calcium ions,
The luciferin, Ri coelenterazine or coelenterazine analog compounds der,
The heavy metal ions, Ru copper ions der,
Method.
重金属イオンを含み、
前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
を有し、
前記ルシフェリンが、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であり、
前記重金属イオンが、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、又はニッケルイオンである、
ことを特徴とする阻害剤。 An inhibitor for inhibiting luminescence activity in a luminescence reaction catalyzed by luciferase using luciferin as a substrate,
Containing heavy metal ions,
The luciferase is a peptide of the following (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added And having a luminescent activity peptide,
The luciferin, Ri coelenterazine or coelenterazine analog compounds der,
The heavy metal ions, Ru copper ions, cadmium ions, zinc ions, or nickel ions der,
An inhibitor characterized by that.
重金属イオンを含み、
前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
を有するアポ蛋白質とセレンテラミドとカルシウムイオンから構成されている青色蛍光蛋白質（ｂＦＰ）であり、
前記ルシフェリンが、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であり、
前記重金属イオンが、銅イオンである、
ことを特徴とする阻害剤。 An inhibitor for inhibiting luminescence activity in a luminescence reaction catalyzed by luciferase using luciferin as a substrate,
Containing heavy metal ions,
The luciferase is a peptide of the following (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added And a blue fluorescent protein (bFP) composed of an apoprotein having a peptide having luminescence activity, coelenteramide, and calcium ions,
The luciferin, Ri coelenterazine or coelenterazine analog compounds der,
The heavy metal ions, Ru copper ions der,
An inhibitor characterized by that.
ルシフェラーゼとルシフェリンを含み、
前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
を有し、
前記ルシフェリンが、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であり、
前記重金属イオンが、銅イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、又はニッケルイオンである、
ことを特徴とするキット。 A kit for detecting heavy metal ions present in a test solution,
Including luciferase and luciferin,
The luciferase is a peptide of the following (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added And having a luminescent activity peptide,
The luciferin, Ri coelenterazine or coelenterazine analog compounds der,
The heavy metal ions, Ru copper ions, cadmium ions, zinc ions, or nickel ions der,
Kit characterized by that.
ルシフェラーゼとルシフェリンを含み、
前記ルシフェラーゼが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ発光活性を有するペプチド
を有するアポ蛋白質とセレンテラミドとカルシウムイオンから構成されている青色蛍光蛋白質（ｂＦＰ）であり、
前記ルシフェリンが、セレンテラジン又はセレンテラジン類縁化合物であり、
前記重金属イオンが、銅イオンである、
ことを特徴とするキット。 A kit for detecting heavy metal ions present in a test solution,
Including luciferase and luciferin,
The luciferase is a peptide of the following (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added And a blue fluorescent protein (bFP) composed of an apoprotein having a peptide having luminescence activity, coelenteramide, and calcium ions,
The luciferin, Ri coelenterazine or coelenterazine analog compounds der,
The heavy metal ions, Ru copper ions der,
Kit characterized by that.
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